CN116904513A - Scn5a基因编辑心律失常模型犬的建立方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及SCN5A基因编辑心律失常模型犬的建立方法，该方法包括利用基因编辑技术获得SCN5A基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞。采用本发明的方法获得了可遗传且表型稳定的SCN5A基因编辑心律失常模型犬模型，该模型在未来肿瘤模型开发、免疫疾相关药物效果评估等领域具有相当可观的应用前景。

Description

SCN5A基因编辑心律失常模型犬的建立方法
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体涉及利用基因编辑技术建立SCN5A基因编辑心律失常模型犬的方法，以及获得的SCN5A基因编辑心律失常模型犬，以及SCN5A基因编辑心律失常模型犬的细胞和组织。
背景技术
心律失常是指心脏冲动的频率、节律及起源部位、传导速度或兴奋秩序的异常，是临床常见的心血管病之一。我国心律失常患者人数超过一千多万，随着我国进入老龄化社会，心律失常发病率快速提升。遗传性心律失常主要包括两大类：原发性心电疾病与致心律失常性心肌病。其中原发性心电疾病是指与遗传相关的以心电紊乱为主要特征的疾病，包括Brugada综合征、长QT综合征、短QT综合征以及其他少见的遗传性心脏传导阻滞、婴儿猝死综合征等。
犬是目前基础医学研究和教学中最常用的实验动物之一，尤其在生理、药理和病理生理学等实验研究中起着重要作用。犬基因组与人类的相似度高于小鼠等其他实验动物。犬在遗传性疾病方面与人类也极为相似，约有癌症、心脏病、聋哑、失明和免疫性神经系统疾病等360多种遗传疾病与人类相同，适于作为人类疾病研究的模式动物。而且，犬的遗传性疾病少，实验重复性好，血液循环和神经系统发达，消化系统及内脏与人相似，在毒理方面的反应与人类比较接近，尤其适合药理、循环生理、眼科、毒理、外科学等的研究。
目前常用的制备犬疾病模型的方法主要包括:饲喂法、机械损伤法及免疫学方法等。由于饲喂法、机械损伤法和免疫学法均是在健康动物基础上，采用特殊的方法诱导其出现疾病表型，因此存在无法出现疾病表型、表型持续时间较短或无法模拟人类疾病症状等问题。而采用基因工程的方法对犬基因组进行基因敲除或转基因修饰，其疾病症状为原发症状，表型持续时间长，并且具有可遗传性。
理想的动物模型应该对临床的有效药物及方法有较高的特异性，无假阳性，对药物反应灵敏，具有药效预测性，行为表现的模拟性，药物作用时间(约2周左右)接近临床，受其它药物干扰少，有合理的理论基础，行为学改变和内分泌改变持续时间应足够长的特点。
相比于小鼠模型，大动物模型与人的生理学特征的相似性使其能够更准确模拟人类疾病，但目前为止，有关缺乏心律失常相关的大动物模型鲜有报道，从而在一定程度上限制了心律失常疾病发病机制和治疗方法的研究。因此，亟需构建一种心律失常犬动物模型，为研究疾病的致病机制、疾病有效诊断和早期干预提供可靠的大动物模型。
发明内容
本发明提供了一种经基因编辑技术建立SCN5A基因编辑的心律失常模型犬的方法，获得可遗传且表型稳定的心律失常模型犬。
本发明的一方面提供了一种SCN5A基因编辑心律失常模型犬的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得SCN5A基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞。
在一些实施方式中，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。
在一些实施方式中，所述方法包括对SCN5A基因的2号外显子进行靶向突变，优选地，所述突变包括核苷酸的插入、删除、置换和/或添加修饰。
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)根据犬SCN5A基因的2号外显子的序列确定打靶位点；
