DE69124857T2

DE69124857T2 - DNS, die ein menschliches, gefässverengendes Peptid kodiert, und dessen Verwendung

Info

Publication number: DE69124857T2
Application number: DE69124857T
Authority: DE
Inventors: Takuo Kosaka; Shoichi Ohkubo; Haruo Onda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-07-18
Filing date: 1991-07-16
Publication date: 1997-07-24
Anticipated expiration: 2011-07-17
Also published as: JPH04281790A; US6365725B1; EP0468337A1; CA2046754A1; ATE149524T1; JP2999579B2; US5756344A; DE69124857D1; EP0468337B1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Precursorprotein von Human-Endothelin-2.
In dieser Beschreibung wird der Ausdruck "Precursorprotein" vorzugsweise verwendet, um ein Protein zu beschreiben, das eine Aminosäuresequenz eines reifen Peptids enthält und am N-Terminus, am C-Terminus oder an beiden Termini einen Teil oder die gesamte Aminosäuresequenz aufweist, die in einem DNA-Segment des Peptids codiert ist.

Hintergrund der Erfindung

Es gibt Berichte über endothehumabhängige gefäßverengende Reaktionen auf verschiedene mechanische und chemische Reize sowie über endothehumabhängige gefäßerweiternde Reaktionen. Es ist zum Beispiel bekannt, daß eine Gefäßverengung durch mechanische Belastungen, wie Gefäßstreckung und erhöhten Gefäßinnendruck, durch Mittel wie Thrombin sowie durch Hypoxämie induziert werden kann, und weiterhin, daß die noradrenalininduzierte Gefäßverengung durch Verwendung von Neuropeptid Y verstärkt werden kann [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79, 5485 (1982); ibid. 81, 4577 (1984)].
Endotheliale koronarvaskuläre Verengungsfaktoren zellulären Ursprungs (mit Molekulargewichten von jeweils 8500 und 3000) sind in Amer. J. Physiol. 248, c550 (1985) und in J. Cell Physiol. 132, 263 (1987) beschrieben. Ihre Sequenzen sind jedoch unbekannt. In J. Pharmacol. Exp. Ther. 236, 339 (1985), wird auch eine endotheliale peptidartige Substanz zellulären Ursprungs beschrieben. Die Sequenz dieser Substanz ist jedoch ebenfalls unbekannt.
Andererseits ist Vasopressin als Peptid mit gefäßverengender Wirkung bekannt. Die Aminosäuresequenz von Vasopressin wurde bestimmt. Es gab jedoch keine Berichte darüber, daß Vasopressin aus vasculären endothelialen Zellen von Säugern oder Vögeln erhalten wurde. Es wird zwar berichtet, daß ein Angiotensin mit einer gefäßverengenden Wirkung aus den endothelialen Zellen von Rinderaortas erhalten wurde [Circulation Research 60, 422 (1987)], doch ist das Angiotensin ein Peptid mit einem Molekulargewicht von nur etwa 1000.
Einigen der Erfinder der vorliegenden Erfindung ist es schon einmal gelungen, Schweine-Endothelin als Peptid mit einer ähnlichen gefäßverengenden Wirkung aus den endothelialen Zellen von Schweineaortas zu isolieren (Japanische Patentanmeldung Nr. 255381/1987). Einigen der Erfinder ist es auch gelungen, Human- Endothelin zu isolieren und Schweine-Endothelin-cDNA und Human- Endothelin-cDNA zu klonieren (Japanische Patentanmeldungen Nr. 275613/1987, 313155/1987 und 148158/1988). Die reifen Polypeptide des Schweine-Endothelins und des Human-Endothelins haben dieselbe Aminosäuresequenz und werden als Endothelin-1 bezeichnet.
Weiterhin haben die Erfinder Patentanmeldungen eingereicht, die die Isolierung von Ratten-Endothelin und die Klonierung seiner cDNA betreffen (Japanische Patentanmeldungen Nr. 174935/1988 und 188083/1988), und dieses wird als Endothelin-3 bezeichnet.
Weiterhin haben die Erfinder auch eine Patentanmeldung eingereicht, die die Klonierung von Human-Endothelin-3 betrifft (Japanische Patentanmeldung Nr. 278497/1989).
Außerdem haben die Erfinder auch eine Patentanmeldung eingereicht, die die Isolierung von Maus-Endothelin und die Klonierung seiner cDNA betrifft (Japanische Patentanmeldung Nr. 223389/ 1988), und dieses wird als Endothelin B bezeichnet.
Außerdem haben die Erfinder aus einer Human-Genom-Bibliothek eine DNA kloniert, die für Endothelin codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der des Endothelin-1 unterscheidet, und das Endothelin-2 genannt wurde, und haben eine Patentanmeldung eingereicht, die ein Protein von Endothelin-2 und seine DNA betrifft (Japanische Patentanmeldung Nr. 274990/1989; EP-A- 366 016).
Die Aminosäuresequenzen dieses Endothelin-1 (SEQ ID NO:3), Endothelin B (SEQ ID NO:4), Endothelin-3 (SEQ ID NO:5) und Endothelin-2 (SEQ ID NO:6) sind in Figur 1 im Vergleich gezeigt.
Endothelin ist ein allgemeiner Ausdruck für Peptide mit einem Molekulargewicht von 2500 ± 300, die 21 Aminosäurereste aufweisen, einschließlich vier Cysteingruppen, die vom N-Terminus der Aminosäuresequenz her dem 1., 3., 11. und 15. Rest entsprechen und zwei Gruppen von Disulfidbindungen bilden. Eine der Kombinationen der Disulfidbindungen kann die Cysteingruppen 1-15 und 3-11 umfassen, und die andere kann 1-11 und 3-15 sein. Die erstere Kombination hat ein größeres Verhältnis der Bildung und der Aktivität als die letztere Kombination.
Proc. Natl. Acad. Sci. 1989, S. 2863-2667, offenbart mit Human- Endothelin in Zusammenhang stehende Gene, z.B. Endothelin-2-Vorläufer, die kloniert wurden, indem eine genomische DNA-Bibliothek durchmustert wurde, wobei sich der Endothelin-2-Vorläufer in seiner Struktur von den Endothelin-2-Vorläufern der vorliegenden Erfindung unterscheidet.
Wie oben beschrieben, wurden homologe Endothelinpeptide aus verschiedenen Tieren entdeckt. Es wurden jedoch keine neuen homologen Gene von derselben Tierspezies entdeckt. Daher sind zur Zeit die weitere Durchmusterung von neuem homologem Endothelin und die Untersuchung der Struktur und Aktivität des Endothelins, wobei seine Nützlichkeit untersucht wird, sowie die Klonierung des neuen Peptids durch DNA-Rekombinationstechnik, um seine Massenproduktion zu ermöglichen, im Gange.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Die Erfinder haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt, wobei sie berücksichtigten, daß wichtige Beiträge zu zukünftigen Untersuchungen und medizinischen Behandlungen geleistet werden, wenn ein neues homologes Gen mit der oben beschriebenen gefäßverengenden Wirkung isoliert und durch DNA-Rekombinationstechnik weiter hergestellt werden kann. Als Ergebnis wurden die folgenden Informationen erhalten, wobei wir zu der vorliegenden Erfindung gelangten.
Den Erfindern ist es nämlich gelungen, aus einer Human-cDNA- Bibliothek cDNA (komplementäre DNA) zu klonieren, die für Endothelin codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich von der des obigen Endothelin-1 und Endothelin-3 [Human-Endothelin (Endothelin A) und Endothelin-3] unterscheidet, indem sie als Sonde das synthetisierte DNA-Segment, das für einen Teil der genomischen DNA von Human-Endothelin codiert und das in den bereits eingereichten Patentanmeldungen beschrieben ist, sowie eine DNA, die ein genomisches DNA-Segment von Endothelin-2 mit etwa 99 bp umfaßt, verwendeten, und dadurch ist es ihnen gelungen, seine Massenproduktion durch Rekombinationstechnik vorzubereiten. Insbesondere stellen die Erfinder einen Vorläufer von Human-Endothelin-2 mit einer neuen Aminosäuresequenz bereit.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden bereitgestellt (1) ein Human-Endothelin-2-Precursorprotein, das durch die Aminosäuresequenz von Nr. 49 bis 86 von SEQ ID NO: 2 im Sequenzlisting dargestellt wird, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:8 im Sequenzusting aufweist:
sowie (2) ein Human-Endothelin-2-Precursorprotein, das durch die Aminosäuresequenz von Nr. 49 bis 85 von SEQ ID NO: 2 im Sequenzlisting dargestellt wird, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7 im Sequenzlisting aufweist:

