ES2281413T3 - Nuevas colectinas. - Google Patents

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ES2281413T3 ES01922014T ES01922014T ES2281413T3 ES 2281413 T3 ES2281413 T3 ES 2281413T3 ES 01922014 T ES01922014 T ES 01922014T ES 01922014 T ES01922014 T ES 01922014T ES 2281413 T3 ES2281413 T3 ES 2281413T3
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Nobutaka Wakamiya
Hiroyuki Keshi
Katsuki Ohtani
Takashi Sakamoto
Yuichiro Kishi
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Abstract

Una proteína que comprende una secuencia amino-acídica que consiste en 245 aminoácidos expuestos en la posición aminoacídica 1-245 de la SEQ ID NO: 4.

Description

Nuevas colectinas.
Campo del invento
El presente invento se refiere a aislar colectinas humanas (aquí referidas como "hCL-L2", genes y proteínas). El presente invento se refiere además a métodos para la producción y uso de las mismas. Adicionalmente, el presente invento se refiere a métodos para cribar fármacos usando CL-L2s. Por otra parte, el presente invento también se refiere a los vectores de expresión que comprenden genes CL-L2 y células transformadas que fueron transformadas con el vector de expresión.
Antecedentes del invento
Los sistemas de complemento que juegan un papel importante en un mecanismo de defensa corporal se conoce que incluyen: una ruta clásica en la cual una inmunoglobulina sirve como una molécula de reconocimiento seguida por la activación de C1 que es el primer componente del complemento; y una ruta alternativa en la que C3, que es el tercer componente del complemento, es directamente acoplado a sustancias extrañas tales como bacterias. Además de estas rutas de la activación del complemento, se ha ilustrado en los últimos años una ruta de lectina, en la que una proteína de unión a manosa (aquí referida como "MBP"), que es una lectina sérica, activa el sistema de complemento a través del reconocimiento directo de y acoplándose a una cadena hidrocarbonada sobre la superficie de la sustancia extraña (Sato, T y otros, Int. Immunol., 6, 665-669, 1994).
MPB es una lectina de tipo C que se une específicamente a la manosa, N-acetilglucosamina y similares en presencia de Ca, cuya estructura comprende un domino de tipo colágeno que contiene al menos un (Gly-Xaa-Yaa)n, y el dominio de reconocimiento de cadena hidrocarbonada (CRD). De modo similar a MBP, las lectinas que tienen un dominio de tipo colágeno y CRD son genéricamente llamadas colectinas (Malhotora, R y otros, Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992), que incluye la colectina 43 (CL-43), tensioactivo A (SP-A), tensioactivo D (SP-D), conglutinina bovina (BKg) y similares, además de MBP. La colectina tiene una actividad opsonizante, que se cree que participa en una inmunidad fundamental frente a una variedad de microorganismos tales como bacterias y virus (Kawasaki, N. y otros, J. Biochem., 106, 483-489, 1989; Ikeda, K y otros, J. Biol. Chem., 262, 7451-7454, 1987; Ohta, M. y otros, J. Biol. Chem., 265, 1980-1984, 1990; Summerfield, J. A., y otros, Lancet, 345, 886, 1995).
Estas colectinas se conoce que están constituidas de una estructura básica que contiene dominios característicos tales como (1) CRD y (2) dominios de tipo colágeno y similares como se muestra en la Fig. 1(a) (Malhortra y otros, Eur. J. Immunol., 22, 1437-1445, 1992). Esta estructura básica forma una subunidad a través de la composición de una triple hélice en el dominio de tipo colágeno, y así estas subunidades forman además una estructura oligomérica tal como un trímero, tetrámero, hexámero y similares.
Recientemente, las colectinas se ha sugerido que participan en la respuesta inmune no específica, por ejemplo, se documento que juegan por ejemplo, un papel importante en neutralizar y excluir diversos microorganismos en niños que tienen anticuerpos maternos insuficientes provenientes de la madre o que tienen un sistema de defensa específico que se desarrolló de modo insuficiente (Super y otros, Lancet, 2, 1236-1239, 1989). Por otro lado, se han documentado los resultados de la investigación implicando el papel de estas colectinas en el sistema de defensa corporal, que por ejemplo, sugiere que los hospedadores se vuelvan más susceptibles a infecciones a través de la concentración reducida de MPB en sangre resultantes de la mutación genética de MBP (Sumiya y otros, Lance, 337, 1569-1570, 1991). Además, se documentó que el contenido en MBP sérica muestra un nivel reducido tras el fallo de la opsonización (Madsen, H.O. y otros, Immuno genetics, 40, 37-44, 1994), mientras que las infecciones bacterianas tienen lugar fácilmente (Garred, P. y otros, Lancet, 346, 941-943, 1995). Por lo tanto, puede considerarse que MBP juega un papel importante en el sistema inmune.
Los presentes inventores encontraron previamente que BKg y MPB inhiben infecciones por virus de influenza (gripe) A de los tipos H1 y H3 así como la actividad de hemaglutinación (Wakamiya y otros, Glycoconjugate J., 8, 235, 1991; Wakamiya y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm., 187, 1270-1278, 1992). A partir de ahí, se obtuvo un clon de cADN que codifica BKg, y la relevancia entre BKg y SP-D y similares ha sido también encontrada (Suzuki y otros, Biochem. Biophys. Res. Comm., 191, 335-342, 1993).
Por consiguiente, las colectinas son sustancias de las que se espera la utilidad en la elucidación de los mecanismos de defensa corporal y su utilidad como sustancias biológicamente activas. Así, el hallazgo de nuevas especies moleculares pertenecientes a la familia puede contribuir en gran medida en diversos campos médicos y campos biológicos además de a la terapia de enfermedades infecciosas.
Descripción del invento
El objeto del presente invento es proporcionar materiales que pueden ser utilizados en la elucidación de mecanismos de inmunidad fundamental; en la elucidación de mecanismos del desarrollo de una amplia variedad de enfermedades tales como infecciones bacterianas; en el diagnóstico, métodos profilácticos y terapéuticos de los mismos; y para el desarrollo de reactivos y fármacos para los mismos.
Por consiguiente, los aspectos proporcionados por el presente invento son como se describen a continuación.
(1) Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que consiste en 245 aminoácidos dispuestos en la posición aminoacídica 1-245 de la SEQ ID NO: 4.
(2) Un polinucleótido dispuesto en la SEQ ID NO: 46 (correspondiente a la secuencia de bases dispuesta en la posición de la base 141-875 de la SEQ ID NO: 3); un polinucleótido que codifica una secuencia aminoacídica dispuesta en la posición aminoacídica 1-245 de la SEQ ID NO: 4
(3) Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que consiste en 197 aminoácidos dispuestos en la posición aminoacídica 1-197 de la SEQ ID NO: 6.
(4) Un polinucleótido dispuesto en la SEQ ID NO: 55 (correspondiente a una secuencia de bases dispuestas en la posición de bases 141-731 de la SEQ ID NO: 5); un polinucleótido que codifica una secuencia aminoacídica dispuesta en la posición aminoacídica 1-197 de la SEQ ID NO: 6.
(5) Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que consiste en 221 aminoácidos dispuestos en la posición aminoacídica 1-221 de la SEQ ID NO: 8.
(6) Un polinucleótido dispuesto en la SEQ ID NO: 56 (correspondiente a una secuencia de bases dispuesta en la posición de bases 141-803 de la SEQ ID NO: 7); un polinucleótido que codifica una secuencia aminoacídica dispuesta en la posición aminoacídica 1-221 de la SEQ ID NO: 8.
(7) Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que consiste en 221 aminoácidos dispuestos en la posición aminoacídica 1-221 de la SEQ ID NO: 10.
(8) Un polinucleótido dispuesto en la SEQ ID NO: 57 (correspondiente a una secuencia de bases dispuestas en la posición de bases 141-803 de la SEQ ID NO: 9); un polinucleótido que codifica una secuencia aminoacídica dispuesta en la posición aminoacídica 1-221 de la SEQ ID NO: 10.
(9) Un vector que comprende un polinucleótido según (2), (4), (6), u (8);
(10) Una célula transformada que lleva un polinucleótido según (2), (4), (6), u (8) a manera de permitir la expresión;
(11) un proceso para la producción de una proteína que comprende las etapas de cultivar una célula según (10);
(12) Un proceso para cribar un fármaco en el que la proteína según (1), (3), (5) o (7) es usada.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un dibujo esquemático que ilustra una estructura básica (a) de las colectinas principales documentadas hasta este momento y una visión general de la proteína (MBP, SP-A y SP-D).
La Fig. 2 es un dibujo que ilustra una mitad procedente de un alineamiento de secuencias aminoacídica de cuatro tipos de colectinas documentadas hasta este momento.
La Fig. 3 es un dibujo que ilustra la otra mitad del alineamiento a la de la Fig. 2.
La Fig. 4 describe dibujos (a) y (b) que muestran cada cebador empleado para la determinación de la secuencia de la nueva colectina del presente invento, y la nueva colectina obtenida de ese modo.
La Fig. 5 es un dibujo que ilustra una mitad precedente de un alineamiento de secuencias aminoacídicas de cuatro tipos de colectinas documentadas hasta este momento y una colectina adicional (hCL-L2-1).
La Fig. 6 es un dibujo que ilustra la mitad posterior del alineamiento de la Fig. 5.
La Fig. 7 muestra los resultados de análisis de distribución de mARN en diversos tejidos humanos que demuestran la distribución tisular de la colectina hCL-L2.
La Fig. 8 muestra un árbol filogenético de diversas colectinas.
La Fig. 9 muestra resultados de análisis de distribución de mARN en diversos tejidos humanos que demuestran la distribución tisular de la colectina hCL-L2-1 y hCL-L2-2 del presente invento.
La Fig. 10 es un dibujo esquemático que ilustra unas características de unión al azúcar de la colectina hCL-L2-1.
Mejor realización para llevar a cabo el invento
Los presentes inventores clonaron con éxito genes de colectinas humanas y murinas (hCL-L2-1 y mCL-L2). Un CRD (posición aminoacídica 113-271 de las SEQ ID NOs: 2 y 13, posición aminoacídica 87-245 de la SEQ ID NO: 4), que se cree que participa en inmunidad fundamental, y un dominio de tipo colágeno (la posición aminoacídica 41- 112 de las SEQ ID NOs: 2 y 13, la posición aminoacídica 18-86 de la SEQ ID NO:4) que tiene la secuencia de (Gly-Xaa-Yaa)n estuvieron presentes en el extremo C-terminal de la nueva CL-L2.
Por otro lado, dos tipos de proteínas (CL-L2-1 y CL-L2-2) que tienen diferentes secuencias aminoacídicas N-terminales fueron encontradas para hCL-L2 como se muestra en la Fig. 4. Específicamente, loa aminoácidos N-terminales de CL-L2-1 (posición 1-43) expuestos en la SEQ ID NO: 2 y aminoácidos N-terminales de CL-L2-2 (posición 1-17) expuestos en la SEQ ID NO: 4 fueron diferentes, mientras que el resto fueron idénticos. Además, aunque la posición de 1-43 de aminoácidos N-terminal de CL-L2-1 contuvieron una secuencia señal y una espiral de un dominio de colágeno y similar, no hubo ni una secuencia señal ni una espiral de un dominio del tipo colágeno en la posición 1-17 del aminoácido N-terminal de CL-L2-2.
