DE69108830T2

DE69108830T2 - Neue im schwein vorkommende physiologisch aktive peptide.

Info

Publication number: DE69108830T2
Application number: DE69108830T
Authority: DE
Inventors: Hisayuki Matsuo
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-04-20
Filing date: 1991-04-20
Publication date: 1995-09-14
Anticipated expiration: 2011-04-21
Also published as: DE69108830D1; ES2073751T3; DK0478797T3; GR3015762T3; EP0478797A4; ATE121102T1; US5352770A; EP0478797A1; EP0478797B1; WO1991016342A1; JP2636500B2

Description

Die Erfindung betrifft neue physiologisch aktive Peptide aus dem Schwein (CNP) mit natriuretischen und Blutdruck-senkenden Wirkungen, und auch der Fähigkeit zur Unterdrückung des Wachstums vaskulärer glatter Muskelzellen.
In jüngster Zeit wurden zwei Arten von Peptidhormone, bezeichnet als "atrielles natriuretisches Peptid (ANP)" und "Gehirn-natriuretisches Peptid (BNP)", aus dem Säugeratrium und -gehirn als Hormone isoliert, die den homeostatischen Ausgleich von Körperflüssigkeitsvolumen und Blutdruck regulieren. Die Struktur dieser Peptide und der Mechanismus ihrer Biosynthese wurde aufgeklärt, und ihre physiologischen Wirkungen werden ebenfalls aufgeklärt.
ANP wurde zunächst aus dem humanen Atrium in drei Typen isoliert, dem α- Typ mit einem Molekulargewicht von ca. 3000 (α-hANP), dem ß-Typ von ca. 6000 (ß-hANP) und dem γ-Typ von 13000 (γ-hANP) und ihre entsprechenden Strukturen wurden aufgeklärt (Kangawa K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 118, 131, 1984; Kangawa K. et al., Nature, 313, 397, 1985).
Im Ergebnis wurden die folgenden Fakten ermittelt:
(1) α-hANP ist eine einzelsträngiges Peptid, das aus 28 Aminosäuren mit einer einzelnen S-S-Bindung im Molekül besteht;
(2) ß-hANP ist ein antiparalleles Dimer mit einer S-S-Bindung, die zwischen zwei α-hANP Molekülen gebildet wird; und
(3) y-hANP ist ein hoch molekulares Protein aus 126 Aminosäuren mit einem α-hANP, das im C-terminalen Teil enthalten ist.
Ferner hat die Analyse der cDNA, die für α-hANP codiert, gezeigt, daß jeder dieser drei Typen von hANP (α-, ß- und -γ-hANP) aus demselben Vorläuferprotein biosynthetisiert wird (Oikawa, S. et al., Nature, 309, 724, 1984). D. h. insbesondere, daß diese Peptide zunächst in den Atriumzellen als ein Vorläufer (pre-hANP), bestehend aus 151 Aminosäureresten, synthetisiert werden, und dann wird das Signalpeptid, bestehend aus 25N-terminalen Resten im Golgi-Apparat unter Herstellung von γ-hANP abgespalten. Anschließend wird das γ-hANP weiter mit einem Enzym unter Bildung von (x-hANP gespalten (d. h. prozessiert), welches hauptsächlich in das Blut sekretiert wird. Der Prozeß der ß- hANP-Synthese ist heute immer noch unklar, es wird jedoch höchst wahrscheinlich über das α-hANP hergestellt.
Seit der Strukturaufklärung von hANP wurden ebenfalls die Strukturen von ANP, die aus anderen Säugern stammen, untersucht. Heutzutage ist der Kenntnisstand wie folgt: ANPs haben ähnliche Aminosäuresequenzen über einen breiten Spektrum von Säugern, von Nagern bis Menschen, insbesondere ANP vom α-Typ (α-ANP) hat die gleiche Aminosäuresequenz bei höheren Säugern einschließlich Menschen, Hunden und Schweinen; und ANPs vom (α-Typ aus Ratten und Kaninchen haben exakt dieselbe Aminosäuresequenz wie (α-hANP mit Ausnahme, daß der Methioninrest an Position 12 durch einen Isoleucinrest ersetzt ist (Oikawa S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 132, 892, 1985; Forssmann, W.G. et al., Anat. Embryol., 168, 307, 1983).
