CZ20004256A3

CZ20004256A3 - Indukce antibiotických proteinů a peptidů LAIT/sCD14-proteinem

Info

Publication number: CZ20004256A3
Application number: CZ20004256A
Authority: CZ
Inventors: Michael H. Julius; Dominik Filipp
Original assignee: Gemma Biotechnology Ltd.
Priority date: 1998-05-27
Filing date: 1999-05-27
Publication date: 2001-09-12
Also published as: US20040259795A1; US7592310B2; HUP0101987A2; EP1080111B1; BR9910725A; CA2328134A1; AU4025899A; ID26730A; HK1041892A1; CN1322214A; PL345208A1; WO1999061468A2; WO1999061468A3; JP2002516339A; HUP0101987A3; IL139339A0; EP1080111A2; AU771448B2

Description

Indukce antibiotických proteinů a peptidů LAIT/sCD14-proteinem

OPlast techniky

Tento vynález se týká LAIT-proteinu (CD14) odvozeného od savců a příbuzných proteinů, které přímo indukují expresi antibiotických polypeptidů, zvláště defensinů, v savčích buňkách, zvláště epiteliálních buňkách. Tento vynález se týká také identifikace části CD14 nutné pro přímou aktivaci B buněk působením CD14.

Dosavadní stav techniky

Peptidová antibiotika a jejich indukce endotoxinem

Antibiotické peptidy jsou v přírodě široce rozšířeny a zahrnují rozšířený mechanismus obrany hostitele (Lehrer R. I. a spol.: Ann. Rev. Immunol. 1993, 11, 105; Boman H. G. : Ann. Rev. Immunol. 1995, 13, 61; Lehrer R. I., Ganz T. a Selsted M. E.: Cell 1991, 64, 229; Zasloff M.: Curr. Opin. Immunol. 1992, 4, 3.). Výhodou peptidových antibiotik jako faktorů přirozeného imunitního systému je jejich schopnost fungovat bez specifičnosti a bez paměti. Jejich protibakteriální, protivirové a protihoubové aktivity umožňují hostiteli zpozdit nebo možná dokonce vyhnout se mikrobiálnímu růstu krátce po infekci před tím, než se může mobilizovat adaptivní imunitní odpověď (Lehrer R.

I. a spol.: Ann. Rev. Immunol. 1993, 11, 105; Boman H. G.:

Ann. Rev. Immunol. 1995, 13, 61; Lehrer R. I., Ganz T. a Selsted Μ. E.: Cell 1991, 64, 229; Zasloff M.: Curr. Opin. Immunol. 1992, 4, 3.). Defensiny jsou největší skupinou antibiotických peptidů, sestávají z 29 až 35 aminokyselinových zbytků a představují více než 5 % z celkového buněčného proteinu v lidských neutrofilech (Boman H. G.: Ann. Rev. Immunol. 1995, 13, 61; Lehrer R. I., Ganz T. a Selsted Μ. E.: Cell 1991, 64, 229; Zasloff M.: Curr. Opin. Immunol. 1992, 4, 3.). Je také známo, že u savců jsou defensiny produkovány plicními makrofágy (Lehrer R. I. a spol.: Ann. Rev. Immunol. 1993, 11, 105; Boman H.

·· ···· ·· ·· · · • · · » · · · ··· ····· ·· · · · ·· ··· ·· ···· ·· ···

G.: Ann. Rev. Immunol. 1995, 13, 61; Lehrer R. I., Ganz T. a

Selsted Μ. E.: Cell 1991, 64, 229; Zasloff M. : Curr. Opin. Immunol. 1992, 4, 3.) a nedávno byly popsány v hovězích epiteliálních buňkách trachey (Diamond G., Russell J. P. a Bevins C.

L. : PNAS 1996, 93, 5156.) a jazyka (Schonwetter B. S., Stolzenberg E. D. a Zasloff M. A.: Science 1995, 267, 1645.).

Bylo ukázáno, že endotoxin, ve formě lipopolysacharidu (LPS), indukuje desetinásobné zvýšení exprese mesengerové RNA (mRNA) kódující antibiotický peptid v primárních tracheálních epiteliálních buňkách (Diamond G., Russell J. P. a Bevins C.

L. : PNAS 1996, 93, 5156.). Tento peptid, označený tracheální antibiotický peptid (TAP), je ze skupiny β-defensinů. Bylo ukázáno, že mechanismus TAP indukce z epiteliálních buněk z respirační sliznice je zprostředkován membránovým CD14 (mCD14) exprimovaným na epiteliálních buňkách. Úloha epiteliálního mCD14 je v souladu s pozorováním, že aktivační proces vedoucí k TAP expresi byl inhibován v přítomnosti monoklonální protilátky (mAb) specifické pro CD14 (Diamond G., Russell J. P. a Bevins C. L.: PNAS 1996, 93, 5156.).

I když se nějaký čas předpokládalo, že exprese mCD14 je výlučným markérem monocytových makrofágů (Zeigler-Heitbrock H. W. L. a Ulevitch R. J.: Immunology Today 1993, 14, 121.), nyní je známo, že je exprimován epiteliálními buňkami odvozenými od mnoha tkání (Fearns C. a spol.: J. Exp. Med. 1995, 181, 857.). Bylo také zjištěno, že epiteliální výstelky jiných tkání odpovídají na endotoxin nebo zánět lokální produkcí defensinů. Konkrétně - bylo ukázáno, že šupinatá epiteliální výstelka jazyka odpovídá na infekci nebo zánět produkcí β-defensinového jazykového antibiotického peptidu (Schonwetter B. S., Stolzenberg E. D. a Zasloff M. A.: Science 1995, 267, 1645.). V této studii bylo ukázáno, že mesengerová RNA (mRNA) kódující jazykový antimikrobiální peptid je přítomna v hojném množství v epiteliálních buňkách jazyka, které obklopují přirozeně se vyskytující poraněni. V této souvislosti zřetelně nebyla popsána žádná angažovanost mCD14.

·· ··· ·· ···· ·· ··· upravená stránka

Shora popsané výsledky poskytují experimentální podklad pro model imunitní odpovědi, při němž se uvede v činnost mašinérie přirozené imunitní odpovědi v lokálních místech infekce a/nebo zánětu tak, aby přispěla k počáteční obraně hostitele. Lokální produkce antibiotických proteinů a peptidů v odpovědi na LPS odvozený od gramnegativních bakterií může tedy hrát roli při prevenci bakteriální kolonizace nebo následné infekce před zapojením klonální adaptivní imunitní odpovědi. Vzhledem k tomu, co zde bylo uvedeno, následuje stručný souhrn současného chápání mechanismu (mechanismů) způsobujícího (způsobujících) endotoxinem vyvolané odpovědi v monocytech, makrofágách, epiteliálních buňkách a endoteliálních buňkách.

CD14 je membránový receptor na monocytech pro komplexy LPS:LPB

Endotoxin ve formě LPS indukuje protizánětlivé cytokiny monocyty/makrofágy jak in vitro tak in vivo (Beutler B. a spol.: Science, 1986, 232, 977; Michie H. R. a spol.: New Engl. J. Med. 1988, 318, 1481; Tracey K. J. a spol.: Nátuře 1987,

330, 662; Waage A., Halstensen A. a Espevik T.: Lancet 1987,

1, 355.). Tyto cytokiny odvozené od monocytů, zahrnující TNFa, IL-1 a IL-6, souvisejí se syndromem septického šoku, což vede nakonec k selhání více orgánů. Nedávná práce charakterizovala CD14 jako monocytový receptor pro LPS (Wright S. D. a spol.: Science 1990, 249, 1431.), který dále vede k počáteční charakterizaci mechanismu, kterým LPS aktivuje monocyty/makrofágy.

Běžné paradigma postuluje zahrnutí v podstatě exprimovaného plasmového proteinu, proteinu vázajícího lipopolysacharid (LBP), který tvoří vysoce afinitní komplexy s LPS (Schumann R.

R. a spol.: Science 1990, 249, 1429; Wright S. D. a spol: Science 1990, 249, 1431; Wright S. D. a spol.: J. Exp. Med. 1989, 170, 1231.). LBP je plasmový glykoprotein produkovaný játry, přítomný v podstatě v plasmě zdravých dospělých lidí v 5 až 10 μg/ml, o kterém bylo ukázáno, že zvyšuje koncentraci až dvacetkrát po odpovědi na akutní fázi (Schumann R. R. a spol.: Science 1990, 249, 1429; Tobiáš P. S. a spol.: Cell. Mol. Biol.

··· ···« ··* ····· ·· · · ·

1992, 7, 239; Tobiáš P. S., Mathison J. C. a Ulevitch R. J.:

J. Biol. Chem. 1988, 263, 13479; Tobiáš P. S., Soldau K. a Ulevitch R. J.: J. Exp. Med. 1986, 164, 777; Wright S. D. a spol.; Science 1990, 249, 1431; Wright S. D. a spol.: J. Exp. Med. 1989, 170, 1231.). Po navázání LBP se zvýší schopnost LPS stimulovat produkci cytokinu v makrofágách (Mathison J. C., Tobiáš P. S. a Ulevitch R. J.: Pathobiology 1991, 59, 185; Schumann R. R. a spol.: Science 1990, 249, 1429; Wright S. D. a spol.: Science 1990, 249, 1431; Wright S. D. a spol.: J. Exp. Med.

1989, 170, 1231.).

Membránový CD14 (mCD14), navázaný prostřednictvím glykosylfosfatidylinositolové kotvy (Zeigler-Heitbrock H. W. L. a Ulevitch R. J.: Immunology Today 1993, 14, 121.), funguje jako receptor pro LPS-LBP komplexy (Schumann R. R. a spol.: Science

1990, 249, 1429; Wright S. D. a spol.: Science 1990, 249, 1431.). CD14 je exprimován ve vysokých hladinách na monocytech a na makrofágách a slabě na neutrofilech (Balí E, D. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1982, 79, 5374; Buckle A. M., Jayaram Y. a Hogg N.: Clin. Exp. Immunol. 1990, 81, 339; Ferrero E. a spol.: J. Immunol... 1990, 145, 331; Goyert S. a spol.: Science 1988, 239, 497; Haziot A. a spol.: J. Immunol. 1988, 11.1, 547.). Myší pre-B buněčná linie 70Z/3 (Paige C. J. a spol.: J. Immunol. 1978, 121, 641.) neexprimuje detegovatelný »CD14 imunofluorescencí a je negativní na message kódující CL)14, jak bylo zjištěno jak Northernovou blotovací analýzou tak RT-PCR (Filipp D. a Julius M.: nepublikovaná zjištění; Lee J.

D. a spol.: J. Exp. Med. 1992, 175, 1697.). Tato buněčná linie byla použita pro získání přesvědčivého důkazu úlohy mCD14 jako receptoru pro komplexy LPS-LBP. Specificky - 70Z/3 odpovídá LPS s expresí membránového imunoglobulinu (mlg) (Paige C. J. a spol.: J. Immunol. 1978, 121, 641.). Koncentrace LPS požadovaná pfo indukováni mlg exprese v mCD14^- 70Z/3 má řádově vyšší hodnotu než koncentrace, která je požadována pro stimulaci produkce cytokinů mCD14^_ monocyty (Lee J. D. a spol.: J. Exp. Med. 1992, 175, 1697.). Jestliže byla 70Z/3 transfektována cDNA kódující lidský CD14, bylo ukázáno, že koncentrace LPS požadovaná pro indukování mlg exprese mCD14~ klony je 10 OOOkrát nižší než koncentrace, která je požadována u přírodního typu mCD14^- rodičovské linie 70Z/3 (Lee J. D. a spol.: J. Exp. Med. 1992, 175, 1697.) .

Tyto výsledky poskytují experimentální důkaz pro běžný mo del in vivo LPS zprostředkované aktivace mCD14~ leukocytů. Po vystavení působení LPS se vytvoří komplexy LPS-LBP a tyto komplexy aktivují monocyty/makrofágy prostřednictvím interakce s mCD14.

Rozpustný CD14 v endotoxinem zprostředkované aktivaci endoteliálních a epiteliálních buněk

Na rozdíl od navrženého mechanismu, který se uplatňuje u LPS zprostředkované aktivace mCD14“ leukocytů, méně je pochopen mechanismus, který se týká LPS zprostředkované aktivace endoteliálních a epiteliálních buněk. Až do nedávná se předpokládalo, že endoteliální a epiteliální buňky jsou mCD14~. Přes nedetegovatelnou expresi mCD14 v těchto typech buněk bylo ukázáno, že LPS zprostředkovaná aktivace je závislá na seru a že je inhibována monoklonálními protilátkami specifickými pro CD14 (Patrick D. a spol.: J. Inf. Dis. 1992, 165, 865; Pugin J. a spol.:

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 2744; Arditi M. a spol.: Infect. Immun. 1993, 61, 3149.). To předpokládá, že CD14 může hrát nějakou úlohu, i když dosud neznámou, při endotoxinem zprostředkované aktivaci endoteliálních a epiteliálních buněk.

Bylo ukázáno, že rozpustný CD14 (sCD14), kterému chybí glykosylfosfatidylinositolová kotva a který je přítomen v seru zdravých dospělých lidí (Bažil V. a spol.: Eur. J. Immunol. 1986, 16, 1583.), je zahrnut v LPS zprostředkované aktivaci jak endoteliálních buněk (Arditi M. a spol.: Infect. Immun. 1993, 61, 3149; Pugin J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1993,

90, 2744; Frey E. A. a spol.: J. Exp. Med. 1992, 176, 1665;

Read M. A. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 9887; Haziot A. a spol.: J. Immunol. 1993, 151, 1500.) tak epiteliál-

nich buněk (Pugin J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 2744.). Bylo ukázáno, že závislost aktivačního procesu na seru existuje díky přítomnosti sCD14 a požadavek na sérum by mohl být nahrazen sCD14. Žádná role LBP nemohla být charakterizována v některých studiích v případě LPS zprostředkované aktivace endoteliálních buněk, což ukazuje na to, že sCD14 samotný je agonistou odpovědí endoteliálních buněk na endotoxin (Arditi M. a spol.: Infect. Immun. 1993, 61, 3149; Frey E. A. a spol.: J. Exp. Med. 1992, 176, 1665; Read M. A. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 9887.). V jiných studiích byla zjištěna duální role u sera při LPS odpovědi jak u endoteliálních buněk tak u epiteliálních buněk. Konkrétně - ukazuje se, že pro endotoxinem zprostředkovanou aktivaci endoteliálních buněk jsou požadovány jak sCD14 tak LBP (Pugin J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 2744; Haziot A. a spol.: J. Immunol. 1993, 151, 1500.). To je zvláště významné tehdy, jestliže je endotoxin přítomen v nízkých koncentracích (Haziot A. a spol.: J. Immunol. 1993, 151, 1500.).

Shora uvedené experimentální výsledky vedly k postulované úloze SCD14-LPS komplexů při aktivaci mCD14“ endoteliálních buněk. Předpokládá se, že při vysokých koncentracích LPS jsou tyto komplexy generovány přímo prostřednictvím interakce sCD14 a LPS. Při nízkých koncentracích LPS se předpokládá, že LBP nejdříve interaguje s LPS, o němž se předpokládá, že ještě necharakterizovanými způsoby usnadňuje generaci komplexů sCD14-LPS.

I když shora uvedené výsledky jsou potenciálně liché, pokud jde o navržený mechanimus podporování odpovědí endoteliálních/epiteliálních buněk na LPS, zahrnují v sobě obecný prvek v tom, že mechanismus (mechanismy) je rozdílný od těch mechanismů, které zahrnují endotoxinem zprostředkovanou aktivaci mCD14~ buněk. Obě studie předpokládají, že sCD14 funguje jako agonista, který umožňuje odpovědi na endotoxin mCD14“ buňkami spíše než fungováním jako receptor pro komplexy LPS-LBP na mCD14^- buňkách. Avšak poslední studie ukázaly, že to nemusí být

pravda, alespoň v případě epiteliálních buněk.

Membránový CD14 v endotoxinem zprostředkované indukci defensinů epiteliálními buňkami

Jak bylo shora uvedeno, nedávná studie ukázala, že endoto xin indukuje expresi defensinů v primárních hovězích tracheálních epiteliáních buňkách (Diamond G., Russell J. P. a Bevins C. L.: PNAS 1996, 93, 5156.) a že tato exprese zahrnuje mCD14.

I když bylo ukázáno, že nestimulované epiteliální buňky jsou mCD14“, byly indukovány na mCD14~ stav po LPS zprostředkované aktivaci (Diamond G., Russell J. P. a Bevins C. L.: PNAS 1996, 93, 5156.). Bylo ukázáno, že indukce mCD14 na primárních tracheálnich epiteliálních buňkách koreluje s indukcí zprávy specifické pro CD14 v epiteliálních buňkách, což ukazuje na to, že byla pravděpodobně endogenního původu. Dále pak LPS zprostředkovaná indukce defensinů byla inhibována mAb specifickou pro CD14 (Diamond G., Russell J. P. a Bevins C. L.: PNAS 1996, 93, 5156.).

Bylo tedy ukázáno, že mechanismus (mechanismy), na kterém (kterých) spočívá LPS zprostředkovaná aktivace epiteliálních buněk, byl(y) tedy paralelní s tím (těmi), který byl (které byly) pozorovány u mCD14~ monocytů a makrofágů. Zdá se, že cesty LPS aktivace u těchto dvou typů buněk se navzájem liší jenom v základní hladině mCD14 exprimovaného těmito dvěma typy cílových buněk. Nebyly popsány srovnávací studie, které by se týkaly endoteliálních buněk.

Rozpustný CD14 přímo aktivuje monocyty v nepřítomnosti sera/LBP

Dosud popsaným paradigmem je to, že endotoxin, ve formě LPS, zprostředkuje aktivaci monocytů/makrofágů a epiteliálních buněk interakcí s mCD14 na buňce. Závislost tohoto procesu na seru, odrážející zahrnutí LBP, byla demonstrována za všech okoiností až na jednu.

·· · ·«· ·· ·· • · · · · · ·

Jak bylo shora popsáno, sCD14 je zahrnut do endotoxinem zprostředkované aktivace/poškození endoteliálních buněk. Bylo předpokládáno, že jeho funkce je zesilování interakce LPS s buňkou (Pugin J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1993, 90, 2744). Následující studie demonstrovala, že sCD14 isolovaný z moči nefrotických lidí byl schopný přímo stimulovat produkci zánětlivých cytokinů, TNF1 a IL-6, lidskými monocyty (Sundán A. a spol.: Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1779.). Lidské monocyty jsou mCD14^_ a LPS zprostředkovaná indukce těchto dvou cytokinů je závislá na seru (Espevik T. a spol.: Eur. J. Immunol. 1993, 23, 255; Wright S. D. a spol.: J. Exp. Med. 1992, 176, 719.). Naproti tomu bylo ukázáno, že aktivita sCD14 isolovaného z moči je v tomto směru sérově nezávislá a že nebyla ovlivněna LBP nebo protilátkami specifickými na LBP (Sundán A. a spol.: Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1779.). Dále pak bylo ukázáno, že schopnost sCD14 stimulovat produkci zánětlivých cytokinů lidskými monocyty je inhibována mAb specifickou pro CD14 (Sundán A. a spol.: Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1779.).

Zdá se tedy, že SCD14 má schopnost přímo interagovat s až dosud neidentifikovanými receptorovými strukturami na monocytech v seru nezávislým způsobem a to vede k produkci cytokinů. Endotoxin a sCD14 jsou tedy schopny zprostředkovat podobné biologické odpovědi v monocytech. Dále pak schopnost stejné CD14 specifické mAb, 3C10 (Van Voorhis W. C. a spol.: J. Exp. Med. 1983, 158, 126.) inhibovat oba tyto způsoby stimulace ukazuje na to, že alespoň zčásti jsou sdíleny signální cesty zahrnující endotoxin a sCD14, možná na úrovni receptorových struktur. CD14 specifická mAb 3C10 rozpoznává N-koncovou část CD14 a toto rozpoznávání je závislé na přítomnosti N-koncových aminokyselin 7 až 14 molekuly CD14 (Juan T. S.-C. a spol.: J. Biol. Chem. 1995, 270, 17237.). Schopnost 3C10 inhibovat LPS zprostředkovanou aktivaci monocytů byla interpretována jako reflektující úlohu mCD14 zbytků 7 až 14 jako interakčního místa mezi mCD14 a LPS (Todd S. C. a spol.: J. Biol. Chem. 1995, 270, 17237.). Naproti tomu podstata schopnosti mAb 3C10 inhibovat funkci SCD14 u monocytů v nepřítomnosti LPS není zřejmá (Sundán A. a spol.: Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1779.). Nejjednodušší vysvětlení předpokládá přítomnost až dosud necharakterizovaných receptorových struktur pro sCD14 na monocytech, mAb interferující s interakcí mezi sCD14 a touto strukturou (těmito strukturami).

Rozpustný CD14 inhibuje LPS indukovanou aktivaci monocytů a neutrofilů in vitro způsobem závislým na dávce

Mezinárodní patentová přihláška,publikovaná pod číslem WO 93/19772 14. října 1993, popisuje inhibici LPS indukované aktivace monocytů a neutrofilů in vitro rekombinantním lidským rozpustným CD14 způsobem závislým na dávce, alespoň jak ukazují data uvedená na obrázku 1 publikovaného dokumentu. Byly provedeny pokusy v přítomnosti komplexu LPS-LBP a tyto pokusy jsou konzistentní s navázáním komplexu a přidaným přítomným CD14, takže se snižuje stupeň interakce mezi komplexem a na membránu navázaným CD14 monocytů a elektrofilů. Takový výsledek je kuriózní v tom, že je známo, že sCD14 samotný je schopen stimulovat produkci zánětlivých cytokinů monocyty.

