KR20100007241A

KR20100007241A - 인간 락토페린을 대량생산하기 위한 형질전환 제브라피쉬및 이를 이용한 인간 락토페린의 대량생산방법

Info

Publication number: KR20100007241A
Application number: KR1020080067786A
Authority: KR
Inventors: 박재학; 석승혁; 조영식; 하건우; 오진식; 오연경
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 주식회사 바이오노트
Priority date: 2008-07-11
Filing date: 2008-07-11
Publication date: 2010-01-22
Also published as: WO2010005273A2; WO2010005273A3

Abstract

본 발명은 인간 락토페린 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환되어 인간 락토페린을 대량생산하는 제브라피쉬, 상기 형질전환된 제브라피쉬로부터 인간 락토페린을 대량생산하는 방법, 및 상기 형질전환된 제브라피쉬를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 및 동물 사료 첨가제에 관한 것이다.

본 발명에 따르면 형질전환된 제브라피쉬로부터 인간 락토페린을 대량으로 쉽게 확보할 수 있고, 나아가 형질전환된 제브라피쉬 자체는 건강기능식품의 원료 및 동물 사료 첨가제로서 유용하게 사용할 수 있다.

제브라피쉬, 인간 락토페린, 대량생산

Description

인간 락토페린을 대량생산하기 위한 형질전환 제브라피쉬 및 이를 이용한 인간 락토페린의 대량생산방법 {A transgenic zebrafish for mass production of human lactoferrin and a process of producing human lactoferrin using the same}

인간 락토페린(Human Lactoferrin, hLf)은 691개의 아미노산(Amino acid)으로 구성된 분자량 78kDa의 당 단백질(Glycoprotein)로서, 단일 폴리펩타이드 체인(Single polypeptide chain)으로 구성되어 있다.

락토페린은 외분비선에서 분비되는 비-면역글로불린 보호 단백질 중의 하나로서 직접 또는 간접적으로 항균작용(anti-bacterial action)을 일으키며, 항바이 러스에 대해서도 영향을 미친다. 락토페린은 인 비트로(in vitro) 와 인 비보(in vivo) 중 어느 상태에서도 여러 종류의 미생물에게 광범위한 항균작용을 일으킨다. 이러한 락토페린은 철이 존재하지 않는 상태(apo-type)에서 대장균(E. coli)이나 클리브시엘라 뉴모니아(Kleabsiella pneumonia) 및 에어로벡터 에어로진(Aerobacter aerogenes) 등의 그람-음성 박테리아(Gram-negative bacteria)에 대해 높은 항미생물활성(anti-microbial activities)을 갖는데, 이는 락토페린이 미생물이 필요로 하는 Fe³ ⁺ 이온을 빼앗아 킬레이팅(chelating) 시킴으로서 미생물의 생장을 억제하기 때문이다. 실제로 인 비트로(in vitro) 실험 결과, 락토페린은 바실러스(Bacillus), 대장균(E. coli) 및 살모넬라(Salmonella) 등의 균을 1시간 이내에 99.99% 사멸시켜 항생물질에 뒤지지 않는 살균작용을 보였다. 또한, 락토페린은 철을 빼앗아 미생물의 성장을 억제시키는 작용 기작과 박테리아 생육성(bacteria viability)을 급속하게 감소시키는 작용 기작을 갖고 있다. 상기 기작은 락토페린이 그람 음성균(Gram-negative bacteria)의 외막(outer membrane)에 손상을 주어 외막의 구성성분인 당지질(lipopolysaccharide)을 다량 방출시킴으로써 투과장벽(permeability barrier)을 파괴하고, 리소자임(lysozyme)이나 리팜피신(rifampicin)같은 소수성 항생제(hydrophobic antibiotics)에 대한 민감성을 증대시켜 저항성을 잃게 하여 사멸시키는 것이다. 따라서, 이렇게 독특한 물질인 락토페린은 세균이나 바이러스 감염으로부터 면역에 미숙한 신생아를 지켜주는 역할을 한다.

