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Diese
Erfindung betrifft chimäre
Proteine, ein Sequenzkonstrukt, eine Pflanzenzelle, das Verfahren
zur Herstellung des chimären
Proteins und der transgenen Pflanze, die transgene Pflanze, die
Verwendung der transgenen Pflanzen bei der Herstellung von oralen
Impfstoffen, ein Arzneimittel, einen Impfstoff gegen den Leberegel,
sowie ein Verfahren zur Induzierung von Immunität gegen Infektionen durch den
Leberegel in Säugetieren.
Im Allgemeinen betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Induzierung
einer Immunantwort, welches das Verabreichen des Impfstoffes über den
Verdauungstrakt umfasst. Die Gegenstände der Erfindung dienen zur Herstellung
von oralen Impfstoffen gegen den Leberegel.
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Der
Leberegel (Fasciola hepatica) ist ein innerer Parasit von Rindern.
Er zählt
zu den Saugwürmern (Trematoden),
was bedeutet, dass man im Lebenszyklus mehrere Entwicklungsstadien
unterscheidet. Dabei ist ein Zwischenwirt beteiligt, die Schnecke
Lymnea truncatula. Das Tier wird nach der Aufnahme von Pflanzen, auf
denen sich die eingekapselte invasive Form, Metazerkarie, befindet,
angegriffen. Im Verdauungstrakt von Wirbeltieren wird die Kapselwand
aufgelöst
und die juvenile Form migriert durch die Bauchhöhle zur Leber und gelangt dann
durch das Weichgewebe dieses Organs in die Gallengänge, wo
sie die geschlechtliche Reife erreicht. Die Krankheit, die durch
den Leberegel hervorgerufen wird, genannt auch Leberegelkrankheit
oder Fasziolose, verursacht ein Abnehmen bei Tieren, eine Abnahme
der Milchproduktion und eine Abnahme der Fruchtbarkeit und kann
auch zum Tod des Tieres führen
(Kadłubowski
et al. 1999). Es ist also eine Krankheit von enormer wirtschaftlicher
Bedeutung, die große ökonomische
Verluste verursacht. Außerdem
werden immer mehr Infektionsfälle
unter den Menschen verzeichnet, insbesondere in den Entwicklungsländern, wo
vermutlich jeder dritte Einwohner infiziert sein kann, und die ernsteren
Fälle der
Leberegelinfektionen mit dem Tod enden können.
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Der
Leberegel wird für
eines der wesentlichsten Veterinärprobleme
mit Parasiten in der Welt gehalten, und Schutzimpfung wird gerade
zur wirksamsten und günstigsten
medizinischen Intervention. Über
die Wirksamkeit des Impfstoffes entscheiden nicht nur seine immunologischen
Eigenschaften, sondern auch seine Verfügbarkeit, im Allgemeinen ein
Ergebnis seines Preises. Die gegenwärtigen Forschungen konzentrieren
sich auch auf die Senkung der Kosten der Impfstoffherstellung.
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Die
Behandlung besteht in der Verwendung von Arzneistoffen gegen den
Leberegel und der Vorbeugung durch Bekämpfung der Schnecke, dem Zwischenwirt
des Parasiten, sowie in der Entwässerung
von Wiesen und Weidegras. Zurzeit gibt es keinen wirksamen Impfstoff,
obwohl viele Versuche unternommen wurden, die zum Ziel hatten, ein
geeignetes Leberegelantigen zu finden, das eine starke Immunantwort
hervorrufen würde.
Zurzeit sind die Antigene, die zum Impfen verwendet werden, aus
dem Leberegel selbst stammende Antigene. (Wędrychowicz und Klockiewicz,
Acta Parasitologica 1994, 39:173).
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Die
Migration des Leberegels durch die Gewebe des Endwirts ist möglich dank
der sekretierten proteolytischen Enzyme unter diesen Cysteinproteinasen
(Piacenza L. et al. Parasitol Int., 1998, 47S:266), die die Proteine
der extrazellulären
Matrix abbauen, zuerst in den Wänden
des Verdauungstrakts und später
im Gallengang und der Leber. Dies ist also ein Schlüsselfaktor,
der die Entwicklung des Parasiten ermöglicht, aber auch das erste
Element der Wechselwirkung Parasit – Wirt. Proteolytische Enzyme
spielen eine wichtige Rolle im Lebenszyklus aller Parasiten, weil
sie ihnen die Invasion der Zellen und Gewebe des Wirts ermöglichen,
sie Elemente des Immunsystems abbauen und die Proteine des Wirtes
als Nährstoffe
für den
Parasiten hydrolysieren. Als ein Ergebnis der Evolution wurden die
Enzyme spezifischer, was auf den Adaptionserfolg der Parasiten Einfluss
hatte.
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Die
Cysteinproteinase gehört
zu einer Gruppe von Proteinen, die Cathepsin L (Cathepsin-ähnliches Protein)
genannt werden. Bekannt sind zwei heterogene Formen dieses Proteins,
L1 und L2 (27 kDa und 29,5 kDa). cDNA der Cysteinproteinase wurde
als Impfstoff gegen den Leberegel eingesetzt, wobei eine Immunisierung
von Ratten erfolgreich war (Kofta et al., Vaccine 2000, 18:2985).
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Noch
vor einigen Jahren wurde behauptet, dass die durch gastrodermale
Zellen des Leberegels sekretierten proteolytischen Enzyme nur zur
Ermöglichung
der Penetration des Wirtgewebes und zur Aufnahme von Nährstoffen
verwendet werden. Heutzutage ist bekannt, dass Cathepsin L Antikörper in
der hinge-Region lysieren kann und den Parasiten vor dem immunologischen
Angriff schützen
kann. Darüber
hinaus sind sie zur Fragmentierung des Fibrinogens fähig, so
dass es ein Gerinnsel bildet, das den durch den Wirtorganismus migrierenden
Leberegel umgibt, und dadurch die Wirksamkeit der Immunantwort schwächt, indem
der Zugang von Makrophagen inhibiert wird. Eines der Cathepsine
ist auch bei erwachsenen Leberegeln in der Melis-Drüse anwesend,
wo es an der Erzeugung von Bier beteiligt ist. Das bedeutet, dass
das Enzym in jeder Lebensstufe des Parasiten sekretiert wird.
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Die
Transgenese ermöglichte
die Verwendung von Tier- und Pflanzenorganismen als Bioreaktoren. Auf
diese Weise gewonnene transgene Organismen erzeugen Antigenproteine,
die das Immunsystem in Einsatzbereitschaft gegen Pathogeninvasion
setzen (Charon et al., „Animal
Genetics", PWN,
Warschau, 2000). In den Impfstoffen dieses Typs ist das Immungen
ein einzelnes Antigen, wie ein Virus-, Bakterien- oder Parasitenprotein.
Eine Stimulation des Immunsystems ist möglich, wenn das Protein seine
unveränderte,
native Struktur behält,
was bedeutet, dass die krankheitsbildenden Faktoren normalerweise
eines eukaryotischen Expressionssystems bedürfen. Deswegen stellte sich
heraus, dass ihre Herstellung in Hefen oder Bakterien, obwohl sie
billiger und produktiver ist, wegen des Möglichkeitsmangels an geeigneten
Proteinmodifizierungen oft erfolglos ist.
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Die
Patentbeschreibung mit der Nummer
US
6,084,156 (veröffentlicht
am 04.07.2000) beschreibt die Lösung
betreffs der lytische Peptide herstellenden Pflanzen. Außer in der
Beschreibung von
US 6,084,156 werden
die Lösungen
betreffs der stabilisierenden Kombination von Polypeptiden mit dem
lytischen Peptid Ubiquitin sowie Verfahren zur Herstellung durch
Subklonierung einer Nukleinsäure,
die die Sequenz eines lytischen Peptids kodiert, in einen Plasmidvektor,
der einen Promotor und eine das Polypeptid Ubiquitin kodierende
Sequenz enthält,
in dem das Polypeptid Ubiquitin mit dem 5'-Ende der Sequenz der Nukleinsäuresequenz des
lytischen Peptides verbunden ist, welches als ein Fusionspolypeptid
Translation unterliegt, auch in den Patentbeschreibungen
US 6,448,391 (veröffentlicht
am 10.09.2002) und
US 6,018,102 (veröffentlicht
am 25.01.2000) und
US 5,955,573 (veröffentlicht
am 21.09.1999) beschrieben. Ferner beschreiben die Beschreibungen
US 6,018,102 und
US 5,955,573 Lösungen betreffs
Genkonstrukten unter Kombinieren des lytischen Peptids Ubiquitin,
ihre Proteinprodukte und ihre Herstellung und Verwendung.
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Die
Patentbeschreibung
US 6,306,663 (veröffentlich
23.10.2001) beschreibt eine Lösung
betreffs der neuen Verbindungen, die Ubiquitin-Erkennungselemente
und einen Protein-bindenden Faktor enthalten. Diese Erfindung betrifft
auch den Einsatz der Verbindungen, um das Niveau und/oder das Aktivitätsniveau
des Zielproteins zu modulieren. Diese Verbindungen sind beim Einsatz
gegen Infektionen, Entzündungszustände, Krebs
und genetische Krankheiten sowie als Herbizide und Insektizide brauchbar.
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Die
Patentbeschreibung
US 6,068,994 (veröffentlicht
am 30.05.2000) beschreibt eine Erfindung betreffs der Ubiquitin-Expression.
Die Lösung
beschreibt ein Verfahren zur Konjugation von Ubiquitin an die Expression
eines Gens, das ein hohes regulierbares Niveau für die Herstellung von heterologen
Proteinen ermöglicht,
die destabilisierende Aminosäurenreste
in einer terminalen Position besitzen. Ubiquitin-Fusionsproteine,
die in Hefen exprimiert werden, werden präzise in vivo durch für Ubiquitin
spezifische endogene Hydrolasen in heterologe Proteine der Hefen
sowie das humane Alfa-1-Antitrypsin, das humane Gamma-Interferon und
das humane HIV-Virusprotein gespalten, was mit den destabilisierenden
Resten initiiert wird. Ein synthetischer Vektor, welcher ein synthetisches
Gen von monomerem Hefe-Ubiquitin enthält, wurde konstruiert und unterlag
der Expression unter der Kontrolle des Heferegulatorglucosepromotors.
Dieses System kann für
Expressionsniveauerhöhung
im Falle von Proteinen mit niedrigem Expressionsniveau und für die Herstellung
von Proteinen mit destabilisierenden Aminosäurenresten in einer terminalen
Position eingesetzt werden.
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In
den Patentbeschreibungen
US 5,847,097 (veröffentlicht
am 08.12.1998) und
US 5,646,017 (veröffentlicht
am 08.07.1997) wird ein Herstellungs- oder Modifizierungsverfahren
für die
Proteinstruktur auf dem Niveau des Proteins oder Gens bereitgestellt,
um spezifische Aminotermini in vivo oder in vitro herzustellen. Die
Verfahren gründen
sich auf die unnatürliche
Einführung
von Protein-Ubiquitin-Konjugaten und auf die Feststellung, dass
die Halbwertszeit des Proteins in vivo eine Funktion der N-terminalen
Aminosäure
des Proteins ist.
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Die
Patentbeschreibung
US 5,620,923 (veröffentlicht
am 15.04.1997) beschreibt ein Herstellungsverfahren von synthetischen
Proteinprodukten, die ungefähr
vierzig am Carboxylende um Ubiquitin verlängerte Aminosäurereste
enthalten, die der Expression in den prokaryotischen Zellen wie
E.coli unterliegen. Dieses Verfahren kann man für die Herstellung von Peptiden,
die 2 bis etwa 40 Aminosäurereste
enthalten, einsetzen und ist besonders für die Herstellung von Peptiden
geeignet, die 5 bis 40 Aminosäurereste
enthalten.
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Die
Patentbeschreibung
US 5,494,818 (veröffentlicht
am 27.02.1996) betrifft eine generische Klasse von Ubiquitin-spezifischen
Proteinasen, die spezifisch Reste nahe dem C-Endrest von Ubiquitin
in einem Ubiquitin-Fusionsprotein spalten, unabhängig von der Größe. Genauer
betrifft die Erfindung Ubiquitin-spezifische Proteinasen einer Klasse,
die aus einer Zelle isoliert wurden, und isolierte DNA-Sequenzen,
die die Proteine aus dieser Klasse kodieren.
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Versuche
zur Herstellung von Antigenen für
Impfstoffe in Säugetier-
und Insektenzellkulturen waren mit sehr hohen Kosten, einer Notwendigkeit
zur kontinuierlichen Kontrolle der Synthese und einer präzisen Reinigung
der Impfstoffe verbunden, damit sie keine potenzielle Quelle für Allergene
oder Faktoren, die Autoimmunreaktionen verurschen, bilden.
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Pflanzenbioreaktoren
sind wesentlich billiger und sicherer. Proteine, die in einer Pflanzenzelle
auf der Basis von exogener DNA entstehen, haben eine identische
Aminosäuresequenz,
unterliegen ähnlichen
Modifizierungen und erlangen ähnliche
Eigenschaften, wie jene, die während
der Pathogenese in dem Wirtorganismus entstehen.
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Transgene
Pflanzen beinhalten in allen Zellen die fremde DNA, die das geeignete
Antigen kodiert, und produzieren das besondere Antigenprotein. Das
eingeführte
fremde Gen wird auf die Nachkommen übertragen.
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Modifizierte
Pflanzen können
roh aufgenommen werden, so dass man die mit der Reinigung des Antigens
verbundenen Kosten umgehen kann. Orale Immunisierung scheint am
günstigsten
zu sein, hinsichtlich der nicht-invasiven und schmerzlosen Verabreichung
und der Effektivität
beim Verursachen einer systemischen Antwort (McGhee J.R., Lamm M.E.,
Strober W., 1999; Mucosal Immunology (Ogra P.L., Lamm M.E., Bienenstock
J., Mestecky J., Strober W., McGhee J.R., Red.), S. 485 bis 505,
Academic Press).
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Die
Patentbeschreibungen
US 6,281,345 (veröffentlicht
am 28.08.2001),
US 6,265,198 (veröffentlicht am
24.07.2001) beschreiben Arzneimittel, welche Nukleinsäuren, Proteine,
Antikörper
und Inhibitoren enthalten, sowie ihre Verwendung zum Tierschutz
gegen Krankheiten, die gastrointestinale Parasiten verursachen.
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Die
Patentbeschreibung
US 6,066,503 (veröffentlicht
am 23.05.2000) beschreibt eine Lösung
betreffs Nukleotidsequenzen, die die Enzyme der Aminopeptidase von
gastrointestinalen Parasiten, ihre Antigene und funktionellen Äquivalente
kodieren, und ihre Verwendung als Impfstoffe gegen diese Parasiten.
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In
der Patentbeschreibung
US 5,885,814 (veröffentlicht
am 23.03.1999) wurde ein Impfstoff gegen gastrointestinale Parasiten
bereitgestellt, der eine aus dem Leberegel isolierte Serinproteinase
enthält.
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Die
Patentbeschreibungen
US 6,419,923 (veröffentlicht
am 22.07.2002),
US 6,365,392 (veröffentlicht am
02.04.2002),
US 5,795,768 (veröffentlicht
am 18.08.1998),
US 5,792,624 (veröffentlicht
am 11.08.1998),
US 5,750,391 (veröffentlicht
am 12.05.1998) und
US 5,691,186 (veröffentlicht
am 25.11.1997) beschreiben Gewinnungsverfahren des Cysteinproteinaseproteins,
von Antikörpern,
Nematodencysteinproteinaseinhibitoren und ihre Verwendung in Arzneimitteln
für Tierschutz
gegen durch gastrointestinale Parasiten hervorgerufene Krankheiten
und isolierte rekombinierte Zellen, welche sie exprimieren. In der
Beschreibung
US 6,365,392 ist
die Zusammensetzung, welche besondere, isolierte Abschnitte der
Nukleinsäure
enthält,
ein rekombinierter Virusimpfstoff.
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Die
Patentbeschreibung
US 5,863,775 (veröffentlicht
am 26.01.1999) beschreibt ein Bekämpfungsverfahren für gastrointestinale
Parasiten bei Tieren, die Endwirte sind, wobei das Verfahren auf
der oralen Verabreichung eines antiparasitären Proteins in der Form eines
Arzneistoffes oder Nahrungsmittels basiert, so dass das Protein
den Parasiten erreicht. Das antiparasitäre Protein kann ein Inhibitor
des Parasitenenzyms sein, zum Beispiel ein Inhibitor eines Verdauungsenzyms
wie ein Cysteinproteinaseinhibitor. Dieser Lösung gemäß ist das antiparasitäre Protein
ein Protein, das der Expression in transgenem Mais und Reis unterliegt,
die das Tierfutter sind.
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Trotz
der oben beschriebenen vorbereitenden Forschung, die der Bereitstellung
eines Impfstoffes gegen Leberegel gewidmet ist, besteht ein Bedarf
für wirksame
Mittel für
die einfache Herstellung von wirksamen Immunimpfstoffen gegen diese
Parasiten.
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Das
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln,
die bei der Gewinnung von Impfstoff gegen den Leberegel verwendet
werden können.
Das besondere Ziel der Erfindung sind die Herstellung von chimären Proteinen,
die ausgewählte
Antigene der Cysteinproteinase, isoliert aus Fasciola hepatica,
enthalten würden
und welche zum Impfen gegen den Leberegel verwendet werden könnten, sowie
Mittel, welche ihre Expression ermöglichen, insbesondere in Pflanzensystemen.
Ein besonderes Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung von Mitteln,
mit welchen eine transgene Pflanze gewonnen werden kann, die bei
der Herstellung von essbaren Impfstoffen gegen den Leberegel verwendet
werden könnte.
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Unerwartet
wurden die Ausführungsform
des beschriebenen Ziels und die Lösung der beschriebenen technologischen
Probleme, welche mit Proteinen auftauchen, die in Zellen auf der
Basis von exogener DNA hergestellt werden, in der vorliegenden Erfindung
erreicht.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein chimäres Protein unter der Kontrolle
des konstitutiven CaMV 35S-Promotors kodierendes Nukleinsäuremolekül, dadurch gekennzeichnet,
dass die das chimäre
Protein kodierende Sequenz aus einer der folgenden Sequenzen besteht:
- – eine
die Aminosäuresequenz
der katalytischen Domäne
der Cysteinproteinase des Leberegels kodierende Nukleotidsequenz,
fusioniert mit der das HBc-Core Protein kodierenden Sequenz,
- – eine
die Aminosäuresequenz
der Leader-Domäne
der Cysteinproteinase des Leberegels kodierende Nukleotidsequenz,
fusioniert mit der das HBc-Core Protein kodierenden Sequenz,
- – eine
die Aminosäuresequenz
der katalytischen Domäne
der Cysteinproteinase des Leberegels kodierende Nukleotidsequenz,
fusioniert mit der das HBc-Core Protein und Glycinreste kodierenden
Sequenz, oder
- – eine
die Aminosäuresequenz
der katalytischen Domäne
der Cysteinproteinase des Leberegels kodierende Nukleotidsequenz,
fusioniert mit der Ubiquitin kodierenden Nukleotidsequenz.
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Bevorzugt
wurde die Sequenz für
das chimäre
Protein unter den in den 1 bis 14 dargestellten Sequenzen
ausgewählt.
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Die
nächste
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine Pflanzenzelle, die dadurch charakterisiert
ist, dass sie eine Nukleinsäuresequenz
wie vorstehend definiert umfasst.
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Die
nächste
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines
chimären
Proteins, das die Einführung
eines Vektors in Agrobacterium tumefaciens-Zellen mittels Elektroporation, die
Transformation der Pflanzen mit einem Bakterienstamm, der diesen
Vektor umfasst, und die Expression des chimären Proteins einschließt, wobei
der Vektor ein Konstrukt enthält,
das eine der Sequenzen wie vorstehend definiert umfasst.
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Die
nächste
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer
transgenen Pflanze, das die Einführung
eines Vektors in Agrobacterium tumefaciens-Zellen mittels Elektroporation, die
Transformation der Pflanzen mit einem Bakterienstamm, der diesen
Vektor enthält,
und die Regeneration der Pflanzen einschließt, wobei der Vektor ein Konstrukt
enthält,
das eine der Sequenzen wie vorstehend definiert umfasst.
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Die
nächste
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze, die mit einem Konstrukt
transformierte Zellen besitzt, das eine Nukleotidsequenz beinhaltet,
die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mit einem Konstrukt transformierte
Zellen enthält,
das eine der Sequenzen wie vorstehend definiert enthält.
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Die
nächste
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine Verwendung einer transgenen,
mit einem Konstrukt transformierten Pflanze, das eine Nukleotidsequenz
beinhaltet, die die Aminosäuresequenz kodiert,
dadurch gekennzeichnet, dass das chimäre Protein aus einer der Sequenzen
wie vorstehend definiert besteht.
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Die
nächste
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Arzneimittel, enthaltend eine
Pflanzenzelle, umfassend eine die Aminosäuresequenz eines chimären Proteins
kodierende Nukleotidsequenz, oder eine transgene Pflanze, die mit
einer die Aminosäuresequenz
eines chimären
Proteins kodierende Nukleotidsequenz transformierte Zellen enthält, oder
ihre Gewebe oder deren Derivatprodukte und eventuell einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger,
dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des chimären Proteins
aus einer der Sequenzen wie vorstehend definiert besteht. Bevorzugt
ist ein Arzneimittel ein Lyophilisat.
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Die
nächste
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist ein Impfstoff gegen den Leberegel,
enthaltend eine Pflanzenzelle, umfassend eine die Aminosäuresequenz
eines chimären
Proteins kodierende Nukleotidsequenz, oder eine transgene Pflanze,
die mit einer die Aminosäuresequenz
eines chimären
Proteins kodierende Nukleotidsequenz transformierte Zellen enthält, oder
ihre Gewebe oder deren Derivatprodukte und eventuell einen pharmazeutisch
verträglichen
Träger,
dadurch gekennzeichnet, dass die Aminosäuresequenz des chimären Proteins
aus einer der Sequenzen wie vorstehend definiert besteht.
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Bevorzugt
ist der Impfstoff ein Lyophilisat.
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Bevorzugt
ist der Impfstoff ein oraler Impfstoff.
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Die
nächste
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine Pflanzenzelle wie vorstehend
definiert oder eine transgene Pflanze wie vorstehend definiert zur
Verwendung bei der Induzierung von Immunität gegen Leberegelinfektionen
in Säugetieren.
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Bevorzugt
wird die Behandlung oral durchgeführt.
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Der
vorliegenden Erfindung gemäß wurde
die Sequenz, die die Proteinasen kodiert, in Regionen aufgeteilt,
welche die katalytische Domäne
und die Leader-Domäne
des Enzyms kodierenden, weil die Verwendung der ganzen Sequenz,
die die Cysteinproteinase kodiert, die Entstehung eines vollständig aktiven
Enzyms mit seinen hydrolytischen Eigenschaften verursachen könnte, was
Entwicklungsprobleme in Pflanzen hervorrufen könnten. In einer besonderen
Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wurden diese Fragmente mit der Sequenz
fusioniert, welche das HBc-Core Protein (Hepatitis B-Core) des HBV-Virus
kodiert. Solche chimären
Gene wurden unter die Kontrolle des konstitutiven CaMV 35S-Promotors
in dem binären
Vektor ROK2 gestellt, wodurch pMKCROK2 und pMLCROK2 gewonnen wurden.
Zusätzlich
wurden Vektoren unter Verwendung der katalytischen Domäne, fusioniert
mit dem HBc-Core Protein, zusammen mit mehreren Glycinresten hergestellt.
Die katalytische Sequenz wurde auch mit Ubiquitin fusioniert. Diese
Plasmide wurden in Pflanzen unter Verwendung von Verfahren, welche
ihre Integration in das Pflanzengenom ermöglichen, eingeführt.
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Die
angefügten
Figuren ermöglichen
ein besseres Verständnis
der Natur der vorliegenden Erfindung.
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1 stellt
die das Hybridprotein ,HBV-Core Fragment::Leader-Domäne der Cysteinproteinase
des Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Dieses Fragment wurde in den Vektor ROK2 eingebracht,
an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
BamHI und SacI entstanden.
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2 stellt
die das Hybridprotein ,HBV-Core Fragment::katalytische Domäne der Cysteinproteinase des
Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor pIGCmT7 eingebracht,
an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
NdeI und HindIII entstanden.
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3 stellt
die die katalytische Domäne
der Cysteinproteinase des Leberegels kodierende Sequenz dar. Das
Fragment wurde in den Vektor pIGCmT7 eingebracht, an die Stellen,
die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen NdeI und HindIII
entstanden.
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4 stellt
die die katalytische Domäne
der Cysteinproteinase des Leberegels kodierende Sequenz dar. Das
Fragment wurde in den Vektor Bluescript SK(-) eingebracht, an die
Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen BamHI
und HindIII entstanden.
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5 stellt
die die katalytische Domäne
der Cysteinproteinase des Leberegels kodierende Sequenz dar. Das
Fragment wurde in den Vektor Bluescript SK(-) eingebracht, an die
Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen BamHI
und HindIII entstanden.
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6 stellt
die das Hybridprotein ,HBV-Core Fragment::katalytische Domäne der Cysteinproteinase des
Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor ROK2 eingebracht,
an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
BamHI und SacI entstanden.
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7 stellt
die das Hybridprotein ,Ubiquitin::katalytische Domäne der Cysteinproteinase
des Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor ROK2 eingebracht,
an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
XbaI und BamHI entstanden.
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8 stellt
die das Hybridprotein ,HBV-Core Fragment::Leader-Domäne der Cysteinproteinase
des Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor pIGCmT7 eingebracht,
an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
NdeI und HindIII entstanden.
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9 stellt
die die katalytische Domäne
der Cysteinproteinase des Leberegels kodierende Sequenz dar. Das
Fragment wurde in den Vektor pIGCmT7 eingebracht, an die Stellen,
die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen NdeI und HindIII
entstanden.
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10 stellt
die das Hybridprotein ,HBV-Core Fragment::katalytische Domäne der Cysteinproteinase des
Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor pIGCmT7 eingebracht,
an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
NdeI und HindIII entstanden.
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11 stellt
die das Hybridprotein ,HBV-Core Fragment::katalytische Domäne der Cysteinproteinase des
Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor Bluescript SK (-)
eingebracht, an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
EcoRI und HindIII entstanden.
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12 stellt
die das Hybridprotein ,Ubiquitin::katalytische Domäne der Cysteinproteinase
des Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor Bluescript SK (-)
eingebracht, an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
EcoRI und XhoI entstanden.
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13 stellt
die das Hybridprotein ,HBV-Core Fragment::Leader-Domäne der Cysteinproteinase
des Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor ROK2 eingebracht,
an die Stellen, die nach der Verdauung mit den Restriktionsnukleasen
BamHI und SacI entstanden.
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14 stellt
die das Hybridprotein ,HBV-Core Fragment::katalytische Domäne der Cysteinproteinase des
Leberegels' kodierende
Sequenz dar. Das Fragment wurde in den Vektor ROK2 eingebracht,
an die Stellen, die nach der Verdauung mit BamHI und Asp718 entstanden.
Das klonierte Fragment enthält
am Beginn (bis zur EcoRI-Restriktionsstelle) und am Ende (von der
HindIII-Restriktionsstelle) eine aus dem Vektor Bluescript SK (-)
stammende Sequenz.
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15 stellt eine Transformantenanalyse durch
PCR unter Verwendung von spezifischen Oligonukleotidprimern dar.
Bestätigt
werden die Transgene in den Vektoren: a – pMKCROK2, A. tumefaciens LBA4404pMKCROK2,
b – pMLCROK2,
A. tumefaciens LBA4404pMLCROK2, c – A. tumefaciens EHA105MOTUBIKatROK,
d – A.
tumefaciens EHA105MOTGlyKatROK;
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15a: 1-8. A.t LBA4404 pMKCROK2, 9. negative Kontrolle,
10. DNA Standard 1 kbp (Sigma), E. coli pMKCROK2, 18. positive Kontrolle,
pMKCROK2;
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15b: 1-5. A.tLBA4404 pMLCROK2, 6-8. E.coli pMLCROK2,
9. DNA Standard 1 kbp (Sigma), 10. positive Kontrolle pMLCROK2;
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15c: 1-10. A. tumefaciens, EHA105MOTUBIKatROK,
11. positive Kontrolle pMOTUBIKatROK, 12. DNA Standard 1 kbp (Sigma);
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15d: 1-10. A. tumefaciens EHA105MOTGlyKatROK,
11. positive Kontrolle MOTGlyKatROK, 12. DNA Standard 1 kbp (Sigma).
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16 stellt eine PCR-Analyse hinsichtlich
der MotKat-Hybridsequenz – C,
MotLid – C,
MotKatGly – C,
MotKatUbi dar. Es wurden die Primer MotL5 und MotL3 verwendet, welche
für die
Leader-Domäne
spezifisch sind; und Mot5 und MotK3 für die Sequenz der katalytischen
Domäne;
MOTGly5 und MOTGly3 für
die Domäne,
die die Glycerinbrücke
beinhaltet, sowie UBIROCK und MOTKATRO für das die Ubiqutin-Sequenz enthaltende
Konstrukt.
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16a: nicht transformierter Salat 1. – negative
Kontrolle, 2. positive Kontrolle pMKCROK, 3. Wasser – negative
Kontrolle, 5. DNA Standard 1 kbp (Sigma), 6-14. DNA-Proben von transgenen
Pflanzen;
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16b: 1. DNA Standard 1 kbp (Sigma), 2-12. DNA-Proben
von transgenen Pflanzen; positive Kontrolle pMLCROK; Wasser – negative
Kontrolle;
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16c: 1. DNA Standard 1 kbp (Sigma), 2-6. DNA-Proben
von transgenen Pflanzen; positive Kontrolle p35SMOTGlyKatRok;
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16d: 1-4. DNA-Proben von transgenen Pflanzen,
5. positive Kontrolle p35SMOTUBIROK, 6. DNA Standard 1 kbp (Sigma).
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17 stellt die PCR-Analyse der Generation
T1 der transformierten Salatpflanzen für die Anwesenheit von Transgenen
dar: a-MotKat – C,
b-MotLid – C,
c-MotKatGly – C,
d-MotKatUbi;
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17a: 1-14. Genotyp A1, 15. positive Kontrolle,
16. negative Kontrolle, 12. DNA Standard 1 kbp;
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17b: 1-12. Gentyp A1, 14-20. Genotyp A2, 22. positive
Kontrolle, 23. negative Kontrolle, 13, 24. DNA Standard 1 kbp;
-
17c: 1-2. positive Kontrolle, 3. negative Kontrolle,
4. DNA Standard 1 kbp, 5-13. Genotyp A1;
-
17d: 1. DNA Standard 1 kbp, 2-12. Genotyp A1,,
13. negative Kontrolle, 14. positive Kontrolle.
-
18 stellt
einen Western-Blot des Proteinextraktes von dem lyophilisierten
Salat, transformiert mit dem Vektor pMLCROK2, dar, wobei die folgenden
Spuren bedeuten:
- 1. Proteinstandard (Promega)
- 2. Proteinextrakt des Kontrolllyophilisates, nicht transformiert
- 3. Proteinextrakt des Kontrolllyophilisates, nicht transformiert,
mit einer Zugabe von Antigen (100 ng)
- 4. Positive Kontrolle, gereinigtes Hybridprotein, das die Leader-Domäne der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Protein c von HBV (100 ng), enthält
- 5,6. Proteinextrakt des transgenen Lyophilisates, wobei das
markierte Produkt das Antigenprotein mit der Größe 28,8 kDa ist.
-
19 stellt
einen Western-Blot des Proteinextraktes von dem lyophilisierten
Salat, transformiert mit dem Vektor pMKCROK2, dar, wobei die folgenden
Spuren bedeuten:
- 1. Proteinstandard (Promega)
- 2. Proteinextrakt des Kontrolllyophilisates, nicht transformiert
- 3. Proteinextrakt einer Kontrollpflanze, nicht transformiert,
mit einer Zugabe von Antigen (100 ng)
- 4. Positive Kontrolle, gereinigtes Hybridprotein, das die katalytische
Domäne
der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von HBV (100
ng), enthält
- 5,6. Proteinextrakt des transgenen Lyophilisates, wobei das
markierte Produkt das Antigenprotein mit der Größe 43,2 kDa ist.
-
20 stellt
einen Western-Blot des Proteinextraktes von dem lyophilisierten
Salat, transformiert mit dem Vektor p35SMOTUBIROK, dar, wobei die
folgenden Spuren bedeuten:
- 5. Proteinstandard
(Invitrogen)
- 6. Proteinextrakt des Kontrolllyophilisates, nicht transformiert
- 7. Proteinextrakt des Kontrolllyophilisates, nicht transformiert,
mit einer Zugabe von Antigen (100 ng)
- 8. Positive Kontrolle, gereinigtes Hybridprotein, das die katalytische
Domäne
der Cysteinproteinase (100 ng) enthält
- 5,6. Proteinextrakt des transgenen Lyophilisates, transgenes
Lyophilisat, wobei das markierte Produkt das Antigenprotein mit
der Größe 26,8
kDa ist.
-
21 stellt
einen Western-Blot des Proteinextraktes von dem lyophilisierten
Salat, transformiert mit dem Vektor p35SMOTGlyKatRok, dar, wobei
die folgenden Spuren bedeuten:
- 9. Proteinstandard
(Invitrogen)
- 10. Proteinextrakt des Kontrolllyophilisates, nicht transformiert
- 11. Proteinextrakt des Kontrolllyophilisates, nicht transformiert,
mit einer Zugabe von Antigen (100 ng)
- 12. Positive Kontrolle, gereinigtes Hybridprotein, das die katalytische
Domäne
der Cysteinproteinase (100 ng) enthält
- 5,6. Proteinextrakt des transgenen Lyophilisates, wobei das
markierte Produkt das Antigenprotein mit der Größe 48 kDa ist.
-
22 stellt einen ELISA-Immunoenzymtest
dar, um die Antigenexpression in den Salatpflanzen zu bestätigen:
- a) Kontrollpflanzen, in welche die Leader-Sequenz
der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von HBV, eingebracht
wurde, wobei:
c- – Proteinextrakt
von nicht-transgenem Salat
– Proteinextrakt von nicht-transgenem
Salat mit einer Antigenzugabe von 0,5 ng, 1 ng, 2 ng, 3 ng, 8ng
1-12 – Proteinextrakt
von dem transgenen Salat, der das Leader-Fragment der Cysteinproteinase, fusioniert
mit dem Protein c von HBV, enthält.
- b) Kontrollpflanzen, in die die katalytische Sequenz der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Protein c von HBV, eingeführt wurde, wobei:
1-22 – Proteinextrakt
von dem transgenen Salat, der die katalytische Sequenz der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Protein c von HBV, enthält, Proteinextrakt von nicht-transgenem
Salat.
- c) Kontrollpflanzen, in welche die katalytische Sequenz der
Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von HBV mit der
Glycinbrücke
eingeführt
wurde, wobei:
1-9 – Proteinextrakt
von dem transgenen Salat, der die katalytische Sequenz der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Protein c von HBV mit der Glycinbrücke enthält.
c- – Proteinextrat
von dem nicht-transgenen Salat
– Proteinextrakt von dem nicht-transgenen
Salat mit einer Antigenzugabe von 5 ng, 10 ng, 20 ng.
- d) Kontrollpflanzen, in die die katalytische Sequenz der Cysteinproteinase,
fusioniert mit Ubiquitin, eingeführt
wurde, wobei:
1-10 – Proteinextrakt
von dem transgenen Salat, der das Fragment der katalytischen Sequenz
der Cysteinproteinase, fusioniert mit Ubiquitin, enthält
c- – Proteinextrakt
von dem nicht-transgenen Salat
– Proteinextrakt von dem nicht-transgenen
Salat mit einer Antigenzugabe von 5 ng, 10 ng
-
23 stellt einen ELISA-Immunoenzymtest
dar, um die Antigenexpression in dem Salatlyophilisat zu bestätigen:
- a) Analyse des Lyophilisates, das die Sequenz
der Leader-Sequenz der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein
c von HBV, enthält,
wobei:
- – Lyophilisat
des transgenen Salats
- – Lyophilisat
des nicht-transgenen Salats
- – Lyophilisat
des nicht-transgenen Salats mit einer Antigenzugabe von 1,5 ng,
6 ng, 12 ng
- – II
Antikörper – negative
Kontrolle, System ohne den polyklonalen II Antikörper anti-L5
- b) Analyse des Lyophilisates, das die Sequenz der katalytischen
Sequenz der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von
HBV, enthält,
wobei:
- – Lyophilisat
des transgenen Salats
- – Lyophilisat
des nicht-transgenen Salats
- – Lyophilisat
des nicht-transgenen Salats mit einer Antigenzugabe von 1,5 ng,
6 ng, 12 ng
- – II
Antikörper – negative
Kontrolle, System ohne den polyklonalen II Antikörper anti-K4
-
24 stellt
einen ELISA-Immunoenzymtest dar: a – Serum von Labortieren (Mäuse) für die Anwesenheit
der für
verabreichtes Leberegelantigen spezifischen IgG-Antikörper, wobei
das Hybridprotein aus der Leader-Sequenz der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Protein c von HBV, besteht, wobei:
- – m
A die mit dem transgenen Salat gefütterten Mäuse
- – m
E die mit dem nicht-transgenen Salat gefütterten Mäuse
- – m
F Mäuse,
denen Phosphatpuffer verabreicht wurde
-
25 stellt einen ELISA-Immunoenzymtest
dar: a – Serum
und b – Fäzes von
Labortieren (Mäuse) für die Anwesenheit
der für
verabreichtes Leberegelantigen spezifischen Antikörper IgG
(Serum) und IgA (Fäzes),
wobei das Hybridprotein aus der katalytischen Domäne der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Kapsidprotein von HBV, besteht, wobei:
- – m
B die mit dem transgenen Salat gefütterten Mäuse
- – m
E die mit dem nicht-transgenen Salat gefütterten Mäuse
- – m
F Mäuse,
denen Phosphatpuffer verabreicht wurde
-
26 stellt einen ELISA-Immunoenzymtest
dar: a – Serum
und b – Fäzes von
Labortieren (Mäuse) für die Anwesenheit
der für
verabreichtes Leberegelantigen spezifischen Antikörper IgG
(Serum) und IgA (Fäzes),
wobei das Hybridprotein aus der katalytischen Domäne der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Ubiquitin-Protein, besteht, wobei:
- – m
C die mit dem transgenen Salat gefütterten Mäuse
- – m
E die mit dem nicht-transgenen Salat gefütterten Mäuse
- – m
F Mäuse,
denen Phosphatpuffer verabreicht wurde
-
27 stellt einen ELISA-Immunoenzymtest
dar: a – Serum
und b – Fäzes von
Labortieren (Mäuse) für die Anwesenheit
der für
verabreichtes Leberegelantigen spezifischen Antikörper IgG
(Serum) und IgA (Fäzes),
wobei das Hybridprotein aus der katalytischen Domäne der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Kapsidprotein von HBV und den Glycinresten, besteht,
wobei:
- – m
D die mit dem transgenen Salat gefütterten Mäuse
- – m
E die mit dem nicht-transgenen Salat gefütterten Mäuse
- – m
F Mäuse,
denen Phosphatpuffer verabreicht wurde
-
28 stellt
das Bakterienexpressionsplasmid pIGCmT7 (4056 pb) dar, das in Anlehnung
an das Plasmid pIGDM1' entstand,
das ein Plasmid aus der Gruppe ColE1 von Enterobacter agglomerans
ist. Das Plasmid pIGCmT7 entstand durch das Einbringen eines Resistenzgens
gegen Chloramphenikol, eines Polylinkers zusammen mit einem T7 RNA-Polymerasepromotor
und einer Sequenz, welche ein Transkriptionsstoppcodon von Phage
T7 kodiert, wobei:
ARG t-RNA – Arginin-tRNA-Gen für die Codons
AGA und AGG
ORI – Ursprung
der Replikation des Plasmids pPIGDM1
Cm-R – Resistenzgen gegen Chloramphenikol
T7 – Promotor
stop – Transkriptionsstopp.
-
29 stellt
das Pflanzenexpressionsplasmid ROK2 dar, wobei:
RB – rechte
flank. Sequenz
LB – linke
flank. Sequenz
pNOS – Nos-Promotor
NPT
II (Kanamycin R) – Resistenzgen
gegen Kanamycin
tNOS – Nos-Terminator
pCaMV
35S – Promotor
des Blumenkohl-Mosaikvirus
-
Nachfolgend
werden Beispielausführungsformen
der oben definierten Erfindung präsentiert.
-
Ausführungsform
1. Konstruktion von Vektoren für
Pflanzentransformation
-
Die
erste Variante betrifft die Konstruktion des Vektors pMKC35SROK,
der die Sequenz der katalytischen Domäne der Cysteinproteinase, fusioniert
mit der das HBc-Protein von HVB kodierenden Sequenz, enthält.
-
Die
zweite Variante betrifft die Konstruktion des Vektors pMLC35SROK,
der die Sequenz der Leader-Domäne
der Cysteinproteinase, fusioniert mit der das HBc-Protein von HBV
kodierenden Sequenz, enthält.
-
Die
dritte Variante betrifft die Konstruktion des Vektors p35SMOTKatUBIROK,
der die Sequenz der katalytischen Domäne der Cysteinproteinase, fusioniert
mit der Ubiquitin kodierenden Sequenz, enthält.
-
Die
vierte Variante betrifft die Konstruktion von p35SMOTGlyKatROK,
der die Sequenz der katalytischen Domäne der Cysteinproteinase, fusioniert
mit der Ubiquitin und Glycinreste kodierenden Sequenz, und von Glycinresten
enthält.
-
Die
in Glycerol suspendierten und in einem Ultragefrierschrank (Temperatur
-70°C) aufbewahrten
Bakterien wurden in einem Eisbad entfrostet. Zu den in dieser Weise
gewonnen Bakterien wurden 1 bis 20 ng Plasmid-DNA gegeben, es wurde
leicht gerührt
und im Eisbad 2 bis 6 min inkubiert. Die Bakterien wurden dann in eine
abgekühlte
Küvette
für Elektroporation überführt. Die
Küvette
wurde in einen Elektroporationsapparat gestellt und ein elektrischer
Strom wurde eingeschaltet. Die Elektroporationsparameter waren 25 μF und 2500
V. Nach der Elektroporation wurden die Bakterien in 1 ml SOC-Medium
suspendiert und in Kolben überführt. Die Bakterien
wurden 1 bis 2 Stunden lang bei 28°C, 50 bis 60 UpM geschüttet. Nach
der Inkubation wurde die Suspension in YEB-Medien mit den folgenden
Antibiotika: Rifampicin 100 mg/l und Kanamycin 50 mg/l überimpft
und 2 Tage lang bei 28°C
kultiviert.
-
Eine
Vorselektion von transformierten Zellen wurde in einem Medium, welches
die Selektionsfaktoren Rifampicin 100 mg/l und Kanamycin 50 mg/l
enthielt, durchgeführt.
Die zweite Methode war eine Visualisierung der Region der eingebrachten
DNA durch ihre Amplifizierung mithilfe von PCR (an aufgekochten
A. tumefaciens-Zellen 10 min. lang in 150 μl Wasser) unter der Verwendung
von spezifischen Oligonukleotidprimern.
-
Die
gewachsenen Agrobakterien wurden in 10 ml flüssiges YEB-Medium mit den Selektionsfaktoren: Kanamycin
50 mg/l und Rifampicin 100 mg/l in Erlenmeyerkolben überimpft
und bei 28°C
kultiviert. Nach 16 bis 20 Stunden der Kultivierung der Suspension
der Agrobakterien wurde in frisches YEBK50,R100-Medium
1:100 überimpft
und es wurde ferner bei 28°C
kultiviert, bis die Bakterien die logarithmische Stufe des Wachstums erreicht
hatten. Die Bakterienwachstumsphase wurde aufgrund der OD der Suspension
bei einer Wellenlänge von
600 nm abgeschätzt.
-
Ausführungsform
2. Transformation und Herstellung von transgenen Pflanzen
-
Tabelle 1. Die Varianten von durchgeführten Experimenten
| Experiment-variante | Stamm
des Agrobacteriums | Salatsorte |
| LT-12 | A.
tumefaciens LBA4404 pMKC35SROK | Syrena |
| LT-13 | A.
tumefaciens LBA4404 pMLC35SROK | Bipp
Burple |
| LT-14 | A.
tumefaciens EHA105MOTUBIROK | Aramir |
| LT-15 | A.
tumefaciens EHA105MOTGlyKatROK | Aramir |
-
Das
Material wurde in Kolben gesammelt und dann 2 min lang in 70 %igem
Ethanol gespült.
Dann wurde das Ethanol entfernt und die Samen wurden mit sterilem
Wasser gespült.
In einer weiteren Stufe wurden die Samen 20 min. in einer 25 %igen
kommerziellen Bleichmittellösung,
Clorox mit einer Zugabe von Tween 20 (mit einer Konzentration von
0,01 %) inkubiert. Nach der erforderlichen Sterilisationszeit wurde
das Material 4 bis 5 Mal mit sterilem destilliertem Wasser für 2 bis
3 Minuten gewaschen, bis Clorox ganz ausgespült worden war. Die sterilisierten
Salatsamen wurden auf Schalen mit 0,8 % Agar ausgelegt. Die Samen
keimten bei einer Temperatur von 22 bis 24 °C bei schwacher Beleuchtung.
Nach 2 bis 3 Tagen wurden die Blätter
abgeschnitten und in die Suspension von A. tumefaciens gegeben und
10 min. unter leichtem Mischen inkubiert. Nach der Überimpfung
wurden die Blätter
bauchseitig auf das LR3A-Medium gelegt. Die Cokultur wurde 2 bis
4 Tage in der Dunkelheit bei 28°C
durchgeführt.
Nach der Beendigung der Cokultur wurden die Blätter in das Selektionsmedium
LR3A, welches die Antibiotika Kanamycin mit 200 mg/l und Augmentin
mit 300 mg/l enthielt, überführt.
-
Die
Blätter,
auf denen ein Kallus entstand, wurden alle 5 Tage in ein frisches
LR3A-Medium mit den Antibiotika Kanamycin mit 200 mg/l und Augmentin
mit 300 mg/l überführt. Die
sich regenerierenden Pflanzen wurden vom Kallus abgeschnitten und
wurden in das LR2A-Medium
mit den Antibiotika Kanamycin mit 200 mg/l und Augmentin mit 300
mg/l verpflanzt. Nachdem die Pflanzen eine Größe von etwa 2 bis 3 cm erreicht hatten,
wurden sie in Gläser überführt, die
das 1/2SH-Medium mit den Antibiotika Kanamycin mit 200 mg/l und Augmentin
mit 300 mg/l enthielten. Verwurzelte Pflanzen wurden in Töpfe eingepflanzt,
die mit Perlit im Verhältnis
1:1 vermischten sterilen Sand enthielten, und wurden auf in-vivo-Bedingungen adaptiert.
-
Samen
von den Primärtransformanten
wurden sterilisiert und in Petrischalen gegeben, die 0,8 % Agar mit
den Antibiotika Kanamycin mit 200 mg/l und Augmentin mit 300 mg/l
enthielten. Die Samen keimten 1 bis 2 Tage lang bei der Temperatur
von 28°C
in Dunkelheit. Die sich aus den Samen entwickelnden Saatpflanzen wurden
in Töpfe
und in vivo-Bedingungen überführt.
-
Pflanzenregeneration
-
Tabelle 2. Bedingungen für die Pflanzenregeneration
| Pflanzenkultur,
in vitro, Kulturraum | Pflanzenkultur,
in vitro, Treibhaus |
| – Temperatur
22 bis 24°C
– Fotoperiode
16/8
– Fluoreszenz-Beleuchtungsstärke ca.
3000 Lux | – Temperatur
18 bis 22°C
am Tag, 14-18°C
in der Nacht
– Fotoperiode
14/10 (14 h Licht und 10h Dunkelheit) in der Herbst-Winter-Periode
und die natürliche
Beleuchtung im Frühling
und Sommer
– Dünger: Stickstoffphosphat |
-
Ausführungsform
3. Expression und Analyse.
-
Analyse von transformierten
Bakterien
-
Eine
anfängliche
Selektion von Transformanten wurde in einem Medium mit der Zugabe
von Selektionsfaktor durchgeführt,
wobei eine Resistenzfaktor-DNA eingebracht wurde (Rifampicin 100
mg/l und Kanamycin 50 mg/l).
-
Die
nächste
Stufe war die Analyse von Transformanten mithilfe von PCR unter
Verwendung von spezifischen Oligonukleotidprimern. Tabelle 3. Oligonukleotidprimer, verwendet
für die
PCR und Sequenzierung.
| Gen | Primer | Primersequenz | t° Annealing, °C | Produktgröße, pb |
| MotLidC | MOTL5 | GGA
TCC ATA TGT CGA ATG ATG ATT TG | 65 | 240 |
| MOTL3 | ATA
CGA TTG TTC GTC TCA TAC GGG A | 65 | |
| MotKatC | MOT5 | TGA
CTG GCG TGA ATC TGG TTA TG | 65 | 546 |
| MOTK3 | TTC
CAC ACA TGT TAC CTC GAT TCC | 65 | |
| MotKatGly | MOTGly5 | GAA
TTT GGA GCT ACT GTG GAG | 58 | 1170 |
| MOTGly3 | AGC
TTA AAC AAC AGT AGT CTC CG | 58 | |
| MotKatUbi | UBIROCK | GGG
GTC TAG ACC ATG CAG ATT TTC GTC AAA ACT TTG | 100 | 912 |
| MOTKATRO | GGG
GAP CCT TAA TGG ATG CCG GAA ATC GTG CC | 100 | |
-
Die
Bestätigung
der Anwesenheit von Transgenen in einem Vektor: a – pMKCROK2,
A. tumefaciens LBA4404pMKCROK2, b – pMLCROK2, A. tumefaciens
LBA4404pMLCROK2, c – A.
tumefaciens EHA105MOTUBIKatROK, d – A. tumefaciens EHA105MOTGlyKatROK
wird in 15 dargestellt.
-
Die
Analyse der Hybride der Generation T0 mithilfe von PCR.
-
Die
resultierenden transgenen Pflanzen wurden hinsichtlich der Anwesenheit
der Hybridsequenz: MotKat – C,
MotLid – C,
MotKatGly – C
und MotKatUbi mithilfe von PCR analysiert. Die verwendeten Primer
waren: MotL5 und MotL3, spezifisch für die Leader-Domäne, Mot5
und MotK3 für
die katalytische Domäne,
MOTGly5 und MOTGly3 für
die Glycinbrücke
enthaltende Domäne,
und UBIROCK und MOTKATRO für
das Ubiquitin enthaltende Konstrukt.
-
Eine
Analyse von transformierten Salatpflanzen hinsichtlich der Anwesenheit
von Transgenen: a-MotKat – C,
b-MotLid – C,
c-MotKatGly – C
und d-MotKatUbi wird in 16 dargestellt.
-
Die
weitere Stufe war die Herstellung einer genetisch homologen T1-Transformantengeneration.
Es wurden 10 Samen aus 5 Linien der Transformanten F0 ausgewählt und
danach wurden die Pflanzen mithilfe von PCR hinsichtlich der Anwesenheit
der Sequenzen der eingeführten
Gene analysiert. Die Analyse der T1-Generation der transformierten
Salatpflanzen auf die Anwesenheit von Transgenen: a-MotKat – C, b-MotLid – C, c-MotKatGly – C und
d-MotKatUbi wird in 17 dargestellt.
-
Immunologische Analyse der resultierenden
Ti-Transformanten.
-
Dank
der Verwendung von immunologischen Verfahren ist die Bestimmung
des Proteinexpressionsniveaus möglich.
-
Die
Hybridproteine können
unter Verwendung von monoklonalen anti-C-Antikörpern und polyklonalen anti-MotKat-
und anti-MotLid-Antikörpern
in einem Western-Blot oder einem Sandwich-ELISA nachgewiesen werden.
-
Die
Proteine wurden für
Western-Blotting aus Lyophilisaten isoliert. Das Ergebnis war positiv,
was die Anwesenheit der Proteine in den Pflanzen bedeutete [18, 19, 20, 21].
-
Die
Western-Analyse ist kein Verfahren, mit dessen Hilfe man die Proteinmenge
genau abschätzen kann.
Außerdem
kann das Protein Fragmentierung oder Aggregation unterliegen, wodurch
die positive Kontrolle nicht zu einer klaren Bande führte. Wir
müssen
auch die Tatsache in Betracht ziehen, dass das in eine Pflanze eingeführte Protein,
ein chimäres
Protein ist, das außer
der Leberegeldomäne
auch ein Virusprotein beinhaltet. Dieses Protein kann Strukturen
bilden, die einem Viruskapsid ähnlich
sind. Deshalb, obwohl die Western-Analyse unter denaturierenden
Bedingungen verläuft,
bleibt ein Teil der Domänen
verbunden, und es entstehen zusätzliche
Signale in der Form einer erhöhten
Anzahl von Banden.
-
Ein
spezifischer ELISA-Test wurde für
die genaue Bestimmung des Antigengehalts in dem Pflanzenmaterial
verwendet.
-
Die
Maxisorp (nunc)-Platte mit Mikrovertiefungen wurde mit monoklonalem
anti-c (Mab zu HBc Ag)-Antikörper,
suspendiert in einem Carbonatpuffer, pH-Wert = 9,6, in einer Verdünnung von
1:5000, beschichtet und bei 37°C
drei Stunden lang inkubiert. Dann hat man dreimal mit Phosphatpuffer
PBS, pH-Wert = 7,4, mit 0,05 % Tween 20 gewaschen. Weiter hat man
eine Blockierung der Platte mit 5 % entfetteter Milch, die in PBS
gelöst
worden war, 390 μl
pro Vertiefung, durchgeführt.
Nach 30 Minuten hat man, dem vorigen Schema gemäß, die Platte gewaschen und
mit E2-Antigen beschichtet. Diese Versuchsphase hat man in der Nacht
bei 4°C
durchgeführt.
Dann hat man wieder die Platte gewaschen und mit den polyklonalen
Kaninchenantikörpern,
die jeweils gegen die Leader- oder katalytische Domäne der Cysteinproteinase
des Leberegels gerichtet sind, suspendiert in PBS-Puffer, 100 μl/Vertiefung
bei einer Verdünnung
von 1:1000 oder 1:2000, beschichtet. Man hat die Platte bei einer
Temperatur von 37°C
eine Stunde lang bei 100 UpM inkubiert und dann gewaschen und mit
monoklonalem anti-Maus-IgG (ganzes Molekül), welches mit alkalischer
Phosphatase (Sigma) gekoppelt ist, suspendiert in PBS-Puffer, 100 μl/Vertiefung
bei einer Verdünnung
von 1:20000, beschichtet. Die Stufe wurde bei 37°C für 1 Stunde durchgeführt. Danach
löste man
die Farbbildungsreaktion aus, durch Zusatz des Substrates (INC):
2-Amino-2-methyl-1,3-propandiol
(10-fach konzentriert) und einer Wasserlösung von p-Nitrophenylphosphat
(50-fache Konzentration), wobei mit MQ-Wasser auf das gewünschte Volumen
aufgefüllt
wurde. Das Substratvolumen pro Vertiefung betrug 100 μl. Man inkubierte
im Dunkeln 30 Minuten lang. Das Auslesen der Reaktion wurde bei λ=405 nm mit
Hilfe eines Plattenlesegeräts
BioRad Modell 550 durchgeführt.
-
Die
Pflanzen der Generation T1 (T1-Transformanten) wurden unter Verwendung
von ELISA auf das Vorhandensein der Hybridproteine analysiert, um
die Pflanzen auszuwählen,
welche die höchste
Expression aufweisen. Nur im Falle der Pflanzen mit der höchsten Expression
des Antigens hat man die Menge vergrößert [22a, 22b, 22c, 22d].
-
Das
Ergebnis des ELISA-Tests zeigt, dass es nicht bei allen Pflanzen
zu einer Proteinexpression kommt, obwohl man auf dem DNA-Niveau
bestätigt
hat, dass sie transgene Pflanzen sind. Es ist also angebracht, bevor
man das Material für
die Lyophilisation sammelt, die Pflanzen immunologisch zu testen.
Dies wird die Eliminierung von den Pflanzen ermöglichen, die ein schwaches
Signal aufweisen, und damit die Konzentration des Antigens im Lyophilisat „verdünnen".
-
Die
Blätter
der Pflanzen, die im ELISA-Test das stärkste Signal ergaben, hat man
gesammelt und lyophilisiert, um das Material zu verdichten. Das
resultierende Material, das in zwei experimentellen Varianten entstanden
ist und das als ein Antigen eine Leader- oder katalytische Domäne, fusioniert
mit dem Protein c von HBV enthält,
wurde mit ELISA getestet, um das Niveau an Antigen für eine weitere
Analyse zu bestimmen [23a, 23b].
-
Die
durchgeführten
Tests zeigen, dass es möglich
ist, durch Auswahl der Pflanzen ein hohes Niveau des Antigens in
dem Lyophilisat zu erreichen. Der spezifische immunologische Test
ermöglichte
die Bestimmung des Antigenniveaus in den Lyophilisaten und die Planung
der experimentellen Immunisierung von Tieren. Wie der ELISA-Test
zeigt, beträgt
das Antigenniveau ungefähr
10 μg in
1 g des Lyophilisates, welches die Leader-Domäne des Gens der Cysteinproteinase,
fusioniert mit dem Protein c von HBV, beinhaltet, und 12 μg des Antigens
in 1 g des Lyophilisates, welches die katalytische Domäne des Gens
der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von HBV, beinhaltet.