Bei Überprüfung der Verteilung von ANP in vivo unter Verwendung von Anti- α-hANP-Antiseren wurde gefunden, daß ANP auch im Gehirn vorkommt, obwohl in kleinen Mengen, wie auch im Atrium. Ferner wird von ANP-haltigen Neuronen berichtet, die in Hypothalamus und Pontin tegmentum des Gehirns auftreten (Cantin, M. et al., Histochemistry, 80, 113, 1984; Saper, C.B., et al., Science, 227, 1047, 1985) und man spekuliert daher heute, daß ANP auch im Gehirn als Nerventransmitter arbeitet, der bei der Regulation des cardiovaskulären Systems teilnimmt.
In jüngster Zeit wurde ein neues Peptid, das eine Struktur ähnlich wie das ANP hat, jedoch vom letzteren deutlich unterscheidbar ist, aus dem Schweinehirn isoliert und identifiziert, und ähnlich wie beim ANP, wurde bestätigt, daß dieses Peptid eine natriuretische und hypotensive Wirkung hat, und es wurde daher als "BNP" bezeichnet (Sudoh, T. et al., Nature, 332, 78, 1988). Später wurde gefunden, daß BPN aus dem Schwein (pBNP) ein einzelsträngiges Peptid war, das aus 26 Aminosäuren mit einer einzelnen S-S-Bindung im Molekül aufgebaut war. Ferner wurde eine für humanes BNP codierende cDNA isoliert, und die Struktur des BNP-Vorläufers wurde ebenfalls klar, was zeigte, daß BNP aus einem vollständige verschiedenem Vorläufer als im Falle von ANP aufgebaut wurde (Sudoh, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 1427, 1989). Bis heute wurde die Struktur von Ratten-BNP ebenfalls aufgeklärt (Kojima, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 1420, 1989).
Es wurde ebenfalls gefunden, daß BNP im Schweinehirn in Mengen vorkam, die 10 mal höher als ANP waren, und dies legte eine höhere Wahrscheinlichkeit nahe, daß Gehirn-BNPs als Nerventransmitter für das Nervensystem zur Regulation des homeostatischen Ausgleichs des Körperflüssigkeitsvolumens und des Blutdruckes dienen (Ueda, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 155, 733, 1988).
Später wurde gefunden, daß wie beim ANP das BNP nicht nur im Gehirn, sondern auch im Atrium (obwohl in einer Menge von nur 2 bis 3 % des ANPs) vorkam, das ins Blut sekretiert wurde, was zeigte, daß BNP, wie das ANP, ebenfalls ein Hormon war, das den homeostatischen Ausgleich der Körperflüssigkeitsvolumens und des Blutdruckes regulierte (Minamino, N. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 155, 740, 1988: Aburaya, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165, 872, 1989). Es wurde ebenfalls als ein Faktum bei Versuchen an Ratten bestätigt, daß pBNp ein vergleichbares Ausmaß an natriuretischen und hypotensivien Wirkungen wie (x-hANP hat. Es wurde daher bis heute gefunden, daß mindestens zwei offensichtlich verschiedene Typen (ANP und BNP) von Hormonen in Säugern vorkommen, und daß sie den homeostatischen Ausgleich des Körperflüssigkeitsvolumens und des Blutdrucks regulieren. Diese Peptide werden aus dem Atrium in das Blut ausgeschieden und arbeiten als Hormone, die den homeostatischen Ausgleich des Körperflüssigkeitsvolumens und des Blutdrucks regulieren. Ferner wurde gefunden, daß diese Peptide ebenfalls im Gehirn vorkommen, wo sie als Nerventransmitter für das Nervensystem unter Regulierung des homeostatischen Ausgleichs des Körperflüssigkeitsvolumens und des Blutdrucks arbeiten. Gleichzeitig zeigten die bis zum heutigen Tag durchgeführten Untersuchungen, daß drei Arten von Rezeptor-cDNA für diese Peptide kloniert werden, und ihre Strukturen wurden untersucht. Zwei der drei Rezeptortypen haben eine Guanylat-Cyclase-Domäne in ihrem intrazellulären Molekülteil, und der andere Typ, der im allgemeinen als ein C-Rezeptor bezeichnet wird (clearance receptor), hat keine Guanylat-Cyclase-Domäne in einem intrazellulären Teil des Moleküls (Chinkers, M. et al., Nature, 338, 78, 1989; Chang, M.S. et al., Nature, 341, 68, 1989; Schulz et al., Cell. 58, 1155, 1989; Fuller, F. et al., J. Biol. Chem., 263, 9395, 1988).