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 zeigt Aminosäuresequenzen verschiedener Endothelinpeptide im Vergleich;
Figur 2 zeigt eine Restriktionsenzymfragmentkarte eines cDNA-Segments, das für das in der vorliegenden Erfindung erhaltene Human- Endothelin-2 codiert;
Figur 3 zeigt eine Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1) des cDNA-Segments, das für das in der vorliegenden Erfindung erhaltene Human- Endothelin-2 codiert, und eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2), die aus dieser Nucleotidsequenz ermittelt wurde;
Figur 4 zeigt eine Aminosäuresequenz eines Vorläufers von Human- Endothelin-2 (SEQ ID NO:2);
Figur 5 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Plasmids für die Expression von Human-Endothelin in Beispiel 5 zeigt;
Figur 6 ist eine Graphik, die sich auf die Expression von Human- Endothelin der vorliegenden Erfindung bezieht;
Figur 7 ist ein Umkehrphasen-HPLC-Chromatogramm, das sich auf die Expression von Human-Endothelin-2 der vorliegenden Erfindung und eines Vorläufers davon bezieht; und
Figur 8 ist ein Massenspektrogramm von Human-Big-Endothelin-2 (1-38).

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Das cDNA-Segment, das für Human-Endothelin-2 codiert, enthält eine Nucleotidsequenz (SEQ ID NO:1), die durch die folgende Formel [1] dargestellt wird oder einem Teil davon entspricht.
Ein Vorläufer von Human-Endothelin-2 enthält eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO:2), die durch die folgende Formel [2] dargestellt wird:
Ein Protein mit einer Sequenz, die der Sequenz von der 49. bis zur 85. Aminosäure in Formel [2] entspricht und die durch die folgende Formel dargestellt wird, ist ebenfalls eine Art Vorläufer von Human-Endothelin-2 und wird Big-Endothelin-2 (1-37) genannt.
Ein Protein mit einer Sequenz, die der Sequenz von der 49. bis zur 86. Aminosäure in Formel [2] entspricht und die durch die folgende Formel dargestellt wird, ist ebenfalls eine Art Vorläufer von Human-Endothelin-2 und wird Big-Endothelin-2 (1-38) genannt.
Die Nucleotidsequenz, die durch Formel [1] dargestellt wird (SEQ ID NO:1) ist die Sequenz der Human-Endothelin-2-cDNA.
Zu den Beispielen für die Nucleotidsequenzen, die für die Aminosäuren des reifen Human-Endothelin-2 codieren, das durch Formel [2] dargestellt wird (SEQ ID NO:2) (die oben unterstrichene Sequenz C S C S S W L D K E C V Y F C H L D I I W), gehört die Sequenz, die durch Nr. 203 bis 265 in Formel [1] dargestellt wird (SEQ ID NO:1).
Ein Expressionsvektor mit der DNA-sequenz, die die Nucleotidsequenz enthält, die für reifes Human-Endothelin-2 codiert, kann nach dem folgenden Verfahren hergestellt werden:
(a) Messenger-RNA (mRNA) wird aus Zellen isoliert, die Human- Endothelin-2 erzeugen.
(b) Aus der mRNA wird einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) synthetisiert, und anschließend wird doppelsträngige DNA synthetisiert.
(c) Die komplementäre DNA wird in einen Klonierungsvektor, wie einen Phagen oder ein Plasmid, eingeführt.
(d) Wirtszellen werden mit dem so erhaltenen rekombinanten Phagen oder Plasmid transformiert.
(e) Nach der Kultivierung der so erhaltenen Transformante werden die Plasmide oder Phagen, die die gewünschte DNA enthalten, nach einem geeigneten Verfahren, wie Hybridisierung mit einer DNA- Sonde, die für einen Teil von Human-Endothelin-2 codiert, oder Immunoassay unter Verwendung eines Anti-Human-Endothelin-2-Antikörpers aus der Transformante isoliert.
(f) Die gewünschte klonierte DNA-Sequenz wird von der rekombinanten DNA abgespalten.
(g) Die klonierte DNA-Sequenz oder ein Teil davon wird stromabwärts von einem Promotor in den Expressionsvektor ligasiert.
Die mRNA, die für Human-Endothelin-2 codiert, kann aus verschiedenen endothelinerzeugenden Zellen erhalten werden, wie ACHN- Zellen von Human-Nierenkrebszellen.
Zu den Verfahren zur Herstellung der mRNA aus den Human-Endothelin-2-erzeugenden Zellen gehört das Guanidinthiocyanat-Verfahren [J.M. Chirgwin et al., Biochemistry 18, 5294 (1979)].
Unter Verwendung der so erhaltenen mRNA als Matrize wird mit Hilfe von Reverser Transcriptase cDNA synthetisiert, zum Beispiel im Einklang mit dem Verfahren von H. Okayama et al. [Molecular and Cellular Biology 2, 161 (1979); und ibid. 3, 280 (1983)]. Die so erhaltene cDNA wird in das Plasmid eingeführt.
Zu den Plasmiden, in die die cDNA eingeführt werden kann, gehören zum Beispiel PBR322 [Gene 2, 95 (1977)], PBR325 [Gene 4, 121 (1978)], pUCl2 [Gene 19, 259 (1982)], pUCl3 [Gene 19, 259 (1982)], pUC118 und PUC119, die jeweils von Escherichia coli abgeleitet sind, sowie pUB110, das von Bacillus subtilis abgeleitet ist [Biochemical and Biophysical Research Communication 112, 678 (1983)]. Es kann jedoch auch jedes andere Plasmid verwendet werden, solange es sich in der Wirtszelle replizieren und züchten läßt. Beispiele für die Phagenvektoren, in die die cDNA eingeführt werden kann, sind gtll. Es kann jedoch auch jeder andere Phagenvektor verwendet werden, solange er sich in der Wirtszelle züchten läßt.
