DE60126602T2

DE60126602T2 - Neue collectine

Info

Publication number: DE60126602T2
Application number: DE60126602T
Authority: DE
Inventors: Nobutaka Asahikawa-shi WAKAMIYA; Hiroyuki Keshi; Katsuki Ohtani; Takashi Sakurai-shi SAKAMOTO; Yuichiro Wakayama-shi KISHI
Original assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Current assignee: Fuso Pharmaceutical Industries Ltd
Priority date: 2000-04-21
Filing date: 2001-04-23
Publication date: 2007-11-22
Anticipated expiration: 2021-04-24
Also published as: AU4884001A; CA2406884C; CA2406884A1; AU2001248840B2; US20090275740A1; EP1283214A4; EP1283214B1; US8604162B2; US20030158382A1; ES2281413T3; DK1283214T3; DE60126602D1; JPWO2001081401A1; EP1881004A1; US20130150565A1; JP2012095656A; WO2001081401A1; ATE353913T1; PT1283214E; EP1881004B1

Description

ERFINDUNGSBEREICH
Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte menschliche Collectine (auf das sich im Folgenden mit "hCL-L2" bezogen wird), Gene und Proteine.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Verfahren für die Herstellung und die Verwendung derselben. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Prüfen von Arzneimitteln, die CL-L2s verwenden. Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung auch Expressionsvektoren, die CL-L2s-Gene umfassen, und transformierte Zellen, die mit dem Expressionsvektor transformiert wurden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Komplementsysteme, die eine wichtige Rolle beim Verteidigungsmechanismus des Körpers spielen, umfassen bekanntlich einen klassischen Weg, bei dem ein Immunoglobulin als Erkennungsmolekül dient, gefolgt von der Aktivierung von C1, das die erste Komponente des Komplements darstellt, und einen alternativen Weg, bei dem C3, das die dritte Komponente des Komplements darstellt, direkt an fremde Substanzen, beispielsweise an Bakterien, gekoppelt wird. Neben diesen Wegen der Komplementaktivierung wurde in den letzten Jahren ein Lektin-Weg beschrieben, bei dem ein Mannose bindendes Protein (auf das sich im Folgenden mit "MBP" bezogen wird), das ein Serumlektin ist, das Komplementsystem durch die direkte Erkennung von Kohlenwasserstoffketten auf der Oberfläche fremder Substanzen aktiviert und an diese ankoppelt (Sato, T. et al., Int. Immunol., 6, 665–669, 1994).
MBP ist ein Lektin vom Typ C, das spezifisch an Mannose, N-Acetylglukosamin und dergleichen in Anwesenheit von Ca bindet, dessen Struktur einen kollagenartigen Bereich umfasst, der wenigstens ein (Gly-Xaa-Yaa)n Motiv und einen Erkennungsbereich von Kohlenwasserstoffketten (CRD) aufweist. Ähnlich wie MBP weisen Lektine einen kollagenartigen Bereich sowie einen CRD auf und werden allgemein als Collectin bezeichnet (Malhotora, R. et al., Eur. J. Immunol., 22, 1437–1445, 1992), das neben MBP Collectin-43 (CL-43), ein oberflächenaktives Protein A (SP-A), ein oberflächenaktives Protein D (SP-D), Rinder-Conglutinin (BKg) und dergleichen umfasst. Collectin verfügt über eine opsonische Aktivität, von der angenommen wird, dass diese bei der fundamentalen Immunreaktion gegen eine Vielzahl von Mikroorganismen wie beispielsweise Bakterien und Viren, eine Rolle spielt (Kawasaki, N. et al., J. Biochem., 106, 483–489, 1989; Ikeda, K. et al., J. Biol. Chem., 262, 7451–7454, 1987; Ohta, M. et al., J. Biol. Chem., 265, 1980–1984, 1990; Summerfield, J. A. et al., Lancet, 345, 886, 1995).
Diese Collectine sind dafür bekannt, aus einer Basisstruktur gebildet zu sein, die charakteristische Bereiche wie (1) CRD, (2) kollagenartige Bereiche und dergleichen aufweist, wie in 1(a) (Malhortra et al., Eur. J. Immunol., 22, 1437–1445, 1992) gezeigt ist. Diese Basisstruktur bildet eine Untereinheit aus, indem diese in dem kollagenartigen Bereich eine dreifache Helix ausbildet, und diese Untereinheiten so eine Oligomerstruktur, wie beispielsweise ein Trimer, Tetramer, Hexamer und dergleichen bilden.
Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass Collectine an einer nichtspezifischen Immunantwort Teil haben; so wurde beispielsweise berichtet, dass diese eine wichtige Rolle beim Neutralisieren und Ausschließen verschiedener Mikroorganismen bei Kindern spielen, die nicht über genügend Antikörper von ihrer Mutter verfügen oder spezifische Verteidigungssysteme aufweisen, die unzureichend entwickelt sind (Super et al., Lancet, 2, 1236–1239, 1989). Ferner wurden Untersuchungsergebnisse vorgestellt, welche die Rolle dieser Collectine mit dem Verteidigungssystem eines Wirts verknüpfen, die beispielsweise vorschlagen, dass der Wirt auf Grund einer abgesenkten Konzentration von MBP im Blut in Folge einer genetischen Mutation des MBP anfälliger gegenüber Infektionen wird (Sumiya et al., Lancet, 337, 1569–1570, 1991). Darüber hinaus liegen Berichte vor, dass der Anteil an Serum-MBP bei einem Fehler im Zusammenhang mit der Opsonisierung abgesenkt war (Madsen, H.O. et al., Immuno Genetics, 40, 37–44, 1994), wobei schnell bakterielle Infektionen auftraten (Garred, P. et al.; Lancet, 346, 941–943, 1995). Daher kann angenommen werden, dass MBP eine wichtige Rolle in einem Immunsystem spielt.
Erst kürzlich konnten die Erfinder zeigen, dass BKg und MPB Infektionen durch Influenza-A-Viren des Typs H1 und H3 sowie eine Aktivität der Nämagglutination inhibieren (Wakamiya et al., Glycoconjugate J., 8, 235, 1991; Wakamiya et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1270–1278, 1992). Anschließend wurde ein c-DNA-Klon kodierendes BKg erhalten, wobei ebenfalls die Relevanz zwischen BKg, SP-D und dergleichen erkannt wurde (Suzuki et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 191, 335–342, 1993).
Demnach stellen Collectine Substanzen dar, die bei der Aufklärung des Verteidigungsmechanismus des Körpers und als eine biologisch aktive Substanz nützlich sein können. Daher kann das Auffinden zu dieser Familie gehörenden neuen molekularen Spezies einen großen Beitrag in unterschiedlichen Bereichen der Medizin, der Biologie und darüber hinaus bei der Therapie von infektiösen Krankheiten leisten.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Aufgabe der Erfindung ist es, Materialien bereitzustellen, die bei der Aufklärung der Mechanismen der fundamentalen Immunität, der Aufklärung der Mechanismen der Entfaltung einer breiten Palette von Krankheiten, beispielsweise von bakteriellen Infektionen, bei der Diagnostik, bei deren prophylaktischen und therapeutischen Verfahren und bei der Entwicklung von Reagenzien und bei Arzneimitteln dafür einen Beitrag leisten können.
Dementsprechende Aspekte, die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt sind, werden nachfolgend beschrieben.

(1) Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 245 Aminosäuren, die mit den Aminosäurepositionen 1–245 der SEQ ID NR: 4 dargestellt sind.
(2) Ein Polynukleotid, dargestellt in der SEQ ID NR: 46 (entsprechend einer Basensequenz in den Basenpositionen 141–875 der SEQ ID NR: 3); ein Polynukleotid, das eine Aminosäuresequenz kodiert, die mit den Aminosäurenpositionen 1–245 der SEQ ID NR: 4 dargestellt ist.
(3) Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 197 Aminosäuren, die mit den Aminosäurepositionen 1–197 der SEQ ID NR: 6 dargestellt sind.
(4) Ein Polynukleotid, das mit der SEQ ID NR: 55 dargestellt ist (korrespondierend mit einer Basensequenz, die mit den Basenpositionen 141–731 der SEQ ID NR: 5 dargestellt ist); ein Polynukleotid, das eine Aminosäurensequenz kodiert, die mit den Aminosäurenpositionen 1–197 der SEQ ID NR: 6 dargestellt ist.
(5) Ein Protein mit einer Aminosäurensequenz bestehend aus 221 Aminosäuren, die mit den Aminosäurepositionen 1–221 der SEQ ID NR: 8 dargestellt sind.
(6) Ein Polynukleotid, das mit der SEQ ID NR: 56 (entsprechend einer Basensequenz, die mit den Basenpositionen 141–803 der SEQ ID NR: 7 dargestellt ist); ein Polynukleotid, das eine Aminosäurensequenz kodiert, die mit den Aminosäurenpositionen 1–221 der SEQ ID NR: 8 dargestellt ist.
(7) Ein Protein mit einer Aminosäurensequenz bestehend aus 221 Aminosäuren, die mit den Aminosäurepositionen 1–221 der SEQ ID NR: 10 dargestellt sind.
(8) Ein Polynukleotid, das mit der SEQ ID NR: 57 dargestellt ist, (entsprechend einer Basensequenz, die mit den Basenpositionen 141–803 der SEQ ID NR: 9 dargestellt ist); ein Polynukleotid, das eine Aminosäurensequenz kodiert, die mit den Aminosäurepositionen 1–221 der SEQ ID NR: 10 dargestellt ist.
(9) Ein Vektor mit einem Polynukleotid gemäß (2), (4), (6) oder (8).
(10) Eine transformierte Zelle, die ein Polynukleotid gemäß (2), (4), (6) oder (8) auf ein Weise beinhaltet, welche die Expression ermöglicht.
(11) Ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins, das die Schritte Kultivieren einer Zelle nach (10) und Sammeln des so hergestellten hCL-L2s Proteins umfasst.
(12) Ein Verfahren zum Durchsuchen bzw. Prüfen eines Arzneimittels, wobei das Protein gemäß (1), (3), (5) oder (7) verwendet wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Zeichnung, welche eine Basisstruktur (a) wesentlicher Collectine, von denen zuvor berichtet wurde, und einen Überblick über das Protein (MBP, SP-A und SP-D) verdeutlicht.
2 ist eine Zeichnung, die eine vorausgehende Hälfte einer Ausrichtung von Aminosäurensequenzen von vier verschiedenen Arten von Collectinen, von denen zuvor berichtet wurde, verdeutlicht.
3 ist eine Zeichnung, die eine nachfolgende Hälfte einer Ausrichtung gemäß 2 verdeutlicht.
4 zeigt Zeichnungen (a) und (b), die jeweils einen Primer zeigen, der für die Bestimmung der Sequenz des neuen Collectins der vorliegenden Erfindung und des dabei erhaltenen neuen Collectins verwendet wurde.
5 ist eine Zeichnung, die eine vorausgehende Hälfte einer Ausrichtung von Aminosäurensequenzen von vier Arten von Collectinen, von denen zuvor berichtet wurde, sowie eines weiteren Collectins (hCL-L2-1) verdeutlicht.
6 ist eine Zeichnung, welche die nachfolgende Hälfte der Ausrichtung gemäß 5 verdeutlicht.
7 zeigt die Ergebnisse einer Analyse der Verteilung der mRNA in verschiedenen menschlichen Geweben, welche die Gewebeverteilung des Collectins hCL-L2 verdeutlicht.
8 zeigt einen Stammbaum aus genetischen Daten verschiedener Collectine.
9 zeigt Ergebnisse einer Analyse der Verteilung der mRNA in verschiedenen menschlichen Geweben, welche die Gewebeverteilung der Collectine hCL-L2-1 und hCL-L2-2 gemäß der vorliegenden Erfindung verdeutlicht.
10 ist eine schematische Zeichnung, welche die an Zucker bindenden Eigenschaften des Collectins hCL-L2-1 verdeutlicht.
BEVORZUGTES AUSFÜHRUNGSBEISPIEL ZUM AUSFÜHREN DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben erfolgreich Collectin-Gene des Menschen und der Maus (hCL-L2-1 und mCL-L2) geklont. Ein CRD (Aminosäurepositionen 113–271 der SEQ ID NRn: 2 und 13, Aminosäurepositionen 87–245 der SEQ ID NR: 4), von dem angenommen wird, bei der fundamentalen Immunität eine Rolle zu spielen, und ein kollagenartiger Bereich (Aminosäurepositionen 41–112 der SEQ ID NRn: 2 und 13, Aminosäurepositionen 18–86 der SEQ ID NR: 4) mit einer Sequenz von (Gly-Xaa-Yaa)n lag am C-terminalen Ende des neuen CL-L2 vor.
