DE69233155T2

DE69233155T2 - Insulinartigen wachstumsfaktor bindendes protein

Info

Publication number: DE69233155T2
Application number: DE69233155T
Authority: DE
Inventors: C. Michael KIEFER
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1991-01-08
Filing date: 1992-01-02
Publication date: 2004-06-03
Anticipated expiration: 2012-01-03
Also published as: WO1992012243A1; EP0556344B1; US6500635B1; IE920044A1; US20030082744A1; CA2100083A1; EP0556344A1; DE69233155D1; PT99995A; ATE247164T1; EP0556344A4; US20050136058A1; US6906029B2; PT99995B

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG Bereich der Offenbarung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Allgemeinen die Herstellung von Polypeptiden mit Hilfe von rekombinanten DNA-Molekülen, die solche Polypeptide codieren. Spezifischer betrifft diese Erfindung ein neues insulinähnlicher Wachstumsfaktor-Bindeprotein (hierin als IGFBP-6 bezeichnet, nun jedoch von der wissenschaftlichen Gemeinschaft als IGFBP-5 bezeichnet), rekombinante DNA-Moleküle, die dieses Polypeptid codieren und Verfahren zur Herstellung von IGFBP-6 aus rekombinanten Wirtszellen.
Beschreibung des damit verwandten Stand der Technik
Insulinähnliche Wachstumsfaktoren (IGFs) sind Polypeptid-Hormone von niedrigem Molekulargewicht mit struktureller Homologie zu Proinsulin. Es sind zwei verschiedene IGFs bekannt, namentlich IGF-I und IGF-II, die in vitro für eine große Vielzahl von Zellen in Gewebekultur mitogen sind. Beide IGFs stimulieren in vitro das Wachstum verschiedener Gewebe und sie induzieren im Besonderen die Kollagensynthese. IGF-I vermittelt die Wachstum-verstärkende Wirkung des Wachstumshormons in der Chondrogenese und Knochenbildung und ist deshalb für das normale Wachstum eines Individuums notwendig. Dies wird durch die Tatsache gezeigt, dass Pygmäen und Zwergpudel für IGF-I defizient sind, jedoch normale Wachstumshormon-Spiegel in ihrem Serum besitzen. Von IGF-II glaubt man, dass es bei der fötalen Entwicklung und dem Nervenwachstum eine Schlüsselrolle spielt.
Zusätzlich zu ihrer primären Wirkung auf das skelettartige Gewebe, zeigen IGFs auch Wachstum-stimulierende Funktionen in anderen Geweben. Von Fibroblasten in Wunden ist bekannt, dass sie IGFs produzieren, die wirksam sind, um Fibroblasten dazu zu stimulieren, zu wachsen und Kollagen zu synthetisieren, ein strukturelles Protein, das normalerweise für die Wundheilung erforderlich ist. Die Vaskularisierung von Wundgewebe wird ebenfalls induziert. Weiter wurde auch gefunden, dass IGFs, dadurch dass sie die Blutbildung (Hämatopoese) induzieren, eine Erythropoietin-ähnliche Aktivität besitzen.
Neuere Studien haben auch gezeigt, dass die von bestimmten Krebszellen, z. B. Brust- und Nieren-Krebszellen, produzierten IGFs die Proliferation von Krebszellen und von vaskulärem und fibrotischem Gewebe, die erforderlich sind, um das Wachstum von Krebsgeweben zu fördern, auto-stimulieren.
Zusätzlich zeigen beide IGFs eine ganze Reihe metabolischer Aktivitäten, die denjenigen von Insulin ähnlich sind, dadurch dass sie im Besonderen den Transport und die Metabolisierung von Glucose stimulieren. Die biologischen Wirkungen von IGFs und Insulin werden durch deren Bindung an spezifische Rezeptoren vermittelt. Im Besonderen haben beide IGFs die Fähigkeit, den Insulin-Rezeptor mit etwa 100-fach niedrigerer Affinität zu binden, als Insulin das tut.
Beide IGFs haben eine Konzentration im Blut, die ungefähr 100-fach höher ist als die von Insulin. Hypoglykämie wird durch einen regulatorischen Mechanismus verhindert, der Trägerproteine beinhaltet, die im Blut vorliegen und in der Lage sind mit IGFs Komplexe zu bilden. Somit zirkulieren IGFs im Blut in Form eines Komplexes, der keine insulinähnliche Aktivität besitzt. Durch ihre Verknüpfung mit Trägerproteinen (hierin nachfolgend als IGF-Bindeproteine oder IGFBPs bezeichnet) wird die Bindung von IGFs an Zelloberflächen-Rezeptoren verhindert. Es ist auch gezeigt worden, dass eine andere Funktion der IGF-Bindeproteine darin liegt, die kurze Halbwertszeit von IGFs zu erhöhen, die einer schnellen proteolytischen Degradation unterliegen, wenn sie in freier Form im Blut vorliegen.
In Übereinstimmung mit dem Vorangehenden können IGFs in vitro zweckmäßig sein, um a) das Wachstum von Tieren und Menschen mit Wachstumshormon-Defizienz zu stimulieren, b) Gewebe-Regeneration, wie Erythropoese und Chondrogenese zu stimulieren, c) Wundheilung und d) die Funktionen verschiedener Organe, z. B. Leber oder Niere zu stimulieren. Als ein Ergebnis ihrer Chondrogenese-stimulierenden Aktivität sind IGFs besonders für die Verwendung zur Knochenbildung geeignet, z. B. bei der Behandlung von Osteoporose. IGFs werden zur Verwendung bei den vorstehend genannten Behandlungen einer Testperson (einem Individuum) vorteilhaft in Verbindung mit mindestens einem IGF-Bindeprotein verabreicht.
Die Verabreichung der Kombination von IGF und einem IGF-Bindeprotein hat eher als IGF alleine heilsame Wirkungen, die Vermeidung von Hypoglykämie und von möglichen mitogenen Wirkungen an den Injektionsstellen und die Verlängerung der IGF-Halbwertszeit eingeschlossen. Darüber hinaus wurde gefunden, dass Bindeproteine zur Verstärkung der Erythropoietin-ähnlichen Wirkung von IGF-I zweckmäßig sind. Die Bindeproteine können auch zum Targetieren der IGFs zu spezifischen Geweben zweckmäßig sein.
Wenn sie alleine verabreicht werden, d. h. ohne irgendein IGF, können die Bindeproteine ebenfalls therapeutisch nützlich sein, um die nachteiligen Wirkungen von IGFs, wie diejenigen, die auftreten, wenn IGFs im Überschuss produziert werden, z. B. freie IGFs, die von bestimmten Krebszellen sekretiert werden, z. B. von Hormon-produzierenden Krebszellen, wie Brust- oder Nieren-Krebszellen, zu blockieren. Eine Therapie mit IGF-Bindeprotein kann auch die Erblindung als ein sekundärer Effekt der diabetischen proliferativen Retinopathie verhindern. Es ist in der Tat gezeigt worden, dass IGFs zu denjenigen Faktoren gehören können, die die endotheliale und die Fibroblasten-Proliferation bei der diabetischen Retinopathie stimulieren.
Eine andere therapeutische Verwendung von IGFBPs ist die Kontrolle von übermäßigem Wachstum in IGF-Bindeproteindefizienten Individuen, denn es ist sehr wahrscheinlich, dass hohe IGF-Spiegel in Kombination mit abnormal niedrigen Spiegeln von Bindeprotein für das übermäßige Wachstum verantwortlich sind.
Bekannte Formen von IGFBPs beinhalten IGFBP-1, das in Menschen ein Molekulargewicht von ungefähr 30–40 kd besitzt. Siehe z. B. Povoa, G. et al., Eur. J. Biochem (1984) 144: 199–204, das sich auf IGFBP-1 bezieht, das aus Amnionflüssigkeit isoliert und aufgereinigt wurde; Koistinen, R. et al., Endocrinology (1986) 118: 1375–1378 bezieht sich auf IGFBP-1, das aus menschlicher Plazenta isoliert und aufgereinigt wurde; Powell, D. R. et al., J. Chromatogr. (1987) 420: 163–170 bezieht sich auf ein 30–40 kd IGFBP-1, das aus konditioniertem Medium von Hepatoma G2 (Hep-G2)-Zellen isoliert und aufgereinigt wurde; Lee, Y. L. et al., Mol. Endocrinol. (1988) 2: 404–411 bezieht sich auf eine Aminosäuresequenz von IGFBP-1, das aus Hep-G2-Zellen isoliert wurde; Brinkman, A. et al., The EMBO Journal (1988) 7: 2417–2423 bezieht sich auf eine IGFBP-1 cDNA-Bibliothek, die aus Plazenta stammt; Brewer, M. T. et al., Bioch. Biophys. Res. Com. (1988) 152: 1289–1297 betrifft die Nucleotid- und Aminosäuresequenz von IGFBP-1, das aus einer menschlichen Gebährmutter-Schwangerschafts-Endometrium-Bibliothek cloniert wurde; WO 89/09792, veröffentlicht am 19. Oktober 1990, Clemmons, D. R. et al., betrifft cDNA-Sequenzen und Clonierungsvektoren für IGFBP-1 und IGFBP-2; WO 89/08667, veröffentlicht am 21. September 1989, Drop, L. S., et al., betrifft eine Aminosäuresequenz von dem insulinähnlicher Wachstumsfaktor-Bindeprotein 1 (IGFBP-1); WO 89/09268, veröffentlicht am 5. Oktober 1989, Baxter, R. C., betrifft eine cDNA-Sequenz von IGFBP-1 und Verfahren zur Expression von IGFBP-1.
IGFBP-2 hat ein Molekulargewicht von ungefähr 33–36 kd. Siehe z. B. Binkert, C. et al., The EMBO Journal (1989) 8: 2497–2502, betrifft eine Nucleotid- und eine davon abgeleitete Aminosäuresequenz von IGFBP-2.
IGFBP-3 hat ein Molekulargewicht von 150 kd. Siehe z. B. Baxter, R. C. et al., Bioch. Biophys. Res. Com. (1986) 139: 1256–1261, betrifft eine 53 kd-Untereinheit von IGFBP-3, die aus menschlichem Serum aufgereinigt wurde; Wood, W. I. et al., Mol. Endocrinol. (1988) 2: 1176–1185 betrifft eine Aminosäuresequenz für IGFBP-3 von vollständiger Länge und die zelluläre Expression der clonierten IGFBP-3 cDNA in menschlichen Gewebekultur-Zellen; WO 90/00569, veröffentlicht am 25. Januar 1990, Baxter, R. C., betrifft die Isolierung einer Säure-unbeständigen Untereinheit ("acid-labile subunit"; ALS) des (IGFBP)-Komplexes aus menschlichem Plasma und die spezielle Aminosäuresequenz von ALS betrifft eine Untereinheit von IGFBP-3.
Für nicht-menschliche Formen, siehe z. B. Mottola, C. et al., Journ. of Biol. Chem. (1986) 261:11.180–11.188 betrifft eine nicht-menschliche Form von IGFBP, die aus konditioniertem Medium von Rattenleber-BRL-3A-Zellen isoliert wurde und die ein Molekulargewicht von ungefähr 33–36 kd besitzt; Lyons, R. M. et al., Mol. Cell. Endocrinol. (1986) 45: 263–270 betrifft ein cloniertes BRL-3A-Rattenleber-Zellprotein von 34 kd, das als MCP bezeichnet wurde; EP-A-0369943 (veröffentlicht am 23. Mai 1990, Binkert, C., et al.,) betrifft eine cDNA-Sequenz des Ratten-BRL-3A-Bindeproteins und verwendet diese Sequenz, um drei menschliche cDNA-Bibliotheken zu durchmustern.
Mohan, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1989) 86: 8338–8342, betrifft eine N-terminale Aminosäuresequenz eines IGFBP (hierin als IGFBP-4 bezeichnet, in den vorliegenden Patentanmeldungen des Anmelders, die nachfolgend aufgeführt sind, jedoch als IGFBP-5 bezeichnet), das aus konditioniertem Medium menschlicher Osteosarkom-Zellen isoliert wurde und Shimasaki, S. et al., Mol. Endocrinology (1990) 4: 1451–1458, betrifft IGFBP-cDNAs, die ein IGFBP codieren (hierin als IGFBP-4 bezeichnet, in den vorliegenden Patentanmeldungen des Anmelders, die nachfolgend aufgeführt sind, jedoch als IGFBP-5 bezeichnet) aus Ratte und Mensch codieren.
Der Anmelder der vorliegenden Anmeldung besitzt eine Anzahl ebenfalls anhängiger Patentanmeldungen, die IGFBPs betreffen, einschließlich: EP-A-0546053 (die Priorität von USSN-07/574,613 und USSN-576,629 beanspruchend) und EP-A-0546081 (die Priorität von USSN-07/574,613 und USSN-07/576,648 beanspruchend), die genetisches Material und Aminosäuresequenzen eines Proteins betreffen, das hierin als "IGFBP-4" bezeichnet wird; EP-A-0546074 (die Priorität von USSN-07/574,613 und USSN-07/577,392 beanspruchend) und EP-A-0546110 (die Priorität von USSN-07/574,613 und USSN-07/577,391 beanspruchend), die genetisches Material und Aminosäuresequenzen eines Proteins betreffen, das hierin als "IGFBP-5" bezeichnet wird.
Zapf, J. et al., J. of Biol. Chem. (1990) 265: 14892–14898, betrifft vier IGFBPs (IGFBP-2, IGFBP-3, eine trunkierte Form von IGFBP-3 und IGFBP-4), die aus Serum eines erwachsenen Menschen mit Hilfe von insulinähnlicher Wachstumsfaktor (IGF)-Affinitätschromatographie und Hochdruck-Flüssigkeits-Chromatographie isoliert wurden.
Die Existenz einer Vielzahl unterschiedlicher IGF-Bindeproteine zeigt an, dass diese Proteine unterschiedliche Funktionen haben können. Da es möglich ist Krankheitsstadien zu diagnostizieren und auf mehrere verschiedene Arten die biologische Aktivität von IGFs zu modifizieren, indem die gegenwärtig bekannten Bindeproteine verwendet werden, besteht ein erhebliches Interesse für die Entdeckung neuer IGF-Bindeproteine, die die gleichen oder verschiedene biologischen/biologische Eigenschaften besitzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß ist es ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein weiteres IGF-Bindeprotein bereitzustellen.
Es ist weiter ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein neues IGF-Bindeprotein bereitzustellen, wobei rekombinante DNA-Moleküle verwendet werden, die in der Lage sind, das neue IGF-Bindeprotein zu exprimieren, um das Bindeprotein zu produzieren.
Diese und andere Gegenstände der Erfindung wurden erreicht, wie in den Ansprüchen dargelegt.
Obwohl das neue IGF-Bindeprotein hierin als "IGFBP-6" bezeichnet wird, hat die wissenschaftliche Gemeinschaft nachfolgend den Namen "IGFBP-5" für dieses Protein eingeführt.
Ein bedeutender Vorteil der Herstellung von IGFBP-6 mit Hilfe von rekombinanten DNA-Verfahren anstelle von Isolierung von IGFBP-6 aus natürlichen Quellen ist, dass entsprechende Mengen hergestellt werden können, indem weniger Ausgangsmaterial verwendet wird, als für die Isolierung des Bindeproteins aus einer natürlichen Quelle erforderlich wäre. Die Herstellung von IGFBP-6 mit Hilfe von rekombinanten Verfahren erlaubt auch, dass IGFBP-6 in Abwesenheit einiger Moleküle isoliert werden kann, die normalerweise in Zellen vorliegen, die natürlicherweise IGFBP-6 produzieren. In der Tat können IGFBP-Zusammensetzungen vollständig frei von irgendwelchen Spuren von menschlichen Protein-Kontaminationen leicht hergestellt werden, da das einzige menschliche Protein, das von dem rekombinanten nicht-menschlichen Wirt produziert wird, das rekombinante IGFBP ist. Potenzielle virale Bestandteile aus natürlichen Quellen werden ebenfalls vermieden. Es ist auch offensichtlich, dass rekombinante DNA-Verfahren verwendet werden können, um IGFBP-6-Polypeptid-Derivate herzustellen, die in der Natur nicht gefunden werden, wie die Variationen, die vorstehend beschrieben sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist ein schematisches Diagramm, das die Aminosäure- und Nucleotidsequenz eines Clons zeigt, der menschliches IGFBP-6 codiert.
BESCHREIBUNG VON SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es werden neue Zusammensetzungen bereitgestellt, die rekombinante Proteine umfassen, die unter Verwendung von Sequenzen, die IGFBP-6 und Fragmente, die davon abstammen, codieren, gemeinsam mit Proteinen, die aus natürlichen Quellen isoliert wurden, sowie Proteinen, die rekombinant exprimiert werden und Verfahren zur Herstellung dieser Proteine.
1. Definitionen
Die Anwendung der vorliegenden Erfindung wird, falls nicht anders angegeben, herkömmliche Verfahren aus der Molekularbiologie, Mikrobiologie, DNA Rekombination und Immunologie benutzen, die dem Stand der Technik entsprechen. Solche Verfahren sind in der Literatur vollständig erklärt. Siehe z. B. Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING; A LABORATORY MANUAL, SECOND EDITION (1989); DNA CLONING, VOLUMES I AND II (D. N. Glover Hrsg. 1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS (M. J. Gait Hrsg , 1984); NUCLEIC ACID HYBRIDIZATION (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (B. D. Hames & S. J. Higgins Hrsg. 1984); ANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney Hrsg. 1986); IMMOBILIZED CELLS AND ENZYMES (IRL Press, 1986); B. Perbal, A PRACTICAL CUIDE TO MOLECULAR CLONING (1984); die Serien, METHODS IN ENZYMOLOGY (Academic Press, Inc.); GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS (J. H. Miller and M. P. Calos Hrsg. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 und Vol. 155 (Wu and Grossman, bzw. Wu, Hrsg.), Mayer and Walker, Hrsg. (1987), IMMUNOCHEMICAL METHODS IN CELL AND MOLECULAR BIOLOGY (Academic Press, London), Scopes, (1987), PROTEIN PURIFICATION: PRINCEIPLES AND PRACTICE, Second Edition (Springer-Verlag, N. Y.), und HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY, VOLUMES I–IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell Hrsg. 1986).