Zu den Verfahren zum Einführen der cDNA in das Plasmid gehört zum Beispiel das Verfahren, das in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, S. 239 (1982), beschrieben ist. Zu den Verfahren zum Einführen der cDNA in den Phagenvektor gehört zum Beispiel das Verfahren von T.V. Hyunh et al. [DNA Cloning, A Practical Approach 1, 49 (1985)].
Das so erhaltene Plasmid wird in eine geeignete Wirtszelle, wie Escherichia und Bacillus, eingeführt.
Beispiele für das oben beschriebene Escherichia sind Escherichia coli K12DH1 [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 60, 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)] und C600 [Genetics 39, 440 (1954)].
Beispiele für das oben beschriebene Bacillus sind Bacillus subtilis MI114 [Gene 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry 95, 87 (1984)].
Zu den Verfahren zum Transformieren der Wirtszelle mit dem Plasmid gehören zum Beispiel das Calciumchlorid-Verfahren oder das Calciumchlorid/Rubidiumchlorid-Verfahren, die in T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, 5. 249 (1982), beschrieben sind.
Wenn der Phagenvektor verwendet wird, kann er zum Beispiel in proliferiertes E. coli transduziert werden, wobei man das invitro-Verpackungsverfahren [T. Maniatis et al., Molecular Cloningl A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, 5. 262-268] verwendet.
Human-cDNA-Bibliotheken, die Human-Endothelin-2-cDNA enthalten, können nach den oben genannten Verfahren erhalten werden.
Zu den Verfahren zum Klonieren von Human-Endothelin-2-cDNA aus der Human-DNA-Bibliothek gehört zum Beispiel das Plaque-Hybridisierungsverfahren unter Verwendung des Phagenvektors X charon 4A und eines Oligonucleotids, das auf der Basis der Aminosäuresequenz von Human-Endothelin-2 chemisch synthetisiert wurde, als Sonde [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1982)]. Die so klonierte Human-Endothelin-2-cDNA kann, falls notwendig, zum Beispiel in pBR322, pUCl2, PUC13, pUC18, pUC19, pUC118 und pUC119 subkloniert werden, so daß man die Human-Endothelin-2-cDNA erhält.
Die Nucleotidsequenz der so erhaltenen DNA wird zum Beispiel nach dem Maxam-Gilbert-Verfahren [A.M. Maxam und W. Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977)] oder dem Didesoxyverfahren [J. Messing et al., Nucleic Acids Research 9, 309 (1981)] bestimmt, und das Vorliegen der Human-Endothelin-2-DNA wird durch Vergleich mit der bekannten Aminosäuresequenz bestatigt.
Wie oben beschrieben, erhält man die cDNA (Human-Endothelin-2- cDNA), die durch Formel [1] dargestellt wird (SEQ ID NO:1) und die für Human-Endothelin-2 codiert.
Figur 2 zeigt die Restriktionsenzymfragmentkarte der cDNA, die für das in dem unten beschriebenen Beispiel 2 erhaltene Human- Endothelin-2 codiert. Figur 3 zeigt die nach dem Didesoxyverfahren bestimmte Nucleotidsequenz der cDNA (SEQ ID NO:1) sowie die aus dieser Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz Figur 4 zeigt die Aminosäuresequenz eines Vorläufers von Human- Endothelin-2 (SEQ ID NO:2).
Die wie oben beschrieben klonierte cDNA, die für Human-Endothelin-2 codiert, kann je nach Verwendungszweck so, wie sie ist, oder, falls gewünscht, nach Abbau mit einem Restriktionsenzym verwendet werden.
Ein Bereich, der exprimiert werden soll, wird aus der klonierten cDNA abgespalten und stromabwärts von dem Promotor in einen für die Expression geeigneten Träger (Vektor) ligasiert, wodurch der Expressionsvektor erhalten werden kann.
Die cDNA enthält ATG als Translationsstartcodon am 5'-Terminus und kann TAA, TGA oder TAG als Translationsstopcodon am 3'-Terminus enthalten. Das Translationsstartcodon und das Translationsstopcodon können unter Verwendung eines geeigneten synthetischen cDNA-Adapters angefügt werden. Der Promotor wird weiterhin stromaufwärts davon ligasiert, um die cDNA zu exprimieren.
Beispiele für die Vektoren sind die obigen von E. coli abgeleiteten Plasmide, wie pBR322, pBR325, pUC12 und PUC13, die von Bacillus subtilis abgeleiteten Plasmide, wie pUB110, pTP5 und pC194, von Hefe abgeleitete Plasmide, wie pSH19 und pSH15, Bakteriophagen, wie λ-Phage, und Tierviren, wie Retroviren und Vacciniaviren.
Als Promotor, der in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kommt jeder Promotor in Frage, solange er für die Expression in der Wirtszelle, die für die Genexpression ausgewählt wurde, geeignet ist.
Wenn die für die Transformation verwendete Wirtszelle Escherichia ist, wird vorzugsweise ein trp-Promotor, ein lac-Promotor, ein recA-Promotor, ein λPL-Promotor oder ein 1pp-Promotor verwendet. Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, wird vorzugsweise ein PHO5-Promotor, ein PGK-Promotor, ein GAP-Promotor oder ein ADH-Promotor verwendet. Insbesondere wird bevorzugt, daß die Wirtszelle Escherichia ist und der Promotor der trp-Promotor oder der λPL- Promotor ist.
Wenn die Wirtszelle eine tierische Zelle ist, sind jeweils ein von SV-40 abgeleiteter Promotor, ein Retroviruspromotor, ein Metallothioneinpromotor und ein Hitzeschockpromotor geeignet.
Für die Expression läßt sich auch wirkungsvoll ein Enhancer verwenden.
Unter Verwendung eines so konstruierten Vektors, der die cDNA enthält, die für das reife Peptid von Human-Endothelin-2 codiert, werden Transformanten hergestellt.
Zu den Wirtszellen gehören zum Beispiel Escherichia, Bacillus, Hefe und tierische Zellen.