Darüber hinaus wurden für hCL-L2, wie in 4 gezeigt, zwei Arten von Proteinen (CL-L2-1 und CL-L2-2) mit unterschiedlichen N-terminalen Enden der Aminosäurensequenzen gefunden. Insbesondere sind die N-terminalen Aminosäuren von CL-L2-1 (Positionen 1–43), die mit der SEQ ID NR: 2 dargestellt sind, und die N-terminalen Aminosäuren von CL-L2-2 (Positionen 1–17), die durch SEQ ID NR: 4 dargestellt sind, verschieden, wohingegen der Rest identisch ist. Ferner konnte, obwohl die Positionen 1–43 des N-terminalen Endes der Aminosäuren von CL-L2-1 eine Signalsequenz, einen Strang eines kollagenartigen Bereiches oder dergleichen aufwiesen, weder eine Signalsequenz noch ein Strang eines kollagenartigen Bereichs in den Positionen 1–17 des N-terminalen Endes der Aminosäuren von CL-L2-2 aufgefunden werden.
Darüber hinaus lagen drei Arten von CL-L2-2 entsprechenden Proteinen vor, die aus einem unterschiedlichen Spleißen der mRNA hervorgingen. Auf diese Proteine wird sich im Folgenden mit CL-L2-2v1 (SEQ ID NR: 5, 6), CL-L2-2v2 (SEQ ID NO: 7, 8) und CL-L2-2v3 (SEQ ID NR: 9, 10) bezogen. CL-L2-2v1 ist eine von CL-L2-2 abgeleitete Form, die mit SEQ ID NR: 4 unter Auslassung der Aminosäurenpositionen 18 bis 65 dargestellt ist (d. h. Auslassen der Basenpositionen 192 bis 335 von CL-L2-2, das mit SEQ ID NR: 3 dargestellt ist); CL-L2-2v2 ist eine von CL-L2-2 abstammende Form, die mit der SEQ ID NR. 4 unter Auslassung der Aminosäurenpositionen 18 bis 41 dargestellt ist (d. h. Auslassung der Basenpositionen 192 bis 263 von CL-L2-2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 3), und CL-L2-2v3 ist eine von CL-L2-2 abgeleitete Form, die mit der SEQ ID NR:4 unter Auslassung der Aminosäurepositionen 42 bis 65 dargestellt ist (d. h. Auslassung der Basenpositionen 264 bis 335 von CL-L2-2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 3). Diese drei Arten von Proteinen ergaben sich alle auf Grund eines unterschiedlichen Spleißens von CL-L2-2 in dessen kollagenartigem Bereich.
Hier verwendete hCL-L2-Gene umfassen hCL-L2-1, dargestellt mit der SEQ ID NR: 1, hCL-L2-2, dargestellt mit der SEQ ID NR:3, hCL-L2-2v1, dargestellt mit der SEQ ID NR: 5, hCL-L2-2v2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 7, hCL-L2-2v3, dargestellt mit der SEQ ID NR: 9, hCL-L2-1v1, dargstellt mit der SEQ ID NR: 36, hCL-L2-1v2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 38 und hCL-L2-1v3, dargestellt mit der SEQ ID NR: 40, insoweit nicht abweichend hiervon darauf hingewiesen wird. Das hier verwendete hCL-L2-Protein umfasst hCL-L2-1, dargestellt mit der SEQ ID NR: 2, hCL-L2-2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 4, hCL-L2-2v1, dargestellt mit der SEQ ID NR: 6, hCL- L2-2v2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 8, hCL-L2-2v3, dargestellt mit der SEQ ID NR: 10, hCL-L2-1v1, dargestellt mit der SEQ ID NR: 37, hCL-L2-1v2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 39 und hCL-L2-1v3, dargestellt mit SEQ ID NR: 41, insoweit nicht anderslautend darauf hingewiesen wird.
Die Aminosäurensequenz von hCL-L2-2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 4 (Aminosäurenpositionen 1–245) stellt ein Protein dar, das aus 245 Aminosäuren besteht, so dass die Basensequenz, die dieses kodiert (SEQ ID NR: 46), aus 735 Basen besteht. Charakteristische Aminosäuresequenzen, beispielsweise ein kollagenartiger Bereich, ein CRD-Bereich und dergleichen, waren Teil der Sequenz. Die Basensequenz, die dieses Protein kodiert, ist mit der SEQ ID NR: 3 dargestellt.
Die Aminosäuresequenz von hCL-L2-2v1, dargestellt mit der SEQ ID NR: 6 (Aminosäurepositionen 1–197), entspricht einem Protein, das aus 197 Aminosäuren besteht, so dass die Basensequenz, die dieses kodiert (SEQ ID NR: 55), aus 591 Basen besteht. Charakteristische Aminosäuresequenzen, beispielsweise ein kollagenartiger Bereich, ein CRD-Bereich und dergleichen, waren Teil der Sequenz. Die Basensequenz, die diese Protein kodiert, ist mit der SEQ ID NR: 5 dargestellt.
Die Aminosäurensequenz von hCL-L2-2v2, dargestellt mit der SEQ ID NR: 8 (Aminosäurepositionen 1–221) entspricht einem aus 221 Aminosäuren bestehenden Protein, und so besteht die Basensequenz, die dieses kodiert (SEQ ID NR: 56), aus 663 Basen. Charakteristische Aminosäuresequenzen, beispielsweise ein kollagenartiger Bereich, ein CRD-Bereich und dergleichen, waren Teil der Sequenz. Die Basensequenz, die dieses Protein kodiert, ist mit der SEQ ID NR: 7 dargestellt.
Die Aminosäurensequenz von hCL-L2-2v3, dargestellt mit der SEQ ID NR: 10 (Aminosäureposition 1–221), stellt ein aus 221 Aminosäuren bestehendes Protein dar, und so besteht die Basensequenz, die diese kodiert (SEQ ID NR: 57), aus 663 Basen. Charakteristische Aminosäuresequenzen, beispielsweise solche eines kollagenartigem Bereichs, eines CRD-Bereichs oder dergleichen, waren Teil der Sequenz. Die Basensequenz, die dieses Protein kodiert, ist mit der SEQ ID NR: 9 dargestellt.
Die Anmeldung offenbart Fragmente, die von der oben beschriebenen Aminsäurensequenz von CL-L2s abgeleitet sind und die beispielsweise einen extrazellulären Bereich, einen intrazellulären Bereich, einen transmembranen Bereich, einen kollagenartigen Bereich, einen CRD-Bereich, einen collectinartigen Bereich, einen hydrophoben Bereich (einen transmembranen Bereich und dergleichen), einen hydrophilen Bereich (kein hydrophober Bereich) oder dergleichen sowie Fragmente umfassen, die durch die Fusion dieser Fragmente erhalten werden.
Die in der SEQ ID NR: 4 dargestellte Aminosäurensequenz von hCL-L2-2 kann beispielsweise folgende Fragmente umfassen: ein Fragment mit Aminosäuren etwa in den Positionen 18–245, das einen CRD-Bereich und einen kollagenartigen Bereich ausbildet, und ein Fragment mit Aminosäuren etwa in den Positionen 18 bis 86, die einen kollagenartigen Bereich ausbilden; die in der SEQ ID NR: 6 dargestellte Aminosäurensequenz von hCL-L2-2v1 kann beispielsweise folgende Fragmente umfassen: ein Fragment mit Aminosäuren etwa in den Positionen 18–197, die einen CRD-Bereich sowie einen kollagenartigen Bereich ausbilden, und ein Fragment mit Aminosäuren etwa in den Positionen 18–38, die einen kollagenartigen Bereich ausbilden; die mit der SEQ ID NR: 8 dargestellte Aminosäurensequenz von hCL-L2-2v2 kann beispielsweise folgende Fragmente umfassen: ein Fragment mit Aminosäuren etwa in den Positionen 18–221, die einen CRD-Bereich und einen kollagenartigen Bereich ausbilden, ein Fragment mit Aminosäuren etwa in den Positionen 18–62, die einen kollagenartigen Bereich ausbilden; die in der SEQ ID NR: 10 dargestellte Aminosäurensequenz von hCL-L2-2v3 kann beispielsweise folgende Fragmente umfassen: ein Fragment mit Aminosäuren etwa in den Positionen 18–221, die einen CRD-Bereich und einen kollagenartigen Bereich ausbilden, ein Fragment mit Aminosäuren etwa in den Positionen 18–62, die einen kollagenartigen Bereich ausbilden.
Verfahren zur Herstellung des CL-L2s-Gens
Ein CL-L2s-Gen gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch jedes beliebige Verfahren erhalten werden. Die Basensequenz zum Kodieren von CL-L2s gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch eine Bereitstellen von mRNA aus Zellen erhalten werden, die das Protein exprimieren, wobei diese durch konventionelle Technik in eine doppelsträngige DNA umgewandelt wird. Zum Bereitstellen der mRNA kann das Guanidin-Isothiocyanat-Calciumchlorid-Verfahren (Chirwin, et al., Biochemistry, 18, 5294, 1979) oder dergleichen eingesetzt werden. Zur Herstellung von Poly(A)⁺-RNA aus der Gesamt-RNA können Träger, die an oligo(dT) beispielsweise durch eine Affinitäten-Chromatographie gebunden sind, bei der Sepharose oder Latexteilchen verwendet werden, eingesetzt werden. Doppelsträngige cDNA kann so durch Verwendung von RNA, die auf diese Art und Weise gewonnen wurde, erhalten werden, die als eine Vorlage für die Behandlung mit reverser Transkriptase entsprechend beschrieben wurde, wobei oligo(dT), das komplementär zur Poly(A) Kette am 3'-Ende ausgebildet ist, ein willkürlicher Primer oder ein synthetisiertes Oligonukleotid, das einem Teil der Aminosäurensequenz von CL-L2s entspricht, als Primer eingesetzt wurden (Mol. Cell Biol., 2, 161, 1982; Mol. Cell Biol., 3, 280, 1983; Gene 25, 263, 1983) und wobei der auf diese Weise erhaltene cDNA-Strang beispielsweise mit E. coli-RNaseH, E. coli-DNA Polymerase 1, E. coli DNA-Ligase behandelt wurde, um den DNA-Strang zu modifizieren. Eine cDNA-Bibliothek kann erzeugt werden, indem diese cDNA in einen Plasmid-Vektor, einen Phagen-Vektor oder einen Cosmid-Vektor zum Transformieren von E. Coli eingefügt wird oder indem diese in E. Coli eingeschleust wird und anschließend ein so genanntes Verpacken in vitro durchgeführt wird.
Der Plasmid-Vektor, der hier eingesetzt werden kann, unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, solange dieser in dem Wirt repliziert und gehalten werden kann. Der Phagen-Vektor unterliegt ebenfalls keinen Beschränkungen, so lange dieser in dem Wirt profilieren kann. Klonende Vektoren umfassen beispielsweise pBR322, pUC19, λgt10, λgt11 und dergleichen. Darüber hinaus weist der Vektor beim immunologischen Durchsuchen bzw. Prüfen vorzugsweise einen Promotor auf, der die Expression eines CL-L2s-Gens in dem Wirt ermöglicht.
Zum Einbinden der cDNA in ein Plasmid dient das von Maniatis, et al. beschriebene Verfahren (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition) und dergleichen als Referenz. Schließlich kann zum Einbinden der cDNA in einen Phagen-Vektor das von Hyunh et al. (DNA cloning, a practical approach, 1, 49, 1985) offenbarte Verfahren und dergleichen als Referenz dienen.
Als Verfahren zum Einführen des oben beschriebenen Expressions-Vektors in Wirtszellen können, beispielsweise das Verfahren zum Einschleusen durch Lipopolyamin, das DEAE-Dextran Verfahren, das Hanahan-Verfahren, das Lipofectin-Verfahren, das Calciumphosphat-Verfahren, die Micro-Injektion, die Elektroporation und dergleichen (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second edition) eingesetzt werden. Das in vitro Verpacken kann auf einfache Weise unter Einsatz handelsüblicher Werkzeuge (hergestellt von Stratagene oder Amersham) durchgeführt werden.
