DE69202136T2

DE69202136T2 - Neuartiges calcitonin, und seine herstellung und verwendung.

Info

Publication number: DE69202136T2
Application number: DE69202136T
Authority: DE
Inventors: Yuichi Sasayama; Akiyoshi Takahashi; Yoshio Takei; Masaharu Takigawa
Original assignee: Sumitomo Metal Industries Ltd
Current assignee: Nippon Steel Corp
Priority date: 1991-05-31
Filing date: 1992-05-29
Publication date: 1995-11-30
Anticipated expiration: 2012-05-30
Also published as: EP0541822A4; EP0541822A1; ES2073924T3; WO1992021700A1; JPH0539299A; EP0541822B1; US5440012A; DE69202136D1

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Peptid und, genauer gesagt, ein aus den Ultimobranchialdrüsen von Knorpelfischen stammendes Calcitonin. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung des Peptids und eine das Peptid als aktiven Bestandteil umfassende pharmazeutische Zusammensetzung, welche als ein Mittel zur Verringerung des Blutcalciums und als ein Mittel zur Förderung der Chondrozyten(Knorpelzellen)-Differenzierung wirksam ist.

Fachlicher Hintergrund

Calcitonin (abgekürzt als CT) ist ein Peptidhormon, das im Mineralstoffwechsel, wie etwa Calcium und Phosphor, beteiligt ist und welches in Schilddrüsen von Säugern und Ultimobranchialdrüsen von Vögeln und Knorpelfischen zu finden ist.
Die japanische Patentanmeldung Kokai Nr. 48-098009 (1973) beschreibt ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung eines stabilen Calcitonins aus den Ultimobranchialdrüsen oder -zellen von Vögeln, Reptilien, Amphibien oder Fischen, aber klärt nicht die Strukturen von Calcitoninen auf
Die Strukturen von hauptsächlich aus den Schilddrüsen von Säugern stammenden Calcitoninen wurden beim Schwein (Potts et al., Pro. Natl. Acad. Sci. USA 59: 1321-1328, 1968), beim Menschen (Neher et aL, Nature 220: 984-996, 1968), beim Rind (Brewer et al., Biochemistry 63: 940- 947, 1969), beim Schaf(Potts et al., Calcium, Parathyroid Hormone and the Calcitonin: 121-127, 1972) und bei Ratten (Raulais et al., Eur. J. Biochem. 64: 607-611, 1976) identifiziert.
Die Strukturen von hauptsächlich aus den Ultimobranchialdrüsen stammenden Calcitoninen wurden bei Lachs (Niall et al., Pro. Natl. Acad. Sci., USA 64: 771-778, 1969), beim Aal (Kotani et al., J. Biochem. 79: 345-352, 1976) und Vögeln (Homma et al., J. Biochem. 100: 459-467, 1986) identifiziert.
Wie in der Fig. 1 gezeigt, können die bisher identifizierten Calcitonine in drei Abstammungslinien (lineages) eingeteilt werden: eine Schweine-Linie, beinhaltend Schweine, Rinder und Schafe, eine Menschen-Linie, beinhaftend Menschen und Ratten, und eine Lachs-Linie, beinhaltend Lachs, Aal und Vögel. Jedes dieser Calcitonine ist ein einzelkettiges Polypeptid, welches aus 32 Aminosäuren besteht, worin die erste und die siebente Aminosäure durch eine Disulfidbrücke (S-S-Brücke) verknüpft sind, um einen siebengliedrigen Ring mit einem am Carboxylende vorhandenen Prolinamid zu bilden.
Man weiß, daß die obenstehend beschriebenen Calcitonine bei der Stoffwechselregulation des Blutserumcalciums und beim Knochenstoffwechsel beteiligt sind. Kürzlich wurde festgestellt, daß Calcitonine zusätzlich zu diesen Aktivitäten auch eine analgetische Wirkung als Neurotransmitter und eine antiulcerale bzw. gegen Geschwüre gerichtete Wirkung über den Calciumstoffwechsel aufweisen. Allerdings sind diese Wirkungen von Calcitoninen nicht vollständig aufgeklärt worden. Es ist ebenfalls bekannt, daß die Intensität der physiologischen Wirkungen der Calcitonine unter den obenstehend beschriebenen Abstammungslinien stark unterschiedlich sind, z.B. auf solche Weise, daß die aus den Ultimobranchialdrüsen abstammenden Calcitonine viel stärker wirksam sind als jene Calcitonine, welche aus den Schilddrüsen stammen. Zum Beispiel besitzt Lachs- Calcitonin eine Wirkung zur Senkung des Blutcalciumspiegels beim Menschen, welche etwa 30mal so hoch ist wie die von menschlichem Calcitonin.
Einige Calcitonine, wie etwa Lachs- und Aal-Calcitonine oder ihre Derivate wurden mittels chemischer Synthese oder Gentechnik kommerziell hergestellt, und sie sind verfügbar und werden zur Behandlung von Osteoporose und ähnlichen Krankheiten eingesetzt. Es wird jedoch erwartet, daß diese Calcitonine nach dem Stand der Technik aufgrund eines durch Langzeitverabreichung davon verursachten Anstiegs des Antikörperspiegels ihre Aktivität verlieren. Folglich ist es für eine therapeutische Verwendung von Calcitoninen erwünscht, ein neues Calcitonin zu finden, welches nicht zu irgendeiner der obenstehend beschriebenen Abstammungslinien von Calcitoninen gehort. Ein derartiges neues Calcitonin wird bei Untersuchungen hilfreich sein, um die physiologischen Wirkungen der Calcitonine aufzuklären.