(2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；
(3)通过体外转录，分别获得sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物；
(4)将步骤(3)获得的sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物导入犬受精卵或犬体细胞中，获得SCN5A基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞。
在一些实施方式中，步骤(1)中，根据犬SCN5A基因的2号外显子的序列确定sgRNA，
优选地，所述sgRNA的序列及其互补序列包括以下序列：
sgRNA序列：CACCGGCGGCCATCGAGAAGCGCATGGg(SEQ ID NO:2)；
sgRNA互补序列：AAACCCATGCGCTTCTCGATGGCCGCCc(SEQ ID NO:3)。
在一些实施方式中，所述方法还包括将SCN5A基因表达降低或缺失的犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备SCN5A基因编辑心律失常模型犬。
在另一些实施方式中，所述方法还包括将SCN5A基因表达降低或缺失的犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬的输卵管内，从而制备SCN5A基因编辑心律失常模型犬。
在一些实施方式中，将犬受精卵或犬去核卵母细胞移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内。
在一些实施方式中，所述犬体细胞来自如下的组织或器官：胎儿组织、皮肤、肌肉、耳、乳腺、输卵管、卵巢、血液、尿液、脂肪、骨髓、血管和管腔内皮。
在一些实施方式中，所述犬体细胞选自胎儿成纤维细胞、皮肤细胞、上皮细胞、耳细胞、成纤维细胞、内皮细胞、肌肉细胞、乳腺细胞、输卵管细胞、卵巢细胞、卵丘细胞、神经细胞和成骨细胞。
在一些实施方式中，所述SCN5A基因编辑心律失常模型犬的基因组包含如SEQ IDNOs:7、8、10、11中至少一项所示的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述SCN5A基因编辑心律失常模型犬具有双等位基因分别突变+9bp、-2bp，出现碱基序列插入或者缺失，导致终止密码子TAA的出现，SCN5A蛋白翻译提前终止，无法获得功能性蛋白。
在一些实施方式中，所述SCN5A基因编辑心律失常模型犬中的SCN5A蛋白表达缺失。
在一些实施方式中，所述SCN5A基因编辑心律失常模型犬为先天性心律失常模型犬。
在一些实施方式中，所使用的骨架载体除真核载体外，还可包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、非病毒载体等基因载体。
在一些实施方式中，本发明利用基因编辑技术，根据犬SCN5A基因序列的外显子选择打靶位点序列，并且根据打靶位点序列构建了sgRNA打靶载体和CRISPR/Cas9表达载体，载体经验证有效后，体外转录为mRNA，然后采用胞质注射的方式将mRNA注射入犬受精卵中，然后将犬受精卵移植到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬的一侧输卵管内，从而制备SCN5A基因编辑心律失常模型犬。
本发明的另一方面还提供而由所述建立方法获得的SCN5A基因编辑心律失常模型犬的犬体细胞、组织或器官。
在一些实施方式中，所述SCN5A基因编辑心律失常模型犬的犬体细胞、组织或器官包含如SEQ ID NOs:7、8、10、11中至少一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述SCN5A基因编辑心律失常模型犬的犬体细胞、组织或器官中的SCN5A蛋白表达缺失。