Das Verfahren zur Isolation von cDNA, die ein CL-L2s-Protein kodiert, aus einer cDNA-Bibliothek, die wie oben beschrieben hergestellt wurde, kann einen allgemeinen Prozess umfassen, der in Kombination mit dem Durchsuchen der cDNA eingesetzt werden kann. So wird beispielsweise eine mit ³²P bezeichnete Probe erzeugt, wobei ein die gewünschte cDNA enthaltendes Klon durch ein Kolonie-Hybridisierungs-Verfahren (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72, 3961, 1975) oder durch ein Plaque-Hybridisierungsverfahren (Molecular Cloning, A Laoratory Manual, second edition, Cold Spring Harbor Labaratory, 2, 108, 1989) durchsucht bzw. geprüft werden kann. Schließlich kann ein Klon durch ein PCR Verfahren selektiert werden. Darüber hinaus kann der gewünschte Klon durch die Verwendung eines Antikörpers selektiert werden, der CL-L2S erkennt, wenn eine cDNA-Bibliothek unter Verwendung eines Vektors erzeugt wird, der cDNA exprimieren kann.
Darüber hinaus werden beispielsweise, wenn ein CL-L2s Gen aus Zellen isoliert wird, die CL-L2s Gene exprimieren, die exprimierenden Zellen unter Verwendung von SDS oder Proteinase K, gelöst, gefolgt von einer Phenol-Behandlung. Unerwünschte DNA wird mit Ribonuklease aufgeschlossen. Die auf diese Weise erhaltene DNA wird mit Restriktions-Enzymen aufgeschlossen und die erhaltenen DNA-Fragmente werden unter Verwendung einer Phage oder eines Cosmids zur Erzeugung einer Bibliothek vervielfältigt. Anschließend wird das gewünschte Klon selektiert, woraufhin schließlich ein CL-L2s-Gen erhalten werden kann.
Die Basensequenz der dementsprechend erhaltenen DNA kann mit Hilfe eines Maxam-Gilbert Verfahrens (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977) oder mit Hilfe eines Verfahrens nach Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977) bestimmt werden. Das CL-L2s-Gen kann ausgehend von dem oben erhaltenen Klon durch Herausschneiden erhalten werden.
Durch Verwendung des Primers, der auf Grundlage der Basensequenz von CL-L2 synthetisiert wurde, kann das Klonen auch mit Hilfe des RT-PCR-Verfahrens unter Einsatz von Poly(A)⁺-RNA von Zellen durchgeführt werden, die CL-L2s als Vorlage exprimieren. Weiterhin kann die gewünschte cDNA auch erhalten werden, indem die cDNA-Bibliothek nach dem Herstellen/Synthetisieren einer Probe, die auf die Basensequenz von CL-L2s zurückzuführen ist, direkt durchsucht bzw. geprüft werden und zwar nicht mit Hilfe der PCR. Das Gen der vorliegenden Erfindung kann aus den Genen, welche durch die hier vorausgehend beschriebenen Verfahren erhalten wurden, durch die Verifikation der Basensequenz des Gens isoliert werden. Das Gen der vorliegenden Erfindung kann ebenso mit konventionellen Verfahren, bei denen chemische Synthesen einer Nukleinsäure angewandt werden, beispielsweise mit dem Phosphoimidit-Verfahren (Mattencci, M. D., et al., J. Am. Chem. Soc., 130, 3185, 1981) oder dergleichen erzeugt werden.
Verfahren zum Herstellen eines Expressions-Vektors
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso einen Vektor mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäurensequenz. Der Vektor unterliegt keinen besonderen Beschränkungen, insoweit dieser das CL-L2s Protein exprimieren kann, wobei jedoch ein Plasmid-Vektor, ein RNA-Vektor, ein DNA-Vektor, ein Virus-Vektor, ein Phagen-Vektor und dergleichen eingesetzt werden können. Bevorzugte Ausführungsbeispiele davon umfassen pBAD/His, pRSETA, pcDNA2.1, pTrcHis2A, pYES2, pBlueBac4.5, pcDNA3.1 oder pSeeTag2, die von Invirtogen hergestellt wurden, pET oder pBAC, die von Novagen Co. hergestellt wurden, pGEM, das von Promega hergestellt wurde, pBluescriptII, pBs, Phagescript, pSG oder pSV2CAT, die von Stratagene hergestellt wurden, oder pGEX, pUC18/19, pBPV, pSVK3 oder pSVL, die von Pharmacia Co. hergestellt wurden.
Die cDNA-Sequenz von CL-L2s, die mit dem Expressions-Vektor ligiert ist, wird wirksam mit einem Promotor verbunden. Der Promoter umfasst beispielsweise eine Phagen-λ-PL-Promoter, E. coli lac-, trp-, tac-Promoter, einen frühen und einen späten SV40-Promoter, einen T7- und T3-Promoter und einen Retrovirus-LTR-Promoter. Insbesondere umfasst der Promoter zur Verwendung in eukaryotischen Zellen einen CMV-Promotor, einen HSV-Promoter, einen frühen und späten SV40-Promoter, einen Retrovirus-LTR-Promoter, einen RSV-Promoter und einen Metallothionein-Promoter. Darüber hinaus kann der Expressionsvektor einen Marker für die Selektion des transformierten Wirts und einen so genannten „Enhancer" umfassen. Beispielhafte Marker umfassen Dihydrofolat-Reduktase-Gen, ein gegenüber Neomycin resistentes Gen, ein gegenüber Ampicillin resistentes Gen und dergleichen. Beispielhafte Enhancer umfassen SV40-Enhancer, einen frühen Cytomegalovirus-Enhancer-Promoter, einen Adenovirus-Enhancer und dergleichen.
Verfahren zum Herstellen transformierter Zellen
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin transformierte Zellen, die eine Basensequenz der vorliegenden Erfindung aufweisen, um deren Expression mittels des Vektors wie oben beschrieben zu ermöglichen, der die Basensequenz aufweist. Die Wirtszelle für den Einsatz als eine transformierte Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung kann vorzugsweise tierische Zellen und Insektenzellen umfassen, wobei jedoch alle Zellen (Mikroorganismen können ebenso umfasst sein) in Frage kommen, die ein CL-L2s-Protein in dem Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung exprimieren können.
Beispielhafte tierische Zellen oder Insektenzellen der vorliegenden Erfindung können jeweils vom Menschen, von einer Fliege oder einer Seidenraupe (Bombyx mor) abgeleitete Zellen umfassen. So können beispielsweise CHO-Zellen, COS-Zellen, BHK-Zellen, Vero-Zellen, Myeloma-Zellen, HEK293- Zellen, HeLa-Zellen, Jurkat-Zellen, Maus-L-Zellen, Maus-C127-Zellen, Maus-FM3A-Zellen, Maus-Fibroblasten, Osteoblasten, Chondrocyten, S2, Sf9, Sf21, High Five^TM-Zellen umfasst sein. Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen Escherichia coli, Saccharomyces cerevisia und dergleichen. Zum Einführen eines Vektors in solche Wirte, kann das oben beschriebene Verfahren eingesetzt werden.
Die CL-L2s gemäß der vorliegenden Erfindung exprimierenden Zellen können zum Analysieren eines Collectinweges eingesetzt werden, der mit infektiösen Krankheiten, Immunität und dergleichen verknüpft ist. Weiterhin können diese Zellen bei der Herstellung eines CL-L2s-Proteins oder eines CL-L2s-Proteins mit einer Kohlenwasserstoffkette verwendet werden. Diese Zellen können ebenfalls beim Durchsuchen bzw. Prüfen eingesetzt werden, um einen Agonisten oder einen Antagonisten des CL-L2s-Proteins zu erhalten.
Verfahren zum Erhalt des Proteins
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines CL-L2s-Proteins, welches das Kultivieren einer Zelle, die, wie weiter oben ausgeführt wurde, mit der Basensequenz gemäß der vorliegenden Erfindung transformiert wurde, und das Sammeln des so erzeugten CL-L2s umfasst. Das Kultivieren der Zellen, das Isolieren des Proteins und dessen Reinigung kann mit konventionellen bekannten Verfahren durchgeführt werden.
Das Protein gemäß der vorliegenden Erfindung kann als ein rekombinantes Fusionsprotein exprimiert werden, das leicht isoliert, gereinigt und als solches erkannt werden kann. Das rekombinante Fusionsprotein ist ein Protein, das nach Anhängen einer geeigneten Peptidkette an das N-terminate Ende und/oder an das C-terminale Ende eines Proteins exprimiert wird, das aus einer Nukleinsäurensequenz exprimiert wurde, die das gewünschte Protein kodiert. Um die Reinigung des exprimierten Proteins zu erleichtern, kann das Protein als ein Fusionsprotein exprimiert werden, das ein Signal für die extrazelluläre Sekretion aufweist. Darüber hinaus kann das Protein ausgehend von verschiedenen Ausgangsprodukten wie beispielsweise ausgehend von kultivierten Zellen, kultivierten Geweben, transformierten Zellen und dergleichen erhalten werden, wobei konventionell bekannte Verfahren eingesetzt werden, wie beispielsweise bekannte Reinigungsverfahren umfassend Aussalzen, wie beispielsweise die der Ammoniumsulfat-Ausfällungstechnik und dergleichen, Gel-Filtrationstechnik unter Verwendung von Sephadex und dergleichen, Ionenaustausch-Chromatographietechnik, hydrophobe Chromatographie-Technik, chromatographische Farbstoff-Gel-Technik, Elektrophorese-Technik, Dialyse, Ultrafiltrationstechnik, Affinitätschromatographietechnik, Hochleistungsflüssigkeitschromatographietechnik und dergleichen.
Verfahren zum Einsatz des Gens
Proben zum Nachweis des CL-L2-s-Gens können auf der Grundlage der Basensequenz festgelegt werden, die entweder mit den SEQ ID NR: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 36, 38 oder 40, den SEQ ID NR: 48 (entsprechend den Basenpositionen 601–1077 von SEQ ID NR: 1) oder mit den Nukleinsäurepositionen 493–969 von SEQ ID NR: 12 verdeutlicht sind. Abweichend davon können Primer für die Vervielfältigung von DNA oder RNA angegeben werden, die eine solche Basensequenz umfassen. Das Spezifizieren einer Probe oder eines Primers, die auf einer vorgegebenen Sequenz basieren, wird vom Fachmann ständig durchgeführt. Ein Oligonukleotid einer spezifizierten Basensequenz kann durch chemische Synthese erhalten werden. Wird dem Oligonukleotid eine geeignete Kennung zugefügt, kann diese auf unterschiedliche Weise für die Hybridisierungsuntersuchung eingesetzt werden. Abweichend davon kann dies ebenso in Reaktionen für die Synthese von Nukleinsäuren wie beispielsweise bei PCR verwendet werden. Das Oligonukleotid, das als ein Primer eingesetzt wird, weist eine Länge von wenigstens 10 Basen und geeigneter Weise eine Länge von 15 bis 50 Basen auf. Vorteilhafterweise weist das als Probe eingesetzte Oligonukleotid wenigstens 100 Basen bis zu seiner vollen Länge auf. Darüber hinaus kann es auch für die Diagnose von Krankheiten eingesetzt werden, die durch eine Mutation eines CL-L2s-Gens verursacht werden, da es zum Nachweis einer genetischen Mutation verwendet werden kann, die ein CL-L2-Protein kodiert und zum Nachweis von SNP. Es wird erwartet, dass es für die Diagnose einer Vielzahl von Krankheiten verwendet werden kann, einschließlich beispielsweise bakterieller Infektionen und dergleichen. Darüber hinaus ist es ebenso nützlich für die Gentherapie, wobei das CL-L2s-Gen in den lebenden Körper eingeführt wird, um seine Expression zu ermöglichen.
Darüber hinaus ist es auch möglich einen Promotorbereich und einen so genannten Enhancer-Bereich des CL-L2s-Gens zu erhalten, das in einem Genom enthalten ist, das auf einer cDNA-Basensequenz von CL-L2s gemäß der vorliegenden Erfindung basiert. Insbesondere können diese Regionen mit ähnlichen Verfahren erhalten werden, die in der ungeprüften Japanischen Patentveröffentlichung mit der Nummer 6-181767; in J. Immunol.; 155, 2477, 1995; Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 92, 3561, 1995 und dergleichen veröffentlicht sind. Promoter-Bereich, auf den hier Bezug genommen wird, ist ein DNA-Bereich, der die Expression eines Genes kontrolliert, das oberhalb einer Stelle zur Aktivierung der Transkription angeordnet ist. Der hier genannte Enhancer-Bereich bezieht sich auf einen DNA-Bereich, der die Expression eines Gens steigert, das in einem Intron, einem 5'-unkodierten Bereich oder einem 3'-unkodierten Bereich, vorliegt.