S laktací související, immunotrofní (LAIT) protein a aktivace B buněk

Popis isolace, charakterizace biologických aktivit, molekulární klonování a exprese rekombinantního LAIT-proteinu (hovězí CD14) jsou popsány v doprovázející USA patentové přihlášce č. 08/746 883, podané 18. listopadu 1996, a v mezinárodní patentové přihlášce č. PCT/CA97/00880, podané 18. listopadu 1997. Odpovídající části těchto předcházejících přihlášek jsou zde reprodukovány.

Protein byl isolován z hovězího a lidského kolostra a prs ního mléka. Tento protein byl nazván s laktací související, immunotrofní (LAIT) protein.

Biologické aktivity LAIT-protienu se liší od všech jiných známých cytokinů, které podporují růst B buněk a diferenciaci •· ··«« ·· ·· ·· • » · «·*· · t · >···· ·· * ·· u dospělých živočichů a tedy mohou hrát jedinečnou roli při regulaci aktivace B buněk. Indukce nejhumorálnějších imunitních odpovědí u dospělých zahrnuje sekvence buněčných interakcí mezi pomocnými” T lymfocyty, antigen presentujícími buňkami (APC) a B lymfocyty (Sprent J. J.: J. Exp. Med. 1978, 147, 1159; Andersson J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1982, 77, 1612; Julius Μ. H. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sel. USA 1982, 79,

1989. ). Tyto interakce jsou nutné (Sprent J. J.: J. Exp. Med. 1978, 147, 1159; Andersson J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1982, 77, 1612; Julius Μ. H. a spol.: Proč. Nati. Acad.

Sci. USA 1982, 79, 1989; Julius Μ. H. a spol.: Immunol. Rev. 1987, 95, 914.) a tedy odrážejí úlohu specifických molekul souvisejících s plasmovou membránou jako přenašečů předpokládaných aktivačních signálů. Podstatná molekulární interakce, reflektovaná požadováním kontaktu T buňka - B buňka, je zprostředkována CD40 exprimovaným na plasmové membráně B buněk a její příbuzný ligand, gp39 (nebo CD40L), se exprimuje na plasmové membráně

T buněk (Noelle R. J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1992, 89, 6550; Armitage R. J. a spol.: Nátuře 1992, 357, 80.). Interakce mezi CD40 a CD40L předpovídá indukci růstu B buněk, diferenciaci B buněk na imunoglobulin sekretující buňky a zapnutí immunoglobulinového isotypu (Foy T. M. a spol.: J. Exp. Med. 1993, 178, 1567.). Navíc soubor cytokinů produkovaných těmito interagujícími buňkami je ústřední pro regulaci aktivace, růstu a diferenciace B lymfocytů (Andersson J. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1982, 77, 1612; Noelle R. J. a spol.: Proč.

Nati. Acad. Sci. USA 1983, 80, 6628; Hodgkin P. D.: J. Immunol.

1990, 145, 2025; Noelle R. J. a spol.: J. Immunol. 1991, 146, 1118; Parker D. C.: Immunol. Rev. 1980, 52, 115; Howard M. a spol.: J. Exp. Med. 1982, 155, 914.). Tyto rozpustné mediátory aktivace lymfocytů nepůsobí isolovaně. Spíše jsou navzájem doplňkem jeden druhého, každý při tom směruje B lymfocyt do dalšího stupně aktivace, což způsobuje, že jsou citlivé na následující a progresivní aktivační signály (Julius Μ. H. a spol.: Immunol. Rev. 1987, 95, 914.).

Naproti tomu LAIT-protein je přímo mitogenní pro B buňky • · · ·*· · · · * ·· • · * » » » « · · · ····· · · · · 9 »· ··· · · «··· · * · » · v nM koncentracích a funguje jako kostimulátor růstu B buněk v kombinaci se stimulací B buněčným antigenovým receptorem v oblasti pM. Za těchto posledních okolností tyto signály, odvozené od antigenu, převádějí B buňky na fysiologický stav, v němž mohou obdržet pomoc T buňky. Případnost doplnění novorozence faktorem, který přímo podporuje růst a diferenciaci B buněk v kombinaci s antigenem, je významná, jestliže se vezme v úvahu potlačený stav T buněk ve vyvíjejícím se novorozenci.

Bylo ukázáno, že i když brzlík účinně produkuje T buňky časně v ontogenezi, na rozdíl od dospělého brzlíku (Bili J. a spol.: J. Exp. Med. 1989, 169, 1405; MacDonald H. R. a spol.: Nátuře 1988, 332, 4020), nezpůsobuje účinné zmizení těchto T buněk exprimujících potenciálně autoreaktivní antigenové receptory (Schenider R. a spol.: J. Exp. Med. 1989, 169, 2149; Smith H. a spol.: Science 1989, 245, 749; Ceredig R.: Intl. Immunol. 1990, 2, 859; Ceredig R. a Waltzinger C.: Intl. Immunol. 1990, 2, 869.). Ve stejné době jsou tito novorozenci zdraví. Kolostrum a časné prsní mléko obsahují dobře charakterizované inhibitory funkce T buněk, zvláště TGFBl a TGFB2, což jsou inhibitory aktivace T buněk (Sporn Μ. B. a spol.: J. Cell. Biol. 1987, 105, 1039; Massagué J.: Cell 1987, 49, 437; Wrann M. a spol.: EMBO J. 1987, 6, 1633; Stoeck M. a spol.: J. Immunol. 1989, 143, 3258.). Je tedy možné, že funkce T buněk u novorozenců je těmito cytokiny aktivně potlačena, což poskytuje čas pro maturaci funkce brzlíku. Pro novorozence je také zřejmě důležité iniciovat produkci svých vlastních ochranných protilátek, což je dáno tím, že od mateřského mléka pocházející a pasivně získaný Ig je jak přechodný tak obsahuje specifičnosti, které reflektují mateřský antigenový protějšek. Očekává se, že LAIT-protein funguje jako náhrada T buněk, která podporuje růst a diferenciaci B buněk u novorozence, který je čerstvě vystaven působení antigenů z okolního prostředí. Působení LAIT-proteinu tedy nabízí alternativu, zkrácenou cestu aktivování imunitního systému, který je nezávislý na funkci T buněk.

Sekvenačni analýza fragmentů hovězího LAIT-proteinu odha»· ···· * * ·« • >4 • · · 4 « · · • · ·«» · r « • · » * · » · • · 4 * « » ·· ··« ·· 4 4«· lila vysokou homologii s lidským CD14. CD14 byl následně vyčištěn z lidského kolostra afinitní chromatografii použitím dostupných monoklonálních protilátek a bylo ukázáno, že má stejný rozsah biologických aktivit jako kolostrální hovězí LAIT-protein. Gen, který kóduje hovězí LAIT-protein, byl klonován z hovězí cDNA knihovny. Bylo ukázáno, že je vysoce homologní s lidským CD14 jak na úrovni nukleotidové tak na úrovni proteinové. Rekombinantní lidský a myší CD14 a také rekombinantnl hovězí LAIT-protein/CD14 byly připraveny v expresních systémech jak hmyzích buněk tak savčích buněk. Bylo ukázáno, že každý obsahuje všechny biologické aktivity přírodního hovězího LAIT-proteinu kolostrálního původu se specifickými aktivitami v rámci faktoru dva z těch, které byly pozorovány u přírodního materiálu isolovaného z každého ze tří druhů.

V souvislosti s tímto vynálezem antibiotické proteiny nebo antibiotické polypeptidy existují s antiobitickými vlastnostmi: i) lineární, většinou helikální peptidy s cysteinem, s nebo bez ohybu (cecropiny), ii) lineární peptidy bez cysteinu a s vysokým podílem některých zbytků, jako je prolin a arginin, iii) antibakteriální peptidy s jednou disulfidovou vazbou, iv) peptidy se dvěma nebo více S-S vazbami poskytujícími hlavně nebo pouze struktury β-sheetu zahrnující, ale bez omezení na ně, lidský defensin, HNP-1, králičí defensin NP-1, krysí defensin NP-1, hovězí β-defensin, TAP, vepřový protegrin, PG-3 a H-s krabí tachypiesin 1, a v) antibakteriální peptidy odvozené od větších polypeptidů s jinými známými funkcemi (Boman H. G.: Ann. Rev. Immunol. 1995, 13, 61.).

Defensiny jsou podskupina antibiotických polypeptidů (Edwards S. W.: Biochemistry and Physiology of the Neutrophil, 1994, Cambridge University Press, str. 67 až 70.).

Sepse je stav, který se sám objevuje u lidského pacienta, jestliže došlo k invazi mikrobiálního činidla, teplota je větší než 38 °C nebo menší než 36 °C, srdeční tep vyšší než 90 úderů za minutu, rychlost dechu větší než 20 dechů za minutu • · ·· ··· ·· ···· ·· · nebo PaCO₂ menší než 4,3 kPa, počet bílých krvinek větší než 12 000 mm~³, menší než 4000 mm^-3 nebo více než 10 % nezralých forem, disfunkce orgánů, hypoperfuze nebo hypotenze. Hypoperfuzní a perfuzní abnormality mohou zahrnovat, ale bez omezení na ně, acidosu z nahromadění kyseliny mléčné, oligurii nebo aktivní změny mentálních stavů (Chest 1992, 101, 1644.).

V souvislosti s touto přihláškou CD14, pokud není uvedeno jinak, znamená jakékoliv hovězí, lidské a myši CD14 proteiny, rekombinantní nebo isolované z přirozeně se vyskytujícího zdroje (přírodní, nativní), sekvence, které odpovídají sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5, respektive sekv. id. č. 6.

Předložený vynález poskytuje způsob zmírnění příznaků sepse. Podle tohoto prvního aspektu vynálezu existuje stupeň přímého vystavení epiteliálních buněk savce, který to potřebuje, působení efektivního množství sloučeniny obsahující (tj. vyrobené z nebo která zahrnuje) rozpustný CD14 nebo peptidový fragment CD14, který stimuluje expresi defensinu v epiteliálních buňkách, nebo konzervativně substituovanou variantu uvedeného CD14 nebo fragment, který stimuluje uvedenou expresi.

Tento vynález zahrnuje také způsob zvýšení exprese defensinů u savce, který to potřebuje, podáváním sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypeptidovou část CD14, která zvyšuje uvedenou expresi, nebo konzervativně substituovanou variantu uvedeného CD14 nebo část, která zvyšuje uvedenou expresi.

Stupeň podávání s výhodou zahrnuje přímé vystavení epiteliálních buněk savce působení uvedené sloučeniny.

Tento vynález zahrnuje způsob stimulování exprese jednoho nebo více defensinů epiteliálními buňkami tak, že se jim podává efektivní množství sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypeptidový fragment CD14, který stimuluje uvedenou expresi, nebo konzervativně substituované varianty uvedeného CD14 nebo fragmentu, který zvyšuje uvedenou expresi.

• · · · • · • · ·· · · · ·· ···· ·· ·

Tento vynález zahrnuje stimulování exprese defensinu podél gastrointestinálního traktu nebo podél respiračního traktu savce tak, že se trakt vystaví působení efektivního množství sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypeptidový fragment CD14, který stimuluje uvedenou expresi, nebo konzervativně substituované varianty uvedeného CD14 nebo fragmentu, který stimuluje uvedenou expresi.

K expresi defensinu dochází podle jistého aspektu na jazyku savce. Exprese defensinu může existovat ve střevu, zvláště v tenkém střevu savce.

Podle obecného aspektu tohoto vynálezu je epiteliálními buňkami savce indukována exprese defensinů.

CD14 může mít aminokyselinovou sekvenci vybránu ze skupiny sestávající ze sekv. id. č. 4. sekv. id. č. 5, sekv. id. č. 6 nebo sekv. id. č. 7 nebo jejich konzervativně substituované varianty.

Podle jiného apsektu tento vynález znamená způsob zmírnění příznaků sepse, vyznačující se tím, že se savci, který to potřebuje, podává efektivní množství rozpustného proteinu tak, aby epiteliální buňky tohoto savce byly přímo vystaveny působení tohoto proteinu, při čemž tento protein má takovou aminokyselinovou sekvenci, která je z alespoň asi 63 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 5a která má schopnost indukovat expresi defensinů v epiteliálních buňkách.

Alternativně může mít protein takovou aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi 68 % nebo asi 71 % nebo asi 73 % nebo asi 78 % nebo asi 83 % nebo asi 88 % nebo asi 93 % nebo asi 98 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 5.

Tento vynález zahrnuje způsob profylaktického léčení li15 popolysacharidem indukované hostitelské zanětlivé odpovědi u savce, vyznačující se tím, že tento zp isob zahrnuje podávání terapeuticky efektivního množství proteinu savci, takže se epiteliální buňky savce přímo vystaví působení tohoto proteinu, při čemž tento protein má aminokyselinovou sekvenci, která je zachována alespoň z asi 63 % vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 4 nebo identifikované jako sekv. id. č. 5 nebo identifikované jako sekv. id. č. 6 a která má schopnost zvyšovat expresi jednoho nebo více defensinů v hovězích epiteliálních buňkách.

Tento vynález zahrnuje způsob zvýšení exprese defensinů u savce, který to potřebuje, tak, že se savci podává efektivní množství rozpustného proteinu, při čemž tento protein má aminokyselinovou sekvenci, která je zachována alespoň z asi 63 % vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 4 nebo identifikované jako sekv. id. č. 5 nebo identifikované jako sekv. id. č. 6 a která má schopnost zvyšovat expresi defensinů v savčích epiteliálních buňkách.

Tento vynález zahrnuje způsob stimulování exprese jednoho nebo více defensinů epiteliálními buňkami tak, že se tyto buňky vystaví působení efektivního množství rozpustného proteinu, při čemž tento protein má aminokyselinovou sekvenci, která je zachována alespoň z asi 63 % vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 4 nebo identifikované jako sekv. id. č. 5 nebo identifikované jako sekv. id. č. 6a která má schopnost stimulovat expresi jednoho nebo více defensinů v epiteliálních buňkách.

Tento vynález se týká způsob stimulování exprese defensinů podél gastrointestinálního traktu savce, vyznačující se tím, že se trakt vystaví působení efektivního množství rozpustného proteinu, při čemž tento protein má aminokyselinovou sekvenci, která je zachována alespoň z asi 63 % vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 4 nebo identifikované jako sekv. id. č. 5 nebo identifikované jako sekv. id. č.

• · · · « · a která má schopnost stimulovat expresi defensinu v hovězích epiteliálních buňkách.

Tento vynález zahrnuje způsob stimulování exprese defensinu podél dýchacího traktu savce a/nebo na jazyku nebo v tenkém střevě savce, vyznačující se tím, že zahrnuje vystavení jazyka působení efektivního množství rozpustného proteinu, při čemž tento protein má aminokyselinovou sekvenci, která je zachována alespoň z asi 63 % vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 4 nebo identifikované jako sekv. id. č. 5 nebo identifikované jako sekv. id. č. 6a která má schopnost stimulovat expresi defensinu v epiteliálních buňkách.

Tento vynález zahrnuje způsob indukování exprese defensinů epiteliálními buňkami savce, který to potřebuje, vyznačující se tím, že se podává efektivní množství proteinu, při čemž tento protein má aminokyselinovou sekvenci, která je zachována alespoň z asi 63 % vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 4 nebo identifikované jako sekv. id. č. 5 nebo identifikované jako sekv. id. č. 6 a která má schopnost indukovat expresi defensinů v epiteliálních buňkách.

CD14 nebo část polypeptidu nebo varianta se může získat rekombinantními nebo chemickými způsoby.

V jiném aspektu tento vynález znamená způsob výroby koncentrátu CD14. Tento způsob zahrnuje získání zásobního roztoku, který obsahuje protein ze sekrece mléčné žlázy, oddělení koncentrátu obsahujícího endogenní CD14 z roztoku a stanovení koncentrace CD14 v koncentrátu.

Sekrece mléčné žlázy může znament mléko, plné mléko nebo část plného mléka obsahující protein, nebo může znamenat kolostrum nebo část kolostra obsahujíc! protein.

Sekrece se s výhodou předem podrobí stupni ošetření, při čemž tento stupeň ošetřeni je dostatečně mírný pro to, aby u• · · · • · • · · · ·· ···· ··· ···· · · · ·· • · · · · ···· ·· · možnil uchování aktivity CD14 spočívající v indukování nebo stimulování produkce produkce defensinu a/nebo stimulování B buněk.

Sekrece mléčné žlázy může znamenat lidskou sekreci nebo může znamenat hovězí sekreci. V případech, kdy se CD14 získává od savce, v němž se vyskytuje endogenně (tj. v savci, který není předmětem molekulárních genových manipulací), CD14 s výhodou znamená hovězí CD14.

V případě, že roztok znamená kapalný roztok, dělící stupeň zahrnuje vysolení proteinů z tohoto roztoku.

Stanovení koncentrace CD14 může zahrnovat vystavení vzorku získaného z koncentrátu působení první protilátky specifické pro CD14, takže se vytvoří komplex protilátka-CD14, a následné vystavení tohoto komplexu působení druhé protilátky specifické pro CD14, při čemž druhá protilátka obsahuje molekulu reportéru. V tomto směru jsou zvláště vhodné ELISA testy.

Stanovení koncentrace CD14 může zahrnovat vystavení vzorku získaného z koncentrátu působeni první protilátky specifické pro CD14, takže se vytvoří komplex protilátka-CD14 a následné vystavení tohoto komplexu působení druhé protilátky specifické pro první protilátku, při čemž druhá protilátka obsahuje molekulu reportéru.

V jiném aspektu tento vynález znamená způsob získání CD14, který zahrnuje získání zásobního roztoku, který obsahuje protein ze sekrece mléčné žlázy, vysrážení proteinové frakce, která obsahuje CD14, ze zásobního roztoku a isolování proteinové frakce ze supernatantu.

Vysrážení může zahrnovat vysolení proteinové frakce, která obsahuje CD14. S výhodou se koncentrace soli roztoku zvýší, takže se získá alespoň tak vysoká iontová síla, která by se získala spojením nasyceného vodného roztoku síranu amonného s ob• · jernem uvedené sekrece mléčné žlázy (jak se přirozeně vyskytuje), při čemž objem roztoku síranu amonného se rovná 65 procentům z celkového objemu spojených roztoků.

Tento způsob často zahrnuje také stupeň stanovení množství CD14 získaného v isolačním stupni.

Opět sekrece mléčné žlázy může znamenat kolostrum a/nebo mléko a může znamenat hovězí sekreci nebo lidskou sekreci nebo sekreci od jiného typu savce, u něhož se v sekrecích mléčné žlázy vyskytuje CD14.

Tento vynález zahrnuje jiný způsob získáni CD14, který zahrnuje získání zásobního roztoku, který obsahuje protein ze sekrece mléčné žlázy, isolování takové frakce z roztoku, který obsahuje proteiny, které nejsou rozpustné v sekreci mléčné žlázy po spojení nasyceného vodného roztoku síranu amonného s objemem uvedené sekrece mléčné žlázy, při čemž objem síranu amonného je roven 65 procentům z celkového objemu spojených roztoků. S výhodou tento způsob zahrnuje stupeň stanovení množství CD14 získaného v isolačním stupni.

Endogenní CD14 proteiny získané způsoby podle tohoto vynálezu se mohou používat pro přímé aktivování B buněk ve vhodné rozpustné formě. Podobně se mohou používat pro výrobu léčiv pro takové použiti.

Podle jiného aspektu tento vynález znamená způsob testování přítomnosti CD14 v prostředku, který obsahuje protein sekrece mléčné žlázy. Tento způsob zahrnuje vystavení prostředku působení protilátky, která je specifická pro CD14, a stanovení, jestli CD14 endogenní k sekreci je přítomen ve vzorku na základě toho, jestli byl ve stupni, kdy byl vystaven působení, vytvořen komplex CD14-protilátka.

Sekrece může být nebo nemusí být předem podrobena stupni ošetření, ale jestliže je podrobena stupni ošetření, potom stu• · peň ošetření je dostatečně mírný, aby dovolil uchování aktivity CD14 pro indukování nebo stimulování produkce defensinu a/nebo pro stimulování B buněk.

Opět, s výhodou, tento způsob zahrnuje stanovení koncentrace CD14 ve vzorku.

Podle jiného aspektu tento vynález znamená způsob předcházení, zmírnění nebo léčeni příznaků sepse u savce, podle kterého se savci podává efektivní množství CD14 získaného ze sekrece mléčné žlázy savce.

S výhodou se CD14 získává ze sekrece mléčné žlázy podle jednoho ze zde popsaných způsobů.

CD14 může být obsažen v kapalině. Kapalina může obsahovat frakci mléka obohacenou o CD14. CD14 může být obsažen v jedlém produktu, jako je potravinová tyčinka (např. čokoládová nebo proteinová tyčinka).