Además, existieron tres tipos de proteínas correspondientes a CL-L2-2, que resultaron de un corte y empalme alternativo de mARN. Esos son referidos como un CL-L2-2v1 (SEQ ID NO: 5, 6), CL-L2-2v2 (SEQ ID NO: 7, 8) y CL-L2-2v3 (SEQ ID NO: 9, 10). CL-L2-2v1 es una forma derivada de CL-L2-2 expuesta en la SEQ ID NO: 4 con deleción de la posición aminoacídica desde 18 a 65 (es decir, deleción de la posición de bases desde 192 hasta 335 de CL-L2-2 expuesta en la SEQ ID NO: 3); CL-L2-2v2 es una forma derivada de CL-L2-2 expuesta en la SEQ ID NO: 4 con deleción de la posición aminoacídica desde 18 hasta 41 (es decir, deleción de la posición de bases desde 192 hasta 263 de CL-L2-2 expuestas en la SEQ ID NO: 3); y CL-L2-2V3 es una forma derivada desde CL-L2-2 expuesta en la SEQ ID NO: 4 con la deleción de la posición aminoacídica desde 42 hasta 65 (es decir, deleción de la posición de bases desde 264 hasta 335 de CL-L2-2 expuesta en la SEQ ID NO: 3). Estos tres tipos de proteínas resultaron todos de cortes y empalmes diferenciales de CL-L2-2 dentro del dominio de tipo colágeno de los mismos.
El gen hCL-12 usado aquí incluye hCL-L2-1 expuesto en la SEQ ID NO: 1, hCL-L2-2 expuesto en la SEQ ID NO: 3, hCL-L2-2v1 expuesto en la SEQ ID NO: 5, hCL-L2-2v2 expuesto en la SEQ ID NO: 7, hCL-L2-2v3 expuesto en la SEQ ID NO: 9, hCL-L2-1v1 expuesto en la SEQ ID NO: 36, hCL-L2-1v2 expuesto en la SEQ ID NO: 38, h hCL-L2-1v3 expuesto en la SEQ ID NO: 40 respectivamente, a menos que se afirme de otra manera. La proteína hCL-L2 usada aquí incluye hCL-L2-1 expuesta en la SEQ ID NO: 2, hCL-L2-2 expuesta en la SEQ ID NO: 4: hCL-L2-2v1 expuesta en la SEQ ID NO: 6, hCL-L2-2v2 expuesta en la SEQ ID NO: 8, hCL-L2-2v3 expuesta en la SEQ ID NO: 10, hCL-L2-1v1 expuesta en la SEQ ID NO: 37, hCL-L2-1v2 expuesta en la SEQ ID NO: 39, y hCL-L2-1v3 expuesta en la SEQ ID NO: 41 respectivamente, a menos que se diga de otra manera.
La secuencia aminoacídica de hCL-L2-2 expuesta en la SEQ ID NO: 4 (posición aminoacídica 1-245) representa una proteína que consiste en 245 aminoácidos, y así la secuencia de bases que codifica la misma (SEQ ID NO: 46) consiste en 735 bases. Las secuencias característica aminoacídicas tales como las del dominio de tipo colágeno, un dominio CRD y similares estuvieron presentes en la secuencia. La secuencia de bases que codifican esta proteína está expuesta en la SEQ ID NO: 3.
La secuencia aminoacídica de hCL-L2-2v1 expuesta en la SEQ ID NO: 6 (posición aminoacídica 1-197) representa una proteína que consiste en 197 aminoácidos, y así la secuencia de bases que codifica para la misma (SEQ ID NO: 55) consiste en 591 bases. Las secuencias aminoacídicas características tales como las del dominio tipo colágeno, un dominio CRD y similares estuvieron presentes en la secuencia. La secuencia de bases que codifican esta proteína está expuesta en la SEQ ID NO: 5.
La secuencia de aminoácidos de hCL-L2-2v2 expuesta en la SEQ ID NO: 8 (posición aminoacídica 1-221) representa una proteína que consiste en 221 aminoácidos, y así la secuencia de bases que codifican la misma (SEQ ID NO: 56) consiste en 663 bases. Las secuencias aminoacídicas características tales como las de un dominio de tipo colágeno, un dominio CRD y similares estuvieron presente en la secuencia. La secuencia de bases que codifica esta proteína está expuesta en la SEQ ID NO: 7.
La secuencia aminoacídica de hCL-L2-2v3 expuesta en la SEQ ID NO: 10 (aminoácidos en posición 1-221) representa una proteína que consiste en 221 aminoácidos, y así la secuencia de bases que codifica para la misma (SEQ ID NO: 57) consiste en 663 bases. Las secuencias aminoacídicas características tales como las del dominio tipo colágeno, un dominio CRD y similares estuvieron presentes en la secuencia. La secuencia de bases que codifica esta proteína está expuesta en la SEQ ID NO: 9.
La aplicación describe fragmentos derivados de la secuencia aminoacídica de CL-L2s descritos anteriormente, que pueden incluir por ejemplo, un dominio extracelular, un dominio intracelular, un dominio transmembrana, un dominio tipo colágeno, un dominio CRD, un dominio de tipo colectina, un dominio hidrofóbico (un dominio transmembrana y similares), un dominio hidrofílico (dominios distintos de dominios hidrofóbicos), y similares, así como fragmentos obtenidos mediante la fusión de estos fragmentos.
En la secuencia aminoacídica de hCL-L2-2 expuesto en la SEQ ID NO: 4, fragmentos ejemplares pueden incluir un fragmento que comprende aminoácidos de aproximadamente la posición 18 a 245 que forman el dominio CRD y un dominio de tipo colágeno, y un fragmento que comprende aminoácidos de aproximadamente desde la posición 18 hasta 86 que forman un dominio de tipo colágeno; en la secuencia aminoacídica de hCL-L2-2v1 expuesta en la SEQ ID NO: 6, fragmentos ejemplares pueden incluir: un fragmento que comprende aminoácidos de aproximadamente desde la posición 18 hasta 197 que forman un dominio CRD y un dominio de tipo colágeno, un fragmento que comprende aminoácidos de aproximadamente desde la posición 18 hasta 38 que forman un dominio de tipo colágeno; en la secuencia aminoacídica de hCL-l2-2v2 expuesta en la SEQ ID NO: 8, fragmentos ejemplares pueden incluir: un fragmento que comprende aminoácidos de aproximadamente desde la posición 18 hasta la 221 que forma un dominio CRD y un dominio de tipo colágeno, un fragmento que comprende aminoácidos de aproximadamente desde la posición 18 hasta la 62 que forma un dominio de tipo colágeno; en la secuencia aminoacídica de hCL-L2-2v3 expuesta en la SEQ ID NO: 10, fragmentos ejemplares pueden incluir: un fragmento que comprende aminoácidos de aproximadamente desde la posición 18 hasta la 221 que forma un dominio CRD y un dominio de tipo colágeno, un fragmento que comprende aminoácidos de aproximadamente desde la posición 18 hasta 62 que forman un dominio de tipo colágeno.
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Proceso para obtener genes CL-L2
Genes CL-L2 según el presente invento pueden ser los obtenidos a través de cualquier proceso. Por ejemplo, la secuencia de bases que codifica CL-L2 del presente invento pueden ser obtenida preparando mARN a partir de células que expresan la proteína, y convirtiéndola en un ADN de doble hebra mediante una técnica convencional. Para la preparación de mARN, el método de cloruro cálcico isotiocianato de guanidinio (Chirwin, y otros, Biorchemistry, 18, 5294, 1979) y similares pueden ser empleados. Para la preparación de ARN poli (A)+ de ARN total, soportes unidos con oligo(dT), por ejemplo, cromatografía de afinidad en la que partículas de sefarosa o latex son usadas, pueden ser empleadas. cADN de doble hebra pueden ser obtenido usando el ARN así obtenido descrito consecuentemente como un molde para tratar con transcriptasa inversa, usando oligo(dT) que es complementario a la cadena poli(A) presente en el extremo 3'-terminal, o un cebador al azar o un oligonucleótido correspondiente a una parte de la secuencia aminoacídica de CL-L2 como un cebador (Mol. Cell Biol., 2, 161, 1982; Mol. Cell Biol., 3, 280, 1983; Gene, 25, 263, 1983); y tratando así la hebra de cADN resultante con por ejemplo, RNasa H de E. coli, ADN polimerasa I de E. coli, ADN ligasa de E. coli para alterar en la hebra de ADN. Una librería de cADN puede ser producida incorporando este cADN en un vector plasmídico, un vector fago o un vector cósmido para transformar E. coli, o tranfectando en E. coli siguiendo un empaquetado in vitro.
El vector plasmídico que puede ser usado aquí no está particularmente limitado siempre y cuando pueda ser replicado y mantenido en el hospedante. El vector fago no está particularmente limitado siempre y cuando pueda proliferar en el hospedante. Los vectores de clonación incluyen, por ejemplo, pBR322, pUC19, \lambdagt10, \lambdagt11 y similares. Por otro lado, tras someter a un cribado inmunológico, el vector tiene preferiblemente un promotor que permite la expresión de un gen CL-L2s en el hospedante.
Para incorporar el cADN en un plásmido, el proceso de Maniatis y otros (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición) y similares puede servir como referencia. Además, para incorporar cADN en un vector fago, el proceso descrito en Hyunh y otros (ADN cloning, a practical approach, 1, 49, 1985) y similares pueden servir como referencia.
Como proceso para introducir el vector de expresión descrito anteriormente en células hospedantes, pueden estar implicados métodos como por ejemplo, transfección mediante el método de la lipopoliamina, método del DEAE dextrano, método Hanahan, método de lipofectina, método de fosfato cálcico; microinyección, y electroporación y similares (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición). El empaquetamiento in vitro puede ser fácilmente efectuado usando kits disponibles comercialmente (manufacturados por Stratagene, o Amersham).
El proceso para el aislamiento de cADN que codifica una proteína CL-L2 a partir de una librería de cADN preparada como se describe anteriormente puede implicar un proceso general, que puede ser usado en combinación, para el cribado de cADN. Por ejemplo, se produce una sonda marcada con ^{32}P, y un clon que contiene el cADN deseado puede ser cribado mediante un método de hibridación de colonias (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72, 3961, 1975), o un método de hibridación en placa (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory, 2, 108, 1989). Además, un clon puede ser seleccionado mediante un método de PCR. Adicionalmente, el clon deseado puede ser seleccionado a través del uso de un anticuerpo que reconoce CL-L2 cuando una librería de cADN es producida usando un vector que puede expresar cADN.
Además, cuando un gen CL-L2 es aislado de células que expresan genes CL-L2, por ejemplo, las células que los expresan son disueltas usando SDS o proteinasa K, seguido por un tratamiento con fenol. El ARN no deseado es digerido con ribonucleasa. Así, el ADN resultante es digerido con enzimas de restricción, y los fragmentos de ADN son amplificados usando fagos o cósmidos para producir una librería. A partir de entonces, el clon deseado es seleccionado, y entonces un gen CL-L2 puede ser obtenido. La secuencia de bases del ADN obtenido consecuentemente puede ser determinada por un método Maxam-Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560, 1977) o por un método de Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463, 1977). El gen CL-L2s puede ser obtenido por corte del clon, como se obtuvo anteriormente.