Verfahren zur Verwendung des Proteins
CL-L2s-Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Aufklärung von Mechanismen der fundamentalen Immunologie, zur Aufklärung von Mechanismen über die Entwicklung einer breiten Palette von Krankheiten, wie beispielsweise bakteriellen Infektionen, bei der Diagnose, bei deren prophylaktischen und therapeutischen Verfahren und zur Entwicklung von Reagenzien und Arzneimitteln für diesselben eingesetzt werden. Darüber hinaus können diese als Antigen zur Herstellung von Antikörpern zu CL-L2s verwendet werden. Ferner können sie beim Durchsuchen bzw. Prüfen eines Agonisten oder eines Antagonisten eingesetzt werden.
Zusammensetzung
CL-L2s-Polynukleotide oder -Proteine werden möglicherweise in diagnostischen, prophylaktischen und therapeutischen Verfahren und für die Entwicklung von Reagenzien und für die Entwicklung von Arzneimitteln gegen verschiedene Arten von Krankheiten einschließlich bakterieller Infektionen und dergleichen eingesetzt.
Die pharmazeutische Zusammenstellung kann CL-L2s-Polynukleotide oder -Proteine, Substanzen, die die Aktivität oder die Aktivierung von CL-L2 Proteinen stimulieren oder hemmen, Substanzen, einschließlich Antikörper von CL-L2s-Proteinen und dergleichen (auf die sich im Folgenden als "CL-L2s betreffende Substanzen" bezogen wird) umfassen. Die CL-L2s betreffenden Substanzen können als Reinstoffe oder nach verschiedenen Behandlungen wie beispielsweise dem Lösen in Wasser oder dergleichen eingesetzt werden, wobei sie jedoch zu pharmazeutischen Erzeugnissen also Arzneimitteln und dergleichen vermischt werden können. In diesen Fällen kann die Menge der zu vermischenden Substanzen ad libitum bestimmt werden. Wird die Substanz für eine systemische Verabreichung formuliert, sind 0,001–50 Gew.-% und insbesondere 0,01–10 Gew.-% erlaubt. Ist die Menge geringer als 0,001%, ist keine ausreichende Wirkung der Lakrimation ermöglicht. Ist die Menge größer als 50%, können Eigenschaften wie Stabilität, Geschmack und dergleichen selbst verschlechtert sein.
Der Weg der Verabreichung kann je nach Bedarf unter der Verabreichung über die Schleimhäute, der transdermalen, intramuskulären, subkutanen, endorektalen, topischen, Okularen Verabreichung und dergleichen neben der oben beschriebenen oralen und intranvenösen Verabreichung ausgewählt werden.
Die CL-L2s betreffenden Substanzen können in einer Formulierung als Salz vorliegen. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen beispielsweise Salze einer Base, beispielsweise einer anorganischen Base, einer organischen Base und dergleichen, saure Zusatzsalze, beispielsweise von anorganischen Säuren, organischen Säuren, basischen oder sauren Aminosäuren. Anorganische Basen umfassen beispielsweise Alkalimetalle wie zum Beispiel Natrium, Kalium und dergleichen, Erdalkalimetalle wie beispielsweise Calcium, Magnesium und dergleichen, Aluminium, Ammonium und dergleichen. Organische Basen umfassen beispielsweise primäre Amine, wie beispielsweise Ethanolamin und dergleichen, sekundäre Amine, wie beispielsweise Diethylamin, Diethanolamin, Dicyclohexylamin, N,N'-Dibenzylethylendiamin und dergleichen, tertiäre Amine, wie beispielsweise Trimethylamin, Triethylamin, Pyrridin, Picolin, Triethanolamin und dergleichen. Anorganische Säuren umfassen beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Salpetersäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen. Organische Säuren umfassen beispielsweise Ameisensäure, Essigsäure, Milchsäure, Trifluoressigsäure, Fumarsäure, Oxalsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Benzoesäure, Zitronensäure, Bernsteinsäure, Apfelsäure, Methanschwefelsäure Ethanschwefelsäure, Benzolschwefelsäure, p-Toluensulfonsäure und dergleichen. Basische Aminosäuren umfassen beispielsweise Arginin, Lysin, Ornithin und dergleichen. Saure Aminosäuren umfassen beispielsweise Asparaginsäure, Glutaminsäure und dergleichen.
Beispielhafte Dosierungsarten für den Einsatz bei der oralen Verabreichung umfassen puderige Formulierungen, gekörnte Formulierungen, gekapselte Formulierungen, Pillen, Tabletten, Elixiere, Suspensionen, Emulsionen, Sirup und dergleichen, die ad libitium auswählt werden können. Darüber hinaus können solche Formulierungen verändert werden. Die Art und Weise dieser Veränderung kann auf eine Abgabekontrolle, eine Stabilisierung, eine vereinfachte Auflösung, ein Blockieren des Auslösens, eine gegenüber Magensäure resistente Umhüllung, auf die Vereinfachung der Absorption und dergleichen abzielen. Darüber hinaus umfassen beispielhafte Dosierungsformen für die intraorale topische Verabreichung kaubare Formulierungen, sublinguale Formulierungen, bukkale Formulierungen, Pastillen, Salben, Pflaster, flüssige Formulierungen und dergleichen, die ad libitium ausgewählt werden können. Darüber hinaus können solche Formulierungen modifiziert werden. Dies kann die kontrollierte Abgabe, die Stabilisierung, die Vereinfachung der Auflösung, das Hemmen der Auflösung, die gegenüber Magensäure resistente Umhüllung, die Vereinfachung der Absorption und dergleichen umfassen.
Im Zusammenhang mit dem oben beschriebenen Dosierungsarten können bekannte Arzneimittel-Liefersystem-(DDS)-Techniken verwendet werden. DDS-Formulierungen, auf die sich hier bezogen wird, umfassen Formulierungen zur anhaltenden Abgabe, topisch einsetzbare Formulierungen (Pastillen, bukkale Formulierungen, sublinguale Formulierungen), Formulierungen zur kontrollierten Arzneimittelabgabe, Formulierungen zur gegenüber Magensäure resistenten Abgabe, im Magen lösliche Formulierungen und dergleichen. Die beschriebenen Formulierungen sind so hergestellt, dass die zweckmäßigste Dosierungsform bereitgestellt ist, wobei der Verabreichungsweg, die Bioverträglichkeit, eine schädliche Wirkung und dergleichen berücksichtigt wurden.
Komponenten des DDS umfassen im Wesentlichen ein Arzneimittel, ein Modul zum Freisetzen des Arzneimittels, eine Beschichtung und ein Therapieprogramm. Genauer ausgedrückt werden Arzneimittel mit einer kurzen Lebensdauer bevorzugt, die eine schnelle Abnahme der Blutkonzentration ermöglichen, insbesondere nach dem Abschluss ihrer Freisetzung. Die Beschichtung reagiert vorzugsweise nicht mit dem Körpergewebe, an dem das Arzneimittel verabreicht wird. Darüber hinaus ist das Therapieprogramm so ausgelegt, dass die optimale Konzentration des Arzneimittels über eine vorbestimmte Zeitdauer hinweg aufrecht erhalten wird. Das Modul zum Freisetzen des Arzneimittels weist im Wesentlichen einen Arzneimittelspeicher, einen Abgabenkontrollteil, eine Energiequelle sowie eine Abgabenöffnung oder eine Abgabenfläche auf. Alle diese fundamentalen Komponenten sind nicht notwendiger Weise erforderlich, so dass der Zusatz, die Streichung oder dergleichen bei Bedarf durchgeführt werden kann, um die bestmögliche Art und Weise der Verabreichung auszuwählen.
Die beispielhaften Materialien, die für das DDS eingesetzt werden können, umfassen Polymere, Cyclodextrinderivate, Lecithin und dergleichen. Das Polymer kann unlösliche Polymere (Silikone, Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Ethylen-Vinylalkohol-Copolymer, Ethylcellulose, Zelluloseacetat und dergleichen), wasserlösliche Polymere und Hydroxylgel bildende Polymere (Polyacrylamid, Polyhydroxyethylmethacrylat in quervernetzter Form, Polyacryl in quervernetzter Form, Polyvinylalkohol, Polyethylenoxid, wasserlösliche Zellulosederivate, quervernetztes Poloxamer, Chitin, Chitosan und dergleichen), langsam lösliche Polymere (Ethylzellulose, einen Teilester des Methylvinylether-Maleinsäureanhydrid-Copolymers und dergleichen), im Magen lösliche Polymere (Hydroxylpropylmethyl-Zellulose, Hydroxylpropyl-Zellulose, Natrium-Carmellose, Macrogol, Polyvinylpyrrolidon, Dimethylaminoethylmethacrylat-methyl-methacrylat-Copolymer und dergleichen), gegenüber Magensäure resistente Polymere (Hydroxylpropylmethyl-Zellulose-Phtalat, Zelluloseacetat-Phtalat, Hydroxylpropylmethyl-Zelluloseacetat-Succinat, Carboxymethylethyl-Zellulose, Acrylsäure-Polymere und dergleichen) und biologisch abbaubare Polymere (unter Wärme koaguliertes oder quervernetztes Albumin, quervernetzte Gelatine, Kollagen, Fibrin, Polycyano-acrylat, Polyglycolsäure, Polymilchsäure, Poly-β-hydroxyessigsäure, Polycaprolacton und dergleichen) umfassen, die ad libitium auf Basis der Dosierungsform ausgewählt werden können.
Für die Steuerung der Arzneimittelabgabe können insbesondere Silikon, Ethylen-Vinylacetat-Copolymer, Ethylen-Vinylalkohol-Copolymer, ein Teilester des Methylvinylether-Maleinsäureanhydrid Copolymers ausgewählt werden. Zelluloseacetat kann als Mittel für eine osmotische Druckpumpe eingesetzt werden, Ethyl-Zellulose, Hydroxypropylmethyl-Zellulose, Hydroxypropyl-Zellulose und Methyl-Zellulose können als Material für eine Membran ausgewählt werden, die bei sich langsam auflösenden Formulierungen zum Einsatz gelangen kann. Quervernetzte Arten des Polyacryls können als Wirkstoff eingesetzt werden, der an Schleimhäuten bindet.
Darüber hinaus kann die Formulierung durch Zusatz von Lösungsmitteln, Hilfstoffen, Beschichtungswirkstoffen, Basen, bindenden Wirkstoffen, Gleitmitteln, zersetzenden Mitteln, die Löslichkeit fördernden Wirkstoffen, suspendierenden Wirkstoffen, Verdickungsmitteln, emulsierenden Wirkstoffen, stabilisierenden Wirkstoffen, filternden (buffering) Wirkstoffen, isotonierenden Wirkstoffen, Beruhigungsmitteln, Konservierungsmitteln, Geschmacksmitteln, Duftmitteln, Färbungsmitteln und dergleichen in Übereinstimmung mit ihrer Dosierungsform, (bekannte Dosierungsformen, wie beispielsweise Formen für die orale Verabreichung, die Injektion, Zäpfchen und dergleichen) hergestellt werden.
Nachfolgend sind besondere Beispiele verdeutlicht. Diese Beispiele sollen die Erfindung jedoch in keinerlei Weise begrenzen.

