CN114134178B - 致癌性小鼠模型及其建立方法和应用 - Google Patents

致癌性小鼠模型及其建立方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种致癌性小鼠模型及其建立方法和应用，属于动物模型技术领域。所述小鼠模型通过将包含人原癌基因c‑Ha‑ras(HRAS)基因序列片段的载体转入C57BL/6小鼠胚胎干细胞，经过囊胚注射，移植入受体鼠，经过筛选获得。本发明的小鼠模型采用干细胞打靶技术，建立高表达人原癌基因的转基因载体定点插入，构建得到的小鼠模型，直接以C57BL/6干细胞作为小鼠背景，不经过漫长回交即可直接获得纯净C57BL/6背景的定点插入模型，所得小鼠模型更加均一，结果一致性更好。

Description

致癌性小鼠模型及其建立方法和应用
技术领域
本发明涉及动物模型技术领域，特别是涉及一种致癌性小鼠模型及其建立方法和应用。
背景技术
人类疾病的动物模型(animal model of human disease)是指医学科学研究中建立的具有人类疾病模拟表型的动物。疾病动物模型使用可以追溯到19世纪，利用动物模型能把复杂问题简单化，能回答部分生命现象与规律，能帮助人们对看似无从下手生物问题着手研究。在基因组测序及后基因组时代，由于通过测序，发现了大量与人类遗传性疾病相关的基因，研究这些基因的功能、致病机制更离不开动物模型。历史上，众多知名科学家及人物都曾推动疾病动物模型发展，包括亚里士多德、首先开启活体解剖的盖伦、号称实验动物之父的Abbie E.C.Lathrop，建立第一个近交系小鼠DBA的C.C.Little等。
转基因动物模型构建技术是利用现代分子生物学手段，通过将外源性目的基因整合到动物基因组中，以获得表达能稳定遗传该外源基因的动物模型的一门技术，由该技术建立的动物模型称为转基因动物。目前已经建立了多种转基因方法，包括逆转录病毒转染法、精子载体介导法、显微注射法、胚胎干细胞介导法，以及目前比较通行CRISPR技术等。
上述方法各有其优缺点。如，CRISPR技术因操作简便，成本低廉等，目前使用最为广泛，但导入较小DNA片段时效率较高，虽然也有导入10余kb DNA片段的报道，但难度迅速增大。干细胞打靶技术操作难度较CRISPR方法大，技术要求高，需要基于特定种属的干细胞系，对于尚未建立稳定干细胞系的种属，如大型家畜，较难制备转基因动物。
基于CRISPR技术制作模型的技术已经非常普遍。但大片段敲入仍然是基因改造中最具挑战性的类型之一(见综述：Embryo-Based Large Fragment Knock-in in Mammals:Why,How and What’s Next Genes 2020,11,140；doi:10.3390/genes11020140)。大片段插入DNA片段有独到的价值，包括在生物学和生物医学研究的各个领域中。故大片段敲入本领域公认的难点技术。
此外，虽将DNA片段或者质粒注射入小鼠原核的转基因技术早在上世纪80年代末开始建立，其优点为技术门槛较低，比较容易操作。但转基因技术建立的小鼠模型往往具有拷贝数不确定、整合位点随机、转入基因容易丢失、性状不稳定的、个体差异较大的不足，目前逐渐为更加精确的定点插入技术取代。
然而，将外源基因定点插入宿主基因组的特定位点也是当今面临的技术难点之一。外源基因在宿主中的表达水平高低直接决定基因的表型，而表达水平受到启动子、增强子、插入位点等的诸多影响。插入位点还直接关系模型的遗传稳定性，某些宿主位点对插入外源基因“不友好”，往往会产生切割和排除外源基因，导致外源基因丢失，动物模型遗传不稳定等问题时有发生。
综上分析，要实现20kb以上的大片段外源基因插入小鼠基因组特定位点，获得正常表达和稳定遗传的动物模型是本领域的难点技术，目前鲜有类似报道。
HRAS基因在进化中相当保守，广泛存在于各种真核生物如哺乳类，果蝇，真菌，线虫及酵母中，提示它有重要的生理功能。哺乳动物的ras基因家族有三个成员，分别是H-ras,K-ras,N-ras。已经在多种肿瘤中发现ras基因突变，是肿瘤发生的驱动基因之一。
国外从上世纪80年代末开始建立转入人原癌基因HRAS的小鼠模型的研究，成功的先例有日本科学家在1990年建立的rasH2小鼠。该小鼠模型在致癌物诱导情况下，易于发生肿瘤，表现出较野生型小鼠对致癌物更加易感的特点。经过多次验证后，该小鼠模型被用于评价药物的潜在致癌性，具有重要的用途。
发明内容
基于此，有必要针对上述问题，提供一种致癌性小鼠模型的建立新方法，采用该方法得到的致癌性小鼠模型，具有个体间更加均一，用于致癌性评价时结果一致性更好的优势。
一种致癌性小鼠模型，所述小鼠模型通过将包含人原癌基因c-Ha-ras(HRAS)基因序列片段的载体转入C57BL/6小鼠胚胎干细胞，经过囊胚注射，移植入受体鼠，经过筛选获得。
本发明人在前期实践工作中发现，常规Tg.rasH2转基因模型构建时采用的是转基因方法，该方法制作的模型会存在外源基因表达的基因“沉默”现象，它既不等同于DNA损坏引起的基因表达水平低下，也不同于外源基因在世代传递中的丢失，是指外源基因稳定整合到受体基因组中后受到各种因素的影响，而在转基因动物的原代或后代中表达受到抑制的现象。
基于上述研究基础，本发明的小鼠模型采用干细胞打靶技术，建立高表达人原癌基因的转基因载体定点插入，构建得到的小鼠模型，直接以C57BL/6胚胎干细胞作为小鼠背景，不经过漫长回交即可直接获得纯净C57BL/6背景的定点插入模型，所得小鼠模型更加均一，结果一致性更好。
在其中一个实施例中，所述人原癌基因HRAS基因序列片段包含1-4个HRAS基因单元片段，所述HRAS基因单元片段序列如SEQ ID NO.1所示。优选的，所述人原癌基因HRAS基因序列片段包含3个HRAS基因片段。
在其中一个实施例中，所述人原癌基因HRAS基因序列片段包含至少2个以上的HRAS基因片段，且所述2个以上HRAS基因片段按照首尾串联的方式连接。即根据连接基因片段数量的不同，采取如：5’-HRAS-3’-5’-HRAS-3’,或者5’-HRAS-3’5’-HRAS-3’5’-HRAS-3’，或者5’-HRAS-3’5’-HRAS-3’5’-HRAS-3’5’-HRAS-3’等方式。
在其中一个实施例中，所述人原癌基因HRAS基因序列片段如SEQ ID NO.2所示。该片段设计思路为：根据GENE数据库中人原癌基因HRAS基因序列合成三个约7.0kb的高GC含量的片段，并将这三个片段进一步按首尾相连的顺序拼接在一起，从而形成一个21kb的含有三个拷贝的人原癌基因HRAS基因大片段。单一HRAS基因导入可能存在转基因表达水平低，效果不明显的现象。本发明创新性的将多个(如三个)HRAS基因拷贝数首尾串联，获得全新的组合Transgene，提高了基因的表达水平。
在其中一个实施例中，所述载体包含所述人原癌基因HRAS基因序列片段和HRAS内源启动子及调控序列。
在其中一个实施例中，将所述人原癌基因HRAS基因序列片段定点插入15E3位点。转基因方法构建的小鼠模型多数为随机插入，可能会导致宿主基因失活，整合不稳定等问题，而采用定点插入的方式，避免了上述问题的发生。
本发明还公开了上述致癌性小鼠模型的建立方法，包括以下步骤：
插入基因构建：根据参考基因组数据，设计并合成人原癌基因HRAS基因序列片段；
载体构建：通过酶切连接转化手段构建包括上述人原癌基因HRAS基因序列片段的打靶载体，并同时保留HRAS基因的内源启动子及调控序列，即得包含重组DNA的载体；
转染：将所述载体转入受体胚胎干细胞中，以选择培养基筛选抗药胚胎干细胞，并鉴定获得发生正确同源重组的胚胎干细胞；
获得嵌合体小鼠：将筛选得到的阳性胚胎干细胞注射到受体囊胚中，注射后存活的胚胎移植到假孕小鼠子宫中，让其受孕，待小鼠出生后，筛选鉴定获得嵌合体小鼠；
获得小鼠模型，将上述嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠交配，获得纯C57BL/6遗传背景的小鼠，基因型鉴定后阳性小鼠即为所述致癌性小鼠模型。
在其中一个实施例中，所述载体构建步骤为：扩增SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示片段A和B，回收片段A和B并通过酶切连接构建PL451-AB载体；扩增SEQ ID NO.5和SEQ IDNO.6所示片段C1和C2，回收片段C1和C2通过Gibson组装法连接到pDTA-down载体中，再将PL451-AB载体线性化后电转至BAC菌中，通过拯救方法，将抗性基因(Neo)重组到BAC载体上，得到包含抗性基因的BAC(Neo)菌；随后用pDTA-down-C载体将BAC(Neo)菌上的从C1到C2片段序列拯救到pDTA-down-C载体上面，转化后获得pDTA-ABC中间载体；再通过酶切连接的方式将人原癌基因HRAS的序列片段插入到pDTA-ABC中间载体，组装成转基因打靶载体pDTA-ES-RAS vector。
上述构建步骤中，可以理解的，可将A和B片段连接至pBlunt载体上，能够更好的对A和B片段进行酶切，也能更好的测序验证A和B片段的正确性；也可采用XhoI和NotI进行线性化，可让pDTA-down载体有对应切口，便于进行Gibson连接C1和C2片段操作。
在其中一个实施例中，所述转染步骤中，以电穿孔方式将所述载体转入受体胚胎干细胞中。
在其中一个实施例中，所述筛选步骤中，所述获得小鼠模型步骤中，以下述引物对进行PCR扩增检测对所得小鼠基因型进行鉴定：
Hras-LR-PCR-F：5'-GGCTTGACTGCCTGGGTGTTG-3'(SEQ ID NO.7)
Hras-LR-PCR-R：5'-CTGCAATTGGTCACGTGGCTG-3'(SEQ ID NO.8)。。
本发明还公开了上述的致癌性小鼠模型在作为受试物的药物、食品添加剂和/或医疗器械的长期毒性和/或致癌性试验评价中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的一种致癌性小鼠模型，为新的致癌性动物模型，构建新模型时，直接采用C57BL/6小鼠背景的干细胞，无需经过漫长回交直接获得纯净C57BL/6背景的转基因模型，因而小鼠模型个体间差异更小，结果一致性更好。
在转基因选择上，选择将3个拷贝的HRAS基因首尾串联，以提高转基因的表达水平，对后续模型性能具有较大的提高。
并且，本发明采用长片段同源臂，引导基因插入特定位点，而非随机整合，以避免宿主基因失活，整合不稳定等问题的发生。同时，本发明克服了较大的技术难度，将三个HRAS基因串联得到拷贝长度为21kb的长片段，整合到小鼠特定基因位点，推动了基因长片段整合技术的发展。
附图说明
图1为实施例中所用分子标记marker示意图；
图2为实施例1中合成的含有三个拷贝的人原癌基因HRAS基因大片段示意图；
图3为实施例1中的打靶载体策略示意图；
图4为实施例1中的打靶载体结构图；
图5为实施例1中PL451-AB载体验证试验结果；
图6为实施例1中pDTA-down-C载体验证试验结果；
图7为实施例1中pDTA-ABC载体验证试验结果；
图8为实施例1中pDTA-down-A1载体验证试验结果；
图9为实施例1中pDTA-down-A1A2载体验证试验结果；
图10为实施例1中pDTA-down-A1A2A3载体验证试验结果；
