JP2002523099A - 新規なヒトリゾチーム遺伝子、それによりコードされたポリペプチド、およびそれらの作製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、リゾチーム遺伝子ファミリーの新規なメンバーであるＬＹＣ１に関するものである。本発明は新規なリゾチームをコードするｃＤＮＡ配列、その配列によりコードされたポリペプチド、および遺伝子組換え技術を用いた新規なヒトリゾチームの作製方法を提供する。また、本発明は、その新規なヒトリゾチームの用途を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、新しいポリヌクレオチド、そのポリヌクレオチドによりコードされ
たポリペプチド、およびそれらの用途に関するものである。具体的には、本発明
はリゾチーム・ファミリーの新しいメンバーに関するものである。

【０００２】

【従来の技術】

リゾチームは生体の殆どの部分、例えば各種の組織、器官および血清などに広
く存在している。また、ニワトリの卵白の中により多く含まれている。リゾチー
ムは、主に、特定の腺上皮細胞或いはある種の白血球細胞により分泌される。

【０００３】 リゾチームは、フレミング(Fleming)等によって１９２２年に初めて報告され
た。その後、リゾチームについての研究は広く行われ、リゾチームの結晶構造、
タンパク質触媒性ドメイン、触媒動力学、免疫学、分子進化等に関する論文が多
く発表されている。リゾチームは最も広く、深く研究されているタンパク質の一
つとも言える。しかし、リゾチームの遺伝子に関する研究はまだ不十分である。
今までにクローニングされたリゾチーム遺伝子は、異なる種からの数種のもので
あり、例えば、大腸菌Ｔ４、サルモネラP２２ファージ、バチルスφファージ、
ニワトリ等からのリゾチーム遺伝子が挙げられる(1983 J．Mol. Biol. 165, 229
―248；1985, Virology 143，280−289；1987, Proc．Natl．Acad．Sci．USA，8
4，955−958；Proc．Natl．Acad．Sci．USA，77，5759−5763)。また、ヒトのリ
ゾチーム遺伝子のクローニングに関する報告もある(1988 Gene 66，223−234)。

【０００４】 リゾチームの主な機能は、細菌細胞壁のＮＡＭ（Ｎ−アセチルムラミン酸）と
ＮＡＧ(Ｎ−アセチルグルコン酸)間のβ(1−4)グリコシド結合を加水分解するこ
とである。生体内のリゾチームは、細菌感染に対して非特異的な免疫分子として
作用する。また、腸内および細菌を常食して生存する軟体動物中で一種の消化酵
素として作用する。さらに、リゾチームは、腫瘍の増大を抑制する機能を持って
いる。リゾチームは上述した機能を有することから、産業および医学の両分野に
おいて重要な応用価値を有する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】

本発明は、新しいポリヌクレオチドを提供することを目的とする。そのポリヌ
クレオチドは、リゾチーム遺伝子ファミリーの新しいメンバーをコードするもの
である。新しいヒトリゾチームはＬＹＣ１と命名されている。

【０００６】 また、本発明は、リゾチームタンパク質ファミリーの新しいメンバーを提供す
ることを目的とする。このリゾチームは、ＬＹＣ１と命名されている。

【０００７】 さらに、本発明は、遺伝子組換え技術により上記の新しいヒトリゾチームを作
製するた新しい方法を提供することを目的とする。

【０００８】 また、本発明は、ヒトリゾチーム遺伝子およびそのコード配列の用途に関する
ものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】

一つの側面において、本発明は、単離された一種のＤＮＡ分子を提供する。こ
のＤＮＡ分子は、ヒトＬＹＣ１タンパク質活性を持つポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を含む。上記のヌクレオチド配列は、配列番号４の８４−５３
０番目のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を持つ。或いは、上記の
ヌクレオチド配列は、中位にストリンジェントな条件下で配列番号４の８４−５
３０番目のヌクレオチド配列とハイブリダイズすることができる。好ましくは、
上記のヌクレオチドは、配列番号５のアミノ酸配列、或いは配列番号５の２０−
１４８番目のアミノ酸配列を含むポリぺプチドをコードしている。更に好ましく
は、そのヌクレオチド配列は、配列番号４の８４−５３０番目のヌクレオチド配
列を含むものである。

【００１０】 さらに、本発明は、単離されたＬＹＣ１ポリペプチドを提供する。そのポリペ
プチドは、配列番号５のアミノ酸配列、配列番号５の２０−１４８番目のアミノ
酸配列を有するポリぺプチド、その活性断片、またはその活性誘導体を含む。好
ましくは、このポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸配列か、或いは配列番号
５の２０−１４８番目のアミノ酸配列を有するものである。

【００１１】 また、本発明は、上述したＤＮＡを含むベクタ−を提供する。

【００１２】 さらに、本発明は、そのベクタ−によって形質転換された宿主細胞を提供する
。

【００１３】 別の側面においては、本発明は、ＬＹＣ１タンパク質活性を持つポリペプチド
を作製する方法を提供する。その方法は下記の通りである。 （ａ）ＬＹＣ１タンパク質活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を含むＬＹＣ１タンパク質の発現ベクターを形成する。ここで、上記のヌ
クレオチド配列は、発現調節配列と作動的に連結されており、且つ配列番号４の
８４−５３０番目のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を持つ。 （ｂ）ステップ（ａ）得られたベクターを、宿主細胞に導入し、ＬＹＣ１タン
パク質の組換え細胞を形成する。 （ｃ）ＬＹＣ１ポリペプチドの発現に適した条件下で、ステップ（ｂ）の組換
え細胞を培養する。 （ｄ）ＬＹＣ１タンパク質活性を持つポリペプチドを単離する。

【００１４】

【発明の実施の形態】

本発明の一つの実施形態においては、単離されたポリヌクレオチドは、５８３
個のヌクレオチド完全長を有し、その詳しい配列は配列番号４に示される。オー
プンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、８４−５３０番目ヌクレオチドに位置
する。