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A través del uso del cebador sintetizado sobre la base de la secuencia de bases de CL-L2, la clonación puede ser también afectada por un método RT-PCR usando ARN poli (A)^{+} de las células que expresan el CL-L2s como plantilla. Además, el cADN deseado puede ser también obtenido por cribado directamente de la librería de cADN después de producir/sintetizar una sonda basada en la secuencia de bases del CL-L2s, no por medio de PCR. El gen del presente invento puede ser seleccionado de entre los genes obtenidos por los métodos descritos aquí anteriormente a través de la verificación de la secuencia de bases del gen. El gen del presente invento puede ser también producido según el proceso convencional en el que la síntesis química de un ácido nucleico, por ejemplo, el método fosfoimidita (Mattencci, M.D. y otros, J. Am. Chem. Soc., 130, 3185, 1981) o similares, es empleado.
Proceso para producir el vector de expresión
El presente invento también se refiere a un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos del invento. El vector no está limitado particularmente siempre y cuando pueda expresar la proteína CL-L2s, sin embargo, un vector plasmídico, un vector ARN, un vector de ADN, un vector de virus, un vector fago y similares pueden ser empleados. Específicamente, los ejemplos del mismo incluyen pBAD/His, pRSETA, pcADN2.1, pTrcHis2A, pYES2, pBlueBac4.5, pcADN3.1 o pSecTag2 fabricados por Invitrogen, pET o pBAC fabricados por Novagen Co., pGEM fabricado por Promega, pBluescriptII, pBs, Phagescript, pSG o pSV2CAT fabricado por Stratagene, o pGEX, pUC18/19, pBPV, pSVK3 o pSVL fabricado por Pharmacia Co.
La secuencia de cADN de CL-L2s ligada al vector de expresión está operativamente unida a un promotor. El promotor incluye, por ejemplo, un promotor fago \lambdaPL, E. coli lac, trp, promotor tac, promotor SV40 temprano y tardío, promotor T7 y T3, promotor LTR de retrovirus. Específicamente, el promotor para el uso en las células eucarióticas incluye el promotor CMV, el promotor HSV, el promotor SV40 temprano y tardío, el promotor LTR de retrovirus, el promotor RSV, el promotor metalotioneina. Además, el vector de expresión puede contener un marcador que permite la selección del hospedante transformado y un potenciador. Ejemplos del marcador incluyen el gen de la reductasa dihidrofolato, gen de resistencia a neomicina, gen de resistencia a la ampicilina y similares. Ejemplos de potenciador incluyen el potenciador SV40, promotor potenciador temprano de citomegalovirus, potenciador de adenovirus y similares.
Proceso para producir células transformadas
El presente invento proporciona además células transformadas que transportan una secuencia de bases del presente invento para permitir la expresión del mismo por medio del vector como se describe anteriormente que transporta la secuencia de bases. La célula hospedante para el uso como célula transformada en el presente invento puede preferentemente incluir células animales y células de insectos, sin embargo, pueden estar incluidas todas las células (los microorganismos pueden también estar incluidos), la cual puede expresar una proteína CL-L2s en el vector de expresión del presente invento.
Las células animales ejemplares o células de insectos del presente invento pueden respectivamente incluir células derivadas de humanos, o células derivadas de la mosca o del gusano de seda (Bómbix mor). Por ejemplo, las células CHO, las células COS, las células BHK, la células Vero, las células de mieloma, las células HEK293, las células HeLa, las células Jurkat, las células L de ratón, las células C127 de ratón, las células FM3A de ratón, las células de fibroblasto de ratón, osteoblastos, condrocitos, S2, Sf9, Sf21, High Five™ pueden ser incluidas. El microorganismo según el presente invento incluye Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae y similares. Para la introducción de un vector en dichos hospedantes, puede ser empleado el método como se describe anteriormente.
Las células que expresan CL-L2s del presente invento pueden ser usadas para analizar una ruta de la colectina implicada en enfermedades infecciosas, inmunización y similares. Además, esas células pueden ser utilizadas en la fabricación de una proteína CL-L2 o una proteína CL-L2 que tiene una cadena de carbohidratos. Las células pueden ser también utilizadas en el cribado con el propósito de obtener un agonista o un antagonista de la proteína CL-L2s.
El proceso para obtener la proteína
El presente invento también se refiere a un proceso para la producción de una proteína CL-L2 que comprende el cultivo de una célula transformada con la secuencia de bases del presente invento de acuerdo con lo anterior, y recoger las CL-L2s así producidas. El cultivo celular, el aislamiento de la proteína, y la purificación de la misma pueden cumplir con los procesos conocidos convencionalmente.
La proteína según el presente invento puede ser expresada como una proteína de fusión recombinante, que puede ser fácilmente aislada, purificada, y reconocida por sí misma. La proteína de fusión recombinante es una proteína expresada por adición de una cadena peptídica apropiada al extremo N terminal y/o al extremo C terminal de una proteína expresada de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína deseada. Para facilitar la purificación de la proteína expresada, la proteína puede ser expresada como una proteína de fusión que tiene una señal para la secreción extracelular. Además, la proteína puede ser obtenida de varios tipos de fuentes tales como células cultivadas, tejidos cultivados, células transformadas y similares usando métodos conocidos convencionalmente, por ejemplo, métodos de purificación conocidos incluyendo: desalado tal como la técnica de precipitación de sulfato amónico y similares; la técnica de filtración en gel usando Sephadex y similares; la técnica cromatográfica de intercambio de ión; la técnica cromatográfica hidrofóbica, la técnica cromatográfica en gel de tinción; la técnica de electroforesis; diálisis; la técnica de ultrafiltración; la técnica de afinidad cromatográfica; la técnica de cromatografía líquida de alto rendimiento; y similares.
Proceso de la utilización del gen
Las sondas para detectar el gen CL-L2s pueden ser especificadas en la base de la secuencia de bases expuesta bien en la SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 12, 36, 38 ó 40, SEQ ID NO: 48 (que corresponde a la posición de bases de 601-1077 de la SEQ ID NO: 1) o bien en la posición de ácidos nucleicos de 493-969 de la SEQ ID NO: 12. Alternativamente, los cebadores pueden ser especificados por la amplificación del ADN o del ARN que incluyen dicha secuencia base. Para especificar una sonda o un cebador basado en una secuencia dada esto es llevado a cabo ordinariamente por los profesionales especializados en esta técnica. Un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases específica puede ser obtenido a través de síntesis química. Cuando una etiqueta adecuada es añadida al oligonucleótido, puede ser utilizado para un ensayo de hibridación en varios formatos. Alternativamente, puede ser también utilizado en reacciones para síntesis de ácidos nucleicos tales como PCR. El oligonucleótido que es utilizado como un cebador es al menos 10 bases de longitud, y adaptable de 15 a 50 bases en longitud. Es deseable que el oligonucleótido que es usado como sonda sea desde 100 bases hasta su longitud máxima. Además, pueden ser también usados para el diagnóstico de enfermedades causadas por mutación de un gen CL-L2s porque pueden ser usados para detectar la mutación genética que codifica una proteína CL-L2s y para detectar SNP. Se espera que estén disponibles para el diagnostico de una variedad de enfermedades que incluyen por ejemplo, infecciones bacterianas y similares. Además, son también útiles para la terapia génica a través de la cual el gen CL-L2s es introducido en un cuerpo vivo para permitir la expresión del mismo.
Además, también es posible obtener una región promotora y una región potenciadora del gen CL-L2s que está presente en un genoma, basado en una secuencia de bases de cADN del CL-L2s proporcionado por el presente invento. En particular, estas regiones de control pueden ser obtenidas por métodos similares a esos descritos en la publicación de patente japonesa sin examinar N°. 6-181767; J. Immunol., 155, 2477, 1995; Proc. Natl. Acad. Sci, USA., 92, 3561, 1995 y similares. La región promotora referida aquí se refiere a una región de ADN que controla la expresión de un gen que existe aguas arriba de un sitio de inicio de la transcripción. La región potenciadora aquí se refiere a una región de ADN que potencia la expresión de un gen que existe en un intrón, una región 5' sin traducir, o una región 3' sin traducir.
Proceso de la utilización de la proteína
Las proteínas CL-L2s del presente invento pueden ser utilizadas en la elucidación de los mecanismos de inmunidad fundamental; en la elucidación de los mecanismos del desarrollo de una amplia variedad de enfermedades tales como infecciones bacterianas; en el diagnóstico, en métodos profilácticos y terapéuticos de las mismas; y para el desarrollo de reactivos y fármacos para las mismas. Además, pueden ser usados como un antígeno para producir anticuerpos frente a CL-L2s. Adicionalmente, pueden ser utilizados en los procesos de cribado de un agonista o un antagonista.
Composición
Los polinucleótidos o las proteínas CL-L2s son utilizados posiblemente en métodos de diagnóstico, profilácticos y terapéuticos, y para el desarrollo de reactivos y fármacos para diversos tipos de enfermedades que incluyen infecciones bacterianas y los similares.
La composición farmacéutica puede comprender polinucleótidos o proteínas CL-L2s, sustancias que estimulan o inhiben la actividad o la activación de la proteína CL-L2s, sustancias que incluyen anticuerpos contra la proteína CL-L2a y similares (de aquí en adelante, referido a "sustancia relacionada a los CL-L2s"). Las sustancias relacionadas a los CL-L2s pueden ser usadas solas, o después de ser sometidas a varios tipos de tratamiento como disolución en agua y similares, sin embargo, pueden ser usadas después de mezclarlas en los productos farmacéuticos, cuasi fármacos y similares. En estos casos, la cantidad de la sustancia a ser mezclada puede ser determinada ad libitum. Cuando la sustancia es formulada para la administración sistémica, 0,001-50% en peso, en particular, 0,01-10% en peso es permisible. Cuando la cantidad es menor del 0,001%, puede no ser permitida la acción suficiente de lagrimeo. Cuando la cantidad es mayor del 50%, las propiedades como la estabilidad, el aroma y la semejanza con la misma composición pueden ser deterioradas.
La ruta de administración puede ser seleccionada opcionalmente de entre la administración vía mucosa, administración transdérmica, administración intramuscular, administración subcutánea, administración endorectal, administración ocular tópica, y similares, en adición a la administración oral y la administración intravenosa descritos anteriormente.
La sustancia relacionada a los CL-L2s puede ser incluida en la formulación como una sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen por ejemplo, sales con base tales como base inorgánica, base orgánica y similares; sales ácidas de adición tales como las de ácido inorgánico, ácido orgánico, ácido de aminoácidos básicos o ácidos. Las bases inorgánicas incluyen por ejemplo, metales alcalino tal como el sodio, potasio y similares; metales alcalino-térreos tal como el calcio, magnesio y similares; aluminio, amonio y similares. Las bases orgánicas incluyen por ejemplo, aminas primarios tales como etanolamina y similares; aminas secundarias tales como dietilamina, dietanolamina, diciclohexilamina, N,N'-dibenciletilen-diamina y similares; aminas terciarias tales como trimetilamina, trietilamina, piridina, picolina, trietanolamina y similares. Los ácidos inorgánicos incluyen por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido nítrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y similares. Los ácidos orgánicos incluyen por ejemplo, ácido fórmico, ácido acético, ácido láctico, ácido trifluoroacético, ácido fumárico, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido benzoico, ácido cítrico, ácido succínico, ácido málico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido bencenosulfóico, ácido p-toluenosulfónico y similares. Los aminoácidos básicos incluyen por ejemplo, arginina, lisina, ornitina y similares. Los aminoácidos ácidos incluyen por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico y similares.
