CN107858373B

CN107858373B - 内皮细胞条件性敲除ccr5基因小鼠模型的构建方法

Info

Publication number: CN107858373B
Application number: CN201711139533.8A
Authority: CN
Inventors: 张钟文; 廖琳; 董建军; 吴红霞; 张瀚允
Original assignee: Shandong Qianfoshan Hospital
Current assignee: Shandong Keyuan Pharmaceutical Co ltd; First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2037-11-16
Also published as: CN107858373A

Abstract

本发明公开了一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法：首先，获得CCR5^loxp/loxp小鼠，然后与Tie‑2‑cre/ERT2小鼠交配，得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠，然后该杂合子小鼠进行相互交配，从而得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的纯合子小鼠。本发明的构建方法，通过CRISPR/Cas9系统构建条件性内皮细胞基因敲除小鼠，在小鼠体内以一种细胞特异性方式引入突变,从而使CCR5靶基因的缺失发生在试验动物的某一特定的组织器官，最大限度达到机理研究的可控性，克服了常规基因敲除术不区分不同组织或细胞，在小鼠体内行所有组织或细胞剔除靶基因的弊端。

Description

内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法

技术领域

本发明涉及一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，属于动物模型及其应用领域。

背景技术

趋化因子受体CCR5(chemokine receptor 5)是一类G蛋白7次跨膜受体，分子量约为40.6KDa，由352个氨基酸残基组成，结构上可分为：胞外N末端、3个胞外环(extracellular loop)区域(ECL1、ECL2、ECL3)、3个胞内环区域、7个跨膜α螺旋和胞内C末端(Szpakowska M,Perez Bercoff D,Chevigne A.Closing the ring:a fourthextracellular loop in chemokine receptors.Science signaling,2014,7(341):pe21.)，主要表达在单核细胞和某些T细胞亚群。CCR5的配体主要为趋化因子CCL3(chemokine C-C motif ligand 3)、CCL4(chemokine C-C motif ligand 4)和CCL5(chemokine C-C motif ligand 5)。CCR5作为一种G蛋白偶联受体，通过胞外环与配体结合后，使G蛋白上α亚基与β、γ亚基分离，变为激活状态，激活下游信号通路，参与机体生理与病理调节过程如刺激淋巴细胞增生，调节巨噬细胞侵润和MI/M2型极化等。高糖条件下，CCR5在单核/巨噬细胞中表达明显升高，高浓度水平的CCR5可促进巨噬细胞侵润，加重机体炎症反应。长期以来，CCR5一直被看作是调控巨噬细胞迁移、加重糖尿病微血管损伤的重要因子。然而我们前期研究发现：CCR5基因功能性缺失会导致糖尿病患者微血管并发症发病风险增加(Zhang ZW,Zhang XQ,Dong JJ,et al.Association of CCL5/CCR5 genepromoter polymorphisms with diabetic microvascular complications:A meta-analysis.Journal of diabetes investigation,2016,Mar；7(2):212-8.)，我们进一步研究证实，CCR5不仅表达于单核/巨噬细胞中，也特异性表达于内皮/内皮祖细胞中，敲除CCR5虽然能减轻炎症反应，但是也加重了内皮损伤(Zhang Z,Dong J,Lobe C G,et al.CCR5facilitates endothelial progenitor cell recruitment and promotes thestabilization of atherosclerotic plaques in ApoE-/-mice.Stem Cell Research&Therapy,2015,6(1):36.)，而内皮细胞特异表达的CCR5是组织血管再生的重要调节因子。与CCR5基因沉默的细胞相比，表达CCR5基因的内皮祖细胞有更强的促血管生成能力。靶向敲除CCR5会导致内皮祖细胞向受损部位聚集减少，促血管生成因子VEGF表达量降低，皮肤损伤愈合延迟(Ishida Y,Kimura A,Kuninaka Y,et al.Pivotal role of the CCL5/CCR5interaction for recruitment of endothelial progenitor cells in mouse woundhealing.The Journal of clinical investigation,2012,122(2):711-721.)。我们前期研究进一步证实，高糖条件下，小鼠微血管内皮细胞中转染CCR5表达质粒后，细胞促血管新生能力增强，而靶向敲除CCR5后这一促血管新生能力又被明显抑制。上述证据提示CCR5在巨噬/内皮细胞的功能存在异质性，CCR5是介导微血管内皮细胞发挥血管新生功能的关键分子。