本发明的另一方面还提供了一种SCN5A基因编辑心律失常模型犬的犬体细胞，所述犬体细胞中的SCN5A蛋白表达缺失，和/或基因组包含如SEQ ID NOs:7、8、10、11中至少一项所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述犬体细胞为编码心脏电压门控钠通道Nav1.5的α亚基的SCN5A(SCN5A)基因敲除的比格犬耳成纤维细胞。在一些实施方式中，所述犬体细胞的分类命名为比格犬成纤维细胞，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)，保藏号为CGMCCNo.19946，保藏日期为2020年6月3日。
本发明的又一方面提供了犬SCN5A基因编辑的打靶载体，所述打靶载体由针对犬SCN5A基因的2号外显子确定的打靶位点序列设计的sgRNA序列以及骨架载体构成；
优选地，所述sgRNA及其互补序列包括以下序列：
sgRNA序列：CACCGGCGGCCATCGAGAAGCGCATGGg(SEQ ID NO:2)；
sgRNA互补序列：AAACCCATGCGCTTCTCGATGGCCGCCc(SEQ ID NO:3)。
本发明的又一方面提供了一种细胞，所述细胞包含所述打靶载体。
在一些实施方式中，所述细胞不能发育为动物。
本发明的又一方面提供了一种引物对组合物，所述引物对组合物包括如下序列：
正向引物：5’-ACGCACTGCGTCTGTGTTTTCTG-3’(SEQ ID NO:4)；
反向引物：5’-GTGCTTGCCCGCTTCTTCTCTTC-3’(SEQ ID NO:5)。
优选地，所述引物对组合物还包括如下序列：
9bpneiF：GGCCATCGAGAAGCAAGTTCTCT(SEQ ID NO:12)
2bpneiR：GCTTGCTTCTCTGCCATGCTT(SEQ ID NO:13)
wtneiF：CGGCCATCGAGAAGCGC(SEQ ID NO:14)。
本发明的又一方面提供了所述引物对组合物在检测包含SEQ ID NO:7和/或8所示的序列的基因组序列的SCN5A基因编辑心律失常模型犬中的应用。
本发明的又一方面还提供了所述方法获得的SCN5A基因编辑心律失常模型犬在心律失常疾病模型构建、心律失常疾病药物的筛选和/或评估中的应用。
心脏离子通道或调节蛋白的基因突变在遗传决定的室性心律失常性疾病如Brugada综合征、长QT综合征、短QT综合征中发挥着重要作用。维甲酸类异构水解酶SCN5A(SCN5A)基因编码心脏电压门控钠通道Nav1.5的α亚基，这一通道控制着向内钠电流(INa)，在调节心脏电生理功能中起着关键作用。Nav1.5的功能障碍是导致病理生理条件下心律失常发生的原因之一。SCN5A突变致钠通道功能的增加或减少产生多种临床表型。SCN5A功能获得突变可致AP平台期间晚钠电流持续增加而不是峰钠电流增加，如LQTS3；反之，SCN5A功能丧失性突变可导致峰钠电流下降，导致BrS1、病态窦房结综合征、心脏传导疾病、扩张型心肌病等疾病表型。因此，通过对SCN5A基因的缺失，可能导致Nav1.5通道功能的改变，进而模拟出相应的疾病。
基于结合犬在免疫系统构成及免疫反应过程等方面与人存在高度相似性的优势，犬作为大动物实验模型用于免疫及相关药物治疗手段的开发等领域上存在极大的潜在开发价值，本发明获得了可遗传且表型稳定的心律失常犬模型，为研究心律失常疾病的致病机制、药物筛选、疾病有效诊断和早期干预提供可靠的大动物模型。
附图说明
图1显示了基因编辑犬1910118个体图片。
图2显示了基因编辑犬1910118的耳组织和尾组织与野生型犬相比SCN5A基因特征序列的比对。
图3显示了基因编辑犬1910118的耳组织和尾组织与野生型犬的耳组织和尾组织的基因测序峰图的对比，其中A为插入9bp SCN5A序列峰图，B为缺失2bp SCN5A序列峰图，C为野生型SCN5A序列峰图。
图4显示扩繁获得的F1代基因突变犬的示例性PCR鉴定结果。
图5显示了基因编辑犬1910118与野生型犬的心电检测结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。