Als spezielle Beispiele für die obigen Escherichia und Bacillus können ähnliche Stämme wie die oben beschriebenen genannt werden.
Beispiele für die obige Hefe sind Saccharomyces cerevisiae AH22, AH22R&supmin;, NA87-11a und DKD-5D.
Beispiele für die tierischen Zellen sind Affenzellen COS-7, Vero, Chinesische Hamsterzellen (CHO), Maus-L-Zellen und Human-FL- Zellen.
Die Transformation des obigen Escherichia wird zum Beispiel nach dem Verfahren durchgeführt, das in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 69, 2110 (1972), beschrieben ist.
Die Transformation des obigen Bacillus wird zum Beispiel nach dem Verfahren durchgeführt, das in Molecular & General Genetics 168, 111 (1979), beschrieben ist.
Die Transformation der Hefe wird zum Beispiel nach dem Verfahren durchgeführt, das in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929 (1978), beschrieben ist.
Die Transformation der tierischen Zellen wird zum Beispiel nach dem Verfahren durchgeführt, das in Virology 52, 456 (1973), beschrieben ist.
So werden Transformanten erhalten, die mit einem Expressionsvektor transformiert sind, der die cDNA enthält, die für das reife Peptid von Human-Endothelin-2 codiert.
Wenn bakterielle Transformanten kultiviert werden, ist ein flüssiges Medium als für die Kultur verwendetes Medium besonders gut geeignet. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, anorganische Verbindungen und andere, die für das Wachstum der Transformanten notwendig sind, sind darin enthalten. Beispiele für die Kohlenstoffquellen sind Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Saccharose. Beispiele für die Stickstoffquellen sind anorganische oder organische Stoffe, wie Ammoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl und Kartoffelextraktlösung. Zu den anorganischen Verbindungen gehören zum Beispiel Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid. Weiterhin können Hefe, Vitamine, wachstumsfördernde Faktoren usw. hinzugefügt werden.
Der pH-Wert des Mediums beträgt vorzugsweise 5 bis 8.
Als Medium für die Kultur von Escherichia wird vorzugsweise zum Beispiel M9-Medium verwendet, das Glucose und Casamino Acids enthält (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972). Damit der Promotor effizient wirkt, kann, falls erforderlich, eine Verbindung wie 3-Indolylacrylsäure hinzugefügt werden.
Wenn die Wirtszelle Escherichia ist, wird die Kultur gewöhnlich 3 bis 24 Stunden bei 15 bis 43ºC durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn die Wirtszelle Bacillus ist, wird die Kultur gewöhnlich 6 bis 24 Stunden bei 30 bis 40ºC durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn Hefetransformanten kultiviert werden, wird zum Beispiel Burkholder-Minimalmedium [K.L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4505 (1980)] als Medium verwendet. Der pH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf 5 bis 8 eingestellt. Die Kultur wird gewöhnlich etwa 24 bis 72 Stunden bei 20 bis 35ºC durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Wenn Tierzelltransformanten kultiviert werden, gehören -zu den Beispielen für die Medien MEM-Medium, das 5 bis 20% Kälberfetusserum enthält [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI1640-Medium [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967] und 199-Medium [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)]. Der pH-Wert beträgt vorzugsweise 6 bis 8. Die Kultur wird gewöhnlich 15 bis 60 Stunden bei 30 bis 40ºC durchgeführt, wobei belüftet oder gerührt wird, falls notwendig.
Das reife Peptid von Human-Endothelin-2 (Endothelin-2) kann aus der oben beschriebenen Kultur zum Beispiel nach dem folgenden Verfahren isoliert und gereinigt werden.
Wenn das reife Peptid von Human-Endothelin-2 aus den kultivierten Zellen extrahiert wird, werden die Zellen nach der Kultur nach in der Technik bekannten Verfahren gewonnen. Dann werden die gewonnenen Zellen in einer geeigneten Pufferlösung suspendiert und durch Ultraschallbehandlung, Lysozym und/oder Frieren/Tauen zerstört. Danach erhält man eine rohe extrahierte Lösung des reifen Peptids von Human-Endothelin-2 durch Zentrifugation oder Filtration. Die Pufferlösung kann ein Protein-Denaturierungsmittel, wie Harnstoff oder Guanidin-Hydrochlond, oder ein Tensid, wie Triton X-100, enthalten.
Wenn das Human-Endothelin-2-Precursorprotein oder das reife Peptid in die Kulturlösung ausgeschieden wird, wird der Überstand nach Beendigung der Kultur nach in der Technik bekannten Verfahren von den Zellen abgetrennt und dann aufgefangen.
Die Abtrennung und Reinigung des Human-Endothelin-2-Precursorproteins oder des reifen Peptids, das in dem so erhaltenen Kulturüberstand oder der extrahierten Lösung enthalten ist, kann durch eine geeignete Kombination in der Technik bekannter Trennund Reinigungsverfahren erfolgen. Zu den bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren gehören Verfahren, die auf Löslichkeit beruhen, wie Salzfällung und Lösungsmittelfällung, Verfahren, die hauptsächlich auf einem Unterschied im Molekulargewicht beruhen, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese, Verfahren, die auf einem Unterschied in der elektrischen Ladung beruhen, wie Ionenaustausch-Säulenchromatographie, Verfahren, die auf spezifischer Affinität beruhen, wie Affinitätschromatographie, Verfahren, die auf einem Unterschied in der Hydrophobie beruhen, wie Umkehrphasen-HPLC, und Verfahren, die auf einem Unterschied im isoelektrischen Punkt beruhen, wie Elektrophorese mit isoelektrischer Fokussierung.
