DE69328060T2

DE69328060T2 - Angiotensin-II Typ-1 Rezeptor und dessen Herstellung

Info

Publication number: DE69328060T2
Application number: DE69328060T
Authority: DE
Inventors: Yukio Fujisawa; Hiroaki Konishi; Shun'ichi Kuroda
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-04-07
Filing date: 1993-04-07
Publication date: 2000-07-13
Anticipated expiration: 2013-04-08
Also published as: CA2093495A1; ATE190630T1; US5595882A; US5427922A; EP0585520B1; DE69328060D1; EP0585520A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen menschlichen Angiotensin-II-Rezeptor Typ 1, eine rekombinante DNA, die ihn kodiert, einen Transformanten, der diese rekombinante DNA trägt, ein Verfahren zur Herstellung des Rezeptors und seine Verwendung. Genauer liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren, um die biologischen Aktivitäten von Angiotensin- II-Antagonisten und -Agonisten in einem reinen System, das im wesentlichen keine anderen Rezeptoren enthält, genau zu untersuchen, indem ein menschliches Gen für den Angiotensin-II- Rezeptor Typ 1 in einer Tierzelle unter Verwendung der Gentechnik exprimiert wird.

Hintergrund der Erfindung

Das Renin-Angiotensin-(RA)-System, das wesentlich ist für die Steuerung des Blutdrucks und der wässrigen Elektrolyten in vivo, spielt eine Schlüsselrolle bei verschiedenen Bluthochdruckerkrankungen, Stauungsherzinsuffizienz und Ödemkrankheiten.
Renin, das hauptsächlich in renalen juxtaglomerulären Apparat erzeugt wird, wirkt auf Angiotensinogen, das im Blut, der Niere und anderen Organen vorhanden ist, ein unter Bildung von Angiotensin (Ang) I. Ang I besitzt praktisch keine biologische Aktivität und wird durch die Wirkung des Angiotensin- Converting Enzyme (ACE) in eine biologisch aktive Form umgewandelt, die als Ang II bekannt ist. Es wird angenommen, daß Ang II den wichtigsten Beitrag zur biologischen Aktivität des RA-Systems leistet, obwohl Ang III auch von dem gleichen System erzeugt wird. Die Anzahl der Aminosäuren von Ang III ist um eins kleiner als die von Ang II und die biologische Aktivität ist der von Ang II ähnlich.
Die wichtigste Wirkung von Ang II ist die kardiovaskuläre Wirkung, wobei die periphäre gefäßverengende Wirkung sehr stark ist und eine Hauptrolle bei der Aufrechterhaltung des Blutdrucks spielt. Zusätzlich zu dieser Wirkung hat sich erwiesen, daß Ang II aktiv auf die Zona glomerubosa der Nebennierenrinde wirkt, um die Aldosteron-Produktion zu induzieren und auf die markhaltigen und sympathischen Nervenenden der Nebennierenrinde, um die Catecholaminausschüttung, die Vasopressinausschüttung und die Prostaglandin E2- und I2- Produktion zu fördern und an der glomerulären Filterfunktion und dem renalen urinbildenden tubulären Natriumreabsorptionsmechanismus beteiligt ist. Da Renin und Ang II auch im Gehirn, Herzen, den Gefäßwänden, der Nebennierenrinde und anderen Nicht-Nierenorganen erzeugt werden, zieht ihre lokale Wirkung, wenn es in diesen ectopischen RA-Systemen erzeugt wird, die Aufmerksamkeit auf sich, ebenso wie die obigen physiologischen Wirkungen.
Da das RA-System seine biologische Aktivität hauptsächlich dem Ang II verdankt, wie oben angegeben, wurde angenommen, daß die oben erwähnten Krankheiten verhindert oder gelindert werden können, indem die Ang II-Produktion und damit das RA- System unterdrückt wird. Um die Reninproduktion zu hemmen, die das Ausgangsmaterial des RA-Systems liefert, wurden lange Zeit β-Blocker verwendet. Da β-Blocker jedoch einen breiten Bereich an Einwirkungspunkten besitzen, hat sich der Schwerpunkt auf die Entwicklung von Renininhibitoren verlagert, deren Absorption im Verdauungstrakt unbefriedigend ist; Es wurde kein Arzneimittel entwickelt, das praktische Anwendung gefunden hat. Die derzeit häufig verwendeten RA-System- Inhibitoren sind ACE-Hemmer, z. B. Captopril, Enalapril, Delapril und Alacepril. Obwohl diese Arzneimittel bereits in praktischer Anwendung sind aufgrund ihrer ausgezeichneten Wirkung, haben sie Nebenwirkungen, z. B. trockenen Husten und Diurese als Ergebnis einer Erhöhung der Bradykinin- und Prostaglandingehalte, da sie auch die Kininase II unterdrüc ken. Daher war die Entwicklung eines Ang II- Rezeptorantagonisten als Arzneimittel, das nur die biologische Aktivität von Ang II unterdrückt, erwünscht.
Oral verabreichbare nicht-peptidartige-Ang II-Rezeptorantagonisten wurden seit langer Zeit untersucht. Z. B. wurden Verbindungen der Imidazolacetatreihe auf ihre diuretische und blutdrucksenkende Wirkung seit etwa 1976 untersucht und CV- 2961 und andere Verbindungen zeigten eine Ang II- Rezeptorantagonistaktivität [Y. Furukawa et al., US-Patent Nr 4,340,598 (1982) Y. Furukawa et al., US-Patent Nr. 4,355,040 (1982)]. Seitdem gab es Verbesserungen bei diesen Verbindungen, was zur Entwicklung von DuP 753 geführt hat [A. T. Chiu et al., Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 252, 711 (1990)]. Es erwies sich, daß DuP 753 spezifisch auf Ang II-Rezeptoren in der Gefäßwand, der Nebennierenrinde und anderen Organen einwirkt, um nur die Ang II- Wirkung zu unterdrücken. Es wurde auch gezeigt, daß es keine Wirkung auf die Reaktionen von KCl, Norepinephrin, Isoproterenol, Vasopressin, Bradykinin, Acetylcholin oder 5-HT oder auf die ACE-Wirkung hat, sogar bei supprimierenden Dosen in hoher Konzentration (10 uM) von Ang II [P. C. Wong et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 252, 719 (1990)]. Aufgrund der Erkenntnis dieser pharmakologischen Eignung von nichtpeptidartigen Antagonisten für Ang II-Rezeptoren wurden die Untersuchungen an Ang II-Rezeptoren verstärkt. Es wird angenommen, daß es mindestens zwei Arten von Ang II-Rezeptoren gibt, nach der Reaktivität der Antagonisten: Rezeptoren-Typ 1, für die DuP 753 antagonistisch ist, und Rezeptoren-Typ 2, für die PD123177 antagonistisch ist [P. B. M. W. M. Timmermans, et al., Trends in Pharmaceutical Science (TiPS), 12, 55 [1991], wobei angenommen wird, daß die Rezeptoren von Typ 1 eine Schlüsselrolle bei bekannten Ang II-abhängigen Krankheiten spielen.
Die Entwicklung von Ang II-Typ 1-Rezeptorantagonisten war sehr schnell. Um die Antagonistaktivität eines Arzneimittels genau festzustellen, ist es notwendig, Zellen oder eine Zellmembranfraktion nur mit Ang II-Rezeptoren vom Typ 1 zu verwenden. Die in diesen Untersuchungen verwendeten Rezeptoren basierten jedoch auf Membranfraktionen, die von Labortieren stammten (z. B. Rindern, Ratten), die verschiedene andere Rezeptoren als den gewünschten Ang II-Rezeptor enthalten. Aus diesem Grund besteht ein Bedarf zur Herstellung von Zellen, die spezifisch menschliche Ang II-Rezeptoren vom Typ 1 exprimieren und für die Verwendung solcher Zellen oder Zellmembranfraktionen um die biologische Aktivität des Antagonisten in einem reinen System genau zu bestimmen.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegenden Erfinder waren erfolgreich bei der Klonierung eines Gens aus einer cDNA-Bibliothek, die aus menschlicher Plazenta stammt, das eine große Homologie mit bekannten Genen für den Ang II-Rezeptor-Typ 1 von Menschen, Rindern und Ratten zeigt, das aber eine neue Nukleotidsequenz hat. Die Erfinder exprimierten diesen Klon in einer Tierzelle und fanden, daß der Klon als Ang II-Rezeptor-Typ 1 dienen kann. Unter der Annahme, daß der so erhaltene Rezeptor ein Ang II- Rezeptoren-Typ 1 menschlichen Ursprungs ist, der von jedem bekannten Ang II-Rezeptor-Typ 1 menschlichen Ursprungs verschieden ist, machten die Erfinder weitere Untersuchungen basierend auf den obigen Erkenntnissen und entwickelten die vorliegende Erfindung.
Somit umfaßt die vorliegende Erfindung, (1) daß man einen Primer synthetisiert, um eine gut konservierte Region zu amplifizieren auf Basis der für den Ang II-Rezeptor-Typ 1 angegebenen Sequenzen, der aus Zona glomerulosa-Zellen der Nebennierenrinde vom Rind stammt [K. Sasaki et al., Nature, 351, 230 (1991)] und für den Ang II-Rezeptor-Typ 1, der aus glat ten Aortamuskelzellen der Ratte stammt [T. J. Murphy et al., Nature 351, 233 [1991], (2) die gut konservierte Region aus einer cDNA-Bibliothek, die aus menschlicher Plazenta stammt, mit PCR unter Verwendung dieser Primer amplifiziert, (3) die amplifizierte DNA in einem Vektor subkloniert, (4) den Bereich der subklonierten DNA identifiziert, der den menschlichen Ang II-Rezeptor-Typ 1 kodiert, (5) ein neues Ang II- Rezeptor-Typ 1-Gen menschlichen Ursprungs erhält durch Plaquehybridisierung unter Verwendung der kodierenden Sequenz als Sonde, (6) eine rekombinante DNA herstellt, um das Gen von (5) oben in einer Wirtszelle zu exprimieren, (7) einen Transformanten herstellt, der die rekombinante DNA von (6) oben trägt, (8) den Ang II-Rezeptor-Typ 1 menschlichen Ursprungs erhält, indem man den Transformanten von (7) oben züchtet, (9) die biologische Aktivität eines Rezeptorantagonisten bestimmt unter Verwendung des gesamten oder eines Teils (z. B. Zellmembran) des Transformanten von (7) oben und (10) die Aktivität des Ang II-Rezeptors-Typ 1 menschlichen Ursprungs unter Verwendung des Transformanten von (7) oben bestimmt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt die Nukleotidsequenz des Ang II-Typ 1- Rezeptorgens aus menschlicher Plazenta, das in dem Plasmid pHARp116 enthalten ist (siehe Beispiel 3).