Standard-Abkürzungen für Nucleotide und Aminosäuren werden in 1 und sonstwo in dieser Beschreibung verwendet.
Wie hierin verwendet, ist der Begriff IGFBP-6 eine Abkürzung für insulinähnlicher Wachstumsfaktor-bindendes Protein 6. Dieses Protein, oder ein Fragment davon, ist in der Lage an einen Antikörper zu binden, der für IGFBP-6 spezifisch ist oder an einen IGF-Faktor. Eine cDNA, die mindestens eine Form von IGFBP-6 codiert, ist in 1 dargestellt. Voraussichtlich existieren andere Arten von IGFBP-6 oder sie können erzeugt werden. Somit betrifft IGFBP-6 alle möglichen natürlich auftretenden Formen von IGFBP-6, einschließlich der Form, die in 1 gezeigt ist. In der gezeigten Sequenz kann die Spaltstelle für das reife Protein dort auftreten, wo es durch einen Pfeil angegeben ist (a), wobei ein Protein resultiert, das ein Molekulargewicht von 29.018 Da besitzt. Zusätzlich können andere Arten des Proteins dort gespalten werden, wo es durch den Pfeil angegeben ist (b), wobei ein Protein resultiert, das ein Molekulargewicht von ungefähr 28.500 Da besitzt.
Zusätzlich sind Analoge in der Definition eingeschlossen und trunkierte Polypeptide (einschließlich Fragmente) und IGFBP-6-ähnliche Polypeptide beinhaltet, z. B. Mutanten, die die katalytische Aktivität erhalten und vorzugsweise eine Homologie von mindestens 80% besitzen, mehr bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95%. Typischerweise unterscheiden sich solche Analoge durch nur 1, 2, 3 oder 4 Codon-Veränderungen. Beispiele beinhalten Polypeptide mit geringen Aminosäure-Variationen bezüglich der natürlichen Aminosäuresequenz von IGFBP-6; im Besonderen konservative Aminosäure-Austausche. Konservative Austausche sind diejenigen, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren auftreten, die hinsichtlich ihrer Seitenketten miteinander verwandt sind. Genetisch codierte Aminosäuren werden im Allgemeinen in vier Familien eingeteilt: (1) sauer = Asparaginsäure, Glutaminsäure; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin; (3) nicht-polar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Seurin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden manchmal gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Es ist zum Beispiel angemessen zu erwarten, dass ein vereinzelter Austausch eines Leucin durch ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartat durch ein Glutamat, eines Threonin durch ein Serin oder ein ähnlicher konservativer Austausch einer Aminosäure mit einer strukturell verwandten Aminosäure, keine große Wirkung auf die biologische Aktivität haben wird. Polypeptid-Moleküle, die im Wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz wie IGFBP-6 haben, aber geringfügige Aminosäure-Substitutionen besitzen, die die Fähigkeit der IGFBP-6-Polypeptid-Derivate mit IGFBP-6-spezifischen Molekülen, wie Antikörper und IGF-Moleküle, insbesondere IGF-I und speziell IGF-II, zu interagieren nicht wesentlich beeinflussen, liegen innerhalb der Definition von IGFBP-6. Derivate beinhalten aggregierte Konjugate mit anderen IGF-BP-Molekülen und kovalente Konjugate mit nicht verwandten chemischen Untereinheiten. Kovalente Derivate werden durch Kopplung von Funktionalitäten an Gruppen hergestellt, die in den IGF-BP-Aminosäure-Ketten oder an den N- oder C-terminalen Resten gefunden werden, wobei Verfahren verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt sind.
IGFBP-6-spezifische Moleküle beinhalten Polypeptide, wie Antikörper, die für das IGFBP-6-Polypeptid spezifisch sind, das die natürlich vorkommende IGFBP-6-Aminosäuresequenz enthält. Mit "spezifisch bindendes Polypeptid" sind Polypeptide gemeint, die an IGFBP-6 und dessen Derivate binden und die eine messbare höhere Bindungsaffinität für das Ziel-Polypeptid, d. h. IGFBP-6 und Polypeptid-Derivate von IGFBP-6 besitzen, als für andere Polypeptide, die auf Bindung getestet wurden. Höhere Affinität um einen Faktor 10 ist bevorzugt, ein Faktor 100 ist mehr bevorzugt. Die Bindungsaffinität für Antikörper betrifft ein einzelnes Bindungsereignis (d. h. monovalente Bindung eines Antikörper-Moleküls). Spezifische Bindung durch Antikörper bedeutet auch, dass die Bindung an der normalen Bindungsstelle des Antikörper-Moleküls stattfindet (am Ende der Arme innerhalb der variablen Region). Durch Verwendung der Sequenzdaten in 1, sowie der angegebenen Eigenschaften von IGFBP-6, liegt es innerhalb des Stands der Technik andere DNA-Sequenzen zu erhalten, die IGFBP-6 codieren. Das strukturelle Gen kann zum Beispiel manipuliert werden, indem einzelne Nucleotide verändert werden, während die richtige Aminosäure(n) erhalten bleibt (bleiben), oder indem die Nucleotide derart verändert werden, dass die Aminosäuren modifiziert werden ohne die biologische Aktivität zu verlieren. Nucleotide können mit Hilfe bekannter Verfahren substitutiert, inseriert oder deletiert werden, wobei diese zum Beispiel in vitro-Mutagenese und Primer- Reparatur beinhalten. Das strukturelle Gen kann an seinem 3'-Ende und/oder seinem 5'-Ende trunkiert sein, während es seine biologische Aktivität erhält.
Der Begriff "rekombinantes Polynucleotid", wie er hierin verwendet wird, betrifft ein Polynucleotid von genomischem, cDNA-, semisynthetischem oder synthetischem Ursprung, das aufgrund seines Ursprungs oder seiner Manipulation: (1) nicht verknüpft ist mit dem gesamten Polynucleotid oder einem Teil eines Polynucleotids, mit dem es natürlicherweise verknüpft ist, (2) mit einem anderen Polynucleotid verknüpft ist, als demjenigen, mit dem es natürlicherweise verknüpft ist, oder (3) es tritt in Natur nicht auf.
Der Begriff "Polynucleotid", wie er hierin verwendet wird, betrifft eine polymere Form von Nucleotiden von beliebiger Länge, entweder Ribonucleotide oder Desoxyribonucleotide. Dieser Begriff bezieht sich nur auf die Primärstruktur des Moleküls. Somit beinhaltet dieser Begriff doppel- und einzelsträngige DNA und RNA. Er beinhaltet auch bekannte Arten von Modifikationen, zum Beispiel Markierungen, die im Stand der Technik bekannt sind, Methylierung, das Vorliegen von "Schutzkappen", die Substitution einer oder mehrerer natürlich vorkommender Nucleotide durch ein Analogon, Internucleotid-Modifikationen, wie zum Beispiel solche mit ungeladenen Verknüpfungen (z. B. Methylphosphonate, Phosphotriester, Phosphoamidate, Carbamate etc.) und mit geladenen Kopplungen (z. B. Phosphothioate, Phosphodithioate etc.), solche, die angehängte Untereinheiten enthalten, wie zum Beispiel Proteine (einschließlich z. B. Nucleasen, Toxine, Antikörper, Signalpeptide, Poly-L-Lysin etc.), solche mit interkalierenden Stoffen (z. B. Acridin, Psoralen etc.), diejenigen, die Chelatoren enthalten (z. B. Metalle, radioaktive Metalle, Bor, oxydative Metalle etc.), solche, die Alkylatoren enthalten, solche mit modifizierten Verknüpfungen (z. B. alpha- anomerische Nucleinsäuren etc.), sowie nicht modifizierte Formen des Polynucleotids.
Ein "Replicon" ist irgendein genetisches Element, z. B. ein Plasmid, ein Chromosom, ein Virus, ein Cosmid etc., das sich als eine autonome Einheit von Polynucleotid-Replikation innerhalb einer Zelle verhält; d. h. in der Lage ist, unter seiner eigenen Kontrolle zu replizieren. Das kann selektierbare Marker beinhalten.
Ein "Vektor" ist ein Replicon, in dem ein anderes Polynucleotid-Segment eingelagert ist, derart dass es die Replikation und/oder Expression des damit verknüpften Segments bewirkt.
"Kontrollsequenz" betrifft Polynucleotidsequenzen, die notwendig sind, um die Expression der codierenden Sequenzen zu bewirken, an die sie ligiert sind. Die Natur solcher Kontrollsequenzen ist unterschiedlich in Abhängigkeit von dem Wirtsorganismus; in Prokaryonten beinhalten solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen den Promotor, die ribosomale Bindungsstelle und die Transkriptions-Terminations-Sequenz; in Eukaryonten beinhalten solche Kontrollsequenzen im Allgemeinen Promotoren und Transkriptions-Terminations-Sequenzen. Der Begriff "Kontrollsequenzen" ist so gemeint, dass mindestens alle Komponenten beinhaltet sind, deren Anwesenheit für die Expression notwendig ist und kann auch zusätzliche Komponenten beinhalten, deren Anwesenheit von Vorteil ist, zum Beispiel Leitsequenzen (Leadersequenzen) und Fusionspartner-Sequenzen.
"Funktionell verbunden" betrifft eine unmittelbare Nachbarschaft, wobei die Komponenten, die derart beschrieben sind, in einer Beziehung zueinander stehen, die ihnen erlaubt, in der beabsichtigten Art und Weise zu funktionieren. Eine Kontrollsequenz funktionell verbunden mit einer codierenden Sequenz ist auf eine Art und Weise ligiert, dass die Expression der codierenden Sequenz unter Bedingungen erhalten wird, die mit den Kontrollsequenzen in Einklang stehen.
Ein "offener Leserahmen" (open reading frame, ORF) ist eine Region einer Polynucleotidsequenz, die ein Polypeptid codiert; diese Region kann einen Teil einer codierenden Sequenz oder eine vollständige codierende Sequenz repräsentieren.
Eine "codierende Sequenz" ist eine Polynucleotidsequenz, die in ein Polypeptid translatiert wird, gewöhnlich über mRNA, wenn sie unter die Kontrolle angemessener regulatorischer Sequenzen gestellt wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Translations-Start-Codon am 5'-Ende und ein Translations-Stop-Codon am 3'-Ende bestimmt. Eine codierende Sequenz kann cDNA und rekombinante Polynucleotidsequenzen beinhalten, ist jedoch nicht darauf beschränkt auf. "PCR" betrifft das Verfahren der Polymerase-Kettenreaktion, wie in Saiki, et al., Nature 324: 163 (1986); U.S.-Patent Nr. 4,683,195; und dem U.S.-Patent Nr. 4,683,202 beschrieben.
Wie hierin beschrieben, ist x "heterolog" im Hinblick auf y, wenn x nicht natürlicherweise mit y auf die gleiche Art und Weise assoziiert ist; d. h. x ist mit y natürlicherweise nicht assoziiert oder x ist mit y nicht auf die gleiche Art und Weise assoziiert, wie es in der Natur vorkommt.
"Homologie" betrifft den Grad an Ähnlichkeit zwischen x und y. Man geht davon aus, dass die allgemeine Homologie zwischen verschiedenen Arten oder Formen von IGFBP-6 auf der Nucleotid-Ebene wahrscheinlich 40% oder größer sein wird, wahrscheinlich etwa 60% oder größer, und sogar noch wahrscheinlicher etwa 80% bis etwa 90% oder größer. Die Übereinstimmung zwischen der Sequenz einer Form mit einer anderen kann durch Verfahren bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Sie kann zum Beispiel durch einen direkten Vergleich der Sequenz-Information des Polynucleotids bestimmt werden. In einer alternativen Ausführungsform kann die Homologie durch Hybridisierung des Polynucleotids unter Bedingungen, die stabile Doppelhelices zwischen homologen Regionen ausbilden (zum Beispiel diejenigen, die vor einer S₁-Spaltung verwendet würden), gefolgt von einer Spaltung mit (einer) Einzelstrang-spezifische(n) Nuclease(n), gefolgt von der Größenbestimmung des gespaltenen Fragments.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Polypeptid" auf ein Polymer von Aminosäuren und betrifft keine spezifische Länge des Produkts; somit sind innerhalb der Definition Polypeptid, Peptide, Oligopeptide und Proteine enthalten. Dieser Begriff schließt auch Modifikationen des Polypeptids nach dessen Expression nicht aus, zum Beispiel Glycosylierungen, Acetylierungen, Phosphorylierungen und ähnliche. Eingeschlossen in der Definition sind zum Beispiel Polypeptide, die ein oder mehrere Analoge s) einer Aminosäure enthalten (eingeschlossen zum Beispiel nicht natürlicherweise vorkommende Aminosäuren etc.), Polypeptide mit substituierten Bindungen, sowie andere Modifikationen, die im Stand der Technik bekannt sind, sowohl natürlicherweise vorkommende und nicht natürlicherweise vorkommende.
Ein Polypeptid oder eine Aminosäuresequenz, die von einer ausgewiesenen Nucleotidsequenz "abstammt", betrifft ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die identisch ist mit derjenigen eines Polypeptids, das durch die Sequenz codiert wird, oder einem Teil davon, wobei der Teil aus mindestens drei bis fünf Aminosäuren und mehr bevorzugt aus mindestens acht bis 10 Aminosäuren und sogar noch mehr bevorzugt von mindestens 11 bis 15 Aminosäuren besteht oder die mit einem Polypeptid, das durch die Sequenz codiert wird, immunologisch identifiziert werden kann. Diese Terminologie beinhaltet auch ein Polypeptid, das von einer ausgewiesenen Nucleinsäuresequenz exprimiert wird.
IGFBP-6 oder Polypeptid-Derivate davon können zur Herstellung von Antikörpern verwendet werden, entweder monoclonalen oder polyclonalen, die für IGFBP-6 spezifisch sind. Diese Begriffe und die Verfahren zur Herstellung der Antikörper sind im Stand der Technik bekannt.
"Rekombinante Wirtszellen", "Wirtszellen", "Zellen", "Zelllinien", "Zellkulturen" und andere solche Begriffe bezeichnen zum Beispiel Mikroorganismen, Insektenzellen und Säugerzellen, die als Empfänger für rekombinante Vektoren oder andere Transfer-DNA verwendet werden können oder verwendet worden sind und beinhalten die Nachkommen der ursprünglichen Zelle, die transformiert worden ist. Es ist selbstverständlich, dass die Nachkommen einer einzelnen elterlichen Zelle bezüglich der Morphologie oder des genomischen oder gesamten DNA-Komplements, aufgrund natürlicher, unbeabsichtigter oder beabsichtigter Mutation, nicht notwendigerweise vollständig mit dem ursprünglichen Vorgänger identisch sind.
Wie hierin verwendet, beinhaltet der Begriff "Mikroorganismus" prokaryontische und eukaryontische mikrobielle Arten, wie Bakterien und Pilze, wobei die letzteren Hefe und filamentöse Pilze beinhalten.
"Transformation", wie hierin verwendet, betrifft die Inserierung eines exogenen Polynucleotids in eine Wirtszelle, ungeachtet des Verfahrens, das für die Inserierung verwendet wurde, zum Beispiel direkte Aufnahme, Transduktion, f-Paarung oder Elektroporation. Das exogene Polynucleotid kann als ein nicht integrierter Vektor erhalten werden, zum Beispiel ein Plasmid, oder in einer alternativen Ausführungsform in das Wirtsgenom integriert vorliegen.
Mit "aufgereinigt" und "isoliert", wenn es sich auf ein Polypeptid oder eine Nucleotidsequenz bezieht, ist gemeint, dass das angezeigte Molekül im Wesentlichen frei von anderen biologischen Makromolekülen vom gleichen Typ vorliegt. Der Begriff "aufgereinigt", wie er hierin verwendet wird, bedeutet vorzugsweise mindestens 95 Gewichts-%, mehr bevorzugt mindestens 99 Gewichts-% und am meisten bevorzugt mindestens 99,8 Gewichts-% biologische Makromoleküle des gleichen Typs liegen vor (Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, insbesondere Moleküle, die ein Molekulargewicht von weniger als 1.000 besitzen, können jedoch vorliegen).
2. Spezifische Verfahrensweisen zur Durchführung der Erfindungs
a. Quellen des IGFBP-6
IGFBP-6 stammt von Säugern ab, z. B. Maus, Schwein, Pferd, Rind und aus menschlichen Quellen. Alle diese Quellen sind in der Definition von IGFBP-6 enthalten, solange sie dem erforderlichen Grad an Homologie entsprechen.