한편, 락토페린은 혈액 내에도 소량이 포함되어 있는데, 대부분 호중구(neutrophil)에서 분비된다. 락토페린은 호중구의 제2 과립세포 의 주된 구성성분으로서 염증반응(inflammatory response) 시에 다량 분비된다. 락토페린은 종종 체내에서 리소자임(lysozyme)이나 IgA와 함께 감염된 병원성 미생물에게 직접 작용하여 파괴시킴으로써 미생물 사멸에 상승효과를 주기도 한다. 이와 같이 락토페린은 숙주에 대한 방어 기작에서 매우 중요한 역할을 담당하고 있으므로, 락토페린을 생성하지 못하는 환자는 각종 질병에 대해 저항성이 훨씬 떨어지고 세균과 곰팡이에 대하여 감염이 증가한다. 그 외에 락토페린은 세포 증식(cell proliferation)이나 철의 전달흡수(iron transport absorption) 등에서도 매개체로서의 역할을 담당한다. 락토페린을 함유한 주요 제품은 유아용 조제분유를 비롯하여 화장품, 식품첨가물, 항설사약, 복막 투석용제, 임상영양제, 여성위생용품, 안약제품, 껌 등이 있다(Nam et al., Korean J. Dairy Sci., 18, 289-298, 1996; Tomita, 1999, Morinaga Milk Industry Co., Ltd).

이와 같이 락토페린이 질병 감염ㆍ악성 종양ㆍ에이즈ㆍ암의 예방 역할 등의 다양한 기능을 수행함에도 불구하고, 인간 락토페린에 대한 연구는 아직 미비한 편이다. 이것은 락토페린이 혈액이나 그 밖의 다른 체액 내에 존재하지만 그 양이 매우 미미하고, 초유(colostral whey)에 상당량이 존재하더라도 초유를 얻을 수 있는 시료에 한계가 있기 때문이다. 최근에 모유의 중요성이 강조되어 락토페린에 대한 연구가 활성화되고, 유전공학의 발달에 따라 인간 락토페린 DNA를 미생물에 클로닝 하고 발현시키고자 하는 시도가 이루어지고 있으나, 여전히 현재 락토페린의 대량 생산과 산업화는 성공을 거두지 못하고 있다.

우선, 상기에서 언급한 바와 같이 락토페린은 항균작용을 가지고 있기 때문에 미생물에서 발현이 어려운 실정이다. 특히, 대장균(E. coli) 등을 위한 특별한 재조합 플라스미드가 제작되지 않는 한, 유전 공학에서 많이 사용하고 있는 대장균을 발현 균주로 사용하는 것은 대단히 어려운 일이다.

종래 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 와드(Ward) 등(1992)은 곰팡이인 아스퍼질러스 니둘란스(Aspergillus nidulans)나 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 사용하여 재조합 락토페린을 생성하는데 성공하였으나, 그 발현양이 5-25 mg/ℓ로 아주 낮은 편이었다.

또한, 형질전환 담배에서 전체 단백질량의 0.3% 로 사람 락토페린을 발현시킨 연구결과가 있고 (Samlmon et at. 1998), 형질전환 소의 우유에서 최대 2 g/L 의 락토페린을 정제할 수 있다는 결과도 있다 (Patrick et al. 1998). 누에 유충(silkworm larvae) 의 혈림프(hemolymph)에서 65ug/ml 의 재조합 락토페린을 얻었고 (Tao et al. 2005), 산양의 유두에 아데노바이러스 벡터를 직접 주사하여 우유에서 2g/L 의 락토페린을 얻을 수 있다는 결과도 보고되었다 (Han et al. 2007). 그러나 이러한 보고들은 락토페린의 생산량이 일정하지 않고, 유즙에서 얻을 수 있는 락토페린의 양에는 한계가 있으며, 형질전환 동물 작제 및 유지에 걸리는 시간 등의 난점, 경제적, 인력, 공간적인 면에 부담이 크다는 문제점 등으로 인해 상업화에는 아직까지 성공하지 못하였다.