Podle jiného aspektu tento vynález zahrnuje způsob stanovení množství endogenního CD14 obsaženého v prostředku, který obsahuje protein sekrece mléčné žlázy, tj. od živočicha, který nebyl podroben molekulové genetické manipulaci, pokud jde o produkci CD14. Tento způsob zahrnuje získání prostředku, vystavení vzorku prostředku působení protilátky, která je specifická pro CD14, a stanovení množství CD14 endogeního k sekreci přítomné ve vzorku vztaženého na množství komplexu CD14-protilátka, který byl vytvořen ve stupni vystavení tomuto účinku.

Tento vynález se týká způsobu stanovení vhodnosti produktu pocházejícího ze sekrece mléčné žlázy pro použiti při indukování nebo stimulování produkce defensinu u savců, vynačující se tím, že tento způsob sestává z následujících stupňů:

získání vzorku produktu a stanovení množství CD14 přítomného ve vzorku.

• ·

Tento aspekt podle vynálezu by se tedy mohl použít jako předběžný stupeň při stanovení množství produktu, který je obsažen v léčivu nebo potravinovém produktu atd., pro použití způsobem podle tohoto vynálezu nebo jiným způsobem, o němž je známo, že je pro něj rozpustný CD14 užitečný.

Je také výhodné, jestliže se sekrece předem podrobí stupni ošetřeni, při čemž stupeň ošetření je dostatečně mírný, aby dovolil uchování aktivity CD14 pro indukování nebo stimulování uvedené produkce defensinu.

Podobně se tento vynález se týká způsobu stanovení vhodnosti produktu odvozeného od sekrece mléčné žlázy pro použití při stimulování B buněk u savců. Tento způsob sestává z následujících stupňů:

získání vzorku produktu a stanovení množství endogenního CD14 přítomného ve vzorku.

Ve výhodných aspektech se pro stupeň stanovení používá protilátka, výhodněji protilátka znamená mAb 3C10 a/nebo mAb, která rozpoznává stejnou aminokyselinovou sekvenci jako mAb 3C10.

Tento vynález zahrnuje použití zde popsaných sloučenin pro výrobu léčiva pro použití při zmírnění příznaků sepse, pro použití při zvýšení exprese defensinů u savce atd.

Jiný aspekt podle vynálezu zahrnuje způsob zvýšení exprese defensinů u savce, který to potřebuje, vyznačující se tím, že se savci, který to potřebuje, podává efektivní množství rekombinantního polypeptidu CD14 kódovaného nepřirozeně se vyskytující molekulou rekombinantní DNA obsahující první DNA sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z:

a) cDNA sekvence kódující CD14 podle sekv. id. č. 2,

b) DNA sekvence, která se specificky hybridizuje s nekódujícím vláknem ad a) a která kóduje expresi polypeptidu specificky rozpoznávaného protilátkou, která také specificky roz• · poznává lidský CD14, a

c) DNA sekvence, která kóduje stejný polypetid, který je kodován DNA sekvencí podle ad a) nebo b) shora, při čemž polypeptid kódovaný podle ad b) nebo ad c) zvyšuje uvedenou expresi.

Ještě jiným aspektem vynálezu je způsob stimulování exprese jednoho nebo více defensinů epiteliálními buňkami, vyznačující se tím, že se savci, který to potřebuje, podává efektivní množství rekombinantního polypeptidu CD14 kódovaného nepřirozeně se vyskytující molekulou rekombinantní DNA obsahující první DNA sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z:

a) cDNA sekvence kódující CD14 podle sekv. id. č. 2,

b) DNA sekvence, která se specificky hybridizuje s nekódujícím vláknem ad a) a která kóduje expresi polypeptidu specificky rozpoznávaného protilátkou, která také specificky rozpoznává lidský CD14, a

c) DNA sekvence, která kóduje stejný polypeptid, který je kodován DNA sekvencí podle ad a) nebo b) shora, při čemž polypeptid kódovaný podle ad b) nebo ad c) stimuluje uvedenou expresi.

S výhodou se specifická hybridizace provádí za selektivních hybridizačnich podmínek.

Hybridizace za selektivních podmínek má obvyklý význam, který je znám odborníkům z oblasti techniky. Zručným odborníkům z oblasti techniky jsou známy příslušné selektivní podmínky, které podporují hybridizaci nukleové kyseliny, například 6x chlorid sodný/citrát sodný (SSC) při 45 °C. Náledující příklady lze nalézt v Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 až 6.3.6. Pro 50 ml prvního vhodného hybridizačního roztoku se spolu smíchá 24 ml formamidu, 12 ml 20x SSC, 0,5 ml 2M Tris-HCl, pH 7,6, 0,5 ml lOOx Denhardtova roztoku, 2,5 ml deionizované vody, 10 ml 50% dextransulfátu a 0,5 ml 10% SDS. Druhý vhodný hybridizační roztok může obsahovat 1% krystalický BSA (frakce V), lmM EDTA, 0,5M Na_HPO₄, pH 7,2, • · * · • · · · • · · ···· ··· • · · · · · · · · · • · ··· ·· · · · · ·· ·

7% SDS. Koncentrace soli ve stupni promývání může být vybrána z nízkoselektivních podmínek asi 2xSSC při 50 °C až vysoceselektivních podmínek asi 0,2xSSC při 50 °C. Oba tyto promývací roztoky mohou obsahovat 0,1 % SDS. Navíc lze teplotu v promývacím stupni zvýšit z podmínek za nízké selektivity za teploty místnosti, asi 22 °C, na podmínky za vysoké selektivity, asi 65 °C. Citovaný odkaz poskytuje podrobnější informace, ale příslušná promývací selektivita závisí na stupni homologie a na délce sondy. Jestliže je homologie 100%, může se použít vysoká teplota (65 °C až 75 ”C). Jestliže je homologie nízká, musí se použít nižší teploty promývání. Avšak jestliže je sonda velmi krátká (kratší než 100 párů nukleotidů), musí se používat nižší teploty i když je homologie 100%. Obecně se s promýváním začne za nižších teplot (37 °C až 40 °C) a teplota se zvyšuje po intervalech 3 až 5 °C tak dlouho, dokud pozadí není dostatečně nízké, nikoliv aby bylo hlavním faktorem v autoradiografii.

Takový polypeptid je s výhodou specificky rozpoznáván protilátkou, která také specificky rozpoznává lidský CD14, jako je mAb 3C10.

Způsoby podle vynálezu mohou zahrnovat přímé místní vystaveni epitelu trachey nebo vnějšího epidermu savce, zvláště poranění, působení polypeptidu nebo proteinu, podle případu.

Tento vynález se tedy týká také způsobu výroby masti pro přímou místní aplikaci na poranění pokožky člověka pro zmírnění účinků infekce, zvláště bakteriální infekce, vyznačující se tím, že se do masti zahrne efektivní množství koncentrátu nebo jiné sloučeniny podle vynálezu, která vykazuje CD14 defensin indukující aktivitu.

Podobně je částí totoho vynálezu kojenecká výživa, mléko nebo jiná kapalina, ke které se přidává frakce mléčného produktu, při čemž tato frakce obsahuje vyšší koncentraci CD14, než jaká se vyskytuje v nefrakcionovaném mléčném produktu, při čemž tento mléčný produkt znamená produkt, který nebyl ošetřen tako• · • · • · · · · · · · · · · ·· · vým způsobem, který denaturuje CD14 v něm obsažený v takovém rozsahu, aby CD14 ztratil žádanou aktivitu.

Prostředky a způsoby podle vynálezu se mohou používat u savce, který má potřebu ochrany proti mikrobiálnímu patogenu vybranému ze skupiny sestávající z viru, bakterie, houby a kvasinky, zvláště tehdy, jestliže savec znamená člověka, který trpí nedostatečnou imunitou.

Mezi indukované defensiny patří RtNPl, RtNP2, RtNP3,

RtNP4, HNP1, HNP2 a HNP3 a jakékoliv jejich kombinace nebo HNP1, HNP2 a HNP3 a jakékoliv jejich kombinace.

Protein nebo polypeptid podle vynálezu, podle případu, se s výhodou podává v množství mezi asi 250 pg až asi 2500 μg na kg tělesné hmotnosti savce za den nebo v množství mezi asi 300 μg až asi 1 mg na kg tělesné hnotnosti za den.

Podle jiného aspektu tento vynález znamená způsob přímého aktivováni B buněk, při němž se používá rozpustný polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci vybránu ze skupiny sestávající z leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-ser, leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-leu a leu-leu-leu-leu-leu-leu-val-his, která je specificky rozpoznávána monoklonální protilátkou 3C10 a která aktivuje B buňky.

S výhodou v tomto způsobu aminokyselina obsahuje sekvenci, která je vybrána ze skupiny sestávající ze sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5 a sekv. id. č. 6, její konzervativně substituovanou variantu, která aktivuje B buňky, její fragment, který aktivuje B buňky, nebo jeho konzervativně substituovanou variantu, která aktivuje B buňky.

Tento vynález zahrnuje transgenního savce, který má do svého genomu zavedenu sekvenci nukleové kyseliny kódující polypetid, který má aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5 nebo sekv. id. č. 6, frag24 ·· ···» · · ·· ·· ··· » · · · «·· ····· ·· ♦ · · • · · · · · · · · · · · · · · · ment uvedeného polypeptidu, který přímo aktivuje B buňky, variantu uvedeného polypeptidu, která přímo aktivuje B buňky, konzervativně substituovanou variantu polypeptidu nebo konjugáty jeho fragmentu nebo varianty, které přímo aktivují B buňky, při čemž sekvence nukleové kyseliny je pod kontrolou CD14 promotoru endogenního pro savce a sekvence nukleové kyseliny existuje vedle sekvencí nukleových kyselin, které se přirozeně vyskytují v DNA savce.

Sekvence nukleové kyseliny popřípadě kóduje polypetid, který má aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5 nebo sekv. id. č. 6, fragment uvedeného polypeptidu, který přímo aktivuje B buňky, nebo konzervativně substituovanou variantu tohoto polypeptidu, výhodněji polypeptid, který má aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5 nebo sekv. id. č. 6, nebo konzervativně substituovanou variantu tohoto polypeptidu, ještě výhodněji polypetid, který má aminokyselinovou sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 4, sekv. id. č. 5 nebo sekv. id. č. 6. Nejvýhodněji sekvence nukleové kyseliny znamená sekvenci identifikovanou jako sekv. id. č. 1 nebo sekv. id. č. 2.

S výhodou má transgenní savec do svého genomu zavedenu sekvenci nukleové kyseliny, která kóduje protein schopný aktivovat B buňky použitím rozpustného polypeptidu, který má aminokyselinovou sekvenci vybránu ze skupiny sestávající z leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-ser, leu-leu-leu-leu-leu-leu-pro-leu a leu-leu-leu-leu-leu-leu-val-his, který je specificky rozpoznáván monoklonální protilátkou 3C10 a který aktivuje B buňky.

Transgenní savec může mít alternativně do svého genomu zavedenu sekvenci nukleové kyseliny kódující jiné proteiny podle vynálezu. Sekvence nukleové kyseliny může znamenat heterologní sekvenci.

V jiném aspektu tento vynález znamená transgenního savce, který má do svého genomu zavedenu sekvenci nukleové kyseliny •· ···· ·· ··» * · · · · · 9 • · · · · ·· · · · • · · · · * · · · · · · · » identifikovanou jako sekv. id. č. 8, při čemž sekvence nukleové kyseliny existuje vedle sekvencí nukleových kyselin, které se přirozeně vyskytují v DNA savce. Sekv. id. č. 8 obsahuje jak kódující sekvence (viz sekv. id. č. 1) tak část nekódující sekvence, tato nekódující část je vystřižena během produkce mRNA, která obsahuje pouze kódující baze. S výhodou je sekvence nukleové kyseliny zavedena do savce nebo předka savce rekombinantní technologií. Savec s výhodou znamená skot.

V další části spisu jsou popsány připojené obrázky.

Obrázek 1A ukazuje různou inhibici specifickou mAb 3C10 a MEM-18 přírodním lidským LAIT (Hu-LAIT, nhCD14) zprostředkovanou aktivaci B buněk CD14 (Todd S.-C. Juan a spol.: J. Biol.

Chem. 1995, 270, 5219.). Uvedená koncentrace mAb 3C10 (-),

MEM-18 (---) nebo jejich isotypově nespecifických mAb, 12CA5 (IgG2_to) (-----) (Field J. a spol.: Mol. Cell. Biol. 1988, 8,

2159.) a W3/25 (IgG-J (----) (Williams A. F.: Cell 1977, 12,

663.) byla přidána k 0,2 ml kultivačního media bez sera na kultivační desce s plochým dnem s 96 jamkami (Costar), které obsahovaly buď: 1 μg/ml přírodního (n) Hu-LAIT ( ) nebo 5 μg/ml LPS ( · ). Po 5 hodinách inkubace při 37 °C bylo do každé kultivační jamky přidáno 1,5.10⁵ myších slezinných B buněk s vysokou vznášivou hustotou, které byly isolovány tak, jak bylo dříve popsáno (Ratcliffe M. J. a spol.: J. Immunol. 1983, 131, 581.). Po 40 hodinách bylo na kultury působeno pulsem 1 μ(3ί ³H-TdR. Po dalších 6 hodinách byly isolovány na filtračních podložkách a příjem thymidinu byl vyhodnocen scintilační spektroskopií. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento odpovědi indukované každým ze dvou stimulů v nepřítomnosti jakékoliv mAb. Pozadí odpovědi v nepřítomnosti stimulů bylo v rozmezí od 0,7 do 1,7.10³ impulsů za minutu (cpm); odpověď na 5 μg/ml LPS a 1 μg/ml nHu-LAIT v nepřítomnosti mAb byla 77,8.10³ cpm, respektive 82,3.10³ cpm. Čárky chyb ukazují standardní odchylku kolem středu trojitých kultur.

Obrázek 1B ukazuje inhibici rekombinantním (r)Hu- a rBo• 9 « · ···» «· · · » « 9 ···« ··« «··«· · C · fc · • 4 ··· · · ···· <1 · 9 upravená stránka

-LAIT zprostředkované aktivace B buněk CD14 specifickou mAb,

3C10. Uvedená koncentrace mAb 3C10 nebo IgG2_fa isotypově nespecifické mAb 0X40 (Paterson D. J. a spol.: Mol. Immunol. 1987,

24, 1281.) byla přidána k 0,2 ml kultivačního media bez sera na kultivační desce s plochým dnem s 96 jamkami (Costar), které obsahovaly buď: 15 gg/ml rozpustného rekombinantního CD14 (rHu-LAIT) (0 ), 2 μg/ml rozpustného rekombinantního hovězího CD14 (rBo-LAIT) ( O ) nebo 5 Mg/ml LPS( o). Po 5 hodinách inkubace při 37 °C bylo do každé kultivační jamky přidáno 1,5.10⁵ myších slezinných B nuněk s vysokou vznášivou hustotou, které byly isolovány tak, jak bylo dříve popsáno (Ratcliffe M. J. a spol.:

J. Immunol. 1983, 131, 581.). Po 40 hodinách bylo na kultury působeno pulsem 1 μϋί ³H-TdR, po dalších 6 hodinách byly isolovány na filtračních podložkách a příjem thymidinu byl vyhodnocen scintilační spektroskopií. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento odpovědi indukované každým ze tří stimulů v nepřítomnosti jakékoliv mAb. Pozadí odpovědi v nepřítomnosti stimulů bylo v rozmezí od 0,7 do 1,7.10³ cpm; odpovědi na 5 Mg/ml LPS, μg/ml rHu-LAIT a 2 μg/ml rBo-LAIT v nepřítomnosti mAb 3C10 byly 77,8.10³ cpm, 10,9.10³ cpm, respektive 82,3.10³ cpm se standardní odchylkou mezi opakovanými kulturami menší než 10 %. Inhibice zprostředkovaná 0X40 byla menší než 15 % u všech testovaných koncentracích.

Obrázky 2A a 2B ilustrují srovnávací analýzu LPS a rBo-LAIT indukce mebránové IgK exprese (mlgx) v myší pre-B buněčné linii, 70Z/3. 8.10⁴ 70Z/3 buněk bylo kultivováno v 0,1 ml kultivačního media bez sera na kultivační desce s plochým dnem s 96 jamkami (Costar) 20 hodin bez přítomnosti žádného stimulu nebo s uvedenými koncentracemi rBo-LAIT ( □ ), LPS odvozeného od S. typhimurium (Sigma) (O) nebo nekultivovaného LPS odvozeného od E. coli mutantu D31m4 ( 0) (Kirkland T. N., Qureshi N. a Takayama K.: Inf. and Imm. 1991, 59, 131.). Buňky byly isolovány a obarveny mAb 187.1 konjugovanou s fluoresceinem (^T187.1) (Yelton D_ř E. a spol.: Hybridoma 1981, 7, 5.), specifickou pro myší IgK, a část mIgK^k buněk byla vyhodnocena průtokovou cytometrií použitím zařízení B.-D. FACScan. Tři horní hi27 * * ··»· «ψ » « • < » fc « · · • > · t a · · · • 3 · · · · • 4 » .4 · » ···· upravená stránka stogramy na obrázku 2A ilustrují podíly mlgK^4- 70Z/3 buněk po dvacetihodinové kultivaci při 37 °C: v nepřítomnosti stimulu (nalevo), v přítomnosti 3 gg/ml S. typhimurium LPS (střed) a v přítomnosti 0,1 gg/ml rBo-LAIT (napravo). Obrázek 2B ukazuje procento mlgK' 70Z/3 buněk indukovaných uvedenými koncentracemi těchto tří stimulů.

Obrázek 3A ukazuje inhibici rBo-LAIT zprostředkované indukce mIgK^F 70Z/3 buněk působením mAb 3C10. Uvedená koncentrace mAb 3C10 byla přidána k 0,1 ml media bez sera, které neobsahovalo žádný další stimul ( ), 3 gg/ml S. typhimurium LPS (O ) nebo 0,1 gg/ml rBo-LAIT (#). Směsi byly vysety na desku s 96 jamkami (Costar) a inkubovány 2 hodiny při 37 °C. Po této předinkubační době bylo do každé kultivační jamky přidáno 8.10⁴buněk 70Z/3, následovala dvacetihodinová inkubace při 37 °C, načež byly buňky isolovány a obarveny ^F187.1 a část mlgK^4- buněk byla vyhodnocena průtokovou cytometrií použitím zařízení B.-D. FACScan. Ilustrováno je % kontrolních odpovědí, tj. podíl mlgK⁴ 70Z/3 buněk pozorovaných v přítomnosti uvedené koncentrace mAb 3C10 podělený podílem mlgK⁴ 70Z/3 buněk pozorovaných v nepřítomnosti mAb 3C10 pro každou indukci rBo-LAIT a LPS. Isotypově nespecifická mAb 0X40 nezprostředkovala větší než 15% inhibici, jestliže byly kultivovány jakékoliv koncentrace, při nichž se mAb 3C10 použily pro kterýkoliv z těchto dvou stimulů.

Obrázek 3B ukazuje různou inhibici rHu-LAIT zprostředkované indukce mlgK⁴ Z70/3 buněk mAb specifickými pro CD14. Uvedená koncentrace mAb 3C10 ( · ), MEM-18 ( a ) nebo jejich příslušných isotypově nespecifických mAb, 12CA5(Q) a W3/25 (O ), byly přidány k 0,1 ml media bez sera, které obsahovalo 0,75 gg/ml nHu-LAIT. Po dvou hodinách inkubace při 37 °C bylo do každé kultivační jamky přidáno 8.10⁴ buněk 70Z/3, následovala dvacetihodninová inkubace při 37 °C, načež byly buňky isolovány a obarveny ^F187.1 a část mlgK^4- buněk byla vyhodnocena průtokovou cytometrií použitím zařízení B.-D. FACScan. Ilustrováno je % kontrolních odpovědí, tj. podíl mlgK^-4 70Z/3 buněk pozorovaných v přítomnosti uvedených koncentrací mAb podělený podílem upravená stránka mIgK⁺ 70Z/3 buněk pozorovaných v přítomnosti 0,75 ^g/ml nHu-LAIT v nepřítomnosti jakékoliv mAb.