IGFBP-6 beinhaltet Bindeproteine, die aus einem Gewebeextrakt oder aus einem konditionierten Kulturmedium aufgereinigt wurden, sowie solche, die durch rekombinante Verfahren erhalten wurden.
b. Reinigung von IGFBP-6
IGFBP-6 kann leicht aus Blut und seinen Komponenten wie Serum und Plasma und aus Zellen, die genetisch derart modifiziert wurden, dass sie IGFBP-6 oder Polypeptid-Derivate davon produzieren, mit Hilfe von Affinitäts-Chromatographie aufgereinigt werden, wobei ein monoclonaler Antikörper verwendet wird, der spezifisch ist für IGFBP-6. Zusätzlich zu der Verwendung von Antikörper-Affinitäts-Chromatographie, können IGFBP-6 und Polypeptid-Derivate davon durch eine Vielzahl anderer weitläufig bekannter Protein-Aufreinigungs-Verfahren (entweder alleine oder in Kombination) aufgereinigt werden, die Immunpräzipitation, Gelfiltration, Ionenaustausch-Chromatographie, Chromatofokussierung, isoelektrische Fokussierung, selektive Präzipitation, Elektrophorese und ähnliche beinhalten. Fraktionen, die während der Aufreinigungsverfahren isoliert werden, können auf die Anwesenheit von IGFBP-6 oder Polypeptid-Derivaten von IGFBP-6, mit Hilfe von Immuntests analysiert werden, die IGFBP-6-spezifische Antikörper oder IGFBP-6-spezifische Biotests verwenden. Ausführliche Beispiele werden nachfolgend bereitgestellt.
c. Isolierung von IGFBP-6-Sequenzen
Die Isolierung von Nucleotidsequenzen, die IGFBP-6 codieren, beinhaltet die Erzeugung von entweder einer genomischen Bibliothek, die aus Zellen hergestellt wurde, die IGFBP-6 codieren, oder die Herstellung einer cDNA-Bibliothek anhand von RNA, die aus Zellen isoliert wurde, die IGFBP-6 exprimieren. Es wird im Allgemeinen bevorzugt, eine cDNA-Bibliothek zur Isolierung von IGFBP-6-codierenden Nucleotidsequenzen zu erzeugen, um alle möglichen Probleme zu vermeiden, die aus Versuchen entstehen die Intron/Exon-Übergänge zu bestimmen. Genetische Bibliotheken können entweder in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirtszellen hergestellt werden. Weitläufig erhältliche Clonierungsvektoren wie Plasmide, Cosmide, Phagen, YACs und ähnliche können verwendet werden, um genetische Bibliotheken zu erzeugen, die zur Isolierung von Nucleotidsequenzenen, die IGFBP-6 oder Teile davon codieren, geeignet sind.
d. Durchmusterung nach Anwesenheit von IGFBP-6-Sequenzen
Zweckmäßige Verfahren zur Durchmusterung genetischer Bibliotheken auf die Anwesenheit von IGFBP-6-Nucleotidsequenzen beinhalten die Herstellung von Oligonucleotid-Sonden, auf der Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz-Information von gereinigtem IGFBP-6 oder von gereinigten internen Fragmenten, die von gereinigtem IGFBP-6 abstammen. Durch Anwendung des Standard-genetischen Triplet-Codes können Oligonucleotidsequenzen von etwa 17 Basenpaaren oder länger mit Hilfe von konventionellen in vitro-Synthese-Verfahren hergestellt werden, derart, dass sie den Bereichen von IGFBP-6 entsprechen, für die die Aminosäuresequenz durch N-terminale Analyse bestimmt worden ist. Die resultierenden Nucleinsäuresequenzen können nachfolgend mit Radionucliden, Enzymen, Biotin, fluoreszierenden Stoffen oder ähnlich markiert werden und als Sonden für die Durchmusterung von genetischen Bibliotheken eingesetzt werden.
Zusätzliche Verfahren von Interesse zur Isolierung von IGFBP-6-codierenden Nucleinsäuresequenzen beinhalten die Durchmusterung genetischer Bibliotheken auf die Expression von IGFBP-6 oder von Fragmenten davon, mit Hilfe von entweder polyclonalen oder monoclonalen IGFBP-6-spezifischen Antikörpern. Ein bevorzugtes Verfahren beinhaltet die Verwendung von degenerierten Primern, die auf partiellen Aminosäuresequenzen von gereinigtem IGFBP-6 basieren oder auf Sequenzen von bekannten verwandten Molekülen und der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), um die Gen-Segmente zwischen den Primern zu amplifizieren. Das Gen kann dann unter Verwendung einer spezifischen Hybridisierungssonde, die auf dem amplifizierten Gensegment basiert, isoliert werden, das dann auf die geeignete Expression von Protein analysiert wird. Eine detaillierte Beschreibung dieses Verfahrens ist in den Beispielen dargelegt, die folgen.
e. Sequenzierungs-Verfahren
Nucleotidsequenzen, die IGFBP-6 codieren, können anhand von rekombinanten DNA-Molekülen erhalten werden, die aus IGFBP-6-genetische Bibliothek-Isolaten gewonnen wurden. Die Nucleotidsequenz, die IGFBP-6 codiert, kann durch Sequenzierung der nicht Vektor-Nucleotidsequenzen dieser rekombinanten Moleküle erhalten werden. Die Nucleotidsequenz-Information kann erhalten werden, indem weitläufig verwendete DNA-Sequenzierungsprotokolle verwendet werden, wie Maxam und Gilbert-Sequenzierung, Didesoxynucleotid-Sequenzierung und ähnliche. Beispiele für geeignete Nucleotidsequenz-Protokolle können in Berger and Kimmel, Methods in Enzymology Vol. 52, Guide to Molecular Cloning Techniques, (1987) Academic Press, gefunden werden. Die Nucleotidsequenz-Information von einigen rekombinanten DNA-Isolaten, umfassend Isolate von sowohl cDNA als auch von genomischen Bibliotheken, können so kombiniert werden, dass die vollständige Aminosäure-codierende Sequenz von IGFBP-6, sowie die Nucleotidsequenzen von Introns innerhalb des IGFBP-6-Gens, stromaufwärts liegende Nucleotidsequenzen und stromabwärts liegende Nucleotidsequenzen, bereitgestellt werden.
Die Nucleotidsequenzen, die durch Sequenzierung von IGFBP-6-spezifischen genetischen Bibliothek-Isolaten erhalten wurden, werden einer Analyse unterzogen, um Bereiche von Interesse in dem IGFBP-6-Gen zu identifizieren. Diese Bereiche von Interesse beinhalten offene Leserahmen, Introns, Promotor-Sequenzen, Terminations-Sequenzen und ähnliches. Die Analyse von Nucleotidsequenz-Information wird vorzugsweise von einem Computer durchgeführt. Geeignete Software zur Analyse von Nucleotidsequenzen nach Regionen von Interesse ist kommerziell erhältlich und beinhaltet zum Beispiel DNASIS^TM (LKB). Es ist auch von Interesse die Aminosäuresequenz-Information zu verwenden, die anhand der Sequenzierung des N-terminalen Endes von gereinigtem IGFBP-6 erhalten wurde, wenn die IGFBP-6-Nucleotidsequenz-Information analysiert wird, um die Präzision der Nucleotidsequenz-Analyse zu verbessern.
f. Expressionssysteme
IGFBP-6 und Polypeptid-Derivate von IGFBP-6 können mit Hilfe von rekombinanten Verfahren exprimiert werden, wenn eine DNA-Sequenz, die das relevante Molekül codiert, funktionell in einen Vektor inseriert wird. Mit "funktionell inseriert" ist gemeint, in exaktem Leserahmen und exakter Orientierung, was von den Fachleuten gut verstanden wird. Wenn ein genetisches Konstrukt hergestellt wird, das einen vollständigen IGFBP-6-Leserahmen enthält, ist ein bevorzugtes Ausgangsmaterial ein cDNA-Bibliothek-Isolat, das IGFBP-6 codiert. Typischerweise wird das IGFBP-6-Gen stromabwärts von einem Promotor inseriert und wird von einem Stop-Codon nachgefolgt, obwohl, falls gewünscht, die Herstellung als ein Hybrid-Protein mit nachfolgender Spaltung verwendet werden kann. Im Allgemeinen werden Wirtszell-spezifische Sequenzen verwendet, die den Produktionsertrag von IGFBP-6 und IGFBP-6-Polypeptid-Derivaten verbessern und geeignete Kontroll-Sequenzen werden zu den Expressions-Vektoren hinzugefügt, wie Enhancer-Sequenzen, Polyadenylierungs-Sequenzen und Ribosomen-Bindungsstellen.
i. Säugersysteme
Sobald die geeignete codierende Sequenz isoliert worden ist, kann sie in einer Vielzahl unterschiedlicher Expressionssysteme exprimiert werden; zum Beispiel diejenigen, die mit Säugerzellen, Baculoviren, Bakterien und Hefe verwendet werden.
Säuger-Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt. Ein Säuger-Promotor ist jede beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Säuger-RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts (3')-Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. ein Strukturgen) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor hat eine Transkriptions-Initiations-Region, die gewöhnlich proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz lokalisiert ist, und eine TATA-Box, die gewöhnlich 25–30 Basenpaare (bp) stromaufwärts der Transkriptions-Initiationsstelle liegt. Man geht davon aus, dass die TATA-Box dazu da ist die RNA-Polymerase II anzuleiten die RNA-Synthese an der richtigen Stelle zu beginnen. Ein Säuger-Promotor enthält auch ein stromaufwärts gelegenes Promotor-Element, das typischerweise innerhalb eines Bereiches von 100–200 by stromaufwärts der TATA-Box gelegen ist. Ein stromaufwärts gelegenes Promotor-Element bestimmt die Rate, mit der die Transkription initiiert wird und kann in beide Richtungen wirken [Sambrook et al. (1989) "Expression of Cloned Genes in Mammalian Cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg.].
Virale Gene in Säugern werden häufig stark exprimiert und besitzen einen breiten Wirtsbereich; deshalb stellen Sequenzen, die virale Gene in Säugern codieren, besonders zweckmäßige Promotor-Sequenzen bereit. Beispiele beinhalten den frühen SV40 Promotor, den Maus-Mammatumor-Virus-LTR-Promotor, den hauptsächlichen späten Adenovirus-Promotor (Ad-MLP) und den Herpes simplex-Virus-Promotor. Zusätzlich stellen Sequenzen, die von nicht-viralen Genen stammen, wie das murine Metallothionein-Gen, ebenfalls zweckmäßige Promotorsequenzen bereit. Die Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) vorliegen, sie kann in Abhängigkeit vom Promotor in Hormon-responsiven Zellen mit Glucocorticoid induziert werden.
Die Anwesenheit eines Enhancer-Elements (Enhancer), kombiniert mit den vorstehend beschriebenen Promotor-Elementen, wird die Expressionsspiegel üblicherweise erhöhen. Ein Enhancer ist eine regulatorische DNA-Sequenz, die die Transkription bis zu 1.000-fach stimulieren kann, wenn sie an homologe oder heterologe Promotoren gekoppelt wird, wobei die Synthese an der normalen RNA-Startstelle beginnt. Enhancer sind auch aktiv, wenn sie stromabwärts oder stromaufwärts der Transkriptions-Initiationsstelle vorliegen, entweder in normaler oder umgedrehter Orientierung, oder in einem Abstand von mehr als 1.000 Nucleotiden vom Promotor entfernt [Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237; Alberts et al. (1989) Molecular Biology of the Cell, 2. Ausgabe]. Enhancer-Elemente, die von Viren abstammen, sind besonders zweckmäßig, da sie üblicherweise einen breiteren Wirtsbereich besitzen. Beispiele beinhalten den Enhancer des frühen SV40-Gens [Dijkema et al. (1985) EMBO J. 4: 761] und die Enhancer/Promotoren, die von der langen terminalen Wiederholungseinheit (long terminal repeat; LTR) des Rous Sarcoma Virus abstammen [Gorman et al. (1982b) Proc. Natl. Acad. Sci. 79: 6777] und vom menschlichen Cytomegalie-Virus [Boshart et al. (1985) Cell 41: 521]. Zusätzlich sind einige Enhancer regulierbar und werden nur in Anwesenheit eines induzierenden Stoffes, wie ein Hormon oder ein Metall-Ion, aktiv [Sassone-Corsi and Borelli (1986) Trends Genet. 2: 215; Maniatis et al. (1987) Science 236: 1237].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär in Säugerzellen exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül gekoppelt werden, wobei in diesem Fall die erste Aminosäure am N-terminalen Ende des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, das durch das ATG-Startcodon codiert wird. Falls gewünscht kann das N-terminale Ende durch in vitro-Inkubation mit Cyan-Bromid von dem Protein abgespalten werden.
In einer alternativen Ausführungsform können die fremden Proteine auch von der Zelle in das Wachstumsmedium sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das von einem Leadersequenz (Leitsequenz)-Fragment umfasst wird, das die Sekretion des fremden Proteins in Säugerzellen bereitstellt. Vorzugsweise gibt es Prozessierungsstellen, die zwischen dem Leadersequenz-Fragment und dem fremden Gen codiert werden, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenz-Fragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das von hydrophoben Aminosäuren umfasst wird, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle dirigieren. Die dreigeteilte Adenovirus-Leadersequenz ist ein Beispiel für eine Leadersequenz, die die Sekretion eines fremden Proteins in Säugerzellen bereitstellt.
Üblicherweise sind Transkriptions-Terminations- und Polyadenylierungs-Sequenzen, die von Säugerzellen erkannt werden, regulatorische Regionen, die bezüglich des Translations-Stop-Codons in 3'-Richtung lokalisiert sind und flankieren somit zusammen mit den Promotor-Elementen die codierende Sequenz. Das 3'-terminale Ende der reifen mRNA wird durch ortsspezifische posttranskriptionelle Spaltung und Polyadenylierung gebildet [Birnstiel et al. (1985) Cell 41: 349; Proudfoot and Whitelaw (1988) "Termination and 3' end processing of eukaryotic RNA. In Transcription and splicing (Hrsg. B. D. Hames and D. M. Glover); Proudfoot (1989) Trends Biochem. Sci. 14: 105]. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid translatiert werden kann, das durch die DNA codiert wird. Beispiele für Transkriptions-Terminations/Polyadenylierungs-Signale beinhalten diejenigen, die von SV40 abstammen [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in cultured mammalian cells." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Einige Gene können effizienter exprimiert werden, wenn Introns (auch zwischengeschaltete Sequenzen genannt) vorliegen. Einige cDNAs wurden jedoch effizient anhand von Vektoren exprimiert, denen Spleiss-Signale (auch Spleiss-Spender- und Spleiss-Empfänger-Stellen genannt) fehlen [siehe zum Beispiel, Gething and Sambrook (1981) Nature 293: 620]. Introns sind zwischengeschaltete nicht-codierende Sequenzen innerhalb einer codierenden Sequenz, die Spleiss-Spender- und -Empfänger-Stellen enthalten. Sie werden durch ein Verfahren entfernt, das "Spleissen" genannt wird, gefolgt von der Polyadenylierung des primären Transkripts [Nevins (1983) Annu. Rev. Biochem. 52: 441; Green (1986) Annu. Rev. Genet. 20: 671; Padgett et al. (1986) Annu. Rev. Biochem. 55: 1119; Krainer and Maniatis (1988) "RNA splicing." In Transcription and splicing (Hrsg. B. D. Hames and D. M. Glover)].
Üblicherweise werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, ein Polyadenylierungs-Signal und eine Transkriptions-Terminations-Sequenz umfassen, in einem Expressionskonstrukt zusammengesetzt. Falls gewünscht, können auch Enhancer, Introns mit funktionellen Spleiss-Spender- und Empfänger-Stellen und Leadersequenzen in einem Expressionskonstrukt enthalten sein. Expressionskonstrukte werden häufig in Form eines Replikon erhalten, wie ein extrachromosomales Element (z. B. Plasmide), das zu einer stabilen Erhaltung in einem Wirt wie Säugerzellen oder Bakterien, in der Lage ist.
Säuger-Replikationssysteme beinhalten diejenigen, die von tierischen Viren abstammen, die trans-aktivierende Faktoren benötigen, um zu replizieren. Plasmide, die zum Beispiel die Replikationssysteme von Papovaviren wie SV40 [Gluzman (1981) Cell 23: 175] oder Polyomavirus enthalten, replizieren in Anwesenheit des geeigneten viralen T-Antigens zu einer extrem hohen Kopienzahl. Weitere Beispiele für Säuger-Replikons beinhalten diejenigen, die von Rinder-Papillomvirus und Epstein-Barr-Virus abstammen. Zusätzlich kann das Replikon zwei Replikationssysteme besitzen, womit zum Beispiel gewährleistet wird, dass es in Säugerzellen zur Expression und in einem prokaryontischen Wirt für die Clonierung und Amplifikation erhalten werden kann. Beispiele für solche Säuger-Bakterien-Pendel (Shuttle)-Vektoren beinhalten pMT2 [Kaufman et al. (1989) Mol. Cell. Biol. 9: 946] und pHEBO [Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 1074].
Das verwendete Transformations-Verfahren hängt von dem zu transformierenden Wirt ab. Verfahren zum Einbringen von heterologen Polynucleotiden in Säugerzellen sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Präzipitation, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Verkapselung von (einem) Polynucleotid(en) in Liposomen und direkte Mikroinjektion von DNA in Kerne.
Säuger-Zelllinien, die als Wirte zur Expression erhältlich sind, sind im Stand der Technik bekannt und beinhalten zahlreiche immortalisierte Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATTC) erhältlich sind, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Ovar-Zellen des chinesischen Hamsters (chinese hamster ovary; CHO), HeLa-Zellen, Baby-Hamsternieren (baby hamster kidney; BHK)-Zellen, Affen-Nierenzellen (COS), menschliche hepatozeluläre Carcinomzellen (z.B. HepG2) und eine Vielzahl anderer Zelllinien.
ii. Baculovirus-Systeme
Das Polynucleotid, das IGFBP-6 codiert, kann auch in einen geeigneten Insekten-Expressions-Vektor inseriert werden und wird mit den Kontrollelementen innerhalb dieses Vektors funktionell verknüpft. Die Vektorkonstruktion verwendet Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind.