따라서, 상기 문제점을 해결하고 산업화로의 빠른 적용이 가능한 새로운 발현숙주의 개발이 절실히 요구되고 있다.

한편, 제브라피쉬(zebrafish, Danio rerio)는 수정란을 대량으로 쉽게 확보할 수 있고, 발생이 매우 빨라 대부분의 조직 및 장기가 하루만에 형성되며, 척추동물로서 유전체 구성이 인간과 비슷하다는 장점이 있기 때문에, 인간 유전자의 기능분석 및 천연물이나 화합물을 대상으로 생체기능조절물질을 스크리닝하는데 유용하게 사용되어 왔다. 그러나, 이와 같이 제브라피쉬를 마우스나 선충, 초파리 등과 같이 유전학적, 세포생물학적 연구를 위한 실험동물모델로 사용한 예는 많으나, 상업적인 목적으로 목적 단백질을 대량 생산시키기 위한 숙주로서 사용된 적은 없었다.

이에, 본 발명자는 인간 락토페린을 유전공학적 방법으로 대량생산함에 있어서 상기한 문제점을 해결하면서 보다 용이하게 인간 락토페린을 대량생산할 수 있는 새로운 발현숙주를 개발하고자 예의 노력한 결과, 그동안 연구 동물모델로만 인식되어온 제브라피쉬에 인간 락토페린 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 형질전환시키면 인간 락토페린을 대량으로 쉽게 확보할 수 있음을 최초로 발견함으로써 본 발명을 완성하였다. 새로운 발현숙주로서 대량 사육이 가능하고 세대교체가 빠른 제브라피쉬를 이용하여 사람의 락토페린을 대량으로 생산한다면 산업화로의 빠른 적용이 가능할 것으로 보이며, 사료화시킨 락토페린을 공급함으로써 축산업가의 소 득 증대를 이룰 수 있을 것이다.

본 발명의 하나의 목적은 인간 락토페린 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 인간 락토페린을 대량생산하는 제브라피쉬를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환된 제브라피쉬를 이용하여 인간 락토페린을 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환된 제브라피쉬를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 하나의 양태로서 본 발명은 인간 락토페린 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 인간 락토페린을 대량생산하는 제브라피쉬에 관한 것이다.

본 발명에 사용되는 인간 락토페린 유전자는 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 예를 들면, 인간 락토페린 유전자의 알려진 염기서열(NCBI Accession. No. AY178998)을 이용하여 공지된 화학적 DNA 합성방법을 통하여 화학적으로 합성하거나, 인간 락토페린 유전자를 포함하는 알려진 플라스미드로부터 적절한 제한 효소 로 절단해 냄으로써 얻을 수도 있다. 상기 인간 락토페린 유전자의 서열은 그에 코딩되는 단백질의 특성과 기능을 실질적으로 동일하게 유지하는 한 적절한 변형을 가할 수 있다. 한편, 인간 락토페린 유전자를 포함하는 발현 벡터는 인간 락토페린 유전자를 발현시킬 제브라피쉬에 당해 분야에 공지된 벡터 중 하나를 선택하여 상기 유전자를 포함하도록 공지된 DNA 조작 방법을 적절히 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 실시예에서는 인간 락토페린 cDNA를 클로닝시키는 형질전환 벡터로 pCS2+ 벡터를 사용하였다(도 4). pCS2+ 벡터는 sCMV IE94 프로모터(simian cytomegalovirus IE94 promoter)와 SV40 poly A(simian virus 40 polyadenlyation site), 암피실린 저항성 유전자 및 다양한 제한효소 절단부위를 가지고 있다. 본 발명의 실시예에서는 pCS+ 벡터를 백본(backbone) 벡터를 사용하여 두 개의 벡터를 제작하였는데, 하나는 락토페린 유전자 및 그 하부에 모니터 유전자인 GFP(green flourscence protein) 유전자를 가지는 벡터로서 제브라피쉬 수정란에 주입하여 전신에서 GFP를 발현하는지 확인하여 간접적으로 락토페린 발현을 확인할 수 있는 벡터이다. 또 하나의 벡터는 GFP 유전자 없이 EF-1α(elongation factor-1 alpha) 프로모터 하에 락토페린 유전자만을 가지고 이 유전자의 끝에 히스티딘 태그를 달아서 후에 단백질을 정제할 수 있도록 하는 벡터로서, 실제로 라인을 형성하여 사람 락토페린을 대량으로 얻기 위한 발현 벡터이다.