Obrázky 4A až 4C ukazují účinek na indukci mIgK⁺ u buněk 70Z/30 působením nBo-LAIT nebo LPS difosforylovaného lipidu A odvozeného od Rhodopseudomonas sphaeroides (RSDPLA). 8.10⁴ buněk 70Z/3 bylo kultivováno v 0,1 ml media bez sera, které obsahovalo 10 Mg/ml RSDPLA na desce s 96 jamkami (Costar) dvě hodiny při 37 °C. Po této předinkubační době byla přidána uvedená koncentrace ReLPS ( □ , obrázek 4A) nebo přírodní Bo-LAIT (O; obrázek 4B). Následovala dvacetihodinová kultivace při 37 °C, načež byly buňky isolovány a obarveny ^F187.1 a část mIgK⁺buněk byla vyhodnocena průtokovou cytometrií použitím zařízení B.-D. FACScan. Byly provedeny dvě kontroly, aby se získalo srovnání výsledků, které byly získány pro každý stimul. K buňkám, které byly předem podobně zpracovány s RSDPLA, byl v uvedené koncentraci přidán RSDPLA ( A ). K buňkám, které byly podobně předinkubovány, ale bez RSDPLA ( 0 , obrázek 4A), byl přidán ReLPA. K buňkám, které byly podobně předinkubovány bez RSDPLA ( φ , obrázek 4B), byl přidán také nBo-LAIT. Na obrázku 4C byla replikace desek s plochým dnem s 96 jamkami (Costar) oseta 8.10⁷ buněk 70Z/3 v 0,1 ml media bez sera, které obsahovalo uvedenou koncentraci RSDPLA na 2 hodiny při 37 C. Po této předinkubační době nebyly kultury doplněny o žádný stimul (A ) nebo o stimul 5 μg/ml LPS ( a) nebo 0,3 pg/ml nBo-LAIT (φ ), jak je uvedeno na obrázku 4C. Jedna deska byla isolována po dalších dvaceti hodinách, buňky byly obarveny fykoerythrinem (PE) konjugovanou kozí antimyší Igx specifickou protilátkou (Southern Biotechnology). Část mlgK* buněk byla vyhodnocena použitím zařízení B.-D. FACScan. Ilustrována jsou % kontrolních odpovědí, tj. podíl mlgK' buněk pozorovaných v přítomnosti uvedené koncentrace RSDPLA podělený podílem mlgK¹ buněk pozorovaných v přítomnosti uvedeného stimulu v nepřítomnosti RSDPLA (levá vertikální osa). Na druhou desku bylo působeno pulsem 1 pCi ³H-TdR 14 hodin po přidání stimulu, po 6 hodinách byla isolována na filtračních podložkách a příjem thymidinu byl vyhodnocen kapalinovou scintilační spektroskopií (vertikální osa napravo).

• · < · upravená stránka

Obrázek 5A je grafickou representací nHu-LAIT/CD14. Jsou zde vyznačeny dvě oblasti, které charakterizují epitopy rozpoznávané mAb 3C10 (aminokyseliny 7 až 14) a MEM18 (aminokyseliny 57 až 65). Obrázek 5B je schématem, jak může RSDPLA fungovat při inhibování Hu-LAIT zprostředkované diferenciace 70Z/3.

RSDPLA může interagovat s LPS vazebným místem Hu-LAIT proteinu nebo může RSDPLA interagovat s domnělým receptorem pro LAIT na buňce 70Z/3. Mohou být sdíleny některé prvky LPS a LAIT-proteinem zprostředkované buněčné aktivace. Je ukázána také mAb MEM-18, která by blokovala interakci nHu-LAIT a RSDPLA podle jednoho z možných způsobů interakce. Obrázek 5C ukazuje účinek různých koncentrací mAb MEM-18 na indukci mlgK*^- do buněk 70Z/3 působením nHu-LAIT v přítomnosti RSDPLA. 8.10⁴ buněk 70Z/3 bylo kultivováno v 0,1 ml media bez sera, které obsahovalo 30 Mg/ml RSDPLA 2 hodiny při 37 °C. Tyto kultury byly doplněny 0,75 Mg/ml nHu-LAIT, který byl předinkubovín s uvedenou koncentrací mAb MEM-18 dvě hodiny při 37 °C. Po dalších 20 hodinách inkubace při 37 °C byly buňky isolovány a obarveny fykoerythrinem (PE) konjugovanou kozí antimyší IgK specifickou protilátkou (Southern Biotechnology). Část mIgK⁺ buněk byla vyhodnocena použitím zařízení B.-D. FACScan. Ilustrováno je % kontrolních odpovědí, tj. podíl mlgK^4- buněk pozorovaných v přítomnosti uvedených koncentrací RSDPLA podělený podílem mlgK^4- buněk pozorovaných (90 %) v přítomnosti 0,75 Mg/ml nHu-LAIT v nenepřítomnosti RSDPLA.

Obrázek 6A ukazuje kvantitativní vyjádření nHu-LAIT/sCD14 v párových vzorcích lidského mléka a sera získaných od 9 subjektů v uvedené době po porodu. sCD14 byl kvantitativně stanoven použitím komerčně dostupné sestavy ELISA (IBL, Hamburg). Výsledky jsou uvedeny jako poměr sCD14/celkový protein v mléku (otevřené symboly) a seru (uzavřené symboly), každý tvar symbolu představuje jiný subjekt. Celkový protein byl stanoven použitím kolorimetrického detekčního systému (BioRad).

Obrázek 6B ukazuje analýzu aktivity podporující růst B buněk teplem denaturovaného nBo-LAIT. 1,5.10⁵ myších slezinných • · upravená stránka buněk s vysokou vznášivou hustotou od konvenčních myší C57B1/6 bylo připraveno jak dříve popsáno (Ratcliffe M. J. H. a spol.:

J. Immunol. 1983, 131, 581.). Buňky byly kultivovány v 0,2 ml media bez sera v přítomnosti uvedených koncentrací stimulů. Uvedené koncentrace nBo-LAIT byly získány zředěním lOx roztoku, který byl vystaven působení 99,9 ^CTC po dobu 10 minut v zařízení Perkin Elmer GenAmp PCR systém 9600 nebo byly nechány nezpracovány. Po tomto zpracování byly buňky chlazeny 5 minut v ledu a přidány ke kulturám, které obsahují B buňky. Na tyto kultury bylo 40 hodin působeno pulsem 1 μθϊ ³H-TdR, po 6 hodinách byly isolovány a příjem thymidinu byl vyhodnocen kapalinovou scintilační spektroskopií.

Obrázky 7A až 7C ukazují částečné čištění bioaktivního nBo-LAIT/CD14 použitím kombinace sekvenčního vysolení a vylučovací chromatografie. Hovězí mléčná syrovátka byla připravena a vysolena tak, jak je popsáno v textu. Na obrázku 7A je ukázán CD14 specifický imunoblot vyčeřené mléčné syrovátky (CM), afinitně vyčištěný nBo-LAIT (nBO) a každá testovaná (NH₄)₂SO₄ frakce. Imunoblot byl proveden tak, jak je popsáno níže pro obrázek 7D.

Na obrázku 7B je uvedeno rozdělení proteinů v každé z frakcí popsaných na obrázku 7A použitím 10% SDS-PAGE s následujícím vybarvením stříbrem. 62% (NH₄)₂SO₄ frakce, která obsahuje nejvyšší podíl nBo-LAIT/CD14, byla podrobena molekulárnímu prosetí na vytěsňovací FPLC koloně (Pharmacia) se Superdexem-75 ekvilibrované v TN pufru (lOmM Tris, pH 8,0, 150mM NaCl). Pro eluci proteinů rychlostí toku 0,4 ml/min byl použit TN pufr. Po dobu 40 minut byly shromažďovány 0,2ml frakce s použitím 0D_28onm detektoru pro sledování elučního profilu proteinu. Každá ze získaných frakcí byla analyzována na nBo-LAIT/sCD14 imunoblotem, jak je popsáno na obrázku 7D. Frakce 47 až 49 z tohoto způsobu dělení obsahovaly podle imunoblotové analýzy nejvyšší koncentraci nBo-LAIT/sCD14. Obrázek 7C ukazuje srovnávací analýzu indukce mlgK exprese v myší pre-B buněčné líni, 70Z/3, afinitně vyčištěným nBo-LAIT/sCD14 (nBo-LAIT). 62% (NH₄)₂SO₄ frakce (O) byla použita jako výchozí materiál pro molekulární prosetí; ze Superdexu-75 byly isolovány frakce 47 ( ), 48 (A) a 49 (· ), • · • · • « • · • · · ·· · · ···· ·· · upravená stránka které měly maximální obsah nBo-LAIT/sCD14, jak bylo vyhodnoceno imunoblotovou analýzou. 8.10⁴ buněk 70Z/3 bylo kultivováno v 0,1 ml media bez sera v 96 jamkách kultivačních desek s plochým dnem (Costar) 20 hodin v přítomnosti uvedených koncentrací každého stimulu. Buňky byly isolovány a obarveny PE konjugovanou kozí antimyší IgK specifickou protilátkou (Southern Biotechnology). Část mlgx⁺ buněk byla vyhodnocena kapalinovou cytometrií použitím zařízení B.-D. FACScan.

Obrázek 7D ukazuje srovnávací B buněčnou stimulační aktivitu nBo-LAIT afinitně vyčištěného z hovězího kolostra a mléka. Vyčištěná kolostrální a mléčná syrovátka byla podrobena sekvenčnímu vysolení zvyšujícími se koncentracemi (NH₄)₂SO₄, jak je popsáno na obrázku 7A. 62% (NH₄)₂SO₄ frakce byla solubilizována a odsolena a sCD14 byl afinitně vyčištěn na mAb 3C10 konjugované na Sephadex 4B. Afinitně vyčištěný materiál z kolostra (O) a mléka (6) byl přidán v uvedených koncentracích k 0,2ml kulturám media bez sera obsahujících 1,5.10⁵ slezinných B buněk s vysokou vznášivou hustotou isolovaných jak shora uvedeno. Po 40 hodinách bylo na kultury působeno pulsem l μθϊ ³H-TdR, po dalších 6 hodinách byly isolovány na filtračních podložkách a příjem thymidinu byl vyhodnocen scintilační spektroskopií. Insert na obrázku 7D představuje imunoblot mléčného (M) a kolostrálního (C) hovězího sCD14. 250 ng proteinu bylo rozděleno 10% SDS-PAGE a protein byl pak přenesen na PVDF membránu. Po jednohodinovém blokování v 5% sbíraném mléku byl protein stanoven použitím polyklonálního králičího protihovězího CD14 v kombinaci s křenovou peroxidasou konjugovaným kozím protikráličím IgG (BioRad). Signály byly detegovány ECL (Amersham).

Obrázek 8A ukazuje sekvence oligonukleotidových sond použitých pro detegování mRNA specifické pro hovězí tracheální antimikrobiální peptid (TAP). Obrázek 8B ukazuje sekvenci oligonukleotidové sondy použité pro detegování mRNA specifické pro hovězí tubulin, použitý jako plnící kontrola.

Obrázek 9A ukazuje indukci tracheální antimikrobiální pep• · tidové (TAP) mRNA do primárních tracheálních epiteliálních buněk působením LPS, přírodního LAIT-proteinu pocházejícího ze skotu (nBo-LAIT) a člověka (nHu-LAIT) a rekombinantního hovězího LAIT-proteinu pocházejícího buď ze savčího expresního systému (rBo-Cl27) nebo expresního systému baculoviru (rBo-Sf9). Primární kultury hovězích tracheálních epiteliálních buněk byly připraveny podle dříve publikovaných způsobů (Diamond G. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sel. USA 1996, 93, 5156.). V 1 ml media bez sera, které obsahovalo uvedenou koncentraci různých stimulů, bylo kultivováno 5.10⁵ tracheálních epiteliálních buněk. Po šestnáctihodinové kultivační periodě při 37 °C byla celková RNA z každé kultury isolována použitím Trizolového způsobu (Gibco) a 20 μg naplněnými na 1,2% formaldehyd/agarosový gel. Rozdělená RNA pak byla přenesena na nylonovou membránu (GeneScreen, DuPont) použitím blotteru Vacuum (Pharmacia) v lOxSSC a UF-zesíťována podle doporučení výrobce. Na 5'-konci označené TAP oligo-sondy (viz obrázky 8A a 8B) byly smíchány v poměru 1:1 a hybridizovány na imobilizovanou RNA v 50% (obj./ /obj.) formamidu/6x standardním solným citrátem (SSC)/5x Denhardtovi/0,5% (hmotn./obj.) SDS/10% (hmotn./obj.) dextransulfátu/100 μg/ml lososové spermální DNA při 42 °C po dobu 16 až 20 hodin a potom promývány 30 minut v 2xSSC, 0,1% SDS při 65 °C. Naplnění bylo normalizováno vyhodnocením hladin hovězího tubulinu v každém pásu. Hybridizace oligosondou specifickou pro hovězí tubulin byla prováděna za podmínek vysoké selektivity zahrnující 0,lxSSC, 1% SDS dvě hodiny při 65 °C. Intenzity signálů pro TAP byly normalizovány na relativní RNA množství měřené vyhodnocením intenzity signálu náplně kontrolní sondy použitím zařízení Phosphorimager (Molecular Dynamics).

Obrázek 9B ukazuje kinetiky LPS a nBo-LAIT/sCD14 indukce tracheální antimikrobiální peptidové (TAP) mRNA v primárních tracheálních epiteliálních buňkách. Primární tracheální epiteliální buňky byly připraveny a kultivovány tak, jak je popsáno v příkladu 9A. Všechny replikované kultury obsahovaly buď 1 μg/ml LPS nebo 1 μg/ml nBo-LAIT/sCD14. V uvedených časech byla isolována celková RNA, rozdělena na agarosových gelech a sondo33

• a aaa · · a··· a a a upravená stránka vána nejdříve TAP specifickými oligosondami a potom oligosondou specifickou pro tubulin, jak je popsáno v obrázku 9A. Intenzity signálů pro TAP byly normalizovány na relativní množství RNA změřené vyhodnocením intenzity signálu náplně kontrolní sondy použitím zařízení Phosphorimager (Molecular Dynamics).

Popis výhodných provedení

Níže popsané pokusy demonstrují, že indukce slezinných B buněk s vysokou vznášivou hustotou pocházejících z myší je indukována tak, aby vstoupily do a pokračovaly buněčným cyklem jako odpověď na rekombinantní formy hovězího a lidského LAIT-proteinu/sCD14 in vitro v definovém mediu bez sera. Je ukázáno, že mAb 3C10, specifická pro zbytky 7 až 14 lidského CD14 na aminovém konci lidského CD14, ale nikoliv mAb MEM-18, specifická pro zbytky 57 až 65, v tomto testu specificky inhibuje růst podporující aktivitu rekombinantního a přírodního hovězího a lidského LAIT-proteinu/sCD14 u myších B buněk.

Je demonstrována in vitro indukce diferenciace mCD14^_, mlg~ myší pre-B buněčné linie 70Z/3 na mlg⁺ stav, rekombinantním hovězím a lidským LAIT-proteinem/sCD14 v definovaném mediu bez sera. Je ukázáno, že tento proces je inhibován mAb 3C10, ale nikoliv mAb MEM-18.

Je ukázáno, že jak LPS tak rekombinantním hovězím LAITproteinem/sCD14 zprostředkovaná indukce myší pre-B buněčné linie 70Z/3 na mlg^ stav je inhibována difosforyllipidem A pocházejícím z Rhodopseudomonas sphaeroides (RSDPLA).

Je ukázáno, že kolostrum lidských subjektů obsahuje 100 až 400krát vyšší koncentrace přírodního lidského LAIT-proteinu/sCD14 při srovnání se vzorky sera ze stejných subjektů získaných ve stejné době po porodu. Je ukázáno, že zvýšená koncentrace lidského LAIT-proteinu/sCD14 v kolostru a mléku vzhledem ke koncentracím, které byly pozorovány v seru, přetrvává až do 400 dnů po porodu.

• · · · • « upravená stránka

Je ukázáno, že biologická aktivita přírodního hovězího LAIT-proteinu/sCD14 v mléku získaném až do 200 dnů po porodu je srovnatelná s aktivitou, která byla pozorována v hovězím kolostru. Je ukázáno, že hovězí od mléka odvozený LAIT-protein/sCD14 indukuje slezinné B buňky s vysokou vznášivou hustotou pocházející z myší k tomu, aby vstoupily a pokračovaly buněčným cyklem in vitro v definovaném mediu bez sera se specifickou aktivitou srovnatelnou s aktivitou, která byla pozorována u přírodňího hovězího LAIT-proteinu/sCD14 pocházejícího z kolostra.

Je ukázáno, že aktivita afinitně vyčištěného nBo-LAIT podporující růst B buněk je po 10 minutách varu při 99,9 °C velmi silně snížena.

Je ukázáno, že postupné vysolení proteinů z vyčištěné hovězí mléčné syrovátky použitím (NH₄)₂SO^, jak je podrobně popsáno níže, vede k obohacení přírodního hovězího LAIT-proteinu/sCD14 v 62% (NH₄)_aSO₄ frakci. Je ukázáno, že tato 62% (NH₄)₂SO₄ frakce hovězí mléčné syrovátky stimuluje indukci diferenciace mCD14^_, mlg^- myší pre-B buněčné linie 70Z/3 na mlgstav in vitro.

Je ukázáno, že molekulární prosetí proteinů v 62% (NH₄)_aS0₄frakci hovězí mléčné syrovátky poskytuje frakce, které jsou obohaceny o bioaktivní přírodní hovězí LAIT-protein/sCD14. Je ukázáno, že tyto obohacené frakce mají zhruba stokrát vyšší specifickou aktivitu než 62% (NH₄)_aSO₄ frakce hovězího mléka při indukci diferenciace mCD14~, mlg“ myší pre-B buněčné linie 70Z/3 na mlg⁴ stav in vitro.

Je ukázáno, že LPS, přírodní formy jak hovězího tak lidského LAIT-proteinu/sCD14 a rekombinantních forem hovězího LAIT-proteinu/sCD14, produkované v expresních systémech savců a baciloviru, indukují expresi tracheálního antimikrobiálního peptidu (TAP) v primárních hovězích tracheálních epiteliálních buňkách.

• · ··· ·· ··«· ·· ·

Příklady provedeni vynálezu

LAIT-proteinem/sCD14 zprostředkovaná aktivace B buněk je inhibována mAb 3C10

CD14 specifické mAb, 3C10 a MEM-18, inhibují aktivaci monocytů a jejich následující produkci zánětlivých cytokinů zprostředkovanou komplexy LPS-LBP. Dále pak bylo ukázáno, že mAb 3C10 inhibuje sCD14 zprostředkovanou aktivaci monocytů. Pozdější výsledek je v souladu s existencí receptorů pro sCD14 na monocytech a s tím, že ta oblast s CD14, která interaguje s těmito domnělými receptory, je stejná jako nebo velmi blízká k oblasti mCD14 na monocytech, které interagují s komplexy LPS-LBP. Jelikož monocyty jsou mCD14~, 3C10 zprostředkovaná inhibice sCD14 funkce by mohla existovat díky jeho interakci s sCD14, mCD14 exprimovanému na cílových monocytech nebo díky obojímu.

Výsledky, které jsou uvedeny na obrázku 1A, ukazují rozdílnou schopnost CD14 specifických mAb inhibovat aktivaci myších B buněk zprostředkovanou přírodním lidským LAIT-proteinem/ /sCD14. mAb 3C10, ale nikoliv mAb MEM-18 ani její případné isotypové kontrolní mAb, inhibuje indukci růstu B buněk působením LAIT-proteinu, i když žádná z mAb neinhibuje růst B buněk indukovaný LPS. Tyto výsledky, které jsou ilustrovány na obrázku 1B, ukazují, že CD14 specifická mAb 3C10 inhibuje jak rBo-LAIT/sCD14 tak rHu-LAIT/sCD14 zprostředkovaný růst myších B buněk, zatímco neovlivněný LPS indukuje růst B buněk.

Jelikož exprese mCD14 B buňkami není vyřešena, tyto výsledky nerozlišují mezi možnými mechanismy řešícími mAb 3C10 inhibici sCD14 zprostředkované aktivace B buněk. Dále pak i když je čistota myších B buněk s vysokou vznášivou hustotou, použitých jako cíle v tomto pokusu, v rozmezí od 88 do 95 %, kontaminující buňky jsou mCD14~. Konkrétně bylo demonstrováno, že tyto B buněčné populace obsahují mRNA kódující CD14 (PCT přihláška č. PCT/CA97/00880.). Bylo provedeny dva pokusy, aby se objasnil mechanismus (mechanismy) řešící LAIT/sCD14 zpro• · upravená stránka středkovanou aktivaci B buněk.

B buňky byly isolovány na základě jejich exprese mlgP fluorescenčně aktivovanými buňkami sortovanými na větší než 99% čistotu. Bylo ukázáno, že tato populace B buněk je negativní na obsaženou CD14 specifickou mRNA, jak bylo vyhodnoceno Northernovou blotovací analýzou. Postupně bylo ukázáno, že tato CD14 B buněčná populace odpovídá tak silně na přírodní Bo-LAIT/SCD14 (nBo-LAIT) pocházející z kolostra, jak je tomu u B buněk, které nebyly tímto způsobem vyčištěny. Podle tohoto kriteria se tedy zdá, že nBo-LAIT interaguje s domnělým receptorem na B buňkách způsobem nezávislým na mCD14 (PCT přihláška č. PCT/CA97/00880). Druhý přístup použitý pro zjištění, jestli mCD14 je zahrnut v LAIT-proteinem zprostředkované aktivaci B buněk, obsahuje vyhodnocení jeho stability indukovat diferenciaci CD14^- pre-B buněčné linie 70Z/3.

LAIT/sCD14 indukuje diferenciaci mCD14^- pre-B buněčné linie

Na membránový imunoglobulin negativní (mlg~) myší pre-B buněčná linie 70Z/3 (Paige C. J. a spol.: J. Immunol. 1978,

121, 641.) neexprimuje mCD14 detegovatelný imunofluorescencí a je negativní pro mRNA kódující CD14, jak bylo vyhodnoceno jak Northernovou blotovou analýzou tak RT-PCR (Filipp D. a Julius M: nepublikované výsledky; Lee J. D. a spol.: J. Exp. Med.