Jedoch wurden bis jetzt die Beziehungen zwischen diesen Rezeptoren und Liganden (ANP, BNP) nicht eindeutig aufgeklärt. In anderen Worten, es ist immer noch viel unklar über die Beziehungen zwischen den einzelnen Rezeptoren und deren ausgeübte physiologische Wirkungen, wie auch der Spezifität zwischen Ligand und Rezeptor.
Unter Berücksichtigung aller Punkt der vorstehenden Diskussion erhebt sich die Frage, ob die heute bekannten ANP und BNP die einzigen Hormone in Säugern sind, die den homeostatischen Ausgleich von Körperflüssigkeitsvolumen und Blutdruck regulieren. Insbesondere unter Berücksichtigungen der zuvor erwähnten Verschiedenheit der Rezeptoren besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit dafür, daß ein neues drittes Peptidhormon (neuer Ligand) neben dem ANP und BNP existieren könnte.
Jedoch ist bis heute unklar, ob ein solcher neuer Ligand existiert. Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, aus Säugern ein neues Peptidhormon zu isolieren, das physiologische Aktivitäten zeigt (z. B. natriuretische und hypotensive Wirkungen), ähnlich wie ANP und BNP, die bei Säugern bereits bekannt sind, jedoch klar von ihnen unterscheidbar ist, und ein Verfahren zur Bereitstellung der Peptide für die Industrie zur Verfügung zu stellen. Es wurde vom Erfinder gefunden, daß bei Isolierung und Reinigung von ANP und BNP eine Messung der Relaxationsaktivität unter Verwendung von Proben aus dem Hühner-Rectum als vergleichsweise einfache und doch verläßliche Methode für einen Biotest nützlich waren, und entwarf ein Projekt zur Entdeckung eines neuen Peptidhormons mit natriuretischer und hypotensiver Wirkung aus dem Schweinehirn unter Verwendung der Ergebnisse aus dem Biotest als Indikator.
Erfindungsgemäß wurde zunächst Schweinehirn in einem geeigneten sauren Lösungsmittel, z. B. Eisessig homogenisiert, und unter Verwendung davon als Ausgangsmaterial wurden Peptidfraktionen mit Molekulargewichten von ca. 3000 gereinigt, wobei die Ergebnisse des zuvor erwähnten Biotests als Indikator eingesetzt wurden, unter Kombination verschiedener Techniken, die üblicherweise bei der Peptidreinigung verwendet werden. Als Ergebnis konnte eine Peptid mit einer Relaxationsaktivität in einem Biotestsystem unter Verwendung von Proben aus dem Hühner-Rectum erfolgreich bis zu Homogenität und reinem Zustand wie in Fig. 2 gereinigt werden. In einem nächsten Schritt wurde ein Teil dieses Peptids reduziert, und die Cysteinreste im Peptid carboxymethyliert und dessen Aminosäurezusammensetzung bestimmt, was zeigte, daß es ein Peptid aus 22 Aminosäureresten mit 2 Cysteinresten war, wie in der folgenden Tabelle 1 gezeigt. Ferner wurde die Primär-Aminosäuresequenz des Peptids aufgeklärt, wobei schließlich gefunden wurde, daß es ein neues Peptid mit der folgenden Struktur war:
(worin (1)/(2) und (3)/(4) direkt miteinander verbunden sind, und beide Cysteinreste (Cys) an den Positionen 6 und 22 eine intramolekulare S-S-Bindung bilden).
Das neue Peptid wird im folgenden als "CNP (natriuretisches Peptid vom C- Typ)" bezeichnet.