상기 재조합 발현 벡터는 제브라피쉬의 세포, 바람직하게는 배아 세포, 가장 바람직하게는 단일 세포 또는 2 세포기의 배아 세포 내로 도입되는 것이 바람직하다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 제작한 발현 벡터를 단일 세포의 수정 란 내로 도입하였다.

형질전환 제브라피쉬를 만들기 위해서는 특정 시스템 특이적 프로모터를 클로닝 하는 것이 중요하며, 적절한 방법을 이용하여 수정란에 형질전환시켜야 한다. 형질전환시키는 방법으로는 종래 알려진 다양한 방법, 예를 들면, 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated gene transfer), 바이러스 감염법(viral infection), 직접근육주입법(direct muscle injection), 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존(trnasposon)을 이용한 기법 중에서 적절하게 선택하여 적용할 수 있다. 본 발명에서는 인간 락토페린 유전자를 포함하는 발현 벡터를 제브라피쉬 수정란에 미세주입법으로 형질전환시켰다.

본 발명자들은 형질전환된 제브라피쉬 수정란에 대하여 몸체가 투명함을 유지하는 7일령까지 UV-램프 하에서 GFP 발현을 확인하였고(도 7), 각 일령별로 수정란을 샘플링하여 RT-PCR 분석을 통해 인간 락토페린 mRNA 의 발현을 확인하였으며(도 9), 자체 개발한 ELISA 키트 및 면역염색(immunostaining)을 통하여 인간 락토페린 단백질이 성공적으로 발현하였음을 확인하였다(도 8).

본 발명에 의한 형질전환제브라피쉬는 락토페린의 특성이 표현되기 때문에 항균성, 항바이러스성 등의 특성을 가지게 된다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환된 제브라피쉬를 이용하여 인간 락토페린을 대량생산하는 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 본 발명의 대량생산방법은 1) 인간 락토페린 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; 2) 상기 발현 벡터를 제브라피쉬 수정란에 형질전환시키는 단계; 3) 상기 형질전환된 제브라피쉬를 배양하는 단계; 및 4) 상기 형질전환된 제브라피쉬로부터 인간 락토페린을 분리 및 정제하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 형질전환된 제브라피쉬로부터 인간 락토페린을 분리 및 정제하는 단계는 제브라피쉬 배아 세포 단계에서 공지된 분리 및 정제 방법에 의하여 이루어질 수도 있고, 제브라피쉬 성체로부터 공지된 분리 및 정제 방법에 의하여 이루어질 수도 있다. 세포 단계에서 분리 정제하는 경우, 프렌치 프레스, 초음파 분쇄기 등의 방법을 이용하여 세포를 파쇄한 후 인간 락토페린을 포함하는 수용성 분획을 염석 (예: 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전 등), 용매 침전(예: 아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 인간 락토페린 단백질을 얻을 수 있다.