图11为实施例1中pDTA-down-ABC载体的PCR验证实验结果；
图12为实施例1中pDTA-down-ABC载体的Southern杂交实验验证结果；
图13为实施例1中阳性ES细胞的Southern杂交结果；
图14为实施例1中阳性ES细胞的杂交示意图；
图15为实施例1中阳性F1代小鼠的鉴定结果；
图16为实施例2中阳性试验组小鼠体重变化趋势；
图17为实施例2中阳性试验组小鼠存活率变化趋势；
图18为实施例2中不同脏器中肿瘤发生类型及比例情况；
图19为实施例2中代表性临床观察图片及典型病理图；
图20为实施例2中小鼠各脏器重量比较情况；
图21为实施例2中小鼠各脏器系数比较情况。
其中，图5-11采用图1中A分子标记作为marker；图12-13采用图1中B分子标记作为marker。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
以下实施例所用原料，如非特别说明，均为市售可得；以下实施例所用方法，如非特别说明，均为常规方法可实现；以下实施例中所用分子标记如图1所示，其中A为克隆实验所使用的分子标记，B是Southern blotting实验所使用的分子标记。
实施例1
一种致癌性小鼠模型，通过以下方法构建：
1、基因合成
根据NCBI数据库查询，获得单拷贝人原癌基因HRAS的完整序列。通过基因合成，获得单拷贝的HRAS序列，其序列如SEQ ID NO.1所示，并插入克隆载体；通过体内BAC(细菌人工染色体)重组与筛选，获得含有两个拷贝HRAS基因的克隆载体，实现两个拷贝串联。
经过方向鉴定，获得首尾串联方向正确的克隆；再次通过BAC拯救，将第三个拷贝的HRAS基因与之链接，经过方向鉴定，筛选出连接方向正确的、连接3个片段克隆载体，从而形成一个21kb的含有三个拷贝的人原癌基因HRAS基因大片段，并且保留HRAS内源启动子及调控序列，该片段结构如图2所示，其序列如SEQ ID NO.2所示。
2、载体构建
通过酶切转化等分子生物学手段构建含有3个拷贝、全长首尾串联排列的人原癌基因HRAS DNA大片段的打靶载体，并且保留HRAS内源启动子及调控序列，其打靶载体示意图如图3所示，该载体结构如图4所示，具体构建方法如下。
2.1首先构建带有抗性基因的鼠源同源臂序列的中间载体。
选择小鼠基因组扩增15E3附近4个片段，分别命名为A、B、C1和C2，片段序列分别为SEQ ID NO.3至SEQ ID NO.6。将C1-A之间片段作为打靶载体的左同源臂，B-C2之间作为打靶载体的右同源臂。
2.2通过PCR的方式扩增片段A和B两个片段。回收片段A和B酶切连接构建PL451-AB载体，然后测序。
选用内切酶Scal进行内切，所得片段大小为：2584bp、1793bp、1108bp；再选用内切酶HindIII进行内切，所得片段大小为：3530bp、1955bp；对所构建的PL451-AB载体进行限制性内切酶验证。
验证结果如图5所示，图中M为marker，各泳道数字表示不同样本编号，CK为阴性对照，从图中可以看出A和B片段已经正确连接到载体上，构建成PL451-AB中间载体。
2.3通过PCR的方式扩增片段C1和C2两个片段。回收片段C1和C2通过Gibson组装法连接到pDTA-down载体中，然后测序。
选用内切酶EcoRl和EcoRV进行内切，所得片段大小为：4304bp、2198bp2；选用内切酶Xhol和Notl进行内切，所得片段大小为：5483bp、1019bp；对所构建的pDTA-down-C载体进行限制性内切酶验证。
验证结果如图6所示，图中M为marker，各泳道数字表示不同样本编号，ck为阴性对照，从图中可以看出C1和C2片段已经正确连接到载体上，构建成pDTA-down-C中间载体。
2.4将含有A和B片段的带有抗性基因的载体PL451-AB线性化后电转BAC质粒，通过拯救方法，将抗性基因重组到BAC菌上。
随后用pDTA-down-C载体将包含抗性基因的BAC(Neo)菌上的从C1到C2这段序列拯救到pDTA-down-C载体上面，转化后获得pDTA-ABC中间载体。
选用内切酶Bglll进行内切，所得片段大小为：7645bp、4277bp、2239bp、1717bp、1180bp、170bp；选用内切酶EcoRI进行内切，所得片段大小为：8913bp、3615bp、1864bp、1347bp、808bp、681bp；选用内切酶BamHl+Salll进行内切，所得片段大小为：8178bp、6404bp、1883bp、763bp；对所构建的pDTA-ABC中间载体进行限制性内切酶验证，所有克隆都是正确的，随机挑选6-2号和8-1号样本送去测序验证，实验结果显示序列正确。
验证结果如图7所示，图中M为marker，各泳道数字表示不同样本编号，ck为阴性对照，从图中可以看出A、B、C1和C2片段已经正确连接到载体上，构建成pDTA-ABC中间载体。
2.5通过酶切链接的方式将合成的转基因片段A1、A2、A3这三个拷贝(即首尾相接的三个HRAS基因单元片段)的人原癌基因HRAS的序列片段依次插入到pDTA-ABC中间载体，组装成最终的转基因打靶载体pDTA-ES-RAS vector。A1、A2、A3片段分别是合成的人原癌基因HRAS的序列片段。
(1)pDTA-down-A1载体验证。
选用内切酶Pacl和Swal进行内切，所得片段大小为：17745bp、6602bp，选用内切酶Xhol进行内切，所得片段大小为：19138bp、5209bp；对所构建的pDTA-down-A1载体进行限制性内切酶验证。
验证结果如图8所示，图中M为marker，左起第二泳道为样本经Pacl和Swal酶切片段，左起第三用到为样本经Xhol酶切片段，ck为阴性对照，从图中可以看出A1片段已经正确连接到载体上，构建成pDTA-down-A1中间载体。
(2)pDTA-down-A1A2载体验证。
选用内切酶BamHl和Sall进行内切，所得片段大小为：15180bp、8849bp、6513bp、803bp；选用内切酶EcoRV和Pacl进行内切，所得片段大小为：24347bp、6998bp,对所构建的pDTA-down-A1A2载体进行限制性内切酶验证。
验证结果如图9所示，图中M为marker，ck为阴性对照，从图中可以看出A1和A2片段已经正确连接到载体上，构建成pDTA-down-A1A2中间载体。
(3)pDTA-down-A1A2A3载体验证。
选用内切酶EcoRV和Sall进行内切，所得片段大小为：22977bp、15326bp，选用内切酶BamHI进行内切，所得片段大小为：15180bp、8809bp、7316bp、6998bp，选用内切酶Pacl和Mlul进行内切，所得片段大小为：23081bp、15222bp；对所构建的pDTA-down-A1A2A3载体进行限制性内切酶验证。
验证结果如图10所示，图中M为marker，ck为阴性对照，从图中可以看出看出A1\A2\和A3片段已经正确连接到载体上，构建成pDTA-down-A1A2A3中间载体。
2.6首先通过长片段PCR方法对载体进行验证。
优化LR-PCR引物，预期片段:5726bp。优化所得NEO-PCR引物对如下：
Hras-PCR-F2：GCTCGACTAGAGCTTGCGGA(SEQ ID NO.9)
Hras-PCR-R2：CACTGTCATCATGCATCCTTC(SEQ ID NO.10)
模板选用:野生型基因组DNA及重组后的BAC,pDTA-down-ABC。
验证结果如图11所示，结果显示：目的片段已经整合到pDTA-down-ABC载体中。
2.7进一步使用Southern杂交实验进行验证：设计5'端和3'端探针，模板使用从小鼠ES细胞分离的DNA进行实验。
验证结果如图12所示，从图中可以看出，目的片段符合预期。
3、转染获得阳性ES细胞
3.1将打靶载体线性化，通过电穿孔的方法，将打靶载体转染入ES细胞中。
转染的ES细胞与新鲜的DMEM+10％FBS细胞培养基混匀，分入已长满滋养层细胞的培养皿。培养24小时后，换成含有G418的筛选培养基，此后每天更换新鲜的筛选培养基。转染7天后可以开始挑取克隆，共挑选了400个克隆。
将ES克隆变成单细胞悬液，每天换新鲜的细胞培养液，培养2-3天后，将其中一块培养皿冻存。将剩余一块96孔培养皿中的克隆经胰蛋白酶消化后转移至24孔培养皿中，用滋养层细胞培养基培养至培养基颜色变成黄色。每孔加入细胞裂解缓冲液，裂解细胞，再转移至Bppendorf管中。提取基因组DNA后用BamHI和EcoRV分别酶切，用打靶载体5'端外侧的探针进行Southern杂交，杂交结果如图13所示，从图中可以看出，在野生型(WT)出现一条约20.6kb的阳性条带。ES阳性克隆分别是10.4kb,18.3kb，15.2kb三个新片段，Southern blot结果说明插入片段大小正确，片段排列方向与顺序正确。所得的ES细胞克隆的Southern杂交示意图如图14所示。最后通过LR-PCR和Southern blot实验方法挑选了11个阳性ES细胞进行下一步实验。
3.2将阳性ES细胞克隆进一步通过干细胞克隆核型鉴定实验后挑选其中一个正确核型ES细胞进行注射。
表1.HRAS小鼠模型的核型鉴定实验结果图
Figure BDA0003403614860000051
从上述结果中，可见1-C06、1-F12、1-C10、4-A01、3-A01克隆染色体数正确且染色体结构异常率都符合要求。进一步开展了细胞的RNA水平目的基因表达量实验，结果显示1-C06的表达量最高，随后用该克隆进行细胞注射。
4、嵌合体小鼠获得
将筛选的ES细胞注射到受体囊胚中，将注射后存活的胚胎移植到假孕小鼠子宫中，让其受孕，
待小鼠出生后，通过观察毛色的嵌合与否和嵌合程度判断是否获得嵌合体小鼠。
表2.HRAS小鼠模型的ES细胞注射实验结果
Figure BDA0003403614860000052
待小鼠出生后，通过观察毛色的嵌合与否和嵌合程度判断并获得嵌合体小鼠。
5、小鼠模型获得
将嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠进行交配获得16只后代，交配表如下所示。
表3.KI.C57-rasV2.0小鼠模型的杂合鼠交配表
嵌合体序号 克隆号 嵌合小鼠 性别 黑色幼鼠数
S1X3-001 1-C06 / 雄性 16
并对所得小鼠进行基因型鉴定，具体方法如下：
剪10天小鼠尾巴尖约0.5cm放入EP管中，用苯酚法提取DNA基因组，溶于TE溶液用于检测。以DNA基因组作为PCR反应的模板，用下表4所示Hras-LR-PCR-F和Hras-LR-PCR-R引物对鉴定野生型和杂合型的Hras基因。这对引物能扩增出大小为4807bp的条带。引物Hras-LR-PCR-F位于小鼠C1片段，Hras-LR-PCR-R位于人源A1片段，从而区分出不同基因型的子代小鼠。
随后，对上述得到的杂合体小鼠进行基因型鉴定其基因型鉴定引物设计如下表所示。
表4.HRAS小鼠模型的基因型鉴定引物设计
Figure BDA0003403614860000061
鉴定结果如图15所示，从图中可以看出，6个样本扩增出目的4807bp条带，即获得6只阳性F1代小鼠模型，命名为KI.C57-rasV2.0模型小鼠。
实施例2
本实施例对上述得到的小鼠模型进行验证。
1、致癌性验证实验设计