1992, 175, 1697.). 70Z/3 je indukována na mlgP^- stav po stimulaci buď LPS nebo IFN-K (Paige C. J. a spol.: J. Immunol. 1978, 121, 641.). Výsledky ilustrované na obrázku 2 ukazují, že rBo-LAIT/sCD14 indukuje diferenciaci 70Z/3 na stav mlg k* tak efektivně jako to dělá LPS. Tento výsledek ukazuje na to, že existuje receptor pro rBo-LAIT na buňkách 70Z/3 a dále, že tento receptor nemůže znamenat mCD14. Tento přístup tedy poskytuje prostředky, kterými se vyhodnocuje mCD14 závislost mAb 3C10 zprostředkované inhibice biologické aktivity LAIT/sCD14.

• · · · • · *·· · · · · *·· ····· · · · · · upravená stránka

LAIT/SCD14 indukce diferenciace 70Z/3 je inhibována mAb 3C10

Výsledky ilustrované na obrázku 3A ukazují, že mAb 3C10 inhibuje LAIT/sCD14 indukci mlgκ exprese na 70Z/3. LPS zprostředkovaná indukce mlgκ není inhibována působením mAb 3C10, což ilustruje, že tato inhibice je specifická pro LAIT/sCD14 zprostředkovanou indukci a dále to, že mechanismus řešící mAb 3C10 zprostředkovanou inhibici nezahrnuje jeho přímou interakci se 70Z/3.

Tyto výsledky, ilustrované na obrázku 3B, ukazují, že ne všechny CD14 specifické mAb inhibují LAIT-proteinem/sCD14 zprostředkovanou diferenciaci 70Z/3 na mlgk' stav. Konkrétně - mAb 3C10, ale nikoliv mAb MEM-18, také specifická pro CD14, ani jakákoliv jejich případná isotypová kontrolní mAb, neinhibuje indukci 70Z/3 diferenciace rekombinantním lidským LAIT-proteinem/ /sCD14. Tyto výsledky ukazují, že mAb 3C10 interaguje s LAIT/ /sCD14 a maskuje determinanty, které interagují s domnělými i) receptorem (receptory) pro LAIT/sCD14 exprimovaný 70Z/3.

Endotoxin a LAIT-protein/sCD14 sdílejí signální dráhy

Jak bylo diskutováno v části týkající se dosavadního stavu techniky, byly navrženy četné modely pro vysvětlení mechanismu, kterým LPS indukuje aktivaci monocytů a jejich následnou produkci prozánětlivých cytokinů. Úloha mCD14, fungujícího jako domnělý receptor pro endotoxin, je ústřední pro nejvíce předpokládaný mechanismus. I když exprese mCD14 snižuje koncentraci LPS požadovaného pro indukování buněčné aktivace v hodnotách řádů, nevypovídá o LPS zprostředkované aktivaci. Konkrétně koncentrace LPS požadovaná pro indukování mlg exprese v mCD14~ 70Z/3 je vyšší, než jaká je vyžadována pro stimulaci produkce cytokinů mCD14‘ monocyty (Lee J. D. a spol.: J. Exp. Med. 1992, 175, 1697.). Dále pak - jestliže se 70Z/3 transfektuje cDNA kódující lidský CD14, bylo demonstrováno, že koncentrace LPS požadovaná pro indukování mlg exprese mCD14' klony byla lOOOOkrát nižší, než jaká je vyžadována u divokého typu mCD14“ rodičovské • · · · upravená stránka linie 70Z/3. Dále byla účinnost stimulace působením LPS za těchto okolností závislá na seru, což ukazuje na to, že je zde zahrnut LBP (Lee J. D. a spol.: J. Exp. Med. 1992, 175, 1697.). I když je zdůrazněna ústřední úloha mCD14 při zprostředkování buněčné interakce s komplexy LPS-LBP, tyto výsledky také demonstrují, že existuje na mCD14 nezávislá aktivační dráha využitá LPS, která je nezávislá na seru a tedy LBP.

Následuje otázka, která se týká toho, jestli dráha nezávislá na mCD14 je zahrnuta v LPS a LAIT/SCD14 aktivace 70Z/3 sdílí signální prvky. Výsledky, které jsou uvedeny na obrázku 7, ukazují na to, že to může být tento případ. Dříve bylo ukázáno, že difosforyllipid A, odvozený od LPS, inhibuje aktivaci 70Z/S působením LPS (Kirkland T. N., Quershi N. a Takayama K.: Infection and Immunity 1991, 59, 131.). Zvláště pak preinkubace 70Z/3 difosforyl-lipidem A (RSDPLA) inhibovala následující expresi mlg indukovanou LPS. Jak bylo ukázáno na obr. 4A, preinkubace 70Z/3 v mediu obsahujícím RSDPLA při 10 Mg/ml vedla ke trojnásobné až čtyřnásobné inhibici IgP exprese zprostředkované LPS. Na obrázku 4A je také vidět, že RSDPLA sám neindukuje Ig κ expresi na 70Z/3 v testovaném koncentračním rozmezí, tj. 0,1 až 30 μg/ml. Obrázek 4B ilustruje, že preinkubace 70Z/3 v mediu, které obsahuje 10 pg/ml RRSDPLA, nejen že inhibuje nBo-LAIT indukci IgK exprese, ale dělá to s daleko větší účinností než v případě, jestliže se jako stimul používá LPS, což vede k alespoň desetinásobné inhibici nBo-LAIT zprostředkované indukce v celém koncentračním rozmezí testovaného nBo-LAIT. Na obrázku 4C je ilustrováno, že i když RSDPLA inhibuje jak LPS tak nBo-LAIT/SCD14 indukci mlgK exprese 70Z/3, neinhibuje růst 70Z/3 v žádné testované koncentraci, tj. 0,03 pg/ml až 10 μg/ml.

RSDPLA zprostředkovaná inhibice LPS zprostředkované aktivace je isologní v tom, že první je odvozen od LPS a o inhibici vlivem RSDPLA se předpokládá, že existuje díky kompetitivnímu navázání na fysiologický receptor(y) lipidu A exprimovaný 70Z/3. Schopnost RSDPLA inhibovat LAIT/sCD14 zprostředkovanou aktivaci by mohla ukazovat na to, že LAIT/SCD14 a LPS sdílejí upravená stránka obecné receptorové prvky a/nebo by mohla existovat díky tomu, že RSDPLA interaguje s dříve charakterizovanou LPS interakční sekvencí na CD14, zbytky 57 až 64 (Juan T. S.-C. a spol.: J. Biol. Chem. 1995, 270, 5219.), což by mohlo dále inhibovat LAIT/SCD14 aktivitu v těchto testech, přes nezávislost LAIT/ /sCD14 funkce na LPS.

Možnost, že RSDPLA inhibuje LAIT-protein/sCD14 funkci přímo navázáním LAIT-proteinu/sCD14, byla vyhodnocována tak, jak je ilustrováno na obrázku 5. Obrázek 5A ukazuje schéma LAIT-proteinu/sCD14 a vyzdvihuje dvě oblasti molekuly, které charakterizují vazebná místa mAb 3C10 a MEM-18. Bylo ukázáno, že MEM-18 blokuje navázání CD14 s LPS a tedy zbytky 57 až 65 jsou indikací LPS vazebného místa na CD14. Obrázek 5B ilustruje dva potenciální mechanismy, které by mohly vysvětlit RSDPLA zprostředkovanou inhibici funkce LAIT-proteinu/sCD14. Buď RSDPLA interaguje přímo s domnělými receptorovými prvky sdílenými LPS a LAIT-proteinem/sCD14 nebo může interagovat přímo a vázat LAIT-protein/sCD14. Jestliže jde o druhý z uvedených případů, potom blokování interakce RSDPLA s LAIT-proteinem/sCD14 použitím mAb MEM-18 (obrázek 5B) by mělo interferovat s RSDPLA inhibicí funkce LAIT-protein/sCD14. Jak je ukázáno na obrázku 5C, preinkubace přírodního lidského LAIT-proteinu/sCD14 s mAb MEM-18 nemění schopnost RSDPLA inhibovat LAIT-proteinovou indukci mlgK exprese 70Z/3.

Bylo zde ukázáno, že mAb 3C10, ale nikoliv mAb MEM-18, inhibuje funkci LAIT/SCD14 jak v maturovaných myších B buňkách (obrázek 1A) tak u myší pre-B buněčné linie 70Z/3 (obrázek 3A a obrázek 3B). Jak bylo shora popsáno, mAb 3C10 rozpoznává sekvenci na CD14, zbytky 7 až 14, která je podstatná pro LPS zprostředkovanou signalizaci, ale ne pro navázání LPS (Juan T. S.-C. a spol.: J. Biol. Chem. 1995, 270, 17237.). Jelikož mAb 3C10 inhibuje na LPS nezávislou LAIT/sCD14 signalizaci, předpokládá se, že zbytky 7 až 14 na LAIT/sCD14 jsou zahrnuty v interakci tohoto ligandu s domnělými strukturami membránového receptoru (membránových receptorů). Dále pak bylo ukázáno, že • · mAb MEM-18, která je specifická pro sekvenci na CD14 obsaženou v navázání LPS a je schopna blokovat interakci LPS-CD14, nemá žádný vliv na RSDPLA zprostředkovanou inhibici aktivace LAIT-protein/sCD14. I když to není definitivně ukázáno, dává se přednost interpretaci, že RSDPLA blokuje LAIT/sCD14 signalizaci jako důsledek kompetitivniho soutěžení obvyklých receptorových prvků.

LIAT/SCD14 je obohacen v lidském kolostru a mléku

Vzhledem k možné důležitosti úlohy rozpustného Hu-LAIT pro novorozené kojence, byl zkoumán systém exprese Hu-LAIT u žen po tom, co porodily. Vzorky kolostra a mléka byly získány od devíti lidských subjektů v různých dobách po porodu. Jelikož je známo, že sérum od zdravých lidských subjektů obsahuje mezi 1 až 5 Mg/ml sCD14, vzorky sera od shora uvedených devíti subjektů byly dány na stanovení toho, jestli koncentrace obsaženého sCD14 odpovídají koncentracím pozorovaným v sekrecích mléčné žlázy. Množství CD14 bylo kvantitativně vyhodnoceno použitím komerčně dostupné sestavy ELISA. Celkový protein byl stanoven použitím komerčně dostupného kolorimetrického detekčního systému. Výsledky uvedené na obrázku 6A jsou presentovány jako μg CD14/mg celkového proteinu pro každý pár získaných vzorků mléka a sera. Jak je ilustrováno, lidské mléko obsahuje mezi 100 až 400násobkem množství SCD14, než které obsahuje sérum od stejného jedince. Rovněž je uvedeno, že obohacení sCD14 v mléku proti seru přetrvává až do 400 dnů po porodu.

Tepelná labilita afinitně vyčištěného nBo-LAIT

Je třeba věnovat péči tomu, aby se zamezilo podmínkám, které snižují žádanou aktivitu CD14 nebo varianty polypeptidů, o který se jedná. Obrázek 6B ukazuje vliv varu při 99 °C po dobu 10 minut na afinitu vyčištěného nBo-LAIT. Velké snížení příjmu thymidinu B buňkami ukazuje na dramatické snížení, jestliže ne úplné zničení stimulační aktivity B buněk.

• · • · ··· · · · · · · · ····· ·· · · · ·· ···· · · · · ·« ··· ·· ··*· ·· ·

Částečné čištění biologicky aktivního hovězího LAIT-proteinu/ /sCD14 z mléka; hovězí LAIT-protein/sCD14 pocházející z kolostra a mléka mají srovnatelnou biologickou aktivitu

Dříve nebylo známo, že rozpustný CD14 je přítomen v mléku krav. V souvislosti s tímto vynálezem pojem sekrece mléčné žlázy zahrnuje kolostrum a mléko. Kolostrum znamená sekreci mléčné žlázy, která začíná v době porodu novorozence a pokračuje po relativní fixní dobu obvykle ne větší než 24 hodin. Mléko znamená sekreci mléčné žlázy, která následuje po sekreci kolostra. Odborník z oblasti techniky může snadno rozlišit kolostrum od mléka. Kolostrum se obvykle získává během několika prvních hodin po porodu a před počátkem kojení. V pokusech, které jsou zde popsány, a v PCT/CA 97/00880, kde se hovězí kolostrum používá jako zdroj bo-LAIT, se kolostrum získává od jedné hodiny po porodu do doby před kojením.

Způsob, který byl dříve používán pro isolování LAIT z hovězího kolostra (PCT/CA 97/00880), byl zde použit pro získání bo-LAIT z mléka. Plné, nepasterované kravské mléko bylo získáno z výzkumné farmy. Mléko bylo stanoveno jako sterilní vyhodnocením růstu v kapalném živném medium a na krevních agarových plotnách. Pro pokusy, které jsou zde popsány, byl použit pouze aseptický materiál.

Vyčeřená mléčná syrovátka byla připravena odstřeďováním kolostra nejdříve 30 minut při 4420 x g, aby se odstranily buňky a zbytky buněk. Supernatant z tohoto odstřeďování byl potom odstřeďován dvě hodiny při 250 000 x g. Plující tuky a peletovaný kasein byly odstraněny. Vyčeřená kolostrální syrovátka pak byla podrobena další frakcionaci.

Vysolení proteinů obsažených v přípravcích mléčné syrovátky bylo provedeno použitím postupného srážení v (NH₄)₂SO₄ přidáváním nasyceného roztoku síranu amonného. Byla použita tato řada zvyšujících se koncentrací solí: 42 %, 50 %, 62 % a 65 % (obj./obj.) síranu amonného (AS). Koncentrace AS v supernatantu • · · · upravená stránka materiálu vysráženého při 42 % byla tedy zvýšena na 50 %; materiál vysrážený při 50 % byl odebrán a koncentrace AS ve zbývajícím supernatantu byla zvýšena na 62 % a tak dále. Každá peleta vysrážená AS byla solubilizována v lOmM Tris-HCl, pH 8,0, obsahujícím 0,15M NaCl a lmM AEBSF (TNAEBSF). Tyto frakce byly odsoleny a pufr byl vyměněn za TNAEBSF použitím kolon 10DG.

Byla vyhodnocena biologická aktivita.

Postupné vysolování proteinů z vyčeřené hovězí mléčné syrovátky použitím (NH₄)_aSO₄ vedlo k obohacení přírodního hovězího LAIT-proteinu/sCD14 v 62% (NH^J^SO^ frakci (srovnej obrázky 7A a 7B). Koncentrace proteinu v 62% (NH₄)₂SO₄ frakcí pocházejících z hovězí mléčné syrovátky a kolostrální syrovátky byla 8 až 15 mg/ml, respektive 47 až 65 mg/ml. Koncentrace LAIT-proteinu/sCD14 v 62% (NH₄)₂SO₄ frakcích pocházejících z mléka a kolostra jsou 1 až 5 pg/ml, respektive 5 až 12 μg/ml. Výtěžky LAIT-proteinu/sCD14 získaného z těchto dvou zdrojů jsou tedy srovnatelné s 0,15 až 0,26 Mg/mg proteinu.

Aktivita 62% frakce byla potom obohacena. Padesát miligramů 62% AS obohacené frakce se nanese na kolonu s anexem. Materiál se dělí použitím solného gradientu 50mM až 400mM NaCl v lOmM bis-tri-propanu se současným pH gradientem 7,5 až 9,5.

Na obrázku 7C je ukázána srovnávací analýza částečně vyčištěných frakcí z mléka pocházejícího hovězího LAIT-proteinu/sCD14 s afinitně vyčištěným materiálem ze stejného zdroje na indukování exprese mlgK v 70Z/3. Jak je ilustrováno, 62% (NH₄)₂SO₄frakce měla specifickou aktivitu zhruba lOOOOkrát nižší než afinitně vyčištěný z mléka pocházející LAIT-protein/sCD14. Na obrázku 7C je ukázána také biologická aktivita frakcí obsahujících většinu LAIT-proteinu/sCD14 (vyhodnoceno imunoblotovou analýzou) získaných po další frakcionaci 62% (NH₄)₂SO₄ frakce na pryskyřici molekulového síta Sephadex 75. Specifická aktivita frakcí 47 až 49 byla lOOkrát vyšší než aktivita 62% (NH₄)₂SO₄frakce a odpovídala srovnatelnému zvýšení koncentrace LAIT-proteinu/sCD14.

• · · · • · ·· ··· ·· ···· ♦· ·

Na obrázku 7D je uvedena srovnávací analýza od mléka a od kolostra pocházejícími hovězími LAIT-proteiny/sCD14 zprostředkované indukce růstu B buněk. Jak je ilustrováno, specifická aktivita materiálu pocházejícího z mléka byla tak vysoká jako aktivita materiálu pocházejícího z kolostra. Insert na obrázku 7D ilustruje imunoblot afinitně vyčištěného LAIT-proteinu/ /sCD14 získaného z mléka a získaného z kolostra.

Bylo tedy ukázáno, že LAIT-protein/sCD14 se přirozeně vyskutuje v hovězím mléku, je možné ho zkoncentrovat a je možné isolovat mléčný protein se zachováním aktivity aktivace B buněk.

LAIT/sCD14 indukuje TAP specifickou mRNA v primárních hovězích tracheálních epiteliálních buňkách

Možnost, že LPS a LAIT/SCD14 sdílejí společné receptorové prvky, jak bylo shora popsáno, vede k možnosti, že mohou mít společné biologické aktivity. Byla zkoumána možnost, že LAIT/ /sCD14 může hrát úlohu při indukci defensinů. Specifické defensinové molekuly byly nedávno popsány u skotu (Diamond G., Russell J. P. a Brevins C. L.: PNAS 1996, 93, 5156; Schonwetter B. S., Stolzenberg E. D. a Zasloff M. A.: Science 1995, 267, 1645.). Byly tedy připraveny oligonukleotidové sondy pro hovězí TAP pro vyhodnocení relativních schopností LPS a LAIT/SCD14 indukovat vzkaz (message) pro tento antiobiotický peptid v uspořádání in vitro.

Obrázek 8A ukazuje sekvenci oligonukleotidových sond použitých pro detekci hovězího tracheálního antimikrobiálního peptidu (TAP) v primárních hovězích epiteliálních buňkách. TAP je polypeptid 38 aminokyselin. Zdá se, že jeho exprese je omezena cylindrickými epiteliálními buňkami hovězího dýchacího traktu (Diamond G. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1996, 93,

5156. ) .

Primární hovězí tracheální epiteliální buňky byly připra• · • · · · * · · · · ♦ · · ·· vény podle dříve popsaných způsobů (Diamond G. a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 1996, 93, 5156.). Byly připraveny jamky, které obsahují přibližně 5.10⁵ epiteliálních buněk v 1 ml mediu bez sera na jamku na kultivační desce s 24 jamkami a stimulovány 16 hodin uvedenými koncentracemi (obrázek 9A) LPS, přírodních forem lidského a hovězího LAIT-proteinu/sCD14 nebo rekombinantními formami Bo-LAIT/sCD14 připravených použitím buď savčího expresního systému (C127) nebo expresního systému baculoviru (Sf9). V pokusech byl použit hovězí LAIT získaný z mléka. Jak je ilustrováno na obrázku 9A, 1 Mg/ml buď přírodního nebo rekombinantního LAIT/sCD14 indukoval srovnatelné úrovně TAP specifické mRNA jako indukuje 1 μg/ml LPS a to vedlo k 15 až 20násobnému zvýšení signálu pozorovaného u nestimulovaných buněk. Na obrázku 9A jsou také ukázány signály získané pro hovězí tubulinovou specifickou mRNA, což ukazuje na to, že každá náplň byla naplněna srovnatelnými množstvími RNA, které byly použity pro normalizaci TAP mRNA signálů.

Na obrázku 9B je uvedena srovnávací analýza kinetik, při nichž 1 μg/ml buď LPS nebo přírodního hovězího LAIT-proteinu/ /sCD14 indukuje TAP mRNA v kulturách primárních hovězích tracheálních epiteliálních buněk. Epiteliální buňky byly kultivovány, jak je popsáno na obrázku 9A a exprese TAP specifické mRNA byla vyhodnocována ve vyznačených časech. Jak je ilustrováno, oba stimuly indukovaly maximum exprese TAP mRNA, normalizované na množství tubulinové mRNA (obrázek 9B) při 16 hodinách .

Předložený vynález tedy poskytuje způsob výroby CD14 koncentrátu ze sekrece mléčné žlázy. Sekrece může znamenat kolostrum nebo mléko a nebo obojí. Sekrece může pocházet od krávy nebo od člověka nebo od jiných druhů. Pro průmyslové účely se zdá slibnou výroba koncentrátu endogenního hovězího CD14, jak se přirozeně vyskytuje v kravském mléku. Za jistých okolností může být výhodné geneticky modifikovat organismus tak, aby produkoval CD14. To bude popsáno níže.

φ Φ ♦ «» I φ φ ΦΦ ΦΦ * « φ «φφφ φφφ «φφφφ «φ φ «φ φφ φφφ φφ φφφφ φφ φφφ

Jelikož je možné snížit nebo zničit příznivé vlastnosti (aktivitu indukce defensinu a/nebo aktivitu stimulace B buněk) CD14 tepelným ošetřením mléka, může být nutné nebo žádoucí získat CD14 bez takového předběžného ošetření mléka. Jedním způsobem, kterým se CD14 může koncentrovat, je níže popsaný způsob vysolení. Není to však jediný způsob dostupný odborníkům z oblasti techniky. Může se například použít chromatografie na ionexu a chromatografie molekulovým prosetím. Způsoby, které jsou zde popsány, by mohly být zlepšeny a optimalizovány pro komerční výrobu CD14 koncentrátů nebo isolátů. Navíc pak další složky mléka nebo kolostra, o kterých může být zjištěno, že jsou nežádoucí, lze odstranit podle způsobů známých odborníkům z oblasti techniky. Příklady těchto postupů jsou zde popsány. Při nich se mléko podrobí odstřeďování, plovoucí tuky se odstraní a kapalina obsahující protein (syrovátka) se dekantuje od kaseinové pelety vytvořené během odstřeďování.