Die Aktivität des so gebildeten Human-Endothelin-2-Precursorproteins oder des reifen Peptids kann durch ein Enzym-Immunoassay unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers gemessen werden. Wenn die Produkte eine gefäßverengende Wirkung haben, kann das Human-Endothelin-2-Precursorprotein oder das reife Peptid auch auf deren Basis gemessen werden.
Mit den mit der DNA der vorliegenden Erfindung transfizierten oder transformierten Zellen lassen sich große Mengen des reifen Peptids von Human-Endothelin-2 erzeugen. Daher kann die Herstellung dieser Peptide vorteilhaft erreicht werden.
Wie die anderen Endothelinpeptide können auch das hier hergestellte Endothelin-2 und sein Vorläufer nicht nur als Hypotonie- Therapeutikum oder topisches gefäßverengendes Mittel verwendet werden, sondern sie lassen sich auch verwenden, um den Mechanismus der gefäßverengenden Reaktionen in vivo zu analysieren und die Antagonisten der gefäßverengenden Faktoren aufzuklären. Ähnlich haben die Peptide als gefäßverengende Mittel Wirkungen wie eine Verhinderung verschiedener Arten von Blutung, zum Beispiel Magen- oder Speiseröhrenblutung, und können auch für die Heilung verschiedener Schocksymptome geeignet sein. Diese Peptide können oral, lokal, intravenös oder parenteral, vorzugsweise topisch oder intravenös, verabreicht werden. Die Dosis-ist 0,001 µg bis 100 µg/kg und vorzugsweise 0,01 µg bis 10 µg/kg. Die Peptide werden in einer gewichtsabhängigen Dosis und in Form einer Lösung in 1 bis 10 ml physiologischer Kochsalzlösung verwendet.
Die Peptide der vorliegenden Erfindung können zusammen mit weiteren Komponenten zu verschiedenen Präparaten, wie Emulsionen, hydratisierten Gemischen, Tabletten, Lösungen, Pulvern, Granulaten, Kapseln und Pillen, verarbeitet werden. Beispiele für die weiteren Komponenten sind pharmazeutisch annehmbare Arzneimittelhilfsstoffe, Sprengmittel, Gleitmittel, Bindemittel, Dispergiermittel, Weichmacher, Füllstoffe und Träger. Was die weiteren Komponenten betrifft, so sind Beispiele für die Arzneimittelhilfsstoffe Lactose, Glucose und weißer Zucker; solche für die Sprengmittel sind Stärke, Natriumalginat, Agarpulver und Carboxymethylcellulosecalcium; solche für die Gleitmittel sind Magnesiumstearat, Talk und flüssiges Paraffin; solche für die Bindemittel sind Sirup, Gelatinelösung, Ethanol und Polyvinylalkohol, solche für die Dispergiermittel sind Methylcellulose, Ethylcellulose und Schellack; und solche für die Weichmacher sind Glycerin und Stärke.
Wenn Nucleotide, Aminosäuren usw. in dieser Beschreibung und den Zeichnungen durch Abkürzungen bezeichnet sind, werden die Abkürzungen verwendet, die von der IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature angenommen wurden oder die in der Technik gewöhnlich verwendet werden. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn die Aminosäuren als optische Isomere vorliegen können, sollen die L-Formen dargestellt sein, wenn nichts anderes angegeben ist.
DNA : Desoxyribonucleinsäure
cDNA : komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A : Adenin
T : Thymin
G : Guanin
C : Cytosin
RNA : Ribonucleinsäure
mRNA : Messenger-Ribonucleinsäure
dATP : Desoxyadenosintriphosphat
dTTP : Desoxythymidintriphosphat
dGTP : Desoxyguanosintriphosphat
dCTP : Desoxycytidintriphosphat
ATP : Adenosintriphosphat
EDTA : Ethylendiamintetraessigsäure
SDS : Natriumdodecylsulfat
Gly oder G: Glycin
Ala oder A: Alanin
Val oder V: Valin
Leu oder L: Leucin
Ile oder I: Isoleucin
Ser oder S: Serin
Thr oder T: Threonin
Cys oder C: Cystein
Met oder M: Methionin
Glu oder E: Glutaminsäure
Asp oder D: Asparaginsäure
Lys oder K: Lysin
Arg oder R: Arginin
His oder H: Histidin
Phe oder F: Phenylalanin
Tyr oder V: Tyrosin
Trp oder W: Tryptophan
Pro oder P: Prolin
Asn oder N: Asparagin
Gln oder Q: Glutamin
Ein Teil der Aminosäuresequenz der Human-Endothelin-2-Vorläuferproteine der vorliegenden Erfindung kann modifiziert sein, und zwar kann eine Addition, Eliminierung oder Substitution mit anderen Aminosäuren vorliegen, solange die gefäßverengende Eigenschaft nicht verlorengeht.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand des folgenden Bezugsbeispiels und der Beispiele ausführlicher beschrieben.
Die in Beispiel 3 erhaltene Transformante E. coli MV1184/pHET-2(K) wurde am 10. Juli 1990 beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) unter der Zugriffsnummer IFO 15064 und außerdem am 12. Juli 1990 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRL) unter der Zugriffsnummer FERM BP-3008 hinterlegt.
Die in Beispiel 5 erhaltene Transformante E. coli MC1061/P3/ PTS612 wurde am 24. Dezember 1990 beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan (IFO) unter der Zugriffsnummer IFO 15122 und außerdem am 20. Dezember 1990 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRI) unter der Zugriffsnummer FERM BP-3211 hinterlegt.