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz, die von dem Ang II-Typ 1-Rezeptorgen aus Humanplazenta abgeleitet ist, das in dem Plasmid pHARp116 enthalten ist (siehe Beispiel 3).
Fig. 3 zeigt Veränderungen der intrazellulären Calciumionenkonzentration als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II in vom Herzen stammenden Ang II-Typ 1-Rezeptor in voller Länge exprimierenden Zellen (siehe Beispiel 11).
Fig. 4 zeigt Veränderungen der intrazellulären Calciumionenkonzentration als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II in von Plazenta stammenden Ang II-Typ 1-Rezeptor in voller Länge exprimierenden Zellen (siehe Beispiel 11).
Fig. 5 zeigt die Dosiswirkungskurve der intrazellulären Calciumionenkonzentration auf eine Stimulierung mit Ang II bei Ang II-Typ 1-Rezeptor in voller Länge exprimierenden Zellen.
Fig. 6 zeigt Veränderungen der intrazellulären Inositphosphatkonzentration als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II bei Ang II-Typ 1-Rezeptor in voller Länge exprimierenden Zellen.
Fig. 7 zeigt die Dosiswirkungskurve der intrazellulären Inositphosphatkonzentration auf die Stimmulierung mit Ang II in voller Länge von Ang II-Typ 1-Rezeptor exprimierenden Zellen.
Fig. 8 zeigt Veränderungen der intrazellulären zyklischen AMP-Konzentration als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II in voller Länge von Ang II-Typ 1-Rezeptor exprimierenden Zellen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung liefert:
(1) Ein neues Polypeptid in einem neuen menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptor, d. h. Polypeptid (I) mit der in der folgenden Formel I dargestellten Aminosäuresequenz:
(2) eine rekombinante DNA (A), die das Polypeptid (I) kodiert,
(3) einen Transformanten (B), der einen Vektor mit der rekombinanten DNA (A) trägt,
(4) ein Verfahren zur Herstellung des Polypeptids (I), wobei der Transformant (B) in einem Medium gezüchtet wird, um das Polypeptid (I) zu erzeugen und anzusammeln, das dann geerntet wird,
(5) ein Verfahren zum Screenen einer Anti-Angiotensin II- Substanz, das umfaßt, daß man in Gegenwart von Angiotensin II und dem Polypeptid (I) eine Substanz identifiziert, die Angiotensin II an einer Bindung an das Polypeptid hemmen kann,
(6) ein Verfahren zum Screenen eines Angiotensin II- Rezeptors-Typ 1-Liganden, das umfaßt, daß man eine Substanz identifiziert, die an das Polypeptid (I) binden kann.
(7) ein Verfahren zum Sereenen einer Anti-Angiotensin II- Substanz, das umfaßt, daß man in- Gegenwart des Transformanten (B), der das Polypeptid (I) enthält, und von Angiotensin II eine Substanz identifiziert, die eine Veränderung einer Konzentration einer auf Angiotensin II ansprechenden Substanz, die intrazellulär vorhanden ist, als Reaktion auf Angiotensin II in dem Transformanten unterdrücken kann.
(8) ein Verfahren zum Screenen eines Angiotensin II-Typ 1- Rezeptoragonisten, das umfaßt, daß man eine Substanz identifiziert, die eine Konzentration einer auf Angiotensin II ansprechenden Substanz intrazellulär in dem Transformanten (B) verändern kann, der das Polypeptid (I) enthält.
Jedes Polypeptid kann als Polypeptid (I) dienen, solange es humanes Ang II aufnehmen kann, d. h. spezifisch an Liganden binden kann, die menschliche Ang II-Typ 1-Rezeptoren binden können, z. B. menschliche Ang II-Antagonisten und Agonisten für menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptor und eine Aktivierung von intrazellulären Substanzen (Ca-Ionen) induziert oder einen Verhaltenswechsel durch eine entstehende Strukturveränderung induziert und die in der obigen Formel (I) (SEQ ID Nr. 1) dargestellte Aminosäuresequenz enthält. Solche Polypeptide schließen (1) einen menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptor mit der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6) und (2) menschliche Ang II-Typ 1-Rezeptormuteine ein, z. B. solche Proteine, die durch Deletion oder Ersatz einer oder mehrerer Aminosäuren an den Positionen 1-186 und 314-359 in der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz entstehen, und Proteine, die durch Zufügung einer oder mehrerer Aminosäuren am N-Ende oder C-Ende der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz entstehen, wobei der menschliche Ang II-Typ 1-Rezeptor mit der in Fig. 2 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 6) bevorzugt ist.
Jede DNA kann als rekombinante DNA (A) dienen, solange sie eine Nukleotidsequenz enthält, die die in Formel I dargestellte Aminosäuresequenz kodiert, unabhängig davon ob ein Teil oder die gesamte Sequenz aus einer natürlichen Quelle stammt oder chemisch synthetisiert wurde oder eine Kombination davon ist.
Jede Nukleodtidsequenz kann dazu dienen, die in Formel I dargestellte Aminosäuresequenz zu kodieren, wobei die in der folgenden Formel 11 dargestellte Nukleotidsequenz bevorzugt ist:
Die rekombinante DNA (A) ist bevorzugt die in Fig. 1 gezeigte Nukleotidsequenz (SEQ ID Nr. 5). Jede Nukleotidsequenz kann dazu dienen, den menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptor, der durch die in Fig. 2 gezeigte Aminosäuresequenz dargestellt wird, zu kodieren, wobei die Nukleotidsequenz, die in der folgenden Formel dargestellt ist, bevorzugt ist (die gleich ist wie die Nucleotie an den Positionen 240-1316 der in Fig. 1 gezeigten Nukleotidsequenz):
Ein Vektor, der die rekombinante DNA beinhaltet, die ein Gen enthält, das den menschlichen Ang II-Rezeptor-Typ 1 (hAT&sub1;) der vorliegenden Erfindung kodiert, kann z. B. erzeugt werden, indem:
(a) RNA abgetrennt wird, die den hAT&sub1;-Rezeptor kodiert,
(b) einzelsträngige komplementäre DNA (cDNA) aus der RNA synthetisiert wird und dann doppelsträngige DNA synthetisiert wird,
(c) die doppelsträngige DNA in ein geeignetes Plasmid eingebaut wird,
(d) ein geeigneter Wirt mit dem entstehenden rekombinanten Plasmid transformiert wird,
(e) der entstehende Transformant gezüchtet wird und dann das Plasmid mit der gewünschten DNA daraus mit einer geeigneten Methode isoliert wird (Koloniehybridisierung unter Verwendung einer DNA-Sonde),
(f) die gewünschte klonierte DNA aus dem Plasmid gespalten wird und
(g) die klonierte DNA stromabwärts eines geeigneten Promotors in einen Träger ligiert wird.
Die cDNA kann auch mit chemischer Synthese hergestellt werden.
RNA, die für einen menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptor kodiert, kann aus verschiedenen menschlichen Organen und Zellen erhalten werden. Methoden zur Herstellung von RNA aus diesen Materialien schließen die Guanidinthiocyanatmethode ein [J. M. Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294 (1979)].
Nach Zugabe eines Oligo-dT-Primers oder eines statistischen Oligonukleotids zu der so erhaltenen RNA kann reverse Transcriptase zugegeben werden, um cDNA zu synthetisieren [H. Okayama et al., Molecular and Cellular Biology, 2, 161 (1982) und 3, 280 (1983)]. Zu diesem cDNA-Präparat können Sense- Primer und Antisense-Primer (siehe Beispiele unten) zugegeben werden, um eine gut konservierte Region zu amplifizieren, auf Basis der für den Ang II-Typ 1-Rezeptor aus adrenalen Zona Glomerulosazellen vom Rind [K. Sasaki et al., Nature, 351, 230 (1991)] und für den Ang II-Typ 1-Rezeptor aus glatten Aortamuskelzellen der Ratte angegebenen Sequenzen [T. J. Murphy et al., Nature, 351, 233 (1991)]. Dann kann eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durchgeführt werden unter Verwen dung eines im Handel erhältlichen Kits (z. B. ein Kit der von Cetus/Perkin-Elmer hergestellt wird). Die amplifizierte cDNA kann mit einer bekannten Methode abgetrennt werden, z. B. Agaroseelektrophorese und dann aus dem Gel gewonnen werden. Die Nukleotidsequenz dieser cDNA kann z. B. mit der "Didesoxy"- Kettenabbruchmethode bestimmt werden [T. Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)].