Bei Vergleich von CNP mit (α-ANP und BNP aus dem Schwein hinsichtlich ihrer primären Aminosäuresequenz und Struktur (siehe Fig. 4) wurde gefunden, daß jedes dieser Peptide eine Ringstruktur bildete, die eine einzelne S-S- Bindung im Molekül hatte, und aus 17 Aminosäurresten aufgebaut war; es wurde ebenfalls gefunden, daß die Primär-Aminosäuresequenz, die diese Ringstruktur bildete, bei DNP, α-ANP und BNP hoch homogen war, wobei 12 der 17 Aminosäureresten die gleichen Aminosäurreste waren.
Jedoch hat mit Ausnahme des cyclischen Strukturteils CNP eine vollständige unterschiedliche Struktur von (x-ANP oder BNP in den N- und C-terminalen Teilen. Die besonders charakteristischen Eigenschaften im C-terminalen Teil sind: die C-terminalen Teile von α-ANP und BNP haben eine "Schwanz (tail)"- Struktur, in der wenige zusätzliche Aminosäurereste an dem Cysteinrest unter Bildung der Ringstruktur angeheftet sind, wogegen der C-Terminus von CNP ein Cysteinrest an Position 22 ist, an dem keine "Schwanz"-Struktur vorliegt.
Ferner zeigt CNP keine beobachtbare Homologie mit α-ANP und BNP hinsichtlich der Primär-Aminosäuresequenz im N-terminalen Teil. Aus diesen Fakten wurde gefunden, daß trotz seiner strukturellen Ähnlichkeit zum zuvor bekannten α-ANP oder BNP, CNP ein neues Peptid ist, das offensichtlich verschieden ist.
Hinsichtlich seiner strukturellen Ähnlichkeit mit α-hANP oder BNP kam der Erfinder zu der Vermutung, daß CNP natriuretische und hypotensive Wirkungen zeigen könnte, und verabreicht es in die Venen von Ratten zur Untersuchung des Auftretens natriuretischer und hypotensiver Wirkungen. Es wurde gefunden, daß CNP offensichtliche diese Wirkungen (siehe Tabelle 2) zeigte, worauf die vorliegende Erfindung abgeschlossen war. Der Erfinder führte daher intensive Untersuchungen unter dem Aspekt durch, um aus Säugern ein neues Peptidhormon zu finden, das physiologische Aktivität (z. B. natriuretische und hypotensive Wirkungen) ähnlich denen von ANP und BNP, die bereits bei Säugern bekannt waren, zu finden, das jedoch von diesen streng unterscheidbar war. Als Ergebnis isolierte der Erfinder erfolgreich ein neues Peptid (CNP) mit 22 Aminosäureresten aus dem Schweinehirn und bestimmte die Struktur des Peptids; gleichzeitig fand der Erfinder, daß dieses Peptid hervorragende natriuretische und hypotensive Wirkungen zeigte, auf Grundlage dessen die vorliegende Erfindung beruht.
Der Erfinder hat auch gefunden, daß das erfindungsgemäße Peptid eine wachstumshemmende Wirkung auf kultivierte vaskuläre glatte Muslkelzellinien hat und es wurde ferner gefunden, daß es eine Aktivität hat zur Förderung der Produktion von cyclischem Guanosin-Monophosphat (cGMP), welches als ein "second messenger" für die Relaxationswirkung im gleichen System angesehen wird. Unter Berücksichtigung dieser Aktivitäten, d. h. der Fähigkeit zur Unterdrückung des Wachstums vaskulärer glatter Muskelzellen und der cGMP-produzierenden Aktivität nimmt man an, daß das erf indungsgemäße Peptid möglicherweise als effektives Agens zur Behandlung von Atherosklerose eingesetzt werden kann.
Wie vorstehend beschrieben, haben das erfindungsgemäße Peptid und die Salze davon nicht nur eine gute den glatten Muskel-relaxierende Wirkung sondern auch uretische und natriuretische Wirkungen, wie auch eine hypotensive Wirkung; sie können daher geeignet als therapeutische Mittel für verschiedene Krankheiten, wie Herzödem, Naphrödem, hepatische Ödem, Bluthochdruck, kongestives Herzversagen, akute und chronische renale Insuffizienz, usw. eingesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Peptid kann in Form von Salzen mit Metallen wie Natrium, Kalium, Lithium und Kalzium, oder Salze mit organischen Basen vorliegen. Es kann auch in Form von Salzen mit Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, Salzsäure und Phosphorsäure, oder Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Maleinsäure vorliegen. Falls das erfindungsgemäße Peptid als Arzneimittel verwendet werden soll, kann es natürlich in seiner freien Form oder als pharmazeutisch annehmbares Salz vorliegen.