Beschreibung der Erfindung

Mit der Absicht, ein neues Calcitonin voll einem Typ, welcher von den bekannten Calcitoninen unterschiedlich ist, zu finden, konzentrierten sich die Erfinder der vorliegenden Erfindung auf die Ultimobranchialdrüsen von Knorpelfischen, welche in der Vergangenheit nicht herausgeschnitten wurden, um Calcitonine zu isolieren. Wie obenstehend beschrieben, wird erwartet, daß ein aus den Ultimobranchialdrüsen stammendes Calcitonin eine starke physiologische Aktivitat haben könnte. Es wurde als Ergebnis von Untersuchungen festgestellt, daß ein Faktor zur Verringerung des Blutcalciums mit einer starken Aktivität in den Ultimobranchialdrüsen von Knorpelfischen vorhanden ist. Dieser aktive Faktor ist ein neues Calcitonin-Peptid, welches von einem von jeglichem bekannten Calcitonin verschiedenen Typ ist, und es ist in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendbar, da es eine Wirkung zur Verringerung des Blutcalciums und eine Wirkung zur Förderung der Chondrozytendifferenzierung besitzt.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Peptid zur Verfügung, welches aus der Ultimobranchialdrüse eines Knorpelfisches stammt und eine Blutcalcium-verringernde Wirkung und eine die Chondrozytendifferenzierung fördernde Wirkung aufweist. Das Peptid besitzt ein Molekulargewicht von 3.400 + 400.
Nach der Erfindung weist das Peptid eine Aminosäuresequenz der folgenden Formel auf
Die Erfindung betrifft auch das Salz dieses Peptides.
Die zwei Cysteinreste (Cys) in der obenstehenden Aminosäuresequenz des Peptids sind über eine Disulfid(S-S)-Brücke oder eine Ethylen-Ethylen-Brücke miteinander verknüpft. Die Struktur des Peptids ist auch in der Figur 1 gezeigt.
Im allgemeineren betrifft die vorliegende Erfindung ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz der folgenden Formel (II) und dessen Salz:
In der obenstehenden Formel bedeutet X Wasserstoff, Tyr- oder einen Rest, welcher mit einem Isotop markiert werden kann, und die zwei Cysteinreste in dem Peptid können über eine Dsulfid- Brücke oder eine Ethylen-Ethylen-Bindung verbunden sein.
Der als X verwendbare, mit einem Isotop markierbare Rest kann jeder derartige Rest sein, welcher z.B. einen aromatischen Rest enthält, der mit ¹²&sup5;I oder Deuterium markiert werden kann.
Die folgende Erfindung betrifft auch ein Mittel zur Verringerung des Blutcalciums und ein Mittel zur Förderung der Chondrozytendifferenzierung, welches das obenstehend beschriebene Peptid oder dessen Salz als einen Wirkstoff umfäßt. Somit besteht eine Möglichkeit, das Peptid der vorliegenden Erfindung bei der Behandlung von Hypercalcämie, Osteoporose, Osteitis deformans (Paget'sche Krankheit), Zwergenwuchs, Knochenbrüchen und dergleichen zu verwenden. Das Peptid ist auch als ein Analgetikum in pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendbar.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist ein aus der Ultimobranchialdrüse des Stachelrochens (Dasyatis akajei), einem Knorpelfisch, stammendes Calcitonin. In Wirbeltieren mit einem Knochenskelett ist dessen Calcitonin bei der Inhibition der Calcium-Lösung aus dem Knochen oder der Festigung des Knochens aufgrund eines Anstiegs der Konzentration von Knochen-Salz im Knochen beteiligt. Knorpelfische unterscheiden sich von anderen Wirbeltieren dadurch, daß sie ein Knorpelskelett besitzen, so daß es schwer vorzustellen ist, daß die physiologischen Wirkungen von Calcitonin in Knorpelfischen exakt die gleichen wie die in anderen Wirbeltieren mit einem Knochenskelett sind, und es wird erwartet, daß Calcitonin in Knorpelfischen andere physiologische Wirkungen besitzt.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung ist ein neuer Typ von Calcitonin mit einer Strüktur, welche zu keiner der bekannten Abstammungslinien von Calcitoninen gehört. Deshalb wird erwartet, daß das Peptid eine große Rolle in Untersuchungen spielen wird, um den Mechanismus der Stoffwechselregulation des Blutcalciums, Ursachen von abnormalen Knochenstoffwechselerkrankungen und die physiologischen Wirkungen von Calcitoninen aufzuklären. Wenn z.B. X in der oben genannten Formel (II) Tyr- oder ein mit einem Isotop markierbarer Rest ist, kann das Peptid der vorliegenden Erfindung markiert werden, und das resultierende markierte Peptid kann verwendet werden, um die Konzentration des Peptids im Blut zu bestimmen oder die Halbwertszeit oder die betroffene Fläche zu messen, was seinerseits bei der Aufklärung der Stoffwechselkinetik des Peptids hilfreich ist.
Da das Calcitonin der vorliegenden Erfindung ein neuer Typ von Calcitonin ist, wird erwartet, daß das Calcitonin, wenn z.B. als ein therapeutisches Mittel gegen Osteoporose verabreicht, selbst in denjenigen Patienten wirksam sein wird, auf die Calcitonine nach dem Stand der Technik wegen der Antikörperherstellung durch die Immunität im Körper der Patienten keine signifikante Wirkung haben.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung kann durch Isolieren und Gewinnen aus denjenigen Zellen, in welchen das Peptid hergestellt wird, hergestellt werden. Brauchbare Peptid-herstellende Zeilen schließen Gewebezellen aus der Ultimobranchiäldruse des Stachelrochens, einem Knorpelfisch, oder durch Zellkultur der Gewebezellen erhakene gezüchtete Zellen und Zellen, welche durch eine Genrekombinationstechnik erhalten wurden und welche fähig sind, das gewünschte Calcitoninpeptid herzustellen, ein. Das Peptid kann aus diesen Zellen isoliert und gereinigt werden, indem eine Kombination verschiedener Techniken, welche herkömmlicherweise bei der Isolierung und Reinigung von Peptiden angewandt werden, verwendet wird, was Extraktion, Gel-Permeationschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Hochieistungsflüssigkeitschromatographie, Elektrophorese und Umkristallisieren einschließt. Insbesondere wird es bevorzugt, daß Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie bei der Isolierung und Reinigung des Peptids angewandt wird.
Alternativ dazu ist es möglich, das Peptid auf der Grundlage der Information über die Aminosäuresequenz, welche durch die Analyse des isolierten und gereinigten Calcitonins ermittelt wurde, aus Aminosäuren chemisch zu synthetisieren. Die Synthese kann unter Verwendung eines herkömmlichen Peptid- Syntheseverfahrens, z.B. eines Festphasen-Aminosäuresyntheseverfahrens von Yanagisawa et al. oder eines Flüssigphasen-Aminosäuresyntheseverfahrens durchgeführt werden.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Die Figur 1 zeigt Aminosäuresequenzen von bekannten Calcitoninen zusammen mit derjenigen des Calcitonins der vorliegenden Erfindung.
In der Figur sind die Aminosäuren durch Ein-Buchstaben-Abkürzungen angegeben, welche den folgenden Drei-Buchstaben-Abkürzungen entsprechen:

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung

Die Isolierung und Reinigung des Calcitonins aus dem Gewebe eines Stachelrochens wird im folgenden beschrieben.
Zuerst wird die Ultimobranchialdrüse eines Stachelrochens herausgeschnitten. Dieser Fisch besitzt ein Paar von Ultimobranchialdrüsen auf der Rückseite des Herzens, und sie können visuell identifiziert und leicht herausgeschnitten werden. Eine gewünschte große Mengen von Zellen kann entweder durch Sammeln einer Anzahl von Ultimobranchialdrüsen durch Herausschneiden oder durch Züchten der Gewebezellen der Ultimobranchialdrüse in Zellkultur erhalten werden.
Nachdem die herausgeschnittenen Ultimobranchialdrüsen eingefroren sind, werden sie zerbrochen und in destilliertem Wasser gekocht. Nach Abkühlen wird Essigsäure zugegeben, und die Mischung wird homogenisiert, um eine Extraktion durchzuführen. Der Extrakt wird zentrifugiert und der resultierende Überstand wird erneut zentrifugiert, nachdem Aceton dazugegeben wurde. Der Überstand wird unter Vakuum bis zur Trockenheit eingedampft, und der Rückstand wird in Essigsäure aufgenommen. Die resultierende Lösung wird dann nach Zugabe von Aceton zentrifugiert. Der Niederschlag wird in einer 0,1%igen Trifluoressigsäurelösung aufgenommen, und die resultierende Lösung wird einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen. Die Fraktion, von welcher durch das Immunoblotting-Verfahren herausgefunden wird. aktiv zu sein, wird gesammelt und durch erneutes Unterziehen einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gereinigt.
Die Aminosäuresequenz des so isolierten Stachelrochen-Calcitonins kann durch Verwendung eines automatischen Aminosäuresequenz-Analyzers ermittelt werden, in welchem die Peptidbindungen aufeinanderfolgend vom N-Terminus aus durch das Edman-Abbauverfahren gespalten werden und die freigesetzten Aminosäuren durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie identifiziert werden. Das Ergebnis ist als SEQ ID Nr. 1 in der anhängigen Sequenzauflistung gezeigt. Die Aminosäureanalyse des gewonnenen Peptids ergab die folgende Aminosäurezusammensetzung:
Die Zahlen in Klammern geben den theoretischen molaren Gehalt jeder Aminosäure an.
Das aus der Ultimobranchialdrüse des Stachelrochens isolierte natürlich vorkommende Peptid besitzt ein Molekulargewicht von 3.395 und eine durch die obenstehende Formel (I) repräsentierte Struktur, worin die zwei Cysteinreste über eine Disulfid-Brücke verbunden sind.
Auf der Grundlage dieser Ergebnisse kann das durch die Formel (I) repräsentierte Stachelrochen- Calcitonin synthetisiert werden, indem ein geradkettiges Peptid mit der als SEQ ID Nr. 1 gezeigten Aminosäuresequenz, z.B. gemäß Yanagisawas Verfahren (Pro. Natl Acad. Sci., USA 85: 6964-6967, 1988) hergestellt wird und die zwei Cysteinreste über eine Disulfid-Brücke oder eine Ethylen-Ethylen-Bindung verbunden werden, und der C-Terminus modifiziert wird, um durch Verwendung geeigneter bekannter Reaktionen ein Amid zu bilden. Falls nötig, kann ein durch die obenstehende Formel (II) repräsentiertes Peptid durch Einfügen eines Tyrosinrestes oder eines mit einem Isotop markierbaren Rest am N-Terminus des resultierenden Calcitonins durch eine bekannte Reaktion und durch Durchführen oder Weglassen der Reaktion für die Verknüpfung zwischen den zwei Cysteinresten synthetisiert werden.
Die physiologischen Aktivitäten des aus der Ultimobranchialdrüse des Stachelrochens extrahierten reinen natürlich vorkommenden Stachelrochen-Calcitonins und diejenigen des auf die obenstehend beschriebene Weise erhaltenen synthetischen Stachelrochen-Calcitonins wurden nach der Technik von Homma et al. (J. Biochem. 100: 459-467, 1986) bestimmt. Es wurde festgestellt, daß beide eine starke Aktivität zur Verringerung des Blutcalciums aufweisen.