Das Plasmid mit der klonierten cDNA kann als solches verwendet werden oder nach dem es mit einem geeigneten Restriktionsenzym gespalten wurde, und nach Bedarf in einen anderen Vektor (z. B. Plasmid) eingesetzt werden.
Beispiele für ein Plasmid zum Einbau der cDNA schließen Plasmide, die von Escherichia coli stammen, z. B. pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pBR325 [Gene, 4, 121 (1978)], pUC12 [Gene, 19, 259 (1982)], pUC13 [Gene, 19, 259 (1982)], pUC118 und pUC119 [Methods in Enzymology, 153, 3-11 [1987] und solche, die von Bacillus subtilis stammen, z. B. pUB110 [Biochemical and Biophysical Research Communications, 112, 678 (1983)] ein, aber jedes andere Plasmid kann für diesen Zweck verwendet werden, solange es in dem Wirt replizierbar ist und in dem Wirt erhalten wird.
Beispiele für ein Verfahren zum Einbau des Plasmids schließen solche ein, die von T. Maniatis et al. in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 239 (1982) beschrieben werden.
Das Plasmid, das die cDNA beinhaltet, kann ein Plasmid sein, das unter Verwendung eines Wirts für eine cDNA-Bibliothek (mit Escherichia coli x1776) erhalten wurde, indem eine cDNA, die aus der mRNA einer menschlichen normalen diploiden Zelle synthetisiert wurde, in den pCD-Vektor eingesetzt wird [siehe Okayama et al., Molecular Cell Biology, 3, 280 (1983)], wobei die cDNA-Bibliothek von Dr. Okayama am Research Institute for Microbial Diseases, Osaka Universität, erhalten wurde.
Das so erhaltene Plasmid wird in einen geeigneten Wirt eingesetzt, z. B. ein Bakterium der Gattung Escherichia oder Bacillus.
Beispielhafte Bakterien der Gattung Escherichia schließen Escherichia coli K12DH1 [Proceedings of the National Academy of Science, USA, 60, 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research, 9, 309, (1981)], JM109 [Methods in Enzymology, 153, 3- 11 (1987)], JA221 [Journal of Molecular Biology 120, 517 (1978)[, HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)], C600 [Genetics, 39, 440 (1954)] und MC1061/P3 [Nature, 329, 840 (1987)].
Beispielhafte Bakterien der Gattung Bacillus schließen Bacillus subtilis MI114 [Gene, 24, 255 (1983)] und 207-21 [Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)] ein.
Methoden der Transformation schließen die Calciumchloridmethode und die Calciumchlorid/Rubidiumchloridmethode, die von T. Maniatis in Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, Seite 249 (1982) beschrieben werden, ein.
Aus den so erhaltenen Transformanten wird der gewünschte Klon ausgewählt unter Verwendung einer bekannten Methode, z. B. der Koloniehybridisierung [Gene, 10, 63 (1980)] oder durch DNA- Nukleotidsequenzierung [Proceedings of the National Academy of Science, USA, 74, 560 (1977); Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)].
Auf diese Weise wird ein Mikroorganismus, der einen Vektor mit einer Nukloetidsequenz, die den klonierten hAT&sub1;-Rezeptor kodiert, erhalten.
Als nächstes wird das Plasmid aus dem Mikroorganismus isoliert. Methoden für eine solche Isolierung schließen die Alkalimethode ein [H. C. Birmboim et al., Nucleic Acids Research, 1, 1513 (1979)].
Der obige Vektor mit einem Gen, das den klonierten hAT&sub1;- Rezeptor kodiert, kann als solcher verwendet werden oder nachdem er mit einem Restriktionsenzym herausgeschnitten wurde.
Das klonierte Gen wird stromabwärts des Promotors in einen Träger (Vektor), der für seine Expression geeignet ist, eingefügt, was einen Expressionsvektor liefert.
Beispielhafte Vektoren schließen die oben erwähnten Plasmide ein, die von Escherichia coli stammen (z. B. pBR322, pBR 325, pUC12, pUC13, pUC118, pUC119), Plasmide, die von von Bacillus subtilis stammen (z. B. pUB110, pTP5, pC194), von Hefe abgeleitete Plasmide (z. B. pSH19, pSH15), Bacteriophagen, wie den λ-Phagen, Tierviren, wie Retrovirus und Vacciniavirus und Plasmide für die Tierzellexpression (z. B. pcDNA I).
Das Gen kann ein ATG (Nukleotidsequenz, die für ein geeignetes Signalpeptid kodiert) als Translationsinitiationskodon am 5'-Ende aufweisen und TAA, TGA oder TAG (bevorzugt TGA) als Translationsterminationskodon am 3'-Ende. Um das Gen zu exprimieren wird ein Promoter stromaufwärts davon ligiert. Jeder Promoter kann für die vorliegende Erfindung verwendet werden, solange er für den Wirt, der zur Expression des Gens verwendet wird, geeignet ist. Beispiele für bevorzugte Promotoren sind unten angegeben.
Bevorzugte Promotoren schließen den T7-Promotor, den trp- Promotor, lac-Promotor, rec A-Promotor, λPL-Promotor und lpp- Promotor ein, wenn der Transformationswirt zu der Gattung Escherichia gehört; den SPO1-Promotor, SPO2-Promotor und pen P-Promotor, wenn der Wirt zu Bacillus gehört und den PHO5- Promotor, PGK-Promotor, GAPDH-Promotor und ADH-Promotor, wenn der Wirt eine Hefe ist. Es wird der Fall bevorzugt, in dem ein Bakterium, das zur Gattung Escherichia gehört, als Wirt verwendet wird zusammen mit dem trp-Promotor oder dem T7- Promotor. Wenn der Wirt eine Tierzelle ist, schließen bevorzugte Promotoren den von SV40 abgeleiteten Promotor, Retroviruspromotor und den humanen Cytomegaloviruspromotor ein, wobei der von SV40 abgeleitete Promotor bevorzugt ist.
Der so konstruierte Expressionsvektor, der ein Gen enthält, das für einen hAT&sub1;-Rezeptor kodiert, wird verwendet, um einen Transformanten herzustellen. Beispiele für den Wirt schließen Bakterien der Gattung Escherichia, Bakterien der Gattung Bacillus, Hefen und Tierzellen ein, wobei Tierzellen bevorzugt sind. Beispiele für die Bakterien der Gattung Escherichia und der Gattung Bacillus schließen die oben angegebenen ein. Insbesondere ist der Wirt bevorzugt eine Tierzelle, wenn die transformierten Zellen verwendet werden, um einen Agonisten oder einen Antagonisten des hAT&sub1;-Rezeptors zu screenen, wie unten beschrieben.
Beispiele für Hefen schließen Saccharomyces cerevisiae AH22R&supmin;, NA87-11A und DKD-5D ein. Beispielhafte Tierzellen schließen Affenzellen COS-7, Vero, chinesische Hamstereierstock-(CHO)-zellen, Maus-L-Zellen, Mausmyeloma-Sp2/O-Zellen und menschliche FL-Zellen ein.
Die Bakterien der Gattung Escherichia können mit dem in Proceedings of the National Academy of Science, USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982) beschriebenen Verfahren transformiert werden. Bakterien der Gattung Bacillus können z. B. gemäß der Methode transformiert werden, die in Molecular and General Genetics, 168, 111 (1979) beschrieben ist. Hefen können mit der Methode transformiert werden, die z. B. in Proceedings of the National Academy of Science, USA, 75, 1929 (1978) beschrieben ist. Tierzellen können z. B. mit der in Virology, 52, 456 (1973) beschriebenen Methode transformiert werden.
Ein Transformant, der durch die Transformation mit einem Vektor, der die cDNA des hAT&sub1;-Rezeptors beinhaltet, entsteht, wird auf diese Weise erhalten.
Um einen Transformanten zu züchten, dessen Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia oder Bacillus ist, ist es geeignet, ein flüssiges Medium zu verwenden, das mit Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Mineralien und anderen Substanzen, die für das Wachstum des Transformanten notwendig sind, ergänzt ist. Beispiele für Kohlenstoffquellen schließen Glucose, Dextrin, lösliche Stärke und Saccharose ein. Beispiele für Stickstoffquellen schließen organische oder anorganische Substanzen, wie Ammmoniumsalze, Nitrate, Maisquellwasser, Pepton, Casein, Fleischextrakt, Sojakuchen und Kartoffelextrakt ein. Beispiele für Mineralien schließen Calciumchlorid, Natriumdihydrogenphosphat und Magnesiumchlorid ein. Hefeextrakt, Vitamine, Wachstumsfaktoren und andere Zusatzstoffe können zugegeben werden. Der pH des Mediums ist bevorzugt etwa 6 bis 8.
Beispiele für Medien, die bevorzugt verwendet werden, um die Gattung Escherichia zu züchten, schließen das M9-Medium ein, das Glucose und Casaminosäure enthält [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1972)]. Um die Promotoreffizienz soweit wie nötig zu erhöhen, kann ein chemisches Mittel, z. B. 3β- Indolylacrylsäure zugegeben werden.
Wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Escherichia ist, wird die Züchtung normalerweise bei etwa 15ºC bis 43ºC etwa 3 bis 24 Stunden lang durchgeführt, wobei je nach Bedarf belüftet und/oder gerührt wird.