Ejemplos de formas de dosificación para el uso en administración oral incluyen formulaciones en polvo, formulaciones granuladas, formulaciones encapsuladas, pastillas, tabletas, elixires, suspensiones, emulsiones, jarabes y similares, los cuales pueden ser seleccionados ad libitum. Además, tales formulaciones pueden ser modificadas, lo cual puede implicar la liberación del testigo, estabilización, facilitación de la desintegración, el bloqueo de la desintegración, revestimiento entérico, facilidad de absorción y similares. Además, los ejemplos de formas de dosis para la administración tópica intraoral incluyen formulaciones masticadas, formulaciones sublinguales, formulaciones bucales, pastillas, pomadas, tiritas, formulaciones líquidas y similares, los cuales pueden ser seleccionados ad libitum. Además, tales formulaciones pueden ser modificadas, lo cual puede implicar la liberación del testigo, estabilización, facilitación de la desintegración, el bloqueo de desintegración, revestimiento 
\hbox{entérico, facilidad de absorción y similares.}
Las técnicas de sistema de suministro de fármacos (DDS) conocidas pueden ser aplicadas a formas de dosificación como se describe anteriormente. La formulación DDS referida aquí implica formulaciones de liberación sostenida, formulaciones aplicadas tópicamente (pastillas, formulaciones bucales, formulaciones sublinguales), formulaciones de liberación controlada de fármacos, formulaciones de revestimiento entérico, formulaciones solubles en el estómago y similares, las cuales son formulaciones que son preparadas de modo que la forma de dosificación más apropiada es conseguida teniendo en cuenta la ruta de administración, la biodisponibilidad, efectos adversos y similares.
Los componentes para el DDS comprenden esencialmente un fármaco, un módulo de liberación de fármaco, un revestimiento y un programa terapéutico. En detalle, es preferido el fármaco que tiene una vida media corta, lo cual permite una rápida disminución de la concentración de la sangre, particularmente tras el cese de la liberación del mismo. El revestimiento es preferiblemente no reactivo a los tejidos corporales en la parte en la que es administrado el fármaco. Además, el programa terapéutico es preferiblemente configurado de modo que la concentración de fármaco más óptima se mantiene durante el periodo predeterminado. El módulo de liberación del fármaco tiene sustancialmente un almacenaje del fármaco, una parte del testigo de liberación, una fuente de energía, y una apertura de liberación o una superficie de liberación. Todos estos componentes fundamentales no son requeridos necesariamente, y así la adición, supresión o similares pueden ser opcionalmente llevados a cabo para seleccionar el mejor modo.
Los ejemplos de materiales que pueden ser usados para el DDS incluyen polímeros, derivados de ciclodextrina, lecitina y similares. El polímero puede incluir polímeros insolubles (silicona, copolímero de acetato de viniletileno, copolímero de alcohol de viniletileno, etilcelulosa, acetato de celulosa y similares), los polímeros hidrosolubles y los polímeros que forman geles hidroxilo (poliacrilamida, forma entrecruzada de metacrilato polihidroxietilo, forma entrecruzada de poliacrilo, alcohol polivinilo, polietilenóxido, derivados de celulosa solubles en agua, poloxámero reticulado, quitina, quitosan y similares), los polímeros de disolución lenta (etilcelulosa, un copolímero de un éster parcial de anhídrido maleico-metilviniléter y similares), los polímeros solubles en el estómago (hidroxilpropilmetilcelulosa, hidroxilpropilcelulosa, carmelosa sódica, macrogol, polivinilpirrolidona, copolímero de netacrtilato de dimetilaminoetilo-metacrilato de metilo y similares), polímeros entéricos (ftalato de hidroxilpropilmetilcelulosa, ftalato de acetato de celulosa, succinato de acetato de hidroxilpropilmetilcelulosa, carboximetiletilcelulosa, polímeros de ácidos acrílicos y similares) polímeros biodegradables (coagulación por calor o albúmina entrecruzada, gelatina entrecruzada, colágeno, fibrina, policianoacrilato, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, ácido poli \beta-hidroxiacético, policaprolactona y similares), que pueden ser seleccionados ad libitum en base a la forma de dosificación.
En particular, la silicona, el copolímero etileno-acetato de vinilo, el copolímero etileno-alcohol de vinilo, un éster parcial del copolímero metilviniléter-anhídrido maleico pueden ser usados para el control de la liberación del fármaco; el acetato de celulosa puede ser usado como material de una bomba de presión osmótica; la etilcelulosa, la hidroxipropilmetilcelulosa, la hidroxipropilcelulosa, la metilcelulosa pueden ser usadas como un material de una membrana de formulaciones de disolución lenta; y la forma entrecruzada poliacrilo puede ser usada como un agente de unión a las mucosas.
Además, la formulación puede ser fabricada con la adición de disolventes, excipientes, agentes de revestimiento, bases, agentes de unión, lubricantes, desintegrantes, agentes solubilizantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, agentes emulsionantes, agentes estabilizantes, agentes tamponadores, agentes isotonizantes, agente calmantes, agentes conservantes, agentes aromatizantes, agentes de fragancia, agentes colorantes y similares conforme a su forma de dosis (forma de dosis conocida tal como formas para administración oral, inyección, supositorio y similares).
Aunque los ejemplos específicos son ilustrados respectivamente más abajo, estos ejemplos no deberían ser interpretados como limitación del presente invento.
[disolvente] agua purificada, agua para inyección, salino, aceite de cacahuete, etanol, glicerol;
[excipiente] almidones, lactosa, glucosa, sacarosa, celulosa cristalina, sulfato cálcico, carbonato cálcico, talco, óxido de titanio, trehalosa, xilitol;
[agente de revestimiento] sacarosa, gelatina, ftalato de acetato de celulosa y los polímeros como los descritos anteriormente;
[base] vaselina, aceite vegetal, macrogol, base para aceite en emulsión de agua, base para el agua en emulsión de aceite;
[agente de unión] compuestos de polímeros naturales tales como almidones y los derivados del mismo, celulosa y los derivados del mismo, gelatina, alginato de sodio, goma de tragacanto, goma arábiga, y similares; polímeros sintéticos tales como la polivinilpirrolidona y similares; dextrina, hidroxilpropil almidón;
[lubricante] ácido esteárico y sales del mismo, talco, ceras, almidón de trigo, macrogol, aceite vegetal hidrogenado, éster de ácido graso sacarosa, polietilenglicol;
[desintegrante] almidón y derivados del mismo, agar, polvo de gelatina, bicarbonato sódico, celulosa y los derivados del mismo, carmelosa cálcica, hidroxipropil almidón, carboximetilcelulosa, y sales y derivados de los mismos, hidroxipropilcelulosa poco sustituida;
[agente solubilizante] ciclodextrina, etanol, glicol propileno, polietilén glicol;
[agente de suspensión] goma arábiga, goma de tragacanto, alginato sódico, monoestearato de aluminio, ácido cítrico, diversos tensioactivos;
[agente espesante] carmelosa sódica, polivinilpirrolidona, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, polivinil alcohol, goma de tragacanto, goma arábiga, alginato sódico;
[agente emulsionante] goma arábiga, colesterol, goma de tragacanto, metilcelulosa, diversos tensioactivos, lecitina;
[agente estabilizante] bisulfito sódico, ácido ascórbico, tocoferol, agente quelante, gas inerte, agente reductor;
[agente tamponante] hidrogenofosfato de sodio, acetato sódico, ácido bórico;
[agente isotonizante] cloruro de sodio, glucosa;
[agente calmante] hidrocloruro de procaína, lidocaína, alcohol bencílico;
[agente conservante] ácido benzoico y sales del mismo, ésteres p-hidroxibenzoicos, clorobutanol, jabón invertido, alcohol bencílico, fenol, timerosal;
[agente aromatizante] sacarosa, sacarina, extracto de glicirhiza, sorbitol, xilitol, glicerol;
[agente de fragancia] tintura de cáscara de naranja, aceite de rosa;
[agente colorante] tinción comestible soluble en agua, tinción de lago.
Ejemplos
La nueva colectina según el presente invento es descrita en más detalle por los siguientes Ejemplos ilustrativos no limitados. Sin embargo, el presente invento no debería ser interpretado como que está limitado a los Ejemplos.
Específicamente, la búsqueda en la base de datos de EST (Ejemplo 1); el cribado de una colectina humana nueva de una librería de cADN derivado del hígado humano por PCR y secuenciado de la secuencia de bases (Ejemplo 2); el cribado de una nueva colectina humana un sitio cap en una librería de cADN derivada del riñón humano por PCR y secuenciado de la secuencia de bases (Ejemplo 3); búsqueda de homologías de la nueva colectina (Ejemplo 4); obtención del cADN de la nueva colectina de ratón (Ejemplo 5); análisis de distribución de la expresión de la nueva colectina humana en los tejidos humanos (Ejemplo 6); análisis genético de la nueva colectina humana (Ejemplo 7); análisis de distribución de la expresión de la nueva colectina CL-L2-1 y CL-L2-2 en tejidos humanos (Ejemplo 8); la construcción de un vector de expresión pcADN3,1/Myc-His(+)-CL-L2-1.2 de la nueva colectina (Ejemplo 9); la producción de una cepa celular que expresa de modo estable la nueva colectina (Ejemplo 10); el análisis de la especificidad del azúcar de la nueva colectina (Ejemplo 11) son descritos a continuación.
Los Ejemplos 5 y 11 no se refieren a realizaciones del presente invento.
Ejemplo 1
Búsqueda en la base de datos EST
Las Figuras 2 y 3 ilustran la homología de los residuos aminoacídicos de colecciones conocidas, es decir, MBP humana, SP-A humano, SP-D humano y CL-L1 colectina derivada del hígado humano, la cual fue recientemente aislada con éxito por el presente inventor (véase la publicación sin examinar de la Patente Japonesa N°. Hei 1l-206377), que tiene una estructura común como se describe en la Fig. 1. En la figura, las porciones de los residuos aminoacídicos que eran reconocidas como homologas fueron recuadradas. Una secuencia aminoacídica de CRD (dominio de reconocimiento de la cadena de carbohidratos) que es responsable de una actividad lecitina (SEQ ID NO: 14) del CL-L1 en esta figura, fue usada para buscar en la base de datos EST (marcas de secuencia expresadas).
Como resultado, se obtuvieron varios datos que contenían una elevada homología de secuencia de aminoácidos. Las secuencias aminoacídicas de los datos resultantes de esta manera fueron buscadas en la base de datos GenBank/EST, y se determinó si eran de sustancias conocidas o desconocidas. Consecuentemente, un dato (H30455, derivado del timo) que exhibe una alta homología pero que contiene una secuencia de bases desconocida podría ser obtenido. Usando la secuencia de bases del clon EST así obtenido, se llevó de nuevo a cabo la búsqueda en la base de datos EST para dar nueve datos (números de acceso: AA558494, derivado de células germinales; AA582499, derivado del riñón; AI420986, derivado de la glándula prostática; AA742449, derivado de las células germinales; AA954657, derivado del riñón; AA908360, derivado del ovario; AI264145, derivado del riñón; AA089855, derivado del corazón; AA456055, derivado del melanocito, del útero embarazado, del corazón fetal) que se demostró que incluían una secuencia de bases idéntica. Todos estos fueron clones que demostraron una parte de una secuencia de bases de una nueva colectina idéntica.