제브라피쉬 성체로부터 정제하는 경우, 안정적으로 인간 락토페린을 생산하는 제브라피쉬를 얻기 위하여 다음과 같은 단계를 거칠 수 있다: a) 인간 락토페린 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계; b) 상기 발현 벡터를 제브라피쉬 수정란에 형질전환시키는 단계; c) 형질전환된 수정란을 선별하는 단계; d) 선별된 수정란을 부화시켜 성체로 발육시키는 단계; e) 상기 성체 제브라피쉬와 야생형 제브라피쉬를 이종교배시켜 이형접합체(heterozygote) 제브라피쉬 자손을 생 성시키는 단계; 및 f) 상기 이형접합체 제브라피쉬끼리 교배시켜 동형접합체(homozyggote) 제브라피쉬 자손을 선별하는 단계. 이와 같이 선별된 동형접합체 제브라피쉬를 이용하면 인간 락토페린을 생산하기 위한 제브라피쉬를 안정적으로 공급받을 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환된 제브라피쉬를 유효성분으로 함유하는 동물의 사료 첨가제 및 건강기능식품에 관한 것이다.

인간 락토페린 단백질을 함유하는 형질전환 제브라피쉬는 그 자체로, 또는 적절하게 가공되거나 추출되어 하여 식품, 건강식품 또는 건강보조식품으로 이용되거나, 각종 의약품의 성분으로 활용이 가능하다. 또한 락토페린을 생산하는 제브라피쉬 또는 그 부산물을 가축 사료로 사용할 경우 가축의 내병성 증가와 동시에 축산비용을 절감시키는데도 유용하게 사용될 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 형질전환된 제브라피쉬를 이용하면 인간 락토페린을 대량으로 쉽게 확보할 수 있으며, 나아가 형질전환 제브라피쉬를 통하여 인체 면역강화 단백질인 락토페린을 용이하게 섭취할 수 있기 때문에 고가인 락토페린을 저렴하게 생산할 수 있게 되어 이를 이용한 다양한 식품, 건강식품, 건강보조식품 및 동물 사료 첨가제 등이 개발될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 실시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. PCR 을 이용한 인간 락토페린 유전자 확보 및 염기서열 확인

인간 락토페린의 유전자를 확보하기 위하여 NCBI Accession. No. AY178998를 기초로 프라이머를 디자인하였다. cDNA는 BioChain(http://www.biochain.com)사의 cDNA-Human Adult Normal tissue(Breast(Cat#: C1234086)의 cDNA를 구매하여 PCR에 사용하였다. PCR 반응은 95℃에서 15분간 DNA를 추출하면서 Hot start Taq을 활성화시킨 후 95℃ 에서 1분, 45℃ 에서 1분, 72℃ 에서 2분을 1회 반복하였고, 95℃ 에서 1분, 55℃ 에서 1분, 72℃ 에서 2분을 28회 반복한 후 마지막으로 95℃ 에서 1분, 60℃ 에서 1분, 72℃ 에서 15분 간의 사이클을 1회 반복하였다. 증폭된 락토페린의 유전자는 2236 bp로 1.5% 아가로스 겔에 로딩하여 밴드 확인 (도 1) 후 이를 용출(elution)하여 pDrive(QIAgen사)에 T-vector 클로닝하였다. 이 클론은 SalⅠ과 BamHⅠ의 제한효소으로 절단하여 유전자가 삽입된 것을 확인(도 2)하고, 제노텍에 시퀀싱 분석을 의뢰한 후 NCBI 상의 염기서열과 비교, 분석하였다.

그 결과, 1 bp의 염기서열이 변환되었으나, 아미노산로 번역(translation)시에는 변환되지 않아 타겟 락토페린과 동일한 단백질을 발현할 것을 예측할 수 있었다(도 3).