Wenn der Wirt ein Bakterium der Gattung Bacillus ist wird die Züchtung normalerweise bei etwa 30ºC bis 40ºC etwa 6 bis 24 Stunden lang durchgeführt, wobei je nach Bedarf belüftet und/oder gerührt wird.
Beispiele für Medien zur Kultivierung eines Transformanten, dessen Wirt eine Hefe ist, schließen Burkholder's Minimalmedium ein [K. L. Bostian, et al., Proceedings of the National Academy of Science, USA, 77, 4505 (1980)]. Der bevorzugte pH des Mediums ist ein pH von etwa 5 bis 8. Die Züchtung wird normalerweise bei etwa 20ºC bis 35ºC etwa 24 bis 72 Stunden lang durchgeführt, wobei je nach Bedarf belüftet und/oder gerührt wird.
Beispiele für Medien zur Kultivierung eines Transformanten, dessen Wirt eine Tierzelle ist, schließen MEM-Medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI 1640-Medium [Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Medium 199 [Proceedings of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] und ASF104 (hergestellt von Ajinomoto) ein. Diese Medien können mit etwa 5% bis 20% fötalem Rinderserum ergänzt werden. Der pH ist bevorzugt etwa 6 bis 8. Die Züchtung wird normalerweise bei etwa 30ºC bis 40ºC etwa 15 bis 60 Stunden lang durchgeführt, wobei je nach Bedarf belüftet und/oder gerührt wird.
Die Abtrennung und Reinigung des hAT&sub1;-Rezeptors der vorliegenden Erfindung aus der oben beschriebenen Kultur kann z. B. wie folgt erreicht werden:
Durch Extraktion des hAT&sub1;-Rezeptors der vorliegenden Erfindung aus gezüchteten Zellen werden die Zellen mit einer bekannten Methode nach der Züchtung gesammelt und in einem Puffer suspendiert, der ein proteindenaturierendes Mittel enthält, z. B. Guanidinhydrochlorid, um den gewünschten hAT&sub1;- Rezeptor aus den Zellen zu eluieren. Bei einer anderen Metho de werden die Zellen durch Ultraschall, Lysozymbehandlung und/oder Einfrieren und Auftauen aufgerissen, wonach sie zentrifugiert werden, um den Rezeptor der Erfindung abzutrennen. Die Methode unter Verwendung einer Kombination von Lysozymbehandlung und Ultraschall ist bevorzugt.
Zur Reinigung des erfindungsgemäßen Rezeptors aus dem Überstand können bekannte Methoden der Trennung und Reinigung in Kombination je nach Bedarf verwendet werden. Solche bekannten Methoden der Trennung und Reinigung schließen solche ein, die auf Löslichkeitsunterschieden basieren, z. B. Aussalzen und Lösungsmittelfällung, solche die hauptsächlich auf Unterschieden im Molekulargewicht basieren, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese, solche die auf Ladungsunterschieden basieren, wie Ionenaustauschchromatographie, solche die auf einer spezifischen Affinität basieren, wie Affinitätschromatographie, solche die auf Unterschieden der Hydrophobizität basieren, wie Reverse-Phase Hochleistungsflüssigchromatographie, und solche, die auf Unterschieden im isoelektrischen Punkt basieren, wie isoelektrische Fokussierung.
Der so erhaltene hAT&sub1;-Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann als trockenes Pulver mit Dialyse, Lyophilisierung und anderen Behandlungen hergestellt werden. Es ist geeignet, Serumalbumin etc. als Träger bei der Aufbewahrung des hAT&sub1;- Rezeptors zuzugeben, um eine Adsorption an dem Behälter zu verhindern.
Der hAT&sub1;-Rezeptor der vorliegenden Erfindung wird im wesentlichen in reiner Form erhalten. Das im wesentlichen reine Protein der vorliegenden Erfindung hat einen Proteingehalt von nicht weniger als 95% (G/G), bevorzugt nicht weniger als 98% (G/G).
Der so erhaltene hAT&sub1;-Rezeptor, die Zellen, die den Rezeptor enthalten, insbesondere exprimieren, Zellmembranderivate davon oder dgl. können verwendet werden, um Substanzen zu screenen, die eine Aktivität als Antagonist oder Agonist gegenüber dem hAT&sub1;-Rezeptor aufweisen, bei denen die Menge an Ligand, die an den hAT&sub1;-Rezeptor gebunden wird, z. B. in einem Ligandenbindungstest bestimmt wird. Insbesondere ist er zur Identifizierung einer Anti-Ang II-Substanz geeignet, die die Bindung von Ang II an den Rezeptor in Gegenwart des hAT&sub1;- Rezeptors der vorliegenden Erfindung und von Ang II als Ligand hemmt. Da die so erhaltenen Tierzellen der vorliegenden Erfindung spezifisch den menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptor menschlichen Ursprungs exprimieren, machen sie es möglich, die biologische Aktivität eines Antagonisten oder Agonisten gegen diesen Rezeptor genau zu bestimmen. Es ist auch möglich, in solchen Tierzellen den Zustand der Signalübertragung als Reaktion auf den Liganden für den Rezeptor zu reproduzieren, d. h. das Verhalten von intrazellulären Substanzen [z. B. Calciumionenkonzentrationsveränderung, cAMP-Konzentrationsveränderungen, IP&sub3;-(Inosittriphosphat)-Konzentrationsveränderung] und genaue Messungen der Mengen der intrazellulären Substanzen (Ca-Ionen, cAMP, IP&sub3;') oder deren Veränderungen in den Tierzellen zu erhalten. Ein hAT&sub1;-Rezeptoragonist kann mit einer Methode gescreent werden, die umfaßt, daß man eine Substanz screent, die eine Menge oder eine Konzentration dieser auf Liganden reagierenden Substanzen, die intrazellulär in einer Tierzelle vorliegen, verändern kann, die das Polypeptid der vorliegenden Erfindung umfaßt. Und eine anti-Ang II- Substanz die einen hAT&sub1;-Rezeptorantagonisten einschließt kann gescreent werden mit einer Methode, die umfaßt, daß man eine Substanz in Gegenwart einer Tierzelle, die ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung und einen bekannten Liganden des Rezeptors, wie Ang II, enthält, screent, die die Veränderungen der Substanz, die intrazellulär in der Zelle vorliegt, als Reaktion auf den Liganden für den Rezeptor hemmen kann. Insbesondere würde, wenn die Anti-Ang II-Substanz ein hAT&sub1;- Rezeptorantagonist ist, die kompetitive Hemmung im Screening gezeigt. In dieser Hinsicht ist die Substanz, die eine Bindungsfähigkeit gegenüber dem Rezeptor in dem Ligandenbindungstest aufweist, eine geeignete Probe, um dieses Screening zu ermöglichen, um den Agonist oder Antagonist des hAT&sub1;- Rezeptors zu erhalten.
Somit kann eine Anti-Ang II-Substanz, insbesondere ein hAT&sub1;- Rezeptorantagonist, mit hoher Qualität mit der erfindungsgemäßen Methode gescreent werden.
Auch kann der hAT&sub1;-Rezeptor als Ang II-maskierendes Protein verwendet werden. Der erfindungsgemäß erhaltene Transformant, der den hAT&sub1;-Rezeptor exprimiert, und Teile davon können wirksam als Antigen verwendet werden, um Antikörper gegen den Rezeptor zu erhalten, wobei die Verteilung, der Gehalt und andere Aspekte des Ang II-Typ 1-Rezeptors, der in Spurenmengen in vivo vorhanden ist, mit der fluoreszierenden Antikörpermethode, mit Western-Blotting und anderen Methoden bestimmt werden können.
Die neue rekombinante DNA, die erfindungsgemäß erhalten wird, kann als Sonde verwendet werden, um den Gehalt an menschlichem Ang II-Typ 1-Rezeptor, der in Spurenmengen in vivo vorhanden ist, mit Northern-Blotting und anderen Methoden zu bestimmen.
Die Abkürzungen für Basen, Aminosäuren, Lösungsmittel und andere, die in der vorliegenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen verwendet werden, basieren auf Abkürzungen, die von der IUPAC-IUB-Commission on Biochemical Nomenclature angegeben sind oder Abkürzungen, die in den relevanten Gebieten üblicherweise in Gebrauch sind. Einige Beispiele sind unten angegeben. Wenn ein optisches Isomer einer Aminosäure vorhanden sein kann, ist es das mit der L-Konfiguration, wenn nicht anders angegeben. Diese Abkürzungen können Reste der entsprechenden Verbindungen darstellen, die eine Peptidbindung bilden können.
DNA: Desoxyribonucleinsäure
cDNA: Komplementäre Desoxyribonucleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
RNA: Ribonucleinsäure
mRNA: Messenger-Ribonucleinsäure
dATP: Desoxyadenosintriphosphat
dTTP: Desoxythymidintriphosphat
dGTP: Desoxyguanosintriphosphat
dCTP: Desoxycytidintriphosphat
ATP: Adenosintriphosphat
EDTA: Ethylendiamintetraessigsäure
SDS: Natriumdodecylsulfat
Gly oder G: Glycin
Ala oder A: Alanin
Val oder V: Valin
Leu oder L: Leucin
Ile oder I: Isoleucin
Ser oder S: Serin
Thr oder T: Threonin
Cys oder C: Cystein
Met oder M: Methionin
Glu oder E: Glutaminsäure
Gln oder Q: Glutamin
Asp oder D: Asparaginsäure
Lys oder K: Lysin
Arg oder R: Arginin
His oder H: Histidin
Phe oder F: Phenylalanin
Tyr oder Y: Tyrosin
Trp oder W: Tryptophan
Pro oder P: Prolin
Asn oder N: Asparagin