Da die Lyophilisation das Antigen etwa 3-fach „konzentriert", ist es zulässig, dass
die Menge an Antigen in 1 g Lyophilisat, welches die katalytische
Domäne
des Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von
HBV und der Glycinbrücke,
beinhaltet, auf etwa 50 μg
ansteigen kann, und dass die Menge an Antigen in 1 g Lyophilisat,
welches die katalytische Domäne
des Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit Ubiquitin, beinhaltet,
etwa 20 μg
beträgt.
-
Ausführungsform
4. Immunisierung der Mäuse
mit Hilfe des transgenen Materials-Salatlyophilisat
-
1. Gruppen der Mäuse
-
In
dem Experiment hat man 10 Wochen alte Weibchen der Balb/C-Variante
eingesetzt. Man hat die Tiere unter sterilen Bedingungen in isolierten
Käfigen
gezüchtet,
wobei autoklaviertes Wasser und Futter gegeben wurden. Man hat 6
Probegruppen mit jeweils 8 Mäusen
gebildet:
- A – die Gruppe, die Lyophilisat
mit Antigen bekommen hat – Hybridprotein,
das aus der Leader-Domäne des
Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von HBV,
besteht
- B – die
Gruppe, die Lyophilisat mit Antigen bekommen hat – Hybridprotein,
das aus der katalytischen Domäne
des Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von
HBV, besteht
- C – die
Gruppe, die Lyophilisat mit Antigen bekommen hat – Hybridprotein,
das aus der katalytischen Domäne
des Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von
HBV und der Glycinbrücke,
besteht
- D – die
Gruppe, die Lyophilisat mit Antigen bekommen hat – Hybridprotein,
das aus der katalytischen Domäne
des Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit Ubiquitin, besteht
- E – die
Gruppe, die Lyophilisat eines nicht-transgenen Salats bekommen hat – die Sorten
Bipp Burple, Syrena oder Aramir
- F – die
Gruppe, die PBS-Pufferlösung
bekommen hat.
-
2. In der Analyse verwendetes Pflanzmaterial.
-
Das
Lyophilisat von den Salatblättern
der Sorten Bipp Burple, Aramir und Syrena, welches das chimäre Protein – Leader-Domäne des Gens
der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von HBV (Sorte Bipp
Burple) enthält,
das Lyophilisat von den Salatblättern,
welches die katalytische Domäne
des Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von
HBV (Sorte Syrena), beinhaltet, das Lyophilisat von den Salatblättern, welches
die katalytische Domäne
des Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit dem Protein c von
HBV und der Glycinbrücke
(Sorte Aramir), beinhaltet, und das Lyophilisat von den Salatblättern, welches die
katalytische Domäne
des Gens der Cysteinproteinase, fusioniert mit Ubiquitin (Sorte
Aramir) beinhaltet. Als eine Kontrolle hat man die Lyophilisate
von nicht-transgenen Salaten derselben Sorte wie die transgene Sorte verwendet.
Das Pflanzenmaterial hat man in einem PBS-Puffer suspendiert, wobei
eine halbflüssige
Pulpe entstanden ist (250 μl),
deren Viskosität
eine einfache Verabreichung ermöglichte.
Das Pflanzenmaterial wurde von den Tieren gut vertragen.
-
3. Verabreichung des Antigens.
-
Das
Lyophilisat wurde oral unter Verwendung einer Magensonde verabreicht.
Zwölf Stunden
vor der Immunisierung hat man das Futter der Tiere entfernt.
-
4. Immunisierungsschema:
-
- a) Die immunisierten Gruppen A, B, C und D
haben Lyophilisate aus transgenem Salat bekommen. Die Kontrollgruppe
E hat ein Lyophilisat aus nicht-transgenem Salat bekommen und die
Gruppe F hat PBS-Pufferlösung
bekommen.
- b) Zweifache Immunisierung mit einem dreißigtägigen Abstand.
- c) Die Dosis von jedem Immunogen pro geeigneter Gruppe der Mäuse betrug:
-
Antigendosis:
-
- 1 g des Lyophilisates enthielt:
- MLC – 10 μg des Antigens
- MKC – 12 μg des Antigens
- MKCGly – nicht
bestimmt, ca. 50 μg
- MKCUbi – nicht
bestimmt, ca. 20 μg
-
Den
Mäusen
verabreichten wir etwa 100 ng des Antigens (entsprechend: 10 mg
des MLC-Lyophilisates
und 8,3 g des MKC-Lyophilisates; und 10 mg MKCGly und MKUbi), suspendiert
in 250 μl
PBS. Nach der Immunisierung wurde das Futter für 12 Stunden entfernt.
-
5. Sammeln von Material der Tiere.
-
150 μl Blut werden
aus dem periorbitalen Nodus unter Verwendung eines Kapillarröhrchens
vor dem Experiment und an den Tagen 14, 30 und 45 während dem
Experiment gesammelt. Fäzesproben
werden vor der Immunisierung und an den Tagen 1, 14, 30 und 45 des
Experiments gesammelt.
-
6. Vorbereitung des Materials für die Analyse.
-
BLUT:
-
- a) direkt nach dem Sammeln wurde in Eppendorfröhrchen bei
4°C, 3000
UpM für
20 min zentrifugiert,
- b) das abgetrennte Serum wurde bei -20°C bis zum Zeitpunkt der Bestimmung
vorgehalten
-
FÄZES:
-
- a) das gesammelte Material wurde in PBS in
einem Verhältnis
von 1:5 mit Hilfe eines Polypropylenstößels homogenisiert,
- b) es wurde 10 min bei 4°C
mit 12 UpM zentrifugiert,
- c) der Überstand
wurde abgetrennt und für
eine weitere Analyse bei -20°C
gelagert.
-
7. Immunologische Analyse.
-
Die
gesammelten Proben wurden nach dem Auftauen zur Durchführung von
Tests unter Verwendung eines hochempfindlichen ELISA verwendet.
- a) Eine Polysorp-Platte (Nunc) hat man mit
Antigen E2, 0,5 μg/ml
in PBS mit 50 μl/Vertiefung
beschichtet,
- b) die Platte wurde bei 4 °C über Nacht
inkubiert,
- c) sie wurde dreimal in PBS mit Tween (0,05 %), pH-Wert 7,4,
gewaschen,
- d) es wurde mit 5 % entfetteter Milch in PBS, 390 μl/Vertiefung,
für 30
min. bei Raumtemperatur blockiert,
- e) waschen wie in Punkt c,
- f) Serumproben wurden in geeigneten Gradientenverdünnungen
verwendet, 50 μl/Vertiefung,
- g) 2 Stunden wurde bei 37°C
und mit einer Rotation von 60 UpM inkubiert,
- h) waschen wie in Punkt c,
- i) Inkubation mit Antikörpern
anti-Maus IgG und IgA, konjugiert mit alkalischer Phosphatase oder
Peroxidase, 100 μl/Vertiefung.
Die Antikörperverdünnung war
1:2000 und die Inkubationszeit betrug 1,5 Stunden bei 37°C und einer
Rotation von 60 UpM,
- j) waschen wie in Punkt c,
- k) Inkubation mit Substraten für Peroxidase oder alkalische
Phosphatase, 100 μl/Vertiefung,
1 Stunde in Dunkelheit bei Raumtemperatur,
- l) die Reaktion wurde mit 1 M Schwefelsäure abgestoppt,
- m) die Reaktion wurde mit einem BioRad-Plattenlesegerät Modell
550 bei λ=405
nm ausgelesen.
-
Die
Analyse des Niveaus der anti-Leberegelantikörper, IgG in Serum und IgA
in Fäzes,
in den Tieren, die mit Lyophilisaten aus transgenen Salatblättern immunisiert
worden waren, zeigt die Anwesenheit der spezifischen Antikörper zu
dem verabreichten Antigen – ein
Protein mit katalytischer oder Leader-Domäne der Cysteinproteinase des
Leberegels Fasciola hepatica. Man kann also sicher annehmen, dass
die Verabreichung des Pflanzenmaterials, das immunogene Hybridproteine
beinhaltet, eine Immunreaktion auslöst. Das Verabreichungsverfahren
mit Futter führt
nicht zur Inaktvierung oder Zerstörung der immunogenen Moleküle, was die
zukünftige
Impfung der Tiere vereinfachen kann. SEQUENZAUFLISTUNG