【００１５】 本発明においては、「単離した」、「精製した」、または「実質的に純粋な」Ｄ
ＮＡとは、天然状態下で両側の配列からＤＮＡ或いはＤＮＡ断片が単離されたこ
とを意味する。また、上記用語は、天然において核酸に付随している他の成分、
および細胞中で天然状態で核酸に付随しているタンパク質から単離されたＤＮＡ
或いはＤＮＡ断片を意味する。

【００１６】 本発明では、「ＬＹＣ１タンパク質をコードする配列」、或いは「ＬＹＣ１ポ
リペプチドをコードする配列」とは、ＬＹＣ１タンパク質活性を持つポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列のことであり、例えば、配列番号４の８４−５
３０番目のヌクレオチド配列またはその縮重配列のことである。縮重配列とは、
配列番号４の８４−５３０番目ヌクレオチド配列であるＯＲＦ中、一個以上のコ
ドンを同じアミノ酸をコードする縮重コドンにより置換した配列のことである。
コドンの縮重によって、配列番号４の８４−５３０番目ヌクレオチド配列と最低
約７０％の相同性を持つ縮重配列も、配列番号５で示されたアミノ酸配列をコー
ドすることができる。この用語は、中位にストリンジェントな条件下で、好まし
くは高度にストリンジェントな条件下、配列番号４の８４−５３０番目のヌクレ
オチド配列とハイブリダイズする配列を指す。また、この用語は、配列番号４の
８４−５３０番目のヌクレオチド配列との相同性が少なくとも７０％、好ましく
は少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の配列が含まれる。さ
らに、この用語には、シグナルぺプチドを除いた後の成熟なタンパク質をコード
するヌクレオチド配列、例えば配列番号４の１４１−５３０番目のヌクレオチド
配列が含まれる。

【００１７】 この用語は、ヒトＬＹＣ１タンパク質と同じ機能を持つタンパク質をコードす
る配列番号４の配列の変異体をも指す。変異体とは以下のものを含むが、それら
には限定されない。すなわち、数個の（普通は１−９０個、好ましくは１−６０
個、より好ましくは１０−２０個、最も好ましくは１−１０個）のヌクレオチド
の欠失、挿入、および／或いは置換、５’末端および/或いは３’末端への数個
（普通は６０個以内、好ましくは３０個以内、より好ましくは１０個以内、最も
好ましくは５個以内）のヌクレオチドの付加である。

【００１８】 本発明においては、「実質的に純粋な」タンパク質或いはポリペプチドとは、
少なくともサンプル総重量（乾燥重量或いは湿重量）の２０％、好ましくは５０
％、より好ましくは８０％、最も好ましくは９０％を占めるものを指す。純度に
ついては、ポリペプチドの場合には、カラムクロマトグラフィー、ＰＡＧＥ或い
はＨＰＬＣ分析等の適切な方法で測定することができる。実質的に純粋なポリペ
プチドは、天然状態下で伴う他の成分を本質的に含んでいない。

【００１９】 本発明においては、「ＬＹＣ１ポリペプチド」或いは「ＬＹＣ１タンパク質」
とは、ＬＹＣ１タンパク質活性を持つ配列番号５の配列、または配列番号５の２
０−１４８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。また、ヒトリゾチ
ームと同じ機能を持つ該配列の変異体をも指す。これら変異体とは、下記のもの
を含むが、それらには限定されない。すなわち、数個（普通は１−５０個、好ま
しくは１−３０個、より好ましくは１−２０個、最も好ましくは１−１０個）の
アミノ酸の欠失、挿入、および/或いは置換、Ｃ末端および/或いはＮ末端への一
個以上（普通は２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）
のアミノ酸の付加である。例えば、アミノ酸残基が同様なまたは類似するもので
置換されても、タンパク質の機能は通常変わらない。また、Ｃ末端および/或い
はＮ末端への一個或いは数個のアミノ酸を付加しても、そのタンパク質の機能は
変わらない。また、この用語には、ＬＹＣ１タンパク質の活性断片と活性誘導体
も含まれる。

【００２０】 ポリペプチドの変異体は下記のものを含んでいる。相同配列、アルレ変異体、
自然突然変異体、誘発変異体、高度或いは低度にストリンジェントな条件下でＬ
ＹＣ１ ＤＮＡとハイブリダイズするＤＮＡによってコードされたタンパク質、
および抗ＬＹＣ１ポリペプチドの抗血清より得られたポリペプチド或いはタンパ
ク質である。本発明は、例えばＬＹＣ１ポリペプチド或いはその断片を含む融合
タンパク質等の他のポリペプチドをも提供する。本発明は、実質的に全長である
ポリぺプチド以外に、ＬＹＣ１ポリぺプチドの可溶性断片をも提供する。この断
片は、ヒトＬＹＣ１ポリペプチド配列の少なくとも１０個、通常では少なくとも
３０個、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも８０個、最も
好ましくは少なくとも１００個の連続アミノ酸を含む。

【００２１】 本発明は、ＬＹＣ１タンパク質或いはポリペプチドの類似体をも提供する。こ
れらの類似体は、天然ＬＹＣ１ポリペプチドとアミノ酸配列の違いによるか、或
いは配列に影響を与えない修飾によるか、或いはそれらの両方によって異なる。
これらの類似体には、天然或いは誘発的遺伝変異体も含まれる。誘発変異体は、
例えば突然変異誘発物質への暴露や放射線によるランダム変異、部位特異的突然
変異誘発方法、或いはその他の分子生物学手法等の各種の方法で得られる。また
、これらの類似体には、天然Ｌ−アミノ酸以外のアミノ酸残基(例えば：Ｄ−ア
ミノ酸)、或いは非天然、または合成アミノ酸（例えばβ、γ―アミノ酸）等を
含むものが含まれる。さらに、本発明のポリペプチドは、上述した代表的なポリ
ペプチドに限定されないことを理解するべきである。