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden genauer mit Hilfe der folgenden Beispiele beschrieben, die nicht als die vorliegende Erfindung beschränkend ausgelegt werden soll.
Der Transformant Escherichia coli MC1061/P3/pHARp206, der im folgenden Beispiel 4 erhalten wurde, wurde unter der Hinterlegungs-Nr. IFO15279 am Institute for Fermentation, Osaka (IFO) am 31. März 1992 mit der Hinterlegungs-Nr. FERM BP-3831 am Fermentation Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Ministerium für internationalen Handel und Industrie am 13. April 1992 hinterlegt.

Beispiel 1

Suchen nach einer gut konservierten Region auf der Ebene der Nukleotidsequenz bei Ang II-Typ 1-Rezeptor vom Rind und Ang II-Typ 1-Rezeptor von der Ratte

Es wurde eine Suche durchgeführt nach einem homologen Anteil in den angegebenen Nukleotidsequenzen für Ang II-Typ 1- Rezeptor aus Zona Glomerulosazellen der Nebennierenrinde vom Rind [K. Sasaki et al., Nature, 351, 230 (1991)] und den Ang II-Typ 1-Rezeptor aus glatten Aortamuskelzellen der Ratte [T. J. Murphy et al., Nature, 351, 233 (1991)]. Die Nukleotidsequenz, die Phe 39 bis Tyr 127 in der Aminosäuresequenz der ersteren entspricht, erwies sich als besser konserviert als irgendein anderer Anteil. Um diesen wohlkonservierten Bereich mit PCR zu amplifizieren, wurden zwei Primer synthetisiert:
Sense Primer Nr. 1, entsprechend Phe 39 bis Asn 46:
Antisense Primer Nr. 2, entsprechend Cys 121 bis Tyr 127:

Beispiel 2

Amplifikation der wohlkonservierten Region der cDNA- Bibliothek aus menschlicher Plazenta mit PCR und Nukleotidsequenzierung
1 ul einer Lösung einer cDNA-Bibliothek aus menschlicher Plazenta, λgt11 (Clontech Laboratories, Inc.) und 9 ul destilliertes Wasser wurden vermischt. Nach 5-minütiger Inkubation bei 95ºC wurde die Mischung sofort auf Eis gekühlt. Zwei Primer (Nr. 1 und Nr. 2 oben, jeweils 100 umol) wurden zugegeben und die PCR wurde durchgeführt, wie in der Anleitung für den Kit, der von Cetus/Perkin-Elmer geliefert wurde, angegeben ist, worin eine Reihe von Reaktionen bei 94ºC 1 Minute lang, 55ºC 2 Minuten lang und 72ºC 3 Minuten lang über 25 Zyklen wiederholt wurde. Das PCR-Produkt wurde durch Gelelektrophorese auf 1,2% Agarose abgetrennt; ein amplifiziertes DNA- Fragment wurde an einer Position festgestellt, die der Größe entsprach (267 bp), die für die Nukleotidsequenz des Ang II- Typ 1-Rezeptors aus Rind erwartet wurde.
Zu dem obigen PCR-Produkt (etwa 100 ul) wurden 10 ul einer 3 M-Natriumacetatlösung und 250 ul Ethanol zugegeben, um die DNA auszufällen, die in 10 ul destilliertem Wasser gelöst wurde. Unter Verwendung von 1 ul dieser PCR-Produktlösung wurde das PCR-Produkt in die T-Projektion am 3'-Ende des pCR- (Markenzeichen)-Vektors durch Einwirkung von T4-DNA-Ligase und ATP eingesetzt, mit dem in den Anleitungen für den TA- Klonierungs-Kit (hergestellt von Invitrogen, Corp.) beschriebenen Methode. Die Nukleotidsequenz des cDNA-Anteils wurde bestimmt unter Verwendung eines Nukleotidsequenzierautomaten (hergestellt von Applied Biosystems, Inc.), basierend auf der "Didesoxy"-Kettenabbruchmethode [J. Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)]. Es wurde gefunden, daß das DNA-Fragment einen gut konservierten Bereich des Ang II-Typ 1-Rezeptorgens enthielt, der deutlich unterschieden war von jeder der angegebenen Sequenzen aus Rind und Ratte. Das angegebene Ang II-Typ 1-Rezeptorgen aus menschlichen Chromosomen [H. Furuta et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 183, 8 [1992] enthielt auch einen Teil, der diesem gut konservierten Bereich entsprach.
Das Plasmid, das dieses cDNA-Fragment enthielt, wurde als pHARp101 bezeichnet.

Beispiel 3

Gewinnung des menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptorgens voller Länge durch Plaquehybridisierung unter Verwendung eines menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptorgenfragments

Das EcoRI-HindIII-Fragment des oben beschriebenen Plasmids pHARp101, das den cDNA-Anteil enthält, wurde mit ³²P markiert und als Sonde verwendet. Dann wurde eine cDNA-Bibliothek aus menschlicher Plazenta über 10 Platten mit etwa 40.000 Plaques/Platte entwickelt und auf einer Nitrocellulosemembran (S & S) repliziert gefolgt von einer Plaquehybridisierung unter Verwendung der Sonde. Die Hybridisierung wurde in einer Lösung mit 6 · SSC, 5 · Denhardt's Lösung, 1% SDS und 100 ug/ml denaturierter Rinderthymus-DNA durchgeführt, wobei einen Tag lang bei 65ºC inkubiert wurde. Das Waschen wurde mit einer 0,1 · SSC-Lösung durchgeführt, die 0,05% SDS enthielt, wobei 1 Stunde lang bei 68ºC inkubiert wurde.
Sechs Plaques (λHARp101 bis 106), die mit der Sonde hybridisierten, wurden auf diese Weise erhalten. Von den so erhaltenen sechs Klonen enthielt λHARp106 das längste cDNA-Fragment, und dieser cDNA-Anteil wurde in die EcoRI-Stelle von pUC118 eingesetzt, wobei das entstehende Plasmid als Plasmid pHARp116 bezeichnet wurde. Die Nukleotidsequenz des cDNA- Anteils wurde bestimmt unter Verwendung eines Nukleotidsequenzierautomaten (hergestellt von Applied Biosystems, Inc.) auf Basis der Didesoxynukleotidsynthesekettenabbruchmethode. Die Nukleotidsequenz und die Aminosäuresequenz, die daraus abgeleitet wurden, sind in Fig. 1 (SEQ. ID Nr. 5) bzw. Fig. 2 (SEQ. Id Nr. 6) angegeben. Die aus dieser cDNA abgeleitete Aminosäuresequenz erwies sich als äußerst homolog mit den angegebenen Rezeptorsequenzen aus Rind, Ratte und Mensch, was darauf hin deutete, daß sie ein typisches Merkmal eines G- proteingekuppelten Rezeptors, wie es diese Rezeptoren sind, ist. Es wurde jedoch gefunden, daß der vorliegende Rezeptor ein humanes Ang II-Typ 1-Rezeptorpolypeptid mit neuer Sequenz ist, das deutlich von jeder bekannten Sequenz unterschieden ist. Es wird vermutet, daß der hAT&sub1;-Rezeptor, der hier erhalten wurde, zu einer Unterart gehört, die von der des angegebenen menschlichen Ang II-Typ 1-Rezeptors verschieden ist [H. Furuta et al., Biochemical and Biophysical Research Communications. 183, 8 (1992)].