Bezugsbeispiel

(1) Test auf verengende Wirkung auf die glatte Gefäßmuskulatur

Spiralproben der rechten Koronarartene von Schweinen (0,5 x 20 mm), wobei die Gefäßinnenhaut durch Reiben mit einem kleinen Tupfer freigelegt wurde, werden in 3 ml Krebs-Ringer-Lösung, die auf 37ºC gehalten wurde, suspendiert und mit einem Gasgemisch gesättigt, das 5 Vol.-% Kohlendioxid und 95 Vol.-% Sauerstoff enthält. Nachdem die Basalspannung auf 2 g gesetzt wurde, wird die isometrische Spannung mit einem Spannungswandler gemessen.

(2) Test auf cardiotonische Wirkung

Anstelle der Spiralproben der rechten Koronararterie von Schweinen, die in dem unter dem obigen Punkt (1) beschriebenen Test verwendet wurden, werden aufgehängte Proben des rechten Atriums von Meerschweinchen verwendet, und die Spannung und die Herzgeschwindigkeit werden nach demselben Verfahren gemessen, wie es unter (1) beschrieben ist.

Beispiel 1

Herstellung einer DNA-Sonde, die für einen Teil der DNA von genomischem Human-Endothelin-2 codiert

Eine DNA-Sonde, die für einen Teil der DNA-Sequenz von genomischem Human-Endothelin-2 codierte und die folgende Sequenz hatte, wurde chemisch synthetisiert und zur Hybridisierung mit einer von ACHN- Zellen abgeleiteten cDNA-Bibliothek verwendet.

Beispiel 2

Extraktion von mRNA und Herstellung einer cDNA-Bibliothek

(1) Extraktion von Gesamt-RNA aus ACHN-Zellen

Human-Nierenkrebszellen, ACHN (ATCC, CRL 1611), wurden bei 37ºC in Dulbecco-Minimalmedium (D-MEM), das 10% Kälberfetusserum enthielt, in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 95% Luft kultiviert [für zehn 150-cm²-Kolben (Falcon)]. Nach 3 bis 4 Tagen wurde die Kulturlösung entfernt, und dann wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen. Dann wurden 100 ml einer Guanidinisothiocyanat-Lösung (5 M Guanidinisothiocyanat, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA und 5% Mercaptoethanol) pro Kolben hinzugefügt, um die Zellen zu lösen, und dann wurden sie in einem 150-ml-Glashomogenisator gewonnen und ausreichend verrieben.
Eine 20%ige Natriumsarcosinatlösung (20% Natrium-N-lauroylsarcosinat, 50 mM Tris-HOL (pH 7,6), 10 mM EDTA und 5% Mercaptoethanol) wurde bis zu einer Endkonzentration von 5% hinzugefügt, worauf eine weitere ausreichende Verreibung folgte. Festes Cäsiumchlorid wurde bis zu einer Konzentration von 0,2 g/ml hinzugefügt, worauf eine weitere ausreichende Verreibung folgte, während es aufgelöst wurde. Dann wurden 5 ml einer 5,2 M Lösung von Cäsiumchlorid in 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in ein Röhrchen für einen SW28-Rotor (Beckmann) gegeben, und 30 ml der oben genannten Zellösung wurde darübergeschichtet; anschließend wurde 48 Stunden bei 22ºC mit 28 000 U/min mit dem SW28-Rotor zentrifugiert.
RNA wurde auf dem Sediment in dem Röhrchen gewonnen, und eine Lösung der oberen Schicht wurde durch Absorption nach dem Verfahren von Kaplain entfernt [Biochem. J. 183, 181-184 (1979)]. Dann, nachdem die RNA in einer 0,4%igen Sarcosinlösung aufgelöst worden war, wurde NaCl bis zu einer Endkonzentration von 0,25 M hinzugefügt. Kaltes Ethanol wurde in einer Menge von 2,5 Volumina hinzugefügt, und die resultierende Lösung wurde bei -20ºC aufbewahrt.

(2) Abtrennung von PolyA&spplus;-RNA

Gesamt-RNAs wurden durch Zentrifugation (20 Minuten bei 25 000 U/min) gewonnen, und PolyA&spplus;-RNA wurde durch Oligo(dT)-Säulenchromatographie gemäß dem Handbuch des Verfahrens zur Reinigung von PolyA&spplus;-RNA (Pharmacia) partiell gereinigt. Etwa 5% der Gesamt-RNAS wurden als PolyA&spplus;-RNA gewonnen.

(3) Synthese von cDNA und Herstellung einer cDNA-Bibliothek unter Verwendung des Phagen λgt11

Aus 5 µg der in dem oben beschriebenen (2) erhaltenen PolyA&spplus;-RNA wurde cDNA synthetisiert, wobei ein cDNA-Synthesekit (Amersham) gemäß dem Handbuch verwendet wurde und ³²P-dCTP als Marker für die cDNA-Synthese verwendet wurde. Etwa 10% der verwendeten 5 µg der PolyA&spplus;-RNA wurden als doppelsträngige DNA (ds-DNA) erhalten.
In ähnlicher Weise wurden unter Verwendung eines cDNA-Klonierungskits (Amersham) Adapter für das Restriktionsenzym EcoRI durch die Ligasierungsreaktion an diese ds-DNA ligasiert und mit EcoRI behandelt, so daß man ds-DNA erhielt, an deren 5'- und 3'- Terminus Eco-RI-Adapter ligasiert waren.
Die cDNA, an die die Eco-RI-Adapter ligasiert waren, wurde in die EcoRI-Schnittstelle von Phage-λgt11-DNA eingeführt, und aus dieser wurden wieder Phagenteilchen aufgebaut, wobei man eine cDNA-Bibliothek des Phagen λgt11 erhielt. Die resultierende cDNA- Bibliothek des Phagen λgt11 zeigte einen Infektionswert von etwa 2 x 10&sup6; plaquebildenden Einheiten/ml.

