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Diese
Erfindung betrifft das Gen und die cDNA eines vom Schwein stammenden
CNP (natriuretisches Peptid des C-Typs) sowie ein vom Schwein stammendes
CNP-Vorläuferprotein.
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Peptide,
die zwei verschiedenen Peptidfamilien, die "atriales natriuretisches Peptid (ANP)" und "Hirnnatriuretisches
Peptid (BNP)" genannt
werden, zuzuordnen sind, wurden kürzlich als Hormone oder Nerventransmitter
entdeckt, die das homöostatische
Gleichgewicht des Körperflüssigkeitsvolumens
und den Blutdruck in vivo regeln. Die Strukturen dieser Peptide,
der Mechanismus ihrer Biosynthese sowie ihre physiologischen Wirkungen
sind auch aufgeklärt
worden.
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Erst
kürzlich
entdeckten die Erfinder im Gehirn von Schweinen ein neues Peptid,
das "natriuretisches Peptid
(CNP) des C-Typs" genannt
wurde und das zu einer dritten Familie von Peptiden gehört.
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Der
erste Hinweis auf die Entdeckung von ANP wurde von de Bold et al.
1981 berichtet. Angesichts der Feststellung, daß bedeutender Harnfluß auftrat,
wenn ein atrialer Rohextrakt von Ratten intravenös in eine andere Ratte injiziert
wurde, berichteten de Bold et al. über das Vorhandensein eines
die Natriurese anregenden Faktors im Atrium (de Bold et al. Life
Sci., 28, 89, 1981). Kangawa K. et al. isolierten später diesen
Faktor aus dem menschlichen Atrium, klärten seine Struktur auf und nannten
ihn "atriales natriuretisches
Peptid (ANP)" (Kangawa
K. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 118, 131, 1984; Kangawa
K. et al., Nature, 313, 397, 1985;
japanische
Patentveröffentlichung
Nr. 19520/1988 ;
japanische
Patentoffenlegung Nr. 184098/1985 und
260596/1985 ). Es wurde festgestellt,
daß menschliches
ANP (hANP), wie es im Atrium vorkommt, sich gemäß des Molekulargewichts in
drei Typen, den α-, β- und γ-Typ einteilen
läßt, wobei
der α-Typ
hANP (α-hANP)
ein einzelsträngiges
Peptid ist, das aus 28 Aminosäuren
besteht und eine einzige S-S-Bindung in dem Molekül besitzt;
der β-Typ
hANP (β-hANP)
ist ein antiparalleles Dimer mit einer zwischen den α-hANP Molekülen vorliegenden
S-S-Bindung; und der γ-Typ
hANP (γ-hANP)
ist ein hochmolekulares Protein, bestehend aus 126 Aminosäuren, wobei α-hANP in
dem C-terminalen Teil enthalten ist. Außerdem ist die cDNA von hANP
isoliert worden, und die Biosynthesewege von α-, β- und γ-hANP wurden auf der Grundlage
der Analyse dieser cDNA identifiziert, was zu der Schlußfolgerung
führte,
daß jeder
dieser drei hANP-Typen
von einem gemeinsamen Vorläuferprotein
biosynthetisiert wird (Oikawa, S. et al., Nature 309, 724, 1984).
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Es
ist bereits bekannt, daß von
diesen drei hANP-Typen das α-hANP
hauptsächlich
ins Blut abgesondert wird.
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Seit
die Struktur von hANP aufgeklärt
wurde, sind die Strukturen von ANPs, die von anderen Säugern abstammen,
auch untersucht worden (
japanische
Patentoffenlegung Nrn. 184097/1985 und
7298/1986 ) und heute sind die folgenden
Kenntnisse verfügbar:
ANPs haben ähnliche
Aminosäuresequenzen
bei einem breiten Spektrum von Säugern,
das sich von Nagern bis zu Menschen erstreckt; α-Typ ANP (α-ANP) hat die gleiche Aminosäuresequenz
in höheren
Säugern
einschließlich
Menschen, Hunden und Schweinen; und α-Typ ANPs, die von Ratten und
Kaninchen stammen, haben vollständig
die gleiche Aminosäuresequenz
wie α-hANP,
außer
daß der
Methioninrest an der Position 12 durch einen Isoleucinrest ausgetauscht
ist (Oikawa, S. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 132, 892,
1985; Forssmann, W. G. et al., Anat. Embryol., 168, 307, 1983).
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Das
erste ANP-Isolat wurde aus dem Atrium gewonnen und spätere Studien,
die sich mit der Herstellung von Anti-ANP-Antikörpern und Untersuchungen ihrer
Verteilung in vivo beschäftigten,
haben gezeigt, daß ANP
sowohl im Gehirn als auch im Atrium vorkommt, außer daß im Gehirn der N-Terminus
von α-ANP
abgeschnitten ist unter Erhalt eines kürzeren α-ANPs [4-28] und α-ANP [5-28]
(Ueda et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 1055, 1987).
Da über
ANP-enthaltende Nervenzellen berichtet wurde, daß sie im Hypothalamus und im
Tegmentum Pontis vorkommen (Cantin, M. et al., Histochemistry, 80,
113, 1984; Saper, C. B. et al., Science, 227, 1047, 1985), wird
heute spekuliert, daß ANP
auch im Gehirn als ein Nerventransmitter wirken kann, der an der
Regelung des cardiovaskulären
Systems teilhat. Die physiologischen Wirkungen von ANP sind mannigfaltig
und sind nicht auf eine bedeutende natriuretische Wirkung allein
beschränkt;
es wurde kürzlich
festgellt, daß es
nicht nur den Blutdruck senken, sondern auch die Herstellung von
Aldosteron in der Nebennierenrinde unterdrücken kann. Es ist daher heute
klar, daß ANP,
da es vom Atrium ins Blut abgesondert wird, nicht nur als ein Hormon
wirkt, das das homöostatische
Gleichgewicht des Körperflüssigkeitsvolumens und
des Blutdrucks regelt, sondern daß es im Gehirn auch als Nerventransmitter
des Nervensystems wirkt, wobei es das homeostatische Gleichgewicht
des Körperflüssigkeitsvolumens
und des Blutdrucks regelt.
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Hirn-natriuretisches
Peptid (BNP) wurde zuerst aus Schweinehirn isoliert und von Sudoh
et al. 1988 identifiziert (Sudoh, T. et al., Nature, 332, 78, 1988).
Das erste BNP-Isolat (pBNP-26) ist ein Peptid, das aus 26 Aminosäureresten
zusammengesetzt ist und eine einzige S-S-Bindung in dem Molekül besitzt und, obwohl es in
der Struktur ähnlich
zu ANP ist, d. h. hinsichtlich der primären Aminosäuresequenz und dem Modus der S-S-Bindung
(die eine Ringstruktur, bestehend aus 17 Aminosäureresten bildet), ist BNP
eindeutig von ANP unterscheidbar. Im Fall von ANP sind die natriuretischen
und hypotensiven Wirkungen für
BNP bestätigt
worden, das daher "Hirn
natriuretisches Peptid (BNP)" genannt
wurde. Zu einem späteren
Zeitpunkt wurde pBNP-32, das aus 32 Aminosäureresten mit 6 Aminosäureresten,
die an dem N-Terminus
von pBNP-26 gebunden sind, zusammengesetzt ist aus Schweinehirn
isoliert (Sudoh, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 115,
726, 1988); außerdem
wurde aus Schweineatrium ein Peptid, genannt "γ-BNP", das aus 106 Aminosäuren zusammengesetzt
ist, isoliert und identifiziert (Minamino, N. et al., Biochem. Biophys.