Beispiel 4

Herstellung von rekombinanter DNA zur Expression von Ang II- Typ 1-Rezeptorgen voller Länge aus menschlicher Plazenta (1) in Tierzellen

Nachdem das obige Plasmid pHARp116 mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut worden war, wurde ein Fragment, das den cDNA- Anteil enthielt, durch Agaroseelektrophorese gewonnen. Dann wurde pcDNA I, ein Derivat aus dem Vektor pCDM8 (Invitrogen, Corp.) [B. Seed et al., Nature, 329, 840 (1987)] für die vorübergehende Expression in Tierzellen verwendet, mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut und das entstehende Fragment wurde in das obige DNA-Fragment durch Einwirkung von T4 DNA- Ligase und ATP ligiert, gefolgt von einer Transformation in Escherichia coli MC1061/P3, was Escherichia coli MC1061/P3/pHARp206 lieferte (IFO 15279, FERM BP-3831), der den gewünschten ExpressionsVektor pHARp206 trägt.

Beispiel 5

Expression des Ang II-Typ 1-Rezeptorgens voller Länge aus menschlicher Plazenta in Tierzellen (1)

Zu jeweils zwei mit Collagen behandelten Glasplatten (1 · 4 cm) in einer 6 cm Petrischale wurden 4 ml eines ASF104- Mediums (hergestellt von Ajinomoto), das 5% (V/V) FCS (fötales Kälberserum) enthielt, zugegeben und 5 · 10&sup5; CHOdhfr- Zellen ausgesät. Nach 1-tägiger Inkubation bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid wurde das Medium abgesaugt und zweimal mit ASF104-Medium gewaschen. 5 ug des obigen Plasmids pHARp206 wurden in 50 ul HBS Puffer (8,0 g/l Natriumchlorid, 380 mg/l Kaliumchlorid, 200 mg/l Dinatriummonohydrogenphosphat, 5,9 g/l HEPES, 15 mg/l Calciumchloriddihydrat, 10 mg/l Magnesiumchloridhexahydrat, pH 7,45) gelöst. Die entstehende Lösung wurde mit 50 ul einer DEAE-Dextran-Lösung (20 g/l DEAE-Dextran, 9,0 g/l Natriumchlorid) vermischt und diese Mischung wurde zu den Zellen gleichförmig tropfenweise zugegeben, was CHOdhfr&supmin;-Zellen, die mit dem Plasmid pHARp206 transformiert waren, lieferte (CHOdhfr&supmin;/pHARp206). Zu diesen transformierten Zellen wurden 20 ul Chloroquinlösung (5,2 g/l Chloroquindiphosphat) zugegeben und anschließend in Gegenwart von 5% Kohlendioxid 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Nachdem das Medium abgesaugt war, wurden 4 ml ASF104-Medium, das 5% FCS enthielt, zugegeben und anschließend weitere 3 Tage unter den gleichen Bedingungen, wie oben, inkubiert.

Beispiel 6

Veränderung der intrazellulären Calciumionenkonzentration als Reaktion auf die Verabreichung von Ang II an Tierzellen, die das Ang II-Typ 1-Rezeptorgen voller Länge aus menschlicher Plazenta exprimieren

Nachdem die obigen transformierten Zellen CHOdhfr&supmin;/pHARp206 zweimal mit HEPES-Puffer (140 mM Natriumchlorid, 5 mM Kaliumchlorid, 1 mM Magnesiumsulfat, 1 mM Dinatriummonohydrogenphosphat, 1 mM Calciumchlorid, 25 mM Glucose, 25 mM HEPES; pH 7,2), gewaschen worden waren, wurden 4 ml HEPES-Puffer mit 4 uM Fura-2AM (Dojin Kagaku) zugegeben und die Mischung bei 15ºC im Dunkeln 80 Minuten lang stehen gelassen. Nachdem dreimal mit HEPES-Puffer gewaschen worden war, wurde die Mischung weiter bei 15ºC im Dunkeln 20 Minuten lang stehen gelassen. Eine Quarzcuvette (1 · 1 · 4 cm) wurde in ein Hitachi-Fluorophotometer Modell F-4000 gestellt, ein Rührstab wurde eingesetzt und 2,5 ml HEPES-Puffer mit 0,05% (G/V) BSA wurden zugegeben. Nach der Equilibrierung bei 37ºC wurden die transformierten Zellen zusammen mit dem Glasträger in die Cuvette eingesetzt. Die Fluoreszenz bei einer Wellenlänge von 505 nm, die durch Anregung mit Ultraviolettstrahlen mit Wellenlängen von 340 nm und 380 nm erzeugt wurde, wurde gemessen. Nachdem sich die Fluoreszenz stabilisiert hatte, wurde Ang II auf eine Endkonzentration von 1 um zugegeben. Mehrere Sekunden später war eine Änderung der Fluoreszenz, die durch einen Anstieg der intrazellulären Calciumionenkonzentration entstand, zu beobachten.
In gleicher Weise wurde Endothelin 1 in der gleichen Konzentration zugegeben, aber es erfolgte keine Veränderung der Fluoreszenz. Bei dem Kontrollversuch erfolgte keine Veränderung der Fluoreszenz bei nichttransformierten CHOdhfr&supmin;-Zellen oder CHOdhfr&supmin;-Zellen, die mit dem oben beschriebenen Plasmid pcDNA I transformiert waren.

Beispiel 7

Herstellung von rekombinanter DNA zur Expression von Ang II- Typ 1-Rezeptorgen voller Länge aus menschlicher Plazenta in Tierzellen (2)

Nachdem das obige Plasmid pHARp116 mit dem Restriktionsenzym EcoRI verdaut worden war, wurde ein Fragment, das den cDNA- Anteil enthielt, durch Agaroseelektrophorese gewonnen. Dann wurde pTB701 [Vektor, der durch Entfernung des C Kinasegens aus dem Plasmid pTB652 entsteht, wie von Y. Ono et al. in Science, 236, 1116-1120 (1987) angegeben] für die vorübergehende Expression in Tierzellen verwendet, mit Restriktionsenzym EcoRI verdaut und das entstehende Fragment in das obige DNA-Fragment durch Einwirkung von T4 DNA-Ligase und ATP ligiert, gefolgt von einer Transformation in Escherichia coli JM109, aus Escherichia coli JM109/pHARp306 lieferte, der den gewünschten ExpressionsVektor pHARp306 trug.

Beispiel 8

Expression des Ang II-Typ 1-Rezeptorgens voller Länge aus menschlicher Plazenta in Tierzellen (2)

In jeden Napfeiner 6-Napf-Petrischale wurden 2 ml eines DMEM-Mediums (hergestellt von DIFCO), das 5% (V/V) FCS enthielt, zugegeben und 5 · 10&sup4; COS7-Zellen wurden ausgesät. Nach 2-tägiger Inkubation bei 37ºC in Gegenwart von 5% Kohlendioxid wurde das Medium abgesaugt und zweimal mit dem DMEM-Medium gewaschen. Unter Verwendung von 3 ug des obigen Plasmids pHARp306 wurden die Zellen mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren transformiert, was die transformierten Zellen COS7/pHARp306 lieferte.

Beispiel 9

Radioaktiv markierte Ang II bindende Aktivität in Tierzellen, die Ang II-Typ 1-Rezeptorgen voller Länge aus menschlicher Plazenta exprimieren

Nachdem die obigen transformierten Zellen COS7/pHARp306 zweimal mit TSMB-Puffer gewaschen worden waren (50 mM Trispuffer, pH 7,5, 150 mM Natriumchlorid, 5 mM Magnesiumchlorid, 0,2% (G/V) BSA, 40 ug/ml Bacitracin, 4 ug/ml Leupeptin, 4 ug/ml Chymostatin, 4 ug/ml Pepstatin A, 5 uM Phosphoramidon), wurde 1 ml eines TSMB-Puffers mit 100 pM Ligand ([¹²&sup5;I]-markiertes Ang II, 2000 Ci/mmol, hergestellt von Amersham) zugegeben und die Mischung 60 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nachdem die Mischung dreimal mit TSMB-Puffer gewaschen worden war, wurden die Zellen mit 1 n Natriumhydroxid (1 ml) solubilisiert und ihre Radioaktivität unter Verwendung eines γ-Strahlenzählers bestimmt. Zum Zeitpunkt der Ligandenbindung waren gleichzeitig auch jeweils 10 um jedes Agonisten (Ang I, Ang II, Ang III) und 10 um jedes Antagonisten (DuP753, PD123177 [P. B. M. W. M. Timmermans et al., TiPS, 12, 55 (1991)] vorhanden. Es wurde gefunden, daß ein Ang II-Typ 1-Rezeptor in den transformierten Zellen (COS7/pHARp306) exprimiert wurde (siehe Tabelle 1). Tabelle 1