基于CCR5在不同的细胞中具体独特的调控机理和特异的功能活性，有必要构建一种动物模型以便于实验和研究，但是国内外尚无CCR5条件性敲除鼠的构建，也无人开展在内皮细胞特异性敲除CCR5的研究。申请人首次证实CCR5在巨噬/内皮细胞中存在“双刃剑”作用，该动物模型一旦构建成功，能为研究CCR5在内皮细胞特异性奠定技术基础，阐明CCR5同一基因在不同细胞、组织中存在异质性，为下一步干预或减缓微血管并发症的进展提供精准分子靶点，符合精准医学的范畴。因此，本发明拟构建条件性内皮细胞基因敲除小鼠，在小鼠体内以一种细胞特异性方式引入突变,从而使CCR5靶基因的缺失发生在试验动物的某一特定的组织器官，最大限度达到机理研究的可控性，克服了常规基因敲除术不区分不同组织或细胞，在小鼠体内行所有组织或细胞剔除靶基因的弊端。本发明现就条件性内皮细胞CCR5基因敲除小鼠制备及繁育方法进行详细的介绍和探讨。

发明内容

针对上述现有技术，本发明提供了一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法。本发明填补了现有技术在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因小鼠的空缺，为微血管病变的机制研究提供一个可信的小鼠模型及该小鼠模型的制备方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法：首先，获得CCR5^loxp/loxp小鼠，然后与Tie-2-cre/ERT2小鼠(携带有Tie2-Cre基因的Cre工具小鼠，该品系小鼠的Cre重组酶由小鼠内皮特异性受体酪氨酸激酶Tie2启动子驱动，经他莫昔芬诱导可在内皮细胞中特异表达Cre重组酶)交配，得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠(CCR5^flox/+,Cre)，然后该杂合子小鼠进行相互交配，从而得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的纯合子小鼠(CCR5^flox/flox,Cre)；

其中，CCR5^loxp/loxp小鼠的构建方法包括以下步骤：

(1)使用显微注射仪将Cas9 mRNA、gRNA和Donor DNA按一定浓度比例混匀后，注射入小鼠的受精卵中，则Cas9蛋白在gRNA的靶向作用下对CCR5基因的DNA双链进行切割(如图5所示)，从而诱发同源重组修复机制以Donor DNA为模板对损伤的CCR5基因进行修复，将LoxP序列整合到小鼠基因组中的特定位点；然后将受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中，通常注射150～200枚受精卵，并移植到2只假孕母鼠中；

所述gRNA的序列为：

上游靶点：CCR5-L4：GGGTGCTAATTACTGTTCTA；反向互补序列：TAGAACAGTAATTAGCACCC；

下游靶点：CCR5-R：GAAGAAAGTTTTACGGTTGT；

所述Donor DNA的序列如SEQ ID NO.20所示；

(2)上述胚胎移植的小鼠出生后，选取雄性的5’端和3’端均有FloxP插入的小鼠，待7周龄后，与野生型异性小鼠(C57BL/6雌性小鼠)交配，得到F1代loxp杂合子小鼠(CCR5^flox/+)；

(3)将上述F1代loxp杂合子小鼠进行相互近交，得到F2代小鼠，从F2代小鼠中选取CCR5 loxp纯合子小鼠(CCR5^flox/flox)，CCR5 loxp纯合子小鼠相互近交产生F3代，得到稳定的CCR5 loxp纯合子小鼠品系。

本发明的内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，是在小鼠体内以一种细胞特异性方式引入突变,从而使CCR5靶基因的缺失发生在试验动物的某一特定的细胞，最大限度达到机理研究的可控性。本发明构建的内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠，将其诱导成糖尿病模型后，与对照组小鼠相比，血管完整性被破坏，内皮细胞密度降低，促血管生成因子如VEGF表达明显降低，微循环功能障碍，该模型构建成功后，可以用于糖尿病微血管并发症如糖尿病心肌病的发病机制研究，也可用于药物的药效观察和药效评价，以及开发相应的微循环治疗药物和治疗方法的研究。

本发明使用的各种术语和短语，若无特别说明，具有本领域技术人员公知的一般含义。

附图说明

图1：gRNA载体示意图。

图2：Cas9蛋白表达载体示意图。

图3：报告质粒示意图。

图4：gRNA的活性检测结果柱形图。

图5：gRNA/Cas9的工作原理示意图。

图6：5’端FloxP插入情况鉴定结果图。

图7：3’端FloxP插入情况鉴定结果图。

图8：5’端插入FloxP序列的小鼠鉴定结果图。

图9：3’端插入FloxP序列的小鼠鉴定结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

对于以下全部实施例，可以使用本领域技术人员已知的标准操作和纯化方法。除非另有说明，所有温度以℃(摄氏度)表示。所有反应均中室温下进行，除非另有说明。所涉及的序列，均为5’-3’。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