Als ihre physiologischen Wirkungen auf Knorpelzellen oder Chondrozyten nach der Technik von Bessey et al. (J. Biol. Chem. 164: 321-329, 1964) und der von Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193: 265-275, 1951) bestimmt wurden, wurde eine starke Aktivität zur Förderung der Zell-Differenzierung bemerkt.
Das Peptid der vorliegenden Erfindung, welches eine durch die obenstehende Formel (I) angegebene Struktur aufweist und welches aus den Ultimobranchialdrüsen von Knorpelfischen isoliert werden kann, besitzt eine signifikante Aktivität zur Verringerung des Blutcalciumspiegels, welche mit den Aktivitäten der herkömmlich verwendeten Lachs- und Aal-Calcitonine vergleichbar ist. Deshalb kann es als ein therapeutisches Mittel gegen Osteoporose, Hypercalcämie und die Paget'sche Krankheit verwendet werden. Es besitzt ebenfalls eine Aktivität als Nervenpeptid und kann somit als ein Analgetikum verwendet werden. Da das Peptid aus Knorpelfischen stammt, weist eine hervorragende Aktivität zur Förderung der Chondrozytendifferenzierung auf und ist als ein therapeutisches Mittel gegen Zwergenwuchs, Knochenbrüche und 0steoporose verwendbar. Das Peptid ist dadurch besonders vorteilhaft, daß es bei solchen Patienten wirksam ist, auf die herkömmliche Calcitonine keinen Effekt haben.
Zusätzlich zur klinischen Verwendung in der Therapie, kann das Peptid der vorliegenden Erfindung in Untersuchungen verwendet werden, um die biologischen Mechanismen der Calciumregulation und des Knochenstoffwechsels aufzuklären. Für diese Zwecke ist ein breiterer Bereich der durch die Formel (II) repräsentierten Peptide verwendbar. In derartigen Fällen nämlich können die Cysteinreste nicht miteinander verbunden sein, und es wird bevorzugt, daß Tyr- oder ein mit einem Isotop markierbarer Rest an den N-Terminus gebunden ist.
Wenn es als ein therapeutisches Mittel verabreicht wird, kann das Peptid der vorliegenden Erfindung oral oder parenteral, z.B. durch intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion, oder örtlich, z.B. in Form von Augentropfen oder Nasalmitteln, verabreicht werden, obwohl die intramuskuläre Injektion für das Peptid besonders bevorzugt wird.
Die Dosis liegt im Bereich von 0,01 - 100 nMol/kg. Im Fall einer intramuskulären Injektion wird eine Dosis des Peptids, welche in Abhängigkeit vom Körpergewicht und dem erwarteten Effekt ausgewählt wird, gewöhnlich in der Form einer in 0,1 bis 10 ml physiologischer Salzlösung gelösten Lösung angewandt.
Wenn das Peptid als ein Wirkstoff in einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet wird, können das Peptid und ein oder mehrere Zusatzstoffe in verschiedenen Formen zubereitet werden, wobei Emulsionen, Wässer, Lösungen, Tabletten, Pulver, Granalien, Kapseln, Pillen und dergleichen eingeschlossen sind.
Zusatzstoffe, welche in der Zubereitung verwendet werden können, schließen pharmakologisch annehmbare isotonische Mittel, Stabilisatoren, Konservierungsstoffe, pH-einstellende Mittel, Arzneimittelträger, Abbaumittel, Gleitmittel, Bindemittel, Dispersionsmittel, Weichmacher und dergleichen ein. Zum Beispiel können Natriumchlorid als ein isotonisches Mittel, gereinigte Gelatine als ein Stabilisationsmittel, Phenol als ein Konservierungsmittel, Chlorwasserstoffsäure und Natriumhydroxid als pH-einstellende Mittel, Lactose und Glykose als Arzneimittelträger, Stärke und Agar als Desintegrationsmittel, Talk und flüssiges Paraffin als Gleitmittel, Einzel-Sirup und Ethanol als Bindemittel, Methylcellulose und Ethylcellulose als Dispersionsmittel und Glycerin und Stärke als Weichmacher verwendet werden.