【００２２】 「修飾」(通常タンパク質の第一構造を変化させない)とは、ポリペプチドのイ
ンビボ或いはインビトロにおいての誘導化、例えば、アセチル化やカルボキシル
化等を含む。また、グリコシル化による修飾も含まれており、例えば、ポリペプ
チドの合成、処理および更なる処理の段階で行ったポリペプチドのグリコシル化
パターンを修飾することによって得られるものがある。例えば、この修飾は、前
記ペプチドを、グリコシル化に影響する酵素（例えば、哺乳動物のグリコシル化
或いは脱グリコシル化酵素）に晒すことによる。さらに、リン酸化アミノ酸残基
（例えば、リン酸化チロシン、リン酸化セリン、リン酸化トレオニン）を含むア
ミノ酸配列と同様に、修飾による抗加水分解機能或いは水溶性が高まった配列も
含まれている。

【００２３】 本発明には、ＬＹＣ１ポリペプチドをコードする配列のアンチセンス配列も含
まれている。このアンチセンス配列は、細胞内でのＬＹＣ１発現を抑制するのに
使用することができる。

【００２４】 本発明はプローブも含んでいる。このプローブは、通常８−１００個（好まし
くは１５−５０個）の連続的なヌクレオチドを含む。また、このプロ−ブは、サ
ンプル中のＬＹＣ１遺伝子をコードする核酸分子の存在を検出するのに用いられ
る。

【００２５】 本発明は、ＬＹＣ１ヌクレオチド配列の検出方法をも含む。つまり、上記のプ
ローブとサンプルをハイブリダイズさせ、プローブ結合を検出することからなる
。好ましくは、サンプルはＰＣＲの増幅産物である。ＰＣＲ増幅用のプライマ−
は、ＬＹＣ１ポリペプチドのコード配列と対応し、ＬＹＣ１のコード配列の両側
或いは中央に位置するものである。プライマ−の長さは通常２０−５０個のヌク
レオチドである。

【００２６】 本発明では、例えば、市販のベクター等、当該分野で公知のベクターを使うこ
とができる。

【００２７】 本発明では、「宿主細胞」には、原核細胞と真核細胞が含まれている。一般的
な原核細胞には大腸菌、枯草菌などがある。一般的な真核細胞には、酵母細胞、
昆虫細胞および哺乳動物細胞がある。「宿主細胞」は真核細胞で、例えば、ＣＨ
Ｏ細胞やＣＯＳ細胞等であることが好ましい。

【００２８】 別の側面において、本発明は、ＬＹＣ１ ＤＮＡ或いはその断片でコードされ
るポリペプチドに特異性のある抗体、好ましくはモノクローナル抗体をも含む。
ここでは、「特異性」とは抗体がＬＹＣ１遺伝子産物或いはその断片と結合でき
ることである。これらの抗体は、ＬＹＣ１遺伝子産物或いはその断片と結合でき
るが、他の無関係抗原分子を実質的に認識せず、結合しないことが好ましい。本
発明の抗体の中には、ＬＹＣ１と結合してＬＹＣ１タンパク質を阻害する抗体と
、ＬＹＣ１の機能に影響を与えない抗体との両方が含まれる。また、本発明は、
修飾型或いは非修飾型のＬＹＣ１遺伝子産物と結合する抗体をも含む。

【００２９】 本発明は、そのままのモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のみなら
ず、免疫活性を持つ抗体断片をも含む。例えば、Fab'或いは(Fab)2断片、抗体の
Ｌ鎖、抗体のＨ鎖、遺伝工学的に処理された一本鎖Fv分子（Ladner等、米国特許
第4，946，778号）、或いはキメラ抗体がある。キメラ抗体は、例えば、ネズミ
抗体の結合特異性を持ち、しかもヒト由来の抗体部分がなお残っている抗体であ
る。

【００３０】 本発明の抗体は、当業者にとって公知である種々の手法によって作製すること
ができる。例えば、精製されたＬＹＣ１遺伝子産物或いはその抗原性のある断片
を動物に投与してポリクローナル抗体の生成を誘起することができる。同様に、
ＬＹＣ１或いはその抗原性のある断片を発現した細胞を用いて、動物を免疫感作
し、抗体を生成させることができる。本発明の抗体は、ハイブドーマ手法で作製
できるモノクローナル抗体でありえる（Kohler等、Nature 256；495，1975；Koh
ler等、Eur．J．immunol．6：511，1976；Kohler等、Eur．J．immunol．6：296
，1976；Hammerling等、In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，El
sevier，N．Y．，1984）。本発明の抗体は、ＬＹＣ１の機能を阻害できるものと
ＬＹＣ１機能に影響を与えないものの両方を含む。本発明の抗体は、ＬＹＣ１遺
伝子産物の断片或いはその機能領域を用いて通常の免疫学的手法で作製すること
ができる。これらの断片または機能領域は、遺伝子組換え技術或いはポリペプチ
ド・シンセサイザーで合成できる。ＬＹＣ１遺伝子産物の非修飾体と結合する抗
体は、原核細胞（例えば、大腸菌）から得られた遺伝子産物を用いて、動物を免
疫感作することによって作製できる。翻訳後の修飾された産物と結合する抗体は
、真核細胞（例えば、酵母或いは昆虫細胞）で得られた遺伝子産物を用いて、動
物を免疫感作することによって作製できる。

【００３１】 本発明のＬＹＣ１の全長ヌクレオチド配列またはその断片は、ＰＣＲ増幅、組
換え法または合成方法で作製することができる。ＰＣＲ増幅について、本発明で
開示したヌクレオチド配列、特にＯＲＦ配列を基にプライマーを設計し、市販の
ｃＤＮＡライブラリー、または公知の従来法で作製したｃＤＮＡライブラリーを
鋳型にして、上記の配列を得ることができる。この配列が長い場合、二回以上回
ＰＣＲ増幅を行うこと、そして、増幅された断片を正しい順序に連結することが
必要である。

【００３２】 一旦、上記配列が得られると、組換え法を用いて、大量にその配列を作製する
ことができる。通常、その断片をベクターにクローニングし、細胞に形質移入す
る。その後、増殖した宿主細胞から通常の方法でその配列を単離する。