Das erfindungsgemäße Peptid oder sein pharmazeutisch annehmbares Salz ist vorzugsweise mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger, Exzipienten, Verdünner, usw. vermischt, die an sich bekannt sind, bevor es nach üblicherweise bei Peptidarzneimitteln verwendeten Verfahren verabreicht wird, nämlich durch parenterale Verabreichung, wie intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung. Bei peroraler Verabreichung wird die erfindungsgemäße Arzneimittelzusammensetzung im Verdauungstrakt abgebaut und daher ist dieses Verabreichungsverfahren im allgemeinen nicht effektiv. Es kann jedoch peroral als eine Präparation verabreicht werden, die gegenüber dem Abbau im Verdauungstrakt resistent ist, z. B. als Mikrokapsel, in der das erfindungsgemäße Peptid als Wirkstoff in einem Liposom eingebracht ist. Ein weiteres Verabreichungsverfahren, das angepaßt werden kann, ist die Absorption des Arzneimittels durch die Mukos-Membran aber nicht der des Verdauungstrakts, so z. B. dem Rectum, innerhalb der Nase oder unter der Zunge. In diesem Fall kann das Arzneimittel als Suppositorium, intranasaler Spray oder sublinguale Tabletten verabreicht werden.
Die Dosis der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann nach Art der Erkrankung, dem Alter des Patienten, seinem Körpergewicht, der Schwere der Erkrankung, dem Verabreichungsweg, usw. variieren, typischerweise kann sie in einer Dosis im Bereich von 0,1 ug/kg bis 100 mg/kg, vorzugsweise im Bereich von 0,5 ug/kg bis 5 mg/kg, besonders bevorzugt von 1 ug/kg bis 1 mg/kg verabreicht werden.
In den im folgenden beschriebenen Beispielen wurde CNP aus Schweinehirn isoliert und gereinigt; da jedoch die Struktur des CNPs in der vorliegenden Erfindung entschlüsselt wurde, ist es selbstverständlich, daß CNP auch nach bekannten Verfahren der chemischen Synthese oder Genmanipulation hergestellt werden kann.
Fig. 1 ist eine graphische Darstellung eines Elutionsprofils, erhalten, wenn ein Extrakt aus Schweinehirn (z. B. Peptidfraktionen mit Molekulargewichten von ca. 3000, die durch Fraktionierung von SP-III-Franktionen auf Sephadex G-50 und G-25 erhalten wurden) weiter durch CM-Ionenaustauschchromatographie gereinigt wurden, wie auch die Hühner-Rectum-Relaxationsaktivität der erhaltenen Fraktionen;
Fig. 2 ist eine grafische Auftragung eines Elutionsprofils einer Umkehrphasen-HPLC unter bei der Schlußreinigung von CNP, wie auch die Hühner- Rectum-Relaxationsaktivität der erhaltenen Fraktionen;
Fig. 3 ist eine grafische Auftragung der Ausbeute von PTH-Aminosäure, die durch sukzessive Zyklen des Edman-Abbaus von (RCM) CNP erhalten wurden, wie auch der Aminosäuresequenz der PTH-Aminosäure; jede Aminosäure wird durch die angegebene Abkürzung dargestellt und Cm steht für einen S-Carboxymethylcysteinrest;
Fig. 4 ist eine graf ische Auftragung der Primär-Aminsäuresequenzen von Schweine-α-hANP, BNP und CNP wie auch Homologie unter der Primär-Aminsäuresequenzen dieser Peptide; und
Fig. 5 ist eine grafische Auftragung der Aktivität von CNP, ANP und 8-BrcGMP bei der Blockade der Thymidinaufnahme.
Die Erfindung wird im folgenden in Einzelheiten durch die Beispiele beschrieben.