实验利用CRISPR/Cas9技术进行CCR5基因条件性敲除小鼠的构建

一、Guide RNA(gRNA)靶序列设计

(1)Floxp序列插入位置设计：

根据生物信息学分析：CCR5基因有2个转录本可编码蛋白。以CCR5-001转录本为例，该转录本包括2个外显子(exon)，编码354aa，因为蛋白翻译起始于exon2，终止于exon2。故选exon2作为flox区，用同源重组的方式将loxp位点定点整合到exon2编码区上下游约100-200bp的序列中。

(2)gRNA靶序列设计：

在要插入FloxP的外显子两端，设计gRNA靶点，剪切基因组DNA。Mouse小鼠CCR5基因组序列如下(如SEQ ID NO.1所示)：

注：mouse CCR5基因组序列：exon2；灰色背景：外显子exon2；下划线：CCR5基因编码区序列；双下划线：Cas9/gRNA剪切基因组DNA的大致位置。

根据基因编码区上下游的序列，设计gRNA靶点，一般在上下游各设计3～6个靶点。在设计靶点时，通常在待删除目标外显子两侧的内含子中或非翻译区寻找合适的靶序列，gRNA靶序列的长度一般选择20bp，其3’端以NGG结尾。其中，设计的CCR5基因gRNA靶序列如下所示(如SEQ ID NO.2～16所示)：

CCR5-L1：

反向互补：CCATCTGATGATGGGAAAATTAA；

CCR5-L2：

反向互补：CCCCACATTGATATGGAAAGCAA；

CCR5-L3：

反向互补：CCTAGAAGCAGCATCTTCTATAG；

CCR5-L4：

反向互补：CCATAGAACAGTAATTAGCACCC；

CCR5-L5：

反向互补：CCAGAAAAACATAAACAGTATAT；

CCR5-R1：

CCR5-R2：

CCR5-R3：

CCR5-R4：

CCR5-R5：

注：灰色背景为PAM序列，上述带有反向互补序列的靶点，表示该靶点序列位于上述基因组序列的互补链上；

二、gRNA的活性检测

将上述设计好的gRNA靶点构建入gRNA表达载体中(如图1所示)，并与Cas9蛋白表达质粒(如图2所示)以及报告质粒(如图3所示)一同转入细胞中，在细胞中进行活性验证。选择活性较高的靶点进行后续实验，并根据所选靶点的序列设计同源臂。实验步骤如下：

(1)合成上述设计的gRNA靶点(不包含3’端的NGG序列)，并在退火形成双链后，连接入gRNA表达载体中(图1)，然后转入大肠杆菌中进行扩增，并提取质粒备用；

(2)合成上述设计的gRNA靶序列(包含3’端的NGG序列)，并在退火形成双链后，连接入Luciferase报告质粒中(图3)，然后转入大肠杆菌中进行扩增，并提取质粒备用；

(3)将上述提取的gRNA质粒、luciferase报告质粒和Cas9蛋白表达质粒共转入293细胞中，转染24h后裂解细胞，检测Luciferase的表达水平；

gRNA的活性检测结果如图4所示。

通过以上结果分析，分别选用CCR5-L4和CCR5-R5作为上、下游靶点，进行后续实验：

上游靶点：CCR5-L：GGGTGCTAATTACTGTTCTA(如SEQ ID NO.17所示)；反向互补序列：TAGAACAGTAATTAGCACCC(如SEQ ID NO.18所示)；

下游靶点：CCR5-R：GAAGAAAGTTTTACGGTTGT(如SEQ ID NO.19所示)。

三、同源重组模板(Donor)的构建

(1)根据上述活性较高的上下游gRNA靶点序列(CCR5-L and CCR5-R)的位置，设计并构建Donor DNA，序列描述如下：

CCR5-exon2-loxp-donor(如SEQ ID NO.20所示)：

注：CCR5基因组序列，exon2；双下划线：Cas9/gRNA剪切基因组DNA的大致位置；斜体：FloxP序列ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT；灰色背景：同源臂序列；下划线：CCR5基因编码区。