Isolovaný CD14 znamená CD14 protein, který je identifikován a oddělen od alespoň jedné znečištěniny, se kterou byl původně asociován v přírodě, jako například od zvířecího nebo lidského zdroje CD14. Ve výhodných provedeních, v nichž je CD14 zamýšlen pro použití jako léčivo, bude CD14 isolován ve farmaceuticky přijatelných úrovních čistoty vzhledem k proteinům podle druhů původu. Ve výhodných provedeních protein CD14 bude vyčištěn (1) na více než 95 % hmotnostních proteinu, jak se stanovuje Lowryho způsobem, nejvýhodněji na více než 99 % hmotnostních. Toto jsou výhodné stupně isolace.

CD14 koncentrát znamená CD14 protein získaný z přirozeného zdroje, který byl zpracován tak, aby byl v koncentrátu přítomen ve větší koncentraci, než ve které se získává v přirozeném zdroji.

• · · fc · •« «··« · » ·

Rozpustný CD14 znamená molekulu CD14, která není vázána na membránu, jako například glykosylfosfatidyl-inositolovou kotvou.

Pokud jde o zpracování, je důležité, aby žádaná CD14 aktivita byla v koncentrovaném CD14 zachována. Tak při výrobě CD14 pro použití při aktivování B buněk by se roztok, který obsahuje CD14, neměl například zahřívat na 99 °C 10 minut, protože o těchto podmínkách je známo, že velmi silně snižují tento typ CD14 aktivity. Viz obrázek 6B, v němž je demonstrováno, že aktivita afinitně vyčištěného n-bo-LAIT je za těchto podmínek v podstatě zničena.

Použitím zde popsaných způsobů může zručný odborník snadno stanovit podmínky, které jsou škodlivé po žádanou aktivitu nebo které jsou relativně benigní. Tak například by se mohly aplikovat účinky různých teplot a časů (např. 40 °C, 50 °C, 60 °C, 70 °C atd.) na roztoky, které obsahují CD14, po různé doby (například 1 minuta, 2 minuty, ..., 10 minut). Podle způsobů zde popsaných se stanoví vliv na aktivitu stimulování B buněk. Podobně by se snadno mohl, za použití podobného schématu, stanovit vliv těchto pomínek na indukci defensinu v epiteliálních buňkách. Snadno lze stanovit také účinky jiných podmínek, jako jsou vlivy soli nebo jiných chemikálií, které by se mohly používat při ošetření mléka. Měla by být tedy věnována péče tomu, aby se CD14 vyhnul vystavení působením takových podmínek, které jsou nepříznivé pro jeho žádoucí aktivity.

Pokud se týká CD14, množství nebo koncentrace CD14 lze stanovit rutinními způsoby. Populárním testem je ELISA test založený na chemiluminiscenci. Pro detekci lidského CD14 se mohou použít komerčně dostupné sestavy (IBL, Hamburg, Německo).

Pro detekci hovězího CD14 nebo jakýchkoliv jiných druhů lze zručným odborníkem snadno vyvinout test ELISA, jehož příklad následuje. Připraví se rekombinantní CD14, jak je popsáno v PCT přihlášce č. PCT/CA 97/00880. Rekombinantní materiál se •α ···· • · · ·· )» ·· • ι* · * & e » • * ··· · · « * · « • « · · · · v··· · • · ·«·« · · » ·· ·*· ·» ·>·· ·· ·» použije pro generaci standardní křivky. V králíkovi se generuji polyklonální protilátky proti rekombinantní molekule a isolují se IgG frakce. IGg se pak imobilizuje na ELISA desce a promyje se, aby se odstranil nadbytečný (nenavázaný) immunoglobulin. Potom následuje přidání BSA (hovězí sérový albumin), aby se blokovala všechna nezreagovaná místa na desce ELISA. Rekombinantní protein se titruje v širokém rozmezí koncentrací, například od 100 gg do 1 ng na ml po lOnásobných inkrementech. Deska se promyje. Protilátka je označena konjugací na enzym, například křenovou peroxidasu, a celé se to nanese na titrované desky, inkubuje se a nadbytek protilátky se opláchne. Navázaná vnější protilátka se odkryje přidáním enzymového kosubstrátu, vyvine se a odečte se na čtečce ELISA desek.

Lineární část křivky (absorbance versus koncentrace proteinu) se použije jako standard, protože o této části bylo zjištěno, že má obvykle vhodný rozsah citlivosti. Množství navázané protilátky (jak je indikováno optickou hustotou) odpovídá známé koncentraci proteinu. Pro stanovení koncentrace proteinu v neznámém vzorku se seriálově ředěné vzorky neznámého obsahu přidávají na novou desku do bodu, ve kterém se zjistí absorbance (která spadá do rozmezí standardní křivky), a spočte se množství proteinu přítomné v původním neznámém vzorku.

Takový test lze rutinně vyvinout pro CD14 jiných druhů, pro které lze získat polyklonální protilátku.

Jestliže se o protilátce mluví jako o specifické pro polypetid, který má příslušnou aminokyselinovou sekvenci (nebo jiný antigen), znamená to, jak tomu bude rozumět zručný odborník, že protilátka a polypeptid se budou navzájem vázat vysoce selektivním způsobem a že tento polypetid se nebude vázat s mnoha dalšími protilátkami, které byly vyvolány jinými antigeny. V takovém případě lze ekvivalentně konstatovat, že polypeptid je specificky rozpoznáván protilátkou.

Jakmile se stanoví koncentrace daného CD14, za předpokla• · • · du, že neobsahuje jiné nežádoucí složky, potom se použije pro zahrnutí do léčiv, potravinových výrobků atd. v žádaných množstvích. Tak například 0,1 (5) g koncentrátu obsahujícího 100 μ9/^ CD14 by se zahrnul do potravinové tyčinky, která pak obsahuje 10 (500) μ9 CD14.

Může být požadováno převést kapalný koncentrát na pevnou formu, například tak, že se kapalina nechá odpařit, lyfolizuje se nebo se použijí jiné způsoby.

Často může být požadováno zahrnout jedno nebo více ochranných činidel, aby se udržela aktivita CD14, jestliže má být zahrnut do kapaliny, jako je například kojenecká strava.

Existují překvapivě jednoduché, ale přesto silné aspekty předloženého vynálezu. Například jedním aspektem tohoto vynálezu je způsob testování přítomnosti CD14 v prostředku, který obsahuje protein sekrece mléčné žlázy. Tento způsob, i když je přímo aplikovatelný, nebyl možný před tím, než se vědělo, že se CD14 přirozeně vyskytuje v sekrecích mléčné žlázy, zvláště v hovězím mléku. Podle tohoto způsobu se prostředek vystaví působení protilátky, která je specifická pro CD14, a stanoví se, jestli CD14 endogenní k sekreci je přítomen ve vzorku na základě toho, jestli se během stupně vystavení působení vytvořil komplex CD14-protilátka, s využitím například ELISA testu.

Tento vynález poskytuje také způsob stanovení množství endogenního CD14 obsaženého v prostředku, který obsahuje protein ze sekrece mléčné žlázy, zvláště hovězího mléka. Získá se tak složení. Vzorek se vystaví účinku protilátky, která je specifická pro CD14, a vhodným ELISA testem se může stanovit množství CD14 endogenního k sekreci přítomného ve vzorku na základě množství vytvořeného komplexu CD14-protilátka ve stupni vystavení účinku.

Podle těchto způsobů se může jako zdroj CD14 použít lidské nebo kravské kolostrum nebo mléko.

• ·

0 000 00 0000 00 ·

Podle jiného aspektu tento vynález znamená způsob stanovení vhodnosti produktu pocházejícího ze sekrece mléčné žlázy pro žádané použití, např. pro použiti při indukování nebo stimulování produkce defensinu (nebo aktivace B buněk) u savců. Tento způsob poskytuje vzorek produktu a stanovení množství CD14 přítomného ve vzorku. Jestliže je známo množství CD14 ve vzorku, může potom zručný odborník zahrnout příslušné množství produktu do prostředku pro použiti, opět podle žádané aktivity. Například použití lidského rozpustného CD14 (rekombinantního) je popsáno v USA patentu č. 5 804 189. Stanoveni množství hovězího CD14, které se získá srovnatelnými výsledky, by mělo být v rámci schopnosti zručného odborníka z oblasti techniky.

Podle některých aspektů tohoto vynálezu protein, který má CD14-podobnou aktivitu (např. aktivitu stimulujíc! B-buňky nebo aktivitu indukce defensinu), může znamenat přirozeně se vyskytující protein, jako jsou sekrece mléčné žlázy, nebo se může vyrábět podle chemických způsobů nebo rekombinantně. Rekombinantní protein nebo polypeptid je taková sloučneina, která se vyrábí použitím molekulárních genetických technik, takže se exprimuje isolovaná sekvence nukleové kyseliny, jak by mělo být pochopeno zručným odborníkem z oblasti techniky.

V tomto spisu se homologie počítá standardními způsoby, které zahrnují seřazení dvou sekvencí, které se mají srovnávat, tak, aby se při srovnávání dosáhlo maximálního množství shodných míst a vypočte se procento těchto shodných míst. V jednom výhodném aspektu tento vynález znamená způsob zmírnění příznaků sepse, vyznačující se tím, že se savci, který to potřebuje, podává efektivní množství rozpustného proteinu tak, aby byly epiteliální buňky savce přímo vystaveny působení tohoto proteinu, při čemž tento protein má takovou aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň asi z asi 63 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 5 a která má schopnost indukovat expresi defensinů v epiteliálních buňkách. Jinými slovy - homologie sekvence, o kterou se jedná, má alespoň asi 63% homologii se sekv. id. č. 5.

• · ·· ··· · · · · · · ·· ·

V podstatě ekvivalentní látky k těmto látkám zahrnují takové látky, v nichž jeden nebo více zbytků přírodní sekvence je deletováno, substituováno jinou aminokyselinou nebo aminokyselinami nebo je v nich vložena jiná aminokyselina nebo aminokyseliny.

Je možné měnit zde popsané polypeptidové sekvence, při čemž se zachovává alespoň část žádané aktivity. Mezi výhodné variace patří substituce, které jsou konzervativní, tj. takové, v nichž je zbytek nahražen jiným zbytkem stejného obecného typu. Jak je dobře známo, přirozeně se vyskytující aminokyseliny lze rozdělit na kyselé, bazické, neutrální a polární nebo neutrální a nepolární. Tomu bude ovšem třeba rozumět tak, bez omezení teorií, že je možná rozmanitost substitucí aminokyselin, při čemž se zachovává” struktura zodpovědná za stimulační efekt zde popsaných polypeptidů na kosti. Očekává se tedy, například, že by byla možná záměna mezi nepolárními alifatickými neutrálními aminokyselinami, glycinem, alaninem, prolinem, valinem a isoleucinem. Podobně by se možná mohly provést substituce mezi polárními alifatickými neutrálními aminokyselinami, serinem, threoninem, methioninem, cysteinem, asparaginem a glutaminem. Mohly by se provést substituce mezi nabitými kyselými aminokyselinami, kyselinou aspartovou a kyselinou glutamovou, stejně jako by se mohly provést substituce mezi nabitými bazickými aminokyselinami, lysinem a argininem. Pravděpodobně by byly možné také substituce mezi aromatickými aminokyselinami, mezi něž patří fenylalanin, histidin, tryptofan a tyrosin. Tyto druhy substitucí a vzájemných záměn jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky. Možné mohou být také další substituce. Tyto druhy substitucí a vzájemných záměn jsou dobře známy odborníkům z oblasti techniky, jak lze vidět na příkladech v USA patentu č. 5 487 983. Návod pro stanovení, které aminokyselinové zbytky mohou být substituovány, vloženy nebo deletovány bez odstranění biologické nebo imunologické aktivity, lze nalézt použitím počítačových programů dobře známých v oblasti techniky, například softwaru DNASTAR.

• · • · · · « ·· ···· ·« ·

Identita nebo homologie sekvence tedy označuje podobnost sekvencí mezi dvěma polypeptidovými molekulami nebo mezi molekulami dvou nukleových kyselin. Jestliže je poloha v obou těchto dvou srovnováných polypeptidových sekvencích například okupována stejnou aminokyselinou, například jestliže stejná poloha v každé z těchto dvou polypeptidových molekul znamená alaninový zbytek, potom jsou tyto molekuly homologní nebo potom jsou tyto sekvence v oné poloze identické. Procento homologie mezi dvěma molekulami nebo identita sekvence mezi dvěma sekvencemi je funkcí počtu shodných překrývajících se poloh sdílených těmito dvěma sekvencemi poděleného počtem srovnávaných poloh krát 100. Například jestliže 6 z 10 poloh ve dvou sekvencích je stejných, potom tyto dvě sekvence mají 60% hmomologii nebo mají 60% identitu sekvencí. Jako příklad lze uvést, že polypeptidové sekvence METLIA a MPTWIF mají 50% homologii nebo identitu sekvencí. Obecně se srovnávání provádí tehdy, jestliže jsou dvě sekvence uspořádány navzájem vůči sobě tak, aby poskytovaly maximální homologii.

Srovnání sekvencí a stanovení procenta homologie mezi těmito dvěma sekvencemi lze provést použitím matematického algoritmu. V tomto spisu se seřazení může provádět způsobem podle Clustala.

Clustalův algoritmus (jak je zde aplikován použitím softwaru dostupného od DNASTAR lne., 1228 South Park Street, Madison, Wi., USA, 1994) je doporučen pro seřazení sekvencí, jejichž podobnost nemusí být nutně evoluční. Algortimus je popsán Higginsem D. G. a spol.: CABIOS 1989, 5, 151. Stejný softwarový program poskytuje seřazení sekvencí podle způsobu Jotun Heina, který je doporučován pro seřazení sekvencí, které obsahují hodně skupin, které mají jasný vzájemný evoluční vztah. Tento algoritmus je popsán Heinem J.: Methods in Enzymology 1990, 183, 626. Používají se standardní parametry nastavení programu (programme default settings). V případě hodnocení aminokyselinových zbytků na základě evoluční substituční sestavy, náboje a strukturní a chemické podobnosti se zvolí procento • · • · · · přijatelné mutace (PAM settings) nastavením na 250. Pro seřazení proteinů se používají parametry párového seřazení K-tuple = 1, Gap penalty = 3, Window = 5 a Diagonals Saved = 5.

V jednom výhodném aspektu předložený vynález znamená způsob zmírnění příznaků sepse, vyznačující se tím, že se savci, který to potřebuje, podává efektivní množství rozpustného proteinu tak, aby epiteliální buňky savce byly přímo vystaveny působení proteinu, při čemž tento protein má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z asi 63 % zachována vzhledem k aminokyselinové sekvenci identifikované jako sekv. id. č. 5 a která má schopnost indukovat expresi defensinů v epiteliálních buňkách. Jinými slovy - homologie sekvence, o kterou se jedná, je alespoň asi 63 % vzhledem k sekv. id. č. 5.

Předložený vynález tedy také poskytuje prostředky, které obsahují efektivní množství sloučenin podle předloženého vynálezu, mezi něž patří netoxické adiční soli, jejich amidy a estery, které mohou samotné sloužit pro získání shora popsaných příznivých léčivých účinků. Tyto prostředky se mohou připravovat také společně s fysiologicky tolerovatelnou kapalinou, gelem nebo pevnými ředidly, pomocnými činidly a vehikuly.

V situacích, které obsahují CD14 proteiny, bylo savcům podáno například asi 250 až 300 μg polypeptidu na kg tělesné hmotnosti savce za den vztaženo na průměrnou denní spotřebu mezi 18 a 36 ml kapaliny za den. Je třeba si uvědomit, že spotřeba velmi mladých savců se časem zvyšuje. Dávka, která se podává, je vztažena na změřenou sCD14 koncentraci v dospělém prsním mléku 10 až 20 pg na ml, při čemž se bere v úvahu, že se u kojenců zvyšuje příjem mléka od asi 0,1 do asi 1 litru za den během prvních šesti měsíců po porodu a předpokládá se, že poměr hmotnosti mezi člověkem a krysou je asi 28. V praxi, zvláště v případě lidských subjektů, může být denní dávka od asi 250 gg do asi 2500 μg nebo více na kg tělesné hmotnosti za den. Výhodněji bude denní dávka blízko od asi 300 μg do asi 1 mg na kg tělesné hmotnosti za den. Může dojít k tomu, že výhodná

frekvence podávání by byla větší nebo menší než jednou denně, což závisí na cestě podávání, na vhodnosti a na proměnných účinnostech léčení s frekvencí a množstvím používaným při podávání. Podávaná dávka závisí také na subjektu a na tom, jaký účinek má takové podávání poskytnout. Dávkování jakékoliv jedné nebo více sloučenin bude záviset na mnoha faktorech včetně specifické sloučeniny nebo kombinace sloučenin, která se používá, na způsobu podávání a na savci, který je léčen. Dávkování příslušné sloučeniny nebo kombinace sloučenin lze stanovit použitím konvenčních úvah: například obvyklým srovnáním různých aktivit předmětných sloučenin a známého činidla, to znamená pomocí příslušného farmakologického protokolu.

Mezi farmaceutické přípravky patří jakékoliv sloučeniny připravené jako injektovatelný roztok, včetně injektovatelného roztoku připravovaného těsně před použitím. Injektovatelný může být buď kapalný roztok nebo suspenze. Mohou se vyrábět také pevné formy vhodné pro rozpuštění nebo pro suspendování v kapalině před podáváním injekce. Přípravek může být také emulgován. Účinný protein se často smíchá s ředidly nebo vehikuly, která jsou fysiologicky tolerovatelná a slučitelná s polypeptidem. Vhodnými ředidly a vehikuly jsou například voda, solný roztok, dextrosa, gycerol nebo podobné a jejich kombinace. Navíc, jestliže je to žádoucí, prostředky mohou obsahovat menší množství pomocných látek, jako jsou smáčecí nebo emulgační činidla, stabilizační činidla nebo činidla pufrující pH a podobně .

Mezi farmaceutické přípravky patří použití sloučenin ve směsi s konvenčními vehikuly, to znamená látky farmaceuticky přijatelného organického nebo anorganického nosiče, které nereagují škodlivě se sloučeninami a které možná zvyšují stabilitu sloučenin při skladování a při zacházení s nimi. Mezi preparativní postup může patřit sterilizace farmaceutických přípravků. Sloučeniny se mohou smíchat s pomocnými činidly, jako jsou mazadla, ochranná činidla, stabilizační činidla, soli pro ovlivnění osmotického tlaku atd., která nereagují škodlivým způsobem a λ • · se sloučeninami.

Prostředky se konvenčně podávají parenterálně, injekcí, například buď subkutánně nebo intravenózně. Mezi další přípravky, které jsou vhodné pro jiné způsoby podávání, patří čípky, intranazální aerosoly a v některých případech orální prostředky. U čípků mezi tradiční pojivá a vehikula mohou patřit například polyalkylenglykoly nebo triglyceridy, takové čípky se mohou vyrábět ze směsi obsahujících účinnou složku v rozmezí od 0,5 % do 10 %, s výhodou 1 % až 2 %. Orální prostředky obsahují taková normálně používaná vehikula, jako jsou například činidla s čistotou pro farmaceutické použití, jako je mannitol, laktosa, škrob, stearát hořečnatý, sodná sůl sacharinu, celulosa, uhličitan hořečnatý a podobná. Tyto prostředky existují ve formě roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, tobolek, přípravků s trvalým uvolňováním nebo prášků a obsahují 10 % až 95 % účinné složky, s výhodou 25 % až 75 % účinné složky. Mezi orální přípravky mohou patřit přípravky, které jsou určeny pro ochranu proteinu do té doby, než dosáhne místa zamýšleného působení, podle vhodnosti.

Proteinové sloučeniny se mohou zahrnovat do prostředků jako neutrální formy nebo ve formě solí. Mezi farmaceuticky přijatelné netoxické soli patří adiční soli s kyselinami (vyrobené s volnými aminovými skupinami) a ty, které se vyrábějí s anorganickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková nebo kyselina fosforečná, nebo organickými kyselinami, jako je kyselina šťavelová, kyselina vinná, kyselina mandlová a podobně. Soli, které jsou tvořeny s volnými karboxylovými skupinami, mohou být odvozeny od anorganických bází, jako je například hydroxid sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý, a takových organických bází, jako je isopropylamin, trimethylamin, 2-ethylaminoethanol, histidin, prokain a podobné.

Sloučeniny podle vynálezu mohou být samy mezi sebou homopolymerovány. Tyto sloučeniny mohou být také konjugovány s bio• · • · · · · ·· · · · · ·· · logicky slučitelnými polymerními sloučeninami, jako je BIOPOL™ (WR Grace & Co., Konn.).

Způsoby, které jsou známy z oblasti techniky výroby přípravků, lze nalézt například v Remington's Pharmaceutical Sciences .