【００３３】 組換え法以外、本発明のタンパク質断片は、固相合成手法を用いて、直接的に
化学合成することによって作製できる(Stewart等(1969) Solid-phase peptide s
ynthesis, WH Freeman Co., San Francisco; Merrifield J. (1963) J. Am Chem
. Soc 85: 2149-2154)。インビトロでのタンパク質合成は、手動、もしくは自動
でできる。例えば、Applied Biosystemsの431A型ぺプチドシンセサイザー(Foste
r City，CA)を用いる。本発明のタンパク質断片を別々に化学合成し、そして、
化学的方法を用いて共に連結し、全長分子を作製することも可能である。

【００３４】 本発明のタンパク質をコードする配列は、遺伝子マッピングにも使うことがで
きる。例えば、ｃＤＮＡクローンと分裂中期の染色体とハイブリダイズさせて、
正確な染色体マッピングを実施することができる。この技術は、５００ｂｐとい
う短いｃＤＮＡを使うことができるが、２０００ｂｐ、或いはさらに長いｃＤＮ
Ａを使うこともできる。詳細については、Verma等のHuman Chromosomes: A Manu
al of Basic Techniques, Pergamon Press, New York(1988)を参照。

【００３５】 一旦、染色体上での配列の位置が正確に決定されると、本配列の染色体上での
物理的な位置と遺伝子マップデータとを関連させることができる。これらのデー
タは、例えば、メンデル(Mendelian)ヒト遺伝データベースから得ることができる
(Johns Hopkins University Welch Medical Libraryを通じて、オンラインで利
用可能である)。遺伝子と、それと同一の染色体領域にマップされた病気との関
連性が連鎖分析によって特定される。

【００３６】 次に、患者と健全者の間のｃＤＮＡ或いはゲノム配列の相違を確認することが
できる。もしある突然変異が一部分、または全部の患者にあり、健全者には無い
のなら、その突然変異はその病気を引き起こす原因である可能性がある。

【００３７】 本発明のタンパク質を利用して、各種の従来法で、ＬＹＣ１と相互作用のある
物質を選別することができる。これらの物質は、例えば受容体、阻害剤或いは拮
抗剤等である。

【００３８】 本発明のタンパク質、その抗体、阻害剤、拮抗剤或いは受容体等は、治療に使
う場合、異なる効果を提供することができる。通常、これらの物質は、無毒、不
活性の薬学的に許容される水性キャリアと調剤される。そのｐＨ値は、通常、５
−８で、好ましくは約６−８である。しかし、ｐＨ値は、調剤される物質の性質
や治療される病症により変化してもよい。調剤された薬学的組成物は、従来法で
投与される。これらは、例えば、筋肉、腹膜内、皮下、皮内、或いは局部投与で
あるが、それらには限定されない。

【００３９】 例えば、本発明のＬＹＣ１タンパク質は、薬学的に許容される適当なキャリア
と、共に投与することができる。例えば、キャリアには、生理食塩水、緩和液、
ブドウ糖、水、グリセリン、またはその組み合わせが含まれる。薬学的な製剤は
、デリバリーの方式に合わせるべきである。本発明のヒトＬＹＣ１タンパク質は
、注射剤に調剤できる。例えば、生理食塩水やブドウ糖とその他の補剤の水溶液
を用いて従来法で調剤することができる。錠剤やカプセルなどの薬学的組成物は
、通常の方法で調剤できる。注射剤、液体、錠剤およびカプセル等の薬学的組成
物は、無菌条件下で生産されなければならない。活性成分は、治療的に有効な量
、例えば体重１ｋｇ当たり一日約１μｇ−５ｍｇで投与される。さらに、本発明
のポリぺプチドを、他の治療薬と共に投与することができる。

【００４０】 本発明のヒトＬＹＣ１ポリぺプチドが薬物として使われる場合、治療的に有効
量を哺乳動物に投与する。通常、治療的に有効な量は、体重１ｋｇ当たり１０μ
ｇ以上で、ほとんどの場合８ｍｇ以下であり、好ましくは、体重１ｋｇ当たり約
１０μｇ−１ｍｇである。当然であるが、正確な有効量は、デリバリーの方法、
患者の健康状態等の要因により、それは熟練医師の裁量である。

【００４１】 本発明の実施形態の一つでは、本発明のポリヌクレオチドは、全長で５８３ｂ
ｐであり、その詳しい配列は配列番号４に示されており、その中でＯＲＦは、８
４−５３０番目に位置する。このポリヌクレオチドは以下のようにして得られる
。すなわち、ヒト脳λgtllｃＤＮＡライブラリー（Clontech）を鋳型とし、順方
向プライマーＡ１:５’− TAAGGAAACCTGGCTGCCCTCTC−３’（配列番号１）と逆
方向プライマーＢ: ５’− CTGAGTGAGGACAGGAGTCTTGG -３’（配列番号２）を用
いてＰＣＲを行った。次に、上述のＰＣＲ断片を鋳型とし、順方向プライマーＡ
２:５’− CCAGGCTCTCAGAGAAGATCAGC −３’（配列番号３）と逆方向プライマー
Ｂを用いて追加のＰＣＲを行った。二回のＰＣＲで６１４ｂｐ（Ａ１Ｂ産物）と
５８１ｂｐ（Ａ２Ｂ産物）の目的断片をそれぞれ得た。さらに、ＰＣＲ産物Ａ２
Ｂの配列を決定し、配列番号４に示す全長ｃＤＮＡ配列を得た。

【００４２】 相同性の比較では、本発明のヌクレオチド配列およびそれによりコードされる
タンパク質のアミノ酸配列は、異なる出所の他のリゾチームと著しい相同性を示
した。従って、本発明のリゾチームは、リゾチーム・ファミリーの新しいメンバ
ーであり、そのファミリーのある種の重要な機能を持つことが示唆される。