BEISPIEL 1: Isolierung und Reinigung von CNP aus Schweinehirn.

40 kg Hirn wurden aus 480 Schweinen entnommen und zermahlen, wobei die Protease durch Behandlung mit 2 Volumen an kochendem Wasser für 5 Minuten inaktiviert wurde. Nach Abkühlen wurde Eisessig unter Erhalt einer Endkonzentration von 1 M zugegeben. Das so behandelte Gewebe wurde mit einem Polytron-Mischer homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenat zentrifugiert, wobei es in eine Präzipitatfraktion und in einen Überstand aufgetrennt wurde, welcher mit einer Pelliconkassette (PCAC #000-05, Millipore) konzentriert wurde. Zum Konzentrat wurde Aceton zugegeben (Endkonzentration 66 %) und das erhaltene Präzipitat wurde durch Zentrifugation entfernt, wobei der Überstand unter Vakuum konzentriert wurde. Das erhaltene Konzentrat wurde in 0,5 M Essigsäure gelöst, und die Lösung wurde auf eine C-18-Kieselgelsäule gegeben (Fassungsvermögen 1,5 l; LC-SORB SPW-C-ODS, Chemco) in vier abgeteilten Portionen. Die auf der Säule adsorbierten Peptide wurden mit einer Lösung aus Wasser, Acetonitril (CH&sub3;CN) und 10 % Trifluoressigsäure (TFE) in einem Verhältnis von 40:60:1 (V/V) eluiert. Unter Konzentrierung des Eluats wurde ein Rückstand aus Peptiden mit einem Trockengewicht von 26 g erhalten. Die Hälfte dieses Rückstands wurde in 1 M Essigsäure gelöst und in Ionenaustauschchromatographie auf einer SP-Sephadex-C-25-Säule (H&spplus;-Form, 3 x 38 cm), die mit 1 M Essigsäure äquilibriert war, unterzogen. Die auf der Säule adsorbierten Peptide wurden der Reihe nach mit 1 M Essigsäure, 2 M Pyridin und 2 M Pyridinessigsäure (pH 5,0) in der angegebenen Reihenfolge eluiert. Die so erhaltene Fraktionen wurden SP-I, SP-II und SP-III bezeichnet und lyophilisiert. Die so erhaltene Fraktion SP-III (Trockengewicht 5,2 g) wurde einer Gelfiltration auf Sephadex-G-50-Säule (fein, 7,5 x 145 cm), Pharmazia) unterzogen, wobei Fraktionen mit Peptiden mit Molekulargewichten von ca. 1000 bis 5000 mit einem Trockengewicht von 2,96 g erhalten wurden. Weiter wurden diese Fraktionen auf einer Sephades-G-50-Säulegel filtriert (fein, 7,5 x 150 cm, Pharmacia), wobei Peptidfraktionen mit Molekulargewichten von ca. 3000 in einem Trockengewicht von 440 mg erhalten wurden. Anschließend wurden diese Fraktionen weiter mit CM (CM-52, 2,4 x 52,5 cm, Whatman) Ionenaustauschchromatographie (Elutionslösung A: 10 mM HCOONH&sub4; (pH 6,6)/CH&sub3;CN = 90/10 (V/V); Elutionslösung B: 0,5M HCOONH&sub4; (pH 6,6)/CH&sub3;CN = 90/10 (V/V); Elutionsbedingungen: linearer Dichtegradient unter Verwendung der Elutionslösungen A und B; Flußrate: 35 ml/h; Fraktionsgröße: 20 ml/Röhrchen) (siehe Fig. 1) und es wurden Fraktionen #51 bis 53, wie in Fig. 1 gezeigt, gesammelt. Anschließend wurden diese Fraktionen (29 mg) einer Immunaffinitäts-Chromatographie unter Verwendung eine Anti-ANP-Antikörpers (Einzelheiten der Säulenherstellung sind in dem folgenden Bericht des Erfinders beschrieben: Ueda, S. et al., Biochm. Biophys. Res. Commun., 1987, 149, 1055-1067) und die auf der Säule adsorbierten Peptide wurden mit 1 M Essigsäurelösung, enthaltend 10 % CH&sub3;CN, eluiert. Für die endgültige Reinigung des neuen erfindungsgemäßen physiologisch aktiven Peptids wurden die Peptidfraktionen auf der zuvor erwähnte Immunaffinitätssäule getrennt und durch Umkehrphasen-HPLC (Flußrate: 1 ml/min; Elutionslösung A: H&sub2;O/CH&sub3;CN/10 % TFE = 90/10/1 (V/V); Elutionslösung B: H&sub2;O/CH&sub3;CN/10 % TFE = 40/60/1 (V/V); Elutionsbedingungen: linearer Dichtegradient unter Verwendung der Elutionslösungen A und B; Elutionszeit:
120 Minuten) unter Verwendung einer Diphenylsäule (219 TP54, 4,6 x 250 mm, Vydac) gereinigt, und die erhaltenen Fraktionen wurden auf Relaxationsaktivität an Proben des Hühner-Rectums getestet. Als Ergebnis konnte ein Peptid mit Relaxationsaktivität bei Proben von Hühner-Rectum (siehe Fig. 2), erfolgreich gereinigt werden, bis es einen einzelnen Peak zeigte und es wurde als "CNP" bezeichnet. die Ausbeute an CNP war ca. 1 ug (400 pmol), ausgehend von 40 kg Schweinehirn.