(2)克隆灰色背景间并包括灰色背景的基因组DNA序列作为同源臂；

(3)在同源臂上的指定位置插入FloxP序列；

(4)将上述构建或合成好的序列，克隆进Donor质粒上，转入大肠杆菌扩增后，提取备用；

四、CCR5-FloxP Founder小鼠的建立

将步骤二中所构建的gRNA表达质粒(CCR5-L4 and CCR5-R)和Cas9蛋白表达质粒线性化后，通过体外转录试剂盒转录出相应的gRNA和Cas9 mRNA，使用显微注射仪将上述Cas9mRNA、gRNA和Donor DNA按一定浓度比例混匀后，注射入小鼠的受精卵中，Cas9蛋白在gRNA的靶向作用下对CCR5基因的DNA双链进行切割(如图5所示)，从而诱发同源重组修复机制以Donor DNA为模板对损伤的CCR5基因进行修复，将LoxP序列整合到小鼠基因组中的特定位点。之后将受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中。通常注射150～200枚受精卵，并移植到2只假孕母鼠中。

五、Founder小鼠鉴定

(1)胚胎移植的小鼠将在手术后19天左右出生，待小鼠出生20天后剪尾提取DNA并进行基因型鉴定。鉴定结果如图6、图7所示。图6示5’端FloxP插入情况鉴定结果图；共出生4只小鼠，分别标记为1#，2#，3#，4#，如上图红色箭头所示，1#和3#小鼠为5’端插入FloxP序列的小鼠。图7示3’端FloxP插入情况鉴定结果图；总共出生4只小鼠，分别标记为1#，2#，3#，4#，如上图红色箭头所示，3#小鼠为3’端插入FloxP序列的小鼠。

(2)综合以上跑胶结果，初步判断3#为5’端和3’端均有FloxP插入的KI小鼠。

六、Founder小鼠与野生型小鼠交配得到F1代

(1)待雄性Founder小鼠(上述鉴定结果为KI的3#小鼠)到7周龄，与野生型异性小鼠交配，得到F1代loxp杂合子小鼠(CCR5^flox/+)9只，小鼠出生20天后取鼠尾，对基因组DNA进行基因型鉴定(如图8、图9所示)。若有阳性小鼠出生，则表示敲入基因已经整合到生殖细胞，标志品系建立成功，确保测序结果与F0代相同。

图8示5’端插入FloxP序列的小鼠鉴定结果图；共出生9只小鼠，分别标记为3-1，3-2，3-3，3-4，3-5，3-6，3-7，3-8，3-9。如图箭头所示，3-2,3-3,3-4,3-7四只小鼠均为5’端插入FloxP序列的小鼠。

图9示3’端插入FloxP序列的小鼠鉴定结果图；共出生9只小鼠，分别编号为3-1，3-2，3-3，3-4，3-5，3-6，3-7，3-8，3-9。如图箭头所示，3-2,3-3,3-4,3-7小鼠均为3’端插入FloxP序列的小鼠；

(2)综合以上跑胶结果，判断编号为3-2,3-3,3-4,3-7小鼠为5’端和3’端均有FloxP插入的F1代小鼠。

七、内皮细胞特异性敲除CCR5基因小鼠的获得

首先将F1代杂合子小鼠(上述鉴定结果为KI的小鼠，编号分别为3-2,3-3,3-4,3-7)进行相互近交，得到F2代小鼠，从F2代小鼠中选取CCR5 loxp纯合子小鼠(CCR5^flox/flox)，CCR5 loxp纯合子小鼠相互近交产生F3代，得到稳定的CCR5 loxp纯合子小鼠品系，再与携带有Tie2-Cre基因的Cre工具小鼠(Tie2-Cre/ERT2，该品系小鼠的Cre重组酶由小鼠内皮特异性受体酪氨酸激酶(Tie2)启动子驱动，经他莫昔芬诱导可在内皮细胞中特异表达Cre重组酶)交配即可得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠(CCR5^flox/+,Cre)，然后再将在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠(CCR5^flox/+,Cre)进行相互交配从而得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的纯合子小鼠(CCR5^flox/flox,Cre)。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。本说明书引述的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，如同这些出版物、专利和专利申请各自特别地和个别地表明通过引用并入本文。