[Lösungsmittel] gereinigtes Wasser, Wasser für die Injektion, Saline, Erdnussöl, Ethanol, Glycerol;
[Arzneimittel] Stärke, Laktose, Glukose, Saccharose, kristalline Zellulose, Calciumsulfat, Calciumcarbonat, Talk, Titanoxid, Trehalose, Xylitol;
[Beschichtungswirkstoff] Saccharose, Gelatine, Zellulose-acetat-phtalat und Polymere wie oben beschrieben;
[Base] Vaseline, pflanzliche Öle, Macrogol, Base für eine Öl-in-Wasser-Emulsion, Base für eine Wasser-in-Öl-Emulsion
[bindender Wirkstoff] natürliche Polymerverbindungen, wie Stärke und deren Derivate, Zellulose und deren Derivate, Gelatine, Natriumalginat, Tragantgummi, Gummiarabikum und dergleichen; synthetische Polymere, wie Polyvinylpyrrolidon und dergleichen, Dextrin, Hydroxypropylstärke;
[Gleitmittel] Stearinsäure und deren Salze, Talk, Wachse, Weizenstärke, Macrogol, hydriertes Pflanzenöl, Saccharosefettsäureester, Polyethylenglycol;
[zerfallende Hilfsmittel] Stärke und deren Derivate, Agar, Gelatinepulver, Natriumbicarbonat, Zellulose und deren Derivate, Carmellose-Calcium, Hydroxypropylstärke, Carboxymethyl-Zellulose und Salze und Derivate davon, wenig substituierte Hydroxypropyl-Zellulose;
[lösende Wirkstoffe] Cyklodextrin, Ethanol, Propylenglycol, Polyethylenglycol;
[suspendierende Wirkstoffe] Gummiarabikum, Tragantgummi, Natriumalginat, Aluminiummonostearat, Zitronensäure, verschiedene oberflächenaktive Stoffe;
[Verdickungsmittel] Carmellose-Natrium, Polyvinylpyrrolidon, Methyl-Zellulose, Hydroxypropylmethyl-Zellulose, Polyvinylalkohol, Tragantgummi, Gummiarabikum, Natriumalginat;
[emulisierende Wirkstoffe] Gummiarabikum, Cholesterol, Tragantgummi, Methyl-Zellulose, verschiedene oberflächenaktive Stoffe, Lecithin;
[stabilisierende Wirkstoffe] Natriumbisulfit, Ascorbinsäure, Tocopherol, chelatbildende Wirkstoffe, inerte Gase, Reduktionsmittel;
[puffernde Wirkstoffe] Natriumhydrogenphosphat, Natriumacetat, Borsäure;
[isotonische Wirkstoffe] Natriumchlorid, Glukose;
[Beruhigungsmittel] Prokainhydrochlorid, Lidokain, Benzylalkohol.
[Konservierungsmittel] Benzoesäure und deren Salze, p-hydroxy-Benzoesäureester, Chlorbutanol, Invertseife, Benzylalkohol, Phenol, Thimerosal;
[Aromastoffe] Saccharose, Saccharin, Glycyrrhizaextrakt, Sorbitol, Xylitol, Glycerol;
[Duftstoffe] Apfelsinenschalentinktur, Rosenöl.
[Färbemittel] Wasserlöslicher essbarer Farbstoff, ein so genannter "Lake Dye".

[Beispiele]
Neues Collectin gemäß der vorliegenden Erfindung wird anhand der nachfolgenden nicht begrenzenden (illustrativen) Anschauungsbeispielen genauer verdeutlicht. Die Erfindung soll jedoch durch die Beispiele nicht begrenzt sein.
Insbesondere sind nachfolgend das Recherchieren in einer EST-Datenbank (Beispiel 1); das Durchsuchen eines neuen menschlichen Collectins in einer cDNA-Bibliothek, die von der menschlichen Leber durch PCR abgeleitet wurde und das Sequenzieren der Basensequenz (Beispiel 2); das Durchsuchen eines neuen menschlichen Collectins aus einer cDNA-Bibliothek mit so genannten Cap-Stellen, die von der menschlichen Niere durch PCR abgeleitet wurde und das Sequenzieren der Basensequenz (Beispiel 3); das Suchen nach Homologen des neuen Collectins (Beispiel 4); der Erhalt neuer Collectin-cDNA von der Maus (Beispiel 5); die Analyse der Verteilung der Expression des neuen menschlichen Collectins in menschlichen Geweben (Beispiel 6); die genetische Analyse des neuen menschlichen Collectins, (Beispiel 7); die Analyse der Verteilung der Expression des neuen Collectins CL-L2-1 und CL-L2-2 in menschlichen Geweben (Beispiel 8); die Bildung eines Expressionsvektors pcDNA3.1/Myc-His(+)-CL-L2-1,2 des neuen Collectins (Beispiel 9); die Erzeugung eines Zellenstranges, der das neue Collectin stabil exprimiert (Beispiel 10) und die Analyse der Zuckerspezifität des neuen Collectins (Beispiel 11) beschrieben.
Die Beispiele 5 und 11 betreffen keine Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung.
Beispiel 1: Suche in der EST-Datenbank
Die 2 und 3 verdeutlichen die Homologie der Aminosäurenreste bekannter Collectine, d. h. menschliches MBP, menschliches SP-A, menschliches SP-D und Collectin-CL-L1, die von der menschlichen Leber abgeleitet und die kürzlich von dem hiesigen Erfinder erfolgreich isoliert wurden (siehe ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung mit der Nummer Hei 11-206377) und die eine gemeinsame in 1 verdeutlichte Struktur aufweisen. In der Figur sind Anteile der Aminosäurereste, die als Homologe erkannt wurden, in einem Kasten dargestellt. Die Aminosäurensequenz des CRD (Erkennungsbereich der Kohlenwasserstoffketten), die für die Lektinaktivität (SEQ ID NR: 14) von CL-L1 in dieser Figur verantwortlich ist, wurde zum Recherchieren in der EST-(so genannte Expressed Sequence Tags)-Datenbank verwendet.
Als Ergebnis wurden verschiedene Daten erhalten, die hoch homologe Aminosäurensequenz umfassen. Die Aminosäurensequenzen der auf diese Weise erhaltenen Daten wurden in einer GenBank/EST-Datenbank recherchiert und daraufhin untersucht, ob diese aus einer bekannten oder einer unbekannten Substanz waren. Folglich konnte ein Datum (H30455, von Thymus abgeleitet) erhalten werden, das eine Homologie aufwies, jedoch eine unbekannte Datensequenz umfasste. Unter Verwendung der Basensequenz des auf diese Weise erhalten EST-Klons wurde die Recherche in der EST-Datenbank erneut durchgeführt, wobei neun Daten (Zugangsnummern: AA558494, das von Keimzellen stammt; AA582499, das von der Niere stammt; AI 420986, das von der Prostata stammt; AA742449, das von Keimzellen stammt; AA 954657, das von der Niere stammt; AA908360, das von den Eierstöcken stammt; AI 264145, das von der Niere abstammt; AA 089855, das vom dem Herzen stammt; AA 456055, die von der Melanozyte, einem schwangeren Uterus, einem fötalen Herzen stammt) erhalten wurden, bei denen identische Basensequenz erkannt wurden. Bei allen Daten handelte es sich um Klone, die einen Teil einer Basensequenz eines identischen neuen Collectins aufwiesen.
Beispiel 2:
Durchsuchen einer cDNA-Bibliothek die von der menschlichen Leber mittels PCR abgeleitet ist, und Seguenzieren der Basensequenz.
Im Hinblick auf die oben beschriebenen Basensequenzen der 10 Klone wurde eine übereinstimmende Sequenz (SEQ ID NR. 15) erzeugt. Anschließend wurden zwei Primer in Aufwärtsrichtung: CAP1 (5'-agattttattgtatagcttgg-3' (SEQ ID NR:16)) und CAP2 (5'-ctgggtaataattacataatg-3' (SEQ ID NR: 17)) auf der Basis einer übereinstimmenden Sequenz, die im Beispiel 1 erhalten wurde, und Primer, die einem Teil eines Bereichs eines Vektors von der cDNA-Bibliothek entsprachen, die von der menschlichen Leber abgeleitet wurde, nämlich λTriplEX-F1 (5'-aagctccgagatctggacgag-3' (SEQ ID NR: 18)) und λTriplEx-F2 (5'-ctcgggaagcgcgccattgtg-3' (SEQ ID NR: 19)), mittels 392A-DNA/RNA-Synthesizer, der von PE Applied Biosystem Inc. hergestellt wurde, synthetisiert, wobei das Durchsuchen mittels PCR wie weiter unten beschrieben durchgeführt wurde, um oberhalb von 5' einen Bereich einer neuen menschlichen Collectin-cDNA (siehe 4) zu klonen.
Zunächst wurde eine PCR unter Verwendung einer cDNA-Bibliothek durchgeführt, die vom Menschen (Clontech Co.) als Vorlage für das Durchsuchen mittels PCR abgeleitet wurde. Die Reaktionsmischung enthielt LA PCR-Puffer II (frei von Mg²⁺), 2,5 mM MgCl₂, jeweils 1 µL von 200 µM dATP, dCTP, dGTP und dTTP (die alle von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt wurden), eine cDNA-Bibliothek, die von der menschlichen Leber (Clontech Co.) abgleitet wurde, 0,5 µM λTriplEx-F1-Primer und 0,5 µM CAP1-Primer bis zu einem Gesamtvolumen 50 µL. Die PCR wurde mit einer Folge von 35 Zyklen einer Wärmedenaturierung bei 95°C über 20 Sekunden hinweg, Temperieren bei 60°C über 20 Sekunden hinweg und einer Verlängerungsreaktion bei 72°C über 90 Sekunden hinweg durchgeführt; und darüber hinaus fand vor der sich wiederholenden Reaktion eine Wärmedenaturierung bei 95°C über 5 Minuten hinweg und eine abschließende Verlängerungsreaktion bei 72°C über 5 Minuten hinweg statt. Nach dem Abschluss der ersten PCR wurde eine zweite PCR durchgeführt. Das Produkt der ersten PCR wurde mit 1 µL als Vorlage verwendet und die eingesetzten Primer waren λTriplEx-F2 Primer und CAP2-Primer. Die Reaktion wurde mit einer ähnlichen Reaktionsabfolge und einem ähnlichen Programm wie die erste PCR durchgeführt mit der Ausnahme, dass die Anzahl der Zyklen 25 Zyklen betrug. Die oben erwähnte PCR wurde mit dem GeneAmp-PCR-System9700 durchgeführt, das von PE Applied Biosystems Inc. hergestellt wurde. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Produkt wurde durch eine Agarose-Gel-Elektrophorese nachgewiesen, von dem Gel entfernt und schließlich bei –80°C 10 Minuten lang eingefroren. Nach dem Zentrifugieren bei 15.000 upm über 10 Minuten hinweg wurde das Produkt durch Ethanolfällung des Überstandes gereinigt.
Das gereinigte DNA-Fragment wurde in einen pT7Blue-Vektor eingefügt, der von Novagen CO. hergestellt wurde, wobei der Vektor in geeignete Zellen, XL1-Blauzellen, transformiert wurde. Die so erhaltenen Zellen wurden in einem LB-Medium (100 µg/mL Ampicillin) kultiviert, gefolgt von einer Extraktion des Plasmids mit einem alkalischen SDS-Verfahren, um deren Basensequenz mit dem Reaktionssatz „Big Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready" und dem Sequenzierer ABI PRISM 377 zu sequenzieren, der von Applied Biosystems Inc. hergestellt wurde. Die eingesetzten Primer umfassten M13 Universal Primer (5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3' (SEQ ID NR:20)) und M13 Reverse Primer (5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NR: 21)), die beide auf eine ähnliche Art und Weise synthetisiert wurden wie der CAP1-Primer. Es konnte gezeigt werden, dass die auf diese Weise erhaltene Basensequenz um 575 Basen länger war als der CAP2-Primer, wobei an dessen 3'-Ende zum N-terminalen Ende hin gestartet wurde (ein Bereich, welcher den Aminosäurenpositionen 68–271 von CL-L2-1-ORF, gezeigt in 4, oder den Aminosäurenpositionen 42–245 von CL-L2-2 ORF entsprach). Es wurde jedoch ein leichter Unterschied im 5'-Endbereich der Basensequenz der übereinstimmenden Sequenz der EST gefunden, die im Beispiel 1 erhalten wurde.
Beispiel 3: Durchsuchen eines neuen menschlichen Collectins von einer cDNA-Bibliothek mit Cap-Stellen, die von der menschlichen Niere mittels PCR erhalten wurde, und Seguenzieren der Basensequenz
Um den 5'-Endbereich zu klonen, der neben der gemäß Beispiel 2 erhaltenen Basensequenz eine Transkriptionsinitialisierungsstelle enthielt, wurde ein Durchsuchen unter Verwendung einer PCR, wobei eine cDNA mit Cap-Stellen eingesetzt wurde, so durchgeführt, dass zwei Primer aufwärts synthetisiert wurden, nämlich CAP3 (5'-ggtcctatgtcaccggaatc-3' (SEQ ID NR: 22)) und CAP4 (5'-ttccatgacgacccacactgc-3' (SEQ ID NR: 23)) und zwar mit einem 392A-DNA/RNA-Synthetisierer, der von PE Applied Biosystems Inc. hergestellt wurde, auf der Basis der Basensequenz, die im Beispiel 2 erhalten wurde (4).