BEISPIEL 2: Aufklärung der Struktur von CNP

A. S-Carboxymethylierung von CNP

Dreiviertel des in Beispiel 1 erhaltenen CNPs wurden einer Reaktion von 0,5 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) bei 37ºC für 4 Stunden unter Verwendung von 50 mM Dithiothreitol (DTT), unterzogen, und anschließend wurden 100 mM Jodacetat zugegeben, worauf sich eine 5-minütige Behandlung unter Erhalt von (RCM) CNP, oder eines S-carboxymethylierten Produkts von CNP anschloß.

B. Aufklärung der Aminosäursequenz von (RCM) CNP

Ca. 150 pmol von (RCM) CNP, erhalten in Beispiel 2A wurden zunächst in 6 N Salzsäure, die 0,1 % Phenol und =,02 % 2-Mercaptoethanol enthielt, bei 110ºC 24 Stunden behandelt, wodurch (RCM) CNP vollständig hydrolysiert wurde. Anschließend wurde die Probe auf ihre Aminosäure-Zusammensetzung von (RCM) CNP unter Verwendung eines Aminosäure-Analysators (L-8500 von Hitachi, Ltd.) analysiert. Die erhaltenen Daten sind in Tabelle 1 gezeigt, die darauf hinwiesen, daß das CNP von Interesse ein Peptid, zusammengesetzt aus 22 Aminosäureresten mit 2 Cysteinresten, war.
Tabelle 1 zeigt die Aminosäuresequenz von (RCM) CNP. Die Werte in Klammern sind ganze Zahlen, die den gemessenen Werten am nächsten liegen, und CmCys bedeutet S-Carboxymethylcystein. TABELLE 1 Gesamt
C. Aufklärung der Primär-Aminosäuresequenz von (RCM) CNP Ca. 150 pmol von (RCM) CNP, hergestellt in Beispiel 2A, wurden auf einen automatischen Aminosäuresequenzator (Applied Biosystems 470A/120A) gegeben und die Primär-Aminosäuresequenz wurde durch Edman-Abbau analysiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt und ermöglichten die Bestimmung der Primer-Aminsäuresequenz von (RCM) CNP.
D. Chemische Synthese von CNP und Identifizierung der S-S-Bindungsart Die Primär-Aminosäuresequenz, bestimmt in Beispiels 2C, wurde als Ausgang für die Synthese von CNP durch Festphasen-Syntheseverfahren mit einem Peptidsynthesator (Applied Biosystems 430A) verwendet.
Bei der Synthese wurde 4-Methylbenzyl als Gruppe zum Schutz von SH in den Cysteingruppen, und HF zur vollständigen Entfernung der Schutzgruppen verwendet, worauf sich Behandlung der SH-Gruppen in den Cysteinresten an Positionen 6 und 22 des CNPs mit Kaliumeisen-(III)-Cyanat [K&sub3;Fe(CN)&sub6;] unter Bildung einer intramolekularen S-S-Bindung anschloß. Die Struktur des so synthetisierten CNPs wurde mit der Aminosäureanalyse überprüft, und durch Analyse der Primär-Aminosäuresequenz. Ferner stimmte das chemisch synthetisierte CNP vollständig mit dem natürlich vorkommenden CNP aus Beispiel 1 hinsichtlich seiner Elutionszeit in der HPLC überein, so daß schließlich die Struktur des CNPs wie folgt bestimmt wurde.
(worin (1)/(2) und (3)/(4) direkt miteinander verbunden sind, und beide Cysteinreste (Cys) an den Positionen 6 und 22 eine intramolekulare S-S-Bindung bilden).

BEISPIEL 3: Biologische Eigenschaften von CNP

A. Hühner-Rectum-Relaxationsaktivität von CNP
Die Hühner-Rectum-Relaxationsaktivität wurde nach dem Verfahren von Currie et al. (Currie et al., Nature, 221, 1-13, 1983) gemessen. In diesem Meßsystem zeigte CNP eine ca. 3- bis 4-fach so hohe Aktivität wie α-hANP.

B. Natriuretische und hypotensive Wirkungen von CNP

Männliche SB-Ratten (Körpergewicht: 230 bis 290 g) wurden durch intraperitoneale Injektion mit 65 mg/kg Pentobarbital anästhesiert und mit einer Tracheotomie-Röhre (PE-240 von Clay Adams) versehen, um den Atemwegstrakt sicherzustellen. Eine Kanüle (PE-50) für Blutdruckmessungen wurde in die Hüftarterie eingeführt und Ringer's-Lösung wurde mit einer stehenden Flußrate von 1,8 ml/h durch eine in die Hüftvene eingeführte Kanüle (PE-10) injiziert. Eine Urinprobe wurde in eine Teströhrchen durch eine cystische Kanüle in Form einer Silastic-Röhre (innerer Durchmesser: 0,02 inch; äußerer Durchmesser: 0,037 inch; Dow Corning) aufgenommen. Die Urinproben jeweils 15 Minuten vor der Verabreichung der Testsubstanz und bis 15 Minuten nach Verabreichung in 5-minütigen Abständen entnommen, worauf eine anschließende Probenentnahme zu vorgegebenen Zeitintervallen folgte. Der Vergleich der Menge einer jeden Probe mit der Konzentration des darin enthaltenen Elektrolyten, wie auch durch Messungen der Blutdruckveränderungen wurden die Wirkungen der Testsubstanz bewertet.
Die Testsubstanz CNP wurde in einer bestimmten Mengen in 0,1 N Essigsäure gelöst und anschließend mit 1/10 Volumen von 1,3 M Tris-Lösung neutralisiert. Die Probe wurde mit 50 ul sterilisierter physiologischer Kochsalzlösung verdünnt und über die cerivicale Vene verabreicht. Wie in Tabelle 2 gezeigt, fand man, daß CNP natriuretische und hypotensive Wirkungen zeigte, und es wurde ebenfalls gefunden, daß diese Wirkungen in einer Dosis-abhängigen Art anstiegen.
Tabelle 2 zeigt die natriuretischen und hypotensiven Wirkungen von CNP. TABELLE 2 CNP-Dosis (nmol/kg) Urinausscheidung % Na&spplus; -Ausscheidung % K&spplus;-Ausscheidung % Cl&supmin;-Ausscheidung % Blutdruckabfall (mmHg)
Die Daten sind als Mittelwerte ± Standardabweichung angegeben, wie von einer jeden Gruppe aus 4 Tieren aufgrund der Veränderung erhalten wurden, die in dem 15-minütigen Zeitraum ab der Verabreichung der Testsubstanz im Vergleich zum Zustand vor der Verabreichung auftraten.