【００４３】 リゾチームは、細菌細胞壁のＮＡＭ（Ｎ−アセチルムラミン酸）とＮＡＧ(Ｎ
−アセチルグルコン酸)間のβ(1−4)グリコシド結合を加水分解することにより
細胞を分解する。生体内のリゾチームは細菌感染に対して非特異的な免疫分子と
して作用する。また、腸内および細菌を常食して生存する軟体動物中で一種の消
化酵素として作用する。さらに、リゾチームは腫瘍の増大を抑制する機能を持っ
ている。１９５５年、CaselliおよびShumacher(Boll Ocul,34：513―533,1955)
は、ラウス肉腫ウイルスによって感染されたニワトリ角膜中の腫瘍形成を、リゾ
チームが関与し、その７０％を阻害することを報告した。また、リゾチームが腫
瘍の転移プロセスに関与し、腫瘍細胞のリン脂質および糖脂質分子と相互作用す
ることも多くの実験より証明された。リゾチームのヒト腫瘍に対する抑制作用も
報告され、特許となっている(1980 日本国公開特許公報33,409、1980 日本国
公開特許公報33,40８)。リゾチームの腫瘍抑制メカニズムには以下の二つの可能
性がある。すなわち、（１）リゾチームが直接、生物の免疫機能を活性化するこ
とであり、（２）リゾチームが間接的に生物の免疫機能を高めることである(198
9 Anticancer Research 9，583−592)。

【００４４】 本発明は、さらに以下の実施例によって説明される。これらの実施例は,本発
明を例示することを意図するのみであり、本発明の範囲を限定することを意図し
ないと理解される。以下の実施例における実験方法については、慣用の条件下に
実施されるものであり、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laborator
y Mannual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989に記載され
ているか、別記のない限り製造業者の指示どおりのものである。

【００４５】

【実施例】

（実施例１） LYC1 cDNA配列のクローニングおよびシークエンシング １．プライマーによる増幅 鋳型はヒト脳λgtllcDNAライブラリー（Clontechから商業的に入手可能）であ
った。順方向プライマー、A1:５’−TAAGGAAACCTGGCTGCCCTCTC−３’（配列番号
１）および逆方向プライマー、B１:５’−CTGAGTGAGGACAGGAGTCTTGG−３’（配
列番号２）を用いて、PCRを行った。A1/BのPCR条件は、次のとおりであった。す
なわち、93℃で4分間、続いて、93℃で１分間、70℃で1分間、72℃で1分間、最
後に72℃で5分間の３５サイクルであった。それから、前記PCR産物を鋳型として
、順方向プライマーA2:５’−CCAGGCTCTCAGAGAAGATCAGC−３’（配列番号３）お
よび逆方向プライマーBでさらにPCRを行なった。そのPCR条件は、次のとおりで
あった。すなわち、93℃で4分間、続いて、93℃で１分間、70℃で1分間、72℃で
1分間、最後に72℃で5分間の３５サイクルであった。PCR断片を電気泳動によっ
て検出した。プライマーA1およびBによって増幅した目的断片は614bpであり、プ
ライマーA2およびBによって増幅した目的断片は583bpであった。

【００４６】 ２．PCR産物のシークエンシング プライマーA2およびBによって増幅したPCR産物をpGEM−Tベクター(登録商標、
Promega)と連結し、Ｅ．Coli JM103に形質移入した。QIAprep Plasmid キッ
ト(QIAGEN)を用いてプラスミドを抽出した。二本鎖ネステッド欠失キット（Phar
macia）で挿入断片の配向性連続欠失を実行した。PCRによって欠失体をすばやく
同定し、順に並べた。欠失体を次々に切り出し、SequiTherm EXCEL DNA シー
クエンシングキット（商標、Epicentre Technologies）でシークエンスした。
コンピュータソフトを用いて、配列を重ね合わせることによって583bpの全長cDN
A配列を得た。詳しい配列は、配列番号４に示すが、その中でORF（オープンリー
デイングフレーム）は84−530番目のヌクレオチドに位置する。

【００４７】 得られた全長cDNA配列に基づき、LYC1のアミノ酸配列を全部で148個のアミノ
酸残基を有すると推定した。その詳しいアミノ酸配列については、配列番号５を
参照。

【００４８】 （実施例２） 相同性比較 LYC1の全長cDNA配列とそのコードされたタンパク質を使用して、Non−redunda
nt（非重複性）Genbank＋EMBL＋DDBJ＋PDBおよびNon−redundant Genbank CDS
translations＋PDB＋SwissProt＋Spupdate＋PIRデータベースをBLASTアルゴリ
ズムによって相同性スクリーニングした。その結果、それらはリゾチーム・ファ
ミリーの他のメンバーと高い相同性を共有することが明らかとなった。PCGENEソ
フトで解析すると、LYC1のアミノ酸配列は、コウライキジ(ring-necked pheasan
t)のリゾチームC(sp/p00702)と46.3％同一性と60％類似性(図1A)、およびキジ(g
reen pheasant)のリゾチームC(sp/p49663)と45．4％同一性と59.2％類似性を有
している(図1B)。

【００４９】 特に、LYC1のアミノ酸配列にはリゾチームとαラクトアルブミンからの19個の
アミノ酸の特徴配列、すなわち、CX₃CX₂(L/M/F)X₃(D/E/N)(L/I)X₅C[配列中、Xは
任意アミノ酸を、“2”などの数字はアミノ酸の数を、“(L／M／H)”はこれらの
３つのアミノ酸のいずれかを示す]。リゾチームとαラクトアルブミンは進化上
、密接に関連している２つのタンパク質である(Eur．J．Biochem．182: 111−11
8)。本発明のタンパク質では、前記特徴配列に相当するのは、CHVDCQDLLNPNLLAG
IHC（配列番号５の94−112番目残基）である。このことから、本発明のLYC1はリ
ゾチーム・ファミリーに属し、そして該リゾチーム・ファミリーの関連機能を有
することが示される。

【００５０】 ヒトLYC1タンパク質は、19個のアミノ酸のシグナルぺプチド(配列番号５の1−
19番目残基)を有する。そのシグナルぺプチドが開裂した後、成熟なヒトLYC1タ
ンパク質は、配列番号５の20−148番目残基のアミノ酸配列を有する。

【００５１】 リゾチームは細菌細胞壁のＮ−アセチルムラミン酸(NAM)とＮ−アセチルグル
コン酸(NAG)間のβ(1−4)グリコシド結合を分解することにより細胞を分解でき
る。生体内のリゾチームは、細菌感染に対して非特異的な免疫分子として作用し
、さらに、腸内および細菌を常食して生存する軟体動物中で一種の消化酵素とし
て作用する。