Zunächst wurde eine PCR mit einer Cap-Stellen aufweisenden cDNA von einer menschlichen Niere, die von NIPPON GENE Co., Ltd hergestellt wurde, unter Verwendung eines 1RC2-Primers (5'-caaggtacgccacagcgtatg-3' (SEQ ID NR: 24)) und eines CAP3-Primers durchgeführt. Die Reaktionsmischung enthielt LA PCR-Puffer II (frei von Mg²⁺), 2,5 mM MgCl₂, jeweils 1 µL von 200 µM dATP, dCTP, dGTP und dTTP (die jeweils von Takara Shuzo Co., Ltd., hergestellt wurden) eine cDNA mit Cap-Stellen von der menschlichen Niere, 0,5 µM 1RC2-Primer (die beide von NIPPON GENE Co., Ltd. hergestellt wurden) und 0,5 µM CAP3-Primer bis zu einem Gesamtvolumen von 50 µL. Das Programm der PCR umfasste 35 Zyklen einer Wärmedenaturierung bei 95°C über 20 Sekunden hinweg, ein Temperieren bei 60°C über 20 Sekunden hinweg und eine Verlängerungsreaktion bei 72°C über 60 Sekunden hinweg. Darüber hinaus wurde vor der sich wiederholenden Reaktion eine Wärmedenaturierung bei 95°C über 5 Minuten hinweg und eine abschließende Verlängerungsreaktion bei 72°C über 10 Minuten hinweg durchgeführt. Nach der Beendigung der ersten PCR wurde eine zweite PCR durchgeführt. Das Produkt der ersten PCR wurde als Vorlage mit 1 µL verwendet, wobei die eingesetzten Primer einen angehängten 2RC2-Primer (5'-gtacgccacagcgtatgatgc-3' (SEQ ID NR: 25)) und einen CAP4-Primer umfassten. Die Reaktion wurde mit einer ähnlichen Reaktionszusammenstellung und einem ähnlichen Programm wie die erste PCR durchgeführt mit der Ausnahme, dass die Anzahl der Zyklen 25 Zyklen betrug. Die oben erwähnte PCR wurde mit GeneAmp-PCR-System9700 durchgeführt, die von PE Applied Biosystems Inc. hergestellt wurde. Das auf diese Weise erhaltene PCR-Produkt wurde mit einer Agarose-Gel-Elektrophorese nachgewiesen, von dem Gel entfernt und anschließend bei –80°C über 10 Minuten hinweg eingefroren. Nach dem Zentrifugieren bei 15.000 upm über 10 Minuten hinweg wurde das Produkt durch Ethanolfällung des Überstandes gereinigt.
Das gereinigte DNA-Fragment wurde in ein pT7Blue-Vektor eingefügt, der von Nuvagen Co hergestellt wurde, wobei der Vektor in geeignete Zellen, XL1-Blauzellen, eingefügt wurde. Die auf diese Weise erhaltenen Zellen wurden in einem LB-Medium (100 µg/mL Ampicillin) kultiviert, gefolgt von der Extraktion des Plasmids mit einem alkalischen SDS-Verfahren, um deren Basissequenz mit einem Reaktionsatz „BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready" und dem Sequenzierer ABI PRISM 377 zu sequenzieren, der von Applied Biosystems Inc. hergestellt wurde. Die eingesetzten Primer waren M13 Universal Primer (5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3' (SEQ ID NR:20)) und M13 Reverse Primer (5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NR: 21)). Es konnte herausgestellt werden, dass die auf diese Weise erhaltenen zwei Basensequenzen, eine Basensequenz mit 492 Basen mehr als die Basensequenz, die in dem Beispiel 2 in deren N-terminaler Richtung (SEQ ID NR: 1) erhalten wurde, und eine Basensequenz mit 274 Basen mehr als die Basensequenz, die in dem Beispiel 2 in deren N-terminaler Richtung erhalten wurde (SEQ ID NR: 3), aufwiesen.
Folglich wurden im Zusammenhang mit CL-L2 zwei cDNA erhalten, darunter eine cDNA mit einem ORF (offenen Leserahmen) von 813 Basen (SEQ ID NR: 1) und 271 Aminosäuren kodierend, die in der SEQ ID NR: 2 (CL-L2-1) dargestellt sind, und eine cDNA mit einem ORF (offenen Leserahmen) von 735 Basen (SEQ ID NR: 3) und 245 Aminosäuren kodierend, die in der SEQ ID NR: 4 (CL-L2-2) dargestellt sind.
Beispiel 4. Recherche der Homologie
Anschließend wurde eine Homologie-Recherche nach DNA und Aminosäuren in einer GenBank-Datenbank durchgeführt. Als Ergebnis konnte nachgewiesen werden, dass die erhaltene Aminosäurensequenz von einem neuen Protein abstammt, das sich von allen Collectinen, die bislang gefunden wurden, unterscheidet.
Die bislang bekannten Aminosäuresequenzen von drei unterschiedlichen Collectinarten (MPB, SP-A und SP-D) und Collectin-CL-L1, das von der menschlichen Leber abgeleitet und kürzlich erfolgreich von dem Erfinder selbst isoliert wurde (ungeprüfte japanische Patentveröffentlichung mit der Nummer Hei 11-206377), wurden mit der Aminosäurensequenz des Collektinstrukturteils des neuen Collectins gemäß der vorliegenden Erfindung verglichen. Die Ergebnisse sind in 5 und in 6 dargestellt. Ähnlich wie in den 2 und 3 sind die Anteile der Aminosäurenreste, die als Homologe erkannt wurden, in einem Kasten dargestellt. Anhand dieser Ausrichtung konnte gezeigt werden, dass das erhaltene neue Protein Homologien mit bekannten Collectinproteinen aufweist und dass dieses zur Familie der Collectine gehört.
Darüber hinaus wurde eine Mutation (SEQ ID NR.: 6), die von den Positionen 141–731 der mit der SEQ ID NR: 5 dargestellten Basensequenz kodiert wird, wobei die Aminosäuren 18–65 ausgelassen wurden, die mit der SEQ ID NR: 4 dargestellten Aminosäurensequenz aufgeführt sind, eine Mutation (SEQ ID NR: 8), die von den Positionen 141–803 der in SEQ ID NR: 7 dargestellten Basensequenz kodiert wird, wobei die Aminosäuren 18–41 in der mit der SEQ ID NR: 4 dargestellten Aminosäurensequenz ausgelassen wurden, und eine Mutation (SEQ ID NR: 10), die von den Positionen 141–803 der mit der SEQ ID NR: 9 dargestellten Basensequenz kodiert wird, wobei die Aminosäuren 42–65 der mit der SEQ ID NR: 4 dargestellten Aminosäurensequenz ausgelassen wurden, erhalten.
Beispiel 5: Erhalt von cDNA eines neuen Collectins der Maus
Auf ähnliche Art und Weise wie im Zusammenhang mit hCL-L2 konnte ein mCL-L2-Gen durch das Durchsuchen einer cDNA-Bibliothek einer Mausleber erhalten werden. Es konnte bestätigt werden, dass die erhaltenen cDNA-Klone von mCL-L2 einen ORF (offenen Leserahmen) mit 813 Basen (SEQ ID NR: 12) aufwiesen und 271 Aminosäuren der in der SEQ ID NR: 13 dargestellten Aminosäuren kodieren.
Beispiel 6: Analyse der Verteilung der Expression des neuen Collectins in menschlichen Geweben
Um die Expression des neuen Collectins in verschiedenen Geweben zu untersuchen, wurden Analysen mit Hilfe einer RT-PCR unternommen. Die RT-PCR wurde unter Verwendung von zwei Primern durchgeführt, die in der Lage waren eine cDNA-Sequenz zu vervielfältigen, die sich von dem so genannten Nackenbereich (neck region) bis zum Kohlenwasserstofferkennungsbereich des neuen Collectins erstreckte, nämlich RTF1 (5'-agattccggtgacataggacc-3' (SEQ ID NR: 26)) und RTR1 (5'-tggtctgggctctgtccctgc-3' (SEQ ID NR: 27), und unter Verwendung von zwei Primern, die in der Lage waren, einen Teil des β-Actin-Gens zu vervielfältigen, um dieses bei dem Vergleich der Mengen des exprimierten neuen Collectins in jedem der Gewebe zu nutzen, nämlich ein für menschliches β-Actin sensitiver Primer (5'-caagagatggccacggctgct-3' (SEQ ID NR: 28)) und ein gegenüber menschlichem β-Actin nicht sensitiver Primer (5''-tccttctgcatcctgtcggca-3' (SEQ ID NR: 29)). Alle diese Primer wurden auf ähnliche Art und Weise wie der CAP1-Primer zum Durchführen der RT-PCR synthetisiert.
Die RT-PCR wurde unter Verwendung eines RNA LA PCR-Satzes (AMV) Ver.1.1 (TAKARA Syuzo, Co.) durchgeführt, wobei jede RNA als Vorlage von mehreren menschlichen Geweben abstammte ((1) Gehirn, (2) Herz, (3) Niere, (4) Leber, (5) Lunge, (6) Luftröhre, (7) Knochenmark, (8) Kolon, (9) Dünndarm, (10) Milz, (11) Magen, (12) Thymus, (13) Milchdrüse, (14) Prostata, (15) Skelettmuskel, (16) Hoden, (17) Uterus, (18) Zerebellum, (19) Fötushirn, (20) Fötusleber, (21) Rückenmark, (22) Plazenta, (23) Nebenniere, (24) Pankreas, (25) Speicheldrüse und (26) Schilddrüse). Zunächst wurde eine reverse Transkriptionsreaktion mit der nachfolgenden Reaktionsmischung durchgeführt.
Die Reaktionsmischung enthielt 5 mM MgCl₂, 1 × RNA PCR-Puffer, 1 mM dNTP-Mischung, 1 U/µL RNase-Inhibitor und 2 µg RNA, wobei das Gesamtvolumen der Mischung mit RNase-freiem destilliertem Wasser auf 40 µl eingestellt wurde. Zur gleichen Zeit wurde eine Reaktionsmischung ohne reverse Transkriptase für eine Negativ-kontrolle hergerichtet. Die oben beschriebene Reaktionsmischung wurde in eine 0,2 ml Röhre gegeben und einer reversen Transkriptionsreaktion mit GeneAmp PCR-System9700 unterworfen, das von PE Applied Biosystems Inc. hergestellt wurde, wobei ein Zyklus 30 Minuten bei 42°C, 5 Minuten bei 99°C und 5 Minuten bei 5°C bedeutete. Das auf diese Weise erhaltene Produkt der reversen Transkriptionsreaktion wurde nachfolgend mit 10 µL für eine LA-PCR mit der folgenden Reaktionsmischung und mit 28 Zyklen beziehungsweise 35 Zyklen eingesetzt. Dazu wurden 2,5 mM MgCl₂, 1 × LA PCR-Puffer (frei von Mg²⁺), 2U TaKaRa LA Taq, 0,2 µM RTF1-Primer und 0,2 µM RTR1-Primer zugegeben, wobei die Mischung zum Erhalt eines Gesamtvolumens von 50 µL mit sterilisiertem destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 50µL eingestellt wurde. Die PCR wurde mit einem Programm durchgeführt, das 28 oder 35 Zyklen einer Wärmedenaturierung bei 95° C über 20 Sekunden hinweg, ein Temperieren bei 60° C über 20 Sekunden hinweg, eine Verlängerungsreaktion bei 72°C über 60 Sekunden hinweg und darüber hinaus vor den sich wiederholenden Reaktionen eine Wärmedenaturierung bei 95°C über 5 Minuten hinweg und eine abschließende Verlängerungsreaktion bei 72° C über 10 Minuten hinweg umfasst. Das Reaktionsprodukt wurde durch eine 1,5%ige Agarosegel-Elektrophorese getrennt, gefolgt von dem Benetzen mit einer Ethidiumbromid-Lösung (0,1 µg/mL), dem Überprüfen des Elektrophoresemusters mit Transilluminator und Identifizieren des exprimierten Gewebes. Um die in jedem der Gewebe exprimierten Mengen zu vergleichen, wurde eine RT-PCR durchgeführt, um einen Teil des β-Actins in jedem der Gewebe zu vervielfältigen, wobei eine Korrektur der RNA Menge durchgeführt wurde. Die RT-PCR wurde auf ähnliche Art und Weise wie das oben beschriebene Verfahren mit reverser Transkriptionsreaktion, PCR, durchgeführt, wobei eine Abschätzung durchgeführt wurde. Die Ergebnisse sind in 7 verdeutlicht, in der die Expression des neuen Collectins gemäß der vorliegenden Erfindung mittels einer PCR verdeutlicht ist, die intensiv mit 28 Zyklen aus Zellmaterial einer Niere (Spur 3) jedoch ebenso mit Zellmaterial einer Leber (Spur 4), eines Dünndarms (Spur 9), einer Thymus (Spur 12), einer fötalen Leber (Spur 20), von Rückenmark (Spur 21), einer Nebenniere (Spur 23), und einem Pankreas (Spur 24) durchgeführt wurde. Darüber hinaus konnte bezüglich einer PCR, die mit 35 Zyklen durchgeführt wurde, eine universelle Expression des neuen Collectins in allen untersuchten Geweben nachgewiesen werden, obwohl unterschiedliche Intensitäten der Expression beobachtet wurden.