실시예 2. 프로모터 벡터를 이용하여 사람 락토페린 벡터 제조

사람의 유방암 cDNA에서 락토페린을 코딩하는 부분을 클로닝하여 pGEM T-easy vector (Invitrogen) 로 옮겼다. 또한, pCS2+벡터와 pCS2+GFP 벡터,두 개의 backbone 벡터를 사용하여 락토페린 유전자 밑으로 모니터 유전자인 GFP (green flourscence protein) 유전자를 가지는 벡터와 GFP 유전자 없이 EF-1α(elongation factor-1 alpha) 프로모터 하에 락토페린 유전자만을 가지고 이 유전자의 끝에 히스티딘 태그를 달아서 후에 단백질을 정제할 수 있도록 하는 벡터를 각각 제작하였다(도 4). 전자는 제브라피쉬 수정란에 주입하여 전신에서 GFP를 발현하는지 확인함으로써 간접적으로 락토페린 발현을 확인할 수 있는 벡터이며, 후자는 실제로 라인을 형성하여 사람 락토페린을 대량으로 얻기 위한 발현벡터이다.

실시예 3. 형질전환된 제브라 피쉬의 제조

제브라피쉬는 28.5 ℃의 개별 순환어조(도 5A)에서 사육하여, 암컷과 수컷을 분리하여 놓았다가 아침에 빛을 가하며 함께 합사시킴으로써 교배시켜 수정란을 얻었다(도 5B 및 도 5C). 미세조작기구(Micromanipulator, 도 6A)를 이용하여 수정된지 20분 이내의 one-cell 단계의 수정란 (도 6B)에 작제한 벡터(100 ng/u)를 주입하였다.

실시예 4. 형질전환된 제브라피쉬로부터 사람 락토페린 발현 여부 확인

본 발명자들은 형질전환된 제브라피쉬 수정란에 대하여 몸체가 투명함을 유지하는 7일령까지 UV-램프 하에서 GFP 발현을 확인하였고(도 7), 각 일령별로 수정란을 샘플링하여 RT-PCR 분석을 통해 인간 락토페린 mRNA 의 발현을 확인하였으며, 자체 개발한 ELISA 키트 및 면역염색(immunostaining)을 통하여 인간 락토페린 단백질이 성공적으로 발현하였음을 확인하였다(도 8). 그 구체적인 실험 내용은 다음과 같다.

4-1. RT - PCR 에 의한 확인

각 일령별로의 수정란을 샘플링하여 RT-PCR을 통해 락토페린 mRNA 발현을 확인하였다. 표 1에 제시한 사람 락토페린과 GFP mRNA 발현 확인을 위한 프라이머를 가지고 추출된 제브라피쉬의 RNA에서 cDNA를 합성하여 PCR을 수행하여 사람의 락토페린의 유전자가 mRNA의 형태로 발현하였는지 여부를 확인하였으며, 그 결과 도 9에 나타난 바와 같이, 락토페린이 성공적으로 발현하였음을 확인할 수 있었다.

4-2. ELISA 에 의한 확인

ELISA 를 통해 락토페린 단백질의 발현을 확인하였다. 우선, 항체를 제작하기 위하여 항원은 Sigma-Aldrich 사의 락토페린(Cat. No. L0520)을 구매하여 사용하였다. 이를 BalB/C 마우스에 면역화하고 SP2/0 세포에 융합하여 ELISA를 통하여 양성인 웰을 선별하였다. 이렇게 선별된 항체 중 12가지를 매칭 테스트(matching test)를 통하여 락토페린 ELISA 키트를 개발하였고 “BIOXYTECH Lactof EIA(Oxis Research 사)”와 비교 시험하였다.

트랜스펙션된 치어는 호모지나이저(homogenizer)로 유제하여 10% 유제액을 만들어 1%, 2.5%로 희석하여 ELISA와 웨스턴 블랏에 사용하였다.

ELISA로 검증 시에는 자체 개발와 시판되고 있는 키트인 OxisResearch 사 제품을 사용하였다. OxisResearch 사는 검체를 검체희석액으로 1/40 희석하여 웰에 100㎕첨가 후 37 ℃에서 1시간 반응 후 세척액으로 5회 세척하고 Anti-LTF 100 ㎕를 첨가하고 37 ℃에서 60 분 반응시켰다. 이를 다시 세척액으로 5회 세척, 스트렙타빈-HRP 100 ㎕를 첨가하여 37 ℃,15 분간 반응시킨 후 OPD 100 ㎕를 첨가하여 37℃ 10분 반응 후 정지 용액(Stop solution) 50 ㎕로 반응을 정지시킨 후 450 nm에서 파장값을 측정하여 정제된 락토페린의 값과 비교하여 락토페린의 양을 추정하였다. 한편, 자체 개발 키트는 검체를 희석된 접합체와 1:1로 혼합하여 37℃ 90분, 상온에서 15분 반응시킨 후 발색하여 파장값을 측정하여 정제된 락토페린의 값과 비교하여 락토페린의 양을 추정하였다.