C. Messung der Zellwachstums-unterdrückende Aktivität

Die Zellwachstums-unterdrückende Aktivität wurde nach dem Verfahren von Kariya et al. bestimmt (Atherosclerosis, 80, 143-147, 1990) durch Messung der Aufnahme von ³H-Thymidin in Zellen als ein Indikator der DNA-Syntheseaktivität unter Verwendung von VSMC von Ratten. Zellen die auf stationäre Phase eingestellt wurden, wurden mit 1 % Serum bei 37ºC 14 Stunden zusammen mit verschiedenen Konzentrationen von α-hANP oder CNP inkubiert, worauf sich die Zugabe von 37 KBq/ml [³H]-Thymidin anschloß, die Inkubation wurde weitere 4 Stunden fortgesetzt. Die Radioaktivität von [³H]-Thymidin, das in die Zellen eingebaut wurde, wurde gemessen. Die Meßwerte waren derart, daß die Radioaktivität von [³H]-Thymidin im Falle, wo nur 1 % Serum in Abwesenheit eines Peptids zugegeben wurde, als 100 % gesetzt wurde, wobei die Unterdrückung aufgrund des Peptids bei der entsprechenden Konzentration in Prozent entsprechend berechnet wurde.
Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.

INDUSTRIELLE ANWENDBAKKEIT

Wie oben beschrieben gelang dem Erfinder die Isolierung und Reinigung eines neuen physiologisch aktiven Peptids aus dem Schweinehirn unter Verwendung von Hühner-Rectum-Relaxationsaktivität als Indikator; der Erfinder klärte nicht nur die Struktur dieses Peptids auf, sondern fand auch, daß dieses Peptid natriuretische und hypotensive Wirkungen zeigte. Zusammengefaßt offenbarte die Erfindung das Vorkommen eines dritten Hormons in Säugern neben α-hANP und BNP, die bereits als Hormone zur Regulierung des homeostatischen Ausgleichs des Körperflüssigkeitsvolumens und des Blutdrucks bekannt sind, und dieses wird einen großen Einfluß auf zukünftige Anstrengungen zur Aufklärung des Mechanismuses, nachdem der homeostatische Ausgleich in dem Körperflüssigkeitsvolumen und dem Blutdruck in Säugern aufrechterhalten wird, haben.
Ferner im Hinblick auf seine Fähigkeit zur Unterdrückung des Wachstums von vaskulären glatten Muskelzellen und der cGMP-produzierenden Aktivität nimmt man an, daß das erfindungsgemäße Peptid als potentielles effektives therapeutisches Mittel für Atherosklerose dienen wird.

Claims

1. Peptid mit der folgenden Strukturformel oder ein Säureadditionssalz davon:

(worin (1)/(2) und (3)/(4) direkt miteinander verbunden sind, und beide Cysteinreste (Cys) an den Positionen 6 und 22 eine intramolekulare S-S-Bindung bilden).

2. Verwendung eines Peptids mit der Strukturformel nach Anspruch 1 oder eines Säureadditionssalzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von cardialen Ödem, Nephrödem, hepatischen Ödem, Bluthochdruck, kongestivem Herzversagen, akuter oder chronischer renaler Insuffizienz oder Atherosklerose.

3. Verwendung eines Peptids mit der Strukturformel nach Anspruch 1 oder eines Säureadditionssalzes davon zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung einer Erkrankung, die durch anormales Wachstum von vaskulären glatten Muskelzellen verursacht ist.