Ejemplo 2
Cribado de una librería de cADN derivada del hígado humano por PCR y secuenciado de la secuencia de bases
Una secuencia consenso (SEQ ID NO: 15) fue producida en vista de las secuencias bases de 10 clones descritos anteriormente. Luego, dos cebadores hacia la dirección aguas arriba: CAP1 (5'-agattttattgtatagcttgg-3' (SEQ ID NO: 16)) y CAP2 (5'-ctgggtaataattacataatg-3' (SEQ ID NO: 17) en base a una secuencia consenso obtenida en el Ejemplo 1, y cebadores pertinente a una parte de una región de un vector de la librería de cADN derivada del hígado humano: \lambdaTriplEx-F1 (5'-aagctccgagatctggacgag-3' (SEQ ID NO:18)) y \lambdaTriplEx-F2 (5'-ctcgggaagcgcgccattgtg-3' (SEQ ID NO:19)) fueron sintetizados con el sintetizador 392 A ADN/ARN fabricados por PE Applied Biosystems Inc., y el cribado por PCR fue llevado a cabo como se describe a continuación para clonar una región 5' aguas arriba de cADN de una nueva colectina humana (véase la Fig. 4).
La primera PCR fue llevada a cabo usando una librería de cADN derivada de humano (Clontech Co.,) como plantilla del cribado por PCR. La mezcla de la reacción contenía un tampón LA PCR Buffer II (libre de Mg^{2+}), 2,5 mM de MgCl_{2}, cada 1 \muL de 200 \muM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (cualquiera de los cuales es fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), una librería de cADN derivada del hígado humano (Clontech Co.,), 0,5 \muM del cebador \lambdaTriplEx-F1 y 0,5 \muM del cebador CAP1 en un volumen total de 50 \muL. La PCR fue realizada con un programa de 35 ciclos de desnaturalización por calor a 95°C durante 20 segundos, hibridación a 60°C durante 20 segundos, reacción de elongación a 72°C durante 90 segundos; y además, una desnaturalización por calor a 95°C durante 5 min antes de la reacción repetida y a la reacción final de elongación a 72°C durante 5 min. Después de completar la primera PCR, se llevó a cabo la segunda PCR. El producto de la primera PCR fue usado como una plantilla a 1 \muL, y los cebadores empleados fueron el cebador \lambdaTriplEx-F2 y el cebador CAP2. La reacción fue realizada con una reacción de constitución y programa similares a los de la primera PCR excepto que el número de ciclos fue de 25. La PCR aquí presente fue realizada con GeneAmp PCR System9700 fabricado por PE Applied Biosystems Inc. El producto de PCR así resultante fue verificado mediante una electroforesis en gel de agarosa, y cortado del gel seguido por un enfriamiento a -80°C durante 10 min. Después de centrifugarlo a 15000 rpm durante 10 min, el producto fue purificado mediante precipitación en etanol del sobrenadante.
El fragmento de ADN purificado fue incorporado al vector pT7Blue fabricado por Novagen CO., y el vector fue transformado en las células competentes, células XL1-Blue. El transformante fue cultivado en un medio LB (100 \mug/mL de ampicilina) seguido por la extracción del plásmido con un método SDS alcalino para secuenciar la secuencia de bases del mismo con el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit y el secuenciador ABI PRISM 377 fabricado por Applied Biosystems Inc. Los cebadores empleados fueron el cebador universal M13 (5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3' (SEQ ID NO: 20)) y el cebador inverso M13 (5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NO: 21)), ambos de los cuales fueron sintetizados similarmente al cebador CAP1. La secuencia de bases obtenida consecuentemente reveló ser una secuencia de bases que es 575 bases más larga que el cebador CAP2 empezando por el extremo 3' al extremo N Terminal del mismo (una región que corresponde a: la posición aminoacídica 68-271 del ORF de CL-L2-1 mostrado en la Fig. 4; o la posición aminoacídica 42-245 del ORF de CL-L2-2). Sin embargo, se encontró una ligera diferencia en la secuencia de bases de la región del extremo 5' de la secuencia consenso del EST obtenida en el Ejemplo 1.
Ejemplo 3
Cribado de una colectina humana nueva de una librería de cADN de sitios cap derivada del riñón humano por PCR y secuenciado de la secuencia de bases
Para clonar la región del extremo 5' que contiene un sitio de iniciación de la transcripción además de la secuencia de bases obtenida en el Ejemplo 2, se llevó a cabo un cribado por PCR usando un cADN de sitios cap como sigue, a través de la sinterización de dos cebadores hacia la dirección aguas arriba: CAP3 (5'-ggtcctatgtcaccggaatc-3' (SEQ ID NO: 22)), CAP4 (5'-ttccatgacgacccacactgc-3' (SEQ ID NO: 23)) con el sintetizador ADN/ARN 392A fabricado por PE Applied Biosystems Inc., en la base de la secuencia de bases obtenida en el Ejemplo 2 (Fig. 4).
La primera PCR fue realizada con el cADN del sitio cap, riñón humano fabricado por NIPPON GENE Co., Ltd usando el cebador 1RC2 adjunto (5'-caaggtacgccacagcgtatg-3' (SEQ ID NO: 24)) y el cebador CAP3. La mezcla de la reacción contenía un tampón LA PCR Buffer II (libre de Mg^{2+}), 2,5 mM de MgCl_{2}, cada 1 \muL de 200 \muM de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (cualquiera de los cuales es fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), un cADN de sitios cap de riñón humano, 0,5 \muM del cebador 1RC2 (ambos de los cuales fueron fabricados por NIPPON GENE Co., Ltd) y 0,5 \muM del cebador CAP3 en un volumen total de 50 \muL. La PCR fue realizada con un programa de 35 ciclos de desnaturalización por calor a 95°C durante 20 segundos, hibridación a 60°C durante 20 segundos, reacción de elongación a 72°C durante 60 segundos; y además, desnaturalización por calor a 95°C durante 5 min antes de la reacción repetida y la reacción final de elongación a 72°C durante 10 min. Después de completar la primera PCR, se llevó a cabo la segunda PCR. El producto de la primera PCR fue usado como una plantilla a 1 \muL, y los cebadores empleados fueron unidos cebador 2RC2 (5'-gtacgccacagcgtatgatgc-3' (SEQ ID NO: 25)) y cebador CAP4. La reacción fue realizada con una reacción de constitución y un programa similares a la primera PCR excepto que el número de ciclos fue de 25. la PCR aquí presente fue realizada con GeneAmp PCR System9700 fabricado por PE Applied Biosystems Inc. El producto de PCR así resultante fue verificado en una electroforesis de gel de agarosa, y cortado del gel seguido por un enfriamiento a -80°C durante 10 min. Después de centrifugarlo a 15000 rpm durante 10 min, el producto fue purificado por precipitación en etanol del sobrenadante.
El fragmento de ADN purificado fue incorporado al vector pT7Blue fabricado por Novagen CO., y el vector fue transformado en las células competentes, células XL1-Blue. El transformante fue cultivado en un medio LB (100 \mug/mL de ampicilina) seguido por la extracción del plásmido con un método SDS alcalino para secuenciar la secuencia de bases del mismo con BigDye Terminador Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit y el secuenciador ABI PRISM 377 fabricado por Applied Biosystems Inc. Los cebadores empleados fueron el cebador universal M13 (5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3' (SEQ ID NO: 20)) y el cebador inverso M13 (5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NO: 21)). Dos secuencias de bases obtenidas consecuentemente revelaron ser: una secuencia de bases que es 492 bases mayor que la secuencia de bases obtenida en el Ejemplo 2 en la dirección a su extremo N terminal (SEQ ID NO: 1); y una secuencia de bases que es 274 bases mayor que la secuencia de bases obtenida en el Ejemplo 2 en la dirección de su extremo N terminal (SEQ ID NO: 3).
Consecuentemente, dos cADNs en conexión con el CL-L2 fueron obtenidos por la presente incluyendo: un cADN que tiene un ORF (marco de lectura abierto) de 813 bases (SEQ ID NO: 1) y que codifica 271 aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 2 (CL-L2-1); y un cADN que tiene un ORF (marco de lectura abierto) de 735 bases (SEQ ID NO: 3) y que codifica 245 aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 4 (CL-L2-2).
Ejemplo 4
Búsqueda de homología
A continuación, la búsqueda de homología fue llevada a cabo para ADN y aminoácidos en la base de datos del GenBank. Como resultado, la secuencia aminoacídica obtenida demostró ser un la de una proteína nueva, que es distinta de cualquier colectina que se haya encontrado hasta el momento.
Las secuencias aminoacídicas de los tres tipos de colectinas presentados hasta el momento (MBP, SP-A y SP-D) y la colectina CL-L1 derivada del hígado humano, que fue aislado con éxito por el presente inventor recientemente (véase la publicación sin examinar de la Patente Japonesa N°. Hei 1l-206377) fueron comparadas con la secuencia aminoacídica de la parte estructural de la colectina de la nueva colectina según el presente invento. Los resultados fueron ilustrados en la Fig. 5 y la Fig. 6. Similarmente a las Figs. 2 y 3, las porciones de los residuos de aminoácidos que son reconocidas por ser homólogas fueron recuadradas. Según esta alineación, se demostró que la proteína nueva resultante tiene homología con las proteínas colectina conocidas, y que pertenece a una familia colectina.
Además, se obtuvo un mutante (SEQ ID NO: 6) codificado por la posición 141-731 de la secuencia de bases establecida en la SEQ ID NO: 5 que tiene una deleción de aminoácidos del 18-65 en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4; un mutante (SEQ ID NO: 8) codificado por la posición 141-803 de la secuencia de bases establecida en la SEQ ID NO: 7 que tiene una deleción de aminoácidos de 18-41 en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4; y un mutante (SEQ ID NO: 10) codificado por la posición del 141-803 de la secuencia de bases establecida en la SEQ ID NO: 9 que tiene una supresión de aminoácidos de 42-65 en la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 4.
Ejemplo 5
Obtención de cADN de una colectina de ratón nueva
En una manera similar a la del hCL-L2, el gen mCL-L2 pudo ser obtenido a través del cribado de una librería de cADN de hígado de ratón. El clon de cADN resultante de mCL-L2 se confirmó que tenía un ORF (marco de lectura abierto) de 813 bases (SEQ ID NO: 12), y codifica aminoácidos de los 271 aminoácidos expuestos en la SEQ ID NO: 13.