Res. Commun., 157 , 402, 1988).
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Heute
sind die cDNAs von menschlichem und Ratten-BNPs isoliert und die
Strukturen der Vorläufer dieser
BNPs sind auch aufgelöst
worden (Sudoh, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 1427,
1989; Kojima, M. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 1420,
1989).
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Auf
Grundlage dieser Ergebnisse wurde festgestellt, daß die Peptide
der BNP-Familie von Vorläufern biosynthetisiert
werden, die völlig
unterschiedlich von ANP sind.
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Wie
bereits erwähnt,
wurde BNP zunächst
aus dem Gehirn isoliert. Es wurde später festgestellt, daß BNP in
Schweinehirn in einer Menge zehnmal größer als ANP vorhanden ist und
daß, wie
ANP, BNP auch im Atrium vorkommt (obwohl in einer Menge von nur
2 bis 3% von ANP), das ins Blut abgesondert wird (Minamino, N. et
al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 155, 740, 1988; Aburaya, M.
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165, 872, 1989). Aufgrund
dieser Tatsachen wurde festgestellt, daß wie ANP, BNP als Nerventransmitter im
Gehirn und auch als Hormon, das aus dem Atrium ins Blut abgesondert
wird, wirkt, wobei es in beiden Fällen dazu beiträgt, das
homöostatische
Gleichgewicht des Körperflüssigkeitsvolumens
und den Blutdruck zu regeln. Wie für natriuretische Peptide veranschaulicht,
kann nicht ein einziges Peptid, aber eine Mehrheit von Peptiden
an der Regulierung einer bestimmten physiologischen Wirkung in vivo
teilnehmen (z. B. Homöeostase
der Körperflüssigkeit
und des Blutdrucks); und opioide Peptide, Tachykinin und Endothelin
sind bisher als Beispiele solcher Peptide bekannt. Es ist festgestellt
worden, daß drei
verschiedene Familien für
jedes dieser Peptide vorkommen (Hollt, V., Trend Neuro Sci., 6,
24, 1983; Nakanishi, S., Physiol. Review, 67, 1117, 1987; Inoue,
A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2863, 1989). Dies hat
die Möglichkeit
verstärkt,
daß, abgesehen von
natriuretischen Proteinen, die bisher den ANP- und BNP-Familien
zuzuordnen sind, Peptide, die in eine dritte Familie eingestuft
werden können,
vorkommen können.
In dieser Hinsicht waren die Erfinder kürzlich erfolgreich zwei neue
Peptide aus dem Schweinehirn zu entdecken, die weder der ANP- noch
der BNP-Familie, aber einer dritten Familie von natriuretischen
Peptiden angehören.
Diese Peptide wurden "natriuretische
Peptide des C-Typs (CNP)" genannt.
Sudoh T. et al. haben ein natriuretisches Peptid vom Typ C (CNP)
identifiziert, das ein neues Mitglied der Familie der natriuretischen
Peptide ist. Das dort offenbarte Peptid ist aus Schweinehirnextrakten
gewonnen worden. Das erste entdeckte CNP war ein Peptid, das aus
22 Aminosäuren
zusammengesetzt ist (dieses Peptid ist hiernach als "CNP-22" abgekürzt. Die
Struktur dieses Peptids ist ähnlich,
aber eindeutig unterschiedlich zu denjenigen von ANP und BNP. Spezifischer
gesagt, ist CNP-22 dahingehend ähnlich
zu ANP und BNP, daß es
basierend auf der intramolekularen S-S-Bindung eine Ringstruktur,
die aus 17 Aminosäuren
zusammengesetzt ist, besitzt und daß die primäre Aminosäuresequenz, die diese Ringstruktur in
CNP-22 bildet, zu denen von α-BNP
und BNP-32 sehr homolog ist. In der Tat waren 12 von 17 Aminosäureresten
unter diesen drei Peptiden identisch. Außer dem Anteil der Ringstruktur
ist CNP-22 jedoch in seinen N- und C-terminalen Anteilen völlig unterschiedlich
zu α-ANP
und BNP-32. Ein besonders kennzeichnendes Merkmal wurde in der Struktur
des C-terminalen Anteils festgestellt; in dem Fall von α-ANP sind
5 Aminosäurereste
(in dem Fall von BNP-32 6 Aminosäurereste)
an dem C-Terminus des Cysteinrestes vorhanden, die eine Ringstruktur
bilden, wodurch eine "Schwanz-"Struktur hergestellt
wird, aber ein solche "Schwanz-"Struktur ist in CNP-22
nicht vorhanden, da sein C-Terminus ein Cysteinrest ist.
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Wie
oben beschrieben, hat CNP-22 offensichtlich eine andere Struktur
als α-ANP
und BNP-32; zusätzlich
wurde bestätigt,
daß, wenn
CNP-22 an Ratten verabreicht wird, es offensichtliche natriuretische
und hypotensive Wirkungen entfaltet; es ist daher festgestellt worden,
daß CNP-22
ein neues Peptid ist, das einer dritten Familie von natriuretischen
Peptiden in vivo angehört
(
Japanische Patentanmeldung
Nr. 105047/1990 ). Die Erfinder stellten später Anti-CNP22-Antikörper her
und reinigten aus Schweinehirn die Peptide, die Immunreaktivität mit diesen
Antikörpern
entfalteten. Folglich isolierten die Erfinder erfolgreich ein Peptid,
das "CNP-53" genannt wird. Eine
Analyse seiner Struktur zeigte, daß CNP-53 ein Peptid ist, das
aus 53 Aminosäureresten
besteht, wobei es am C-Terminus CNP-22 enthält, nämlich ein Peptid ist mit 31
zusätzlichen
Aminosäureresten,
die an den C-Terminus von CNP-22 gebunden sind (siehe die gemeinsam
zugeschriebene Patentanmeldung
EP
91 111 629 , die am selben Tag dieser Anmeldung eingereicht
wurde).
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Kurzgefasst
wurden bis heute folgende Beobachtungen erhalten: mindestens drei
Familien (die ANP-, BNP- und CNP-Familie) von natriuretischen Peptiden
mit offensichtlich unterschiedlichen Strukturen kommen in Säugern vor;
Peptide der ANP- und BNP-Familien werden nicht nur aus dem Atrium
ins Blut abgesondert und wirken als Hormone, die das homeostatische
Gleichgewicht des Körperflüssigkeitsvolumens
und den Blutdruck regeln; sie werden auch im Gehirn biosynthetisiert,
wo sie als Nerventransmitter für
das Nervensystem wirken, indem sie das homöostatische Gleichgewicht des
Körperflüssigkeitsvolumens
und den Blutdruck regeln. Die kürzlich
entdeckten Peptide der CNP-Familie (CNP-22 und CNP-53 kommen jedoch
in wesentlich kleineren Mengen im Gehirn vor, als ANP und BNP, und
bis heute wurden keine detaillierten Informationen in Bezug auf
den Mechanismus der CNP-Synthese, ihre Verteilung in vivo und physiologischen
Wirkungen erhalten.