V případě režimu podporujícího celkové zdraví by výhodnou cestou podávání měla být orální cesta. CD14 je přítomen v kapalině tak, aby se gastrointestinální trakt vystavil po polknutí kapaliny působení CD14. Může být obsažen dokonce ve žvýkací látce nebo ohebné látce, která chrání CD14 před degradací, ale která snadno uvolňuje CD14 po žvýkání pro její následné působení na grastrointestinální trakt.

Prostředky podle předloženého vynálezu mohou být místně podávány na místo poranění v jakémkoliv vhodném farmaceuticky přijatelném vehikulu, například v kapalném nosiči, jako je propylenglykol-ethanol, propylenglykol-ethanol-chloroform a podobně. Možná koncentrace účinné sloučeniny v těchto prostředcích je alespoň 0,01 % hmotnostních, pravděpodobněji asi 0,1 % až asi 0,5 % hmotnostních a ještě pravděpodobněji od asi 0,05 % hmotnostních do asi 0,2 % hmotnostních, ale lze použít jakoukoliv terapeuticky efektivní koncentraci.

Prostředky podle předloženého vynálezu se mohou sestavovat jakýmkoliv počtem jiných způsobů podle toho, jestli je požadován vodný roztok, krém nebo mast a podle toho, jestli by se používal/a jeho místa použití, které může být na povrchu kůže nebo v oku.

Prostředky sestavované jako krém mohou obsahovat stabilizátor krému, jako je xantenová guma, emulgační činidlo, s výhodou neiontové emulgační činidlo, alespoň jeden kapalný a jeden pevný hydrofobní materiál vybraný z kapalných a pevných mastných kyselin, mastných alkoholů, esterů mastných kyselin, vosků farmaceutické čistoty a uhlovodíků, poslední z uvedených • · • · v rozmezí od kapalin přes polokapalné látky, jako je vazelína, až k pevným látkám a podobně, ochranné činidlo, antioxidační činidlo a vodu.

Způsoby podporování hojení ran snížením infekce pokožky zahrnuje aplikování nebo uvedení prostředků podle předloženého vynálezu, které podporují produkci defensinu v epiteliálních buňkách, přímo do kontaktu s poraněním. Prostředku se umožní, aby zůstal v kontaktu s poraněním po takovou dobu, která je postačující pro to, aby se například napomohlo snížení infekce. Mezi tyto způsoby patří zahrnutí prostředků podle předloženého vynálezu do krémových přípravků nebo nasáknutí obvazové vaty roztokem prostředku a potom aplikací krému nebo nasáknuté gázy na místo poranění, jako je popálenina, místo poranění dárce, vřed nebo jakýkoliv typ kožního poranění. Dále pak mohou být švy nebo sponky potaženy nebo nasáknuty prostředkem podle vynálezu a použity pro uzavření otevřeného poranění.

Mezi typy poranění, které mohou být léčeny použitím prostředku podle předloženého vynálezu, patří ty typy, které pocházejí z jakéhokoliv lékařského nebo náhodného poranění, které způsobuje epiteliální poškození, jako jsou asoftalmová poranění, jako jsou ty, které pocházejí od korneálních vředů, kožní poranění, jako jsou poranění popálením, místo poranění dárce při transplantacích kůže a vředy. Dále se pak mohou prostředky podle předloženého vynálezu léčit dermatologické stavy, při nichž je poškozena pokožka. Také vředy nohy a chodidla se mohou léčit prostředky podle předloženého vynálezu.

Podávání prostředků podle předloženého vynálezu využitím aerosolu by bylo zvláště vhodné pro vystavení trachey a dokonce plic účinku CD14.

Při jakékoliv události bude obecně pochopena výhoda vystavení bakterií (nebo virů, hub atd.) působení jednoho nebo více defensinů během polykání nebo inhalování atd. To bude zvláště pravdivé v případě subjektů, které nejsou nutně schopny vyvolat plnou nebo normální imunitní odpověď. V případě gramnegativních bakterií, ze kterých lze generovat LPS, přítomnost jednoho nebo více defensinů v gastrointestinálním traktu nebo trachee může být zvláště výhodná pro ty, u nichž se předpokládá vysoké riziko septického šoku.

V jiném aspektu předložený vynález zahrnuje transgenního savce, který byl geneticky změněn tak, aby v jeho mléku docházelo ke zvýšené produkci CD14. I když technologie získání transgenních myší je používána již dvě desetiletí, snadnost zavedení cizích genů do genomu dobytka, mezi který patři kozy, ovce, krávy a prasata, byla demonstrována teprve nedávno. I když je technicky obtížnější, zavedení klonovaných genů kódujících farmaceuticky důležité molekuly do domácích zvířat poskytuje výhodu možnosti významně rozšířit produkci rekombinantních proteinů. To pak dále dramaticky snižuje ceny výroby. Tímto způsobem lze transgenní domácí zvířata považovat za biologický reaktor, který produkuje farmaceuticky užitečné proteiny v mléku, krvi nebo moči.

Během posledních několika let exprese proteinů v krvi a tkáních významně rozšířila potenciální aplikaci transgenních živočichů v lékařství. Například nedávno bylo mnoho pozornosti věnováno vytvoření tajných živočišných orgánů pro použití při transplantaci u lidí. Důležité je to, že bylo dosaženo významného pokroku ve schopnosti exprimovat transgenní proteiny v mléku. Dosud provedené studie se soustředily na směrování exprese proteinů do mléčné žlázy a na zlepšení hladiny jejich produkce.

Technika produkce transgenních zvířat se provádí podle dobře daných základů (Marki U. a Hari A.: Int. J. Exp. Path.

1996, 77, 247.). Gen, o který se jedná, se zkombinuje s promotorovou sekvenci, která směruje a reguluje expresi genu tkáňově/buňkově specifickým způsobem v transgenním živočichovi. Expresní konstrukt (DNA) se injekčně vnese do pronuclea oplodněných vajíček a injektovaná vajíčka se implantují do hormonálně ·· ···· ·« · · «· ··· ···· ··· synchronizovaných pěstounských matek. Živočichové, kteří pocházejí z tohoto umělého oplodnění, se zkontrolují na integraci injektovaného DNA konstruktu. Potomci základních živočichů se testují na expresi genu a jeho produktu a dědičnost sestavy genu se zajistí transmisí zárodečné linie, to znamená že transgen se inkorporuje do zárodečné linie tohoto živočicha.

Ve výhodném aspektu tento vynález znamená transgenního hovězího savce, v němž CD14 (nebo jeho analog, který přímo aktivuje B buňky nebo přímo indukuje produkci defensinu v epiteliálních buňkách) je zaveden technologií rekombinace DNA do savce tak, aby byl pod kontrolou endogenního CD14 promotoru.

V jiném výhodném aspektu transgenní savec znamená hovězí dobytek, který má gen, který je zaveden do dalších kopií genomové sekvence (exon a intron, tj. sekv. id. č. 8), od níž je odvozena mRNA kódující endogenní hovězí CD14.

Rozpustný CD14 je přírodní složkou kolostra a mléka u tří dosud testovaných druhů: člověka, krávy a myši. I když molekulárnímu základu řešícímu objevení se rozpustného CD14 v těchto sekrecích není dobře porozuměno, role endogenního CD14 promotoru hraje v tomto směru pravděpodobně důležitou roli. Proto je použití endogenní CD14 promotorové sekvence používáno pro řízení exprese transgenního CD14 stejně jako tkáňově specifického promotoru, který bude selektivně aktivovat expresi transgenního CD14 v tkáni mléčné žlázy.

Bylo ukázáno, že použití genomových spíše než cDNA sekvencí při přípravě transgenních živočichů vede k účinnější expresi transgenu (Janne J. a spol.: Int. J. Biochem. 1994, 26, 859.). Hovězí a/nebo lidská genomová DNA kódující CD14 může být tedy klonována v kombinaci s hovězími CD14 endogenními promotorovými sekvencemi. Alternativně ovčí ó-laktoglobulinový promotor (Wright G. a spol.: Biotechnology 1991, 9, 830.) řídí a reguluje genovou expresi převážně do mléčné žlázy. Vektor nesoucí genový konstrukt může být přidán s účinným terminátorem trans59 « · · · · ·· » · · · ·· · kripce stejně jako s oblastmi připojenými na matrici a specializovanými chromatinovými sekvencemi, které slouží pro zvýšení exprese transgenu a pro jeho isolování od zeslabujícího účinku chromatinového prostředí. Tento konstrukt se injekčně vnese do pronuklea vajíčka žádaného druhu a implantuje se do hormonálně synchronizovaného příjemce tohoto druhu.

úKaždá z citací, na kterou je odkazováno v této přihlášce, je zde celá zahrnuta jako odkaz. Jako odkaz jsou zde zahrnuty také úplné spisy a nároky USA provisorní patentové přihlášky č. 60/086 884, podané 27. května 1999, z níž tato přihláška nárokuje prioritu, a doprovázející (jako datum podání této přihlášky) USA patentové přihlášky č. 08/746 883, podané 18. listopadu 1996.

Polypeptidové a proteinové sekvence, které jsou zde diskutovány, jsou identifikovány následujícím způsobem:

Sekv. id. CD14.	č.	1:	kódující	sekvence	nukleové	kyseliny	pro	hovězí
Sekv. id. CD14.	č.	2:	kódující	sekvence	nukleové	kyseliny	pro	lidský
Sekv. id.	č.	3:	kódující	sekvence	nukleové	kyseliny	pro	myší

CD14.

Sekv. id. č. 4: aminokyselinová sekvence pro hovězí CD14.

Sekv. id. č. 5: aminokyselinová sekvence pro lidský CD14.

Sekv. id. č. 6: aminokyselinová sekvence pro myší CD14.

Sekv. id. č. 7: aminokyselinová sekvence pro králičí CD14.

Sekv. id. č. 8: genomová sekvence nukleové kyseliny pro hovězí CD14.

V sekv. id. č. 8 nukleotidy 1 až 83 znamenají 5'-nepřekládanou oblast, 84 až 86 znamenají ATG start kodon, 87 až 163 znamenají intron, nukleotidy 164 až 1282 znamenají kódující sekvenci a nukleotidy 1283 až 1405 znamenají 3'-nepřekládanou oblast.

Aminokyselinová sekvence pro králičí D14 byla již dříve • · ·♦·· ·« ·· ·« ····· · · · ·· · ♦ · ··· ·· ···· «· ··· známa (Ikeda A. a spol.: J. Vet. Med. Sci. 1997, 59, 715.).

Bylo zjištěno, že homologie mezi lidským a hovězím je 70,8 %, mezi lidským a myším 63,4 %, mezi lidským a králičím 71,8 % a mezi hovězím a myším 58,7 %.

• ·

- él ~~ • · · · · · · ··· ····· ·* · ·· • · · · · · ···· ·· · · · · · · ·· · · · ·· ···· ·· · pl/ /ft/7 íj.

1/9

SEZNAM SEKVENCÍ <11O Gemma Biotechnology Ltd.; Julius Michael H., Filipp D.

<120> Indukce antibiotických proteinů a peptidů LAIT/sCD14-proteinem <130 47841710048 <130 PCT/CA9900482 <141 > 27.061998 <150 USA pat. pnhl.60086884 <151 > 27.06.1996 <160 8 <170 Wordperfect 6.1 <210 1 <211> 1122 <212> DNA <213> hovězí <400> 1

atgqtgtgcg tgccctacct	gctgctgctg	ctgctgccgt	cactgctgcg	tgtgtctgcq	60
gacacaacag aaccctgcga	gctggacgac	gacgatttcc	gttgtgtctg	caacttcacg	120
qatccqaagc ctgactggtc	tagcgccgtt	cagtgtatgg	ttgccgtcga	ggtggagatc	180
agtgccggcg gccqcagcct	ggaacagttt	ctcaagggag	ccgacaccaa	cccgaagcag	240
tatgctgaca caatcaaggc	tctgcgcgtt	cggcgactca	agctgggcgc	tgcacaggtt	300
cctgctcagc ttctggtcgc	cgttctgcgc	gcgctcgggt	actctcgtct	caaggaactg	360
acgcttgagg acctggaggt	aaccggccca	acgcccccga	cgcctctgga	agccgctggg	420
cctqcgctca ccaccctcag	tctgcgtaac	gtatcgtgga	caacaggagg	tgcctggctc	480
ggcgaactcc agcagtggct	caagcctggg	ctcagggtgc	tgaacattgc	ccaagcacac	540
tcgcttgcct ttccgtgcgc	agggctctcc	accttcgagg	cgctcaccac	cctagacctc	600
tctgacaatc ccagtctcgg	cgacacgggg	ctgatggcag	ctctctgtcc	gaacaagttc	660
ccggccctcc aatatctagc	gctacgcaac	gcggggatgg	agacgccgag	cggcgtgtgc	720
gcggcgctgg cggcagcgag	ggtgcagccc	caaagcctgg	acctcagcca	caactcgcta	780
cgcgtcaccg ccccgggtgc	tacccgatgt	gtctggccca	gtgcactaag	gtctctcaat	840
ttgtcgttcg ctgggctgga	gcaagtgcct	aagggactgc	cccctaagct	cagcgtgctt	900
gatctcagct gcaacaagct	aagcagggag	ccgcggcgag	acgagctgcc	cgaggtaaat	960
gacctgactc tggacggaaa	tccctttctg	gaccctggag	ccctccagca	ccaaaatgac	1020
ccgatgatct ccggcgtggt	cccagcctgt	gcgcgttctg	cctLgaccat	gggggtgtca	1080
ggagccctgg cgctgcttca	aggagcccga	ggcttcgcgt	aa		1122

• · ·

2/9

<210> <211> <212> <213> <400> atggagcgcg	2 1128 DMA lidská 2 cgtcctgctt	gttgctgctg	ctgctgccgc	tggtgcacgt	ctctgcgacc	60
acgccčaaac	cttgtgagct	ggacgatgaa	gatttccgct	gcgtctgcaa	cttctccgaa	120
cctcagcccg	actggtccga	agccttccag	tgtgtgtctg	cagtagaggt	ggagatccat	180
gccggcggtc	tcaacccaga	gccgtttcta	aagcgcgtcg	atgcggacgc	cgacccgcgg	240
caqtatgctg	acacggtcaa	ggctctccgc	gtgcggcggc	tcacagtggg	agccgcacag	300
gttcctgctc	agctactggt	aggcgccctg	cgtgtgctag	cgtactcccg	cctcaaggaa	360
ctgacactcg	aggacctaaa	gataaccggc	accatgcctc	cgctgcctct	ggaagccaca	420
gqactcccac	tttccaactt	gcgcctacgc	aacgtgtcgt	gggcgacagg	gcgttcttgg	480
ctcgccgagc	tgcagcagtg	gctcaagcca	ggcctcaagg	tactgagcat	tgcccaagca	540
cactcqcctg	ccttttcctg	cgaacaggtt	cgcgccttcc	cggcccttac	cagcctagac	600
ctqtctgaca	atcctggact	gggcgaacgc	ggactgatgg	cggctctctg	tccccacaag	660
ttcccggcca	tccagaatct	agcgctgcgc	aacacaggaa	tggagacgcc	cacaggcgtg	720
tgcgccgcac	tggcggcggc	aggtgtgcag	ccccacagcc	tagacctcag	ccacaactcg	780
ctgcgcgcca	ccgtaaaccc	tagcgctccg	agatgcatgt	ggtccagcgc	cctgaactcc	840
ctcaatctgt	cgttcgctgg	gctggaacag	gtgcctaaag	gactgccagc	caagctcaga	900
gtgctcaatc	Lcagctgcaa	cagactgaac	agggcgccgc	agcctgacga	gctgcccgag	960
gtggacaacc	tgacactgga	cgggaatccc	ttcctggtcc	ctggaactgc	cctcccccac	1020
gaggcctcaa	tgaactccgg	cgtggtccca	gcctgtgcac	gttcgaccct	gtcggtgggg	1O8C
gtgtcgqgaa	ccctggtgct	gctccaaggg	gcccggggct	ttgcctaa		1128
<210:· <211> <212> <213> <400> ATGGAGCGTG	3 1101 DNA myší 3 TGCTTGGCTT	GTTGCTGTTG	CTTCTGGTGC	ACGCCTCTCC	CGCCCCACCA	60
GAGCCCTGCG	AGCTAGACGA	GGAAAGTTGT	TCCTGCAACT	TCTCAGATCC	GAAGCCAGAT	120
TGGTCCAGCG	CTTTCAATTG	TTTGGGGGCG	GCAGATGTGG	AATTGTACGG	CGGCGGCCGC	180
AGCCTGGAAT	ACCTTCTAAA	GCGTGTGGAC	ACGGAAGCAG	ATCTGGGGCA	GTTCACTGAT	240
ATTATCAAGT	CTCTGTCCTT	AAAGCGGCTT	ACGGTGCGGG	CCGCGCGGAT	TCCTAGTCGG	300
ATTCTATTCG	GAGCCCTGCG	TGTGCTCGGG	ATTTCCGGCC	TCCAGGAACT	GACTCTTGAA	360

• ·

3/9

AATCTCGAGG	TAACCGGCAC	CGCGCCGCCA	CCGCTTCTGG	AAGCCACCGG	ACCCGATCTC	420
AACATCTTGA	ACCTCCGCAA	CGTGTCGTGG	GCAACAAGGG	ATGCCTGGCT	CGCAGAACTG	480
CAGCAGTGGC	TAAAGCCTGG	ACTCAAGGTA	CTGAGTATTG	CCCAAGCACA	CTCACTCAAC	540
TTTTCCTGCG	AACAGGTCCG	CGTCTTCCCT	GCCCTCTCCA	CCTTAGACCT	GTCTGACAAT	600
CCTGAATTGG	GCGAGAGAGG	ACTGATCTCA	GCCCTCTGTC	CCCTCAAGTT	CCCGACCCTC	660
CAAGTTTTAG	CGC.TGCGTAA	CGCGGGGATG	GAGACGCCCA	GCGGCGTGTG	CTCTGCGCTG	720
GCCGCAGCAA	GGGTACAGCT	GCAAGGACTA	GACCTTAGTC	ACAATTCACT	GCGGGATGCT	780
GCAGGCGCTC	CGAGTTGTGA	CTGGCCCAGT	CAGCTAAACT	CGCTCAATCT	GTCTTTCACT	840
GGGCTGAAGC	AGGTACCTAA	AGGGCTGCCA	GCCAAGCTCA	GCGTGCTGGA	TCTCAGTTAC	900
AACAGGCTGG	ATAGGAACCC	TAGCCCAGAT	GAGCTGCCCC	AAGTGGGGAA	CCTGTCACTT	960
AAAGGAAATC	CCTTTTTGGA	CTCTGAATCC	CACTCGGAGA	AGTTTAACTC	TGGCGTAGTC	1020
ACCGCCGGAG	CTCCATCATC	CCAAGCAGTG	GCCTTGTCAG	GAACTCTGGC	TTTGCTCCTA	1080
GGAGATCGCC	TCTTTGTTTA	A				1101

<210>

4

<211>

3738

<212>

PRT

<213>

hovězí

<40C

4

Met

Val Cys

Val

Pro

Tyr

Leu

Pro

Ser

Leu

1

5

10

15

Arg

Val Ser

Ala

Asp

Thr

Glu

Pro

Cys

Glu

Leu

Asp

20

25

30

Phe

Arg Cys

Val

Cys

Asn

Phe

Thr

Asp

Pro

Lys

Pro

Asp

Trp

Ser

35

40

45

Ala

Val Gin

Cys

Met

Val

Ala

Val

Glu

Val

Glu

Ile

Ser

Ala

Gly

50

55

60

Arg

Ser Leu

Glu

Gin

Phe

Leu

Lys

Gly

Ala

Asp

Thr

Asn

Pro

Lys

Gin

65

70

75

80

Tyr

Ala Asp

Thr

Ile

Lys

Ala

Leu

Arg

Val

Arg

Leu

Lys

Leu

Gly

85

90

95

Ala

Ala Gin

Val

Pro

Ala

Gin

Leu

Val

Ala

Val

Leu

Arg

Ala

Leu

100

105

110

Gly

Tyr Ser

Arg

Leu

Lys

Glu

Leu

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Glu

Val

Thr

115

120

125

Gly

Pro Thr

Pro

Thr

Pro

Leu

Glu

Ala

Gly

Pro

Ala

Leu

Thr

130

135

140

Thr

Leu Ser

Leu

Arg

Asn

Val

Ser

Trp

Thr

Gly

Ala

Trp

Leu

145

150

155

160

···· · » ·· ·· • · · · · · « · • · · ·· · ·· • · · · · ·· · • · · · · · • · · ·· · · · · ·· · <5/9

Gly Glu

Leu

Gin Gin

Trp

Leu

Lys

Pro

Gly

Leu

Arg Val

Leu

Asn

Ile

165

170

175

Ala Gin

Ala

His Ser

Leu

Ala

Phe

Pro

Cys

Ala

Gly Leu

Ser

Thr

Phe

180

185

190

Glu Ala

Leu

Thr Thr

Leu

Asp

Leu

Ser

Asp

Asn

Pro Ser

Leu

Gly

Asp

195

200

205

Thr Gly

Leu

Met Ala

Ala

Leu

Cys

Pro

Asn

Lys

Phe Pro

Ala

Leu

Gin

210

215

220

Tyr Leu

Ala

Leu Arg

Asn

Ala

Gly

Met

Glu

Thr

Pro Ser

Gly

Val

Cys

225

230

235

240

Ala Ala

Leu

Ala Ala

Ala

Arg

Val

Gin

Pro

Gin

Ser Leu

Asp

Leu

Ser

245

250

255

: a

His Asn

Ser

Leu Arg

Val

Thr

Ala

Pro

Gly

Ala

Thr Arg

Cys

Val

Trp

260

265

270

Pro Se:

Ala

Leu Arg

Ser

Leu

Asn

Leu

Ser

Phe

Ala Gly

Leu

Glu

Gin

275

280

285

Val Pro

Lys

Gly Leu

Pro

Lys

Leu

Ser

Val

Leu Asp

Leu

Ser

Cys

290

295

300

i

Asn Lys

Leu

Ser Arg

Glu

Pro

Arg

Asp

Glu

Leu Pro

Glu

Val

Asn

305

310

315

320

Asp Leu

Thr

Leu Asp

Gly

Asn

Pro

Phe

Leu

Asp

Pro Gly

Ala

Leu

Gin

325

330

335

His Gin

Asn

Asp Pro

Met

Ile

Ser

Gly

Val

Pro Ala

Cys

Ala

Arg

340

345

350

Ser Ala

Leu

Thr Met

Gly

Val

Ser

Gly

Ala

Leu

Ala Leu

Leu

Gin

Gly

355

360

365

fc

Ala Are

Gly

Phe Ala

37Č

-

<210>

5

<211>

375

<212>

PRT

<213>

lidská

¹

<400>

5

Met Glu

Arg

Ala Ser

Cys

Leu

Leu Pro

Leu

Val

His

Γ

1

5

10

15

Val Ser

AI a

Thr Thr

Pro

Glu

Pro

Cys

Glu

Leu

Asp Asp

Glu

Asp

Phe

•

20

25

30

Arg Cys

Val

Cys Asn

Phe

Ser

Glu

Prc

Glr

Prc

Asp Trp

Ser

Glu

Ala

35

40

45

Phe Gli

Cys

Val Ser

Ala

Va J

Glu

Val

Glu Ile

His Ala

Gly Gly

Leu

50

55

60

Asn Leu Glu Pro Phe Leu Lys Arg Val Asp Ala Asp Ala Asp Pro Arg 65 70 75 80

5/9

Gin

Tyr Ala

Asp

Thr 85

Val

Lys

Ala

Leu

Arg Val 90

Arg

Leu

Thr 95

Val

Gly

Ala Ala

Gin

Val

Pro

Ala

Gin

Leu

Val

Gly

Ala

Leu

Arg

Val

100

105

110

Leu

Ala Tyr

Ser

Arg

Leu

Lys

Glu

Leu

Thr

Leu

Glu

Asp

Leu

Lys

lle

115

120

125

Thr

Gly Thr

Met

Pro

Leu

Pro

Leu

Glu

Ala

Thr

Gly

Leu

Ala

Leu

V Ses >*-

130

135

140

i'.)''