Ejemplo 6
Análisis de la distribución de la expresión de la nueva colectina en tejidos humanos
Para examinar la expresión de la nueva colectina en varios tejidos, el análisis fue realizado mediante RT-PCR. La RT-PCR fue realizado usando dos cebadores que son capaces de amplificar una secuencia de cADN que abarca desde la región del cuello al dominio de reconocimiento de carbohidratos de la nueva colectina: RTF1 (5'-agattccggtgacataggacc-3' (SEQ ID NO: 26)), RTR1 (5'-tggtctgggctctgtccctgc-3' (SEQ ID NO: 27)), y dos cebadores que son capaces de amplificar una parte del gen \beta-actina para usar en la comparación a la cantidad de nueva colectina expresada en cada uno de los tejidos: cebador homosentido de \beta-actina humana (5'-caagagatggccacggctgct-3' (SEQ ID NO: 28)), cebador antisentido de \beta-actina humana (5'-tccttctgcatcctgtcggca-3' (SEQ ID NO: 29)). Todos estos cebadores fueron sintetizados de manera similar al cebador CAP1 para llevar a cabo la RT-PCR.
La RT-PCR fue llevada a cabo usando el kit RNA LA PCR (AMV) Ver. 1.1 (TAKARA Syuzo, Co.) con cada ARN derivado de varios tejidos humanos ((1) cerebro, (2) corazón, (3) riñón, (4) hígado, (5) pulmón, (6) tráquea, (7) médula ósea, (8) colon, (9) intestino delgado, (10) bazo, (11) estómago, (12) timo, (13) glándula mamaria, (14) glándula prostática, (15) músculo esquelético, (16) testículos, (17) útero, (18) cerebelo, (19) cerebro fetal, (20) hígado fetal, (21) columna vertebral, (22) placenta, (23) glándula adrenal, (24) páncreas, (25) glándula salivar, y (26) tiroides) como plantilla. Primero, se llevó a cabo una reacción de transcripción inversa en la siguiente mezcla de
reacción.
La mezcla de la reacción contenía 5 mM de MgCl_{2}, un tampón 1 x RNA PCR, una mezcla de 1 mM de dNTP, un inhibidor de 1 U/\mul RNasa y 2 \mug de ARN, y el volumen total de la mezcla fue ajustado para dar 40 \mul con agua destilada libre de RNasa. Al mismo tiempo, una mezcla de reacción sin transcriptasa inversa fue preparada también como testigo negativo. La mezcla de la reacción como se describe anteriormente fue colocada en un tubo de 0,2 ml, y sujeta a una reacción de transcripción inversa con GeneAmp PCR System 9700 fabricado por PE Applied Biosystems Inc. a través de un ciclo de: 30 minutos a 42°C, 5 minutos a 99°C, y 5 minutos a 5°C. Así el producto de reacción de transcripción inversa resultante fue usado subsecuentemente a 10 \muL para LA PCR en la siguiente mezcla de reacción con 28 ciclos y 35 ciclos respectivamente. Se añadieron a la misma 2,5 mM de MgCl_{2}, un tampón 1 x LA PCR (libre de Mg^{2+}), 2U TaKaRa LA Taq, 0,2 \muM del cebador RTF1 y 0,2 \muM del cebador RTR1, y la muestra fue ajustada para dar un volumen total de 50 \muL con agua destilada esterilizada. La PCR fue realizada con un programa de 28 a 35 ciclos de desnaturalización por calor a 95°C durante 20 segundos, hibridación a 60°C durante 20 segundos, reacción de elongación a 72°C durante 60 segundos; y en adición, desnaturalización por calor a 95°C durante 5 min antes de la reacción repetida y la reacción final de elongación a 72°C durante 10 min. El producto de reacción fue separado en electroforesis de gel de agarosa al 1,5%, seguido por tinción con una solución de bromuro de etidio (0,1 \mug/mL), verificación del patrón de electroforesis con transiluminador e identificación del tejido de expresión. Para comparar la cantidad expresada en cada uno de los tejidos, se realizó una RT-PCR para amplificar una parte de la \beta-actina con cada uno de los tejidos, y se llevó a cabo la corrección de la cantidad de ARN. La RT-PCR fue realizada similarmente al procedimiento anterior con la reacción de transcripción inversa, PCR, y se realizó la estimación. Los resultados son ilustrados en la Fig. 7, la cual demuestra la expresión de la nueva colectina según el presente invento mediante PCR realizada con 28 ciclos en el riñón (carril 3) intensamente, y también en el hígado (carril 4), intestino delgado (carril 9), timo (carril 12), hígado fetal (carril 20), médula espinal (carril 21), glándula adrenal (carril 23) y el páncreas (carril 24). Además, con respecto a la PCR realizada con 35 ciclos, la expresión ubicua de la nueva colectina pudo ser verificada en todos los tejidos ensayados, aunque se observó una variación de la intensidad en la
expresión.
Ejemplo 7
Análisis genético de la nueva colectina
En base a la secuencia de ADNs de las colectinas nuevas obtenidas (hCL-L2-1 (SEQ ID NO: 1) y mCL-L2 (SEQ ID NO: 12)) se produjo un árbol filogenético a través de la realización del análisis con el propósito de clarificar la posición genética entre las colectinas conocidas.
Las colectinas seleccionadas para el análisis fueron proteínas en diversas familias de colectina ilustradas en la Fig. 8 (en la figura, la CL-L1 y CL-P1 fueron aisladas con éxito por los presentes inventores). Una alineación múltiple fue producida con el método clustalw usando una región que contenía un dominio de lectina en la base de datos que fueron obtenidos por la búsqueda de cada secuencia de aminoácidos de la base de datos GenBank. Un árbol filogenético fue producido con el programa del paquete Phylip versión 3.57c usando un proceso N-J (proceso de unión - vecino) basado en la alineación múltiple así resultante.
Consecuentemente, se supuso que el SP-D, CL-43 bovino, y la conglutinina bovina formaron un agrupamiento, mientras que el MBP y SP-A formaron respectivamente agrupamientos separados, sin embargo la nueva colectina del presente invento no pertenecía a ninguno de estos agrupamientos pero pertenecía al mismo agrupamiento que la CL-L1. Por consiguiente, se especuló que la nueva colectina del presente invento es una homóloga de la CL-L1.
\newpage
Ejemplo 8
Análisis de la distribución de la expresión de la nueva colectina (CL-L2-1 y CL-L2-2) en tejidos humanos
El análisis con la técnica RT-PCR fue llevado a cabo para examinar la expresión del CL-L2-1 (SEQ ID NO: 1) y CL-L2-2 (SEQ ID NO: 3) en diversos tejidos. La RT PCR fue llevada a cabo usando los cebadores que son capaces de amplificar la región traducida completa de la CL-L2-1 obtenida como (RTF2 (5'-atgagggggaatctggccctggtg-3' (SEQ ID NO: 30)), RTR2 (5'-catgttctccttgtcaaactcac-3' (SEQ ID NO: 31))); los cebadores que son capaces de amplificar la región traducida completa del CL-L2-2 obtenida como (RTF3 (5'-atgtggtgggtgcctccgagtc-3' (SEQ ID NO: 32)), RTR2 (SEQ ID NO: 31)); y dos cebadores \beta-actina humanos usados en el Ejemplo 6, que son capaces de amplificar una parte del gen \beta-actina para el uso en comparación de la cantidad de la nueva colectina expresada en cada uno de los tejidos. Todos estos cebadores fueron sintetizados en una manera similar al cebador CAP1, y la RT-PCR fue realizada similarmente al Ejemplo 6.
Los resultados son ilustrados en la Fig. 9, que demuestra una expresión intensa del CL-L2-1 (SEQ ID NO: 1) según el presente invento mediante PCR realizada con 28 ciclos en el riñón (carril 3), en el hígado (carril 4), intestino delgado (carril 9), timo (carril 12), hígado fetal (carril 20), médula espinal (carril 21), glándula adrenal (carril 23), páncreas (carril 24). Además, con respecto a la PCR realizada con 35 ciclos, la expresión ubicua de CL-L2-1 (SEQ ID NO: 1) se pudo verificar en todos los tejidos ensayados, aunque se observó intensidad variable en la expresión. Además, se encontró que la CL-L2-2 (SEQ ID NO: 3) se expresa intensamente en el riñón (carril 3) para la PCR realizada con 28 ciclos, mientras que en PCR realizada con 35 ciclos e expresa en el riñón (carril 3) así como en la glándula prostática (carril 14), testículos (carril 16), médula espinal (carril 21), placenta (carril 22).
Adicionalmente, varios fragmentos amplificados fueron encontrados en los productos de RT-PCR de las CL-L2-1 y CL-L2-2 como se muestra en la Fig. 9. Estas bandas fueron cortadas del gel y purificadas mediante un proceso similar al del Ejemplo 2, es decir, por congelación a -80°C durante 10 min, centrifugación a 15000 rpm durante 10 min seguido por precipitación en etanol del sobrenadante. El fragmento de ADN purificado fue incorporado en el vector pT7Blue fabricado por Novagen Co., y el vector así resultante fue transformado en las células competentes, células CL1-Blue. El transformante fue cultivado en un medio LB (100 \mug/mL de ampicilina) y luego el plásmido fue extraído con un método SDS alcalino. La secuencia de bases fue determinada por el kit BigDye Terminador Cycle Sequencing FS Ready Reaction y el secuenciador ABI PRISM 377 fabricado por Applied Biosystems Inc. Los cebadores empleados fueron el cebador universal M13 (5'-cgacgttgtaaaacgacggccagt-3' (SEQ ID NO: 20)) y el cebador inverso M13 (5'-caggaaacagctatgac-3' (SEQ ID NO: 21)).
La secuencia de bases resultante fue la misma que CL-L2-2v1, CL-L2-2v2 y CL-L2-2v3 que son variantes de CL-L2-2 (SEQ ID NO: 3) obtenidas en el Ejemplo 2. Además, las tres proteínas estuvieron presentes como CL-L2-1 expuestas en la SEQ ID NO: 2, que fueron derivados del corte y empalme alternativo del mARN. Estos se refieren a CL-L2-1v1 (SEQ ID NO: 36, 37), CL-L2-1v2 (SEQ ID NO: 38, 39) y CL-L2-1v3 (SEQ ID NO: 40, 41). El CL-L2-1v1 tiene una deleción de la posición aminoacídica 44-91 del CL-L2-1 establecida en la SEQ ID NO: 2 (deleción de la posición de bases 394-537 de la CL-L2-1 expuesta en la SEQ ID NO: 1), cuya secuencia aminoacídica es codificada por la posición del 265-933 de una secuencia de bases expuesta en la SEQ ID NO: 36 (SEQ ID NO: 59). El CL-L2-1v2 tiene una deleción de la posición de aminoácidos 44-67 del CL-L2-1 establecida en la SEQ ID NO: 2 (deleción de la posición de bases 394-465 de la CL-L2-1 expuesta en la SEQ ID NO: 1), cuya secuencia aminoacídica está codificada por la posición del 265-1005 de una secuencia de bases expuesta en la SEQ ID NO: 38 (SEQ ID NO: 60). La CL-L2-1v3 tiene una deleción de la posición de aminoácidos 68-91 de la CL-L2-1 expuesta en la SEQ ID NO: 2 (deleción de la posición de bases 466-537 de la CL-L2-1 expuesta en la SEQ ID NO: 1), cuya secuencia aminoacídica está codificada por la posición 265-1005 de una secuencia de bases expuesta en la SEQ ID NO: 40 (SEQ ID NO: 61). Además, el gen mCL-L2-2 puede ser obtenido en un proceso similar al del Ejemplo 14.