Im Allgemeinen beinhalten die Bestandteile des Expressionssystems einen Transfer-Vektor, gewöhnlich ein bakterielles Plasmid, das sowohl ein Fragment des Baculovirus-Genoms enthält, wie auch eine geeignete Restriktionsschnittstelle für die Inserierung des heterologen Gens oder der heterologen Gene, das/die exprimiert werden soll(en); ein Wildtyp-Baculovirus mit einer Sequenz, die zu dem Baculovirus-spezifischen Fragment in dem Transfer-Vektor homolog ist (dies erlaubt die homologe Rekombination des heterologen Gens in das Baculovirus-Genom); und geeignete Insekten-Wirtszellen und Wachstumsmedien.
Nach Inserierung der IGFBP-6 DNA-Sequenz in den Transfer-Vektor werden der Vektor und das Wildtyp-virale Genom in eine Insekten-Wirtszelle transfiziert, wobei dem Vektor und dem viralen Genom erlaubt wird zu rekombinieren. Das verpackte rekombinante Virus wird exprimiert und rekombinante Plaques werden identifiziert und aufgereinigt. Materialien und Verfahren für Baculovirus/Insektenzell-Expressionssysteme sind kommerziell in Kit-Form erhältlich von, unter anderem, Invitrogen, San Diego CA ("MaxBac"-Kit). Diese Verfahren sind den Fachleuten im Allgemeinen bekannt und in Summers and Smith, Texas Agricultural Experiment Station Bulletin Nr. 1555 (1987) (hierin nachfolgend "Summer and Smith" genannt) vollständig beschrieben.
Vor der Inserierung der IGFBP-6 DNA-Sequenz in das Baculovirus-Genom werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Leadersequenz (falls gewünscht), die codierende Sequenz von Interesse und die Transkriptions-Terminations-Sequenz umfassen, üblicherweise zu einem intermediären Trans-Austausch-Konstrukt (Transfer-Vektor) zusammengesetzt. Dieses Konstrukt kann ein einzelnes Gen und funktionell verknüpfte regulatorische Elemente enthalten; zahlreiche Gene, jedes mit seinem eigenen Satz funktionell gekoppelter regulatorischer Elemente; oder zahlreiche Gene, die von dem gleichen Satz regulatorischer Elemente reguliert werden. Intermediäre Trans-Austausch-Konstrukte sind oft in einem Replikon, wie einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide) enthalten, die zu einer stabilen Erhaltung in einem Wirt, wie ein Bakterium, in der Lage sind. Das Replikon hat ein Replikationssystem, das es ihm erlaubt, zur Clonierung und Amplifikation in einem geeigneten Wirt erhalten zu werden.
Gegenwärtig ist der am häufigsten verwendete Transfer-Vektor zum Einbringen fremder Gene in AcNPV pAc373. Zahlreiche andere Vektoren, die dem Fachmann bekannt sind, sind ebenfalls entworfen worden. Diese beinhalten zum Beispiel pVL985 (das das Polyhedrin-Startcodon von ATG nach ATT verändert und das eine Bam HI-Clonierungsstelle 32 Basenpaare stromabwärts des ATT erzeugt; siehe Luckow and Summers, Virology (1989) 17: 31.
Das Plasmid enthält gewöhnlich auch das Polyhedrin-Polyadenylierungs-Signal (Miller et al. (1988) Ann. Rev. Microbiol., 42: 177) und ein prokaryontisches Ampicillin-Resistenz (Amp)-Gen und den Replikationsursprung zur Selektion und Vermehrung in E. coli.
Baculovirus-Transfer-Vektoren enthalten gewöhnlich einen Baculovirus-Promotor. Ein Baculovirus-Promotor ist jede beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, eine Baculovirus-RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts (5' nach 3')-Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. eines strukturellen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor hat eine Transkriptions-Initiations-Region, die gewöhnlich proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz vorliegt. Diese Transkriptions-Initiations-Region beinhaltet gewöhnlich eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiations-Stelle. Ein Baculovirus-Transfer-Vektor kann auch eine zweite Domäne besitzen, die ein Enhancer genannt wird, der, falls vorliegend, gewöhnlich distal zu dem strukturellen Gen liegt. Die Expression kann entweder reguliert oder konstitutiv sein.
Strukturelle Gene, die zu einem späten Zeitpunkt in einem viralen Infektionszyklus reichlich transkribiert werden, stellen besonders zweckmäßige Promotor-Sequenzen bereit. Beispiele beinhalten Sequenzen, die von dem Gen abstammen, das das virale Polyhedron-Protein codiert, Friesen et al., (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression," in: The Molecular Biology of Baculoviruses (Hrsg. Walter Doerfler); E. P. O. Veröffentlichung Nrn. 127.839 und 155.476; und von dem Gen, das das p10-Protein codiert, Vlak et al., (1988), J. Gen. Virol. 69: 765.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sekretierte Insekten- oder Baculovirus-Proteine, wie das Baculovirus-Polyhedrin-Gen (Carbonell et al. (1988) Gene, 73: 409), abstammen. In einer alternativen Ausführungsform können Leadersequenzen von nicht Insekten-Ursprung, wie diejenigen, die von Genen abstammen, die menschliches α-Interferon codieren, Maeda et al., (1985), Nature 315: 592; menschliches Gastrin-freisetzendes Peptid (gastrin releasing peptide), Lebarcq-Verheyden et al., (1988), Molec. Cell. Biol. 8: 3129; menschliches IL-2, Smith et al., (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 8404; IL-3 der Maus, (Miyajima et al., (1987) Gene 58: 273; und menschliche Glucocerebrosidase, Martin et al., (1988) DNA, 7: 99, können ebenfalls verwendet, werden, um die Sekretion in Insekten bereitzustellen, da die Signale für Säugerzell-posttranslationale Modifikationen (wie Signalpeptid-Spaltung, proteolytische Spaltung und Phosphorylierung) offensichtlich von Insektenzellen ebenfalls erkannt werden und die Signale, die für die Sekretion und nucleäre Akkumulation erforderlich sind, scheinbar ebenfalls zwischen den Invertebraten-Zellen und Vertebraten-Zellen konserviert sind.
Ein rekombinantes Polypeptid oder Polyprotein kann intrazellulär exprimiert werden oder, falls es mit den geeigneten regulatorischen Sequenzen exprimiert wird, kann es sekretiert werden. Eine gute intrazelluläre Expression von nicht-fusionierten fremden Proteinen erfordert gewöhnliche heterologe Gene, die idealerweise eine kurze Leadersequenz besitzen, die geeignete Transkriptions-Initiations-Signale enthält, die einem ATG-Startsignal vorangehen. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-terminalen Ende durch in vitro-Inkubation mit Cyan-Bromid von dem reifen Protein abgespaltet werden.
In einer Alternative können rekombinante Polyproteine oder Proteine, die nicht natürlicherweise sekretiert werden, durch Erzeugung chimärer DNA-Moleküle, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem Leadersequenz-Fragment umfasst wird, das die Sekretion des fremden Proteins in Insekten bereitstellt, aus der Insektenzelle sekretiert werden. Das Leadersequenz-Fragment codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren besteht, die die Translokation des Proteins in das endoplasmatische Retikulum veranlassen.
Nach Inserierung der IGFBP-6-DNA-Sequenz und/oder des Gens, das den Vorläufer des Expressionsprodukts codiert, wird ein Insektenzell-Wirt mit der heterologen DNA des Transfer-Vektors und der genomischen DNA des Wildtyp-Baculovirus – gewöhnlich durch Co-Transfektion – co-transformiert. Der Promotor und die Transkriptions-Terminations-Sequenz des Konstrukts umfassen gewöhnlich einen Bereich von 2–5 kb des Baculovirus-Genoms. Verfahren zum Einbringen heterologer DNA an die gewünschte Stelle in dem Baculovirus sind im Stand der Technik bekannt (siehe Summers and Smith vorstehend; Ju et al. (1987); Smith et al., Mol. Cell. Biol. (1983) 3: 2156; und Luckow and Summers (1989)). Die Inserierung kann zum Beispiel in ein Gen, wie das Polyhedrin-Gen, durch homologe doppelt crossing over-Rekombination (doppelte Chiasmabildungs-Rekombination) erfolgen; die Inserierung kann auch in eine Restriktions-Enzym-Schnittstelle erfolgen, die gentechnisch in das gewünschte Baculovirus-Gen eingebracht wurde. Miller et al., (1989), Bioessays 4: 91. Die DNA-Sequenz wird, wenn sie anstelle des Polyhedrin-Gens in den Expressionsvektor cloniert wird, sowohl 5' als auch 3' von Polyhedrin-spezifischen Sequenzen flankiert und liegt stromabwärts des Polyhedrin-Promotors vor.
Der neu erzeugte Baculovirus-Expressionsvektor wird nachfolgend in einen infektiösen rekombinanten Baculovirus verpackt. Die homologe Rekombination tritt mit niedriger Häufigkeit (zwischen etwa 1% und etwa 5%) auf; somit ist die Mehrheit des nach Co-Transfektion produzierten Virus noch immer Wildtyp-Virus. Deshalb ist ein Verfahren erforderlich, um rekombinante Viren zu identifizieren. Das Schöne an dem Expressionssystem ist die Möglichkeit einer visuellen Durchmusterung, die es erlaubt rekombinante Viren zu unterscheiden. Das Polyhedrin-Protein, das von dem nativen Virus produziert wird, wird in sehr niedrigen Mengen im Zellkern von infizierten Zellen zu später Zeit nach viraler Infektion hergestellt. Angereicherte Polyhedrin-Proteine bilden Einschlusskörper, die auch eingeschlossene Teilchen enthalten. Diese Einschlusskörper von bis zu 15 μm Größe sind hochgradig lichtbrechend, was ihnen eine hell leuchtende Erscheinung verleiht, die unter dem Lichtmikroskop leicht ersichtlich ist. Zellen, die mit rekombinanten Viren infiziert sind, besitzen keine Einschlusskörper. Um rekombinante Viren von Wildtyp-Viren zu unterscheiden, wird der Überstand der Transfektion anhand von Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind, auf einen Monolayer von Insektenzellen verteilt. Und zwar werden die Plaques unter dem Lichtmikroskop auf die Anwesenheit (indikativ für Wildtyp-Virus) oder Abwesenheit (indikativ für rekombinantes Virus) von Einschlusskörpern durchmustert. "Current Protocols in Microbiology" Vol. 2 (Ausubel et al. Hrsg.) in 16.8 (Supp. 10, 1990); Summers and Smith, vorstehend; Miller et al. (1989).
Rekombinante Baculovirus-Expressions-Vektoren zur Infektion von verschiedenen Insektenzellen sind entwickelt worden. Rekombinante Baculoviren sind zum Beispiel entwickelt worden für, unter anderem: Aedes aegypti, Autographa californica, Bombyx mori, Drosophila melanogaster, Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni (P. C. Z. Veröffentlichung Nr. WO 89/046699; Carbonell et al., (1985) J. Virol. 56: 153; Wright (1986) Nature 321: 718; Smith et al., (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 2156; und siehe im Allgemeinen, Fraser, et al. (1989) In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).
Zellen und Zellkultur-Medien für sowohl die direkte als auch die Fusions-Expression von heterologen Polypeptiden in einem Baculovirus/Expressions-System sind kommerziell erhältlich; Die Zellkultur-Technologie ist den Fachleuten im Allgemeinen bekannt. Siehe z. B. Sommers and Smith, vorstehend.
Die modifizierten Insektenzellen können dann in einem geeigneten Nährmedium gezüchtet werden, das die stabile Erhaltung des (der) Plasmid(e) gewährleistet, die in dem modifizierten Insektenwirt vorliegt (vorliegen). Dort wo das Expressionsprodukt-Gen unter induzierbarer Kontrolle vorliegt, kann der Wirt zu hoher Dichte gezüchtet und die Expression induziert werden. In einer alternativen Ausführungsform, bei der die Expression konstitutiv erfolgt, wird das Produkt kontinuierlich in das Medium exprimiert und das Nährmedium muss fortlaufend zirkuliert werden, wobei das interessierende Produkt entfernt und aufgebrauchte Nährstoffe angereichert werden. Das Produkt kann durch solche Verfahren wie Chromatographie, z. B. HPLC, Affinitäts-Chromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie etc.; Elektrophorese; Dichtegradienten-Zentrifugation; Lösungsmittel-Extraktion oder ähnliche, aufgereinigt werden, falls erforderlich, um im Wesentlichen alle Insektenproteine zu entfernen, die ebenfalls in das Medium sekretiert werden oder aus der Lyse von Insektenzellen resultieren, um ein Produkt bereitzustellen, das im Wesentlichen zumindest frei ist von Zelltrümmern des Wirts, z. B. Proteinen, Lipiden und Polysacchariden.
Um IGFBP-6-Expression zu erhalten, werden rekombinante Wirtszellen, die von den Transformanten abstammen, unter Bedingungen inkuziert, die die Expression der das rekombinante IGFBP-6 codierenden Sequenz erlauben. Diese Bedingungen variieren in Abhängigkeit von der ausgewählten Wirtszelle. Die Bedingungen sind jedoch für die Fachleute auf der Grundlage dessen, was im Stand der Technik bekannt ist, leicht bestimmbar.
iii. Bakterielle Systeme
Bakterielle Expressions-Verfahren sind im Stand der Technik bekannt. Ein bakterieller Promotor ist jede beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts (3')-Transkription einer codierenden Sequenz (z.B. eines strukturellen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor besitzt eine Transkriptions-Initiations-Region, die gewöhnlich proximal von dem 5'-Ende der codierenden Sequenz vorliegt. Diese Transkriptions-Initiations-Region beinhaltet gewöhnlich eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle und eine Transkriptions-Initiations-Stelle. Ein bakterieller Promotor kann auch eine zweite Domäne enthalten, die ein Operator genannt wird, der mit einer benachbarten RNA-Polymerase-Bindungsstelle überlappen kann, an der die RNA-Synthese beginnt. Der Operator erlaubt die negativ regulierte (induzierbare) Transkription sobald ein Gen-Repressor-Protein den Operator binden kann und dabei die Transkription eines spezifischen Gens hemmt. Die konstitutive Expression kann in Abwesenheit von negativen regulatorischen Elementen, wie dem Operator, auftreten. Zusätzlich kann die positive Regulation durch eine Gen-Aktivatorprotein-Bindungssequenz erhalten werden, die, falls vorliegend, gewöhnlich proximal (5') der RNA-Polymerase-Bindungssequenz vorliegt. Ein Beispiel für ein Gen-Aktivator-Protein ist das Catabolit-Aktivator-Protein (CAP), das bei der Initiation der Transkription des lac-Operons in Escherichia coli (E. coli) hilft [Raibaud et al. (1984) Annu. Rev. Genet. 18: 173]. Die regulierte Expression kann deshalb entweder positiv oder negativ sein, wobei die Transkription entweder verstärkt oder reduziert wird.
Sequenzen, die Enzyme für metabolische Signalwege codieren, stellen besonders zweckmäßige Promotor-Sequenzen bereit. Beispiele beinhalten Promotor-Sequenzen, die von Zucker-metabolisierenden Enzymen abstammen, wie Galactose, Lactose (lac) [Chang et al. (1977) Nature 198: 1056] und Maltose. Zusätzliche Beispiele beinhalten Promotor-Sequenzen, die von biosynthetischen Enzymen, wie Tryptophan (trp) abstammen [Goeddel et al. (1980) Nuc. Acids Res. 8: 4057; Yelverton et al. (1981) Nuc. Acids Res. 9: 731; U. S. Patent Nr. 4,738,921; EPO Veröffentlichungen Nrn. 036 776 und 121 775]. Das g-Laotamase (bla) Promotor-System [Weissmann (1981) "The cloning of interferon and other mistakes." In Interferon 3 (Hrsg. I. Gresser)], die Bakteriophagen Lambda PL [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128] und T5 [U. S. Patent Nr. 4,689,406] Promotor-Systeme stellen ebenfalls zweckmäßige Promotor-Sequenzen bereit.
Zusätzlich fungieren synthetische Promotoren, die natürlicherweise nicht auftreten, ebenfalls als bakterielle Promotoren. Transkriptions-Aktivierungs-Sequenzen eines bakteriellen oder eines Bakteriophagen-Promotors können mit den Operon-Sequenzen eines anderen bakteriellen oder Bakteriophagen-Promotors verknüpft werden, wobei ein synthetischer Hybrid-Promotor erzeugt wird [U. S. Patent Nr. 4,551,433]. Der tac-Promotor zum Beispiel ist ein Hybrid trp-lac-Promotor, der sowohl aus trp-Promotor- als auch lac-Operon-Sequenzen, die durch den lac-Repressor reguliert werden, zusammengesetzt ist [Amann et al. (1983) Gene 25: 167; de Boer et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 80: 21]. Darüber hinaus kann ein bakterieller Promotor natürlich vorkommende Promotoren nicht bakteriellen Ursprungs beinhalten, die die Fähigkeit haben, bakterielle RNA-Polymerase zu binden und Transkription zu initiieren. Ein natürlich vorkommender Promotor von nicht bakteriellem Ursprung kann auch mit einer passenden RNA-Polymerase verknüpft sein, um große Mengen an Expression von einigen Genen in Prokaryonten zu produzieren. Das Bakteriophage T7-RNA-Polymerase/Promotor-System ist ein Beispiel eines gekoppelten Promotor-Systems [Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; Tabor et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1074]. Zusätzlich kann ein Hybrid-Promotor auch aus einem Bakteriophagen-Promotor und einer E. coli-Operator-Region zusammengesetzt sein (EPO Veröffentlichung Nr. 267 851).