【００５２】 リゾチームは、産業や医学の分野で重要な応用価値があるものである。

【００５３】 まず、産業(主に食品産業)においては、リゾチームは食品の防腐剤や添加剤と
して使用できる。この分野で、日本はリゾチームの数多くの用途を開発してきて
、多くの特許を保有する。例えば、新鮮な果物、野菜、豆乳、海鮮食品および肉
類の防腐剤として用いられている。また、ヒト乳に似せるために、リゾチームは
乳児食品の添加剤としても使用することができる(1988, Crit Rev Food Sci Nut
r 26(4): 359−395)。

【００５４】 薬学的用途において、リゾチームはウイルスや細菌の感染症を治療するのに用
いることができる。例えば、EDTA−tris−リゾチーム溶液は、大腸菌感染によっ
て引き起こされるシュードモナス膀胱炎に効果がある。ヒトや動物の血清リゾチ
ーム濃度は、感染の指標である。Zajackowska−BialowasおよびMuraiは、唾液リ
ゾチーム活性と口腔病の関係について調べた。その結果から、リゾチームは慢性
歯周炎に明白な緩和作用を有することが示された。さらに、リゾチームとある種
の抗生物質との相乗効果が見出された。リゾチームが単独で使用されたとき、多
量の使用でも、黄色ブドウ球菌(S.aures)に対する溶菌効果は小さかった。しか
しながら、アモキシリンの存在下で溶菌効果は高まり、さらにリゾチーム量と比
例した（1988 Crit Rev Food Sci．Nutr 26(4): 359−395）。

【００５５】 また、リゾチームは腫瘍の増大を抑制する機能を有する。１９５５年、Casell
iおよびShumacher(1955 Boll Ocul 34: 513-533)は、ラウス肉腫ウイルスによっ
て感染されたニワトリ角膜中の腫瘍形成をリゾチームが関与し、その７０％を阻
害することを報告した。また、リゾチームが腫瘍転移の抑制に対して、ある因果
関係を有することは、その他の多くの実験より証明された(1988 Clin. Expl. Me
tastasis 6: 245−253；1998 Folia Oncol 10, Suppl A: 219−224；1988 Eur
Ｊ. Cancer Clin. Onco. 124: 1737−1743)。また、リゾチームが腫瘍細胞のリ
ン脂質および糖脂質分子と相互作用することも発見されている。リゾチームのヒ
ト腫瘍に対する抑制作用も報告された。Laterzaは、手術と放射線療法後の転移
を伴う小腸細網状肉腫の一症例の治療に成功した（“Atti del II Simposium In
ternazionale sul Lisozima"，Milano．7−8−9 1961．Vol I，sez V，pp49−50
）。Battagliaらは、胃癌、前立腺癌、子宮癌、乳癌の治療において、リゾチー
ムが腫瘍の大きさを減らすことは出来ないが、痛みを和らげる作用と回復補助作
用が明らかであることを見出した（“Atti del II Simposium Internazionale s
ul Lisozima di Fleming", Milano．3−4−5 1964．Vol I，sez IV，pp69−76）
。日本では、リゾチームの癌治療への応用は、既に特許となっている(1980日本
国公開特許公報33,409、1980日本国公開特許公報33,408)。その他、A．Vaccaら
は1985年に、リゾチームを免疫調節剤として経口投入する化学免疫療法によって
、多発性骨髄腫を治療する試みを報告した。彼らの実験では、多量のリゾチーム
で処置された患者の５０％が、対照と比較して免疫能力が高まったことが示され
た（Chemiother IV ｎ．2: 147−155，1985）。リゾチームの腫瘍抑制メカニズ
ムには以下の二つの可能性がある。すなわち、（１）リゾチームが直接、生物の
免疫機能を活性化することであり、（２）リゾチームが間接的に生物の免疫機能
を高めることである(1989 Anticancer Research 9，583−592)。

【００５６】 （実施例３） 大腸菌でのLYC1の発現 ヒト脳λgtllcDNAライブラリー（Clontech）を鋳型として用い、LYC1をコード
するcDNA配列を該DNA配列の5’と3’末端に対応するオリゴヌクレオチドPCRプラ
イマーで増幅した。得られた産物を挿入断片として使用した。

【００５７】 5’末端オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、5’-GCTGGATCCATGACAAAGGCG
CTACTCAT-3’(配列番号６)であった。

【００５８】 このプライマーは、制限エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位、続いて開始コ
ドンから始まるLYC1コード配列の19個のヌクレオチドを含んでいた。

【００５９】 3’末端プライマーの配列は、5’-CATGTCGACTCATCTCAGGCGGCATCCTG-3’(配列
番号７)であった。

【００６０】 このプライマーは、制限エンドヌクレアーゼSalIの切断部位、翻訳ターミネー
ターおよび部分LYC1コード配列を含んでいた。

【００６１】 プライマーにある前記の制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、細菌発現用の
ベクターpQE-9(Qiagen Inc. Chatsworth, CA)の切断部位に対応していた。そのベ
クターpQE-9は、抗生物質(Ampr)への抵抗性、細菌の複製起点(ori)、IPTGの調節
可能なプロモター／オペロン(P／O)、リボソーム結合部位(RBS)、６個のヒスチ
ジンタグ(6-His)、および制限エンドヌクレアーゼのクローニング部位をコード
する。

【００６２】 BamHIとSalIでベクターpQE−9と挿入断片を消化して、それから確実にオープ
ンリーデイングフレームが細菌のRBSから始まるよう、ともに連結した。その後
、前記連結混合物を用いて、大腸菌M15/rep4(Qiagen)を形質転換したが、これは
複数コピーのpREP4プラスミドを含み、後者はLacIリプレッサーを発現し、かつ
カナマイシン(Kan^r)に抵抗性であった。AmpとKanを含むLB培地上で形質転換体を
選択した。Amp(100μg/ml)とKan（25μg/ml）を追加したLB液体培地中で形質転
換体のポジテイブクローンを一晩培養した。プラスミドを抽出した。挿入断片の
サイズと向きをHindIII消化によって検証した。シークエンシングからLYC1のcDN
A断片は正しく前記ベクターに挿入されたことを確かめた。