Beispiel 7: Genetische Analyse des neuen Collectins
Auf der Basis der DNA Sequenz des erhaltenen neuen Collectins (hCL-L2-1 (SEQ ID NR: 1)) und mCL-L2) (SEQ ID NR: 12)), wurde ein Stammbaum aus genetischen Daten erzeugt, indem eine Analyse durchgeführt wurde, um die genetische Lage unter den bekannten Collectinen zu klären.
Die zur Analyse ausgewählten Collectine waren Proteine von verschiedenen Collectinfamilien, die in 8 verdeutlicht sind (in der Figur wurden CL-L1 und CL-P1 erfolgreich von den hier vertretenen Erfindern isoliert). Zahlreiche Ausrichtungen wurden mit dem Clustalw-Verfahren unter Verwendung eines Bereichs hergestellt, der einen Lektin-Bereich auf der Datenbasis beinhaltet, die durch die Recherche aller Aminosäurensequenzen von der GenBank-Datenbank erhalten wurde. Basierend auf den auf diese Weise erhaltenen zahlreichen Ausrichtungen wurde ein Stammbaum aus genetischen Daten mit dem Paketprogramm Phylip-Version 3.57c unter Verwendung des N-J-Verfahrens (ein Nachbarn verbindendes Verfahren) erzeugt.
Folglich wurde angenommen, dass SP-D, CL-43 vom Rind und Conglutinin vom Rind einen Cluster ausbilden, während MPB beziehungsweise SP-A separate Cluster ausbilden, wobei jedoch das erfindungsgemäße neue Collectin keinem dieser Cluster angehörte, jedoch dem gleichen Cluster wie CL-L1 zuzuordnen war. Dementsprechend wurde angenommen, dass das erfindungsgemäße neue Collectin ein Homologon von CL-L1 ist.
Beispiel 8: Analyse der Verteilung der Expression des neuen Collectins (CL-L2-1 und CL-L2-2) in menschlichen Geweben
Um die Expression von CL-L2-1 (SEQ ID NR: 1) und CL-L2-2 (SEQ ID NR: 3) in verschiedenen Geweben zu untersuchen, wurde mittels der RT PCR-Technik eine Analyse durchgeführt. Die RT PCR wurde unter Verwendung von Primern durchgeführt, die in der Lage waren den gesamten übertragenen Bereich von CL-L2-1 wie erhalten (RTF2 (5'-atgagggggaatctggccctggtg-3' (SEQ ID NR: 30)), RTR2 (5'-catgttctccttgtcaaactcac-3' (SEQ ID NR: 31))) zu vervielfältigen, von Primern, die in der Lage waren den gesamten übertragenen Bereich von CL-L2-2 wie erhalten (RTF3 (5'-atgtggtgggtgcctccgagtc-3' (SEQ ID NR: 32)), RTR2 (SEQ ID NR: 31)) zu vervielfältigen und von zwei menschlichen β-Actin-Primern, die in Beispiel 6 verwendet wurden und die in der Lage waren, einen Teil des β-Actin-Gens zu vervielfältigen, um dieses bei einem Vergleich der Mengen des exprimierten neuen Collectins in jedem der Gewebe zu verwenden. Alle diese Primer wurden auf ähnliche Art und Weise wie der CAP1-Primer synthetisiert, wobei eine RT-PCR auf ähnliche Art und Weise wie in Beispiel 6 durchgeführt wurde.
Die Ergebnisse sind in 9 verdeutlicht, die eine intensive Expression von CL-L2-1 (SEQ ID NR: 1) gemäß der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei die PCR mit 28 Zyklen bei einer Niere (Spur 3), einer Leber (Spur 4), einem Dünndarm (Spur 9), dem Thymus (Spur 12), einer fötalen Leber (Spur 20), einem Rückenmark (Spur 21), der Nebenniere (Spur 23), dem Pankreas (Spur 24) durchgeführt wurde. Darüber hinaus konnte hinsichtlich der PCR, die mit 35 Zyklen durchgeführt wurde, eine universelle Expression von CL-L2-1 (SEQ ID NR: 1) in allen getesteten Geweben nachgewiesen werden, obwohl eine sich verändernde Intensität der Expression beobachtet wurde. Darüber hinaus wurde herausgefunden, dass CL-L2-2 (SEQ ID NR: 3) intensiv in der Leber (Spur 3) exprimiert wurde und zwar bei einer PCR, die mit 28 Zyklen durchgeführt wurde, während bei einer PCR, die mit 35 Zyklen durchgeführt wurde, es in der Leber (Spur 3) sowie in der Prostata (Spur 14), dem Hoden (Spur 16), dem Rückenmark (Spur 21) und in der Plazenta (Spur 22) exprimiert wurde.
Darüber hinaus wurden mehrere vervielfältigte Fragmente in den RT PCR-Produkten von CL-L2-1 und von CL-L2-2, wie in 9 gezeigt, gefunden. Diese Bereiche wurden von dem Gel gelöst und durch ein chemisches Verfahren wie in Beispiel 2 gereinigt, also durch Einfrieren bei –80°C über 10 Min. hinweg, Zentrifugieren bei 15000 upm über 10 Minuten hinweg gefolgt von einer Ausfällung des Überstandes mit Ethanol. Das gereinigte DNA Fragment wurde in einen pT7Blue-Vektor eingefügt, der von Novagen Co. hergestellt wurde, wobei der so erhaltene Vektor in geeignete Zellen, XL1-Blauzellen, transformiert wurde. Das Transformierte wurde in einem LB Medium (100 µg/ml Ampicillin) kultiviert und das so erhaltene Plasmid durch ein alkalisches SDS-Verfahren extrahiert. Die Basensequenz wurde mit dem Reaktionssatz BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready und dem ABI PRISM 377 Sequenzierer, der von PE Applied Biosystems Inc. hergestellt wurde, nachgewiesen. Die eingesetzten Primer waren M13 Universal Primer (5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3' (SEQ ID NR: 20)) und M13 reverser Primer (5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NR: 21)).
Die erhaltene Basensequenz war die gleiche wie bei CL-L2-2v1, CL-L2-2v2 und CL-L2-2v3, die Varianten des in dem Beispiel 2 erhaltenen CL-L2-2 (SEQ ID NR: 3) darstellen. Darüber hinaus wurden auf Grund eines unterschiedlichen Spleißens der mRNA drei Proteine als CL-L2-1 erhalten, das mit der SEQ ID NR: 2 dargestellt ist. Auf diese wird sich im Folgenden mit CL-L2-1v1 (SEQ ID NR: 36, 37), CL-L2-1v2 (SEQ ID NR: 38, 39) und CL-L2 1v3 (SEQ ID NR: 40, 41) bezogen. CL-L2-1v1 weist Fehlstellen der Aminosäurenpositionen 44–91 von CL-L2-1 auf, das mit der SEQ ID NR: 2 dargestellt ist (Fehlstellen der Basenpositionen 394–537 von CL-L2-1, dargestellt mit der SEQ ID NR: 1), dessen Aminosäurensequenz von den Positionen 265–933 einer Basensequenz kodiert wird, die mit der SEQ ID NR: 36 (SEQ ID NR: 59) dargestellt ist. CL-L2-1v2 weist Fehlstellen der Aminosäurenpositionen 44–67 von CL-L2-1 auf, das mit der SEQ ID NR: 2 dargestellt ist (Fehlstellen der Basenpositionen 394–465 von CL-L2-1, dargestellt in SEQ ID NR: 1), dessen Aminosäurensequenz von den Positionen 265–1005 einer mit der SEQ ID NR: 38 (SEQ ID NR: 60) dargestellten Basensequenz kodiert ist. CL-L2-1v3 weist Fehlstellen der Aminosäurenpositionen 68–91 von CL-L2-1 auf, das mit der SEQ ID NR: 2 dargstellt ist (Fehlstellen der Basenpositionen 466–537 des mit der als SEQ ID NR: 1 dargestellten CL-L2-1), dessen Aminosäurensequenz durch die Positionen 265–1005 einer mit der als SEQ ID NR: 40 (SEQ ID NR: 61) dargestellten Basensequenz kodiert wird. Darüber hinaus kann ein mCL-L2-2 Gen auf eine ähnliche Art und Weise wie in Beispiel 4 erhalten werden.
Beispiel 9: Bildung des Expressionsvektors pcDNA3.1/Myc-His(+)A-CL-L2-1,2 des neuen Collectins
Ein übertragener Bereich von CL-L2-1 (SEQ ID NR: 1) wurde durch Einsatz eines CL-L2-1F Primers (5'-gggaagcttcgatcaggatgagggggaatctggccctggtg-3' (SEQ ID NR:33)) und eines CL-L2-1R Primers (5'-gggctcgagcatgttctccttgtcaaactcac-3' (SEQ ID NR: 34)) durch PCR (Takara Thermal Cycler MP hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit einer cDNA-Bibliothek vervielfältigt, die von einer menschlichen Niere als Vorlage abgeleitet wurde. Darüber hinaus wurde ein übertragener Bereich des neuen Collectins (SEQ ID NR: 3) unter Einsatz eines CL-L2-2F Primers (5'-gggaagcttccagcacaatgtggtgggtgcctccgagtc-3' (SEQ ID NR: 35)) und eines CL-L2-1R Primers (SEQ ID NR: 34) durch PCR mit einer cDNA Bibliothek vervielfältigt, die von der menschlichen Niere als Vorlage abgeleitet wurde. Die auf diese Weise erhaltene CL-L2-1-cDNA wurde an einen T7Blau-T-Vektor (hergestellt von Novagen Co.) gebunden und in Escherichia coli XLI-Blue transformiert. Ein CL-L2-1-cDNA enthaltendes Plasmid wurde von dem erhaltenen Klon gereinigt. Nach der Bestätigung der Basensequenz des erhaltenen Plasmids mit einem Sequenzierer wurde das Plasmid fehlerfrei durch die Verdauungsenyzme Hind III und Xho I zersetzt und an den pcDNA 3.1/Myc-His(+)A-Vektor (herstellt durch Invitrogen Co,.) gebunden, der von den gleichen Enzymen zersetzt wurde, und gereinigt. Nachdem das gebundene Plasmid in Escherichia coli XLI-Blue transformiert wurde, wurde das erhaltene Klon kultiviert. Das Plasmid wurde anschließend gereinigt, um einen Expressionsvektor pcDNA3.1/Myc-His(+)A-CL-L2-1,2 zu ergeben. Gleichzeitig wurden auf ähnliche Art und Weise Expressionsvektoren für Varianten von CL-L2-1, und CL-L2-2 (SEQ ID NR: 5, SEQ ID NR: 7, SEQ ID NR: 9, SEQ ID NR: 36, SEQ ID NR: 38 und SEQ ID NR: 40) erzeugt.