本试验方案参照了NMPA发布的药物致癌试验必要性的技术指导原则,ICH发布的S1A和S1B指导原则进行设计(REF1-4)，检测项目按照GLP条件下药物致癌性评价内容来执行。
试验共分别为溶媒对照组和阳性试验组，剂量为75mg/kg，给药方式为单次腹腔注射，阳性致癌物选用甲基亚硝基脲(MNU)。
阳性试验组共分为2组：(1)转基因小鼠MNU组(KI.C57-HRAS，或者称为KI.C57-rasV2.0)，共50只，雌雄各25只；(2)野生型小鼠MNU组(C57BL/6)，共50只，雌雄各25只；
溶媒对照组：(1)转基因小鼠组，共50只，雌雄各25只。
给药后持续观察26周，观察指标如下：①临床症状；②体重(1次/周)；③摄食量(1次/周)；④肿瘤触诊(给药后第9周开始，1次/周)；⑥血清生化；⑦大体解剖；⑧病理。
2、给予MNU后体重及生存率
试验期间，溶媒对照组所有动物中，雌性组有1只于21周濒死解剖，其余均存活至观察期结束，未见明显异常。
给予MNU后体重及生存率实验结果如图16-17所示，从图16中可以看出，试验期间，自第2周起阳性试验组雌鼠中，转基因小鼠MNU组体重均值持续低于野生小鼠MNU组，其中试验第11周开始，转基因小鼠MNU组体重均值与野生小鼠MNU组比较显著降低(P≤0.05)。自第7周起阳性试验组雄鼠中，转基因小鼠MNU组体重均值持续低于野生小鼠MNU组，其中试验第24周开始，转基因小鼠MNU组体重均值与野生小鼠MNU组比较显著降低(P≤0.05)。
至26周观察期结束，阳性试验组雄鼠存活8只，雌鼠存活12只，生存率分别为16％、24％。雌性动物最早出现死亡时间D56，雄性动物最早出现死亡时间D65，为本试验首次发现雌鼠死亡，具体见图17。
3、大体观察肿瘤发生结果
通过26周的实验观察，阳性组中KI.C57-rasV2.0模型小鼠组给药后出现多只的前胃结节、皮肤、口鼻爪的肉瘤样结节、胸腺增大、脾脏肿大、肾脏肿物等临床病变，溶媒对照组出现雌雄各一只的临床病变。具体结果见表5。
表5.MNU单次给药转基因小鼠给药后临床观察统计
Figure BDA0003403614860000062
Figure BDA0003403614860000071
注：KI.C57-ras V2.0即为KI.C57-HRAS小鼠，WT为C57BL/6小鼠。
4、肿瘤类型与比例
26周的实验结束后，对所有动物进行解剖计划取材，将所取得组织脏器均进行组织病理学检查。
进一步统计不同试验组的肿瘤类型并计算发生比例，肿瘤类型主要为多器官恶性淋巴瘤、前胃及皮肤鳞状细胞癌、鳞状细胞乳头状瘤，肺脏腺瘤及增生以及肠腺癌等肿瘤，与文献报道一致。阳性试验组的KI.C57-rasV2.0模型小鼠(KI C57-HRAS)和野生型小鼠(C57BL/6)的恶性淋巴瘤肿瘤发生率分别是63.1％和82.03％，典型肿瘤鳞状细胞癌、鳞状细胞乳头状瘤、鳞状细胞乳头状增生的在KI.C57-rasV2.0模型小鼠的比例均高于野生型小鼠，具体见下表。
表6.肿瘤类型及发生比例统计
Figure BDA0003403614860000072
5、不同脏器中肿瘤发生类型及比例
不同脏器中肿瘤发生类型及比例也是致癌性实验观察指标之一，不同脏器中肿瘤发生类型及比例如图18所示，其中，A-F分别为恶性淋巴瘤(Malignant lymphoma)、鳞状细胞皮肤癌(Squamous cell carcinoma)、腺癌(Adenocarcinoma)、腺瘤(Aadenoma)、鳞状细胞增生(Squamous cell hyperplasia)和鳞状细胞乳头状瘤(Squamous cell papilloma)在不同脏器中的发生比例。
通过统计得出MNU给药后，多诱发阳性试验组KI.C57-rasV2.0模型小鼠和野生型小鼠多组织脏器的恶性淋巴瘤，常累及胸腺、脾脏、肝脏、淋巴结和骨髓。对于典型肿瘤类型皮肤乳头状瘤、乳头状瘤、鳞状细胞癌及淋巴瘤多发生于特定的组织脏器，比如前胃、皮肤，且比例明显高于野生型小鼠，这种给药后出现的组织病理学特征与文献报道特征一致，进一步证实本发明制备得到的小鼠模型具有对致癌物易感的特点。
6、代表性肿瘤类型及病理特征
代表性临床观察图片及典型病理如图19所示，其中A-C分别是观察到的阴部皮肤、爪、口腔部位的结节突起，D是病理诊断为阴部皮肤鳞状细胞乳头状瘤的组织染色切片、E前胃鳞状细胞乳头状瘤的组织染色切片，F前胃鳞状细胞癌的组织染色切片。
7、脏器重量及系数
脏器重量及系数的统计数据详见图20及图21，根据实验结果分性别统计了阳性试验组的KI.C57-rasV2.0模型小鼠和野生型小鼠的脏器重量及系数。
脏器重量方面，雌鼠的肺重量、雄鼠的心脏、胃重量与野生型小鼠相比有统计学差异(P≤0.05)；脏器系数方面，雌鼠的脑系数、雄鼠的脑、心脏、肝脏、肺脏、肾脏、胃、胸腺和脾脏系数显著有统计学差异(P≤0.05或P≤0.01)。特别是雄鼠的胃脏器系数明显低于野生型小鼠。
8、自发肿瘤发生率
模型自发肿瘤率是验证致癌性小鼠模型的关键指标，因为模型小鼠自发肿瘤率过高会发生实验结果难以评估的问题。
选取50只KI.C57-rasV2.0模型小鼠，雌雄各半，进行自发肿瘤监测实验，实验周期8个月，在21周观察到各1只雌性或雄性小鼠的外生殖器结节，其它未见异常，对所有脏器HE染色，50只小鼠中有1只的前胃病变组织病理学诊断为鳞状细胞乳头状瘤，计算得出自发肿瘤发生率是2％，符合致癌性小鼠模型要求。
实施例3
对实施例1制备得到的小鼠模型进行致癌实验验证。
1、验证实例1
选取KI.C57-rasV2.0模型小鼠，雌雄各半，按性别和体重大小通过简单随机化分组方式分为2组。组1为0.5％CMC-Na阴性对照组，每性别25只动物。组2为MNU阳性对照组(N甲基亚硝基脲，剂量为80mg/kg)，每性别15只动物。第1组每天1次经口灌胃，连续给药26周。第2组第一天腹腔注射甲基亚硝基脲(MNU)，给药1次。
实验结果显示：0.5％CMC-Na阴性对照组雄性所有动物均存活至计划解剖日，未出现非计划性死亡动物；雌性1只动物D79死亡，其余均存活至计划解剖日。阳性对照MNU组，雄性动物首次死亡时间是D53，末期存活率是33.3％；雌性动物首次死亡时间是D66，末期存活率是20％；其他均存活到计划解剖前濒死或发现死亡。
2、验证实例2
选取KI.C57-rasV2.0模型小鼠，按性别和体重大小通过简单随机化分组方式分为2组。组1为溶媒对照组，雌鼠4只，雄鼠11只。组2为MNU阳性对照组(甲基亚硝基脲，剂量为75mg/kg)，每性别15只动物，给药方式为单次腹腔注射。
至26周观察期结束，MNU阳性对照组，雄性动物首次死亡时间是D22，末期存活率是53.3％；雄性动物首次死亡时间是D88，末期存活率是20％。
雄性和雌性小鼠的肿瘤发生率分别为86.7％和66.7％。雌雄性小鼠前胃相关肿瘤率分别是26％和40％。发生肿瘤的主要靶器官，雄性小鼠是皮肤、胃、肺、气管、尿道、淋巴结，雌性小鼠是乳腺、皮肤、胃、肺、尿道、免疫造血系统、哈氏腺。其中，典型肿瘤鳞状细胞癌、鳞状细胞乳头状瘤、鳞状细胞乳头状增生在MNU阳性对照组小鼠的比例均高于溶媒对照组小鼠。
脏器重量及系数的统计数据，与溶媒对照组比较，MNU阳性对照组雌鼠的心脏重量、脑重量显著降低(P≤0.05)，子宫重量、子宫系数、肺脏系数显著升高(P≤0.05或P≤0.01)。与阴性对照组比较，MNU阳性对照组雄鼠的体重均值显著降低(P≤0.05)，脑系数及脾脏系数显著升高(P≤0.05或P≤0.01)。
综上，本发明成功的将长达21kb的DNA片段定点插入15E3位点中，该基因稳定整合入基因组，能正常表达，能稳定遗传；经过测序验证，插入位点正确。给予MNU阳性致癌物，本模型能很快发生肿瘤，初次死亡时间较野生型早，肿瘤谱发生改变，在前胃、皮肤等靶器官产生了特异性肿瘤；表明该模型对致癌物易感，可以用于药物、医疗器械的潜在致癌性，也可以用于肿瘤发生机制研究。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 中国食品药品检定研究院
<120> 致癌性小鼠模型及其建立方法和应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 6386
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgaggtgct tgctgaaggc aaagggaata caaaataggt agcagaagat agttattaat 60
accagctaca gccacgtgac caattgcaga aacaaggatt gtaattgtca cgactatttc 120
ctccttattt tgttaaaaat gtttgtgcat gtatacactt gtactaagaa aacatcttca 180
ttaatttcct ttctttttcc attatcatgt gacataagat ttattgattt tatatcagca 240
tttaaatgtt gttaacttta tgtaatagca tttaggttaa ggattagtgt gcttctggtt 300
gtatgaagga tagctgtatt acgttaggtg taattatgac cttattattt cctttatttg 360
gagattaaat atgatttcag gagatgtgta tgggttcaag ttgacaaggg gttcaagttg 420
acaaggactt gtgatgttaa tatatcaacc tgatcagatt gaaggatgcc tagatagctg 480
gtaaacttgt tcctgggtgt gtctgtgagg gtgttgccag aggagattag gagatgccgc 540
cccgggcccc cagacaccgg ctccctggcc ttcctcgagc aaccccgagc tcggctccgg 600
tctccagcca agcccaaccc cgagaggccg cggccctact ggctccgcct cccgcgttgc 660
tcccggaagc cccgcccgac cgcggctcct gacagacggg ccgctcagcc aaccggggtg 720
gggcggggcc cgatggcgcg cagccaatgg taggccgcgc ctggcagacg gacgggcgcg 780
gggcggggcg tgcgcaggcc cgcccgagtc tccgccgccc gtgccctgcg cccgcaaccc 840
gagccgcacc cgccgcggac ggagcccatg cgcggggcga accgcgcgcc cccgcccccg 900
ccccgccccg gcctcggccc cggccctggc cccgggggca gtcgcgcctg tgaacggtga 960
gtgcgggcag ggatcggccg ggccgcgcgc cctcctcgcc cccaggcggc agcaatacgc 1020
gcggcgcggg ccgggggcgc ggggccggcg ggcgtaagcg gcggcggcgg cggcggcggc 1080
gggtgggtgg ggccgggcgg ggcccgcggg cacaggtgag cgggcgtcgg gggctgcggc 1140