Zusätzlich zu einer funktionellen Promotor-Sequenz ist eine wirkungsvolle Ribosomen-Bindungsstelle ebenfalls zweckmäßig für die Expression fremder Gene in Prokaryonten. In E. coli wird die Ribosomen-Bindungsstelle die Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz genannt und beinhaltet ein Initiations-Codon (ATG) und eine Sequenz von 3–9 Nucleotiden Länge, die 3–11 Nucleotide stromaufwärts von dem Initiations-Codon vorliegt [Shine et al. (1975) Nature 254: 34]. Man geht davon aus, dass die SD-Sequenz die Bindung von mRNA an das Ribosom durch die Paarung von Basen zwischen der SD-Sequenz und dem 3'-Ende der E. coli 16S rRNA verstärkt [Steitz et al. (1979) "Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA." In Biological Regulation and Development: Gene Expression (Hrsg. R. F. Goldberger], um eukaryontische Gene und prokaryontische Gene mit schwacher Ribosomen-Bindungsstelle zu exprimieren [Sambrook et al. (1989) "Expression of cloned genes in Escherichia coli." In Molecular Cloning: A Laboratory Manual].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül gekoppelt sein, wobei die erste Aminosäure am N-terminalen Ende jeweils ein Methionin ist, das durch das ATG-Start-Codon codiert wird. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-terminalen Ende durch in vitro-Inkubation mit Cyan-Bromid oder durch Inkubation mit einer bakteriellen Methionin-N-terminalen Peptidase, entweder in vivo oder in vitro, von dem Protein abgespalten werden (EPO Veröffentlichung Nr. 219 237).
Fusionsproteine stellen eine alternative Ausführungsform zur direkten Expression dar. Gewöhnlich wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Bereich eines endogenen bakteriellen Proteins codiert oder ein anderes stabiles Protein, mit dem 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Nach der Expression stellt dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen bereit. Das Bakteriophage Lambda-Zellgen kann zum Beispiel an das 5'-Ende eines fremden Gens gekoppelt werden und in Bakterien exprimiert werden. Das resultierende Fusionsprotein behält vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym (Faktor Xa), um das Bakteriophagen-Protein von dem fremden Gen abzuspalten [Nagai et al. (1984) Nature 309: 810]. Fusionsproteine können auch mit Sequenzen aus lacZ-Genen hergestellt werden [Jia et al. (1987) Gene 60: 197], trpE [Allen et al. (1987) J. Biotechnol. 5: 93; Makoff et al. (1989) J. Gen. Microbiol. 135: 11], und Chey [EPO Veröffentlichung Nr. 324.647]. Die DNA-Sequenz an der Verknüpfung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region hergestellt, die vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym behält (z. B. eine Ubiquitin-spezifische prozessierende Protease), um das Ubiquitin von dem fremden Protein abzuspalten. Mit diesem Verfahren kann ein natives fremdes Protein isoliert werden [Miller et al. (1989) Bio/Technology 7: 698].
In einer Alternative können fremde Proteine auch aus der Zelle sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem Signalpeptid-Sequenz-Fragment zusammengesetzt ist, das die Sekretion des fremden Proteins in Bakterien bereitstellt (U.S. Patent Nr. 4,336,336). Das Signalsequenz-Fragment codiert gewöhnlich ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetzt ist, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle veranlassen. Das Protein wird entweder in das Wachstumsmedium sekretiert (Gram-positive Bakterien) oder in den periplasmatischen Raum, der zwischen der inneren und äußeren Membran der Zelle vorliegt (Gram-negative Bakterien). Vorzugsweise gibt es Prozessierungsstellen, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können, die zwischen dem Signalpeptid-Fragment und dem fremden Gen codiert vorliegen.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sekretierte bakterielle Proteine abstammen, wie das E. coli äußere Membran-Protein-Gen (ompA) [Masui et al. (1983), in: Experimental Manipulation of Gene Expression; Ghrayeb et al. (1984) EMBO J. 3: 2437] und die E. coli alkalische Phosphatase-Signalsequenz (phoA) [Oka et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7212]. Als ein zusätzliches Beispiel kann die Signalsequenz des Alpha-Amylase-Gens aus verschiedenen Bacillus-Stämmen verwendet werden, um heterologe Proteine aus B. subtilis zu sekretieren [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Veröffentlichung Nr. 244 042].
Gewöhnlich sind Transkriptions-Terminierungs-Sequenzen, die von Bakterien erkannt werden, regulatorische Regionen, die 3' von dem Translations-Stop-Codon vorliegen und somit zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen veranlassen die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid translatiert werden kann, das durch die DNA codiert wird. Transkriptions-Terminations-Sequenzen beinhalten häufig DNA-Sequenzen von etwa 50 Nucleotiden, die in der Lage sind, Stamm-Loop-Strukturen auszubilden, die bei der Terminierung der Transkription helfen. Beispiele beinhalten Transkriptions-Terminations-Sequenzen, die von Genen mit starken Promotoren abstammen, wie das trp-Gen in E. coli sowie andere Gene der Biosynthese.
Gewöhnlich werden die vorstehend beschriebenen Komponenten, die einen Promotor, eine Signal-Sequenz (falls gewünscht), die codierende Sequenz von Interesse und die Transkriptions-Terminations-Sequenz umfassen, in einem Expressionskonstrukt zusammengefasst. Expressionskonstrukte werden häufig in einem Replikon erhalten, wie als ein extrachromosomales Element (z. B. Plasmide), das zu einer stabilen Erhaltung in einem Wirt, wie Bakterien, in der Lage ist. Das Replikon hat ein Replikationssystem, das ihm erlaubt, in einem prokaryontischen Wirt entweder zur Expression oder zur Clonierung und Amplifikation erhalten zu werden. Zusätzlich kann ein Replikon entweder ein Plasmid von hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid von hoher Kopienzahl besitzt gewöhnlich eine Kopienzahl, die in einem Bereich von etwa 5 bis etwa 200 liegt und gewöhnlich von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid von hoher Kopienzahl enthält, enthält vorzugsweise mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20 Plasmide. Es kann, in Abhängigkeit von der Wirkung des Vektors und des fremden Proteins auf den Wirt, entweder ein Vektor von hoher oder niedriger Kopienzahl ausgewählt werden.
In einer Alternative können die Expressionskonstrukte mit Hilfe eines Integrations-Vektors in das bakterielle Genom integriert werden. Integrations-Vektoren enthalten gewöhnlich mindestens eine Sequenz, die zu dem bakteriellen Chromosom homolog ist und die dem Vektor die Integration erlaubt. Es scheint, dass Integrationen aus Rekombinationen zwischen homologer DNA des Vektors und dem bakteriellen Chromosom auftreten. Integrations-Vektoren, die zum Beispiel mit DNA aus verschiedenen Bacillus-Stämmen konstruiert wurden, integrieren in das Bacillus-Chromosom (EPO Veröffentlichung Nr. 127 328). Integrations-Vektoren können auch aus Bakteriophagen- oder Transposon-Sequenzen zusammengesetzt sein.
Gewöhnlich können extra-chromosomale und Integrations-Expressionskonstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion von bakteriellen Stämmen zu erlauben, die transformiert worden sind. Selektierbare Marker können in dem bakteriellen Wirt exprimiert werden und können Gene beinhalten, die Bakterien resistent machen gegenüber Arzneimitteln, wie Ampicillin, Chloramphenicol, Erythromycin, Kanamycin (Neomycin) und Tetracyclin [Davies et al. (1987) Annu. Rev. Microbiol. 34: 469]. Selektierbare Marker können auch Gene der Biosynthese beinhalten, sowie diejenigen der Histidin-, Tryptophan- und Leucin-Biosynthese-Signalwege.
In einer Alternative können einige der vorstehend beschriebenen Bestandteile in Transformations-Vektoren zusammengefasst sein. Transformations-Vektoren sind gewöhnlich aus einem selektierbaren Marker zusammengesetzt, der entweder in einem Replikon erhalten wird, oder, wie vorstehend beschrieben, in einem Integrations-Vektor entwickelt wurde.
Expressions- und Transformations-Vektoren, entweder extra-chromosomale Replikons oder Integrations-Vektoren, sind für die Transformation in viele Bakterien entwickelt worden. Es sind zum Beispiel Expressions-Vektoren entwickelt worden für, unter anderem, die folgenden Bakterien: Bacillus subtilis [Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Veröffentlichungen Nrn. 036 259 und 063 953; PCT WO 84/04541], Escherichia coli [Shimatake et al. (1981) Nature 292: 128; Amann et al. (1985) Gene 49: 183; Studier et al. (1986) J. Mol. Biol. 189: 113; EPO Veröffentlichungen Nrn. 036.776, 136.829 und 136.907], Strepococcus cremoris [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655]; Streptococcus lividans [Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655], Streptomyces lividans [U. S. Patent Nr. 4,745,056].
Verfahren zum Einbringen exogener DNA in bakterielle Wirte sind im Stand der Technik gut bekannt und beinhalten gewöhnlich entweder die Transformation von Bakterien, die mit CaCl₂ oder anderen Stoffen, wie bivalente Kationen und DMSO, behandelt wurden. DNA kann auch durch Elektroporation in bakterielle Zellen eingebracht werden. Transformations-Verfahren variieren gewöhnlich mit den zu transformierenden bakteriellen Arten. Siehe z. B. [Masson et al. (1989) FEMS Microbiol. Lett. 60: 273; Palva et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 5582; EPO Veröffentlichungen Nrn. 036 259 und 063 953; PCT WO 84/04541, Bacillus], [Miller et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 856; Wang et al. (1990) J. Bacteriol. 172: 949, Campylobacter], [Cohen et al. (1973) Proc. Natl. Acad. Sci. 69: 2110; Dower et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 6127; Kushner (1978) "An improved method for transformation of Escherichia coli with ColE1-derived plasmids. In Genetic Engineering: Proceedings of the International Symposium on Genetic Engineering (Hrsg. H. W. Boyer and S. Nicosia); Mandel et al. (1970) J. Mol. Biol. 53: 159; Taketo (1988) Biochem. Biophys. Acta 949: 318; Escherichia], [Chassy et al. (1987) FEMS Microbiol. Lett. 44: 173 Lactobacillus]; [Fiedler et al. (1988) Anal. Biochem. 170: 38, Pseudomonas]; [Augustin et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 66: 203, Staphylococcus], [Barny et al. (1980) J. Bacteriol. 144: 698; Harlander (1987) "Transformation of Streptococcus lactis by electroporation, in: Streptococcal Genetics (Hrsg. J. Ferretti and R. Curtiss III); Perry et al. (1981) Infec. Immun. 32: 1295; Powell et al. (1988) Appl. Environ. Microbiol. 54: 655; Somkuti et al. (1987) Proc. 4th Evr. Cong. Biotechnology 1: 412, Streptococcus].
iv. Hefe-Expression
Hefe-Expressions-Systeme sind ebenfalls einem Durchschnittsfachmann bekannt. Ein Hefe-Promotor ist jede beliebige DNA-Sequenz, die in der Lage ist, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und die stromabwärts (3')-Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. eines strukturellen Gens) in mRNA zu initiieren. Ein Promotor wird eine Transkriptions-Initiations-Region besitzen, die gewöhnlich proximal zu dem 5'-Ende der codierenden Sequenz vorliegt. Diese Transkriptions-Initiations-Region beinhaltet gewöhnlich eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle (die "TATA-Box") und eine Transkriptions-Initiationsstelle. Ein Hefe-Promuotor kann auch eine zweite Domäne besitzen, die eine Stromaufwärts-Aktivator-Sequenz (UAS) genannt wird, die, falls vorliegend, gewöhnlich distal des strukturellen Gens vorliegt. Die UAS erlaubt die regulierte (induzierbare) Expression. Konstitutive Expression tritt in Abwesenheit einer UAS auf. Die regulierte Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wobei die Transkription entweder verstärkt oder reduziert wird.
Hefe ist ein fermentierender Organismus mit einem aktiven metabolischen Signalweg, deshalb stellen Sequenzen, die Enzyme in dem metabolischen Signalweg codieren, besonders zweckmäßige Promotor-Sequenzen bereit. Beispiele beinhalten Alkoholdehydrogenase (ADH) (EPO-Veröffentlichung Nr. 284 044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-Phosphat-Isomerase, Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglycerat-Mutase und Pyruvat-Kinase (PyK) (EPO-Veröffentlichung Nr. 329 203). Das Hefe-PHO5-Gen, das saure Phosphatase codiert, stellt ebenfalls zweckmäßige Promotor-Sequenzen bereit [Myanohara et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 1].
Zusätzlich wirken synthetische Promotoren, die natürlicherweise nicht vorkommen, ebenso als Hefe-Promotoren. UAS-Sequenzen eines Hefe-Promotors können zum Beispiel mit der Transkriptions-Aktivierungs-Region eines anderen Hefe-Promotors verknüpft werden, wobei ein synthetischer Hybrid-Promotor erzeugt wird. Beispiele solcher Hybrid-Promotoren beinhalten die ADH-regulatorische Sequenz, gekoppelt an die GAP-Transkriptions-Aktivierungs-Region (U. S. Patent Nrn. 4,876,197 und 4,880,73). Andere Beispiele für Hybrid-Promotoren beinhalten Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen von entweder den ADH2-, GAL4-, GAL10- oder PH05-Genen bestehen, kombiniert mit der Transkriptions-Aktivierungs-Region eines glycolytischen Enzym-Gens, wie GAP oder PyK (EPO-Veröffentlichung Nr. 164 556). Darüber hinaus kann ein Hefe-Promotor natürlich vorkommende Promotoren von nicht Hefe-Ursprung beinhalten, die die Fähigkeit besitzen, Hefe-RNA-Polymerase zu binden und Transkription zu initiieren. Beispiele für solche Promotoren beinhalten, unter anderem, [Cohen et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 1078; Henikoff et al. (1981) Nature 283: 835; Hollenberg et al. (1979) "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae," in: Plasmids of Medical, Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K>N> Timmis and A. Puhler); Mercerau-Puigalon et al. (1980) Gene 11: 163; Panthier et al. (1980) Curr. Genet. 2: 109].
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär in Hefe exprimiert werden. Eine Promotor-Sequenz kann direkt mit dem DNA-Molekül gekoppelt sein, wobei die erste Aminosäure des N-terminalen Endes des rekombinanten Proteins immer ein Methionin sein wird, das durch das ATG-Start-Codon codiert wird. Falls gewünscht, kann das Methionin am N-terminalen Ende durch in vitro-Inkubation mit Cyan-Bromid von dem Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine alternative Ausführungsform für Hefe-Expressions-Systeme bereit, ebenso wie in Säuger-, Baculovirus- und bakteriellen Expressionssystemen.
Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Bereich eines endogenen Hefe-Proteins codiert, oder ein anderes stabiles Protein, an das 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Nach Expression stellt dieses Konstrukt eine Fusion der beiden Aminosäuresequenzen bereit. Das Hefe- oder menschliche Superoxid-Dismutase (SOD)-Gen kann zum Beispiel an das 5'-terminale Ende eines fremden Gens gekoppelt und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz an der Verknüpfung der beiden Aminosäuresequenzen kann eine spaltbare Stelle codieren oder nicht. Siehe z. B. EPO-Veröffentlichung Nr. 196 056. Ein anderes Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein solches Fusionsprotein wird mit der Ubiquitin-Region hergestellt, die vorzugsweise eine Stelle für ein prozessierendes Enzym enthält (z. B. eine Ubiquitin-spezifische Prozessierungs-Protease), um das Ubiquitin von dem fremden Protein abzuspalten. Mit Hilfe dieses Verfahrens kann deshalb ein natives fremdes Protein isoliert werden (siehe z. B. PCT WO 88/024066). Dieses System ist ein bevorzugtes System zur Produktion von IGFBP-6.
In einer Alternative können die fremden Proteine auch aus der Zelle in das Wachstumsmedium sekretiert werden, indem chimäre DNA-Moleküle erzeugt werden, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem Leadersequenz-Fragment zusammengesetzt ist, das die Sekretion des fremden Proteins in Hefe gewährleistet. Vorzugsweise gibt es Prozessierungsstellen, die zwischen dem Leader-Fragment und dem fremden Gen codiert sind, die entweder in vivo oder in vitro gespalten werden können. Das Leadersequenz-Fragment codiert üblicherweise ein Signalpeptid, das aus hydrophoben Aminosäuren zusammengesetzt ist, die die Sekretion des Proteins aus der Zelle veranlassen.