Beispiel 10: Herstellung eines Zellstranges, der stabil neues Collectin exprimiert
Eine transiente Expression wurde durch Cotransfektion des in Beispiel 9 erhaltenen Vektors pcDNA3.1/Myc-His(+)A-CL-L2-1 und des pEGFP-F Vektors (hergestellt von Clontech Co..) in CHO Zellen unter Verwendung von LIPOFECTAMINE 2000 (LF 2000) Reagenz (hergestellt von GIBCO BRL Co.) durchgeführt. Eine 0,5 ml Lösung des LF 2000 Reagenz (LF2000 Reagenz 30 µL, Nutrient Mixture F-12 Ham (Ham's F12 Medium (hergestellt von Sigma Co.))) wurde zunächst hergestellt und bei Raumtemperatur 5 Minuten lang inkubiert. Anschließend wurden 0,5 ml einer Vektorlösung (pcDNA 3.1/Myc-His(+)A-CL-L2-1,2: 7,5 µg, pEGFP-F Vektor, 2,5 µg, Ham's F-12 Medium) damit vermischt, gefolgt von einer Inkubation über 20 Minuten hinweg. Anschließend wurde die Lösung CHO Zellen zugegeben, die in einem 25 cm² Kolben mit 5 mL von Ham's-F-12 Medium, das 5%FCS enthielt, zu einer hohen Dichte kultiviert waren. Nach der Inkubation bei 37°C über 4 Stunden hinweg in der Anwesenheit von 5% CO₂, wurde das Medium durch ein Fleischmedium ersetzt, gefolgt von einer Inkubation bei 37°C über 20 Stunden hinweg in der Anwesenheit von 5% CO₂. Als nächstes wurde das Medium durch Ham's-F-12 Medium, das 5% FCS, 0,4 mg/ml Geniticin (hergestellt durch GIBCO BRL Co.) enthielt, ersetzt, wobei anschließend 10 Tage lang kultiviert wurde. Bei diesem Verfahren wurde der Ersatz des Mediums einmal durchgeführt.
Auf Grund dieser Selektion über 10 Tage hinweg konnten nur die transformierten Zellen überleben und sich vermehren, wobei jedoch die nicht transformierten Zellen abgestorben waren. Um hoch exprimierende Zellen von den erhaltenen transformierten Zellen zu erhalten, wurde ein Sortiervorgang mit einem Zellensortierer (hergstellt von Becton Dickinson Co.) mit der Fluoreszenz von GFP als Markierer durchgeführt. Nach dem zweimaligen Waschen der transformierten Zellen in einem 25 cm² Kolben mit 5 mL PBS(-) wurden die Zellen mit 0,3 mL einer 0,02%igen EDTA-Lösung (hergestellt von Nakarai Tesc KK) abgelöst. Die Zellen wurden in 10ml PBS(-) suspendiert und anschließend bei 200 × g über 7 Minuten hinweg bei 4°C zur Entfernung des Überstandes zentrifugiert. Die übrig gebliebenen Zellen wurden in 0,5 ml von 2%igem FCS/PBS(-) unter Erhalt einer Sortierprobe suspendiert. Die Probe wurde durch ein 5 ml Röhrchen geschickt, das mit einer Zellenabscheiderkappe (hergestellt von Becton Dickinson Co.) ausgerüstet war, und anschließend in einen Zellensortierer gegeben. Die CHO-Zellen, die keiner Transformation ausgesetzt wurden, und die auf ähnliche Art und Weise behandelt wurden, wurden als Vergleichszellen verwendet. Entsprechend wurde eine Probe mit einer Fluoreszenzintensität ausgewählt, die zehnmal größer war als diejenige der Vergleichsprobe. Die Zellen wurde auf Kultivierungsplatten mit 96 Kammern verteilt, wobei die Kammern jeweils 100 µl von Ham's-F-12 Medium enthielten (enthaltend 5% FCS, 0,4 mg/ml Geneticin), um jede Kammer mit einer einzigen Zelle zu beladen. Nachdem die Zellen bei 37°C in der Anwesenheit von 5% CO₂ über eine Woche hinweg kultiviert wurden, wurden über 100 µl eines Kultivierungsmediums hinzugefügt, gefolgt von einer zusätzlichen Kultivierung über eine weitere Woche hinweg. Ein unter Selektion mit Geneticin vermehrter Klon wurde in zwei Teile aufgeteilt, die Durchgängen auf Kultivierplatten mit 12 Kammern und mit 24 Kammern ausgesetzt wurden. Bei den Durchgängen wurden Klone ausgeschlossen, die durch eine Vermehrung in einer Kammer erhalten wurden, in der 2 oder mehr Zellen vorlagen, wobei die Zellen für die Zellenkultivierplatten mit 12 Kammern und mit 24 Kammern mit einem Verhältnis 9:1 ausplattiert wurden. Die Zellen wurden bei 37°C in der Anwesenheit von 5% CO₂ kultiviert, bis die Zellen in der Platte mit 12 Kammern die höchste Dichte aufwiesen. Anschließend wurden 200 µL des Überstandes der Kultur auf einer Immobilon-P Membran (hergestellt von Millipore Co., Ltd) unter Verwendung eines Bio-Dot Mikrofiltrations-Apparates (hergestellt von BIO-RAD Co, Ltd.) punktgerastert, wobei die Membran in einer Lösung eines Anti-Myc-Antikörpers (herstellt von Invitorogen Co.;) in 0,05% Tween 20/TBS Puffer (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd) 5000fach verdünnt bei Raumtemperatur über eine Stunde hinweg inkubiert wurde. Anschließend wurde die Membran mit 100 ml 0,05%Tween 20/TBS Puffer bei Raumtemperatur über 20 Minuten hinweg dreimal gewaschen, gefolgt von einer weiteren Inkubation in einer Lösung von anti-IgG-HRP (hergstellt von Chemicon Co., Ltd) in 0,05%Tween 20/TBS Puffer 5000fach verdünnt bei Raumtemperatur über eine Stunde hinweg. Anschließend wurde die Membran mit 100 ml 0,05%Tween 20/TBS Puffer bei Raumtemperatur über 20 Minuten hinweg dreimal gewaschen, gefolgt von einem Nachweis unter Verwendung des TMB Membran-Peroxidase-Substrat-Systems (hergestellt von Funakoshi KK). Nach einer Bestätigung der Klone durch eine intensive Farbentwicklung wurden die Zellen in den entsprechenden Kammern der Platte mit 24 Kammern als stabil exprimierende Zellenstämme (CHO/CL-L2-1) identifiziert.
Beispiel 11: Analyse der Spezifität der Zuckerbindung des neuen Collectins
Ein Liter des Kulturüberstandes der stabil exprimierenden Zellenstämme des neuen Collectins (CHO/CL-L2-1), die in Beispiel 10 erzeugt wurden, wurde unter Verwendung von VIVAPORE10 (hergestellt von Funakoshi KK) auf 50 ml konzentriert, wobei anschließend 200 µl von Ni-NTA-Agarose (hergestellt von Quiagen Co., Ltd) hinzugefügt wurden. Das neue Collectin wurde an Ni-NTA Agarose durch Inkubation mit der Mischung unter Schütteln bei 4°C über Nacht gebunden. Die Ni-NTA-Agarose wurde in Poly-Prep-Chromatographie-Säulen (hergestellt von BIO-RAD Co., Ltd) gegeben und anschließend mit 5 ml einer 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazol und 0,05% Tween20 (pH 8,0) dreimal gewaschen und schließlich fünfmal mit 200 µl einer 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, 20 mM Imidazole, 0,05% Tween20 (pH 8.0) unter Erhalt von gereinigtem Collectin ausgewaschen. Das neue Collectin wurde quantitativ bestimmt und zur Analyse der Zuckerspezifität verwendet.
Insbesondere wurden 1 µg des gereinigten neuen Collectins auf einer Immobilon-P Membran (hergestellt von Milipore Co., Ltd) punktgerastert, um Punkte in einer Anzahl zu ergeben, die den Typen der Zuckerkettenproben entsprachen, die zur Ermittlung der Bindungspezifität untersucht wurden, wobei der Bio-Dot-Microfiltration-Apparat (hergestellt von B10-RAD Co. Ltd.) verwendet wurde. Jeder Punkt wurde anschließend zum Erhalt eines 1 cm großen Quadrates geschnitten und in so genanntes Block Ace (hergestellt von Dai Nippon Pharmaceutical Co., Ltd) eingetaucht und bei Raumtemperatur eine Stunde lang inkubiert. Anschließend wurde die Membran mit 0,05% Tween20, 5 mM CaCl₂, TBS Puffer dreimal gewaschen und anschließend mit jeder Zuckerkettenprobenlösung (siehe 10), die mit 5 mM CaCl₂, TBS Puffer zum Erhalt von 1 µg/ml verdünnt wurde, bei Raumtemperatur über eine Stunde hinweg inkubiert. Anschließend wurden die Membranen wieder mit 0,05% Tween20, 5 mM CaCl₂, TBS Puffer dreimal gewaschen. Anschließend wurde die Membran in einer Lösung von Streptabvidin-biotinylated HRP (hergestellt von Amersham Co.), die in 0,05% Tween20, 5 mM CaCl₂, TBS Puffer 1000fach verdünnt wurde, bei Raumtemperatur über 30 Minuten hinweg inkubiert, wobei anschließend mit 0,05% Tween20, 5 mM CaCl₂, TBS Puffer dreimal gewaschen und ein Nachweis unter Verwendung von TMB Membran Peroxidase-Substrat-System (hergestellt von Funakoshi KK) durchgeführt wurde. Wie in 10 gezeigt ist, hat das neue Collectin aktiv an Mannose, Fucose, N-Acetylgalactosamin, N-Acetylneuraminsäure und Mannose-6-Phosphorsäure gebunden.
Da das CL-L2s-Protein der vorliegenden Erfindung eine Collectin-Struktur aufweist, wird davon ausgegangen, dass dieses eine Substanz ist, welche die charakteristischen Eigenschaften solcher Strukturen aufweist. Daher kann es bei der Aufklärung von Mechanismen der fundamentalen Immunologie, bei der Aufklärung von Mechanismen der Entwicklung einer breiten Palette von Krankheiten, wie beispielsweise bakteriellen Infektionen, bei der Diagnostik, bei deren prophylaktischen und therapeutischen Verfahren sowie bei der Entwicklung von Reagenzien und Arzneimitteln hierfür verwendet werden. Liste der Sequenzen

Claims

Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 245 Aminosäuren, die in den Aminosäurepositionen 1–245 von SEQ ID NO: 4 angeordnet sind.
Ein Polynukleotid, das eine Aminosäuresequenz kodiert, die in den Aminosäurepositionen 1–245 von SEQ ID NO: 4 angeordnet sind.
Ein Polynukleotid nach Anspruch 2, wobei die Basensequenz in SEQ ID NO: 46 angeordnet ist.
Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 197 Aminosäuren, die in den Aminosäurepositionen 1–197 von SEQ ID NO: 6 angeordnet sind.
Ein Polynukledotid, das eine Aminosäuresequenz, die in den Aminosäurepositionen 1–197 von SEQ ID NO: 6 angeordnet sind, kodiert.
Ein Polynukleotid nach Anspruch 5, wobei die Basensequenz in SEQ ID NO: 55 angeordnet ist.
Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 221 Aminosäuren, die in den Aminosäurepositionen 1–221 von SEQ ID NO: 8 angeordnet sind.
Ein Polynukleotid, das eine Aminosäuresequenz, die in den Aminosäurepositionen 1–221 von SEQ ID NO: 8 angeordnet sind, kodiert.
Ein Polynukleotid nach Anspruch 8, wobei die Basensequenz in SEQ ID NO: 56 dargestellt ist.
Ein Protein mit einer Aminosäuresequenz bestehend aus 221 Aminosäuren, die in den Aminosäurepositionen 1–221 von SEQ ID NO: 10 dargestellt sind.
Ein Polynukleotid, das eine Aminosäuresequenz, die in den Aminosäurepositionen 1–221 von SEQ ID NO: 10 angeordnet sind, kodiert.
Ein Polynukleotid nach Anspruch 11, wobei die Basensequenz in SEQ ID NO: 57 dargestellt ist.
Ein Vektor mit einem Polynukleotid nach einem der Ansprüche 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 oder 12.
Eine Zelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 13 derart transformiert ist, um darin die Expression des Polynukleotids nach einem der Ansprüche 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 oder 12 zu erlauben.
Ein Verfahren zum Herstellen eines Proteins, wobei das Verfahren die Schritte des Kultivierens einer Zelle nach Anspruch 14 und Sammelns des so produzierten hCL-L2s-Proteins umfasst.
Ein Verfahren zum Screenen eines Medikaments, wobei das Protein nach Anspruch 1, 4, 7 oder 10 verwendet wird.
Die Zelle nach Anspruch 14, wobei die Zelle eine Escherichia coli-Zelle, eine tierische Zelle oder eine Insektenzelle ist.