gggcgggggc cccttcctcc ctggggcctg cgggaatccg ggccccaccc gtggcctcgc 1200
gctgggcacg gtccccacgc cggcgtaccc gggagcctcg ggcccggcgc cctcacaccc 1260
gggggcgtct gggaggaggc ggccgcggcc acggcacgcc cgggcacccc cgattcagca 1320
tcacaggtcg cggaccaggc cgggggcctc agccccagtg ccttttccct ctccgggtct 1380
cccgcgccgc ttctcggccc cttcctgtcg ctcagtccct gcttcccagg agctcctctg 1440
tcttctccag ctttctgtgg ctgaaagatg cccccggttc cccgccgggg gtgcggggcg 1500
ctgcccgggt ctgccctccc ctcggcggcg cctagtacgc agtaggcgct cagcaaatac 1560
ttgtcggagg caccagcgcc gcggggcctg caggctggca ctagcctgcc cgggcacgcc 1620
gtggcgcgct ccgccgtggc cagacctgtt ctggaggacg gtaacctcag ccctcgggcg 1680
cctcccttta gcctttctgc cgacccagca gcttctaatt tgggtgcgtg gttgagagcg 1740
ctcagctgtc agccctgcct ttgagggctg ggtccctttt cccatcactg ggtcattaag 1800
agcaagtggg ggcgaggcga cagccctccc gcacgctggg ttgcagctgc acaggtaggc 1860
acgctgcagt ccttgctgcc tggcgttggg gcccagggac cgctgtgggt ttgcccttca 1920
gatggccctg ccagcagctg ccctgtgggg cctggggctg ggcctgggcc tggctgagca 1980
gggccctcct tggcaggtgg ggcaggagac cctgtaggag gaccccgggc cgcaggcccc 2040
tgaggagcga tgacggaata taagctggtg gtggtgggcg ccggcggtgt gggcaagagt 2100
gcgctgacca tccagctgat ccagaaccat tttgtggacg aatacgaccc cactatagag 2160
gtgagcctgg cgccgccgtc caggtgccag cagctgctgc gggcgagccc aggacacagc 2220
caggataggg ctggctgcag cccctggtcc cctgcatggt gctgtggccc tgtctcctgc 2280
ttcctctaga ggaggggagt ccctcgtctc agcaccccag gagaggaggg ggcatgaggg 2340
gcatgagagg taccagggag aggctggctg tgtgaactcc ccccacggaa ggtcctgagg 2400
gggtccctga gccctgtcct cctgcaggat tcctaccgga agcaggtggt cattgatggg 2460
gagacgtgcc tgttggacat cctggatacc gccggccagg aggagtacag cgccatgcgg 2520
gaccagtaca tgcgcaccgg ggagggcttc ctgtgtgtgt ttgccatcaa caacaccaag 2580
tcttttgagg acatccacca gtacaggtga accccgtgag gctggcccgg gagcccacgc 2640
cgcacaggtg gggccaggcc ggctgcgtcc aggcaggggc ctcctgtcct ctctgcgcat 2700
gtcctggatg ccgctgcgcc tgcagccccc gtagccagct ctcgctttcc acctctcagg 2760
gagcagatca aacgggtgaa ggactcggat gacgtgccca tggtgctggt ggggaacaag 2820
tgtgacctgg ctgcacgcac tgtggaatct cggcaggctc aggacctcgc ccgaagctac 2880
ggcatcccct acatcgagac ctcggccaag acccggcagg tgaggcagct ctccacccca 2940
cagctagcca gggacccgcc ccgccccgcc ccagccaggg agcagcactc actgaccctc 3000
tcccttgaca cagggcagcc gctctggctc tagctccagc tccgggaccc tctgggaccc 3060
cccgggaccc atgtgaccca gcggcccctc gcgctgtagg tctcccggga cggcagggca 3120
gtgagggagg cgagggccgg ggtctgggct cacgccctgc agtcctgggc cgacacagct 3180
ccggggaagg cggaggtcct tggggagagc tgccctgagc caggccggag cggtgaccct 3240
ggggcccggc ccctcttgtc cccagagtgt cccacgggca cctgttggtt ctgagtctta 3300
gtggggctac tggggacacg ggccgtagct gagtcgagag ctgggtgcag ggtggtcaaa 3360
ccctggccag acctggagtt caggagggcc ccgggccacc ctgacctttg aggggctgct 3420
gtagcatgat gcgggtggcc ctgggcactt cgagatggcc agagtccagc ttcccgtgtg 3480
tgtggtgggc ctggggaagt ggctggtgga gtcgggagct tcgggccagg caaggcttga 3540
tcccacagca gggagcccct cacccaggca ggcggccaca ggccggtccc tcctgatccc 3600
atccctcctt tcccagggag tggaggatgc cttctacacg ttggtgcgtg agatccggca 3660
gcacaagctg cggaagctga accctcctga tgagagtggc cccggctgca tgagctgcaa 3720
gtgtgtgctc tcctgacgca ggtgaggggg actcccaggg cggccgccac gcccaccgga 3780
tgaccccggc tccccgcccc tgccggtctc ctggcctgcg gtcagcagcc tcccttgtgc 3840
cccgcccagc acaagctcag gacatggagg tgccggatgc aggaaggagg tgcagacgga 3900
aggaggagga aggaaggacg gaagcaagga aggaaggaag ggctgctgga gcccagtcac 3960
cccgggaccg tgggccgagg tgactgcaga ccctcccagg gaggctgtgc acagactgtc 4020
ttgaacatcc caaatgccac cggaacccca gcccttagct cccctcccag gcctctgtgg 4080
gcccttgtcg ggcacagatg ggatcacagt aaattattgg atggtcttga tcttggtttt 4140
cggctgaggg tgggacacgg tgcgcgtgtg gcctggcatg aggtatgtcg gaacctcagg 4200
cctgtccagc cctgggctct ccatagcctt tgggaggggg aggttgggag aggccggtca 4260
ggggtctggg ctgtggtgct ctctcctccc gcctgcccca gtgtccacgg cttctggcag 4320
agagctctgg acaagcaggc agatcataag gacagagagc ttactgtgct tctaccaact 4380
aggagggcgt cctggtcctc cagagggagg tggtttcagg ggttggggat ctgtgccggt 4440
ggctctggtc tctgctggga gccttcttgg cggtgagagg catcaccttt cctgacttgc 4500
tcccagcgtg aaatgcacct gccaagaatg gcagacatag ggaccccgcc tcctgggcct 4560
tcacatgccc agttttcttc ggctctgtgg cctgaagcgg tctgtggacc ttggaagtag 4620
ggctccagca ccgactggcc tcaggcctct gcctcattgg tggtcgggta gcggccagta 4680
gggcgtggga gcctggccat ccctgcctcc tggagtggac gaggttggca gctggtccgt 4740
ctgctcctgc cccactctcc cccgcccctg ccctcaccct acccttgccc cacgcctgcc 4800
tcatggctgg ttgctcttgg agcctggtag tgtcactggc tcagccttgc tgggtataca 4860
caggctctgc cacccactct gctccaaggg gcttgccctg ccttgggcca agttctaggt 4920
ctggccacag ccacagacag ctcagtcccc tgtgtggtca tcctggcttc tgctgggggc 4980
ccacagcgcc cctggtgccc ctcccctccc agggcccggg ttgaggctgg gccaggcccc 5040
tctgggacgg ggacttgtgc cctgtcaggg ttccctatcc ctgaggttgg gggagagcta 5100
gcagggcatg ccgctggctg gccagggctg cagggacact cccccttttg tccagggaat 5160
accacactcg cccttctctc cagcgaacac cacactcgcc cttctctcca ggggacgcca 5220
cactccccct tctgtccagg ggacgccaca ctcccccttc tctccagggg acgccacact 5280