Ser

Ser Leu

Arg

Leu

Arg

Asn

Val

Ser

Trp

Ala

Thr

Gly

Arg

Ser

Trp

145

150

155

160

*5

Leu

Ala Glu

Leu

Gin

Trp

Leu

Lys

Pro

Gly

Leu

Lys

Val

Leu

Ser

165

170

175

«

lle

Ala Gin

Ala

His

Ser

Pro

Ala

Phe

Ser

Tyr

Glu

Gin

Val

Arg

Ala

i

180

185

190

Ptie

Pro Ala

Leu

Thr

Ser

Leu

Asp

Leu

Ser

Asp

Asn

Pro

Gly

Lau

Gly

195

200

205

Glu

Arg Gly

Leu

Met

Ala

Leu

Cys

Pro

His

Lys

Phe

Pro

Ala

lle

210

215

220

Gin

Asn Leu

Ala

Leu

Arg

Asn

Thr

Gly

Met

Glu

Thr

Pro

Thr

Gly

Val

•

225

230

235

240

Cys

Ala Ala

Leu

Ala

Gly

Val

Gin

Pro

His

Ser

Leu

Asp

Leu

245

250

255

t

Ser

His Asn

Ser

Leu

Arg

Ala

Thr

Val

Asn

Pro

Ser

Ala

Pro

Arg

Cys

260

265

270

Met

Trp Ser

Ser

Ala

Leu

Asn

Ser

Leu

Asn

Leu

Ser

Phe

Ala

Gly

Leu

275

280

285

-

Glu

Gin Val

Pro

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Lys

Leu

Arg

Val

Leu

Asp

Leu

290

295

300

6/9

Ser Cys Asn Arg Leu Asn Arg Ala	Pro Gin	Pro Asp 315	Glu	Leu	Pro	Glu 320
305	310
Val Asp Asn	Leu Thr Leu Asp Gly .	Asn Pro	Phe Leu	Val	Pro	Gly	Thr
	325	330				335
Ala Leu Pro	His Glu Gly Ser Met	Asn Ser	Gly Val	Val	Pro	Ala	Cys
	340	345			350
Ala Arg Ser	Thr Leu Ser Val Gly	Val Ser	Gly Thr	Leu	Val	Leu	Leu
355	360			365
Gin Gly Ala	Arg Gly Phe Ala
37 0	375
< 2 10 >	6
<2 li>	366
<212>	PRT
<213>	myší
<400>	6
Met. Glu Arg	Val Leu Gly Leu Leu	Leu Leu	Leu Leu	Val	His	Ala	Ser
1	5	10				15
Pro Ala Pro	Pro Glu Pro Cys Glu	Leu Asp	Glu Glu	Ser	Cys	Ser	Cys
	20	25			30
Asn Phe Ser	Asp Pro Lys Pro Asp	Trp Ser	Ser Ala	Phe	Asn	Cys	Leu
35	40			45
Gly Ala Ala	Asp Val Glu Leu Tyr	Gly Gly	Gly Arg	Ser	Leu	Glu	Tyr
50	55		60
Leu Leu Lys	Arg Val Asp Thr Glu	Ala Asp	Leu Gly	Gin	Phe	Thr	Asp
65	70		75				80
Ile Ile Lys	Ser Leu Ser Leu Lys	Arg Leu	Thr Val	Arg	Ala	Ala	Arg
	85	90				95
Ile Pro Ser	Arg Ile Leu Phe Gly	Ala Leu	Arg Val	Leu	Gly	Ile	Ser
	100	105			110
Gly Leu Gin	Glu Leu Thr Leu Glu	Asn Leu	Glu Val	Thr	Gly	Thr	Ala
115	120			125
Pro Pro Pro	Leu.Leu Glu Ala Thr	Gly Pro	Asp Leu	Asn	Ile	Leu	Asn
130	135		140
Leu Arg Asn	Val Ser Trp Ala Thr	Arg Asp	Ala Trp	Leu	Ala	Glu	Leu
145	150		155				160
Gin Gin Trp	Leu Lys Pro Gly Leu	Lys Val	Leu Ser	Ile	Ala	Gin	Ala
	165	170				175
His Ser Leu	: Asn Phe Ser Cys Glu	Gin Val	Arg Val	Phe	Pro	, Ala	Leu

180 185 190 ί

- 1} • · · · · · · · ·· ·· • · * · · « · ··· ·«··· · · · ·· • · ···· ····

7/9

Ser Thr

Leu 195

Asp

Leu

Ser

Asp

Asn 200

Pro

Glu

Leu

Gly

Glu 205

Arg

Gly

Leu

lle Ser

AI a

Leu

Cys

Pro

Leu

Lys

Phe

Pro

Thr

Leu

Gin

Val

Leu

Ala

210

215

220

Leu Arg

Asn

Ala

Gly

Met

Glu

Thr

Pro

Ser

Gly

Val

Cys

Ser

Ala

Leu

225

230

235

240

Ala Ala

Ala

Arg

Val

Gin

Leu

Gin

Gly

Leu

Asp

Leu

Ser

His

Asn

Ser

245

250

255

Leu Arg

Asp

Ala

AI a

Gly

Ala

Pro

Ser

Cys

Asp

Trp

Pro

Ser

Gin

Leu

260

265

270

Asn Ser

Leu

Asn

Leu

Ser

Phe

Thr

Gly

Leu

Lys

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

275

280

285

Leu Pro

Ala

Lys

Leu

Ser

Val

Leu

Asp

Leu

Ser

Tyr

Asn

Arg

Leu

Asp

290

295

300

Arg Asr.

Pro

Ser

Pro

Asp

Glu

Leu

Pro

Gin

Val

Gly

Asn

Leu

Ser

Leu

305

310

315

320

Lys Gly

Asn

Pro

Phe

Leu

Asp

Ser

Glu

Ser

His

Ser

Glu

Lys

Phe

Asn

325

330

335

Ser Gly

Val

Thr

Ala

Gly

Ala

Pro

Ser

Gin

Ala

Val

Ala

Leu

340

345

350

Ser Gly

Thr

Leu

Ala

Leu

Gly

Asp

Arg

Leu

Phe

Val

355

360

365

<210>

7

<211>

377

<212>

PRT

<213>

králičí

< 4 0 0 >

7

Met Glu

Pro

Val

Pro

Cys

Leu

Pro

Xaa

Leu

1

5

10

15

Arg Ala

Ser

Thr

Asp

Thr

Pro

Glu

Pro

Cys

Glu

Leu

Asp

20

25

30

lle Arg

Cys

Val·

Cys

Asn

Phe

Ser

Asp

Pro

Gin

Pro

'Asp

Trp

Ser

35

40

45

Ala Leu

Gin

Cys

Met

Pro

Ala

Val

Gin

Val

Glu

Met

Trp

Gly

50

55

60

Ilxs Ser

Leu

Glu

Gin

Phe

Leu

Arg

Gin

Ala

Asp

Leu

Tyr

Thr

Asp

Gin

65

70

75

80

Arg Arg Tyr Ala Asp Val Val Lys Ala Leu Arg Val Arg Arg Leu Thr 85 90 95 • « v «

8/9 • » » » • · · * · · · ♦ · « · · * • « · · t • ♦ · · · · ·

Val Gly Ala Val Gin Val Pro Ala 100

Val Leu Gly Tyr Ser Arg Leu Lys 115 120

Pro

105

Glu

Leu Leu

Leu Ala

Leu	Gly	Val 110	Leu	Arg
Leu	Glu 125	Asp	Ile	Glu

Val Thr 130

Gly

Thr

Ala

Pro

Pro 135

Pro

Leu

Glu 140

Ala

Thr

Gly

Pro

Ala Leu

Ser

Thr

Leu

Ser

Leu

Arg

Asn

Val

Ser

Trp

Pro

Lys

Gly

145

150

155

160

Ala Trp

Leu

Ser

Glu

Leu

Gin

Trp

Leu

Lys

Pro

Gly

Leu

Gin

Val

165

170

175

Leu Asn

Ile

Ala

Gin

Ala

His

Thr

Leu

Ala

Phe

Ser

Cys

Glu

Gin

Val

180

185

190

Arg Thr

Phe

Ser

Ala

Leu

Thr

Leu

Asp

Leu

Ser

Glu

Asn

Pro

Gly

195

200

205

Leu Gly

Glu

Arg

Gly

Leu

Val

Ala

Leu

Cys

Pro

His

Lys

Glu

Pro

210

215

220

Ala Leu

Gin

Asp

Leu

Ala

Leu

Arg

Asn

Ala

Gly

Met

Lys

Ile

Leu

Gin

225

230

235

240

Gly Val

Cys

Ala

Leu

Ala

Glu

Ala

Gly

Val

Gin

Pro

His

Leu

245

250

255

Asp Leu

Ser

His

Asn

Ser

Leu

Arg

Xaa

Ala

Xaa

Asp

Thr

Gin

260

265

270

Arg Cys

Ile

Trp

Pro

Ser

Ala

Leu

Asn

Ser

Leu

Asn

Leu

Ser

Phe

Thr

275

280

285

G1y Leu

Gin

Val

Pro

Lys

Gly

Leu

Pro

Ala

Lys

Leu

Asn

Val

Leu

290

295

300

Asp Leu

Ser

Cys

Asn

Lys

Leu

Asn

Arg

Ala

Pro

Gin

Pro

Gly

Glu

Leu

305

310

315

320

Pro Lys

Val

Asn

Leu

Ser

Leu

Asp

Gly

Asn

Pro

Phe

Leu

Val

Pro

325

330

335

Gly Ala

Ser

Lys

Leu

Gin

Glu

Asp

Leu

Thr

Asn

Ser

Gly

Val

Phe

Pro

340

345

350

Ala Cys

Pro

Ser

Pro

Leu

Ala

Met

Gly

Met

Ser

Gly

Thr

Leu

Ala

355

360

365

Leu Leu

Gin

Gly

Ala

Arg

Gly

Phe

Ile

370

375

<210>

8

<211>

1405

<212>

DNA

<213>

hovězí

<400>

8

gcgtgacgca

ctgtaaagga aagaatccac agtccagccc

; gacaaccaga

gagagaggca

i

4· 4444 • 4 4 4 4 ♦ 9 4

4 ·

4 · 4 4 •4 ·4 fc • 4 4 4 4 444 « 4 4 4 4 • 4 4 · 4 « 4

4 4 «44 • 4 4444 44 « Γ 4

9/9

caggctctga	gaatctactg	actatgttct	tggggccgaa	gcgtgggcta	tttggggact	120
taggaacagg	cttgggccgc	cctgacctcc	gctgtcgggc	caggtgtgcg	tgccctacct	180
gctgctgctg	ctgctgccgt	cactgctgcg	tgtgtctgcg	gacacaacag	aaccctgcga	240
gctggacgac	cacqatttcc	gttgtgtctg	caacttcacg	gatccgaagc	ctgactggtc	300
tagcgccgtt	cagtgtatgg	ttgccgtcga	ggtggagatc	agtgccggcg	gccgcagcct	360
ggaacagttt	ctcaagggag	ccgacaccaa	cccgaagcag	tatgctgaca	caatcaaggc	420
tctgcgcgtt	cggcgactca	agctgggcgc	tgcacaggtt	cctgctcagc	ttctggtcgc	480
cgttctgcqc	gcgctcgggt	actctcgtct	caaggaactg	acgcttgagg	acctggaggt	540
aaccggccca	acgcccccga	cgcctctgga	agccgctggg	cctgcgctca	ccaccctcag	600
tctgcgtaac	gtatcgtgga	caacaggagg	tgcctggctc	ggcgaactgc	agcagtgcct	660
caagcctgqg	ctcagggtgc	tgaacattgc	ccaagcacac	tcgcttgcct	ttccgtgcgc	720
agggctctcc	accttcgagg	cgctcaccac	cctagacctg	tctgacaatc	ccagtctcgg	780
cgacagcggg	ctgatggcag	ctctctgtcc	gaacaagttc	ccggccctcc	aatatctagc	840
gctacgcaac	gcggggatgg	agacgccgag	cggcgtgtgc	gcggcgctgg	cggcagcgag	900
ggtgcagccc	caaagcctgg	acctcagcca	caactcgctg	cgcgtcaccg	ccccgggtgc	960
tacccgatgt	gtctggccca	gtgcactaag	gtctctcaat	ttgtcgttcg	ctgggctgga	1020
gcaagtgcct	aagggactgc	cccctaagct	cagcgtgctt	gatctcagct	gcaacaagct	1080
aagcagggag	ccgcggcgag	acgagctgcc	cgaggtaaat	gacctgactc	tggacggaaa	1140
tccctttctg	gaccctggag	ccctccagca	ccaaaatgac	ccgatgatct	ccggcgtggt	1200
cccagcctgt	gcgcgttctg	ccttgaccat	gggggtgtca	ggagccctgg	cgctgcttca	1260
aggagcccga	ggcttcgcgt	aaggccaggg	gaagagaggg	aagaggaatg	aattggctca	1320
gattgccctg	gctccgggag	accctcgcca	ggacatctca	accaaccagc	cttctgcccc	1380

atccttattn aaatcttaaa cagca

Claims

PATENTOVÉ Ν

1. Použití sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypetidový fragment CD14, který stimuluje expresi defensinu v epiteliálních buňkách, nebo konzervativně substituovanou variantu uvedeného CD14 nebo fragmentu, který stimuluje uvedenou expresi, pro výrobu léčiva pro použití ke zmírnění příznaků sepse přímým vystavením epiteliálních buněk savce jejímu působení.
2. Použití sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypetidovou část CD14, která zvyšuje expresi defensinů u savce, nebo konzervativně substituovanou variantu uvedeného CD14 nebo části, která zvyšuje uvedenou expresi, pro výrobu léčiva pro použití ke zvýšení exprese defensinů u savce.
3. Použití sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypetidový fragment CD14, který stimuluje expresi jednoho nebo více defensinů epiteliálními buňkami, nebo konzervativně substituovanou variantu uvedeného CD14 nebo fragmentu, který zvyšuje uvedenou expresi, pro výrobu léčiva pro použití ke stimulaci exprese jednoho nebo více defensinů epiteliálními buňkami savce.
4. Použití sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypetidový fragment CD14, který stimuluje expresi defensinu, nebo konzervativně substituovanou variantu uvedeného CD14 nebo fragmentu, který stimuluje uvedenou expresi, pro výrobu přípravku pro použití ke stimulaci exprese defensinu podél gastrointestinálnímho traktu savce.
5. Použití sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypetidovou část CD14, která stimuluje uvedenou expresi, nebo konzervativně substituovanou variantu uvedeného CD14 nebo části, která stimuluje expresi defensinu, pro výrobu léčiva pro použití ke stimulaci exprese defensinu podél respiračního traktu savce.

I

1S2
6. Použití sloučeniny obsahující rozpustný CD14 nebo polypetidový fragment CD14, který stimuluje uvedenou expresi, nebo konzervativně substituovanou variantu uvedeného CD14 nebo fragmentu, který stimuluje expresi defensinu, pro výrobu přípravku pro použití ke stimulaci exprese defensinu na jazyku savce.
7. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv předcházejícího nároku, přičemž sloučenina obsahuje sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny zahrnující sekv.id.č. 4, sekv.id.č. 5, sekv.id.č. 6 nebo sekv.id.č. 7 nebo jejich konzervativně substituovanou variantu.
8. Použití sloučeniny podle nároku 7, přičemž CD14 má sekvenci aminokyselin vybranou ze skupiny zahrnující sekv.id.č. 4, sekv.id.č. 5, sekv.id.č. 6 nebo sekv.id.č. 7.
9. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv přičemž sloučenina obsahuje CD14 získaný žlázy savce.

z nároků 1 až 7, ze sekrese mléčné
10. Použití sloučeniny podle nároku 9, přičemž CD14 se získá z kravského mléka.
11. Použití sloučeniny podle nároku 8 nebo 9, přičemž byla-li sekrece předem podrobena stupni ošetření, stupeň ošetření je dostatečně mírný, aby dovolil uchování aktivity CD14 pro indukování nebo stimulování produkce defensinu v epiteliálních buňkách.
12. Použití sloučeniny podle nároku 9, přičemž CD14 je obsažen v kapalině.
13. Použití sloučeniny podle nároku 12, přičemž kapalina obsahuje frakci mléka obohacenou o uvedený CD14.

• · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · · • ·· ··· · · • · · · · · · ·· · · · · ···
14. Použití sloučeniny podle nároku 9, přičemž jedlém produktu.

CD14 je obsažen v
15. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků přičemž je sloučenina pro orální podávání savcům.

9 až 14,
16. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, přičemž je sloučenina pro orální podávání savcům.
17. Použití sloučeniny podle nároku 16, přičemž je sloučenina pro podávání dětem jako složka dětské výživy.
18. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, přičemž je sloučenina pro podávání ve formě aerosolu.
19. Použití koncentrátu při způsobu výroby léčiva, dietního zdroje nebo žvýkacího produktu pro použití pro přímé stimulování produkce defensinu u savce, přičemž způsob zahrnuje stupně:

získání zásobního roztoku, který obsahuje protein ze sekrece mléčné žlázy, oddělení koncentrátu, který obsahuje endogenní CD14, z roztoku a stanovení koncentrace CD14 v koncentrátu.
20. Způsob podle nároku 19, vyznačuící se tím, že mléčná sekrece je hovězí sekrece.
21. Způsob výroby masti pro přímou místní aplikaci na poranění pokožky člověka pro zmírnění účinků infekce, zvláště bakteriální infekce, vyznačuící se tím, že se do masti zahrne efektivní množství koncentrátu obsahujícího CD14 získaného ze sekrece mléčné žlázy.

• ·
22. Dietní zdroj, jako je dětská výživa, mléko nebo jiná kapalina, vyznačuící se tím, že je k němu přidána frakce mléčného produktu, tato frakce obsahuje vyšší koncentraci CD14, než jaká se přirozeně vyskytuje v nefrakcionovaném mléčném produktu, přičemž tento mléčný produkt znamená produkt, který nebyl ošetřen takovým způsobem, který denaturuje CD14 v něm obsažený v takovém rozsahu, aby CD14 ztratil žádanou aktivitu.
23. Dietní zdroj podle nároku 22, vyznačuící se tím, že CD14 je získán z kravského mléka.
24. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, přičemž je defensin(y) vybrán ze skupiny zahrnující RtNPl,RtNP2, RtNP3,RtNP4,ΗΝΡΙ,HNP2 a HNP3 a jakákoliv kombinace toho, nebo skupiny zahrnující HNP1,HNP2 a HNP3.