本公开提供了一种SCN5A基因编辑心律失常模型犬的建立方法，包括如下方法：
1)根据犬SCN5A基因序列，针对外显子的序列确定打靶位点序列；
2)根据步骤(1)确定的打靶位点序列合成sgRNA序列及其互补序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；
3)将sgRNA打靶载体体外转录获得sgRNA的mRNA，以及将CRISPR/Cas9体外转录为mRNA；
4)将步骤(3)获得的sgRNA的mRNA和CRISPR/Cas9的mRNA混合后胞质内注射到犬受精卵中；或者将步骤(3)获得的sgRNA的mRNA和CRISPR/Cas9的mRNA混合后胞质内注射到犬体细胞中，然后将犬体细胞核移植到犬去核卵母细胞中；
5)将步骤4)获得的犬受精卵或者犬去核卵母细胞到双侧输卵管均进行了冲胚的母犬出血较少的一侧输卵管内，从而制备SCN5A基因编辑心律失常模型犬。
实施例1
1.打靶载体的构建与鉴定
根据Genbank中的犬SCN5A基因(NC_051827.1/XM_038431580.1)序列信息，将SCN5A基因的2号外显子确定打靶位点(5'-GGCGGCCATCGAGAAGCGCATGG-3'，SEQ ID NO:1)。
针对该打靶位点设计了sgRNA，sgRNA序列及其互补序列为：
sgRNA序列：CACCGGCGGCCATCGAGAAGCGCATGGg(SEQ ID NO:2)；以及
sgRNA互补序列：AAACCCATGCGCTTCTCGATGGCCGCCc(SEQ ID NO:3)。
将载体质粒px330用BbsI单酶切使其线性化，1％琼脂糖凝胶电泳，再切胶回收，测定浓度，按照线性化载体与SCN5A基因打靶sgRNA摩尔比1:3的体系，使用T4 DNA连接酶16℃连接过夜。连接产物转化氨苄抗性LB板筛选，菌落PCR鉴定阳性克隆，并接种摇菌使用质粒小提试剂盒提取质粒。吸取5μL重组质粒进行测序，并采用Snapgene分析对比测序结果，将测序对比正确的质粒保存备用。
2.体外转录
首先对CRISPR/Cas9的质粒进行线性化，反应体系为：30μg质粒，5μL限制性内切酶AflII；10μL的10×Buffer及ddH2O，总体积为100μL。然后加入100μL酚：仿：异戊醇(25:24:1)纯化线性化质粒DNA，12000g离心5min；吸取50μl上清至无Rnase的1.5ml离心管内，加入1/10体积醋酸钠和3倍体积无水乙醇沉淀质粒DNA，12000g离心5min；弃上清，尽量吸弃残留的上清，加150μL 70％乙醇洗涤质粒，12000g离心5min；空气中干燥3-5min，用15μL无RNase的ddH2O溶解DNA，测定浓度。
使用体外转录mRNA试剂盒(Thermo Scientific)进行体外转录。
体外转录体系为：1μg线性化质粒DNA，10μL的2×NTP/CAP，2μL的10×Buffer，2μL的RNA合成酶及ddH2O，总体积为20μL。混匀后37℃孵育1hr；加入1μL TURBO DNA酶，消化质粒模板，37℃孵育30min。然后将20μL体外转录产物，20μL的10×Reaction Buffer，10μL的ATP(10mM)，2.5μL的RNA酶抑制剂，2μL的Poly(A)聚合酶及无核酸酶ddH2O混合，配制总体积为100μL的体外转录mRNA加polyA体系，37℃孵育1hr。孵育后，向反应体系中加入350μL结合缓冲液，吹吸混匀；然后加入250μL无水乙醇，混合均匀；再将样品转移到mRNA纯化柱中，10000g室温离心1min；弃掉滤液，重新装好柱子，500μL洗脱液漂洗柱子，10000g室温离心1min；重复漂洗一次，弃掉滤液，空柱离心1min将蛋白质等杂质洗脱掉；然后将柱子放入一个新的离心管中，加入50μL RNA洗脱液到柱子中央位置，盖好盖子65℃孵育10min，10000g室温离心1min；检测RNA质量及浓度。
将CRISPR的sgRNA及Cas9的mRNA进行混合，使sgRNA的终浓度为50ng/μL、Cas9的终浓度为200ng/μL，置于-80℃保存，用于胞质注射。