DNA, die geeignete Signalsequenzen codiert, kann von Genen für sekretierte Hefe-Proteine abstammen, wie das Hefe-Invertase-Gen (EPO-Veröffentlichung Nr. 012 873; JPO- Veröffentlichung Nr. 62/096 086) und das A-Faktor-Gen (U. S. Patent Nr. 4,588,684). In einer alternativen Ausführungsform liegen Leadersequenzen von nicht Hefe-Ursprung vor, sowie eine Interferon-Leadersequenz, die ebenfalls die Sekretion in Hefe gewährleisten (EPO-Veröffentlichung Nr. 060 057).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretions-Leadersequenzen sind diejenigen, die ein Fragment des Hefe-Alpha-Faktor-Gens verwenden, das sowohl eine "Prä"-Signalsequenz, als auch eine "Pro"-Region enthält. Die Arten von Alpha-Faktor-Fragmenten, die verwendet werden können, beinhalten die Prä-Pro-Alpha-Faktor-Leadersequenz von vollständiger Länge (etwa 83 Aminosäurereste) sowie trunkierte Alpha-Faktor-Leadersequenzen (üblicherweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) (U. S. Patent Nrn. 4,546,083 und 4,870,008; EPO-Veröffentlichung Nr. 324 274). Zusätzliche Leadersequenzen, die ein Alpha-Faktor-Leader-Fragment verwenden, das die Sekretion bereitstellt, beinhalten Hybrid-Alpha-Faktor-Leadersequenzen, die mit einer Prä-Sequenz einer ersten Hefe, jedoch mit einer Pro-Region aus einem zweiten Hefe-Alpha-Faktor hergestellt wurden (siehe z. B. PCT WO 89/02463).
Gewöhnlich sind Transkriptions-Terminations-Sequenzen, die von Hefe erkannt werden, regulatorische Regionen, die in 3'-Richtung des Translations-Stop-Codons vorliegen und somit zusammen mit dem Promotor die codierende Sequenz flankieren. Diese Sequenzen veranlassen die Transkription einer mRNA, die in das Polypeptid translatiert werden kann, das durch die DNA codiert wird. Beispiele für eine Transkriptions-Terminations-Sequenz und andere von Hefe erkannte Terminations-Sequenzen wie diejenigen, die glycolytische Enzyme codieren.
Gewöhnlich werden die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, eine Leader-Sequenz (falls gewünscht), die codierende Sequenz von Interesse und eine Transkritptions-Terminations-Sequenz umfassen, in ein Expressions-Konstrukt zusammengesetzt. Expressions-Konstrukte werden häufig in Form eines Replikons erhalten, wie ein extrachromosomales Element (z. B. Plasmide), das zu einer stabilen Erhaltung in einem Wirt, wie Hefe oder Bakterien, in der Lage ist. Das Replikon kann zwei Replikations-Systeme enthalten, was ihm erlaubt, dass es zum Beispiel in Hefe zur Expression und in einem prokaryontischen Wirt zur Clonierung und Amplifikation erhalten werden kann. Beispiele für solche Hefe-Bakterien-Pendel (Shuttle)-Vektoren beinhalten Yep24 [Botstein et al. (1979) Gene 8: 17–24], pCl/1 [Brake et al. (1.984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 4642–4646] und YRp17 [Stinchcomb et al. (1982) J. Mol. Biol. 158: 157]. Zusätzlich kann ein Replikon entweder ein Plasmid von hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid von hoher Kopienzahl besitzt im Allgemeinen eine Kopienzahl im Bereich von etwa 5 bis etwa 200 und gewöhnlich von etwa 10 bis etwa 150. Ein Wirt, der ein Plasmid von hoher Kopienzahl enthält, hat mindestens etwa 10 und mehr bevorzugt mindestens etwa 20. Das Einbringen eines Vektors von hoher oder niedriger Kopienzahl kann in Abhängigkeit von der Wirkung des Vektors und des fremden Proteins auf den Wirt ausgewählt werden. Siehe z. B. Brake et al., supra (oben).
In einer Alternative können die Expressions-Konstrukte mit Hilfe eines Integrations-Vektors in das Hefe-Genom integriert werden. Integrations-Vektoren enthalten gewöhnlich mindestens eine Sequenz, die zu einem Hefe-Chromosom homolog ist, das dem Vektor die Integration erlaubt, und enthalten vorzugsweise zwei homologe Sequenzen, die das Expressions-Konstrukt flankieren. Integrationen resultieren offenbar aus Rekombinationen zwischen homologer DNA in dem Vektor und dem Hefe-Chromosom [Orr-Weaver et al. (1983) Methods in Enzymol. 101: 228–245]. Ein Integrations-Vektor kann durch Auswählen der geeigneten homologen Sequenz und deren Einbeziehung in den Vektor, auf einen spezifischen Ort in Hefe gerichtet sein. Ein oder mehrere Expressions-Konstrukt e) können integrieren, was möglicherweise die Spiegel an produziertem rekombinantem Protein beeinflusst [Rine et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 6750]. Die chromosomalen Sequenzen, die in dem Vektor eingeschlossen sind, können entweder als ein einzelnes Segment in dem Vektor auftreten, was in der Integration des gesamten Vektors resultiert oder zwei Segmente enthalten, die zu den benachbarten Sequenzen in dem Chromosom homolog sind und das Expressions-Konstrukt in dem Vektor flankieren, was in der stabilen Integration von ausschließlich dem Expressions-Konstrukt resultieren kann.
Gewöhnlich können extra-chromosomale und Integrations-Expressions-Konstrukte selektierbare Marker enthalten, um die Selektion von Hefestämmen zu erlauben, die transformiert worden sind. Selektierbare Marker können Gene der Biosynthese beinhalten, die in dem Hefe-Wirt exprimiert werden können, wie ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und ALG7 und das G418-Resistenz-Gen, das in Hefezellen Resistenz gegen Tunicamycin bzw. G418 verleiht. Zusätzlich kann ein geeigneter selektierbarer Marker auch Hefe bereitstellen, die die Fähigkeit besitzt, in Anwesenheit toxischer Stoffe wie Metall zu wachsen. Die Anwesenheit von CUP1, zum Beispiel, erlaubt Hefe in Anwesenheit von Kupferionen zu wachsen [Butt et al. (1987) Microbiol, Rev. 51: 351].
In einer Alternative können einige der vorstehend beschriebenen Komponenten in einen Transformations-Vektor zusammengesetzt werden. Transformations-Vektoren sind gewöhnlich aus einem selektierbaren Marker zusammengesetzt, der, wie vorstehend beschrieben, entweder in einem Replikon erhalten wird oder sich in einen Integrations-Verktor entwickelt.
Expressions- und Transformations-Vektoren, entweder extra-chromosomale Replikons oder Integrations-Vektoren, sind für die Transformation von vielen Hefen entwickelt worden. Es sind zum Beispiel Expressions-Vektoren entwickelt worden für, unter anderem, die folgenden Hefen: Candida albicans [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142], Candida maltosa [Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141]. Hansenula polymorpha [Gleeson et al (1986) J. Gen. Microbiol 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302], Kluyveromyces fragilis [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165], Kluyveromyces lactis [De Louvencourt et al (1983) J. Bacteriol. 154: 737; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135], Pichia guillerimondii [Kunze et al (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141], Pichia pastoris [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; U. S. Patent Nrn. 4.837.147 und 4.929.555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al. (1983) J. Bacteriol. 153: 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach and Nurse (1981) Nature 300: 706], und Yarrowia lipolytica [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10: 380471 Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49].
Verfahren zum Einbringen exogener DNA in Hefe-Wirte sind im Stand der Technik gut bekannt und beinhalten gewöhnlich entweder die Transformation von Sphäroplasten oder von intakten Hefe-Zellen, die mit Alkali-Kationen behandelt wurden. Transformations-Verfahren variieren gewöhnlich in Abhängigkeit von der Hefeart, die transformiert werden soll. Siehe z. B. [Kurtz et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 142; Kunze et al (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; Candida]; [Gleeson et al (1986) J. Gen. Microbiol. 132: 3459; Roggenkamp et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 302; Hansenula]; [Das et al. (1984) J. Bacteriol. 158: 1165; De Louvencourt et al. (1983) J. Bacteriol. 154: 1165; Van den Berg et al. (1990) Bio/Technology 8: 135; Kluyveromyces]; [Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3376; Kunze et al. (1985) J. Basic Microbiol. 25: 141; U. S. Patent Nrn. 4.837.148 und 4.929.555; Pichia]; [Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929; Ito et al (1983) J. Bacteriol. 153: 163 Saccharomyces]; [Beach and Nurse (1981) Nature 300: 706; Schizosaccharomyces]; [Davidow et al. (1985) Curr. Genet. 10: 39; Gaillardin et al. (1985) Curr. Genet. 10: 49; Yarrowia].
g. Herstellung von Antikörpern gegen IGFBP-6
Spezifische Antikörper für IGFBP-6 werden durch Immunisierung eines geeigneten Vertebraten-Wirts, z. B. Kaninchen, mit gereinigtem IGFBP-6 oder Polypeptid-Derivaten von IGFBP-6, durch diese selbst oder in Verbindung mit einem herkömmlichen Adjuvans, hergestellt. Gewöhnlich sind zwei oder mehr Immunisierungen beteiligt und Blut oder die Milz werden einige Tage nach der letzten Injektion geerntet. Für polyclonale Antiseren können die Immunglobuline präzipitiert, isoliert und mit Hilfe einer Reihe von Standard-Verfahren gereinigt werden, die Affinitätsreinigung unter Verwendung von IGFBP-6, das an eine feste Oberfläche gekoppelt vorliegt, wie als ein Gel oder als Kügelchen in einer Affinitäts-Säule, beinhaltet. Für monoclonale Antikörper werden die Splenocyten (Milzzellen) normalerweise mit einem immortalisierten Lymphocyten fusioniert, z. B. eine myeloide Zelllinie, wobei selektive Bedingungen für die Hybridombildung vorliegen. Die Hybridome können dann unter einschränkenden Verdünnungsbedingungen cloniert werden und ihre Überstände auf Antikörper durchmustert werden, die die gewünschte Spezifität haben. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern sind in der Literatur gut bekannt und sind durch die Veröffentlichung Antibodies: A laboratory Manual (1988) Hrsg. Harlow and Lane, Cold Spring Harbor Laboratories Press and U. S. Patent Nrn. 4,381,292., 4,451,570 und 4,618,577 beispielhaft erläutert.
Sowohl für die in vivo-Verwendung von Antikörpern gegen IGFBP-6 und Anti-Idiotyp-Antikörper, als auch für die diagnostische Verwendung, kann es bevorzugt werden, monoclonale Antikörper zu verwenden. Monoclonale Anti-Virus-Partikel-Antikörper oder Anti-Idiotyp-Antikörper können wie folgt hergestellt werden. Die Milz oder die Lymphocyten aus einem immunisierten Tier werden entnommen und immortalisiert oder verwendet, um anhand von Verfahren, die den Fachleuten gut bekannt sind, Hybridome herzustellen. Um ein Mensch-Mensch-Hybridom herzustellen, wird ein menschlicher Lymphocyten-Spender ausgewählt. Epstein-Barr-Virus (EBV) kann verwendet werden, um menschliche Lymphocyten zu immortalisieren oder ein menschlicher Fusionspartner kann verwendet werden, um Mensch-Mensch-Hybridome herzustellen. Die primäre in vitro-Immunisierung mit Peptiden kann ebenfalls für die Erzeugung menschlicher monoclonaler Antikörper verwendet werden. Antikörper, die von den immortalisierten Zellen sekretiert werden, werden durchmustert, um die Clone zu bestimmen, die Antikörper von der gewünschten Spezifität sekretieren.
h. Diagnostische Verfahren, die Antigene, genetisches Material oder Antikörper verwenden
Die Zusammensetzungen, die erfindungsgemäße Antigene oder Antikörper umfassen, sowie das genetische Material, können in diagnostischen Tests verwendet werden. Unter der biologisch zweckmäßigen Information, die erhalten werden kann, sind erhöhte Bindeprotein-Spiegel, aufgrund der Anwesenheit von Tumoren, die in einer erhöhten Produktion von entweder IGF oder einem der IGFBP-Bindeproteine (da die Bindeproteine in Anwesenheit von überschüssigem IGF hergestellt werden), resultieren. Zusätzlich kann eine Vielzahl von Funktionsstörungen mit IGF-Konzentrationen in Bezug stehen. Einige Arten von Osteoporose zum Beispiel, haben einen Bezug zu IGF-Spiegeln. Zusätzlich. können die Bindeproteine zur Identifizierung, Herstellung und Aufreinigung von rekombinant hergestellten IGFs verwendet werden. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von IGFBP-6 umfassen die Analyse einer biologischen Probe, wie einer Blutprobe, von Cerebrospinalflüssigkeit oder Tumor- oder Knochen-Gewebe.
Gewöhnlich sind Verfahren zum Nachweis der Analyte, wie der erfindungsgemäßen Bindeproteine, auf Immuntests begründet. Solche Verfahren sind gut bekannt und brauchen hier nicht in Einzelheiten beschrieben zu werden. Beispiele beinhalten sowohl heterogene als auch homogene Immuntest-Verfahren. Beide Verfahren beruhen auf der Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen dem Bindeprotein und einem entsprechenden spezifischen Antikörper. Heterogene Tests für IGFBP-6 verwenden gewöhnlich einen spezifischen monoclonalen oder polyclonalen Antikörper, der an eine feste Oberfläche gebunden ist. Sandwich-Tests sind in zunehmendem Maße populär. Homogene Tests, die in Lösung durchgeführt werden, ohne Anwesenheit einer Festphase, können ebenfalls verwendet werden, zum Beispiel durch Bestimmung des Unterschiedes an Enzym-Aktivität, die durch Bindung des freien Antikörpers an ein Enzym-Antigen-Konjugat hervorgerufen wird. Eine Anzahl geeigneter Tests sind in den U. S. Patenten mit den Nrn. 3,817,837, 4,006,360, 3,996,345 offenbart.
Das Festphasen-Reagenz in dem vorstehenden Test wird durch bekannte Verfahren zur Anheftung von Protein-Material an festes Träger-Material, wie polymere Kügelchen, beschichtete Stöckchen (sticks) oder Filter-Material hergestellt. Diese Anheftungs-Verfahren beinhalten im Allgemeinen nicht-spezifische Anlagerung (Adsorption) des Proteins an den Träger oder die kovalente Anheftung des Proteins, gewöhnlich durch eine freie Aminogruppe, an eine chemisch reaktive Gruppe auf dem festen Träger, wie eine aktivierte Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aldehyd-Gruppe.
In einer zweiten diagnostischen Konfiguration, die als ein homogener Test bekannt ist, produziert die Bindung des Antikörpers an einen Analyten einige Veränderungen in dem Reaktionsmedium, die in dem Medium direkt nachgewiesen werden können. Vorgeschlagene bekannte übliche Typen homogener Tests beinhalten vor dem (a) Spin-markierte Reporter, wobei die Bindung des Antikörpers an das Antigen durch eine Veränderung in der angezeigten Mobilität nachgewiesen wird (Verbreiterung der Spin-aufspaltenden Spitzen (peaks)), (b) fluoreszierende Reporter, wobei die Bindung durch eine Veränderung in der Fluoreszenz-Wirksamkeit nachgewiesen wird, (c) Enzym-Reporter, wobei die Antikörper-Bindung die Enzym/Substrat-Wechselwirkungen beeinflusst und (d) Liposomen-gebundene Reporter, wobei die Bindung zur Lyse der Liposomen und Freisetzung verkapselter Reporter führen. Die Anpassung dieser Verfahren an das erfindungsgemäße Protein-Antigen richtet sich nach herkömmlichen Verfahren zur Herstellung homogener Test-Reagenzien.
i. Diagnostische Anwendungen unter Verwendung genetischer Sonden
Das erfindungsgemäße genetische Material kann selbst in zahlreichen Tests in Form von Sonden zum Nachweis von genetischem Material, das in natürlich auftretenden Materialien vorliegt, verwendet werden. Der Analyt kann eine Nucleotidsequenz sein, die mit einer Sonde hybridisiert, die eine Sequenz von (gewöhnlich) mindestens 16 aufeinander folgenden Nucleotiden, gewöhnlich 30 bis 200 Nucleotiden bis hin zu der im Wesentlichen vollständigen Sequenz der oberhalb gezeigten Sequenzen (cDNA-Sequenzen), umfasst. Der Analyt kann RNA oder cDNA sein. Die Probe ist gewöhnlich wie im vorangehenden Abschnitt beschrieben. Ein positives Ergebnis wird im Allgemeinen dadurch charakterisiert, dass ein genetisches Material identifiziert wird, das eine Sequenz von mindestens etwa 70% Homologie zu einer Sequenz von mindestens 12 aufeinander folgenden Nucleotiden der hierin dargestellten Sequenzen umfasst, gewöhnlich von mindestens etwa 80% Homologie zu mindestens etwa 60 aufeinander folgenden Nucleotiden innerhalb der Sequenzen, und kann eine Sequenz umfassen, die im Wesentlichen homolog zu den vollständigen Sequenzen ist. Um einen Analyten nachzuweisen, wobei der Analyt mit einer Sonde hybridisiert, kann die Sonde eine nachweisbare Markierung enthalten. Sonden, die besonders zweckmäßig für den Nachweis von Bindeproteinen sind, basieren auf konservierten Regionen dieser Proteine, besonders die Aminosäuren 181 bis 191 (PNCD) und die Aminosäuren 212 bis 215 (CWCV) von PB6. Diese Aminosäuren sind in allen verwandten IGF-Bindeproteinen hoch konserviert. Ausschließlich IGFBP-1 zeigt einen Unterschied, ein N für das D an Position 191.