Beispiel 10

Gewinnung einer Tierzelllinie, die Ang II-Typ 1-Rezeptorgen voller Länge aus menschlicher Plazenta stabil exprimiert

In 1 · 10&sup5; CHOdhfr&supmin;-Zellen, die auf einer Platte mit 6 cm Durchmesser gezüchtet worden waren, wurden 5 ug pHARp306 und 0,5 ug pTB348, ein Plasmid, das das dhfr-Gen exprimiert, eingeführt unter Verwendung von Transfectumreagenz (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). CHOdhrf&spplus;-Zellen, die auf einem DMEM-Medium wachsen, das 10% (V/V) dialysiertes FCS und 35 ug/ml L-Prolin enthält, wurden isoliert. Unter Verwendung dieser Zellen wurde die Bindungsaktivität für Ang II bestimmt mit der in Beispiel 9 beschriebenen Methode; ein Zellklon, der hohe Affinität für Ang II zeigte, wurde erhalten. Dieser Klon wurde als eine CHO-Zelllinie identifiziert, die den Ang II-Typ 1-Rezeptor aus menschlicher Plazenta in voller Länge exprimiert, der als CHO/pHARp306 bezeichnet wurde und in den folgenden Versuchen verwendet wurde.
Unter Verwendung einer Lösung einer cDNA-Bibliothek von λgt11 aus menschlichem Herzen (Clontech Laboratories, Inc.) wurde auch das Gen des Ang II-Typ 1-Rezeptors in voller Länge erhalten mit dem in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren, der sich als identisch erwies mit dem angegebenen Rezeptorgen der gleichen Art [H. Furuta et al., Biochemical Biophysical Research Communications, 183, 8 (1992)]. Dieses Gen wurde in pTB701 mit der Methode von Beispiel 7 eingesetzt, was das Expressionsplasmid pHARt306 lieferte, das dann in CHOdhfr&supmin;- Zellen, wie oben beschrieben, eingeführt wurde, um eine CHO- Linie zu etablieren, die das Ang II-Typ 1-Rezeptorgen voller Länge aus menschlichem Herzen stabil exprimierte, das als CHO/pHARt306 bezeichnet wurde und als Kontrolle in den folgenden Versuchen verwendet wurde.

Beispiel 11

Veränderungen der intrazellulären Calciumionenkonzentration als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II in CHO-Zellen (CHO/pHARp306), die das Ang II-Typ 1-Rezeptorgen voller Länge aus menschlicher Plazenta stabil exprimieren Veränderungen der intrazellulären Calciumionenkonzentration als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II (Endkonzentration 100 nM) in der obigen stabil exprimierenden Linie (CHO/pHARp306) wurden mit der Methode von Beispiel 6 gemessen; ein schneller Anstieg der Konzentration erfolgte, gefolgt von einem Abfall auf den Pegel vor der Verabreichung 1 Minute nach der Stimulierung (siehe Fig. 4). Gleichzeitig wurde CHO/pHARt306 untersucht; ein schneller Anstieg der Konzentration und anschließend aufrecht erhaltene höhere Pegel über einen Zeitraum von mehreren Minuten nach der Stimulierung wurden festgestellt (siehe Fig. 3). Diese Befunde deuten darauf hin, daß der Ang II-Typ 1-Rezeptor aus menschlicher Plazenta auf den Calciumionenkanal in anderer Weise ein wirkt, als der Ang II-Typ 1-Rezeptor, über den berichtet wurde.
Unter Verwendung des gleichen Testsystems wie oben, wurde die maximale Veränderung der intrazellulären Calciumionenkonzentration dreimal gemessen mit Ang II-Endkonzentrationen von 1 pM bis 10 uM. Anders als der angegebenen Ang II-Typ 1- Rezeptor (siehe Fig. 5A) war der Ang II-Typ 1-Rezeptor der vorliegenden Erfindung (siehe Fig. 5B) Gegenstand einer spezifischen Hemmung der Veränderung der intrazellulären Calciumionenkonzentration bei hohen Konzentrationen von Ang II.

Beispiel 12

Veränderungen der intrazellulären Inositphosphat-(IPS)- konzentration als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II in CHO-Zellen (CHO/pHARp306), die Ang II-Typ 1-Rezeptorgen aus menschlicher Plazenta mit voller Länge stabil exprimieren In jeden Napfeiner 12-Napf-Petrischale wurde DMEM-Medium mit 10% (V/V) dialysiertem FCS und 35 ug/ml L-Prolin zugegeben und 1 · 10&sup5; CHO/pHAR306-Zellen wurden eingeimpft. Einen Tag später wurde das Medium durch das gleiche Medium ersetzt, das aber 1 uCi/ml [³H]-markiertes Inosit (Amersham) enthielt und die Kultivierung wurde 24 Stunden lang fortgesetzt. Die Petrischale wurde zweimal mit PBS-Puffer (Flow Laboratories), der 0,2% (G/V) BSA enthielt, gewaschen und dann 30 Minuten lang stehen gelassen, wonach er 30 Minuten lang bei 37ºC in Gegenwart des gleichen Puffers, der aber 10 mM Lithiumchlorid enthielt, stehen gelassen wurde. Dann wurde Ang II auf eine Endkonzentration von 100 nM zugegeben und die Petrischale wurde bei 37ºC über einen gegebenen Zeitraum stehen gelassen. Sobald die Reaktionszeit 30 Sekunden überstieg, wurde die Reaktionsmischung unter Verwendung eines Absaugers entfernt, wonach 1 ml 5% (G/V) Trichloressigsäurelösung in jeden Napf zugegeben wurden, um die Reaktion zu stoppen. Wenn die Reak tionszeit 5 bis 30 Sekunden war, wurde 1 ml einer 10%-igen (G/V) Trichloressigsäurelösung direkt in jeden Napfinjiziert, um die Reaktion zu stoppen. Das mit [³H]-markierte Inositphosphat (IPs) wurde unter Verwendung einer Ionenaustauschsäule AG1-X8 (Bio-Rad Laboratories) abgetrennt. Insbesondere wurden Inositmonophosphat (IP1), Inositdiphosphat (IP2) und Inosittriphosphat (IP3) mit 5 mM Dinatriumtetraborat und 0,18 M Natriumformiat, mit 0,1 M Ameisensäure und 0,4 M Ammoniumformiat bzw. mit 0,1 M Ameisensäure und 1,0 M Ammoniumformiat eluiert. Die Radioaktivität jeder Fraktion wurde bestimmt unter Verwendung eines Flüssigscintillationszählers.
Als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II trat eine vorübergehende Erhöhung der IP3-Konzentration auf, gefolgt von der Bildung von IP2 und IP1 in dieser Reihenfolge (siehe Fig. 6). Kontroll-CHO/pHARt306-Zellen zeigten das gleiche IPs- Produktionsmuster, wie CHO/pHARp306-Zellen.
Dann wurde unter Verwendung des gleichen Testsystems, wie oben, die gesamte IPs-Produktion zwanzig Minuten nach der Stimulierung dreimal gemessen mit Ang II-Endkonzentrationen von 1 pM bis 10 um. Die IPs-Produktion wurde unterdrückt als Reaktion auf die Stimulierung mit hohen Konzentrationen von Ang II in CHO/pHARp306-Zellen (siehe Fig. 7B). Gleichzeitig wurden Kontroll-CHO/pHARt306-Zellen getestet, aber die IPs- Produktion wurde nicht unterdrückt, nicht einmal in Gegenwart hoher Konzentrationen von Ang II (siehe Fig. 7A). Dies zeigt, daß der Ang II-Typ 1-Rezeptor der vorliegenden Erfindung anders als der beschriebene Ang II-Typ 1-Rezeptor einer spezifischen Hemmung der IPs-Produktion bei hohen Konzentrationen von Ang II unterliegt.