【００６３】 一晩培養したものを1:100〜1:250に希釈し、大容積の培地に接種し、600nmの光
学密度(OD₆₀₀)が0.4〜0.6になるまで培養した。IPTG（イソプロピルチオ−β−D
−ガラクトシド）を最終濃度が1mMになるまで添加した。LacIリプレッサーを失
活させることによって、IPTGはプロモターP/Oを誘導し、遺伝子発現を増加させ
た。細胞をさらに3〜4時間培養した後、遠心分離(6000×g、20分間)を行った。
培養物を超音波処理し、細胞溶解物を回収し、6Ｍグアニジン塩酸塩で希釈した
。清澄化後、溶液に溶解したLYC1を、6-Hisでタグされたタンパク質とカラムが
緊密に結合できる条件下、ニッケルキレート・カラムクロマトグラフィ−によっ
て精製した。LYC1を6Mグアニジン塩酸塩(pH5.0)で溶出した。数種の方法でグア
ニジン塩酸塩から変性タンパク質を沈殿させた。第一の方法として、透析により
グアニジン塩酸塩を分離した。別法として、ニッケルキレート・カラムから単離
した、精製タンパク質を二番目のグアニジン塩酸塩が直線勾配となって減少して
いるカラムに結合させた。そのカラムに結合するとき、タンパク質は変性し、そ
れからグアニジン塩酸塩(pH5.0)で溶出した。最後に、可溶性タンパク質をPBSで
透析し、10％(w/v)の最終グリセロール濃度を有するグリセロールストック溶液
に保存した。

【００６４】 12％SDS-PAGEによって確認すると、前記発現タンパク質の分子量は約17kDaで
あった。

【００６５】 さらに、その発現タンパク質のNおよびC末端のそれぞれ10個のアミノ酸をシー
クエンスした結果から、それらの配列が配列番号５のものと同一であることが示
された。

【００６６】 （実施例4） 真核細胞(CHO細胞株)でのLYC1の発現 本実施例では、ヒト脳λgtllcDNAライブラリー（Clontech）を鋳型として用い
、LYC1をコードするcDNA配列を該DNA配列の5’と3’末端に対応するオリゴヌク
レオチドPCRプライマーで増幅した。得られた産物を挿入断片として使用した。

【００６７】 5’末端オリゴヌクレオチドプライマーの配列は、5’-GCTAAGCTTATGACAAAGGCG
CTACTCAT-3’(配列番号８)であった。

【００６８】 このプライマーは、制限エンドヌクレアーゼHindIIIの切断部位、続いて開始
コドンから始まるLYC1コード配列の20個のヌクレオチドを含んでいた。

【００６９】 3’末端プライマーの配列は、5’-CATGGATCCTCATCTCAGGCGGCATCCTG-3’(配列
番号９)であった。

【００７０】 このプライマーは、制限エンドヌクレアーゼBamHIの切断部位、翻訳終結コド
ンと部分LYC1コード配列を含んでいた。

【００７１】 プライマーにある前記の制限エンドヌクレアーゼの切断部位は、CHO細胞発現
用のベクターpcDNA3の切断部位に対応していた。このベクターは、二種類の抗生
物質(Amp^rとNeo^r)への抵抗性、ファージ複製起点(fl ori)、ウイルス複製起点(SV
40 ori)、T7プロモター、ウイルスプロモター(P-CMV)、Sp6プロモター、SV40の
ポリアデニル化シグナルとそのポリA配列、BGHのポリアデニル化シグナルとその
ポリA配列をコードする。

【００７２】 HindIIIとBamHIでベクターpcDNA3と挿入断片を消化して、ともに連結した。続
いて、前記連結混合物で大腸菌株DH5αを形質転換した。Ampを含むLB培地上で形
質転換体を選択した。Amp(100μg/ml)を追加したLB液体培地中で目的構築物を含
むクローンを一晩培養した。プラスミドを抽出した。シークエンシングからLYC1
のcDNA断片は正しく前記ベクターに挿入されたことが示された。

【００７３】 プラスミッド類をLipofectinキット(GiBco Life)でリポフェクションによって
CHO細胞にトランスフェクトした。細胞を48時間トランスフェクションし、2〜3週
間G418で該細胞を選択した後、細胞とその上澄み液を回収し、そして発現タンパ
ク質の酵素活性を測定した。G418を除き、さらに形質転換体を続いて継代培養した
。その混合クローン細胞を限界希釈し、よりタンパク活性の高いサブクローンを選
択した。常法に従い前記のポジティブサブクローンを大量培養した。48時間後、
細胞とその上澄み液を回収した。細胞を超音波処理した。0.05％のTritonを含む
50mMTris-HCl(pH7.6)溶液を平衡溶液および溶出液として使用し、予め平衡化さ
れたSuperdex G-75のカラムでタンパク質の活性ピークを集めた。さらに、0-1M
NaClを含む50mM Tris-HCl(pH8.0)溶液を溶出液として使用し、50mM Tris-HCl(pH
8.0)で平衡化したDEAE-Sepharoseカラムで、傾斜勾配洗浄した。タンパク質の活
性ピークを回収した。発現タンパク質溶液をPBS(pH7.4)で透析し、最後に凍結乾
燥後、保存した。

【００７４】 12％SDS-PAGEによって確認すると、前記発現タンパク質の分子量は約1５kDaで
あった。

【００７５】 同時に、シグナルぺプチドを除去するために、5'末端オリゴヌクレオチドプラ
イマー(5’-GCTAAGCTTAGCCTCATCAGTCGCTG-3’(配列番号１０))を設計した。配列
番号９および１０をプライマーとして使用した以外は、上記の実施例4の手順を
繰り返した。分子量15kDaの発現タンパク質が得られが、これは前記シグナルぺ
プチド配列がないLYC1であった。

【００７６】 さらに、その発現タンパク質のNおよびC末端のそれぞれ10個のアミノ酸をシー
クエンスした結果から、それらの配列が配列番号５のものと同一であることが示
された。