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Diese
Erfindung ist unter diesen Voraussetzungen bewerkstelligt worden
und Aufgabe ist es, die Gene und cDNAs von Schweine-CNP-22 zu isolieren
und untersuchen. Dies kann zu Vorläufern führen, um die primäre Aminosäuresequenz
des Vorläuferproteins
von Schweine-CNP zu identifizieren, und kann auch ein Verfahren
zur Herstellung durch Genmanipulation des ganzen oder eines Teils
des Proteins, der durch das Gen dieses Vorläuferproteins codiert wird,
bereitzustellen.
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1 ist
ein Diagramm, in dem die Basensequenzen der synthetischen DNA-Primer
(KF 225 und KF 226), die zum spezifischen Amplifizieren des CNP-53-codierenden Genbereichs
eines chromosomalen Schweinegens mit PCR verwendet werden, und die
DNA-Mischsonde (KF 209), die zum Isolieren des Gens verwendet wird,
zusammen mit der CNP-53 Aminosäuresequenz
gezeigt sind;
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2(a) ist eine Restriktionsenzymkarte für das chromosomale
Gen (BamHI DNA-Fragment) eines Schweine-CNP-Vorläuferproteins;
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2(b) ist eine graphische Darstellung, die die
Strategie der Bestimmung der DNA-Basensequenz des Gens zeigt;
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2(c) ist eine graphische Darstellung, die die
Basensequenz des synthetischen DNA-Primers, der bei der Bestimmung
der Basensequenz verwendet wird, zeigt;
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3 ist
eine graphische Darstellung, die die Basensequenz des chromosomalen
Gens (BamHI DNA-Fragment),
die für
das Schweine-CNP-Vorläuferprotein
codiert und die primäre
Aminosäuresequenz
des Schweine-CNP-Vorläuferproteins,
die durch die Exone in dem Strukturgenbereich codiert ist, zeigt;
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4 veranschaulicht
wie ein Tierzellen-Expressionsvektor
pSV2CNP hergestellt wird;
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5 ist
ein Diagramm, das die ganze Basensequenz der CNP cDNA und der primären Aminosäuresequenz
des Schweine-CNP-Vorläuferproteins,
die durch die cDNA codiert ist, zeigt; und
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6 ist
ein Diagramm, das das Elutionsprofil, das durch Trennen der in dem
Kulturüberstand
von COS-1/pSV2CNP1 Zellen enthaltenen Proteine und Peptide auf einer
Sephadex G-75 Gelfiltrationssäule
zeigt, sowie die Immunreaktivität
der resultierenden Elutionsfraktionen mit einem Anti-CNP-22-Antiserum.
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Die
durch die Erfinder zuvor isolierten CNP-22 und CNP-53 kommen im
Schweinehirn im Vergleich zu ANP und BNP in viel kleineren Mengen
vor. Außerdem
muß das
für die
Herstellung dieser Peptide im Gehirn verantwortliche Gewebe noch
identifiziert werden. Wegen dieser Umstände dachten die Erfinder, daß es schwierig
sein würde,
die für
CNP entsprechende cDNA direkt zu isolieren und die Struktur des
CNP-Vorläuferproteins
auf Basis der Untersuchung dieser cDNA zu identifizieren. Stattdessen
planten die Erfinder ein Projekt zur Isolierung des CNP-Gens des Schweinechromosoms
und die Identifizierung der Struktur des Schweine-CNP Vorläuferproteins
durch Analysieren des isolierten Chromosoms.
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In
dieser Erfindung wurde eine für
das Isolieren des CNP-Gens
zu verwendende DNA-Sonde durch das folgende Verfahren hergestellt.
Zunächst
wurden, wie in 1 gezeigt, DNA-Primer (KF 225
und KF 226), die der primären Aminosäuresequenz
von CNP-53 in den N- und C-terminalen Anteilen entsprechen, hergestellt.
In 1 bedeutet N, das in der Basensequenz von KF 206
vorkommt, entweder A, T, C oder G. Unter Verwendung dieser Primer
wurde dann die Polymerasekettenreaktion (PCR) gemäß des Verfahrens
von Saiki et al. (Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487, 1988)
durchgeführt,
wobei nur der DNA-Bereich des chromosomalen Schweinegens, der für die primäre Aminosäuresequenz
von CNP codiert, spezifisch amplifiziert wurde. Die amplifizierte
DNA wurde, bevor ein Klon (DH1/pCNP5), der die gewünschte DNA
umfaßte,
isoliert wurde, in einen Plasmidvektor eingebracht.
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Das
Plasmid pCNP5 wurde von dem so erhaltenen DH1/pCNP5 zurückgewonnen
und untersucht, um zu bestätigen,
daß es
ein DNA-Fragment, zusammengesetzt aus 167 Basenpaaren (bp), das
durch PCR amplifiziert worden ist, enthält (dieses DNA-Fragment ist
hier als DC-53 abgekürzt)
und daß DC-53
eine DNA ist, die für
die primäre
Aminosäuresequenz
von CNP-53 codiert. Durch diese Ergebnisse wurde zumindestens klar,
daß keine
Introne in dem Genbereich, der für
die primäre
Aminosäuresequenz
von CNP-53 codiert, enthalten sind. Anschließend wurde die so hergestellte
DNA-Sonde (DC53) verwendet, um eine chromosomalen Schweine-Genbibliothek
zu screenen (wobei in einem γ-Phagen
das chromosomale Genfragment eingeführt ist), wodurch ein Klon
(γ-CNP6),
der mit DC-53 hybridisiert, erhalten wurde. Aufgrund der Analyse
wurde festgestellt, daß der
Klon γ-CNP6
ca. 14 kbp des chromosomalen Schweinegens enthält. Es wurde außerdem festgestellt,
daß ein
BamHI-DNA-Fragment, zusammengesetzt aus ca. 2 kbp dieser 14 kbp
mit einer DC-53 DNA-Sonde hybridisieren würde. Auf Grundlage dieser Ergebnisse
wurde die gesamte Basensequenz des BamHI-DNA-Fragments, die aus
ca. 2 kpb zusammengesetzt ist durch das in 2 gezeigte Verfahren
bestimmt. Folglich wurde festgestellt, daß das BamHI-DNA-Fragment nicht
nur einen Strukturgenbereich, der für die gesamte Aminosäuresequenz
des Schweine-CNP-Vorläuferproteins
codiert, sondern auch den Promoterbereich des Schweine-CNP-Gens
enthält
(siehe 3).
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Zunächst wurde
hinsichtlich des Promoterbereichs festgestellt, daß eine TATA-Box,
die zwischen den Promoterbereichen von eukaryontischen Genen geteilt
wird, an den Positionen 133-138 der in 3 gezeigten Basensequenz
vorkommt; es wurde außerdem
festgestellt, daß 2
GC-Boxen und eine Y-Box, von denen angenommen wird, daß sie an
der Kontrolle der Genexpression teilnehmen, stromaufwärts der
TATA-Box vorhanden sind. Aufgrund dieser Tatsachen wurde schlußgefolgert,
daß der
zu berücksichtigende
Bereich der Promoterbereich des CNP-Vorläuferproteins
ist.