Beispiel 13

Veränderungen der intrazellulären Konzentration an zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II bei CHO-Zellen (CHO/pHARp306), die Ang II-Typ I- Rezeptorgen voller Länge aus menschlicher Plazenta stabil exprimieren

In jeden Napfeiner 24-Napf-Petrischale wurde DMEM-Medium, das 10% (V/V) dialysiertes FCS und 35 ug/ml L-Prolin enthielt, gegeben und 1 · 10&sup5; CHO/pHAR306-Zellen wurden eingeimpft. Zwei Tage später wurde die Petrischale zweimal mit PBS-Puffer (Flow Laboratories), der 0,2% (G/V) BSA und 1 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX) enthielt, gewaschen und dann bei 37ºC 20 Minuten lang stehen gelassen, wonach Ang II auf eine Endkonzentration von 100 nM zugegeben wurde und die Petrischale 10 Minuten bei 37ºC stehen gelassen wurde. Nachdem die Reaktionsmischung unter Verwendung eines Absaugers entfernt worden war, wurden 500 ul einer 5%-igen (G/V) Trichloressigsäurelösung in jeden Napfgegeben, um die Reaktion zu stoppen. Die Menge an cAMP wurde mit EIA gemessen (cAMP-Enzyme immunoassay system, hergestellt von Amersham). Gleichzeitig wurde unter Verwendung von Kontroll- CHO/pHARt306-Zellen die Veränderung der intrazellulären cAMP- Konzentration als Reaktion auf die Stimulierung mit Ang II gemessen. In jeder Art von Zellen blieb die cAMP- Konzentration unverändert, sogar bei einer Stimulierung mit Ang II.
Dann wurde unter Verwendung des gleichen Testsystems wie oben, wobei aber 10 um Forskolin als Stimulans an Stelle von Ang II verwendet wurden, intrazelluläre Adenylatcyclase aktiviert, was zur Bildung von etwa 80 umol/Napf cAMP bei beiden Arten von Zellen führte. Getrennt wurden Zellen sowohl mit 1 pM bis 10 um Ang II und 10 um Forskolin gleichzeitig stimuliert und die gesamte cAMP-Produktion wurde dreimal 10 Minu ten später gemessen. Kontroll-CHO/pHARt306-Zellen erlitten eine Unterdrückung der cAMP-Produktion abhängig von der Ang II-Konzentration (siehe Fig. 8A). Andererseits zeigte sich bei den CHO/pHARp306-Zellen keine Unterdrückung der cAMP- Produktion bei einer Stimulierung mit hohen Konzentrationen von Ang II, obwohl sie das gleiche Muster der cAMP- Produktionsunterdrückung zeigten, wie die Kontrollzellen, als Reaktion auf die Stimulierung mit geringen Konzentrationen von Ang II (siehe Fig. 8B).

Beispiel 14

Bestimmung der Bindungsaktivität von radioaktiv markiertem Ang II unter Verwendung der Membranfraktion von Tierzellen, die Ang II-Typ 1-Rezeptorgen voller Länge aus menschlicher Plazenta stabil exprimieren

Eine Zellmembranfraktion wurde aus der stabil exprimierenden Linie, die in Beispiel 10 beschrieben wird (CHO/pHARp306) extrahiert mit dem in Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 244, 571 (1988) beschriebenen Verfahren und bei -80ºC aufbewahrt, bis zur Bestimmung der Bindungsaktivität. Alle Messungen wurden in einer Reihe von drei Durchläufen durchgeführt. Eine nichtspezifische Bindung wurde definiert als der Anteil an Bindung in Gegenwart von 1 um Ang II. Ein Aliquot einer Membranfraktion, die äquivalent 10 ug Protein war, wurde in einer 0,1%-igen (G/V) BSA-Lösung, die 25 mM Tris (pH 7,6) und 5 mM Magnesiumchlorid enthielt, suspendiert, was 194 ul Suspension lieferte. Zu dieser Suspension wurden 5 ul Probe und 1 ul mit [¹²&sup5;I] markiertem Ang II (Amersham) zugegeben und die Mischung bei 22ºC stehen gelassen. Nach 45 Minuten der Reaktion wurde die Reaktionsmischung auf ein Glasfilter abgesaugt, das mit 4 ml eisgekühltem Tris (pH 7,6) gewaschen wurde und die verbleibende Radioaktivität auf dem Glasfilter unter Verwendung eines γ-Strahlenzählers gemessen. Die endgültige Probenkonzentration wurde über einen Bereich von 1 pM bis 10 um variiert. Bei der Messung wurde der Anteil an nichtspezifischer Bindung als 0% definiert und der maximale Anteil an Bindung in Abwesenheit von Probe wurde als 100% definiert. In dieser Hinsicht wurde der -10 g (M) Wert der Probenkonzentration (M), der bei 50%-iger Bindung entsteht, als IC&sub5;&sub0;-Wert definiert. Eine Membranfraktion wurde auch aus Kontroll-CHO/pHARt305-Zellen auf gleiche Weise, wie oben, extrahiert und untersucht unter Verwendung des gleichen Testsystems. Die verwendeten Proben waren Ang I, Ang II und Ang III als Agonisten und DuP753, PD123177 (oben beschrieben, siehe Beispiel 8), CV-11974 (Arbeitsbeispiel 2 und Tabelle 3 von EP 459136), CV-12843 (Arbeitsbeispiel 38 von EP445811) und CV-12426 (Arbeitsbeispiel 22 von EP483683) als Antagonisten.
Der Ang II-Typ 1-Rezeptor aus menschlicher Plazenta (siehe Tabelle 2B) zeigte eine Ligandenbindungsstelle, deren Affinität verschieden war von der des angegebenen Ang II-Typ 1- Rezeptors aus menschlichem Herzen (siehe Tabelle 2A). Tabelle 2

Claims

1. Polypeptid enthaltend die Aminosäuresequenz der Formel

2. Polypeptid nach Anspruch 1, die das Polypeptid umfaßt, das die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 6 gezeigt ist, enthält.

3. Polypeptid nach Anspruch 1, worin das Polypeptid ein Angiotensin II-Typ 1-Rezeptor ist.

4. Rekombinante DNA umfassend die Nukleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz von Anspruch 1 kodiert.

5. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, worin die DNA die Nukleotidsequenz der Formel:

umfaßt.

6. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, worin die DNA die Nukleotidsequenz der Formel:

umfaßt.

7. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, worin die DNA die in SEQ ID Nr. 5 gezeigte Nukleotidsequenz umfaßt.

8. Transformant, der die rekombinante DNA von Anspruch 4 trägt.

9. Verfahren zur Herstellung des Polypeptids nach Anspruch 1, das umfaßt, daß man den Transformanten von Anspruch 8 in einem Medium züchtet, um das Polypeptid zu erzeugen und anzusammeln, und es aus der Kulturbrühe erntet.

10. Verfahren zum Screenen einer Anti-Angiotensin II- Substanz, das umfaßt, daß man in Gegenwart von Angiotensin II und dem Polypeptid von Anspruch 1 eine Substanz identifiziert, die Angiotensin II an der Bindung an das Polypeptid hemmen kann.

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin die Anti-Angiotensin II-Substanz ein Angiotensin II-Typ 1-Rezeptor-Antagonist ist.

12. Verfahren zum Screenen eines Angiontensin II-Typ 1- Rezeptor-Liganden, das umfaßt, daß man eine Substanz identifiziert, die das Polypeptid von Anspruch 1 binden kann.

13. Verfahren nach Anspruch 12, worin der Ligand ein Angiotensin II-Typ 1-Rezeptor-Agonist ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, worin der Ligand ein Angiotensin II-Typ 1-Rezeptorantagonist ist.

15. Verfahren zum Screenen einer Anti-Angiotensin II- Substanz, das umfaßt, daß man in Gegenwart des Transformanten von Anspruch 8, der das Polypeptid von Anspruch 1 enthält, und von Angiotensin II eine Substanz identifiziert, die eine Veränderung der Konzentration einer auf Angiotensin II reagierenden Substanz, die intrazellulär vorhanden ist, als Reaktion auf Angiotensin II in dem Transformanten unterdrücken kann.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin der Transformant eine Tierzelle ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15, worin die auf Angiontensin 11 reagierende Substanz ein Calciumion, Inositphosphat oder cAMP ist.

18. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Anti-Angiotensin II-Substanz ein Angiotensin II-Typ 1-Rezeptorantagonist ist.

19. Verfahren zum Screenen eines Angiotensin II-Typ 1- Rezeptoragonisten, das umfaßt, daß man eine Substanz identifiziert, die eine Konzentration einer auf Angiotensin II reagierenden Substanz, die intrazellulär vorhanden ist, in dem Transformanten von Anspruch 8, der das Polypeptid von Anspruch 1 enthält, verändern kann.

20. Rekombinante DNA nach Anspruch 4, worin die DNA eine Nukleotidsequenz umfaßt, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID Nr. 6 kodiert.

21. Transformant nach Anspruch 8, worin der Transformant eine Hefe- oder Tierzelle ist.

22. Transformant nach Anspruch 8, worin der Transformant ein Bakterium der Gattung Escherichia oder der Gattung Bacillus ist.

23. Verfahren nach Anspruch 19, worin der Transformant eine Tierzelle ist.

Sequenzprotokoll

SEQ ID Nr.: 1

Sequenzlänge: 127

Sequenzart: Aminosäure

Molekülart: Peptid

Hypothetische Sequenz: Ja

Fragmentart:

Intermediärfragment

SEQ ID Nr.: 2

Sequenzlänge: 381

Sequenzart: Nucleinsäure

Strangform: Doppelstrang

Topologie: linear

Molekülart: cDNA zu mRNA

Ursprung:

Organismus: Mensch

Organ: Plazenta

SEQ ID Nr.: 4

Sequenzlänge: 20

Sequenzart: Nucleinsäure

Strangform: Einzelstrang

Topologie: linear

Molekülart: Andere Nucleinsäure (chemisch synthetisierte DNA)

Antisense: ja

SEQ ID Nr.: 5

Sequenzlänge: 1572

Sequenzart: Nucleinsäure

Strangform: Doppelstrang

Topologie: linear

Molekülart: cDNA zu mRNA

Ursprung:

Organismus: Mensch

Organ: Plazenta

Direkter Ursprung:

Bibliothek: Humanplazenta cDNA-Bibliothek

Clone: pHARp 116