3.胞质注射和胚胎移植及鉴定
Cas9 mRNA和sgRNA按照2:1的比例混合，进行犬受精卵胞质注射，共进行胚胎移植5次，移植胚胎数量为24枚，移植受体5只，出生幼犬合计27只，基因编辑阳性犬1只(参见表1，胞质注射实验记录)。
具体操作包括：共计自然发情的比格母犬，作为受精卵供体同时作为胚胎移植受体进行实验。对所有母犬采集血液检测血清中孕酮浓度，当孕酮浓度达到4-7ng/mL时可以确定为排卵期，排卵后48h进行自然交配，然后冲取受精胚胎，累计获得受精卵29枚。收集受精卵后，采用含有0.1％透明质酸酶的TCM199培养基脱去卵丘颗粒细胞，然后放入HEPES缓冲的TCM199培养基(HM，GIBCO11150)微滴中，再放到装有显微操作仪的倒置显微镜上。利用显微注射针吸取含有以体积计4:1的上述制备的sgRNA的mRNA和Cas9的mRNA的混合液，然后注射到受精卵的胞质中。用10mL含有10％胎牛血清的HEPES缓冲的TCM199培养基(HM，GIBCO11150)冲洗输卵管，冲卵液由输卵管伞部结扎的注射针处流出并收集到10mL离心管中。胞质注射完成后，将胚胎装入胚胎移植管中，将胚胎移植管中的胚胎从伞部注射到冲胚时出血较少一侧的输卵管内。最终获得出生幼犬合计27只，阳性犬1只。
表1.胞质注射实验记录
取新生幼犬的耳组织(E)和尾组织(T)提取基因组(参见志昂生物的组织DNA磁珠法核酸提取试剂盒步骤)，设计特异性针对SCN5A基因外显子2的引物序列，并进行PCR扩增。
以犬基因组DNA作为模板进行PCR和PCR产物测序鉴定，其中，基因型鉴定引物对为：
SCN5A-F：5’-ACGCACTGCGTCTGTGTTTTCTG-3’(SEQ ID NO:4)；
SCN5A-R：5’-GTGCTTGCCCGCTTCTTCTCTTC-3’(SEQ ID NO:5)；
PCR产物切胶纯化回收后连接至T载体进行转化至大肠杆菌中，每板挑取15个菌落测序。测序结果与野生型序列比对，分析单克隆基因突变情况。
经过胚胎移植和测序，获得编号为1910118的SCN5A基因编辑犬，参见图1，具体基因型为+9bp、-2bp双等位基因突变，碱基序列插入，缺失导致终止密码子TAA的出现，SCN5A蛋白翻译提前终止，无法获得功能性蛋白。参见图2，编号为1910118个体的SCN5A基因与野生型(GGCGGCCATCGAGAAGCGCATGGCAGAGAAGCAAGCC，SEQ ID NO:6)相比较，存在9bp碱基序列的插入(插入的序列为AAGTTCTCT，为GGCGGCCATCGAGAAGCAAGTTCTCTGCATGGCAGAGAAGC，SEQID NO:7)和2bp的缺失(缺失的序列为GC，GGCGGCCATCGAGAAGC--ATGGCAGAGAAGCAAGCCCGA，SEQ ID NO:8)。参见附图3，显示了编号为1910118的SCN5A基因基因编辑犬耳组织和尾组织与野生型犬基因测序峰图的对比。
其中，SCN5A基因野生型序列如下SEQ ID NO:9所示：
ACGCACTGCGTCTGTGTTTTCTGGCTTCCCCACAGGCCACACGAGGACTGCCGGTGCCCCAGAAGCAGGATGAGAAGATGGCAGACTTCCTGTTACCTCGGGGCACCAGCAGCTTCCGCAGGTTCACCCGGGAGTCCCTGGCGGCCATCGAGAAGCGCATGGCAGAGAAGCAAGCCCGAGGCTCGGCCGCCTCGCAGGAGAGCCGGGAAGGGCTGCCCGAAGAGGAGGCTCCCCGGCCCCAGCTGGACCTGCAGGCCTCCAAAAAGCTGCCAGATCTCTATGGCAACCCGCCCCGAGAGCTCATCGGGGAGCCCCTGGAGGACCTGGACCCCTTCTATAGCACCCAAAAGGTGACTGCCGCCCACCTCCCTGCCCACACCTTCCTGCAGCTCCCTTGTCAGCGCAGCAGATAGGGAGAAGGCCTCGCCTCCATATGGGGCTGTGTTTGGGGTGGGCTCCCTGGGCTCTGGGGGAGTGAGTCATTGGGGATCTGTATTCCAATCATTTTAATTTTATTCCAGAATAAAAGCCAGAATTACGCAGCCTGATATGGTTTGGTATTAGAAGAGAAGAAGCGGGCAAGCAC(SEQ ID NO:9)；