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Was
den Strukturgenbereich angeht, ist ATG in den Positionen 310-312
stromabwärts
(3'-Seite) der Basensequenz
der TATA-Box vorhanden; da ATG der erste Methionincodon ist, der
stromabwärts
(3'-Seite) der TATA-Box vorkommt, und
da die Basensequenz um den Codon herum in Übereinstimmung mit der Consensus-Sequenz
eines Startcodons, A/G NNATG (N bedeutet entweder A, T, G oder C),
von dem bekannt ist, daß es
in Eukaryonten vorkommt, ist. Basierend auf diesen Tatsachen schätzten die
Erfinder, daß das
ATG von Interesse ein Translationsstartcodon für den Schweine-CNP-Vorläufer sein
wird.
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Stromabwärts dieses
Translationsstartcodons ATG ist ein offenes Leseraster vorhanden,
das für
40 Aminosäurereste
codiert und das sich bis zu einem Translationsterminatorcodon (TGA),
das an Positionen 430-432 vorhanden ist, fortsetzt. Aminosäuresequenzen,
die CNP-22 und CNP-53 entsprechen, treten jedoch nicht in der von
diesem offenen Leseraster vorhersagbaren Aminosäuresequenz des Peptids auf.
Auf der anderen Seite enthält
das BamHI-DNA-Fragment von Interesse ein offenes Leseraster, das
für 134
Aminosäurereste
von Positionen 725 bis 1126 der Basensequenz codiert, und es wurde
festgestellt, daß primäre Aminosäuresequenzen,
die CNP-22 und CNP-53 entsprechen, in der von diesem offenem Leseraster
vorhersagbaren primären
Aminosäuresequenz
des Peptids vorkommen. Auf Grundlage dieser Analysen wurde festgestellt, daß das Schweine-CNP-Strukturgen
mindestens ein Intron enthält;
mit anderen Worten wird das Schweine-CNP-Vorläuferprotein auf dem Gen durch
mindestens zwei Exone codiert. Dies wird auch durch die folgenden
beiden Tatsachen unterstützt;
eine Basensequenz, ähnlich
der von C/A AGGT A/G ATG, von der bekannt ist, daß sie die
Consensus-Sequenz eines Splicedonors ist, kommt in einem Bereich
in der Nähe
der Position 400 der Basensequenz vor von diesem offenem Leseraster
vorhersagbar; und eine Basensequenz, ähnlich zu (Py)n N C/T AGG (Py
bedeutet einen Pyridinrest und N bedeutet irgendeine der Basen A,
T, C oder G), von der bekannt ist, daß sie die Consensus-Sequenz eines Spliceakzeptors
ist, kommt an der 5'-Seite
der Position 840 der Basensequenz vor. Auf Grundlage dieser Tatsachen
haben die Erfinder angenommen, daß der DNA-Bereich von der Position
399 bis zu der Position 838 der Basensequenz ein Intron sein kann,
das vermutlich durch Splicen ausgeschieden werden kann, wenn eine
reife mRNA, die für
das CNP-Vorläuferprotein codiert,
hergestellt wird. Mit anderen Worten wurde angenommen, daß das CNP-Vorläuferprotein
ein Polypeptid sein wird, das insgesamt aus 126 Aminosäureresten
zusammengesetzt ist, und das durch die beiden Exone codiert wird,
wobei das erste an der Position 310 der Basensequenz beginnt und
an der Position 399 endet und das zweite an der Position 838 beginnt.
Um diese Schätzung
zu bestätigen,
exprimierten die Erfinder den Strukturgenbereich des CNP-Vorläufergens
in Tierzellen und untersuchten die mRNA-Struktur, die von diesem Strukturgen
transkribiert wird, sowie das von dieser mRNA translatierte Protein.
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Dazu
stellten die Erfinder zunächst
ein Plasmid pSV2CNP mit dem Strukturgenbereich des CNP-Vorläuferproteins,
der an einen Anfangspromoter von SV 40 gebunden ist (siehe 4)
her und brachten das Plasmid in COS-1-Zellen ein (die Zellen sind
hiernach mit COS-1/pSV2CNP abgekürzt)
wobei das Strukturgen in Tierzellen unter der Kontrolle des SV 40
Promoters exprimiert wird.
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Für die mRNA-Untersuchung
wurde das folgende Verfahren verwendet. Die gesamte RNA wurde aus COS-1/pSV2CNP
extrahiert und anschließend
wurde unter Verwendung einer oligo-dT-Zellulosesäule poly(A)+ RNA
hergestellt, die zur Herstellung einer cDNA-Bibliothek verwendet
wurde. Die cDNA-Bibliothek wurde anschließend unter Verwendung von DC-53
DNA gescreent, um den Klon DH1/pCNP cDNA zu isolieren, der mit der
DNA-Sonde hybridisieren wird. Das Plasmid pCNP cDNA 1 wurde außerdem zur
Bestimmung der gesamten Basensequenz des cDNA-Bereiches aus einem
Klon isoliert. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß die reife mRNA
(cDNA), die von dem Strukturgen des CNP-Gens abstammt, nicht den
Bereich enthält,
von dem die Erfinder annahmen, daß er einem Intron entspricht
(siehe 5). Der DNA-Bereich, der in den Positionen 400-838
der Basensequenz, die in 3 gezeigt ist, lokalisiert ist,
ist ein Intron, aber es wurde festgestellt, daß er durch Splicen entfernt
wird, wenn eine reife mRNA, die für das CNP-Vorläuferprotein
codiert, hergestellt wird. Unter diesen Umständen waren die Erfinder schließlich erfolgreich,
die Positionen der Exone und ein Intron im Strukturgenbereich des
CNP-Gens festzustellen. Sie identifizierten auch erfolgreich das
CNP-Vorläuferprotein,
das ein Polypeptid ist, das aus 126 Aminosäureresten zusammengesetzt ist
und die primäre
Aminosäuresequenz,
die in 5 gezeigt ist, besitzt. In der so identifizierten
primären
Aminosäuresequenz
des Schweine-CNP-Vorläuferproteins
(das hier als PrePro-CNP abgekürzt
ist) sind CNP-22 und CNP-53 im C-terminalen Bereich von PrePro-CNP
vorhanden, während
ein Bereich reich an hydrophoben Aminosäureresten (in den Positionen
10-16 der primären
Aminosäuresequenz,
die in 5 gezeigt ist) im N-terminalen Bereich von PrePro-CNP
vorhanden ist und angesichts dieser Tatsachen war es sehr wahrscheinlich,
daß das
Signalpeptid, das für
die Absonderung notwendig ist, im N-terminalen Bereich von PrePro-CNP
vorkommt.
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Unter
Berücksichtigung
der oben diskutierten Tatsachen werden CNP-22 und CNP-53 vermutlich durch
den folgenden Weg biosynthetisiert. Zunächst wird PrePro-CNP, zusammengesetzt
aus 126 Aminosäuren
von der RNA translatiert. Anschließend wird das Signalpeptid,
das im N-terminalen Bereich des PrePro-CNP vorhanden ist, durch
Umwandlung zu Pro-CNP im Verlauf der Absonderung gespalten. Außerdem wird
das Pro-CNP durch prozessierende Enzyme an spezifischen Positionen
(zwischen den Positionen 73 und 74 der primären Aminosäuresequenz und zwischen den
Positionen 104 und 105 derselben Sequenz, die in 5 gezeigt
ist) gespalten, um in CNP-53 und CNP-22 umgewandelt zu werden.