Beispiel 1

Isolierung und Reinigung von Stachekochengewebe

Eine Menge von 2,2 g der Ultimobranchialdrüsen, die durch Herausschneiden aus den Körpern von 200 Stachelrochen gesammelt wurde, wurde bei -50ºC eingefroren und dann in einem Fleischwolf zerkleinert. Zu den Fragmenten wurden 7 Volumen destilliertes Wasser zugegeben und 5 Minuten lang gekocht. Nach Kühlen wurde Essigsäure zugegeben, um eine Konzentration von 1 M zu erhalten, und in einem Polytron-Mischer homogenisiert. Die resultierende Suspension wurde bei 4ºC und 25.000 x G 30 Minuten lang zentrifugiert. Zu dem Uberstand wurden 2 Volumen kaltes Aceton gegeben, um eine Acetonkonzentration von 67% zu erhalten, und es wurde bei 4ºC und 16.000 x G 30 Minuten lang zentrifugiert. Der Überstand wurde unter Vakuum destilliert, um das Aceton zu entfernen, und der Rückstand wurde lyophilisiert. Das resultierende Pulver wurde in 10 ml 1 M Essigsäurelösung gelöst, und 600 ml kaltes Aceton wurden zugegeben, um eine Aceton-Konzentration von 98,5% zu erhalten. Die Lösung wurde 30 Minuten lang bei 16.000 x G zentrifugiert.
Der aufgefangene Niederschlag wurde getrocknet und dann in einer wäßrigen 0,1%igen Trifluoressigsäure-Lösung gelöst, und die resultierende Lösung wurde einer Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter den folgenden Bedingungen unterzogen.