cgcccttctc tccaggggac gccacactcg cccttctctc caggggacgc cacactcccc 5340
cttctgtcca ggggacgcca cactcgccct tctctccagg ggacgccaca ctcgcccttc 5400
tctccagggg acgccacact cgcccttctc tccaggggac gccacacttg cccttctgtc 5460
cagggaatgc cacactcccc cttctcccca gcagcctccg agtgaccagc ttccccatcg 5520
atagacttcc cgaggccagg agccctctag ggctgccggg tgccaccctg gctccttcca 5580
caccgtgctg gtcactgcct gctgggggcg tcagatgcag gtgaccctgt gcaggaggta 5640
tctctggacc tgcctcttgg tcattacggg gctgggcagg gcctggtatc agggccccgc 5700
tggggttgca gggctgggcc tgtgctgtgg tcctggggtg tccaggacag acgtggaggg 5760
gtcagggccc agcacccctg ctccatgctg aactgtggga agcatccagg tccctgggtg 5820
gcttcaacag gagttccagc acgggaacca ctggacaacc tggggtgtgt cctgatctgg 5880
ggacaggcca gccacacccc gagtcctagg gactccagag agcagcccac tgccctgggc 5940
tccacggaag ccccctcatg ccgctaggcc ttggcctcgg ggacagccca gctaggccag 6000
tgtgtggcag gaccaggccc ccatgtggga gctgacccct tgggattctg gagctgtgct 6060
gatgggcagg ggagagccag ctcctcccct tgagggaggg tcttgatgcc tggggttacc 6120
cgcagaggcc tgggtgccgg gacgctcccc ggtttggctg aaaggaaagc agatgtggtc 6180
agcttctcca ctgagcccat ctggtcttcc cggggctggg ccccatagat ctgggtccct 6240
gtgtggcccc cctggtctga tgccgaggat acccctgcaa actgccaatc ccagaggaca 6300
agactgggaa gtccctgcag ggagagccca tccccgcacc ctgacccaca agagggactc 6360
ctgctgccca ccaggcatcc ctccag 6598
<210> 2
<211> 19460
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgaggtgct tgctgaaggc aaagggaata caaaataggt agcagaagat agttattaat 60
accagctaca gccacgtgac caattgcaga aacaaggatt gtaattgtca cgactatttc 120
ctccttattt tgttaaaaat gtttgtgcat gtatacactt gtactaagaa aacatcttca 180
ttaatttcct ttctttttcc attatcatgt gacataagat ttattgattt tatatcagca 240
tttaaatgtt gttaacttta tgtaatagca tttaggttaa ggattagtgt gcttctggtt 300
gtatgaagga tagctgtatt acgttaggtg taattatgac cttattattt cctttatttg 360
gagattaaat atgatttcag gagatgtgta tgggttcaag ttgacaaggg gttcaagttg 420
acaaggactt gtgatgttaa tatatcaacc tgatcagatt gaaggatgcc tagatagctg 480
gtaaacttgt tcctgggtgt gtctgtgagg gtgttgccag aggagattag gagatgccgc 540
cccgggcccc cagacaccgg ctccctggcc ttcctcgagc aaccccgagc tcggctccgg 600
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gggcggggcc cgatggcgcg cagccaatgg taggccgcgc ctggcagacg gacgggcgcg 780
gggcggggcg tgcgcaggcc cgcccgagtc tccgccgccc gtgccctgcg cccgcaaccc 840
gagccgcacc cgccgcggac ggagcccatg cgcggggcga accgcgcgcc cccgcccccg 900
ccccgccccg gcctcggccc cggccctggc cccgggggca gtcgcgcctg tgaacggtga 960
gtgcgggcag ggatcggccg ggccgcgcgc cctcctcgcc cccaggcggc agcaatacgc 1020
gcggcgcggg ccgggggcgc ggggccggcg ggcgtaagcg gcggcggcgg cggcggcggc 1080
gggtgggtgg ggccgggcgg ggcccgcggg cacaggtgag cgggcgtcgg gggctgcggc 1140
gggcgggggc cccttcctcc ctggggcctg cgggaatccg ggccccaccc gtggcctcgc 1200
gctgggcacg gtccccacgc cggcgtaccc gggagcctcg ggcccggcgc cctcacaccc 1260
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cccgcgccgc ttctcggccc cttcctgtcg ctcagtccct gcttcccagg agctcctctg 1440
tcttctccag ctttctgtgg ctgaaagatg cccccggttc cccgccgggg gtgcggggcg 1500
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gtggcgcgct ccgccgtggc cagacctgtt ctggaggacg gtaacctcag ccctcgggcg 1680
cctcccttta gcctttctgc cgacccagca gcttctaatt tgggtgcgtg gttgagagcg 1740
ctcagctgtc agccctgcct ttgagggctg ggtccctttt cccatcactg ggtcattaag 1800
agcaagtggg ggcgaggcga cagccctccc gcacgctggg ttgcagctgc acaggtaggc 1860
acgctgcagt ccttgctgcc tggcgttggg gcccagggac cgctgtgggt ttgcccttca 1920
gatggccctg ccagcagctg ccctgtgggg cctggggctg ggcctgggcc tggctgagca 1980
gggccctcct tggcaggtgg ggcaggagac cctgtaggag gaccccgggc cgcaggcccc 2040
tgaggagcga tgacggaata taagctggtg gtggtgggcg ccggcggtgt gggcaagagt 2100
gcgctgacca tccagctgat ccagaaccat tttgtggacg aatacgaccc cactatagag 2160
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ttcctctaga ggaggggagt ccctcgtctc agcaccccag gagaggaggg ggcatgaggg 2340
gcatgagagg taccagggag aggctggctg tgtgaactcc ccccacggaa ggtcctgagg 2400
gggtccctga gccctgtcct cctgcaggat tcctaccgga agcaggtggt cattgatggg 2460
gagacgtgcc tgttggacat cctggatacc gccggccagg aggagtacag cgccatgcgg 2520
gaccagtaca tgcgcaccgg ggagggcttc ctgtgtgtgt ttgccatcaa caacaccaag 2580
tcttttgagg acatccacca gtacaggtga accccgtgag gctggcccgg gagcccacgc 2640
cgcacaggtg gggccaggcc ggctgcgtcc aggcaggggc ctcctgtcct ctctgcgcat 2700
gtcctggatg ccgctgcgcc tgcagccccc gtagccagct ctcgctttcc acctctcagg 2760
gagcagatca aacgggtgaa ggactcggat gacgtgccca tggtgctggt ggggaacaag 2820
tgtgacctgg ctgcacgcac tgtggaatct cggcaggctc aggacctcgc ccgaagctac 2880
ggcatcccct acatcgagac ctcggccaag acccggcagg tgaggcagct ctccacccca 2940
cagctagcca gggacccgcc ccgccccgcc ccagccaggg agcagcactc actgaccctc 3000
tcccttgaca cagggcagcc gctctggctc tagctccagc tccgggaccc tctgggaccc 3060
cccgggaccc atgtgaccca gcggcccctc gcgctgtagg tctcccggga cggcagggca 3120
gtgagggagg cgagggccgg ggtctgggct cacgccctgc agtcctgggc cgacacagct 3180
ccggggaagg cggaggtcct tggggagagc tgccctgagc caggccggag cggtgaccct 3240