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Um
diese Annahmen zu bestätigen,
untersuchten die Erfinder durch das folgende Verfahren dann das Protein
im Kulturüberstand
von COS-1/pSV2CNP. Zunächst
wurde der flüssige Überstand
von COS-1/pSV2CNP gesammelt und konzentriert. Anschließend wurden
die im Konzentrat enthaltenen Protein aufgrund ihrer Molekulargewichte
unter Verwendung von Sephadex G-75 fraktioniert. Mit einem Anteil
jeder Elutionsfraktion wurde ein Radioimmunassay (RIA) unter Verwendung
eines Anti-CNP-22-Antiserums durchgeführt, wobei die Menge der Peptide
und Proteine, die in jeder Fraktion vorhanden waren und die Immunreaktivität mit dem
Anti-CNP-22-Antikörper
zeigten, bestimmt wurden.
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Die
Ergebnisse sind in 6 gezeigt, wobei die Positionen
der Elution von γ-rANP
(1) und α-rANP
(2) auf der Säule
durch einen Pfeil angezeigt sind. Wie man aus 6 entnehmen
kann, waren Proteine und Peptide, die mit dem Anti-CNP-22-Antiserum
Immunreaktivität
zeigten, in Fraktionen mit Molekulargewichten von ca. 16 kd und
in Fraktionen mit Molekulargewichten von ca. 3-10 kd vorhanden.
Das führte
zu der Schlußfolgerung,
daß Pro-CNP
abgesondert wurde und in COS-1/pSV2CNP-Zellen exprimiert wird. Außerdem ist
aus der 6 zu entnehmen, daß Peptide,
die Immunreaktivität
mit dem Anti-CNP-22-Antiserum
zeigten, bei Molekulargewichten von ca. 3-7 kd vorkommen. Dies führte auch
zu der Schlußfolgerung,
daß ein
Teil von Pro-CNP weiter zu Peptiden mit niedrigeren Molekulargewichten
(wobei jedes eine CNP-22-Struktur in seinem C-terminalen Bereich
aufweist) in COS-1/pSV2CNP-Zellen
umgewandelt wird.
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Zusammenfassend
läßt sich
sagen, daß die
Erfinder für
die Vorläuferproteine
von Schweine-CNP (CNP-22 und CNP-53) codierende chromosomale Gene
und cDNA isolierten und sie untersuchten, um die primären Aminosäuresequenzen
der Schweine-CNP Vorläuferproteine
zu identifizieren. Gleichermaßen
stellten sie durch Genmanipulationsverfahren die gesamten oder Teile
der Proteine, die durch dieses Gen oder cDNA codiert sind, her.
Diese Erfindung ist unter diesen Voraussetzungen bewerkstelligt
worden.
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Die
folgenden Beispiele werden zum Zwecke der weiteren Darstellung dieser
Erfindung bereitgestellt.
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BEISPIEL 1
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Herstellung der DNA-Sonde (DC-53):
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A. Gen-Amplifikation durch PCR:
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Der
für die
CNP-53 primäre
Aminosäuresequenz
codierende chromosomale Genbereich wurde in vitro durch das folgende
Verfahren amplifiziert. Zunächst
wurden zwei DNA-Primers (KF 225 und KF 226), die der primären Aminosäuresequenz
von CNP-53 in seinen N- und C-terminalen Bereichen (siehe 1)
entsprechen, chemisch synthetisiert. Eine Restriktionsenzym-(PstI)-Erkennungsstelle
wurde künstlich
in die 5'-terminalen
Bereiche von KF 225 und KF 226 eingeführt, um das Suklonieren des
Gens nach seiner Amplifikation zu erleichtern (in 1 sind
die künstlich
umgewandelten Basen durch kleine Buchstaben des Alphabets angezeigt).
Anschließend
unter Verwendung dieser DNA-Primers wurde die Polymerasekettenreaktion
(PCR) gemäß dem Verfahren
von Saiki et al. (Saiki, R. K. et al., Science, 239, 487, 1988)
durch das folgende Verfahren durchgeführt. KF 225 und KF 226, wobei
jedes 1,26 μg
wiegt, und eine Schweine-DNA (1 μg)
wurden zu 100 μl
einer Reaktionslösung
[10 mM Tris-HCl (pH 8,5), 2,5 mM MgCl2,
50 mM KCl, 0,2 mM NPTs und 0,02% Gelatine] gegeben. Zu dieser Lösung wurden
5 Einheiten der Thermus aquaticus DNA Polymerase (New England BioLabs)
gegeben, um 30 PCR-Zyklen durchzuführen, wobei jeder aus aufeinanderfolgendem
Wärmen bei
90°C für 1,5 Minuten,
bei 65°C
für 2 Minuten
und bei 70°C
für 1,5
Minuten bestand. Bei Zyklus 10 wurden 5 weitere Einheiten der obengenannten
DNA-Polymerase zu der Reaktionslösung
gegeben. Die auf diesem Wege amplifizierten Gene wurden durch Ethanolausfällung wiedergewonnen.
-
B. Subklonieren und Untersuchen von DC-53:
-
Zum
Erhalt eines für
die primäre
Aminosäuresequenz
des gewünschten
CNP-53 codierenden DNA-Fragments wurden die unter A. amplifizierten
DNA-Fragmente in einen Plasmidvektor pUC 118 subkloniert, bevor
die amplifizierten Gene mit einem Restriktionsenzym PstI behandelt
wurden. Die behandelten Genfragmente wurden in das pUC 118 (Takara
Shuzo Co., Ltd.) an der PstI-Stelle eingebracht, das zum Transformieren
des. E. coli-Stammes 12, abstammend von DH1 verwendet wurde, um
eine Genbibliothek herzustellen. Anschließend wurde die Genbibliothek
unter Verwendung einer chemisch synthetisierten gemischten DNA-Sonde
KF 206 (eine Oligonucleotidgemischte DNA-Sonde, die dem Teil der
primären
Aminosäuresequenz
von CNP-53 entspricht, die in 1 gezeigt
ist und die mit Leucin (Leu) an der Position 16 beginnt und mit
Asparagin (Asn) an der Position 21 endet; 32 14-mers Gemische wurden
gemäß dem Verfahren
von Wood (Wood, W. O. et al., Proc Natl Acad Sci USA., 82, 1585,
1985) gescreent, wobei ein mit KF 206 hybridisierender Klon DH1/pCNP5
erhalten wurde. In einem anschließenden Schritt wurde ein Plasmid
(pCNP5) getrennt und aus dem Klon auf gewöhnliche Weise gereinigt. Das
gereinigte Plasmid wurde mit einem Restriktionsenzym PstI gespalten.
Durch die Untersuchung wurde festgestellt, daß pCNP5 ein aus ca. 150 bp
zusammengesetztes PstI-DNA- Fragment
enthält.