Ejemplo 9
Construcción del vector de expresión pcADN 3,1/Myc-His(+)A-CL-L2-1.2 de la nueva colectina
Una región traducida de la CL-L2-1 (SEQ ID NO: 1) fue amplificada usando el cebador CL-L2-1F (5'-gggaagcttcgatcaggatgagggggaatctggccctggtg-3' (SEQ ID NO: 33)) y el cebador CL-L2-1R (5'-gggctcgagcatgttctcctt gtcaaactcac-3' (SEQ ID NO: 34)) por PCR (Takara termal Cycler MP fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) con una librería de cADN derivada de riñón humano como plantilla. Además, una región traducida de la nueva colectina (SEQ ID NO: 3) fue amplificada usando el cebador CL-L2-2F (5'-gggaagcttccagcacaatgtggtgggtgcctccgagtc-3' (SEQ ID NO: 35)) y el cebador CL-L2-1R (SEQ ID NO: 34) por PCR con una librería de cADN derivada del riñón humano como plantilla. El cADN CL-L2-1 así resultante fue ligado al vector T pT7Blue (fabricado por Novagen Co.) y fue transformado en Escherichia coli XLI-Blue. Un plásmido que contenía cADN CL-L2-1 fue purificado de los clones resultantes. Tras la confirmación de la secuencia de bases del plásmido resultante con un secuenciador, el plásmido sin errores fue digerido con las enzimas de restricción Hind III y Xho I, y ligado al vector pcADN 3,1/Myc-His(+)A (fabricado por Invitrogen Co.,) que había sido digerido con las mismas enzimas y purificado. Después de que el plásmido ligado fue transformado en Escherichia Coli, XLI-Blue, el clon resultante fue cultivado. El plásmido fue luego purificado para dar un vector de expresión pcADN 3,1/Myc-His(+)A-CL-L2-1.2. En el mismo momento, los vectores de expresión fueron producidos similarmente por variantes de CL-L2-1 y CL-L2-2 (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 38 y SEQ ID NO: 40).
Ejemplo 10
Producción de la cepa celular, que es estable en la expresión de la nueva colectina
La expresión transitoria fue llevada a cabo a través de la cotransfección del vector de expresión pcADN 3,1/Myc-His(+)A-CL-L2-1 obtenido en el Ejemplo 9 y el vector pEGFP-F (fabricado por Clontech Co.,) a las células CHO usando el reactivo LIPOFECTAMINA 2000 (LF2000) (fabricado por GIBCO BRL Co.). Una disolución de 0,5 ml del reactivo LF2000 (30 \mul del reactivo LF2000, Ham F-12 mezcla nutriente (medio F-12 de Ham, (fabricado por Sigma Co.))) fue preparada primero e incubado a temperatura ambiente durante 5 minutos. Después, 0,5 ml de una disolución del vector (pcADN 3,1/Myc-His(+)A-CL-L2-1.2:7,5 \mug, 2,5 \mug del vector pEGFP-F, medio F-12 de Ham) fue mezclada con la misma, seguido por una incubación durante 20 minutos. A partir de entonces, la disolución fue añadida a las células CHO que habían sido cultivadas a una elevada densidad en un frasco de 25 cm^{2} incluyendo 5 ml del medio F-12 de Ham que contenía 5% de FCS. Después de incubarla a 37°C durante 4 horas en presencia de 5% de CO_{2}, el medio fue remplazado con un medio F-12 de Ham, seguido por la subsiguiente incubación a 37°C durante 20 horas en presencia de 5% de CO_{2}. A continuación, el medio fue reemplazado con el medio F-12 de Ham que contenía 5% de FCS, 0,4 mg/ml de Geneticina, (fabricado por GIBCO BRL Co.) y consiguientemente se dejaron transcurrir 10 días de cultivo. En este proceso el reemplazo del medio se llevó a cabo una vez.
A través de esta selección con un fármaco durante 10 días, sólo las células transformadas pudieron sobrevivir y proliferar, al contrario sin embargo, las células que no fueron transformadas murieron. Para obtener células de alta expresión a partir de las células transformadas resultantes, la clasificación fue realizada por un clasificador celular (fabricado por Becton Dickinson Co.) con fluorescencia del GFP como marcador. Después de lavar las células transformadas en un frasco de 25 cm^{2} con 5 ml de PBS (-) dos veces, las células fueron despegadas con 0,3 ml de una disolución de EDTA al 0,02% (fabricada por Nakarai Tesc KK). Las células fueron suspendidas en 10 ml de PBS (-) y a partir de ese momento centrifugadas a 200x g durante 7 minutos a 4°C para eliminar el sobrenadante. El resto de las células fueron suspendidas en 0,5 ml de FCS/PBS (-) al 2% de para dar una muestra de selección. Después de que la muestra fuera hecha pasar a través de un tubo de 5 ml equipado con una tapa de filtro celular (fabricado por Becton Dickinson Co.) se aplicó a un aparato de selección celular. Las células CHO sin estar sujetas a la transformación, las cuales han sido tratadas similarmente, fueron usadas como células testigo. Consecuentemente, una muestra fue seleccionada, la cual exhibió una intensidad fluorescente de 10 veces o más que la muestra testigo. Estas células fueron dispuestas en una placa de microvaloración celular de 96 pocillos, en las que los pocillos contenían respectivamente 100 \mul del medio F-12 de Ham (que contenía 5% de FCS, 0,4 mg/ml de Geneticina), para cargar una célula única por pocillo. Después de que las células fueron cultivadas a 37°C en presencia de 5% de CO_{2} durante una semana, cada 100 \mul de medio de cultivo fue además añadido al mismo seguido por el cultivo adicional durante una semana. Un clon proliferado con el fármaco Geneticina de selección fue dividido en dos partes, que fueron sujetas a pases en placas de microvaloración de 12 pocillos y 24 pocillos. Tras el pase, los clones fueron excluidos, los cuales fueron derivados de la proliferación en un pocillo en el que dos o más células existían por pocillo y las células fueron puestas en placa en una relación de número celular de 9:1 para las placas de microvaloración de 12 pocillos y 24 pocillos. Las células fueron cultivas a 37°C en presencia de 5% de CO_{2} hasta que las células en la placa de 12 pocillos alcanzaron una densidad alta. Luego, 200 \mul del sobrenadante de cultivo fueron sometidos a la transferencia dot plot sobre una membrana Immobilon-P (fabricada por Millipore Co., Ltd) usando el aparato de microfiltración Bio-Dot (fabricado por BIO-RAD Co., Ltd) y la membrana fue incubada en una disolución de anticuerpos anti-myc (fabricado por Invitrogen Co.,) x 5000 diluido en 0,05% de un tampón Tween 20 al 0,05%/TBS (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) a temperatura ambiente durante 1 hora. A partir de entonces, la membrana fue lavada con 100 ml del tampón Tween 20 al 0,05%/TBS a temperatura ambiente durante 20 min. x 3 seguido por la incubación adicional en una disolución de anti-IgG-HRP (fabricado por Chemicon Co., Ltd) x 5000 diluido en tampón Tween 20 al 0,05%/TBS a temperatura ambiente durante 1 hora. A partir de entonces, la membrana fue lavada con 100 ml del tampón Tween 20 al 0,05%/TBS a temperatura ambiente durante 20 min. x 3 seguido de la detección usando un sistema de sustrato de peroxidasa de membrana TMB (fabricado por Funakoshi KK). Después de confirmar los clones con un desarrollo de color intenso, las células en los correspondientes pocillos respectivos de la placa de 24 pocillos fueron identificadas como una cepa celular de expresión estable (CHO/CL-L2-1).
Ejemplo 11
El análisis de la especificidad de unión al azúcar de la nueva colectina
Un litro del sobrenadante de cultivo de la cepa celular de expresión estable de la nueva colectina (CHO/CL-L2-1) producido en el Ejemplo 10 fue concentrado a 50 ml usando el VIVAPORE10 (fabricado por Funakoshi KK), a partir de ahí se le añadieron 200 \mul de agarosa Ni-NTA (fabricado por Quiagen Co., Ltd) al mismo. La nueva colectina fue vinculada a la agarosa Ni-NTA por incubación de la mezcla con agitación a 4°C durante toda la noche. La agarosa Ni-NTA fue embalada en columnas de cromatografía poli-prep (fabricadas por BIO-RAD Co., Ltd.) seguido de lavados con 5 ml de 50 mH de NaH_{2}PO_{4}, 300 mM de NaCl, 20 mM de imidazole, 0,05% de Tween20 (pH8,0) tres veces, y por elusión con 200 \mul de 50 mM de NaH_{2}PO_{4}, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazole, 0,05% de Tween20 (pH 8,0) cinco veces para purificar la nueva colectina. La nueva colectina purificada fue determinada cuantitativamente y usada para el análisis de la especificidad del azúcar.
Específicamente, 1 \mug de la nueva colectina purificada fue transferida mediante dot blot a una membrana Immobilon-P (fabricada por Millipore Co., Ltd) para dar manchas en un número correspondiente a los tipos de las sondas de cadena del azúcar para ser examinadas en lo que se refiere a la especificidad de unión, usando el aparato de Microfiltración Bio-Dot (fabricado por BIO-RAD Co., Ltd.). Cada punto fue a partir de entonces cortado para rendir 1 cm cuadrado, y fue inmerso en un Block Ace (fabricada por Dai Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), y fue incubado a temperatura ambiente durante 1 hora. Luego, la membrana fue lavada tres veces con el tampón 0,05% de Tween 20, 5 mM de CaCl_{2}, TBS, y fue incubada en cada disolución de sonda de cadena del azúcar (véase, Fig. 10) diluida con 5 mM de CaCl_{2}, con el tampón TBS para dar 1 \mug/ml a temperatura ambiente durante 1 hora. A partir de entonces, la membrana fue lavada de nuevo tres veces con el tampón 0,05% de Tween 20, 5 mM de CaCl_{2}, TBS. Luego la membrana fue incubada en una disolución de HRP biotinilada unida a estreptavidina (fabricado por Amersham Co.) x 1000 diluido con el tampón 0,05% de Tween20, 5 mM de CaCl_{2}, TBS a temperatura ambiente durante 30 min. seguido por tres lavados con el tampón 0,05% de Tween 20, 5 mM de CaCl_{2}, TBS y por detección usando el sistema de sustrato de peroxidasa de membrana TMB (fabricado por Funakoshi KK). Como se muestra en la Fig. 10, la nueva colectina fue activa en la unión con manosa, fucosa, N-acetilgalactosamina, ácido N-acetilneuramínico, manosa-6 ácido fosfórico.
Debido a que la proteína CL-L2 del presente invento tiene una estructura de colectina, se cree que es una sustancia que ejerce efectos característicos a esas estructuras. Por tanto, se puede utilizar en la elucidación de mecanismos de inmunidad fundamental; en la elucidación de mecanismos del desarrollo de una amplia variedad de enfermedades tales como infecciones bacterianas; en el diagnóstico, profilaxis y métodos terapéuticos de las mismas; y en el desarrollo de reactivos y fármacos para el mismo.
<110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES. LTD.
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<120> Nueva colectina
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<130> 01P237WO
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<160> 61
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<210> 1
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<211> 1341
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (265) .. (1077)
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<400> 1
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1
2
3 
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<210> 2
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<211> 271
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
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<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 1.