Bedingungen 1:

Säule: 4,6 x 250 mm-Säule (Toso, ODS-120T),
Fließrate: 1 ml/min
Elutionsmittel: A = eine Mischung einer wäßrigen 0,1%igen Trifluoressigsäure-Lösung und Acetonitril (8:2) B = eine Mischung einer wäßrigen 0,1%igen Trifluoressigsäure-Lösung und Acetonitril (2:8)
Elution: Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von Elutionsmittel A zu Elutionsmittel B (60 Minuten).
Jede der aufgefangenen Fraktionen wurde durch das Immunoblotting-Verfahren unter Verwendung der Tatsache, daß anti-Lachs-Calcitonin-Serum mit dem Calcitonin der vorliegenden Erfindung kreuzreaktiv ist, untersucht, um eine aktive Fraktion (Nr. 12) auf die folgende Weise zu erhalten. Jede Fraktion, welche lyophilisiert worden war, und synthetisches Lachs-Calcitonin wurden in 10 ul einer Michung aus einer 0,1 M Natriumcarbonat-Lösung und Methanol [4:1 (v/v), pH 9,5] gelöst, und die resultierende Lösung wurde auf wine Nylon-Membran (Millipore, Immobilin PVDF-Transfer Membran) aufgetropft und von der Membran adsorbiert. Nachdem die Membran 3 Sekunden lang in 100% Methanol eingetaucht wurde, wurde sie dreimal mit einem 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,2 abgekürzt als PBST) gewaschen, welcher 0,05% Tween 20 enthielt, anschließend zweimal mit PBST, welcher 1% Ziegenserum enthielt, gewaschen und schließlich drei Mal mit PBST gewaschen. Die gewaschene Membran wurde 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit Antiserum (verdünnt auf 1/4000) zur Reaktion gebracht, welches aus einem Kaninchen gewonnen wurde, das gegen synthetisches Lachs-Calcitonin immunisiert wurde. Nach dreimaligem Waschen mit PBST wurde die Membran unter Verwendung eines Vectastain-ABC- Kits (Vector Laboratories) einer Immunofärbung unterzogen, um eine aktive Fraktion zu identifizieren.
Die aktive Fraktion, welche lyophilisiert worden war, wurde wiederurn der Umkehrphasen- Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in derselben Weise wie obenstehend beschrieben unter den folgenden Bedingungen unterzogen.

Bedingungen 2:

Säule: 4,6 x 250 mm-Säule (Toso, ODS-120T),
Fließrate: 1 ml/min,
Elutionsmittel: A = eine Mischung aus Wasser, Acetonitril und 1 M Ammoniumacetat (pH 4,6) (72:8:1, v/v), B = eine Mischung aus Wasser, Acetonitril und 1 M Ammoniumacetat (pH 4,6) (25:100:1, v/v).
Elution: Elution mit einem linearen Konzentrations-Gradienten von Elutionsmittel A zu Elutionsmittel B (40 Minuten).
Als Ergebnis wurde in einer bestimmten Fraktion ein einzelner Peak mit einer starken Absorption (A230) aufgrund eines Peptids bemerkt. Die Fraktion wurde lyophilisiert, um 122 nMol reines Stachelrochen-Calcitonin nach der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Das so isolierte reine Stachelrochen-Calcitonin (12,2 nMol) wurde einer S-Carboxymethylierung unterzogen, uni die S-S-Bindung zu trennen, und das Reaktionsprodukt wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie auf dieselbe Weise wie bei den Bedingungen 1 gereinigt. Eine Probe des gereinigten Produkts wurde einer Aminosäureanalyse unterzogen, und die obenstehend beschriebene Aminosäurezusammensetzung wurde festgestellt. Darüberhinaus wurde eine andere Probe des gereinigten Produkts in einer herkömmlichen Weise einem Edman-Abbau unterzogen, und die Aminosäuresequenz des Peptids wurde durch eine bekannte Aminosäurenanalyse-Technik sequentiell vom Amino-Terminus aus ermittelt. Das Vorhandensein des Prolins am Carboxyl-Terminus in der Form eines Amids wurde durch die Tatsache bestätigt, daß ein einzelner Peak erhalten wurde, wenn eine Probe des gereinigten Produkts zusammen mit einer Probe des in Beispiel 2 erhaltenen amidierten synthetischen Stachelrochen-Calcitonins unter den obenstehend beschriebenen Bedingungen 1 und 2 der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen wurde. So wurde festgestellt, daß das isolierte Stachelrochen Calcitonin die als SEQ ID Nr. 1 in der anhangigen Sequenzauflistung gezeigte Aminosäuresequenz besaß. Das Calcitonin weist nämlich die Struktur der obenstehenden Formel (I) auf, in welcher die zwei Cysteinreste über eine Disulfid-Brücke verbunden sind.