Ein Verfahren zur Amplifikation von Ziel-Nucleinsäuren, zur späteren Analyse durch Hybridisierungs-Tests, ist als die Polymerase-Ketten-Reaktion oder das PCR-Verfahren bekannt. Das PCR-Verfahren kann verwendet werden, um erfindungsgemäßes IGFBP-6 in vermuteten Proben nachzuweisen, wobei Oligonucleotid-Primer verwendet werden, die räumlich voneinander entfernt vorliegen und auf der hierin dargelegten genetischen Sequenz basieren. Die Primer sind komplementär zu den gegenüberliegenden Strängen eines doppelsträngigen DNA-Moleküls und sind gewöhnlich durch etwa 50 bis 450 Nucleotide oder mehr (gewöhnlich nicht mehr als 2.000 nt) voneinander getrennt. Dieses Verfahren schließt die Herstellung spezifischer Oligonucleotid-Primer und dann sich wiederholende Zyklen von Ziel-DNA-Denaturierung, Primer-Bindung und Verlängerung mit einer DNA-Polymerase ein, um DNA-Fragmente von der erwarteten Länge zu erhalten, basierend auf dem Abstand zwischen den Primern. Verlängerungsprodukte (Extensionsprodukte), die von einem Primer erzeugt werden, dienen als zusätzliche Ziel-Sequenzen für den anderen Primer. Der Grad an Amplifikation einer Ziel-Sequenz wird durch die Anzahl der Zyklen kontrolliert, die durchgeführt werden und wird theoretisch durch die einfache Formel 2ⁿ kalkuliert, wobei n die Anzahl der Zyklen bedeutet. Angesichts dessen, dass der durchschnittliche Wirkungsgrad pro Zyklus in einem Bereich von etwa 65% bis 85% liegt, produzieren 25 Zyklen zwischen 0,3 bis 4,8 Millionen Kopien der Ziel-Sequenz. Das PCR-Verfahren ist in einer Vielzahl von Publikationen beschrieben, einschließlich Saiki et al., Science (1985) 230: 1350–1354; Saiki et al., Nature (1986) 324: 163–166; und Scharf et al, Science (1986) 233: 1076–1078. Siehe auch die U.S.-Patente mit den Nrn. 4,683,194; 4,683,195 und 4,683,202.
Die Erfindung beinhaltet ein spezifisches diagnostisches Verfahren zur Bestimmung von IGFBP-6, das auf der selektiven Amplifikation von IGFBP-6-codierenden DNA-Fragmenten beruht. Dieses Verfahren verwendet ein Paar einzelsträngige Primer, die von nicht-homologen Regionen sich gegenüberliegender Stränge eines DNA-Doppelhelix-Fragments abstammen, die aus den Sequenzen, die in 1 dargestellt sind, ausgewählt wurden. Diese "Primer-Fragmente", die einen Aspekt der Erfindung bilden, werden wie vorstehend beschrieben aus IGFBP-6-Fragmenten hergestellt. Das Verfahren folgt dem Prozess zur Amplifikation ausgewählter Nucleinsäure-Sequenzen, wie in dem U. S. Patent Nr. 4,683,202, wie vorstehend diskutiert, offenbart ist.
j. Test auf biologische Eigenschaften von IGFBP-6
Die Eigenschaft, an einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor zu binden, ist eine der biologischen Eigenschaften des erfindungsgemäßen Proteins. Diese Proteine können in einem Bindungstest in geeigneter Weise getestet werden, wobei IGF-I verwendet wird [Rinderknecht, E. and Humbel, R. E., J. Biol. Chem. (1978) 253: 2769] oder IGF-II [Rinderknecht, E. and Humbel, R. E., FEBS (1978) 89: 283], vorzugsweise IGF-II in einer markierten, z. B. jodierten, Form. Ein solcher Test kann zum Beispiel in geeigneter Weise die Durchführung einer Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) der erfindungsgemäßen Proteine beinhalten, gefolgt von einem Western Blot des Gels, dann die Inkubation des Blots in Anwesenheit von [¹²⁵I]IGF-I oder II, Waschen des Blots, um freies IGF-I oder -II zu entfernen und Nachweis der Radioaktivität auf dem Blot.
k. Verwendungen von IGFBP-6
Therapeutische Verwendungen der erfindungsgemäßen Bindeproteine beinhalten deren Verwendung als ein einzelnes therapeutisches Mittel und deren Verwendung in Kombination mit einem IGF, wobei die letztere Verwendung bevorzugt wird.
Wenn es in Kombination mit einem IGF verwendet wird, ist ein erfindungsgemäßes Bindeprotein zur Verwendung für die vorstehend erwähnten Indikationen geeignet, hauptsächlich als ein Wachstum-induzierendes, Gewebe-regenerierendes oder Wundheilungs-Mittel.
Demgemäß stellt die Erfindung bereit:

(i) Verwendung eines erfindungsgemäßen Bindeproteins zusammen mit IGF in freier oder fixierter Kombination zur Stimulation des Wachstums, der Gewebe- oder Organ-Regeneration oder Wundheilung eines Individuums (Subjekts), oder
(ii) ein Verfahren zur Stimulation des Wachstums eines Individuums, der Gewebe- oder Organ-Regeneration oder Wundheilung in einem Individuum, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Bindeproteins zusammen mit einer therapeutisch wirksamen Menge eines IGF, an einen Patienten, der einer solchen Behandlung bedarf, umfasst, oder
(iii) ein Arzneimittel zur Stimulation des Wachstums, der Gewebe- oder Organ-Regeneration oder Wundheilung eines Individuums, das ein erfindungsgemäßes Bindeprotein zusammen mit einem IGF und mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel umfasst, oder
(iv) einer Packung, die bis zur Verwendung in Dosierungsform ein erfindungsgemäßes Bindeprotein und ein IGF voneinander getrennt, zusammen mit Anleitungen für das Mischen oder die begleitende Verabreichung, enthält.

In Verbindung mit einem IGF, ist ein erfindungsgemäßes Bindeprotein von speziellem Interesse zur Vermittlung von Chondrogenese oder Hämatopoese. Das kann in den nachfolgenden Tests A bis C gezeigt werden.
A) Ein IGF erhöht die Knochenbildungsrate, wie z. B. durch einen erhöhten Einbau von [³H]-Prolin in Collagen- und nicht Collagen-Proteine, in den Schädeldächern einer fötalen Ratte angezeigt wird. Ein synergistischer Effekt tritt auf, wenn ein IGF in Anwesenheit eines erfindungsgemäßen Bindeproteins verwendet wird. Organkulturen der Schädeldächer der Ratte werden hergestellt, indem frontale und parietale Knochen von 21 Tage alten fötalen Ratten seziert werden, entlang der sagittalen Wundnaht zerteilt werden und nach dem Verfahren von Kream et al. (Endocrinology (1985) 116. 296) gezüchtet werden. Ein Bindeprotein oder IGF wird in Dosen von 10 bis 200 ng/ml Kultur zugegeben. Wenn beide gemeinsam zugegeben werden, beträgt das molare Verhältnis 1:1. Die Züchtung wird 24 bis 48 Stunden durchgeführt. Um den Einbau von [³H]-Prolin in Collagenase-spaltbares Protein und Nicht-Collagen-Protein zu quantifizieren, werden Knochen-Homogenate mit bakterieller Collagenase, gemäß dem Verfahren von Diegelman R. and Peterkofsky (Dev. Biol. (1972) 28: 443) und modifiziert von Kream et al. (Endocrinology (1985) 116: 296), gespalten.
B) Ein IGF erniedrigt die Knochen-Resorption, wie durch eine Abnahme der Freisetzung von [⁴⁵]Ca aus Knochen angezeigt wird. Ein synergistischer Effekt tritt auf, wenn ein IGF in Anwesenheit eines erfindungsgemäßen Bindeproteins verwendet wird. Der Test wird gemäß den Prinzipien von Raisz (J. Clin. Invest. (1965) 44: 103) beeinflusst. Trächtige Ratten werden am 18. Tag der Schwangerschaft mit [⁴⁵]Ca s.c. injiziert. Ein IGF, alleine oder in Anwesenheit eines erfindungsgemäßen Bindeproteins, wird mit einer Dosis von 10 ng bis 200 ng pro Tier injiziert. Das Bindeprotein wird derart zugegeben, dass das molare Verhältnis von IGF 1:1 beträgt. Am Tag 19 werden die Tiere getötet, die Föten entnommen. Die mineralisierten Achsen der Speichen und Ellen werden seziert und in Kultur genommen. Die Resorption wird auf der Grundlage der Freisetzung von [⁴⁵]Ca aus Knochenexplantaten quantifiziert.
C) Die erfindungsgemäßen IGF-Bindeproteine, sowie andere IGF-Bindeproteine verstärken die Erythropoietin-ähnliche Wirkung von IGF-I. Dies kann im Besonderen durch Testen von IGF-I, z. B. 10 ng/ml IGF-I, alleine oder in Kombination mit dem reifen IGF-Bindeprotein aus 1, z. B. einem 50 μl Aliquot eines Überstands, der von einer Kultur der CHO-Zelllinie stammt, die das reife IGF-Bindeprotein von 1 exprimiert, in einem CFU-E-Test, wie in Fagg, B. Roitsch, C. A. Cell, Physiol. (1986) 126:1 beschrieben, gezeigt werden. Obwohl das Ergebnis, das mit dem IGF-Bindeprotein alleine erhalten wird, sich nicht signifikant von der Kontrolle unterscheidet, ist eine synergistische Wirkung der Kombination ersichtlich, wenn man diese mit IGF-I alleine vergleicht.
Darüber hinaus kann die mitogene Aktivität eines IGF in Kombination mit einem erfindungsgemäßen Bindeprotein wie folgt getestet werden: Der Einbau von [³H]-Methylthymidin in CCL 39-Zellen (Lungen-Fibroblasten des chinesischen Hamsters) in Kultur wird wie von Plouet et al. Cell. Miol. (1984) 30: 105 beschrieben, gemessen. In diesem Test wird die Zelllinie CCI 39 auf einer Platte in einer Dichte von 40.000 Zellen pro Vertiefung in 0,5 ml MEM-Kulturmedium (Gibco), das 10% fötales Kälberserum, 0,1% Penicillin, 0,4% Streptomycin und 0,5% Fungizon enthält, ausgesät. Nach 72 Stunden Inkubation bei 37° C in einer Atmosphäre, die mit 5% CO₂ angereichert ist, werden die Zellen mit MEM-Medium in Abwesenheit von fötalem Kälberserum gewaschen und dann in diesem Medium 20 Stunden lang gezüchtet. In diesem Stadium ist die Zellkultur konfluent und ein IGF oder ein Bindeprotein oder beide zusammen werden überimpft, jeweils in einer Dosis von 10 ng bis 200 ng Kulturmedium. Wenn beide zusammen verabreicht werden, muss das molare Verhältnis 1:1 betragen. Die Testprobe wird 24 Stunden bei 37° C inkubiert und dann werden 1 mCi [³H]-Methylthymidin in 10 ml PBS zugegeben. Nach 4 Stunden Inkubation wird der Einbau von Methylthymidin gestoppt und werden die Zellen mit PBS gewaschen. Die Zellen werden mit 0,5 ml Trichlor-Essigsäure (5%) 30 Minuten fixiert, mit Wasser gewaschen und schließlich mit 0,5 ml 0,1 molarer NaOH 2 Stunden lang bei 37° C lysiert. 0,5 ml des Lysats werden in ein Scintillationsröhrchen gegeben und mit 3 ml Scintillationsflüssigkeit zur Messung der b-Radioaktivität vermischt. Das Bindeprotein verstärkt die mitogene Aktivität von IGF, obwohl die Radioaktivitäts-Spiegel, die gemessen werden, wenn ein Bindeprotein alleine verwendet wird, sich nicht wesentlich von denjenigen der Kontrollprobe unterscheidet.
Mehr besonders ist ein erfindungsgemäßes Bindeprotein in Kombination mit einem IGF zweckmäßig a) zur Behandlung von Hypophysen-Vorderlappen-Insuffizienz, Kleinwuchs vom Laron-Typ, Osteoporose, Anämien, insbesondere Komplikationen nachfolgend einer chronischen Nieren-Insuffizienz und Leber- oder Nieren-Mangelfunktion und b) zur Verstärkung von Wundheilung, wie bei Geschwüren und Verbrennungen oder derjenigen, die bei Unfall-Ereignissen auftritt oder aus Operationen resultiert.
Zur gemeinsamen Verwendung mit einem erfindungsgemäßen Bindeprotein, wird IGF vorzugsweise ausgewählt aus IGF-I, wie in Rinderknecht, E. and Humbel, R. E., J. Biol. Chem. (1978) 253: 2769, IGF-II, wie in Rinderknecht, E. and Humbel, R. E., FEBS (1978) 89: 283 beschrieben und jedes Derivat oder Fragment von IGF-I und IGF-II, das eine insulinähnliche Wachstumsfaktor-Aktivität besitzt. Am meisten bevorzugt ist dies IGF-II.
Für die Verwendung gemeinsam mit einem IGF, ist ein erfindungsgemäßes Bindeprotein vorzugsweise ein Protein, das von 85–100% homolog ist mit dem Prä-IGF-BP oder dem IGF-BP, wie in 1 gezeigt.
Falls nicht mit IGFs assoziiert, haben erfindungsgemäße Bindeproteine weitere therapeutische Verwendungen bei jeder physiologischen Funktionsstörung, die aus einer überschüssigen Produktion von freiem IGF resultiert, z. B. IGF-produzierende Krebserkrankungen wie Brust- oder Nierenkrebs, diabetische proliferative Retinopathie oder abnormales Wachstum bei großgewachsenen Kindern mit hohen Serumspiegeln an freiem IGF. Demgemäß betrifft die Erfindung auch

(i) die Verwendung eines erfindungsgemäßen Bindeproteins zur Behandlung physiologischer Fehlfunktionen, die aus einer überschüssigen Produktion von freiem IGF durch einen Säuger, zum Beispiel den menschlichen Körper, resultieren, z. B. IGF-produzierende Krebserkrankungen, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum von großgewachsenen Individuen, oder
(ii) ein Verfahren zur Behandlung physiologischer Fehlfunktionen, die aus einer überschüssigen Produktion von freiem IGF resultieren, z. B. IGF-produzierende Krebserkrankungen, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum eines Individuums, das die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Bindeproteins an ein Individuum umfasst, das einer solchen Behandlung bedarf oder
(iii) ein Arzneimittel zur Behandlung physiologischer Fehlfunktionen, die aus einer überschüssigen Produktion von freiem IGF resultieren, z. B. IGF-produzierende Krebserkrankungen, diabetische Retinopathie oder abnormales Wachstum eines Individuums, die ein erfindungsgemäßes Bindeprotein, verknüpft mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Verdünnungsmittel, umfasst, oder
(iv) ein Verfahren zur Verabreichung von IGFs an spezifische Organe oder Gewebe, basierend auf den differenzierten Bindungseigenschaften von IGFBP-6, wie durch das biologische Testen gezeigt ist.

Fragmente von mutierten Formen von Prä-IGF-BP oder IGF-BP, wie in 1 gezeigt, sind von besonderem Wert für die Behandlung der physiologischen Fehlfunktionen, die aus einer überschüssigen Produktion von freiem IGF in dem menschlichen Körper resultieren.
Ein erfindungsgemäßes Bindeprotein, alleine oder in Kombination mit einem IGF, kann auf jedem beliebigen Weg verabreicht werden, der für Peptide geeignet ist, oder insbesondere über den Darm, z. B. in Form von Tabletten oder Kapseln oder vorzugsweise parenteral, z. B. subkutan oder intravenös in Form von Injektionen oder Infusionen. Weiter kann es auch topisch verwendet werden, z. B. in Form von Salben oder Suspensionen, wenn es z. B. als ein Wundheilungsmittel verwendet wird.
Für alle die vorstehenden Indikationen wird die entsprechende Dosis natürlich in Abhängigkeit von zum Beispiel der Natur und Schwere der zu behandelnden Fehlfunktion und der Art der Verabreichung, variieren. Zufriedenstellende Ergebnisse können bei der Behandlung von Osteoporose oder Anämie zum Beispiel bei einer täglichen Dosis von etwa 0,1 mg/kg bis 40 mg/kg Körpergewicht, vorzugsweise von etwa 0,5 mg/kg bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht eines erfindungsgemäßen Bindeproteins, erhalten werden. In größeren Säugern, zum Beispiel Menschen, beträgt eine tägliche Dosis wie angezeigt etwa 5 mg, die auf herkömmliche Art und Weise parenteral verabreicht wird, zum Beispiel einmal pro Tag. Zur Wundheilung ist eine tägliche Dosis von 0,1 bis 10 mg erfindungsgemäßes Protein pro cm² Wundbereich als geeignet für größere Säuger, zum Beispiel Menschen, angezeigt. Diese wird auf herkömmliche Art und Weise einmal am Tag verabreicht. Wenn es in Kombination mit einem IGF verwendet wird, beträgt das molare Verhältnis des Bindeproteins zu IGF vorzugsweise von 0,1:1 bis 5:1, mehr bevorzugt von 0,5:1 bis 2:1, am meisten bevorzugt 1.1.
Erfindungsgemäße Arzneimittel können auf herkömmliche Art und Weise hergestellt werden.
Andere Verwendungen der erfindungsgemäßen Bindeproteine beinhalten verschiedene Anwendungen bei der Produktion von IGF-Molekülen mit Hilfe von rekombinanten Verfahren. Die erfindungsgemäßen Bindeproteine können verwendet werden, um von Hefe-produziertes IGF in nativer (aktiver) Konformation (im Gegensatz zu inaktivierten Formen) nachzuweisen. Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Proteine bei der Herstellung von IGF als Träger verwendet werden (möglicherweise in Form von co-exprimierten Proteinen). Da die Bindeproteine in der Lage waren, IGF in vivo zu stabilisieren, erwartet man das Gleiche in vitro. Die Bindeproteine können auch verwendet werden, um IGF aufzureinigen, das in Hefe produziert wurde, indem sie an eine Festphase (wie bei einer Affinitäts-Chromatographie) angeheftet werden.