序列表

<110> 山东省千佛山医院

<120> 内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法

<141> 2017-11-15

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 9939

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 1

tagcaggtgg ccttaatgga ggcggcccat cttttagcat ggacaaagct ctaagaggca 60

aggtcccaaa gagacttggg tttaggattg cttcttgcag ctgagaagcc ttttcctatc 120

acttcacata gcctaaaagt tcgtgggtat cagcccacca tattggtcag atttcttgca 180

catcaacata aagatgaact ttcatgaatt aactaatgct gtttaggtga attaatgact 240

ttatagagtt cctgatttga tttaaataat cttaggaaga aatttttaaa agatggtttt 300

agttgtttgc tagaaagatg taataaagtt aaaatcaaga atagaatgta cccactcctc 360

ataatagtaa gtaaggctgc ataataagaa atataatgag ttgttatcac tacactaaaa 420

agagaaatat gcttgggaca aatttgtgtt taaggaaaaa gtattcaagt ttaagaatta 480

agccacaggt gtacactatt ataagacaaa gccatgtgaa acagtgacta tgaacttaag 540

tatatagaat gaaaaactgc tttaaagtta atatcaacat ccttttgtaa ctctcatttt 600

gtataacatt ttgtcatgag gtaattttct aataactttt atctataaaa aggccagaga 660

gaggaaataa agatgagtgg gtggttgagg gggaatctgt accatctacc cacctaccca 720

tccatccata catacatcca tccaaggtag tgatgcagcc attttctcct tcacccagtg 780

tgtatgtgtc tgtgagagtg acatctttcc tttccttttt ctctctgatt caaaaagagt 840

taaccagcct ggccagtgaa gggcttctgg ctgcctggca ataaatcctt tatttaatcc 900

cctgttgtta agcaacaggt gataattcct ctgaagcctt tggcttctgg cccaagaaca 960

atgaagaatc aagagtaaat attatttata ctaagaaacc tttattcttg aaaaatcaag 1020

ttttggtccc cacccttcta ctgctctccc aattggctac tatccagaaa gagccagtgt 1080

tctggaaagc tcaaggaaaa ccatggagag agagagagag agagagagag agagagagag 1140

agagagagag agagagaagg aaggagaaag agagagagag agagagagag aaggaaggag 1200

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag agagagacat cttattagtt 1260