SCN5A基因插入9bp后的序列如下SEQ ID NO:10所示：
ACGCACTGCGTCTGTGTTTTCTGGCTTCCCCACAGGCCACACGAGGACTGCCGGTGCCCCAGAAGCAGGATGAGAAGATGGCAGACTTCCTGTTACCTCGGGGCACCAGCAGCTTCCGCAGGTTCACCCGGGAGTCCCTGGCGGCCATCGAGAAGCAAGTTCTCTGCATGGCAGAGAAGCAAGCCCGAGGCTCGGCCGCCTCGCAGGAGAGCCGGGAAGGGCTGCCCGAAGAGGAGGCTCCCCGGCCCCAGCTGGACCTGCAGGCCTCCAAAAAGCTGCCAGATCTCTATGGCAACCCGCCCCGAGAGCTCATCGGGGAGCCCCTGGAGGACCTGGACCCCTTCTATAGCACCCAAAAGGTGACTGCCGCCCACCTCCCTGCCCACACCTTCCTGCAGCTCCCCTGTCAGCGCAGCAGATAGGGAGAAGGCCTCGCCTCCATATGGGGCTGTGTTTGGGGTGGGCTCCCTGGGCTCTGGGGGAGTGAGTCATTGGGGATCTGTATTCCAATCATTTTAATTTTATTCCAGAATAAAAGCCAGAATTACGCAGCCTGATATGGTTTGGTATTAGAAGAGAAGAAGCGGGCAAGCAC(SEQID NO:10)；
SCN5A基因缺失2bp后的序列如下SEQ ID NO:11所示：
ACGCACTGCGTCTGTGTTTTCTGGCTTCCCCACAGGCCACACGAGGACTGCCGGTGCCCCAGAAGCAGGATGAGAAGATGGCAGACTTCCTGTTACCTCGGGGCACCAGCAGCTTCCGCAGGTTCACCCGGGAGTCCCTGGCGGCCATCGAGAAGC--ATGGCAGAGAAGCAAGCCCGAGGCTCGGCCGCCTCGCAGGAGAGCCGGGAAGGGCTGCCCGAAGAGGAGGCTCCCCGGCCCCAGCTGGACCTGCAGGCCTCCAAAAAGCTGCCAGATCTCTATGGCAACCCGCCCCGAGAGCTCATCGGGGAGCCCCTGGAGGACCTGGACCCCTTCTATAGCACCCAAAAGGTGACTGCCGCCCACCTCCCTGCCCACACCTTCCTGCAGCTCCCCTGTCAGCGCAGCAGATAGGGAGAAGGCCTCGCCTCCATATGGGGCTGTGTTTGGGGTGGGCTCCCTGGGCTCTGGGGGAGTGAGTCATTGGGGATCTGTATTCCAATCATTTTAATTTTATTCCAGAATAAAAGCCAGAATTACGCAGCCTGATATGGTTTGGTATTAGAAGAGAAGAAGCGGGCAAGCAC(SEQ ID NO:11)。
4.SCN5A基因编辑犬的扩繁
经过使用SCN5A基因编辑犬1910118和野生母犬进行扩繁(繁育记录参见表2)获得F1代杂合子SCN5A基因突变犬。
表2
进一步针对-2bp，+9bp突变型设计引物以区分-2bp和+9bp突变型，引物具体如下：
SCN5A-F：5’-ACGCACTGCGTCTGTGTTTTCTG-3’(SEQ ID NO:4)；
SCN5A-R：5’-GTGCTTGCCCGCTTCTTCTCTTC-3’(SEQ ID NO:5)；
9bpneiF：GGCCATCGAGAAGCAAGTTCTCT(SEQ ID NO:12)
2bpneiR：GCTTGCTTCTCTGCCATGCTT(SEQ ID NO:13)
wtneiF：CGGCCATCGAGAAGCGC(SEQ ID NO:14)。
PCR鉴定条件如下表3所示：
表3
注：区分-2bp和+9bp基因型：引物1和2分别为SCN5A-F和SCN5A-R，引物3和4分别为2bpneiR\9bpneiF；区分野生型或突变基因型：引物1和2分别为SCN5A-F和SCN5A-R，引物3和4分别为wtneiF。
利用上述特定引物进行PCR鉴定，根据扩增条带的类型可以确定不同的基因型，鉴定方法如下：
(1)区分-2bp，+9bp的引物扩增条带分别为
(a)-2bp/+9bp：约586bp，453bp，173bp；
(b)-2bp：约586bp，173bp；
(c)+9bp：约586bp，453bp；
(2)区分野生型及突变型引物扩增条带分别为：
(a)野生型/杂合型：约586bp，445bp
(b)纯合突变：约586bp。
(3)结合两种引物扩增结果综合判断：
(a)如果区分-2bp，+9bp的引物出现3条带，区分野生型及突变型引物出现1条带，个体基因型为-2bp/+9bp；
(b)如果区分-2bp，+9bp的引物出现约586bp，173bp的2条带，区分野生型及突变型引物出现2条带，个体基因型为-2bp/+；
(c)如果区分-2bp，+9bp的引物出现约586bp，173bp的2条带，区分野生型及突变型引物出现1条带，个体基因型为-2bp/-2bp；
(d)如果区分-2bp，+9bp的引物出现约约586bp，453bp的2条带，区分野生型及突变型引物出现2条带，个体基因型为+9bp/+；
(e)如果区分-2bp，+9bp的引物出现约约586bp，453bp的2条带，区分野生型及突变型引物出现1条带，个体基因型为+9bp/+9bp；
(f)如果区分-2bp，+9bp的引物出现约586bp的1条带，区分野生型及突变型引物出现2条带，个体基因型为+/+。
扩繁获得的F1代基因突变犬的示例性PCR鉴定结果如图4所示。根据图4胶图结果，综合判断编号210317、210319、210323的犬基因型为-2/+，编号210318、210320、210321、210322、210324、210325的犬基因型为+9/+。进一步表明本公开获得的心律失常表型可以在F1代上重复再现。
5.SCN5A基因编辑犬心电图监测：
SCN5A基因编辑犬1910118在出生后每月进行心电检测分析，SCN5A基因编辑犬自出生后QRS波群和PR-I间期2个指标始终与野生型存在明显差异，QTcf间期在1个月和5个月龄时与野生型存在显著差异，参见图5。可以看出SCN5A基因编辑犬出现明显的心律失常相关心电电位变化，证明成功获得了SCN5A心律失常犬模型。
SCN5A基因编辑犬1910118的犬体细胞保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，其分类命名为比格犬成纤维细胞，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号(邮政编码100101)，保藏号为CGMCC No.19946，保藏日期为2020年6月3日。
本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。

Claims (15)

1.SCN5A基因编辑心律失常模型犬的建立方法，所述方法包括利用基因编辑技术获得SCN5A基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自BE3单碱基编辑技术、CRISPR、TALEN和ZFN，优选为CRISPR/Cas9。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括对SCN5A基因的2号外显子进行靶向突变，优选地，所述突变包括核苷酸的插入、删除、置换和/或添加修饰。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)根据犬SCN5A基因的2号外显子的序列确定打靶位点；
(2)根据步骤(1)确定的打靶位点合成sgRNA序列，然后将合成的序列与骨架载体连接构建sgRNA打靶载体；