Beispiel 2

Ein Peptid, das aus 32 Aminosäuren besteht und dieselbe Aminosäuresequenz wie das in Beispiel 1 erhaltene Stachelrochen-Calcitonin der vorliegenden Erfindung besitzt, wurde nach dem Verfahren von Yanagisawa et al. (Pro. Natl. Acad. Sci., USA 85: 6964-6967, 1988) chemisch synthetisiert. Unter Verwendung eines vollautomatischen Peptid-Synthesizers (Applied Biosystem) wurden Aminosäuren durch das t-Butoxycarbonyl(BOC)-Verfahren gekoppelt. Eine Disulfid-Brücke wurde zwischen den zwei Cysteinresten in dem resultierenden geradkettigen Peptid durch 0xidation der an diese Cysteinreste angeknüpften Schutzgruppen mit Kaliumferricyanid gebildet. Das synthetisierte Produkt wurde durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeits chromatographie (Shimadzu LC8A) gereinigt.
Das wie obenstehend erhaltene synthetische Peptid wurde zusammen mit dem in Beispiel 1 erhaltenen Calcitonin der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen, und es wurde bestätigt, daß beide Peptide eine Elutionsbande in der gleichen Position aufwiesen.

Beispiel 3

Männliche Wistar-Ratten mit einem Gewicht von 90 - 110 g (10 Tiere in jeder Gruppe), welche 24 Stunden lang vor dem Experiment gefastet hatten, wurden intravenös mit einer Standardlösung von Lachs-Calcitonin oder Aal-Calcitonin oder einer Lösung des synthetischen Stachelrochen- Calcitonins (hergestellt in Beispiel 2), jeweils gelöst in einer wäßrigen 0,9%igen Natriumchlorid- Lösung (pH 4,6) mit 0,1% Rinderserumalbumin bei einer Dosis von 1 pMol oder 10 pMol je Tier, injiziert. Exakt 1 Stunde nach der Verabreichung wurde eine Blutprobe aus der Arterie jedes Versuchstieres entnommen, und die Konzentration des Calciums im Serum wurde durch Atomabsorptionsspektroskopie ermittelt. Auf der Grundlage der Werte für die Serum-Calcium-Konzentration in Ratten der Gruppen, in denen eine der Standardlösungen bei einer Dosis von 1 pMol oder 10 pMol je Tier verabreicht wurde, und derjenigen in Ratten der Gruppe, in welcher das Stachelrochen-Calcitonin der vorliegenden Erfindung bei der gleichen Dosis verabreicht wurde, wurde der relative Titer des Stachelrochen-Calcitonins durch statistische Standardverfahren für Parallelversuche ermittelt.
Die Titer von Lachs-Calcitonin und Aal-Calcitonin, welche als Standardsubstanzen verwendet wurden, betrugen etwa 3.500 IU/mg bzw. 4.500 IU/mg. Andererseits hatte das Calcitonin der vorliegenden Erfindung einen Titer von etwa 3.770 IU/mg. Somit wies das Peptid nach der vorliegenden Erfindung eine hervorragende Wirkung zur Verringerung des Blutcalciums aufs welche mit bekannten aus den Ultimobranchialdrüsen stammenden Calcitoninen vergleichbar war.

Beispiel 4

Eine gezüchtete Knorpelzell-Kultur aus Kaninchen-Rippenknorpel, hergestellt gemäß dem Verfahren von Suzuki et al. [Yamane und Endo, Hg., Saishin Soshiki Baiyo Oyo Kenkyu-ho (Modern Tissue Culture Applied Research Methods), 116-128, veröffentlicht durch Soft Science, Tokio, 1985], wurde in einer Menge von 3,5x10&sup4; Zellen je Milliliter in einem α-MEM-Medium (Flow Laboratory) mit 10% fötalem Rinderserum suspendiert, und 1 ml der resultierenden Suspension wurde in jede Vertiefung einer Multi-Well-Platte (16 mm Durchmesser, Corning) mit 24 Vertiefungen gegeben, welche mit Collagen beschichtet war. Die Platte wurde 9 Tage lang bei 37ºC in einer aus 5% Kohlendioxid und 95% Luft bestehenden Atmosphäre unter Verwendung eines Kohlendioxid-Inkubators (Sanyo/Farma) inkubiert. Im Verlauf der Inkubation wurde das Medium am vierten und am sechsten Tag erneuert, und zu diesem Zeitpunkt wurden 10 ul einer Phosphatpufferlösung, welche 0,2% Rinderserumalbumin und 10&supmin;¹² Mol/ml Standard-Calcitonin, welches entweder Lachs-Calcitonin oder Aal-Calcitonin war, oder Stachelrochen-Calcitonin der vorliegenden Erfindung (in Beispiel 2 erhaltenes synthetisches Produkt) enthielt, zu dem Medium zugegeben. Als Kontrolle wurde dieselbe Pufferlösung,, welche 0,2% Rinderserumalbumin aber kein Calcitonin enthielt, verwendet.
Nach 9 Tage langer Inkubation wurde die Zellschicht (1) geerntet, und die Alkalische Phosphatase-Aktivität in jeder Vertiefung wurde durch das Verfahren von Bessey et al. (J. Boil. Chem. 164: 321-329, 1946) unter Verwendung von p-Nitrophenylphosphorsäure als Substrat bestimmt.
Die Proteinmenge in jeder Vertiefung wurde ebenfalls durch Untersuchen der gewonnenen Zellschicht (1) gemäß dem Verfahren von Lowry et al. (J. Biol. Chem. 193: 265-275, 1951) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als einer Standardsubstanz bestimmt.
Der Wert der Aktivitat der Alkalischen Phosphatase pro Gewichtseinheit Protein wurde aus den wie obenstehend bestimmten Werten für die Aktivitat der Alkalischen Phosphatase und die Proteinmenge berechnet. Der berechnete Wert der Kontrolle betrug etwa 88. 150 nMol/30 min/mg-Protein. Die Werte der Lachs-Calcitonin- und Aal-Calcitonin-Standardsubstanzen betrugen etwa 95.000 nMol/ 30 min/mg-Protein bzw. etwa 103.000 nMol/30 min/mg Protein.
Das Calcitonin der vorliegenden Erfindung wies einen Wert von etwa 106.000 nMol/30 min/mg- Protein auf. Somit zeigte das Calcitonin der vorliegenden Erfindung eine hervorragende Aktivität zur Förderung der Chondrozytendifferenzierung.