accaaggagt gacaagcaac atatgtcagt taaggtttca tactgcccaa attcaaagta 1320

agttacttcc tggtagtgtg gtttttatat taacattcat tttctctata cttggggagt 1380

gttttatcca gaaaaacata aacagtatat ttcttgcctc aagcagttaa ctcaagcgtt 1440

tagcaaatgc atatgtcata ccatagaaca gtaattagca cccactactc attctttctg 1500

gcatttgtgt gaactctagg atttatggat aaatgcctag aagcagcatc ttctatagag 1560

atcttaagcc catgaattag agaggacctg actcagtttc acagattaat tcaccccaca 1620

ttgatatgga aagcaacatt ttatttgatc aaatgcatct ttggtgaatt tcaagccatc 1680

tgatgatggg aaaattaaat gtagaagtct atgcctcaaa gacccactaa gttataaaac 1740

aataattgtg gtaggccaac aattgcttta acctttatta agcattgtct tttatttatt 1800

cataggctct tgcaggatgg attttcaagg gtcagttccg acctatagct atgacatcga 1860

ttatggtatg tcagcaccct gccaaaaaat caatgtgaaa caaattgcgg ctcagctcct 1920

gcccccactc tactccctgg tattcatctt tggttttgtg ggtaacatga tggtcttcct 1980

catcttgata agctgcaaaa agctgaagag cgtgactgat atctacctgc tcaacctggc 2040

catctctgac ctgctcttcc tgctcacact accattctgg gctcactatg ctgcaaatga 2100

gtgggtcttt gggaacataa tgtgtaaagt attcacaggg ctctatcaca ttggttattt 2160

tggtggaatc ttcttcatta tcctcctgac aattgatagg tacttggcta ttgtccatgc 2220

tgtgtttgct ttaaaagtca gaacggtcaa ctttggggtg ataacaagtg tagtcacttg 2280

ggcggtggct gtgtttgcct ctctcccaga aataatcttt accagatctc agaaagaagg 2340

ttttcattat acatgcagtc ctcattttcc acacactcag tatcatttct ggaagagttt 2400

ccaaacatta aagatggtca tcttgagcct gatcctgcct ctacttgtca tggtcatctg 2460

ctactcagga attctccaca ccctgtttcg ctgtaggaat gagaagaaga ggcacagggc 2520

tgtgaggctc atctttgcca tcatgattgt ctactttctc ttctggactc cctacaacat 2580

tgtcctcctc ctgaccacct tccaggaatt ctttggactg aataactgca gtagttctaa 2640

tagactagac caggccatgc aggcaacaga gactcttgga atgacacact gctgcctaaa 2700

ccctgtcatc tatgcctttg ttggagagaa gttccggagt tatctctcag tgttcttccg 2760

aaaacacatg gtcaaacgct tttgcaaacg gtgttcaatt ttccagcaag acaatcctga 2820

tcgtgcaagc tcagtctata cccgatccac aggagaacat gaagtttcta ctggtttatg 2880

acctggttga cttttgtgta tcacgtagtt tttctatgca gcttgggagt aggaatggtt 2940

cttttaaaaa aagaaattag tatcatagag ggcccaagat acatgcatct ttttgatatt 3000

tatttttaga tagattgggt cttttaaaac tgaatgggga ggttggggtg gaggagcagg 3060

gagaacgagt cttttatcag ggccgggaaa tatgcacaaa gagacttgag gcaggtgcca 3120

tgacccatat gcaaagggac ggacacaggg ccgatgctgt ggcctagaga tgacgtgtct 3180

caccgctggg ttcctgaaag gcggctgtaa atatgcctga ttgccataaa gtcgcttctt 3240

gctgtctatg gatgtgcctg actgccaaca gggaagaacc acttctgcct ataaaacgta 3300

gagtcagcag aacttggggt aaatcggagt tagaggtgca taagaacccc taggcttagt 3360

taggttgaaa tacccattga ggaaacagca aatacaaagg aagaataaag agtttagccg 3420

ggaaggtagt ctcattttac agccggaata taatgttatc tcaggctagc attttgttcc 3480

tgccttcaga cctaaatcct accacaccgg gactgtgaaa cacctggatt atgaatcatg 3540

agcctgaggt ctaggaataa taataacgtt tgtgatttta gatgagggct gtttccatag 3600

tttgaagcca gaactttatc atcttgagca gaagctccaa gagatgagga aagagcacca 3660

atttttctct aatttactta gcagtcatca tctctggaag attcatttta gaaacaagtt 3720

gttgtgcccc tcagaagcca tgagagtata acgactgctc tctgtgttcc aggctgagta 3780

tgaggacttc agtcacactt tccagatggc ttctccacac aaacaatgct aagtttggcc 3840

atttcagagg tttaggattt tttgttgttt ttgcagttga tattttgaat tttagagcag 3900

ttgagatctt cctagtgaag gctagaggag gaaagaaagg ggttagaatc tctcaggaga 3960

ttaaagtttc tgcctaacaa gaggtgttac tggtttttct caagctccga ttgtgaaacc 4020

agaggcctgg gactgtcagc aggaagtgag catttgcttt tttcttcctt gtgatccaca 4080

ttcctccccc actctgttgc tcagactggc gtcaagctca cgatcctcct gcttacatct 4140

caagttctga gattacaagt atatgtgaac atatccagcg gttattttat tcattagcat 4200

atagaaagtt atacgttctt tgaagataat gagtcttata aaaagtgctt tgtaaaaaaa 4260

attgcatttt atactttcaa tcaagtgtac atttagtgag tagtacgtaa aattatgaga 4320

gtattttgta agtagttgtt ttggagaacg cccccaataa tacttgttta aatatagcgt 4380

tcttggatta agtgggtggt ggtgatgata atatttcctt gaaagtattt ttagccgtta 4440

actttcttcc ttaaacaatt tttcataata atttgttctt aaagatgtta tgtccaagca 4500

tgcagtttcg gagcagtgtt gctttgaaag agtgtaaatt ttaaattgtg cttactctca 4560

atcaaaagag ttttaacata tttacgaatt tatttcagaa gtcaagaatc tggttgaaaa 4620

taaagatatg caactttatg gtctggtatt tgagtgggag tcagagaggg tgaggccttt 4680

ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctcaag tgtgttaata atttcagtaa 4740