ggggcccggc ccctcttgtc cccagagtgt cccacgggca cctgttggtt ctgagtctta 3300
gtggggctac tggggacacg ggccgtagct gagtcgagag ctgggtgcag ggtggtcaaa 3360
ccctggccag acctggagtt caggagggcc ccgggccacc ctgacctttg aggggctgct 3420
gtagcatgat gcgggtggcc ctgggcactt cgagatggcc agagtccagc ttcccgtgtg 3480
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atccctcctt tcccagggag tggaggatgc cttctacacg ttggtgcgtg agatccggca 3660
gcacaagctg cggaagctga accctcctga tgagagtggc cccggctgca tgagctgcaa 3720
gtgtgtgctc tcctgacgca ggtgaggggg actcccaggg cggccgccac gcccaccgga 3780
tgaccccggc tccccgcccc tgccggtctc ctggcctgcg gtcagcagcc tcccttgtgc 3840
cccgcccagc acaagctcag gacatggagg tgccggatgc aggaaggagg tgcagacgga 3900
aggaggagga aggaaggacg gaagcaagga aggaaggaag ggctgctgga gcccagtcac 3960
cccgggaccg tgggccgagg tgactgcaga ccctcccagg gaggctgtgc acagactgtc 4020
ttgaacatcc caaatgccac cggaacccca gcccttagct cccctcccag gcctctgtgg 4080
gcccttgtcg ggcacagatg ggatcacagt aaattattgg atggtcttga tcttggtttt 4140
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aggagggcgt cctggtcctc cagagggagg tggtttcagg ggttggggat ctgtgccggt 4440
ggctctggtc tctgctggga gccttcttgg cggtgagagg catcaccttt cctgacttgc 4500
tcccagcgtg aaatgcacct gccaagaatg gcagacatag ggaccccgcc tcctgggcct 4560
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ctgctcctgc cccactctcc cccgcccctg ccctcaccct acccttgccc cacgcctgcc 4800
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caggctctgc cacccactct gctccaaggg gcttgccctg ccttgggcca agttctaggt 4920
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gcagggcatg ccgctggctg gccagggctg cagggacact cccccttttg tccagggaat 5160
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cgcccttctc tccaggggac gccacactcg cccttctctc caggggacgc cacactcccc 5340
cttctgtcca ggggacgcca cactcgccct tctctccagg ggacgccaca ctcgcccttc 5400
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atagacttcc cgaggccagg agccctctag ggctgccggg tgccaccctg gctccttcca 5580
caccgtgctg gtcactgcct gctgggggcg tcagatgcag gtgaccctgt gcaggaggta 5640
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gcttcaacag gagttccagc acgggaacca ctggacaacc tggggtgtgt cctgatctgg 5880
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cgcagaggcc tgggtgccgg gacgctcccc ggtttggctg aaaggaaagc agatgtggtc 6180
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gtgtggcccc cctggtctga tgccgaggat acccctgcaa actgccaatc ccagaggaca 6300
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cacgactatt tcctccttat tttgttaaaa atgtttgtgc atgtatacac ttgtactaag 6720
aaaacatctt cattaatttc ctttcttttt ccattatcat gtgacataag atttattgat 6780
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ttctgagtct tagtggggct actggggaca cgggccgtag ctgagtcgag agctgggtgc 9900
agggtggtca aaccctggcc agacctggag ttcaggaggg ccccgggcca ccctgacctt 9960
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gggccaggcc cctctgggac ggggacttgt gccctgtcag ggttccctat ccctgaggtt 11640
gggggagagc tagcagggca tgccgctggc tggccagggc tgcagggaca ctcccccttt 11700
tgtccaggga ataccacact cgcccttctc tccagcgaac accacactcg cccttctctc 11760
caggggacgc cacactcccc cttctgtcca ggggacgcca cactccccct tctctccagg 11820
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cactcgccct tctctccagg ggacgccaca ctcgcccttc tctccagggg acgccacact 12000
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agaggagatt aggagatgcc gccccgggcc cccagacacc ggctccctgg ccttcctcga 13680
gcaaccccga gctcggctcc ggtctccagc caagcccaac cccgagaggc cgcggcccta 13740
ctggctccgc ctcccgcgtt gctcccggaa gccccgcccg accgcggctc ctgacagacg 13800
ggccgctcag ccaaccgggg tggggcgggg cccgatggcg cgcagccaat ggtaggccgc 13860
gcctggcaga cggacgggcg cggggcgggg cgtgcgcagg cccgcccgag tctccgccgc 13920
ccgtgccctg cgcccgcaac ccgagccgca cccgccgcgg acggagccca tgcgcggggc 13980
gaaccgcgcg cccccgcccc cgccccgccc cggcctcggc cccggccctg gccccggggg 14040
cagtcgcgcc tgtgaacggt gagtgcgggc agggatcggc cgggccgcgc gccctcctcg 14100
cccccaggcg gcagcaatac gcgcggcgcg ggccgggggc gcggggccgg cgggcgtaag 14160
cggcggcggc ggcggcggcg gcgggtgggt ggggccgggc ggggcccgcg ggcacaggtg 14220
agcgggcgtc gggggctgcg gcgggcgggg gccccttcct ccctggggcc tgcgggaatc 14280
cgggccccac ccgtggcctc gcgctgggca cggtccccac gccggcgtac ccgggagcct 14340
cgggcccggc gccctcacac ccgggggcgt ctgggaggag gcggccgcgg ccacggcacg 14400
cccgggcacc cccgattcag catcacaggt cgcggaccag gccgggggcc tcagccccag 14460
tgccttttcc ctctccgggt ctcccgcgcc gcttctcggc cccttcctgt cgctcagtcc 14520
ctgcttccca ggagctcctc tgtcttctcc agctttctgt ggctgaaaga tgcccccggt 14580
tccccgccgg gggtgcgggg cgctgcccgg gtctgccctc ccctcggcgg cgcctagtac 14640
gcagtaggcg ctcagcaaat acttgtcgga ggcaccagcg ccgcggggcc tgcaggctgg 14700
cactagcctg cccgggcacg ccgtggcgcg ctccgccgtg gccagacctg ttctggagga 14760
cggtaacctc agccctcggg cgcctccctt tagcctttct gccgacccag cagcttctaa 14820
tttgggtgcg tggttgagag cgctcagctg tcagccctgc ctttgagggc tgggtccctt 14880
ttcccatcac tgggtcatta agagcaagtg ggggcgaggc gacagccctc ccgcacgctg 14940
ggttgcagct gcacaggtag gcacgctgca gtccttgctg cctggcgttg gggcccaggg 15000