Beispiel 3

Klonierung von Human-Endothelin-2-cDNA und Isolierung von Phagenklonen, die Human-Endothelin-2-cDNA enthalten
Der in (3) von Beispiel 2 erhaltene rekombinante Phage (λgt11) wurde unter der Bedingung von 1500 Plaques/Schale nach dem Verfahren von Pentone und Davis [Science-196, 180-182 (1977)] in E. coli Y1090 transfiziert, und dann wurde der Phage auf ein Nitrocellulosefilter übertragen. Das Filter wurde nach dem Verfahren von Benton und Davis [W.D. Benton und R.W. Davis, Science 196, S. 180 (1977)] behandelt. Ein partielles DNA-Fragment mit einer Nucleinsäuresequenz [Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 2863-2867 (1989)], die für Endothelin-2 von genomischer Human-DNA codiert und das die folgende Sequenz (SEQ ID NO:9) hatte, wurde mit einem DNA-Synthesizer (Modell AB1) synthetisiert, und eine ³²P-markierte Sonde wurde nach dem statistischen Primerverfahren unter Verwendung von α-³²P-dCTP hergestellt.
Die auf das Nitrocellulosefilter übertragene rekombinante Phagen- DNA wurde nach dem Verfahren von Pentone und Davis [Science 196, 180-182 (1977)] mit der ³²P-markierten Endothelin-2-Sonde hybridisiert. Phagenklone, die Hybride bildeten, wurden durchmustert, wobei man mehrere positive Plaques erhielt. Der klonierte Phage wurde in LB-Brühe bei 37ºC 5 bis 6 Stunden lang in E. coli Y1090 transfiziert. Nach dem Entfernen von E. coli durch Zentrifugation wurden 200 µl einer Lösung von 20% Polyethylenglycol und 0,15 M NaCl zu 1 ml der Kulturlösung gegeben, die man anschließend 2 bis 3 Stunden bei 4ºC stehen ließ. Dann wurden die Phagenteilchen durch 20 Minuten Zentrifugation bei 15 000 U/min ausgefällt. Die Phagenteilchen wurden durch Zugabe von 100 µl destilliertem Wasser suspendiert, und die resultierende Suspension wurde 10 Minuten lang auf 95ºC erhitzt. Diese rekombinante Phagen-DNA war λgt11. Unter Verwendung der DNA-Fragmente
in der Nähe der EcoRI-Stelle, einer rekombinanten Stelle der cDNA, als Primer für λgt11 wurde dieser cDNA-Teil durch Amplifikation nach dem Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
[I.A. Michael und Iunis, PCR Protocols,-Academic Press (1990)] erhalten.
Die durch Amplifikationssynthese nach dem PCR-Verfahren erhaltene DNA wurde mit EcoRI behandelt und anschließend durch die Ligasierungsreaktion an die EcoRI-Stelle des Plasmids pUC118 ligasiert. Dann wurde E. coli DH5α in die unten gezeigten 5 Klone transformiert:
pHET-2(52)/E. coli MV1184
pHET-2(31)/E. coli MV1184
pHET-2(27)/E. coli MV1184
pHET-2(26)/E. coli MV1184
pHET-2(35)/E. coli MV1184
Von diesen Klonen wird pHET-2(52)/E. coli MV1184 als pHET/2(K)/ E. coli MV1184 bezeichnet.

Beispiel 4

Bestimmung der Nucleotidsequenz der klonierten DNA

Die in dem oben beschriebenen Beispiel 3 erhaltene Plasmid-DNA wurde gereinigt, und die Nucleotidsequenz der DNA wurde nach dem Didesoxy-Kettenabbruchverfahren bestimmt [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463-5467 (1977)]. Die Bestimmungsrichtung und die gesamte Nucleotidsequenz davon (SEQ ID NO:1) sind in Figur 3 gezeigt.
Die cDNA, die für den Vorläufer von Human-Endothelin-2 codiert, ist pHET-2(52) und besteht aus 1218 Nucleotiden. Ein offenes Leseraster von 534 Nucleotiden wird daraus entfernt; es codiert für 178 Aminosäurereste. Der eingerahmte Teil ist der Teil von Human-Endothelin-2 und ist mit der Sequenz identisch, die zuvor aus der Sequenz der genomischen DNA gezeigt wurde.

Beispiel 5

Expression von Human-Endothelin-2

Das Plasmid pHET-2(K) mit einer cDNA, die für den Vorläufer von Human-Endothelin-2 codiert, wurde mit dem Restriktionsenzym EcoRI gespalten und in die EcoRI-Stelle des Expressionsvektors pcDNA eingeführt. Dann wurde E. coli MC1061/P3 transformiert, wobei man E. coli MC1061/P3/PTS612 erhielt (Figur 5). Dieses Plasmid wurde gereinigt und zusammen mit dem Plasmid pSV2neo nach dem Verfahren von McCutchan und Pagano [J.H. McCutchan und J.S. Pagano, J. of the National Cancer Institute, 41(2), S. 351-357 (1968)] in CHO- K1-Zellen eingeschleust. Dann wurden gegen den Wirkstoff G418 resistente Zellen selektiert. Die Zellen wurden kloniert, und die Zellinie wurde CHO-12-5-12 genannt.
Die selektierten Zellen wurden in DMEM-Medium kultiviert, das 10% Kälberserum enthielt, und das immunoreaktive ET der Kulturlösung wurde bestimmt. Als Ergebnis wurde die Sekretion von immunoreaktivem Endothelin (ausgefüllte Quadrate) und von Big-Endothelin (leere Quadrate) neben der Zellproliferation (leere Dreiecke zeigen die Gesamtzahl der Zellen) beobachtet, wie es in Figur 6 gezeigt ist.

Beispiel 6

Expression von Human-Endothelin und Endothelin-Vorläufer in einer CHO-Zell-Transformante und Bestimmung ihrer Strukturen