Um zu bestätigen,
daß das
PstI-DNA-Fragment
ein DNA-Fragment ist, das für die
primäre
Aminosäuresequenz
der endgültigen
Zie1-CNP-53 codiert, wurde dieses PstI-DNA-Fragment in einen M13-Phagen
kloniert und die DNA-Basensequenz wurde mittels SEQUENASE (United
States Biochemical Corporation) durch das Didesoxyverfahren (Sanger,
F. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 74, 5463, 1977) bestimmt. Es
wurde dadurch festgestellt, daß das
PstI-DNA-Fragment ein insgesamt aus 147 bp zusammengesetztes Gen
ist und eine für
CNP-53 codierende Basensequenz aufweist.
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C. Herstellung von DC-53:
-
Ein
für das
Klonieren eines Gens, das für
das Schweine-CNP-Vorläuferprotein
codiert, zu verwendendes DNA-Fragment wurde durch ein Verfahren,
bestehend aus der Spaltung des zuvor genannten Plasmids pCNP5 mit
einem Restriktionenzym PstI, dem Isolieren eine 147 bp DNA-Fragments
und dem radioaktiven Markieren des DNA-Fragments durch Nick-Translation unter
Verwendung von (α-32P) dCTP hergestellt.
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BEISPIEL 2
-
Isolieren des für das Schweine-CNP-Vorläuferprotein
codierenden chromosomalen Gens:
-
Der
von LE 392 abstammende E. coli-Stamm K12 wurde mit einer Schweine-chromosomalen
Genphagen DNA-Bibliothek (Erzeugnis von Clonetech Co.), die bei
4°C aufbewahrt
wurde, infiziert. Die Zellen wurden auf einem LB Medium (10 g Bactotrypton,
5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl, 1,5% Bactoagar, Gesamtvolumen 1 l) plattiert
und über
Nacht bei 37°C
kultiviert. Die Platte wurde bei 4°C für 30 Minuten gekühlt und
ein Nitrozellulosefilter (Erzeugnis von Schleicher & Schnell Co.)
wurde auf dem Phagenplaque für
5 Minuten liegen gelassen. Anschließend wurde der Filter von der
Platte abgelöst,
an der Luft getrocknet, zunächst
in eine alkalische Zersetzungslösung
(0,5 M NaOH und 1,5 M NaCl) für
1 Minute und dann in eine Neutralisierungslösung (0,5 M Tris-HCl, pH 7,0,
1,5 M NaCl) für
1 Minute eingetaucht. Danach wurde der Nitrozellulosefilter mit
einer 3 × SSC-Lösung (20 × SSC NaCl,
175,3 g; Trinatriumcitrat, 88,2 g; Gesamtvolumen 1 l) gewaschen,
an der Luft getrocknet und unter Vakuum bei 80°C für 120 Minuten wärmebehandelt.
-
Unter
Verwendung des so hergestellten Nitrozellulosefilters wurde Plaquehybridisierung
unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Zunächst wurde eine Prähybridisierungslösung [3 × SSC; 1 × Denhardt's Lösung (bestehend
aus Albumin, Polyvinylpyrrolidon und Ficoll, wobei jedes 0,2 mg/ml
wiegt); Lachsspermien-DNA, 50 μg/ml;
0,1% SDS] zu dem Nitrozellulosefilter gegeben und die Prähybridisierung
wurde bei 65°C für 3 Stunden
durchgeführt.
Dann wurde Hybridisierung unter Verwendung von 106 cpm
der DC-53 DNA-Sonde und 1 ml der Prähybridisierungslösung für 2 Blätter des
Nitrozellulosefilters über
Nacht bei 65°C
durchgeführt.
Anschließend
wurde der Filter dreimal mit einer 3 × SSC-Lösung,
enthaltend 0,1% SDS, gewaschen, wobei jedes Waschen bei 65°C für 30 Minuten
ausgeführt
wurde; der gewaschene Filter wurde an der Luft getrocknet und eine
Autoradiographie bei –80°C für 24 Stunden
durchgeführt.
Durch Screenen von ca. 2 × 106 Klonen auf diese Weise wurden 5 mit der
DC-53 DNA-Sonde hybridisierenden Klone erhalten. Einer dieser Klone
wurde "γCNP6" genannt und in den
folgenden Schritten wurden Untersuchungen durchgeführt.
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BEISPIEL 3
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Untersuchung des γCNP6-Phagen und Bestimmung seiner
Besensequenz:
-
A. Analyse der γCNP6-Phagen-DNA:
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Die
DNA wurde auf gewöhnliche
Weise von dem γCNP6-Phagen
hergestellt. Anschließend
wurde die Phagen-DNA mit den Restriktionsenzymen BamHI, HindIII
und PstI gespalten und die resultierenden DNA-Fragmente wurden getrennt
und durch Elektrophorese auf einem Agarosegel untersucht. Es wurde
festgestellt, daß γCNP6 ein
Phage ist, der ca. 14 kbp Schweine-chromosomales Gen enthält. Die
Analyse durch Southern Blotting unter Verwendung der DC-53 DNA-Sonde
zeigte, daß jedes
BamHI-DNA-Fragment von ca. 2 kbp, jedes HindIII-DNA-Fragment von
ca. 3 kbp und jedes PstI-DNA-Fragment
von ca. 5 kbp mit der DC-53 DNA-Sonde hybridisierte. Die gesamte
Basensequenz der BamHI-DNA, die das niedrigste Molekulargewicht (2
kbp) dieser drei Fragmente besitzt und die mit der DC-53 DNA-Sonde
hybridisierte, wurde durch das folgende Verfahren bestimmt, wobei
sowohl der obere als auch der untere Strang bestimmt wurde.
-
B. Bestimmung der Besensequenz des BamHI-DNA-Fragments:
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Zum
Bestimmen der Basensequenz des oberen Stranges des BamHI-DNA-Fragments
wurde zur Herstellung von pUC CNP6 das letztere in einen Plasmidvektor
pUC 118 (Takara Shuzo Co., Ltd.) an der BamHI-Stelle subkloniert.
Anschließend
wurde pUC CNP6 mit den Restriktionsenzymen XbaI und SphI gespalten und
unter Verwendung eines TAKARA Kilosequenzierungsdeletionskits (Takara
Shuzo Co., Ltd.) wurden Deletionsplasmide oder Plasmide, wobei der
linke DNA-Terminus der BamHI-DNA mit verschiedenen Längen deletiert
war, wie in 2(a) gezeigt, hergestellt. Anschließend wurde
die Länge
der Deletion durch Elektrophorese auf einem Agarosegel untersucht
und 9 Klone, die auf geeignete Längen
deletiert waren, wurden ausgewählt.
Schließlich
wurden diese Klone mit einem Helferphagen M13K07 infiziert und eine
einzelsträngige
DNA (oberer Strang) wurde zurückgewonnen.
Unter Verwendung eines universellen Primers, wobei die wiedergewonnene
DNA als eine Matrize verwendet wurde, wurde die DNA-Basensequenz des
oberen Stranges des BamHI-DNA-Fragments durch das Didesoxyverfahren
SEQUENASE (United States Biochemical Corporation) bestimmt. Hinsichtlich
der Bereiche, deren Basensequenzen aufgrund der Nichtverfügbarkeit
von Deletionsmutantenklonen mit geeigneten Längen durch das oben beschriebene
Verfahren nicht bestimmt werden konnten, wurde deren DNA-Basensequenzen unter
Verwendung eines Primers der Oligonucleotide KF 248, KF 249 und
KF 250 [siehe 2(c)], die chemisch synthetisiert
wurden auf Basis der bereits bekannten Basensequenzen bestimmt.