accgctgtgg gtttgccctt cagatggccc tgccagcagc tgccctgtgg ggcctggggc 15060
tgggcctggg cctggctgag cagggccctc cttggcaggt ggggcaggag accctgtagg 15120
aggaccccgg gccgcaggcc cctgaggagc gatgacggaa tataagctgg tggtggtggg 15180
cgccggcggt gtgggcaaga gtgcgctgac catccagctg atccagaacc attttgtgga 15240
cgaatacgac cccactatag aggtgagcct ggcgccgccg tccaggtgcc agcagctgct 15300
gcgggcgagc ccaggacaca gccaggatag ggctggctgc agcccctggt cccctgcatg 15360
gtgctgtggc cctgtctcct gcttcctcta gaggagggga gtccctcgtc tcagcacccc 15420
aggagaggag ggggcatgag gggcatgaga ggtaccaggg agaggctggc tgtgtgaact 15480
ccccccacgg aaggtcctga gggggtccct gagccctgtc ctcctgcagg attcctaccg 15540
gaagcaggtg gtcattgatg gggagacgtg cctgttggac atcctggata ccgccggcca 15600
ggaggagtac agcgccatgc gggaccagta catgcgcacc ggggagggct tcctgtgtgt 15660
gtttgccatc aacaacacca agtcttttga ggacatccac cagtacaggt gaaccccgtg 15720
aggctggccc gggagcccac gccgcacagg tggggccagg ccggctgcgt ccaggcaggg 15780
gcctcctgtc ctctctgcgc atgtcctgga tgccgctgcg cctgcagccc ccgtagccag 15840
ctctcgcttt ccacctctca gggagcagat caaacgggtg aaggactcgg atgacgtgcc 15900
catggtgctg gtggggaaca agtgtgacct ggctgcacgc actgtggaat ctcggcaggc 15960
tcaggacctc gcccgaagct acggcatccc ctacatcgag acctcggcca agacccggca 16020
ggtgaggcag ctctccaccc cacagctagc cagggacccg ccccgccccg ccccagccag 16080
ggagcagcac tcactgaccc tctcccttga cacagggcag ccgctctggc tctagctcca 16140
gctccgggac cctctgggac cccccgggac ccatgtgacc cagcggcccc tcgcgctgta 16200
ggtctcccgg gacggcaggg cagtgaggga ggcgagggcc ggggtctggg ctcacgccct 16260
gcagtcctgg gccgacacag ctccggggaa ggcggaggtc cttggggaga gctgccctga 16320
gccaggccgg agcggtgacc ctggggcccg gcccctcttg tccccagagt gtcccacggg 16380
cacctgttgg ttctgagtct tagtggggct actggggaca cgggccgtag ctgagtcgag 16440
agctgggtgc agggtggtca aaccctggcc agacctggag ttcaggaggg ccccgggcca 16500
ccctgacctt tgaggggctg ctgtagcatg atgcgggtgg ccctgggcac ttcgagatgg 16560
ccagagtcca gcttcccgtg tgtgtggtgg gcctggggaa gtggctggtg gagtcgggag 16620
cttcgggcca ggcaaggctt gatcccacag cagggagccc ctcacccagg caggcggcca 16680
caggccggtc cctcctgatc ccatccctcc tttcccaggg agtggaggat gccttctaca 16740
cgttggtgcg tgagatccgg cagcacaagc tgcggaagct gaaccctcct gatgagagtg 16800
gccccggctg catgagctgc aagtgtgtgc tctcctgacg caggtgaggg ggactcccag 16860
ggcggccgcc acgcccaccg gatgaccccg gctccccgcc cctgccggtc tcctggcctg 16920
cggtcagcag cctcccttgt gccccgccca gcacaagctc aggacatgga ggtgccggat 16980
gcaggaagga ggtgcagacg gaaggaggag gaaggaagga cggaagcaag gaaggaagga 17040
agggctgctg gagcccagtc accccgggac cgtgggccga ggtgactgca gaccctccca 17100
gggaggctgt gcacagactg tcttgaacat cccaaatgcc accggaaccc cagcccttag 17160
ctcccctccc aggcctctgt gggcccttgt cgggcacaga tgggatcaca gtaaattatt 17220
ggatggtctt gatcttggtt ttcggctgag ggtgggacac ggtgcgcgtg tggcctggca 17280
tgaggtatgt cggaacctca ggcctgtcca gccctgggct ctccatagcc tttgggaggg 17340
ggaggttggg agaggccggt caggggtctg ggctgtggtg ctctctcctc ccgcctgccc 17400
cagtgtccac ggcttctggc agagagctct ggacaagcag gcagatcata aggacagaga 17460
gcttactgtg cttctaccaa ctaggagggc gtcctggtcc tccagaggga ggtggtttca 17520
ggggttgggg atctgtgccg gtggctctgg tctctgctgg gagccttctt ggcggtgaga 17580
ggcatcacct ttcctgactt gctcccagcg tgaaatgcac ctgccaagaa tggcagacat 17640
agggaccccg cctcctgggc cttcacatgc ccagttttct tcggctctgt ggcctgaagc 17700
ggtctgtgga ccttggaagt agggctccag caccgactgg cctcaggcct ctgcctcatt 17760
ggtggtcggg tagcggccag tagggcgtgg gagcctggcc atccctgcct cctggagtgg 17820
acgaggttgg cagctggtcc gtctgctcct gccccactct cccccgcccc tgccctcacc 17880
ctacccttgc cccacgcctg cctcatggct ggttgctctt ggagcctggt agtgtcactg 17940
gctcagcctt gctgggtata cacaggctct gccacccact ctgctccaag gggcttgccc 18000
tgccttgggc caagttctag gtctggccac agccacagac agctcagtcc cctgtgtggt 18060
catcctggct tctgctgggg gcccacagcg cccctggtgc ccctcccctc ccagggcccg 18120
ggttgaggct gggccaggcc cctctgggac ggggacttgt gccctgtcag ggttccctat 18180
ccctgaggtt gggggagagc tagcagggca tgccgctggc tggccagggc tgcagggaca 18240
ctcccccttt tgtccaggga ataccacact cgcccttctc tccagcgaac accacactcg 18300
cccttctctc caggggacgc cacactcccc cttctgtcca ggggacgcca cactccccct 18360
tctctccagg ggacgccaca ctcgcccttc tctccagggg acgccacact cgcccttctc 18420
tccaggggac gccacactcc cccttctgtc caggggacgc cacactcgcc cttctctcca 18480
ggggacgcca cactcgccct tctctccagg ggacgccaca ctcgcccttc tctccagggg 18540
acgccacact tgcccttctg tccagggaat gccacactcc cccttctccc cagcagcctc 18600
cgagtgacca gcttccccat cgatagactt cccgaggcca ggagccctct agggctgccg 18660
ggtgccaccc tggctccttc cacaccgtgc tggtcactgc ctgctggggg cgtcagatgc 18720
aggtgaccct gtgcaggagg tatctctgga cctgcctctt ggtcattacg gggctgggca 18780
gggcctggta tcagggcccc gctggggttg cagggctggg cctgtgctgt ggtcctgggg 18840
tgtccaggac agacgtggag gggtcagggc ccagcacccc tgctccatgc tgaactgtgg 18900
gaagcatcca ggtccctggg tggcttcaac aggagttcca gcacgggaac cactggacaa 18960
cctggggtgt gtcctgatct ggggacaggc cagccacacc ccgagtccta gggactccag 19020