1500 ml eines Kulturüberstandes von CHO-12-5-12-Zellen, also CHO- Zellen, die mit dem Expressionsplasmid pTS612 transformiert wurden, in das die cDNA von Human-Endothelin-2 eingeführt worden war, wurden in drei Portionen aufgeteilt, und jede 500-ml-Portion wurde in der folgenden Weise behandelt.
(1) Jede Portion wurde durch ein 0,22-µm-Filter filtriert und (2) einer AwETN40-Affinitätssäulenchromatographie unterworfen (der Herstellungsweg ist unten beschrieben). (3) Die absorbierten Substanzen wurden durch Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) getrennt (Figur 7). (4) Jede der resultierenden Fraktionen wurde im Vakuum getrocknet und (5) einem Enzym-Immunoassay (EIA) auf Human-Big- Endothelin-2 (1-37) unterworfen. (6) Eine Fraktion (Peak 24 in Figur 7) eluierte 2 Minuten,bevor die Elution von synthetisiertem Human-Big-Endothelin-2 (1-37) erfolgte, und (7) die Aminosäuresequenz wurde mit einem AB1 (Modell 477A) bestimmt.
Als Ergebnis wurde die Sequenz von 20 Aminosäureresten vom N-Terminus her zu
bestimmt.
Das siebente Leu vom N-Terminus her entsprach offensichtlich Leu zu der Zeit, als die Nucleotidsequenz der cDNA von Endothelin-2 in die Aminosäuresequenz translatiert wurde. Der N-Terminus wurde als Cys abgeleitet, und die obige Sequenz wurde als die Sequenz von Endothelin-2 abgeleitet, wobei die Positionen 1, 3, 11 und 15 von Cys in Betracht gezogen wurden.
Obwohl oben die N-terminale Aminosäuresequenz von immunoreaktivem (ir)-Big-Endothelin-2 gezeigt wurde, das dem Peak 24 in Figur 7 entspricht, wurde die Fraktion von Peak 24 mit Massenspektrographen (JMSS-HX110HF und DA-500, JEOL) weiter analysiert, um das gesamte Molekulargewicht und die C-terminale Aminosäuresequenz zu bestimmen. Als Ergebnis wurde das Molekulargewicht zu 4342 gemessen (Figur 8), und die folgende Sequenz wurde abgeleitet, die aus 38 Aminosäureresten besteht, wobei ein Arg an den C- Terminus der Aminosäuren 1-37, bezogen auf die Nucleotidsequenz der cDNA von Human-Big-Endothelin-2 (1-37) gebunden ist:
Dieses neue Peptid wird Human-Big-Endothelin-2 (1-38) genannt. Das Molekül eluierte an derselben Stelle, da dieses Human-Big- Endothelin-2 (1-38) vermutlich auch in menschlichem Blut und im Kulturüberstand der Human-Nierenkrebszellen ACHN vorkommt, und dieses Molekül sowie Human-Big-Endothelin-2 (1-37) sind Vorläufer von Endothelin-2.
Die Antikörpersäule mit AwETN40 wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt.
Man ließ AwETN40-Antikörper nach den in der Technik bekannten Verfahren an eine Tresyl-TOYOPAL-Säule (TOYO ROSHI Ltd. Japan) binden. 500 ml des Kulturüberstands von CHO-12-5-12-Zellen wurden mit 1 ml des erhaltenen Gels behandelt. Und zwar wurde eine Säule mit 1 cm Durchmesser bis zu einer Höhe von 0,5 cm mit der antikörperbindenden Säule gepackt, und eine Probe für RP-HPLC wurde durch die folgenden Schritte hergestellt:
(1) Man ließ 8 ml 0,05 M Glycin-HCl und 0,1 M NaCl durchfließen.
(2) Man ließ 30 ml Phosphatpuffer durchfließen.
(3) Man ließ 500 ml des Zellkulturüberstands durchfließen.
(4) Die Säule wurde mit 30 ml Phosphatpuffer gewaschen.
(5) Die Säule wurde mit 10 ml destilliertem Wasser gewaschen.
(6) Die Elution wurde mit 9 ml 60%igem CH&sub3;CN und 0,1%iger TFA durchgeführt.
Dann wurde das Eluat in Gegenwart von N&sub2;-Gas auf 200 bis 300 µl konzentriert und einer RP-HPLC unterworfen, wobei man durch Fraktionierung Immunreaktion-positive Substanzen, Endothelin-2 und Big-Endothelin-2 erhielt (Figur 7).
Die Bedingungen für die RP-HPLC waren wie folgt:
Säule: TSKgel ODS-80 (TOSO Ltd. Japan, 4,6 mm 1D x 25 cm)
Eluent A: 5% CH&sub3;CN, 0,05% TFA
Eluent B: 60% CH&sub3;CN, 0,05% TFA
Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von CH&sub3;CN von 18 bis 60% durchgeführt. Ein Teil jeder Fraktion wurde entnommen und mit EIA auf Human-Big-Endothelin-2 (1-37) getestet.
Der Endothelin-Vorläufer, der 21 Aminosäurereste von Endothelin-2 (ET-2) enthielt, wurde also in der CHO-Kl-Zelle, einer tierischen Zelle, exprimiert, und Endothelin-2, Big-Endothelin-2 (big-ET-2) (1-37) sowie big-ET-2 (1-38), die ein größeres Molekül als ET-2 aufweisen, sowie Proteine mit größeren Molekülen wurden in die Zellkulturlösung sezerniert.
Dieses System ist nützlich, um den Synthese- und den Sekretionsmechanismus von ET-2 zu erfahren und um Verfahren zur Hemmung von dessen Synthese und Sekretion zu entwickeln. Weiterhin steht dieses System zur Verfügung, um Mittel zur Hemmung der Synthese von drei Arten von Endothelinpeptiden einschließlich Peptiden, die mit Endothelin-1 und Endothelin-3 verwandt sind, zu entwickeln.
Wie oben beschrieben, wurde die cDNA kloniert, die für den Vorläufer von Human-Endothelin-2 codiert, und ihre Struktur wurde bestimmt. Diese cDNA wurde in den Expressionsvektor eingeführt, wodurch es möglich wurde, Endothelin-2 und seinen Vorläufer zu exprimieren.
Weiterhin wurde es durch die Verwendung der cDNA von Human- Endothelin-2 als Sonde möglich, die Genexpression von Endothelin-2 auf dem DNA-Niveau aufzuklären, zusammen mit Endothelin-1 und Endothelin-3, die von den Erfindern bereits erhalten wurden. Weiterhin wurde es in Kombination mit dem zuvor entwickelten EIA auf Endothelin möglich, Krankheiten zu diagnostizieren, die mit Endothelin in Zusammenhang stehen.

Sequenzlisting

SEQ ID NO:1
Sequenzlänge: 1218
Sequenztyp: Nucleotid
Strangform: Doppelstrang
Topologie: linear
Molekültyp: cDNA zu genomischer DNA
Herkunft: Human-Nierenkrebszelle-ACHN-cDNA
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:2
Sequenzlänge: 178
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Peptid
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:3
Sequenzlänge: 21
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Peptid
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:4
Sequenzlänge: 21
Sequenz typ: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Peptid
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:5
Sequenzlänge: 21
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Peptid
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:6
Sequenzlänge: 21
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Peptid
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:7
Sequenzlänge: 37
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Peptid
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:8
Sequenzlänge: 38
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Peptid
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:9
Sequenzlänge: 99
Sequenztyp: Nucleotid
Strangform: Einzelstrang
Topologie: linear
Molekültyp: andere, synthetisiert
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:10
Sequenzlänge: 24
Sequenztyp: Nucleotid
Strangform: Einzelstrang
Topologie: linear
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:11
Sequenzlänge: 24
Sequenztyp: Nucleotid
Strangform: Einzelstrang
Topologie: linear
Sequenzbeschreibung:
SEQ ID NO:12
Sequenzlänge: 21
Sequenztyp: Aminosäure
Topologie: linear
Molekültyp: Peptid
Sequenzbeschreibung:

Claims

1. Human-Endothelin-2-Precursorprotein, das durch die Aminosäuresequenz von Nr. 49 bis 86 von SEQ ID NO: 2 im Sequenzlisting dargestellt wird, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:8 im Sequenzlisting aufweist:

2. Human-Endothelin-2-Precursorprotein, das durch die Aminosäuresequenz von Nr. 49 bis 85 von SEQ ID NO: 2 im Sequenzlisting dargestellt wird, wobei das Protein die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:7 im Sequenzlisting aufweist: