JPH04504352A - 動物体細胞及び生殖細胞中への外因性ｄｎａの導入方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 動物体細胞及び生殖細胞中への外因性ＤＮＡの導入方法！８発明の分野 本発明は、動物体細胞及び生殖細胞中への外因性ＤＮＡの導入方法に関する。

特に、その方法は外因性ＤＮＡまたは組換えＤＮＡの既知技術に従って修飾され たＤＮＡを修飾されるべき動物の精子に導入し、前記の精子を人工受精に関して 既知の技術により卵子受精に使用することからなる。

２、従来技術 遺伝子導入動物、即ちそれら自体のゲノムに外来の遺伝情報及びその他の遺伝系 から誘導される遺伝情報が永久に組み込まれた動物の発生は、遺伝的調節の研究 、化学目的及び治療目的の両方、並びに家畜、魚、練皮動物及び両生類の飼育に 主として重要な目的であったし、依然としてそうである。

特別の有利な特性、例えば飼育のための動物の場合には成長の速度もしくは或種 の疾患に対する抵抗性、又はその逆に、新規薬剤を試験するのに利用される動物 の場合には或種の疾患に対する疾病素質を有する動物を発生することが、実際に 可能である。遺伝子導入動物を得る最初の試みは７０年代の中頃までさかのぼる 。これらの試みは、主として、Ｍ、　）１．　Ｌ及びＡ、　ＭｃＬａｒｅｎによ りＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　（１９２４）　８ ６．１〜８に、並びにＲ，Ｊａｅｎｉｓｃｈ及びＢ、　Ｍｉｎｔｚ　（１９７４ ）によりＰｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９７４）　７１．１２５０〜 ５４に記載されているように、マウスの胚胎または培養細胞の操作及びマウスの 尾胞空洞中への直接のＤＮＡ　（例えば、５ｖ４０）導入に基いた。

しかしながら、得られた結果は、特に使用された技術の難点のため期待に反した 。

１９８０年には、Ｊｏｈｎ　Ｗ、　Ｇｏｒｄｏｎらが、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　（１９８０）、　７７　Ｎｏ、１２．７３８０ 〜８４に於いて、受精卵母細胞の前核中へのクローン化ＤＮＡのマイクロインジ ェクションによるマウス胚胎の遺伝子形質転換に関する新規技術を記載した。

こうして処理された接合体は、偽妊娠母体の子宮中に再移植され、妊娠させられ た。

近年改良されたこの技術により、外因性ＤＮＡをマウスの体細胞及び生殖細胞中 に導入して遺伝子導入動物を得ることが可能であることが示された。

受精卵中への外因性ＤＮＡのマイクロインジェクションの技術により得られ、抗 腫瘍治療を試験するのに使用される遺伝子導入動物の典型的な例は、米国特許第 ４、７３６．８６６号明細書に記載されたマウスであり、これらのマウスはそれ らの体細胞及び生殖細胞中に腫瘍遺伝子配列の存在を示す。

マイクロインジェクション技術が飼育の分野で実験されつつある。しかしながら 、本発明者らは最終的に得られた結果の情報を持たない。

受精卵母細胞中のＤＮＡマイクロインジェクションは、いずれにしても、高い流 産率、得られた動物中のモザイク現象の高率及びそれら動物の著しい生殖不能の ために低い効率を有する複雑で高価な技術である。

３、技術上の問題点 本発明により解決される基本的な技術上の問題点は、導入される外因性ＤＮＡの 典型的な配列を実際には持たない動物種に属する動物の小房中への、組換えＤＮ Ａの既知技術により処理されたＤＮＡの導入であり、その結果、前記の組換えＤ ＮＡ中に含まれた遺伝情報は処理された個体のゲノム中に永久的に組み込まれ、 それ故、個体の子孫に伝達し得る。

法は、実験観察、即ち分子が例え大きな寸法であっても精子頭部中へ浸透するの に成功する驚くべき容易さに基（。

哺乳類及びその他の動物種の両方の精子の典型的なこの性質は、精子を修飾し、 転移されるべきクローン化ＤＮＡをそれらに導入するのに利用された。

修飾された精子を用いて、相当する卵母細胞は、その後、未修飾精子を用いて使 用される人工受精技術により受精される。

本発明の基本的な特徴によれば、それ自体のゲノムに外因性の遺伝情報及びその 他の系に由来する遺伝情報を導入したいと欲する種の精子が、外因性ＤＮＡを転 移するためのベクターとして使用される。

本発明の方法を実施する可能な方法の一つは、下記の工程： ａ）水性精子懸濁液の調製 ｂ）クローン化ＤＮＡによる精子の形質転換Ｃ）修飾精子による卵母細胞の試験 管内受精ｄ）選択種の偽妊娠の雌への受精卵母細胞の移植を含む。

本発明を実施する別の可能な方法によれば、修飾精子が、試験管内の卵母細胞受 精及び偽妊娠の雌への受精卵母細胞の連続移植を経ることなく、動物受精に直接 使用し得る。

本発明のこの形態の実現は、その方法が飼育に使用される場合に特に有益である 。

本発明の方法は、マイクロインジェクション技術よりも非常に簡単であり、非常 に迅速であり、コストがかからず、しかもマイクロインジェクション技術によく 見られる流産を起こさない。

本発明が特にマウス精子の修飾に関して詳しく説明される。

本発明者らは、この動物を使用した。何となれば、その試験管内受精、並びにそ の遺伝子の組込み及び発現の研究に関する全ての実験技術が科学文献に充分に報 告されているからである。

外因性ＤＮＡとして、本発明者らはｐ　ＳＶ２　ＣＡＴ　、ポリオーマ及びヒト 成長遺伝子を使用した。何となれば、それらの制限遺伝地図が文献に記載されて おり、マウスゲノム中に天然に存在しない塩基配列を含むからである。

”陽性”マウス、即ち処理された精子で受精された卵子から得られたマウス中の これらの配列の同定は、クローン化ＤＮＡが処理された精子中に実際に導入され 、そしてこれらにより受精卵中に導入され、それ故、得られる遺伝子導入個体の ゲノム中に組み込まれたことを紛れもなく確かめる。

ａ）精子の調製 雄マウスの精巣上体を１ｍｌのＰＭ緩衝液（Ｄ、　Ｇ。

Ｗｈｉｔｔｉｎｇａｍ著、Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｍｏｕｓｅ−ｏｗｅ−（１９ ７１）−ＪＲｅｐｒｏｄ、　Ｆｅｒｔ、　５ｕｐｐ、　１４．９．７〜２１に記 載されたように調製した）中に押しつぶすことにより精子懸濁液を調製した。

精子を分離するため精子懸濁液を遠心分離し、これらを１ｍｌの緩衝液に再懸濁 した。

精液の完全な排除を確実にすることにより精子を洗浄するため、上記の処理を５ 回繰り返した。乳酸ナトリウム、ペニシリン及びストレプトマイシンを排除し、 リン酸−ナトリウムを０．１５ｍＭのリン酸二ナトリウムにより置換し、塩化ナ トリウムの量を１２０ｍＭに変えて、緩衝液を変性した。次いで精子懸濁液を１ 〜２ミリオン／ｍｌの濃度に希釈し、５％〜ｌＯ％の二酸化炭素を含む空気中で ２０℃〜３７℃の温度で３０分〜３時間の期間にわたってインキュベートした。

ｂ）精子のＤＮＡ形質転換 ５００μ！の一分中の希釈された懸濁液に、精子中に挿入しようとするクローン 化環状ＤＮＡの溶液を添加し、その混合物を５・％〜１０％の二酸化炭素番含む 空気中で０℃〜３７℃の温度で少なくとも３０分間にわたって更にインキュベー トする、低温では、精子中へのＤＮＡの挿入は精子の外因性ヌクレアーゼの減少 された活性のために容易であるが、インキュベーン１２時間は３０分より長い。

クローン化環状ＤＮＡ溶液を、０．４〜２μｇ１０＋１の範囲のクローン化ＤＮ Ａ混合物中への最終濃度を得るような量で添加する。

Ｃ）卵子受精 成熟マウス雌をヒト慢性ゴナドトロピンにより過剰排卵に誘導し、注射１４．５ 時間後に卵子を卵管から抽出する（　Ｂ、Ｈｏｇａｎらにより’　Ｍａｎｉｐｕ ｌａｔｉｎｇ　ｔｈｅ　Ｍｏｕｓｅｔｌｍｂｒｙｏ　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ 　Ｍａｎｕａｌ　”　ＣＳＭニューヨーク、１９８６に記載された方法による） 。

卵管から抽出された卵子を形質転換された精子の５００μｌの画分中に導入し、 ５％〜１０％の二酸化炭素を含む空気中で２０℃〜３７℃の温度で５〜ＩＯ時間 インキュベートする。上記の期間の終了時に、卵子を１６緩衝液（Ｗｈｉｔｔｉ ｎｇａａ＋により記載されたように調製される一上記のａ）の文献を参照のこと ）で洗浄し、同緩衝液５０μｍ中で一夜放置する。

２４時間後に、胚胎を二つの小房の段階で偽妊娠雌の卵管中に手術により転移す る。

３週間の齢で、これらの移植体から誘導する子孫から末端尾部フラグメントを切 断し、これからＤＮＡを抽出し、これを書籍”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ　”　：　ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ　”　Ｔ、Ｍａｎｉａｔ ｉｓら著−Ｃ，Ｓ、　Ｍ、　ニー　ニーヨーク１９８４に記載された”サザンプ ロット”の助けにより分析する。　この分析は、”陽性“個体、即ちそのゲノム が出発精子中に導入された同じクローン化ＤＮＡの組み込まれた形態またはエピ ソーム形懇の一つ以上のコピーを育する個体を同定する。

本発明の方法に従って得られる”陽性個体“の収率は常に３０％より高＜７０％ までであり、その上重要なことには、不妊の個体がそれらの中に見られない。

陽性動物の連続の遺伝的性格付けは、制限及び配列の二つの分析法で行われる。

陽性マウスのゲノムＤＮＡの分析を二つの方法に従って行った。

制限分析 フラグメントへのゲノムＤＮＡの分割を可能にする特異的制限酵素によるＤＮＡ 制限分析。得られたフラグメントを、その後、電気泳動により分別し、既知のサ ザンプロット技術によりニトロセルロースフィルター上に移す。次いでフィルタ ーを、精子を形質転換するのに使用された初期のクローン化ＤＮＡに特異的なプ ローブで処理し、Ｐ３寞で放射性にし、Ｘ線感受性フィルム上で露出する。

フィルムは、放射性プローブがフィルターに結合された部位に一致して、即ち夫 々の放射性ＤＮＡ結合に一致して露出され、夫々のＤＮＡフラグメントに関する 信号を残す。

一つ以上の信号の存在、それらの数及びそれらが示すＤＮＡフラグメントの寸法 は、陽性マウスゲノムプローブに類似する配列が存在することを結論させ、制限 遺伝地図を決定させる。

この遺伝地図と精子（これから“陽性“マウスが生じる）中に導入されたクロー ン化ＤＮＡの一つとの間の類似性は、初期のクローン配列が遺伝子導入マウスゲ ノム中に組み込まれることを証明する。

−配列分析 ”陽性”マウスゲノムを構成する塩基の配列を分析するため、等量（１５μｇ） の陽性マウスのゲノムＤＮＡ及びアンピシリンに耐性のｐＵｃ１３プラスミドを 制限ＥｃｏＲＩ酵素で制限した。次いで、二つの制限されたＤＮＡを混合し、再 度環状化し、大腸菌ＨＢＩＯＩ細菌中に導入し、次いでこれらを寒天＋アンピシ リンで培養した。

陽性コロニー（即ち、クローン化フラグメントを含むコロニー）を分離し、増幅 し、精製した。次いでクローン化フラグメントをＥｃｏＲＩによる制限によりｐ Ｕｃ１３ベクターから分離し、ランガー法を使用してそれから６２６の塩基を配 列決定した。

こうして、初期のクローンが精子から受精卵に転移され、ついで得られた個体の ゲノム中に組み込まれたことを確かめることが可能であった。

上記の二つの方法の他に、本発明者らは、外因性ＤＮＡの位置を確かめる目的で 、クローン化ＤＮＡによるそれらの形質転換後に精子の分析を行った。

この目的のため、本発明者らはＨ３ラベルしたＤＮＡを使用し、ラベルしたＤＮ Ａによるそれらのインキュベーション後の精子溶液の種々のアリコートを光学電 子顕微鏡でラジオオートグラフにかけた。得られた結果は、クローン化ＤＮＡが 赤道下の位置で精子頭部内に特異的に配置されることを実証した。精子のその他 の領域中の痕跡量の放射能は重要ではない。

受精つ瞬間の精子と卵母細胞との間の光体融合反応（精子から卵子への遺伝物質 の転移による）が特別な領域で起こることが知られているので、外因性ＤＮＡが 種のＤＮＡプロパーと同時に同様にまた転移されると考えられる。この機構は本 発明の方法の驚くべき効率を説明し得る。

国際調査報告 ｔ−ｍ−ｕ−ＩＡ−ｅｋｍ−１１ｅＰＣＴ／ＥＰ９０１０００３２国際調査報告 ＥＰ　９００００３２ Ｓ＾　３３１７０

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. １．修飾しようとする動物の精子中への外因性ＤＮＡまたは既知のＤＮＡ組換え 技術により修飾されたＤＮＡの導入、及び通常の人工受精技術により卵子を受精 するための前記の精子の使用を特徴とする動物体細胞及び生殖細胞中への外因性 ＤＮＡの導入方法。
2. ２．ａ）水性精子懸濁液を調製し； ｂ）精子をクローン化ＤＮＡで修飾し；ｃ）卵母細胞を修飾精子により試験管内 で受精し；ｄ）受精卵母細胞を選択種の偽妊娠雌に移植することを特徴とする請 求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記の水性精子懸濁液をＦＭ緩衝液で緩衝し、１〜２ミリオン／血ｌの精子 濃度まで希釈し、５％〜１０％の二酸化炭素を含む室気中で３０分〜３時間の期 間にわたって２０℃〜３７℃でインキュベートすることを特徴とする請求の範囲 第２項に記載の方法。
4. ４．精子に挿入すべき環状クローン化ＤＮＡ溶液を前記のインキュベートされた 水性精子懸濁液に添加し、更に０℃〜３７℃の温度で少なくとも３０分間インキ ュベートし、混合物中の最終クローン化ＤＮＡ濃度０．４〜２μｇ／ｍｌを有す るような量で前記の溶液を添加することを特徴とする請求の範囲第２項に記載の 方法。
5. ５．受精すべき卵母細胞を水性のインキュベートされた精子懸濁液に添加し、そ の混合物を５％〜１０％の二酸化炭素を含む空気中で２０℃〜３７℃の温度で５ 〜１０時間インキュベートすることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の方法 。
6. ６．上記の受精卵母細胞から得られた胚胎を、二つの細胞の発育段階に達する時 に、偽妊娠雌の卵管に手術により移植することを特徴とする請求の範囲第５項に 記載の方法。