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Hinsichtlich
der Basensequenz des unteren Stranges wurde der obere Strang eines
2 kbp BamHI DNA-Fragments in einen M13-Phagen subkloniert und unter
Verwendung des Subklons als Matrize wurde die Basensequenz durch
das Didesoxyverfahren mit Hilfe eines universellen Primers und den
Oligonucleotidprimern KF 239, KF 243, KF 244, KF 245, KF 246, KF
247, KF 252 und KF 254 [siehe 2(c)],
die auf Basis der Basensequenz des oberen Stranges, durch das oben
beschriebene Verfahren chemisch synthetisiert wurden, bestimmt.
Die Bereiche, deren Basensequenzen unter Verwendung eines universellen
Primers bestimmt wurden, sind durch ausgefüllte Pfeile in 2(b) identifiziert und diejenigen, deren Basensequenzen
unter Verwendung der chemisch synthetisierten Oligonucleotidprimers
bestimmt wurden, sind durch gestrichelte Pfeile in 2(b) identifiziert.
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Die
Basensequenz des oberen Stranges des BamHI-DNA-Fragments, die durch das oben beschriebene
Verfahrenbestimmt wurde, und die durch die Exonstellen codierte
Aminosäuresequenz,
die von der Basensequenz vorhersagbar ist, sind in 3 gezeigt.
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BEISPIEL 4
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Expression des Schweine-CNP-Gens:
-
Unter
Verwendung des Schweine-CNP-Vorläufergens
(BamHI-DNA-Fragment),
das in Beispiel 3 isoliert und analysiert wurde, wurde der Strukturgenbereich
des Schweine-CNP-Vorläuferproteins
in Tierzellen exprimiert und nicht nur die Struktur der mRNA, die
von diesem Strukturgen transkribiert ist, sondern auch das Protein,
das von dieser mRNA translatiert ist, untersucht.
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A. Herstellung des Schweine-CNP-Strukturgen-Expressionsvektors
pSV2CNP:
-
Wie
in 4 gezeigt wurde ein Plasmidvektor pSV2dhfr (Bethesda
Research Laboratories, Inc.) mit einem Restriktionsenzym Bgl II
gespalten. Anschließend
wurden die mit Bgl II gespaltenen Stellen mit einem stumpfen Ende
ausgestattet und danach mit einem Restriktionsenzym HindIII behandelt,
um den cDNA-Bereich einer Mäuse- Dehydrofolsäurereductase
(Mäuse-dhfr)
aus dem pSV2dhfr auszuschließen.
In dem nächsten
Schritt wurde ein Plasmid pUC CNPdel mit den Restriktionsenzymen
HindIII und RsaI gespalten unter Erhalt eines DNA-Fragments, zusammengesetzt
aus 989 bp [wobei das Plasmid eines der Deletionsplasmide ist, das
in Beispiel 3 hergestellt wird, wobei die Basensequenz des oberen
DNA-Stranges des BamHI-DNA-Fragments
bestimmt wurde und 166 bp vom 5'-Terminus
des BamHI-DNA-Fragments, gezeigt in 3, deletiert waren;
die mit diesem Plasmid transformierte Wirtzelle wurde "Escherichia coli
SMB318" genannt
und wurde beim Fermentation Research Institute, the Agency of Industrial
Science and Technology am 10. Juni 1990 unter der Accession Nr.
2997 (FERN BP-2997) hinterlegt]. Dieses DNA-Fragment wurde mit dem
HindIII-Bgl II DNA-Fragment von pSV2dhfr, das durch das vorhergehende
Verfahren hergestellt wurde, legiert, woraufhin ein Schweine-CNP-Strukturgenexpressionsvektor
pSV2CNP hergestellt wurde.
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B. Analyse der vom pSV2CNP transkribierten
mRNA:
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Die
Struktur der vom Schweine-CNP-Strukturgen transkribierten mRNA wurde
durch das folgende Verfahren untersucht.
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Zuerst
wurde das Plasmid pSV2CNP (10 μg)
in von COS-1 abstammenden Affennierenzellen (7,5 × 105 Zellen) unter Verwendung des Cellphect
Transfect Kit (Pharmacia) eingebracht. Die transfizierten Zellen wurden
in 8 ml DMEM (Dulbeco's
Modified Eagle's
Medium, GIBCO), enthaltend 10%iges FCS (fetales Kälberserum)
in Gegenwart von CO2 bei 37°C für 72 Stunden
kultiviert. Danach wurde der Überstand
der Kultur von den Zellen getrennt. Der so erhaltene Kulturüberstand
wurde bei –70°C aufbewahrt
und in der Proteinanalyse, die unten unter C. beschrieben wird, verwendet.
Auf der anderen Seite wurden die Zellen in der mRNA-Analyse, wie
hier unten beschrieben, verwendet.
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Unter
Verwendung eines Guanidin-Thiocyanat-Verfahrens wurden 800 μg der Gesamt-RNA
aus ca. 107 Zellen des COS1/pSV2CNP extrahiert.
Anschließend
unter Verwendung einer oligo(dT)-Cellulosesäule wurden ca. 150 μg Poly(A)+ RNA aus 800 μg der Gesamt-RNA hergestellt.
Anschließend
unter Verwendung von 10 μg
Poly(A)+ RNA wurde eine cDNA-Bibliothek durch
das Verfahren von Okayama-Berg (Molec. Cell Biol., 2, 161-170, 1982)
hergestellt unter Erhalt von ca. 2 × 105 unabhängigen Klonen.
Die aus ca 4 × 103 Klonen bestehende cDNA-Bibliothek wurde
auf die gleiche Weise unter Verwendung der DC-53 DNA-Sonde, die
in Beispiel 1 hergestellt wurde, gescreent, wobei "DH1/pCNP cDNA 1" genannte mit der
DC-53 DNA-Sonde hybridisierende Klone erhalten wurden.
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In
dem darauffolgenden Schritt wurde das Plasmid (pCNP cDNA 1) getrennt
und von dem Klon auf gewöhnliche
Art und Weise gereinigt, mit verschiedenen Restriktionsenzymen gespalten
und untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, daß pCNP cDNA
1 ca. 14 kb der cDNA enthält.
Für die
endgültige
Analyse der mRNA wurde die 1,4-kb cDNA in einen M13-Phagen subkloniert
und die DNA-Basensequenz wurde durch das Didesoxyverfahren unter
Verwendung von SEQUENASE (United States Biochemical Corporation)
bestimmt. 5 zeigt die so bestimmte DNA-Basensequenz
der cDNA und die primäre
Aminosäuresequenz,
die aufgrund der DNA-Basensequenz vorhersagbar ist.