그 결과, 락토페린을 단독 발현시킨 치어와 락토페린과 GFP 융합단백질 형태의 파장값을 보았을 때 락토페린만 단독 발현시킨 치어에서만 락토페린이 64 ng/㎖ 정도 발현되고 있음을 추정할 수 있었다.

시료	OxisResearch 사 키트의 O.D.
100 ng/㎖	1.865
50 ng/㎖	1.398
25 ng/㎖	0.951
12.5 ng/㎖	0.612
6.2 ng/㎖	0.439
3.1 ng/㎖	0.319
1.6 ng/㎖	0.249
blabk	0.161
대조군	0.205
대조군	0.198
락토페린	0.317
락토페린	0.318
락토페린/GFP	0.198
락토페린/GFP	0.190
blank	0.196
blank	0.174

시료	자체개발 키트의 O.D.
NC	0.098
PC, 64 ng/㎖	2.644
PC, 32 ng/㎖	1.573
PC, 16 ng/㎖	0.805
PC, 8 ng/㎖	0.481
PC, 4ng/㎖	0.297
PC, 2 ng/㎖	0.204
PC, 1 ng/㎖	0.169
대조군	0.105
대조군	0.081
락토페린	2.457
락토페린	2.492
락토페린/GFP	0.158
락토페린/GFP	0.168
blank	0.103
blank	0.175

4-3. 면역염색( Immunostaining ) 에 의한 확인

면역염색(Immunostaining)을 통해 단백질 발현을 확인하였다. 치어를 이용하여 락토페린에 특이적인 항체를 사용하여 면역염색을 실시하고, 실제로 어느 조직에서 어떠한 양상으로 락토페린을 발현하는지에 대한 데이터를 수집하였다.

구체적으로, 치어에 락토페린 및 GFP 유전자를 포함하는 발현 벡터 및 락토페린을 포함하는 발현 벡터를 각각 주입한 후에 일정 시간 단백질 발현 후 4% 파라포름알데하이드로 고정 후 4°C에서 보관하였고, 2% 염소 혈청으로 1시간 동안 실온에서 블러킹을 시켰다. 1:300 희석된 락토페린 1차 항체에서 밤새 배양(overnight incubation)했다. PBT 용액으로 세척한 후 4°C에서 1:1000 희석된 2차 FITC(fluorescein isothiocyanate) 가 붙은 항체로 밤새 배양했다. 형광 현미경으로 FITC 형광을 관찰한 후 사진을 찍었다.

그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 수정 후 26시간 후의 배아에서 FITC 발현을 확인함으로써, 락토페린이 성공적으로 발현하였음을 확인하였고, 특히 눈(eye)과 전뇌(forebrain) 부분에 락토페린이 많이 발현하였음을 확인하였다.

도 1은 PCR 로 증폭시킨 인간 락토페린 유전자 2236 bp 를 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 2는 인간 락토페린 유전자를 T-벡터에 클로닝 한 후 성공적으로 클로닝되었는지를 확인하기 위하여 제한효소로 절단하여 전기영동으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 증폭 및 벡터에 클로닝한 인간 락토페린 유전자와 NCBI 에 등록된 인간 락토페린 유전자의 염기서열을 비교분석한 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 인간 락토페린 유전자를 pCS+ 벡터에 클로닝하여 재조합 발현 벡터를 제조하는 과정을 나타낸 모식도이다.