Obwohl die Erfindung mit Bezug auf bestimmte Ausführungsformen, Verfahren, Konstruktionen und Verwendungen beschrieben wurde, ist es für die Fachleute offensichtlich, dass verschiedene Änderungen und Modifikationen durchgeführt werden können, ohne sich dabei von der Erfindung zu entfernen.
3. Beispiele
Gewebe
Menschliches Osteosarcom-Gewebe wurde von Dr. Marshall Urist (Univ. of California, Los Angeles) erhalten.
RNA-Isolierung
RNA wurde mit Hilfe des Guanidiniumthiocyanat-Verfahrens [Chirgwin, J. M. et al. (1978) Biochemistry 18: 5294–5299] mit Modifikationen [Freeman, G. J. et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4094–4098] isoliert. Poly(A)⁺-RNA wurde durch eine einzelne Fraktionierung über Oligo(dT)-Cellulose [Aviv, H. and Leder, P. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci USA 69: 1408–1412] aufgereinigt.
Oligonucleotid-Synthese
Oligonucleotid-Adapter, Sonden und Primer wurden anhand des Phosphoamidit-Verfahrens mit einem Applied Biosystems Modell 380A Syntheseautomaten synthetisiert, durch Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese aufgereinigt und über Sep-Pak C18-Patronen (Waters, Milford, MA) entsalzt.
Ein 14-mer-Oligonucleotid (5'-CCTGTAGATCTCCG-3') und 18-mer-Oligonucleotid (5'-AATTCGGAGATCTACAGG-3') wurden synthetisiert und als die EcoRI-Adapter für die cDNA-Bibliothek verwendet, die in ZAPII konstruiert wurde. Das 14-mer wurde phosphoryliert [Maniatis, T. et al. (1982). Molecular Cloning, a Laboratory Manua1 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)], dann sofort 15 Minuten lang auf 95°C erhitzt, um die Polynucleotid-Kinase zu inaktivieren. Die Adapter enthalten auch eine interne BglII-Restriktionsschnittstelle.
Die zwei Konsensus-PCR-Primer, die verwendet wurden, um BP6 zu identifizieren, waren ein Sense-Primer, der aus einem Gemisch von 32 24-meren (5'-AGATCTGAATTCGCCXAA(C/T)TG(C/T) (A/G)A-3') bestand und einem Antisense-Primer, der aus einem Gemisch von 16 25-meren (5'-AGATCTAAGCTTCXAC(A/G)CACCA(A/G)CA-3') bestand, wobei X alle vier Desoxynucleotide bezeichnet. EcoRI und HindIII-Restriktionsschnittstellen wurden in die Sense- bzw. Antisense-Primer eingeschlossen, um die Subclonierung der PCR-Produkte im M13-Sequenzierungs-Vektoren zu erlauben.
Die BP6-Sonden, die verwendet wurden, um die cDNA-Bibliothek zu durchmustern, waren 2 19-mere, (5'-GCAAAGGATTCTACAAGAG-3') und (5'-CAAACCTTCCCGTGGCCGC-3').
PCR-Amplifikation
Die PCR-Rektionen wurden mit dem PCR-Kit (Perkin Elmer Cetus), gemäß den Anleitungen des Anbieters durchgeführt, wobei die vorstehend beschriebenen PCR-Primer in einer finalen Konzentration von 8 μM verwendet wurden. Die cDNA-Matrize wurde aus 2,5 μg poly(A)⁺-RNA aus menschlichem Osteosarcom (Ost2) synthetisiert. Die Bedingungen der cDNA-Synthese waren identisch mit denjenigen für die Erststrang-cDNA-Synthese (siehe Konstruktion der cDNA-Bibliothek). Die cDNA wurde über Biogel A-15m fraktioniert, durch Ethanol-Präzipitation zurückgewonnen und in 100 μl steriles Wasser resuspendiert. 1 μl cDNA-Matrize wurde für die PCR-Reaktion verwendet. In einem Perkin Elmer Cetus-DNA-Thermal-Cycler wurden 35 Zyklen PCR durchgeführt. Die ersten 10 Zyklen bestanden aus einem 94° C, 1 Minute-Denaturierungsschritt, einem 33° C, 1 Minute-Anheftungsschritt (annealing) und einem 33° C, 1 Minute-Verlängerungsschritt (Extension). Die nächsten 25 Zyklen bestanden aus einem 94° C, 1 Minute-Denaturierungsschritt, einem 55° C, 1 Minute-Anheftungsschritt und einem 72° C, 1 Minute-Verlängerungsschritt. Der finale Verlängerungsschritt des letzten Zyklus betrug 7 Minuten. Die Probe wurde einmal mit Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (1:1:0,04) extrahiert, einmal mit Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) und durch Ethanol-Präzipitation wiedergewonnen. Das PCR-DNA-Produkt wurde dann 20 Minuten bei 37° C mit 10 Einheiten DNA-Polymerase I, Klenow-Fragment, in 10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreitol und 40 μM von jeweils dATP, dGTP, dTTP und dCTP inkubiert. Die Probe wurde wie vorstehend extrahiert, durch Ethanol-Präzipitation wiedergewonnen, mit EcoRI und HindIII gespalten und durch Elektrophorese in einem 7% Acrylamid, 1 × TBE (Tris/Borat/EDTA)-Gel fraktioniert. DNA mit einem Migrationsverhalten zwischen 80 bis 100 Basenpaaren wurde ausgeschnitten; durch sanftes Schütteln in 10 mM Tris-Hydrochlorid pH 7,5, 1 mM EDTA 16 Stunden passiv eluiert, durch Passage über eine Elutip-D-Säule, wie von dem Anbieter beschrieben (Schleicher und Schuell), aufgereinigt, in einen EcoRI- und HindIII-gespaltenen M13-Sequenzierungs-Vektor (mp18) ligiert und in den E. coli-Stamm DH5αF' eingebracht.
Konstruktion der cDNA-Bibliothek
Aus menschlicher Osteosarcom-poly(A)⁺-RNA wurde eine ZAPII/menschliche Osteosarcom-cDNA-Bibliothek kontruiert, wie in Zapf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 14892–14898 beschrieben. Es wurde eine Bibliothek von 1,75 × 10⁷ unabhängigen rekombinanten Clonen erhalten.
Durchmusterung der cDNA-Bibliothek Ungefähr 300.000 rekombinante Phagen der Ost4-cDNA-Bibliothek wurden in E. coli-BB4 ausplattiert (50.000 Phagen pro 137 mm Durchmesser-Platte) und 5–6 Stunden bei 37° C gezüchtet. Die Phagen wurden auf Nitrocellulose-Filter (Millipore, HAFT 137) transferiert, prozessiert [Benton, W. D., and Davis, R. W. (1977) Science 196: 180–182] und mit zwei BP6-Sonden durchmustert. Die Sonden wurden mit T4-Polynucleotid-Kinase und [³²P]-ATP [Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] zu einer spezifischen Aktivität von 1–2 × 10⁸ cpm/μg markiert. Die Filter wurden 1–2 Stunden bei 37° C vorhybridisiert, wie in Zapf et al. (1990) J. Biol. Chem. 265: 14892–14898, beschrieben. Die markierte Sonde wurde in einer Konzentration von 10⁶ cpm/ml zugegeben und die Hybridisierung wurde über Nacht bei 37° C unter sanftem Schütteln fortgeführt. Die Filter wurden in 2 × SSC (1 × SSC = 0,15 M Natriumchlorid/0,015 M Natriumcitrat, pH 7), 0,1% SDS bei 50° C gewaschen und über Nacht bei –80° C mit Kodak XAR-2-Filmen mit einer Du Pont Lightning Plus Verstärkerfolie exponiert. Bereiche von Plaques, die zweifach Signale ergaben, wurden herausgepickt, repliziert und solange erneut durchmustert, bis reine Plaques erhalten wurden.
Plasmid-Isolierung, Subclonierung und Sequenzierung
Bluescript SK(–)-Plasmide, die BP6-cDNA-Inserierungen enthalten, wurden aus ZAP freigesetzt, wobei das Freisetzungs/Ausschneide-Protokoll verwendet wurde, das von dem Anbieter beschrieben wurde (Stratagene). Die Plasmid-DNA wurde anhand des Alkalische-Lyse-Verfahrens [Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)] isoliert. Die Inserierungen wurden aus dem Bluescript SK(–)-Vektor durch BglII- oder EcoRI-Spaltung ausgeschnitten und durch Agarose-Gel-Elektrophorese fraktioniert. Die Inserierungen wurden aus dem Gel ausgeschnitten und 12 Stunden unter sanftem Schütteln in 10 mM Tris-Hydrochlorid pH 7,5, 1 mM EDTA (TE) eluiert, über eine Elutip-D-Säule (siehe vorstehend) aufgereinigt und in einen M13-Sequenzierungs-Vektor [Yanish-Perron, C. et al. (1985) Gene 33: 103–119] subcloniert. Die DNA-Sequenzierung wurde mit dem Didesoxy-Ketten-Terminierungs-Verfahren [Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463–5467] durchgeführt, wobei M13-Primer sowie spezifische interne Primer verwendet wurden. Unklare Regionen wurden unter Verwendung von 7-Deaza-2-Desoxyguanosin-Triphosphat [Barr, P.J. et al. (1986) Biotechniques 4: 428–432] und Sequenase (US-Biochemicals) aufgelöst.
Northern blot-Analyse
Poly(A)⁺-RNA wurde in einem 1,4%-Agarosegel in Anwesenheit von Formaldehyd [Lehrach, H. et al. (1977) Biochemistry 16: 4743–4751] fraktioniert, direkt auf Nitrocellulose transferiert und wie beschrieben prozessiert [Thomas, P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201–5205]. Die Filter wurden mit der gereinigten cDNA-Inserierung von BP6.1, wie vorstehend beschrieben (Durchmusterung der cDNA-Bibliothek), hybridisiert. Die Filter wurden zweimal 20 Minuten in 0,1 × SSC, 0,1% SDS bei 65° C gewaschen. Die cDNA-Sonden wurden, wie beschrieben [Thomas, P. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 5201–5205] zu einer spezifischen Aktivität von 2 × 10⁹ cpm/mg markiert.
Ergebnisse
Identifizierung und Clonierung von PB6
Ein Aminosäuresequenz-Vergleich der fünf bekannten menschlichen IGFBPs ergab einen hohen Grad an Homologie in den NH₂- und den COOH-terminalen Bereichen. Die längste Ausdehnung identischer Aminosäuren in allen fünf BPs befindet sich in zwei Regionen des COOH-terminalen Bereiches und besteht aus drei Aminosäuren Pro-Asn-Cys und vier Aminosäuren Cys-Trp-Cys-Val. Diese konservierten Aminosäuren befinden sich innerhalb einer Region der BPs, von der gezeigt wurde, dass sie homolog ist zu 10 sich wiederholenden Einheiten innerhalb des Aminoterminalen Endes von zwei Dritteln der Thyroglobulin-Moleküle.
In einem Versuch neue BPs zu identifizieren, wurden auf der Grundlage dieser Sequenzen degenerierte Primer entworfen und unter Verwendung von menschlicher Osteosarcom-cDNA als Matrize wurde PCR durchgeführt. Die DNA-Sequenz-Analyse der acht PCR-Produkte ergab eine Sequenz, die mit BP2 identisch war, drei identisch mit BP4, drei identisch mit BP5 und eine einzige Sequenz, die mit IGFBP-6 bezeichnet wurde, und eine 60%ige DNA-Sequenzidentität und eine 76% Aminosäure-Identität mit BP3 aufwies.
Auf der Grundlage der PCR-DNA-Sequenz von BP6 wurden zwei einzelne BP6-DNA-Sonden synthetisiert und verwendet, um eine ZAPII/menschliches Osteosarcom-cDNA-Bibliothek zu durchmustern. Von den 300.000 durchmusterten rekombinanten Clonen wurden 12 Clone identifiziert, die mit beiden Sonden hybridisierten. Fünf Clone wurden weiter aufgereinigt und die cDNA-Inserierungen wurden mit Hilfe von BglII- und EcoRI-Restriktionsenzym-Spaltung und Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert. Die cDNAs liegen in zwei Größenordnungen von ungefähr 1,7 kb und 6 kb, die durch die Clone 1 bzw. 12 beispielhaft dargestellt sind.
Expression von BP6-mRNA
Eine Northern Blot-Analyse von einigen unterschiedlichen Geweben unter Verwendung von ³²P-markierter Clon 1-cDNA bestätigte, dass diese beiden Klassen von BP6-mRNA existierten und wies darauf hin, dass Osteoplasten die Hauptquelle von BP6-mRNA sind. Alle getesteten Gewebe (Leber, Niere und Gehirn) produzierten BP6-mRNA, jedoch in niedrigeren Spiegeln.
Sequenzanalyse von BP6
BP6-Clon 1 (BP6.1)-cDNA wurde sequenziert und ist in 1 mit der davon abgeleiteten Aminosäure-Sequenz gezeigt. Die Amino-terminale Region von BP6 ist hydrophob und vermutlich ein Signalpeptid. Die vorhergesagte Signal-Peptidase-Spaltstelle (↓a) [von Heiji (1986) Nucleic Acids Research 11: 4683–4690] folgt nach Aminosäure 15, wobei ein reifes Protein von 257 Aminosäuren mit einem MW von 29.018 Da erhalten wird. Es gibt keine N-Glycosylierungsstellen. Es gibt 18 Cystein-Reste in BP6, wovon alle mit den Cystein-Resten in den BPs 1–5 übereinstimmen. Es gibt einige Grade Aminosäure-Homologie zwischen BP6 und den anderen fünf BPs, die in den Amino- und den Carboxy-terminalen Bereichen der Moleküle am deutlichsten hervortreten.
4. Hinterlegung von biologischem Material
Die Escherichia coli-Stamm HB101-Wirtszellen, die mit pBsBP6.1 transformiert wurden, sind am 18. Dezember 1990 bei der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, hinterlegt worden und erhielten die Hinterlegungsnummer 68496. Diese Hinterlegung wird nach den Richtlinien des Budapester Vertrages zur Internationalen Erkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für Zwecke von Patentverfahren durchgeführt. Die Hinterlegungsnummer ist von ATCC erhältlich.
Diese Hinterlegung wird lediglich zur Benutzung für Fachleute bereitgestellt und ist kein Zugeständnis, dass eine Hinterlegung gemäß 35 U. S. C. 112 erforderlich ist. Die Nucleinsäuresequenz dieses Plasmids, sowie die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das dadurch codiert wird, dienen der Kontrolle für den Fall, dass irgendein Konflikt mit der hierin vorliegenden Beschreibung auftritt. Es kann eine Lizenz dafür erforderlich sein, das hinterlegte Material herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen und eine solche Lizenz wird hierdurch nicht gewährt.

Claims

Gereinigtes insulinähnlicher Wachstumsfaktor-Bindeprotein, das eine Aminosäuresequenz mit mindestens 85% Ähnlichkeit zu der Aminosäuresequenz von 1 besitzt.
Fragment des Bindeproteins nach Anspruch 1, umfassend mindestens 10 aufeinanderfolgende Aminosäuren davon, wobei das Fragment an (i) einen Antikörper, der spezifisch für das Bindeprotein ist, oder (ii) an einen insulinähnlichen Wachstumsfaktor binden kann.
Gereinigtes Bindeprotein nach Anspruch 1, das die Aminosäuresequenz von 1 umfasst.
Zusammensetzung, die ein Protein nach Anspruch 1 oder ein Fragment nach Anspruch 2 umfasst, wobei das Bindeprotein ein menschliches Protein ist.
Verfahren zur Herstellung eines Proteins nach Anspruch 1 oder eines Fragments nach Anspruch 2 durch rekombinante Mittel.
Antikörper, Derivat davon oder ein Fragment des Antikörpers oder des Derivats, der/das ein Bindeprotein nach Anspruch 1 oder ein Fragment nach Anspruch 2 erkennt.
Polynucleotid, umfassend eine Nucleotidsequenz, die (i) ein Protein nach Anspruch 1 oder (ii) ein Fragment nach Anspruch 2 codiert.
Polynucleotid nach Anspruch 7, das die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz aufweist.
Polynucleotid nach Anspruch 7, wobei die Nucleotidsequenz eine menschliche Sequenz ist.
Polynucleotid nach Anspruch 7, wobei die Nucleotidsequenz eine genomische Sequenz ist.
Polynucleotid nach Anspruch 7, wobei die Nucleotidsequenz eine cDNA-Sequenz ist.
Polynucleotid nach Anspruch 7, wobei die Nucleotidsequenz im Plasmid pBsBP6.1 vorhanden ist, das in E.-coli-Zellen mit der ATCC-Hinterlegungsnummer 68496 vorhanden ist.
Rekombinanter Mikroorganismus oder Zelllinie, der/die ein Polynucleotid nach einem der Ansprüche 7 bis 12 enthält.
Mikroorganismus nach Anspruch 13, der eine Hefe ist.
Zelllinie nach Anspruch 13, die eine CHO-Zelllinie ist.
Verfahren zur Herstellung eines Bindeproteins nach Anspruch 1 oder eines Fragments nach Anspruch 2, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: – Züchten eines rekombinanten Wirts, der ein Polynucleotid nach Anspruch 7 enthält, unter Bedingungen, bei denen das Bindeprotein durch den Wirt exprimiert wird; und – Isolieren des exprimierten Bindeproteins, wobei der Wirt ein Mikroorganismus, eine Zellinie oder ein nichtmenschliches transgenes Tier ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Wirt ein Mikroorganismus ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Wirt eine eukaryontische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei der Wirt ein nicht-menschliches transgenes Tier ist.