【００７７】 （実施例5） 抗体の調製 上記の実施例で得られた組換えタンパク質を用いて、動物を免疫感作すること
により抗体を製造した。その方法は下記の通りであった。すなわち、前記組換え
タンパク質をクロマトグラフィーで分離し、使用のために保存した。別法として
、SDS-PAGE電気泳動によりタンパク質を単離し、その場合、ゲルから電気泳動の
バンドを切り出して得た。そのタンパク質を同じ体積のフロイント完全アジュバ
ンドで乳化した。50〜100μg/0.2mlの投与量で乳化したタンパク質をマウスに腹
腔内注射した。14日後、同一抗原をフロイント不完全アジュバンドで乳化し、これ
をマウスに50〜100μg/0.2mlの投与量で腹腔内注射し、追加免疫した。14日間隔
で、最低三回、追加免疫を実施した。得られた抗血清の特異的反応活性は、in v
itroでのLYC1遺伝子の翻訳産物を沈殿させる能力によって評価した。

【００７８】 本明細書で引用された全ての文献は、各文献がそれぞれ個別に援用されている
かのごとく本発明中に援用される。さらに、上記の本発明の教示のなかで、当業者
は、本発明に対して、種々の変更や修正を加えることができるが、これらは本明
細書の特許請求の範囲によって定められる本発明の範囲内にある等価物であると
理解される。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ヒトＬＹＣ１のアミノ酸配列と他のリゾチームのアミノ酸配列とのアライメン
ト比較図である。Ａは、ヒトＬＹＣ１アミノ酸配列とコウライキジ(ring-necked
pheasant)のリゾチームＣ(sp/p00702)のアミノ酸配列との相同性についての比
較を示す。Ｂは、ヒトＬＹＣ１のアミノ酸配列とキジ(green pheasant)のリゾチ
ームＣ（sp/p49663）のアミノ酸配列の相同性についての比較を示す。配列間で
同一のアミノ酸は”：”で、配列間で類似するアミノ酸は”・”で示される。類
似するアミノ酸は、A，S，T；D，E；N，Q；R，K；I，L, M，V；F，Y，Wである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/36 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 フ， チャン チャイナ， シャンハイ 200433， ハン ダン ロード 220， フダン ユニヴァ ーシティ， インスティテュート オブ ジェネティックス (72)発明者 ヅァオ， ヨン チャイナ， シャンハイ 200433， ハン ダン ロード 220， フダン ユニヴァ ーシティ， インスティテュート オブ ジェネティックス (72)発明者 ヅァン， ホンライ チャイナ， シャンハイ 200433， ハン ダン ロード 220， フダン ユニヴァ ーシティ， インスティテュート オブ ジェネティックス (72)発明者 ビ， アンディン チャイナ， シャンハイ 200433， ハン ダン ロード 220， フダン ユニヴァ ーシティ， インスティテュート オブ ジェネティックス Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA12 CA04 DA01 DA02 DA05 DA11 EA04 GA11 HA15 4B050 CC01 CC03 DD11 LL01 4B064 AG27 DA03 4B065 AA01X AA57X AA87X AA93Y AB01 AC14 BA02 CA31 CA44 4H045 AA10 AA11 BA10 CA40 DA76 EA20 FA72 FA74

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトＬＹＣ１タンパク質活性を有するポリペプチドをコード
   するヌクレオチド配列を含む単離されたＤＮＡ分子であって、 前記ヌクレオチド配列が、配列番号４の８４−５３０番目のヌクレオチド配列と
   少なくとも７０％の相同性を有し、或いは、前記ヌクレオチド配列は、中位にス
   トリンジェントな条件下で配列番号４の８４−５３０番目のヌクレオチド配列と
   ハイブリダイズできることを特徴とする、ＤＮＡ分子。
2. 【請求項２】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号５のアミノ酸配列または
   配列番号５の２０−１４８番目のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする
   ことを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ分子。
3. 【請求項３】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号４の８４−５３０番目の
   ヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項１記載のＤＮＡ分子。
4. 【請求項４】 配列番号５のアミノ酸配列または配列番号５の２０−１４８
   番目のアミノ酸配列を有するポリペプチド、その活性断片、またはその活性誘導
   体を含むことを特徴とする、単離されたＬＹＣ１ポリペプチド。
5. 【請求項５】 前記ポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列または配列
   番号５の２０−１４８番目のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特
   徴とする、請求項４記載のポリペプチド。
6. 【請求項６】 請求項1記載のＤＮＡ配列を含むベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 宿主細胞が大腸菌からなる、請求項７記載の宿主細胞。
9. 【請求項９】 宿主細胞が真核細胞からなる、請求項７記載の宿主細胞。
10. 【請求項１０】 ＬＹＣ１タンパク質活性を有するポリペプチドの作製方法
    であって、 （ａ）ＬＹＣ１タンパク質活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド
    配列であり、発現調節配列と作動的に連結されており、且つ配列番号４の８４−
    ５３０番目のヌクレオチド配列と少なくとも７０％の相同性を持つヌクレオチド
    配列を含むＬＹＣ１タンパク質の発現用ベクターを形成するステップ、 （ｂ）ステップ（ａ）で得られたベクターを宿主細胞に導入し、ＬＹＣ１タンパ
    ク質の組換え細胞を形成するステップ、 （ｃ）ＬＹＣ１ポリペプチドの発現に適した条件下で、ステップ（ｂ）の組換え
    細胞を培養するステップ、 （ｄ）ＬＹＣ１タンパク質活性を有するポリペプチドを単離するステップ、 を含むことを特徴とする、前記作製方法。
11. 【請求項１１】 前記ヌクレオチド配列が、配列番号４の８４−５３０番目
    のヌクレオチドを含むことを特徴とする、請求項１０記載の作製方法。
12. 【請求項１２】 請求項４記載のＬＹＣ１ポリペプチドで特異的に結合され
    る抗体。
13. 【請求項１３】 請求項１記載のＤＮＡ分子のアンチセンス配列であること
    を特徴とする、ヌクレオチド分子。
14. 【請求項１４】 請求項１記載のＤＮＡ分子の約８−１００個の連続的なヌ
    クレオチドを含むことを特徴とする、プローブ。