도 5의 A는 제브라피쉬를 사육하는 개별 순환어조를 나타낸 것이며, B는 제브라피쉬를 교배시켜 얻은 수정란을 나타낸 것이며, C는 상기 수정란을 확대한 그림이다.

도 6의 A은 picopump(1), 현미경(2) 및 미세조작기구(Micromanipulator, 3)를 나타낸 사진이며, B는 제브라피쉬의 수정란(one cell) 단계에서 준비한 DNA 를 미세주입하는 모습을 나타낸 사진이다.

도 7은 체절기(somite stage) 및 수정 후 28시간 후의 제브라피쉬 배아에서 락토페린 및 GFP를 포함하는 벡터를 주입한 후 형광발현하는 모습을 나타낸 것이다.

도 8은 수정 후 26시간 후의 제브라피쉬 배아에서 락토페린 유전자 발현 벡 터를 주입한 후 FITC 형광발현하는 모습을 면역염색을 통하여 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 9는 사람의 락토페린 유전자를 주입한 제브라피쉬 mRNA를 이용한 RT-PCR 결과를 나타내는 그림이다 (PC1:락토페린 양성 DNA, PC2: GFP양성 DNA, lane 1. hLF-1F + hLF-1R, lane 2. hLF-1F + hLF-2R, lane 3. hLF-2F + hLF-2R, lane 4. GFP 1F + GFP 1R, lane 5. GFP 1F + GFP 2R, lane 6. GFP 2F + GFP 2R).

<110> ANIMAL GENETICS, Inc. Seoul National University Industry Foundation <120> A transgenic zebrafish for mass production of human lactoferrin and a process of producing human lactoferrin using the same <130> PA080184/KR <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for hLF-1 <400> 1 atgaaacttg tcttcctcgt cctg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for hLF-2 <400> 2 cagccacgaa ctcactatta tgcc 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for hLF-1 <400> 3 atgaaaccac catcaagggt cac 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for hLF-2 <400> 4 cttcgtgcca caacggcatg ag 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GFP-1 <400> 5 atggtgagca agggcgagga g 21 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GFP-2 <400> 6 tggtgaaccg catcgagctg aag 23 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GFP-1 <400> 7 actgcacgcc gtaggtcagg 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GFP-2 <400> 8 cagctcgtcc atgccgagag tga 23

Claims

인간 락토페린 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터로 형질전환된, 인간 락토페린을 대량생산하는 제브라피쉬.
제1항에 있어서, 상기 발현 벡터는 도 4의 개열지도로 표시되는 벡터인 형질전환된 제브라피쉬.
제1항에 있어서, 상기 형질전환은 제브라피쉬 수정란의 1 또는 2 세포 시기에 이루어지는 것인 형질전환된 제브라피쉬.
제1항에 있어서, 상기 형질전환은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), 입자 분사법(particle bombardment), 정자를 이용하는 방법(sperm-mediated gene transfer), 바이러스 감염법(viral infection), 직접근육주입법(direct muscle injection), 인슐레이터(insulator) 및 트랜스포존(trnasposon)을 이용한 기법으로 이루어지는 군에서 선택되는 방법에 의한 것인 형질전환된 제브라피쉬.
1) 인간 락토페린 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제조하는 단계;

2) 상기 발현 벡터를 제브라피쉬 수정란에 형질전환시키는 단계;

3) 상기 형질전환된 제브라피쉬를 배양하는 단계; 및

4) 상기 형질전환된 제브라피쉬로부터 인간 락토페린을 분리 및 정제하는 단계를 포함하는, 인간 락토페린의 대량생산방법.
제5항에 있어서, 상기 발현 벡터는 도 4의 개열지도로 표시되는 벡터인 방법.
제1항의 형질전환된 제브라피쉬를 유효성분으로 함유하는 건강기능식품.
제1항의 형질전환된 제브라피쉬를 유효성분으로 함유하는 동물의 사료 첨가제.