agagcagccc actgccctgg gctccacgga agccccctca tgccgctagg ccttggcctc 19080
ggggacagcc cagctaggcc agtgtgtggc aggaccaggc ccccatgtgg gagctgaccc 19140
cttgggattc tggagctgtg ctgatgggca ggggagagcc agctcctccc cttgagggag 19200
ggtcttgatg cctggggtta cccgcagagg cctgggtgcc gggacgctcc ccggtttggc 19260
tgaaaggaaa gcagatgtgg tcagcttctc cactgagccc atctggtctt cccggggctg 19320
ggccccatag atctgggtcc ctgtgtggcc cccctggtct gatgccgagg atacccctgc 19380
aaactgccaa tcccagagga caagactggg aagtccctgc agggagagcc catccccgca 19440
ccctgaccca caagagggac 20108
<210> 3
<211> 538
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
actactttag ttccagccca tatctgtttt tagtaattgg taccttttat gtcctatttt 60
gaaaattcct tttctatctc taaatttaaa aaatcattat tctataatac ttctaaaggc 120
attattattt atatttcata tttaagtatg tagcttctct ggaatttttt taaaactttt 180
tttttttttt tactactgtt aaattccatg tatctgtgtg ccttctgtga gtctgtgctt 240
tgagtgcagc tgcccatgga atccagacga gtgttgggtc ctctggagct ggagttacag 300
actactgtga gccttttggt gtgggtgctg ggaacataac tcaggtctct gcaagtgcca 360
tttgtgctct taatgactga gaagtctccc actcctggct actatatttg gcaattcttg 420
agtgatttat tagtgcttat ctaacttcag ggcttgcttt ttattttatg ttttatccag 480
attttctggc tgtccttaac agggcagttg atctgaatca tctagcttat attcccag 554
<210> 4
<211> 606
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcctcctgcc tctgcctccc gagtgctggg attaaaggca tgtgccacca cgcccaggat 60
agctgctgta tcttaagcca agctttaaag aaccttgctt aaatataagg cactggtcct 120
ttctcatatt agtaattcct tgaaagatga taatttcaat tttgaaaatg taatgattta 180
ttgttgatac ccttccttct ctcttctctt ctcttctctt ctcttctctt ctcttctctt 240
ctcttctctt ctcttctcct cctttcctct cccccctctc ccctcccccc tctctctcct 300
ctcccccctt tcccctctct ctcccctctc cccatctccc cctcttcccc ctctccccct 360
ccccctcttt cccttctctc tcctctcctc tctctcctca cctctctccc ccctctcccc 420
ctctcccctg tctctcccct cccctcctcc cttctcccct tccctcccct cccctcccct 480
ctcttctctt ctcttacctc cttttttgag aaaagaatct cactatgtag ccctggctgg 540
acaagaactc actgtgtaga acaggctggc ctgtaattca gagatctgcc tgctttactc 600
gtgagt 626
<210> 5
<211> 493
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagatagcag tagacttcta atgcttgaca gtttggctgt gaagggagca gagaaacagt 60
gttagctgaa ggtgatgtgg ggtgagagag ggccaaagaa ttttccccaa gtaggcgttc 120
tcactactca tattcacccc tcttttttat agacacctct ctccttcctt tccttttccc 180
tctatgcccg cctcttttct cccttttttg acaggatcta atttggtagc ccagtttgac 240
ttcaagctct cagtcctgct tctgcctccc tactttttgg attacaggta tgtgatgcag 300
tatctgtcta gggagacagt cttgagcttc aaagttgttg agaagaatgt tctaagacag 360
agggagttat ggctagttgc agaattggag tttataagga gaataatatc attttggtat 420
ttgaattttg gtatttgaga ggaggaacct tggaagagag tggagtgttc cttcatggga 480
atggatcttt gat 493
<210> 6
<211> 519
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcagtgagg gtcttcagca taaatcacag caggtgtggt gaacagagac caggtcacag 60
tggaggagaa gtgcatctag aaaatccttt tttaaaaaaa ctacactgaa ggtagtgggt 120
acttactgac tcagtttaag ccacagcata cacaaaggtc agacttgctt ttgagatggt 180
tgtaacaaca gtgtggcata gcagaaggag gagggagtga tggagatagt cctaattctg 240
tttgcaacag cattggtgta ttgatttcaa cagttaagtg cagtaaacag aggtaatggc 300
agatgtggtc attcagtaaa gtagcacttt aactgttgtg acatactggg gacttaaagc 360
tatcccttat actgcatagc cacgggaatg gcaaaccctc tcatagatag agcaacttgc 420
agatagagac agttttctga cagcctggac tggtgcttgt tttgcccatc tccaaacaca 480
acgtaggtgc atcctgagca ggagagagac ttgtcatca 519
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcttgactg cctgggtgtt g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctgcaattgg tcacgtggct g 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctcgactag agcttgcgga 20
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cactgtcatc atgcatcctt c 21

Claims (5)

1.一种致癌性小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
插入基因构建：根据参考基因组数据，设计并合成人原癌基因HRAS基因序列片段，所述人原癌基因HRAS基因序列片段如SEQ ID NO.2所示；
载体构建：通过酶切转化手段构建包括上述人原癌基因HRAS基因序列片段的打靶载体，并同时保留HRAS基因的内源启动子及调控序列，即得包含重组DNA的载体；具体如下：扩增SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示片段A和B，回收片段A和B并通过酶切连接构建PL451-AB载体；扩增SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示片段C1和C2，回收片段C1和C2通过Gibson组装法连接到pDTA-down载体中，再将PL451-AB载体线性化后电转至BAC菌中，通过拯救方法，将新霉素抗性基因（Neo）重组到BAC载体上，得到包含新霉素抗性基因的BAC（Neo）菌；随后用pDTA-down-C 载体将BAC （Neo）菌上的从C1到C2片段序列拯救到pDTA-down-C载体上面，转化后获得pDTA-ABC中间载体；再通过酶切连接的方式将人原癌基因HRAS的序列片段插入到pDTA-ABC中间载体，组装成转基因打靶载体pDTA-ES-RAS vector；
转染：将所述载体转入受体胚胎干细胞中，使所述人原癌基因HRAS基因序列片段定点插入15E3位点，以选择培养基筛选抗药胚胎干细胞，并鉴定获得发生正确同源重组的胚胎干细胞；
获得嵌合体小鼠：将筛选得到的阳性胚胎干细胞注射到受体囊胚中，注射后存活的胚胎移植到假孕小鼠子宫中，让其受孕，待小鼠出生后，筛选鉴定获得嵌合体小鼠；
获得小鼠模型，将上述嵌合体小鼠与C57BL/6小鼠交配，获得纯C57BL/6遗传背景的小鼠，基因型鉴定后阳性小鼠即为所述致癌性小鼠模型。
2. 根据权利要求1所述的致癌性小鼠模型的建立方法，其特征在于，所述获得小鼠模型步骤中，以下述引物对进行PCR扩增检测对所得小鼠基因型进行鉴定：
Hras-LR-PCR-F：5'- GGCTTGACTGCCTGGGTGTTG -3'（SEQ ID NO.7）
Hras-LR-PCR-R：5'- CTGCAATTGGTCA CGTGGCTG -3'（SEQ ID NO.8）。
3.权利要求1-2任一项所述的致癌性小鼠模型在作为受试物的药物的长期毒性和/或致癌性试验评价中的应用。
4.权利要求1-2任一项所述的致癌性小鼠模型在作为受试物的食品添加剂的长期毒性和/或致癌性试验评价中的应用。
5.权利要求1-2任一项所述的致癌性小鼠模型在作为受试物的医疗器械的长期毒性和/或致癌性试验评价中的应用。
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