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C. Analyse des von der CNP mRNA translatierten
Proteins:
-
Das
von der CNP mRNA translatierte Protein wurde durch das folgende
Verfahren untersucht. Zunächst
wurde der Überstand
(75 ml) von den in Beispiel 4-B hergestellten COS-1/pSV2CNP gelöst, mit
anschließendem
Konzentrieren und Aussalzen mit Sep-pak. Dann wurde die Probe lyophilisiert
und in 5 ml einer 1 M Essigsäurelösung gelöst. Anschließend wurden
die in der Lösung
enthaltenen Proteine und Peptide auf einer Sephadex G-75-Säule (1,8 × 137 cm,
Pharmacia) gemäß der Molekulargewichte
(Fließgeschwindigkeit: 7,7
ml/h; Fraktionsgröße: 5 ml)
fraktioniert. Schließlich
wurde bei einem Teil (40 μl)
jeder eluierten Fraktion ein Radioimmunoassay (RIA) unter Verwendung
eines Anti-CNP-22-Antiserums durchgeführt zur Bestimmung der Peptid-
und Proteinmengen (ir-CNP-22), die in jeder Fraktion vorhanden waren
und die mit dem anti-CNP-22 Antikörper Immunreaktivität zeigten
[für Details
des RIA siehe die gewöhnlich
genannte Patentanmeldung über ein
neues physiologisch aktives Schweinepeptid (CNP-53)].
-
Das
Ergebnis ist in 6 gezeigt, wobei zu erkennen
ist, daß ein
Protein und Peptid, die Immunreaktivität mit dem anti-CNP-22 Antiserum
zeigten, in den eluierten Fraktionen (≠ 33-44) mit Molekulargewichten von
ca 16 kd und in den eluierten Fraktionen (≠ 45-66) mit Molekulargewichten
von 3-10 kd vorkamen. Die RIA-Ergebnisse
zeigten auch, daß der
Kulturüberstand
der COSI/pSV2CNP in Bezug auf CNP-22 150 ng eines Proteins und Peptids,
das mit dem anti-CNP-22 Antiserum Immunreaktivität entfaltete, enthielt. Gemäß dieser
Erfindung wurde der DNA-Bereich eines schweinechromsomalen Gens,
das für
CNP-53 codierte, spezifisch durch PCR amplifiziert unter Erhalt
einer DNA-Sonde (DC-53).
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Anschließend, unter
Verwendung der DC-53 wurde ein chromosomales Gen, das für das Schweine-CNP
(CNP-22 und CNP-53) Vorläuferprotein
codiert isoliert und seine Struktur identifiziert. Wie in 3 gezeigt,
wurde festgestellt, daß das
BamH1-DNA-Fragment, das in dieser Erfindung isoliert wurde, nicht
nur den Strukturgenbereich, der für die gesamte Aminosäuresequenz.
des Schweine-CNP-Vorläuferproteins
(das durch zwei Exone in seinem Strukturgenbereich codiert wird),
sondern auch den Promoterbereich des Schweine-CNP-Gens, codiert.
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In
dem nächsten
Schritt wurde der Strukturgenbereich des chromosomalen Gens in von
Affennieren abstammenden COS-1-Zellen
exprimiert und die mRNA-Struktur (cDNA), die von dem Strukturgen
transkribiert wird, sowie das Protein, das von der mRNA translatiert
wird, wurde untersucht. Es wurde folglich festgestellt, daß das Schweine-CNP-Vorläuferprotein
ein Polypeptid ist, das die in 5 gezeigte
primäre
Aminosäuresequenz
aufweist und das insgesamt aus 126 Aminosäureresten zusammengesetzt ist.
Es wurde außerdem festgestellt,
daß ein
Signalpeptid im N-terminalen Bereich des Vorläuferprotein (PrePro-CNP) vorhanden
ist und das sowohl CNP-22 als auch CNP-53 Peptide sind, die in vivo
von Zellen abgesondert werden. Es wurde weiterhin festgestellt,
daß durch
Exprimieren des Schweine-CNP-Strukturgens in Tierzellen ein Peptid
und ein Protein, das mit einem Anti-CNP-22-Antikörper Immunreaktivität zeigte,
hergestellt werden konnte.
-
Die
Gene und cDNAs der Schweine-CNP-Vorläufer wurden durch diese Erfindung
isoliert und identifiziert. Wenn sie als DNA-Sonden verwendet werden,
können
das CNP-Gen oder die cDNA, die von anderen Tierzellen als Schweinezellen
abstammen, isoliert werden und, indem sie untersucht werden, kann
das CNP von nicht-Schweinezellen identifiziert werden. Wie in Beispiel
4-c gezeigt, können
das Gen oder die für
den Schweine-CNP-Vorläufer
codierende cDNA in Tierzellen exprimiert werden und das Protein
oder Peptid, das aus den Zellen abgesondert wird, kann isoliert
und identifiziert werden, um detailliertere Informationen über den
Mechanismus, der hinter der Biosynthese von Schweine-CNPs steht,
zu liefern. Pro-CNP, dem ein Signalpeptid von PrePro-CNP fehlt,
ist bisher in vivo nicht isoliert und identifiziert worden und verschiedene
Peptide, die an den N-Terminus von CNP-53 gebundenen zusätzlichen
Aminosäuren
aufweisen, auch nicht [mindestens 5-Lysin (Lys) Reste und mindestens
3 Arginin (Arg) Reste sind in der primären Aminosäuresequenz von PrePro-CNP zwischen
den Positionen 24 und 73, mit Lysin an den Positionen 30, 51, 52,
55 und 65 und Arginin an den Positionen 33, 68 und 70 vorhanden,
so daß Pro-CNP
wahrscheinlich spezifisch am C-Terminus jeder dieser basischen Aminosäurereste
mit prozessierenden Enzymen in vivo spezifisch gespalten werden
kann und außerdem
ist es Bezug auf die bereits in vivo identifizierten CNP-22 und
CNP-53 sehr wahrscheinlich, daß diese
Peptide mit zusätzlichen
Aminosäuren,
die an den N-Terminus von CNP-53 gebunden sind, auftreten, aber,
gemäß dieser
Erfindung können
gerade auch diese Peptide zum Zweck des Untersuchens ihrer physiologischen
Aktivitäten
isoliert und identifiziert werden].
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Es
wurde weiterhin festgestellt, daß das in 3 gezeigte
Gen des Schweine-CNP-Vorläuferproteins nicht
nur einen Strukturgenbereich, der für den Schweine-CNP-Vorläufer codiert,
sondern auch einen Promoterbereich, der das Strukturgen von Interesse
exprimieren kann, enthält.
Angesichts der Tatsache, daß CNP-22
und CNP-53 aus dem Gehirn isoliert werden können, wird der Promoter höchstwahrscheinlich
im Gehirn auf eine spezifische Weise wirken. Wenn daher ein Gen,
das für
ein geeignetes Protein codiert, stromabwärts des Promoters gebunden
wird und wenn die Kombination zum Herstellen einer transgenen Maus
verwendet wird, kann das Protein von Interesse spezifisch im Gehirn
der transgenen Maus exprimiert werden, wodurch es möglich wird,
die physiologischen Wirkungen des Proteins auf individueller Ebene
zu untersuchen.
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Die
durch diese Erfindung erhaltene Information betreffend das chromosomale
Gen, die cDNA und die primäre
Aminosäuresequenz
der Schweine -CNP-Vorläuferproteine
leistet einen großen
Beitrag nicht nur in Bezug auf zukünftige Studien zur Aufklärung des
Mechanismus, der hinter der Biosynthese steht und den physiologischen
Wirkungen von CNP in Säugern,
sondern auch um die Anstrengungen und pharmazeutische Anwendungen
von Peptiden, die der CNP-Familie zuzuordnen sind, zu etablieren.
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