Industrielle Anwendbarkeit

Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Calcitonin bereit, welches in den Ultimobranchialdrüsen von Knorpelfischen vorkommt und welches von jeglicher bekannten Abstammungslinie von Calcitoninen verschieden ist. Das Peptid besitzt eine hervorragende Aktivität zur Verringerung des Blutcalciums und eine hervorragende Aktivität zur Förderung der Chondrozytendifferenzierung und ist in pharmazeutischen Anwendungen als ein therapeutisches Mittel gegen Hypercalcämie, 0steoporose, die Paget'sche Krankheit, Zwergenwuchs, Knochenbrüche und dergleichen und als ein Analgetikum verwendbar. Man erwartet, daß das Peptid eine große Rolle in Untersuchungen spielt, um die Mechanismen der Blutcalcium-Regulierung und des Knochenstoffwechsels aufzuklären. Da die Struktur des Peptids von derjenigen des Aal-Calcitonins und Lachs- Catcitonins, welche klinisch angewandt wurden, verschieden ist, besteht eine gute Möglichkeit, daß es an diejenigen Patienten verabreicht werden kann, auf die herkömmliche Calcitonine wegen der Antikörperherstellung durch die Immunität im Körper der Patienten keinen Effekt ausüben.

SEQUENZ-AUFLISTUNG

SEQ ID NR.: 1
SEQUENZLÄNGE: 32
SEQUENZTYP: Aminosäure
TOPOLOGIE: beide
MOLEKÜLTYP: Peptid
ORIGINALQUELLE:
ORGANSIMUS: Stachekochen (Daysyatis akajei)
GEWEBETYP: Ultimobranchialdrüse
EIGENSCHAFT:
LOKALISIERUNG: 32
WEITERE INFORMATION: Der Carboxyl-Terminus ist amidiert.
SEQUENZBESCHREIBUNG:

Claims

1. Peptid mit einer Aminosäuresequenz der folgenden Formel:

wobei die zwei Cysteinreste (Cys) in dem Peptid über eine Disulfid (S-S)-Bindung oder eine Ethylen-Ethylen-Bindung verbunden sind, und ein Salz davon.

2. Peptid mit einer Aminosäuresequenz der folgenden Formel:

worin X Wasserstoff, Tyr- oder ein Rest, welcher mit einem Isotop markiert werden kann, bedeutet, und wobei die zwei Cysteinreste in dem Peptid über eine Disulfidbindung oder eine Ethylen-Ethylen-Bindung verbunden sein können.

3. Verfahren zur Herstellung des Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid nach Anspruch 1 aus Zellen, welche in der Lage sind, das Peptid zu bilden, durch ein bekanntes Verfahren isoliert und gewinnt.

4. Verfahren zur Herstellung des Peptids nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Peptid nach Anspruch 2 durch ein bekanntes chemisches Syntheseverfahren herstellt.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend das Peptid nach Anspruch 1 oder dessen Salz als einen Wirkstoff und ein oder mehrere pharmazeutisch annehmbare Additive.

6. Mittel zur Verringerung des Blutcalciums, umfassend das Peptid nach Anspruch 1 oder dessen Salz als einen Wirkstoff.

7. Mittel zur Förderung der Chondrozytendifferenzierung, umfassend das Peptid nach Anspruch 1 oder dessen Salz als einen Wirkstoff.