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<400> 2
4
5 
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<210> 3
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<211> 1139
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (141).. (875)
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<400> 3
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6
7 
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<210> 4
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<211> 245
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<212> PRT
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
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<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 3
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<400> 4
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8 
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<210> 5
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<211> 995
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<212> ADN
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<213> Homo Sapiens 
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<220>
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<221> CDS
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<222> (141).. (731)
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<400> 5
9
10 
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<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
11
12 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1067
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (141)..(803)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 7
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
15 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1067
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (141)..(803)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
16
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de un dominio de tipo colágeno de la nueva colectina mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (157).. (969)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
21
22 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
23
24 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia CRD aminoacídica conocida del CL-L1 documentado que ha sido empleado para la búsqueda de EST en bases de datos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
25 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 619
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica consenso de la nueva colectina derivada de varias secuencias nucleotídicas obtenidas de las bases de datos de EST
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
26
27 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CAP1 para clonar la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agattttatt gtatagcttg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CAP2 para clonar la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgggtaata attacataat g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético \lambdaTriplEx-F1 para clonar la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagctccgag atctggacga g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético \lambdaTriplEx-F2 para clonar la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgggaagc gcgccattgt g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador universal M13 sintético para secuenciar la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgacgttgta aaacgacggc cagt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso M13 sintético para secuenciar la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggaaacag ctatgac 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CAP3 para un clonaje adicional de la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtcctatgt caccggaatc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CAP4 para un clonaje adicional de la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttccatgacg acccacactg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético IRC2 para un clonaje adicional de la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaggtacgc cacagcgtat g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético IRC2 para un clonaje adicional de la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtacgccaca gcgtatgatg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTF1 para RT-PCR para determinar la distribución tisular de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agattccggt gacataggac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTR1 para RT-PCR para determinar la distribución tisular de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggtctgggc tctgtccctg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador homosentido \beta-actina sintético para RT-PCR para determinar el nivel de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caagagatgg ccacggctgc t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador antisentido \beta-actina sintético para RT-PCR para determinar el nivel de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccttctgca tcctgtcggc a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTF2 para amplificación de CL-L2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaggggga atctggccct ggtg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTR2 para amplificación de CL-L2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgttctcc ttgtcaaact cac 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTF3 para amplificación de CL-L2-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgtggtggg tgcctccgag tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CL-L2-1F sintético para amplificación de CL-L2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaagcttc gatcaggatg agggggaatc tggccctggt g 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CL-L2-IR sintético para amplificación de CL-L2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggctcgagc atgttctcct tgtcaaactc ac 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador CL-L2-2F sintético para amplificación de CL-L2-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaagcttc cagcacaatg tggtgggtgc ctccgagtcc ctggtg 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (265)..(933)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
28
29 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la variante de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 36
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
30
31 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (265)..(1005)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
32
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la variante de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
\vskip1.000000\baselineskip
35
36 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (265)..(1005)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
37
38 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la variante de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 40
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
39 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de un dominio de tipo colágeno de la nueva colectina mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
\vskip1.000000\baselineskip
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de un dominio de tipo colágeno de la nueva colectina mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ser Gly Asp Ile Gly Pro Pro Gly}
\sac{Pro Asn Gly Glu Pro Gly Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de un dominio de tipo colágeno de la nueva colectina mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
\vskip1.000000\baselineskip
42 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 813
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
43 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 735
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
44 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
45 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 477
\vskip0.400000\baselineskip
<212>
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
46 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
47 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
48
49 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Glu Lys Gly Asp Ser Gly Asp Ile Gly Pro Pro Gly Pro Asn Gly}
\sac{Glu Pro Gly Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\vskip1.000000\baselineskip
490 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
\vskip1.000000\baselineskip
491 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Trp Trp Val Pro Pro Ser Pro Tyr Gly Cys Leu Pro Cys Ala Leu}
\sac{Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
\vskip1.000000\baselineskip
50 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 663
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
\vskip1.000000\baselineskip
51 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 663
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
\vskip1.000000\baselineskip
52 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 813
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\vskip1.000000\baselineskip
53
54 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
\vskip1.000000\baselineskip
55 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\vskip1.000000\baselineskip
56
57 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\vskip1.000000\baselineskip
58 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
LISTADO DE SECUENCIAS 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> FUSO PHARMACEUTICAL INDUSTRIES, LTD.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 01P237WO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 61
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1341
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (265)..(1077)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
69
70 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 1.
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
71
72 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1139
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (141)..(875)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
73
74 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 245
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
75
76 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 995
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (141)..(731)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
77
78 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
79 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1067
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (141)..(803)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
80
81 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
82
83 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1067
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (141)..(803)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
84
85 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 221
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
86
87 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de un dominio de tipo colágeno de la nueva colectina mutada
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
870 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1522
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (157)..(969)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
88
89 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 271
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 12
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
90
91 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia CRD aminoacídica conocida del CL-L1 documentado que ha sido empleado para la búsqueda de EST en bases de datos
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
92
93 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 619
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia nucleotídica consenso de la nueva colectina derivada de varias secuencias nucleotídicas obtenidas de las bases de datos de EST
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
94 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CAP1 para clonar la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agattttatt gtatagcttg g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CAP2 para clonar la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctgggtaata attacataat g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético \lambdaTriplEx-F1 para clonar la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
aagctccgag atctggacga g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético \lambdaTriplEx-F2 para clonar la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ctcgggaagc gcgccattgt g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador universal M13 sintético para secuenciar la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
cgacgttgta aaacgacggc cagt 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso M13 sintético para secuenciar la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caggaaacag ctatgac 
\hfill
17 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CAP3 para un clonaje adicional de la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ggtcctatgt caccggaatc 
\hfill
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CAP4 para un clonaje adicional de la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ttccatgacg acccacactg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético 1RC2 para un clonaje adicional de la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 24
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caaggtacgc cacagcgtat g 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 25
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético 2RC2 para un clonaje adicional de la región 5' aguas arriba de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gtacgccaca gcgtatgatg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 26
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTF1 para RT-PCR para determinar la distribución tisular de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 26
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
agattccggt gacataggac c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTR1 para RT-PCR para determinar la distribución tisular de la nueva colectina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tggtctgggc tctgtccctg c 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 28
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador homosentido \beta-actina sintético para RT-PCR para determinar los niveles de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
caagagatgg ccacggctgc t 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 29
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador antisentido \beta-actina sintético para RT-PCR para determinar los niveles de control
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 29
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
tccttctgca tcctgtcggc a 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 30
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTF2 para amplificación de CL-L2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 30
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgaggggga atctggccct ggtg 
\hfill
24 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTR2 para amplificación de CL-L2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
catgttctcc ttgtcaaact cac 
\hfill
23 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético RTF3 para amplificación de CL-L2-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 32
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
atgtggtggg tgcctccgag tc 
\hfill
22 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 33
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CL-L2-1F para amplificación de CL-L2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 33
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaagcttc gatcaggatg agggggaatc tggccctggt g 
\hfill
41 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 32
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CL-L2-1R para amplificación de CL-L2-1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggctcgagc atgttctcct tgtcaaactc ac 
\hfill
32 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador sintético CL-L2-2F para amplificación de CL-L2-2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 35
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
gggaagcttc cagcacaatg tggtgggtgc ctccgagtcc ctggtg 
\hfill
46 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 36
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1197
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (265)..(933)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 36
95
96 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 37
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 223
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la variante de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 36
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 37
\vskip1.000000\baselineskip
97
98 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 38
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (265)..(1005)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 38
99 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 247
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la variante de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 38
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 39
101
102 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (265)..(1005)
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 40
\vskip1.000000\baselineskip
103
104 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 257
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de la variante de la nueva colectina de la secuencia nucleotídica expuesta en la SEQ ID NO: 40
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 41
105
106 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de un dominio de tipo colágeno de la nueva colectina mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 42
1060 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 43
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de un dominio de tipo colágeno de la nueva colectina mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 43
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Leu Lys Gly Glu Lys Gly Asp Ser Gly Asp Ile Gly Pro Pro Gly}
\sac{Pro Asn Gly Glu Pro Gly Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 44
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Secuencia aminoacídica deducida de un dominio de tipo colágeno de la nueva colectina mutada
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 44
1061 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 813
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 45
107 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 46
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 735
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 46
\vskip1.000000\baselineskip
108 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 159
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 47
\vskip1.000000\baselineskip
109
110 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 48
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 477
\vskip0.400000\baselineskip
<212>
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 48
111 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 49
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 49
112 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 50
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 50
113 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 51
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Glu Lys Gly Asp Ser Gly Asp Ile Gly Pro Pro Gly Pro Asn Gly}
\sac{Glu Pro Gly Leu Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 52
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 45
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
1130 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 53
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 40
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 53
1131 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 54
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 54
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Trp Trp Val Pro Pro Ser Pro Tyr Gly Cys Leu Pro Cys Ala Leu}
\sac{Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 55
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 591
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 55
114
115 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 56
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 663
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 56
116 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 57
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 663
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 57
117 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 813
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus musculus 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
118
119 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 59
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 669
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 59
120 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
121 
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 741
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens 
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
122
123

Claims (17)

1. Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que consiste en 245 aminoácidos expuestos en la posición aminoacídica 1-245 de la SEQ ID NO: 4.
2. Un polinucleótido que codifica una secuencia aminoacídica expuesta en la posición aminoacídica 1-245 de la SEQ ID NO: 4.
3. Un polinucleótido reivindicado en la reivindicación 2, en el que la secuencia de bases está expuesta en la SEQ ID NO: 46.
4. Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que consiste en 197 aminoácidos expuestos en la posición aminoacídica 1-197 de la SEQ ID NO: 6.
5. Un polinucleótido que codifica una secuencia aminoacídica expuesta en la posición aminoacídica 1-197 de la SEQ ID NO: 6.
6. Un polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 5, en la que la secuencia de bases está expuesta en la SEQ ID NO: 55.
7. Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que consiste en 221 aminoácidos expuestos en la posición aminoacídica 1-221 de la SEQ ID NO: 8.
8. Un polinucleótido que codifica una secuencia aminoacídica expuesta en la posición aminoacídica 1-221 de la SEQ ID NO: 8.
9. Un polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 8, en la que la secuencia de bases está expuesta en la SEQ ID NO: 56.
10. Una proteína que comprende una secuencia aminoacídica que consiste en 221 aminoácidos expuestos en la posición aminoacídica 1-221 de la SEQ ID NO: 10.
11. Un polinucleótido que codifica una secuencia aminoacídica expuesta en la posición aminoacídica 1-221 de la SEQ ID NO: 10.
12. Un polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 11, en la que la secuencia de bases está expuesta en la SEQ ID NO: 57.
13. Un vector que comprende un polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11 ó 12.
14. Una célula transformada con el vector según la reivindicación 13, a manera de permitir la expresión ahí del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3, 5, 6, 8, 8, 11 ó 12.
15. Un proceso para producir una proteína, proceso que comprende las etapas de cultivar una célula según la reivindicación 14 y recoger las proteínas hCL-L2 así producidas.
16. Un proceso para cribar un fármaco, en el que la proteína según la reivindicación 1, 4, 7 ó 10 es usada.
17. La célula según la reivindicación 14, en la que la célula es una célula de Escherichia coli, una célula animal o una célula de insecto.
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