tggaaattct ataacactgg gatttctgtg cacatgtttc ttgtccagag agaggataga 4800

tcctccaagg agagtctgga acaatgctga ttttcagtct gctacagccc cagcttccaa 4860

agagggtgtg caaagatgtt cgggctatta atgctcctaa tgaaagagac aaacgagcag 4920

gaagtaaaat gggctctgag tggtttagta acttctcacc agattcaaag ggttgctttt 4980

catctcttag atttgaaggt agaaagtgtt aaagaagagt ggaaggcagc tgggcttagg 5040

agaaaggagt caggggaagg gagccctcta tctgctatga taaagccagc ttttgtgggg 5100

atgagggaaa gtgtgttaat aacttatctt gtggctgtga caaaatatct gacaaaggca 5160

gcttaaagaa gaaagtttta cggttgttgg tagtttgatg gaatacattc taccgtggtg 5220

tgttaggagt gtgagcttgg tggtaatgtc acatctacat ccaggaagca aagaattgaa 5280

tgctggtgtc agctctcttt ctcctcttta ttcagtccaa ttccccagtc cataaaatgg 5340

tgttgttcat attcagggtg ggtcttctct ccttggctaa tcctttgtgg aaacatcctc 5400

ataggtacag acagaaatgt ttatcctagg tagttctaaa tccagtaaag caatcaatca 5460

atactaacca ctacaaaagc tctctctctc tctctctctc cctctctctc tctctctttc 5520

tctctctccc tttttttatg gctgatgtac acactccttc ttaccttgcc atatgttaga 5580

tgaatttaca aagaaaaacc acttgaggta ttgtataact atgtatatat tttctttcat 5640

aatttaaaaa atactttaat gttccatttg gctccatatt gttacttttt cgatgaatta 5700

taatttctgt gttattataa ttctgtaata cctcaagagc ttattttgtt ttaaaaatag 5760

gggattttgt ttgtctattt tgagagtttc ttctgtagtc caggctgccc tggaacttcc 5820

tctgtagatc aggctggcct caaatatgaa atatgcccgc ctctgcttcc aaattgcttg 5880

gattaaaggt gtgcactacc attacctggc tcaaagatga gttttaaagc atacatagtg 5940

aaaaataacc ccttttcctg attgagccaa gctatcaaaa ctgcaaataa cctaggctat 6000

attgattcta tactgccctc cagtggccaa ctagcaaata acaaagatgt ttggcaacca 6060

gcatggacca catcatacaa ataaggagta tggcttcact gaatttttta ctgtttgtgt 6120

ctttaattcc agtgtggaca gaggcatatc cagagcagct cagggtattt gacacacagc 6180

tctttctcac tgcttctgaa gaacaggaag agccccagtt gaggatacaa gttgacactt 6240

tgaaataatg gtttcaggtg gatctgcaga atgctggagc ccagaccttg aaaaggctcg 6300

ggaaattact tataaacagg tattttcaca tgcatgaagt gccccagact ctccttgcat 6360

ttcactctaa ccctgcatat cccaagtgtt tgcagtgttc caatatagtt gaaaggcagg 6420

tggctttctt tgattctttt tattctcttt tcttcattac cattattatt ccatccacac 6480

ggatgaaaca ttcttacaaa actatacacc tttaaaatgg aaaagctgtt gaggatcact 6540

cagtccaggt gcctctctct gtaggtgaaa agcagagtct actccacact ctcaaagagg 6600

gtttcagagg actcaagaat tagcaagttt tgacagtgtt ttccaatctc agtgtgcagt 6660

cggtgataag ccattgaacg agtgggtggg gagagggtct gataccactt acaatcatgc 6720

ctagataaat tcaggagatg agtttacaat taatgaaggc tacattctag tcctggcttc 6780

atcttagcta cactttgaaa tgacacggga agttgacacc aagtctcact acaattctac 6840

actgaacaac tctctttaat caacccacat gtacctgtgt ttctaactct taggaattcc 6900

ccaggtggtt ctcaaaatag ccaagtttga gacactggta gtgaaaactg ggttgaagtc 6960

tgtcatactg gatatgatgt ttggaatctg agctttgtca cacagtgtga gggtttggag 7020

aatgaagaag atcatgacct ggtcaggcaa ggttaattcg gaaaaagttg aaaagttagc 7080

attcagagag taacttttag atggcctggc acctaattta aatgtgtgca catatatgca 7140

tgaaacaaag cttggcttgc attagttact tttgtgtctc tgtgaccata gtactcagct 7200

aaaacaactg aaggaaagag tttactttgg ctcatagctt tagttcatta tggggaagtc 7260

atagcattgt atcaaagtac atgggtatgt ataccagaga ctgttcatgt tacagacgtc 7320

cagaaagcag agtccagaag caggggcaag ctataacttt caaaggatca tccctagtgc 7380

cttcaagcca gccagacttc acctcctaaa gaatctatgg gcttaccaat agtgccagtc 7440

tggacatatt ttgctataca caaaacatga ccctgtgagg gatatttctg aaagacagat 7500

ataagttgct ctttttgttt tgagtcaaga caacatcccc tcttgaaact aagtatcact 7560

gaacataatg cagctaagtt taaaaataaa aacatcgtgg aaatgcttca ggatagtcta 7620

tatttaccag aaaattctac caggattttt ctacttacat ttatttccat tatcttagat 7680

