KR100268714B1 - 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 당뇨병 유전자 이식 마우스에 관한 것으로 인간 인슐린 유전자 프로모터에 열충격 단백질(Hsp) 유전자가 융합된 당뇨병 발생 유전자를 마우스에 이식하여 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스를 제공한다. 혈중 포도당의 농도가 300mg/dl 이상인 인슐린 비의존성의 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스 주(transgenic mice line)을 얻을 수 있으며, 이는 당뇨병 질환의 모델 개발과 당뇨병 발생 기전의 규명, 치료제의 개발 및 새로운 약의 검정 시스템 등의 연구 분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
Description
제1도는 인슐린 프로모터의 조절하에서 인간 역충격 단백질이 70이 발현되도록 구축한 유전자의 개략적인 묘사도 이며,
제2도는 인간 열충격 단백질 70 유전자 발현벡터(pINS/HSP)의 개략적인 구축 방법에 관한 것이다.
제3도는 유전자 이식 마우스의 꼬리 DNA를 PCR에 의해 분석한 결과이고,
제4도는 유전자 이식 마우스의 포도당 부하실험 결과를 도시한 것이며,
제5도는 정상 마우스와 유전자 이식 마우스의 췌장 조직을 사진 촬영한 것이다.
본 발명은 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스에 관한 것으로, 좀더 상세하게는 열충격 단백질(Hsp)이 인슐린 프로모터의 조절하에서 발현되도록 하는 유전자를 마우스에 이식하여 생산되는 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스에 관한 것이다.
유전자 이식 마우스는 특정 유전자 조각을 마우스의 수정란에 미세주입, 이를 다른 쥐의 자궁에 착상시켜 출산시킨 후, 3주정도 지난 마우스의 꼬리 DNA를 검사하여 외부에서 넣어준 유전자가 마우스 세포내 DNA에 성공적으로 삽입되었는가를 확인하는 과정을 거쳐 탄생된다. 유전자 이식 마우스는 유전자의 기능을 생체내에서 알아볼 수 있는 방법으로서 인체 각종 질환의 모델 개발과 이에 따른 각종 치료제의 개발 및 마우스의 몸을 생체공장으로 만드는 유전자 농장(bio-reactor) 등이 기대되는 분야이다.
현재 암과 같은 유전적 문제(genetic problem)에 대한 접근방법으로 유전자 이식 마우스 기술에 의한 새로운 모델이 개발되고 있으며, 이미 미국 하버드 대학의 P.Leder 교수에 의한 c-myc 암유전자가 삽입된 유전자 이식 마우스의 개발 성공은 인체 백혈병의 모델이라는 점에서 큰 주목을 받고 있으며, 살아있는 생명에 대해 세계에서 최초로 특허를 획득하였다.(미국특허 제 5,087,571호), 그 후, Philip Leder등이 발명한 전립선이 비대해진 수컷 마우스(미국특허 제5,175,383호), Paulus J.A.Krimpenfort 등이 발명한 성숙 T-세포가 생성되지 않는 마우스(미국특허 제5,175,384호) 및 Thomas E, Wagner등이 발명한 인간 베타 인터페론을 생산하는 마우스(미국특허 제 5,175,385호)등이 소개된 바 있다.
인슐린은 췌장 소도의 β세포에서 분비되어 혈액중에 포도당량을 제어하는 역할을 담당하는 호르몬이다. 당뇨병은 효과적인 인슐린의 부적절한 공급으로 인해 탄수화물, 지방 및 단백질의 대상에 장애를 일으키는 대사성 질환으로서 유전의 확률이 매우 높은 질병이다. 당뇨와 그 합병증으로 인한 사망은 미국의 3대 사망원인중의 하나이며 미국 국민의 5%가 당뇨환자일정도로 당뇨병은 세계에서 가장 흔한 병중의 하나이고 지금도 계속 증가 일로에 있다.
당뇨병은 크게 인슐린 의존성 당뇨병(type I)과 인슐린 비의존성 당뇨병(type Ⅱ)으로 나누어 볼 수 있는데 인슐린 의존성은 자가면역기전에 의해 또는 손상된 후 β-세포가 재생이 안되어 체내에서 생산되는 인슐린의 양이 극히 적어지므로 반드시 외부에서 생산된 인슐린의 공급을 필요로 하며, 대개 젊은 사람에게서 발병하는 반면, 인슐린 비의존성 당뇨병은 체내에서 적정 또는 과잉의 인슐린이 분비되나, 인슐린 수용체의 부족과 조직 내에 있어서 인슐린 결합의 감소로 인해 발병하며 매우 느린 속도로 발병하고 증상이 비교적 경미한 편이다. 또한 인슐린 의존성 당뇨병은 전체 당뇨병 환자중 5-10%에 불과하고 나머지는 인슐린 비의존성 당뇨병에 해당한다.
한편, 열충격 단백질(Hsp)은 세포의 손상을 회복시키는데 중요한 단백질로서, 열충격이나 스트레스 상태에서 발현되며, 배형성시, 세포분화 및 세포 싸이클의 특정단계에서 발현된다.
본 발명자들은 췌장소도의 β세포의 분화에 열충격 단백질(Hsp)의 발현이 미치는 영향을 연구하던중 인간인슐린 유전자 프로모터에 인간 열충격 단백질(Hsp)의 유전자가 재조합된 유전자를 마우스에 이식시키는 경우, 당뇨병이 발생된다는 점에 착안하여 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명은 인간인슐린 유전자 프로모터에 인간 열충격 단백질(Hsp)유전자가 융합된 당뇨병 발생 유전자를 마우스에 이식하여 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스를 제공하는데 있다.
본 발명은 췌장 소도의 β세포에서 열충격 단백질(Hsp)이 발현되도록 하기 위해 인간 인슐린 프로모터와 열충격 단백질(Hsp)유전자의 전체 코딩영역으로 구성된 유전자(제1도)를 구축한 뒤, 수정된 난자에 유전자를 미세주사하여 시조 유전자 이식 마우스(founder transgenic mouse)를 얻고 미세주사한 당뇨병 발생 유전자가 삽입된 것을 확인한 후 교배가 가능한 마우스를 이용한 F1 유전자 이식 마우스(F1 transgenic mouse)를 생산하는 것으로 구성된다.
상기와 같은 기술적 조작을 행하므로서 혈중 포도당의 농도가 300mg/dl 이상인 인슐린 비의존성의 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스주(transgenic mice line)를 얻을 수 있었으며, 이는 당뇨병 질환의 모델 개발과 당뇨병 발생 기전의 규명, 치료제의 개발 및 새로운 약의 검정 시스템 등의 연구분야에서 유용하게 이용될 수 있다.
이하, 실시예에서는 본 발명을 구체적으로 설명하나 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.
[실시예]
[단계 1] 인간 열충격 단백질(Hsp)유전자 발현벡터의 구축
인간 열충격 단백질(Hsp)을 얻기 위해 pH2.3(Hunt, C＆ Morimoto, R.I., 1985, Proc, Natl. Acad. Sci. 82)을 Bam HI와 Hind Ⅲ 제한 효소로 잘라 0.8% 아가로스 겔에서 전기영동하여 2.3kb의 DNA 절편을 얻었다. 이 2.3kb의 절편을 DEAE-셀룰로즈 멤브레인(DEAE-cellulose membrane)을 이용하여 통상적인 방법으로 정제하였다(Sambrook 등, Molecular cloning, 제2판, 6.24-6.27).
pSP651INS(N.Sarvetnick et al., 1983, Cell vol. 52, 773-7882)도 Eco RI와 Bam HI 제한 효소로 잘라 동일한 방법으로 1.8kb의 인간 인슐린 프로모터를 정제하였다. 이렇게 얻은 두가지 절편을 Boehringer Mannheim사의 T4 DNA 리가제(ligase)를 사용하여 통상적인 방법대로 리게이션(ligation)하여 (Sambrook 등, Molecular cloning, 제2판, 1.68-1.69), 4.1kb의 절편을 얻은 후(제1도 참조), Promega로부터 구입한 pSP65의 Eco RI와 Hind Ⅲ 제한 효소 위치에 클로닝하여 pINS/HSp를 제조(제2도 참조)하였다. 이어서 이를 CaCl2를 이용한 통상의 방법(Sambrook 등, Molecular cloning, 제2판, 1.82-1.84)으로 형질전환하여 HB 101 E.coli에 보관하였다.
미세주사용 DNA용액을 제조하기 위해 상기 보관중인 E, coli를 암피씰린(ampicilline)을 함유한 LB배지(1% Bactotrypton, 0.5% Yeast Extract, 1% NaCl)에 접종하고, 밤새 37℃에서 배양한 다음, 자란 균을 2,000g에서 10분간 원침하여 모으고 이를 50mM glucose, 10mM Tris- Cl, 1mM EDTA, 4mg/ml 1ysozme 용액에 녹인 후 얼음위에서 5분간 방치하였다. 다시 0.2 N NaOH, 1% SDS 용액을 2 volume 넣고 조심스럽게 섞은 다음 5분간 상온에 방치한 뒤, 이 반응액을 5M 의 potassium acetate 용액을 0.5 volume 넣고 얼음에 5분간 둔 후에 12,000g에서 10분간 원침하여 상층액을 얻었다. 상층액을 페놀과 페놀/클로로포름/아이소아밀 알콜(25:24:1)로 2-3회 추출하고, 0.1 volume의 3M sodium acetate와 2 volume의 에탄올을 넣어 플라스미드 DNA를 침전시켰다. 침전된 DNA를 다시 TE 완충액(10mM Tris-Cl, pH 8.0/1 mM EATA, pH 8.0)으로 녹이고 CsCl을 1g/ml가 되도록 넣었다. 이 용액을 Beckman TL 100 roter를 이용하여 100,000 rpm에서 12시간 동안 원심분리하여 플라스미드 DNA를 정제하였다. 플라스미드 DNA를 포함하는 띠를 주사기로 분리하고 이를 n-butanol로 추출한 다음 TE 완충액에서 24시간 동안 투석하였다. 플라스미드 DNA를 추출한 후, Hind Ⅲ 제한효소로 절단하고, 0.8% 아가로스 젤에서 전기영동하여 4.1kb 의 당뇨병 발생 유전자 DNA를 포함하는 아가로스 젤절편을 절단해 내어 DNA를 정제하였다. DNA 의 농도를 정량한 후, 10mM Tris -Cl, pH 7.5/0.2 mM EDTA, pH 8.0 완충액으로, DNA의 농도가 4ng/ul이 되도록 희석하고 -20℃에 보관하여 미세주사에 사용된다.
[단계 2] 당뇨병유전자의 미세주사
한국생명공학 연구소에서 구입한 F1하이브리드 주(C57BL × CBA)또는 B＆K사(영국)에서 구입한 FVB순계 마우스중 6주 이상된 암컷을 골라서 과배란(superovulation)을하여 적은 수의 공급자 마우스(donor mouse)로부터 많은 수의 수정란을 얻었다. 수정된 난자의 웅성전핵(male proncleus)에 DNA를 미세주사하는데 가장 좋은 시기는 생쥐 수정란의 1 세포기로서 공급자의 주(strain)와 동물장의 light-dark cycle을 오후 7시에 꺼지고 오전 6시에 켜지도록 조정하여 미세 주사를 보통 오전 10시 30분부터 시작하였다. 수정된 난(egg) 하나를 웅성 전핵이 잘 보이는 위치에 고정하고 주사용 피펫으로 웅성 전핵에 1-2pl정도의 DNA를 주입하였다.
[단계 3] 미세주사된 수정란의 대리모 마우스 수란관내에 삽입
DNA를 삽입한 수정란 중 건강한 것과 용해된 것을 분류해서 용해된 것을 버리고 건강한 것은 그날 대리모 마우스(foster mother mice)에 옮겨주거나 M16 배지에 넣어, 37℃ 인큐베이터 속에 배양하였다. 대리모와 교배시키는 수컷 마우스는 ICR 순계(inbred)주를 사용하였는데, 이를 정관수술한 뒤 다른 암컷마우스와 교배시켰을 때 질전(vaginal plug)이 있어도 새끼가 태어나지 않는 것을 확인하고 사용하였다. 배란기에 가까운 ICR 암컷 마우스를 정관 수술한 수컷 마우스와 교배시켜 질전(vaginal plug)이 있으면 대리모로 사용하였다. 수술은 somnopenty(Pitman-Moore사 제품 64.8 mg sodium pentobarbital/ml)을 PBS로 10배 희석한 마취약 0.2ml를 복강내 주사하고, DNA가 미세주사된 수정란 20-25개를 양쪽 수란관(oviduct)내로 삽입한 뒤 수술부위를 봉합하였다.
[단계 4] 유전자 이식 마우스의 사육
꼬리 DNA의 PCR을 통하여 당뇨병 발생 유전자가 삽입된 것이 확인된 유전자 이식 마우스는 생후 6주 이후 정상 하이브리드(C57BL × CBA) 마우스 또는 FVB 순계 마우스와 교배시켰다. 매일아침에 질전(vaginal plug)를 검사하여 수정여부를 측정하였고 만일 정상적인 교배를 못할 경우 정상 마우스를 교환하여 계속 수정여부를 검사하였다. 새끼(F1)가 태어나면 3-4주 후에 꼬리 DNA로 PCR을 시행하여 대리모의 당뇨병 발생 유전자가 전달되었는지를 검사하였다. 당뇨병 발생 유전자가 전달된 것이 확인되면 이를 유전자이식 마우스주(transmice line)로 명명하였다. F1유전자 이식 마우스는 다시 생후 6주후에 정상 하이브리드(C57BL × CBA) 마우스또는 FVB순계 마우스와 교배시켰다.
한편, 동형집합체(homozygote)유전자 이식 마우스를 만들기 위해서 F1 유전자 이식 마우스중에서 같은 대리모 마우스에서 나온 자매간에 교배를 실시하였다. 이들 사이에서 태어난 F2 유전자 이식 마우스중 동형접합체 마우스를 찾아내기 위하여 이들을 다시 정상 하이브리드(C57BL×CBA)마우스 또는 FVB순계 마우스와 교배시켜 F3마우스를 얻은 뒤, 당뇨병 유전자를 가지는가를 검사하였다.
[당뇨병 유전자 이식 마우스의 성상분석]
1) 꼬리 DNA 추출
마우스의 꼬리로부터 고분자 DNA 추출하고, 이를 PCR방법에 의해 분석하므로서 형질전환된 유전자의 여부를 판별할 수 있었다.
3-4주 가량된 마우스의 꼬리 끝부분을 1.5-2.0cm 가량 절단한 후에 잘게 잘라 50 mM Tris-Cl, pH 8.0/50 mM EDTA, pH 8.0/0.5% SDS 완충액 500ul에 넣고 proteinase k를 200ug/ml가 되도록 가한 후 55℃에서 9시간 동안 반응시켰다. 이를 동량의 페놀 및 페놀/클로르포름/아이소아밀 알콜(25:24:1)로 3회 추출한 뒤, 10 mM Tris-Cl. pH8.0/1mM EDTA, pH8.0 용액으로 36시간 투석하였다(12시간×3회). DNA 의 농도를 스펙트로포토메터로 측정한 뒤 이 DNA 용액을 4℃에서 보관하였다.
2) PCR 분석
마이크로퓨즈 튜브안에 77.5㎕ DW, 시료 DNA 2㎕, dATP. dGTP, dCTP, dTTP 각각 2㎕, Taq DNA 폴리머레이즈 완충액 10㎕(100mM Tris(pH 8.3). 500mM KCl, 15mM MgCl2, 0.1% 젤라틴), 프라이머 2㎕를 넣고 혼합하였다. 이때 프라이머는 제1도에 화살표로 도시된 지역에 존재하며 프라이머의 염기서열은 밑줄 그은 부분이다. 혼합액의 상층부에 미네랄 오일을 첨가하고 95℃에서 5분간 열처리하여 DNA 추출시 잔존하는 프로테아제를 비활성화시키고 한편으로는 DNA 가 충분히 변성되도록 한 후, 72℃로 온도변화를 시켰다. 각 튜브에 0.5 ㎕의 Taq DNA 폴리머레이즈(2.5U)를 오일층을 통과해 반응혼합액에 넣어 혼합한 후, 94℃에서 0.5분-1분(denaturation), 55℃에서 0.5분-1분(annealing), 72℃에서1분(extending)의 PCR 싸이클을 30회 수행하였다. 적정 PCR싸이클이 완료된 반응혼합액은 마지막 과정을 5분간 연장하여 증폭된 DNA절편들이 충분히 이중나선을 형성하도록 유도한 후, 튜브 상층부의 오일을 제거하고 동량의 플로르 포름을 넣어 혼합한 후, 15,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상등액을 새 튜브에 옮기고 0.1배의3M NaOAc(pH 5.2)와 2.5 배의 95% EtOH를 넣어 혼합하여 15분간 -70℃에서 냉각시킨후, 15분간 15,000rpm(4℃)에서 원심침전시킨다. 침전물은 70% EtOH 로 넣어 세척한 후, 5분간 원심분리하며, 최종 PCR 증폭 DNA는 진공건조하고 20㎕의 TE 완충액 또는 증류수에 녹인 후, 그중 1-2㎕를 전기영동하여 결과를 판정하였다.
제3도는 이 실험결과로서, P는 양성대조군, C는 유전자 이식이 되지 않은 보통의 마우스를 나타내며, 58번, 60번, 65번 유전자 이식 마우스에서 양성 대조군과 같은 밴드를 나타내므로 상기 마우스들에 당뇨병 발생 유전자가 이식되었음을 알 수 있다.
3)포도당 부하검사(glucose tolerance test)
유전자 이식된 마우스가 당뇨병을 나타내는 지를 알아보기 위해 정상 마우스와 유전자가 이식된 마우스에 5mg의 설탕을 섭취시킨 후, 0, 60, 90, 120분 간격으로 혈중 포도당 수준을 측정하였으며 이에 따른 검사결과를 제4도에 도시하였다. 정상 마우스는 시간이 경과해도 100mg/dl 이하의 혈중 포도당 수준을 유지하였으나 유전자 이식된 마우스는 시간에 따른 높은 증가를 나타냈으며, 그 수준이 300mg/dl 까지 올라가므로 유전자 이식된 마우스에 당뇨병이 발생되었음을 알 수 있다.
4) 췌장의 병리조직학적 검사
췌장의 standard 5-μ section을 4% 파라포롬알데히드에 고정하였고 파라핀에 포매한후 통상의 과정을 거쳐 헤마특실린 염색을 하였으며 제5도는 그것의 사진촬영 결과이다(a:100배. b:200배 c:400배 확대).
췌장의 소도가 과중식 되어 있는 것으로 보아 인슐린 비의존성(type Ⅱ)당뇨병이 발생되었음을 알 수 있다.
Claims (1)
- 생식 세포와 체세포에 인간 열충격 단백질 70 유전자의 2.3kb Bam HI-Hind Ⅲ 단편에 연결된 인간 인슐린 유전자 프로모터의 1.8kb Hind Ⅲ-EcoRI 절편으로 구성된 재조합 DNA를 포함하는 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스로서, 상기 DNA는 상기 유전자 이식 마우스의 배 단계에서 도입된 당뇨병 발생 유전자 이식 마우스.
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