(3)通过体外转录，分别获得sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物；
(4)将步骤(3)获得的sgRNA和CRISPR/Cas9的体外转录产物导入犬受精卵或犬体细胞中，获得SCN5A基因表达降低或缺失的犬受精卵或犬体细胞；
优选地，步骤(1)中，根据犬SCN5A基因的2号外显子的序列确定sgRNA，
优选地，所述sgRNA的序列及其互补序列包括以下序列：
sgRNA序列：CACCGGCGGCCATCGAGAAGCGCATGGg(SEQ ID NO:2)；
sgRNA互补序列：AAACCCATGCGCTTCTCGATGGCCGCCc(SEQ ID NO:3)。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将SCN5A基因表达降低或缺失的犬受精卵移植到受体母犬的输卵管内，从而制备SCN5A基因编辑心律失常模型犬；或者
所述方法还包括将SCN5A基因表达降低或缺失的犬体细胞的细胞核移植到犬去核卵母细胞中，然后将核移植后的犬去核卵母细胞移植到受体母犬的输卵管内，从而制备SCN5A基因编辑心律失常模型犬。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述SCN5A基因编辑心律失常模型犬中的SCN5A蛋白表达缺失，和/或
所述SCN5A基因编辑心律失常模型犬的基因组包含如SEQ ID NOs:7、8、10、11中至少一项所示的核苷酸序列。
7.由权利要求1-6任一项的建立方法获得的SCN5A基因编辑心律失常模型犬的犬体细胞、组织或器官；
优选地，所述犬体细胞、组织或器官中的SCN5A蛋白表达缺失，和/或包含如SEQ IDNOs:7、8、10、11中至少一项所示的核苷酸序列。
8.一种SCN5A基因编辑心律失常模型犬的犬体细胞，所述犬体细胞中的SCN5A蛋白表达缺失，和/或基因组包含如SEQ ID NOs:7、8、10、11中至少一项所示的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的犬体细胞，其特征在于，所述犬体细胞的分类命名为比格犬成纤维细胞，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.19946，保藏日期为2020年6月3日。
10.犬SCN5A基因编辑的打靶载体，所述打靶载体由针对犬SCN5A基因的2号外显子确定的打靶位点序列设计的sgRNA序列以及骨架载体构成；
优选地，所述sgRNA及其互补序列包括以下序列：
sgRNA序列：CACCGGCGGCCATCGAGAAGCGCATGGg(SEQ ID NO:2)；
sgRNA互补序列：AAACCCATGCGCTTCTCGATGGCCGCCc(SEQ ID NO:3)。
11.一种细胞，所述细胞包含权利要求9所述的打靶载体。
12.根据权利要求11所述的细胞，其特征在于，所述细胞不能发育为动物。
13.一种引物对组合物，所述引物对包括如下序列：
正向引物：ACGCACTGCGTCTGTGTTTTCTG(SEQ ID NO:4)；
反向引物：GTGCTTGCCCGCTTCTTCTCTTC(SEQ ID NO:5)；
优选地，所述引物对组合物还包括如下序列：
9bpneiF：GGCCATCGAGAAGCAAGTTCTCT(SEQ ID NO:12)
2bpneiR：GCTTGCTTCTCTGCCATGCTT(SEQ ID NO:13)
wtneiF：CGGCCATCGAGAAGCGC(SEQ ID NO:14)。
14.根据权利要求13所述的引物对组合物在检测包含SEQ ID NO:7或8所示的序列的基因组序列的SCN5A基因编辑心律失常模型犬中的应用。
15.权利要求1-6中任一项所述的方法获得的SCN5A基因编辑心律失常模型犬在心律失常疾病模型构建、心律失常疾病药物的筛选和/或评估中的应用。
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