tactcaaaaa atatcctata aagaagttat aatgttttct caatatataa tcaaatcaat 7740

catctgttaa tgggacagct cagtctttcc tgcatggtaa aaaccaaact ctgggatgag 7800

aaggtaagaa cttaaaattc atattggcct gaatatcatg ttgaagcagt gggagcttag 7860

gaagtaatct gagttcttat agccttttgt tccttttggt aatttgaaga ctactaatat 7920

cagcagacag ggatgttttg gatagaaaat atctatacta ggctgcacaa tagaattttc 7980

ctaacatcat gctttctttc tatatcttct aatatggtag catattacat gaatgtagaa 8040

tgtggctaat gtgggttata tattattttt aattttaatg tggccaggat tattatattg 8100

aatattccaa gtctggtgtg cataaaatag tatagtttga cttgtgttta gtcattacag 8160

tattgagcta actatgaaag catactattt ttaagccttg acttttttct ctgtaattga 8220

gtataataat atctatctat ctatctcata gttttgatta gagggtaact aagatattgc 8280

atgataagac cttaagatag tgtcacctag ttcacagaca tccttgtaaa tatttgctat 8340

tgtaaaaatt ttctgagaat gtctattttt ttttatcttg aagcaaataa ggcacataag 8400

acactaaatg actctgtgta aactgactta tggtgtagct caatgagatc attagccttt 8460

agagtgaggt ttcaatcatc taccagttat aaccatgcaa ggacatacac tttagaatct 8520

aatattagta tccaattcaa taactttcag gcatactcaa gatatgtaga atttattgtt 8580

tttgttctgt gctccctaat tttatttctt ccttatttaa cccactgttg attctcctag 8640

agtagttatt ctcaatgaga ggatggtaat accctcaggg ggtatccaga aatttctaga 8700

gacattttgg tagctgaact gagagacttg ttactaatag gatctcacag atgaagtcaa 8760

ggatgctatt taacattcta caatatacac cataattcat tttgtaaaag tttttatcat 8820

tctgacaaag tgcatgagca aaacaacttt aaggaggaaa gatttatttt ggttcagaga 8880

ttcagaagtt agtccatcat ggcagaaaga tagtgttaga gcagaacagc taacatcatg 8940

gtgctcggaa aacagagaaa aattggctac tttggttgtt tttctctttt ccccctttta 9000

ttctatctag gcttttaacc tgtaaatggt gctactactt tcaggacaga tcttccccct 9060

ttagataagt ctctctataa acaccttcac agacttacct agagaagagc tttattgtgt 9120

tcttctaggt acttctcaat ccaatcaagc tggtggacaa gataaatcac actactccac 9180

tataagaact tattaaatcc agagtatcca cagaaacatg attgaaagcc cttttacagt 9240

gttctcagct aaccatagcc acatgaaaga aggctctcca aaaagaggag acttgtatgg 9300

gctctggctg atttctgtgg ttgattttat actcataata tgtccttggt ttttttgatt 9360

gactacagga gactcagact gtctccagac tctttatttt aatctacatg tccattgcct 9420

ttcttcatga gttgttccag gactgtgaat aagtggtttt gatgagcatt tgtagcctct 9480

accctaactg gcaagtgcta gactgctaga acccagccta gtatcacagt tccctgagaa 9540

gggcagcaag ggtggcattg gtgatcccag agccaaaacc ttcttacttt tggcaattta 9600

actgttactt taactctttg ctgttctgtg gcccaaagcc actggcttct ggcaatttaa 9660

ctcctcctga tagcagctgg ggggtgggag agaggtgggg ggaggggagt ggtggaaaga 9720

aatttaatta ctttggttct tttctctgta atcaggtctc ttgctggcct gatcacatga 9780

gccagagagg agaggaaagg aaaggaaagg aaaggaaagg aaaggaaagg aaaggaaagg 9840

aaaggaaagg aaaggaaaaa ggaaaggaaa aaggaaagga aaaaggaaag gaaaaaggaa 9900

aggaaaaagg aaaggaaaaa ggaaaggaaa aaggaaagg 9939

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ttaattttcc catcatcaga tgg 23

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ccatctgatg atgggaaaat taa 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

ttgctttcca tatcaatgtg ggg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

ccccacattg atatggaaag caa 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

ctatagaaga tgctgcttct agg 23

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cctagaagca gcatcttcta tag 23

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gggtgctaat tactgttcta tgg 23

<210> 9

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

ccatagaaca gtaattagca ccc 23

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

atatactgtt tatgtttttc tgg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

ccagaaaaac ataaacagta tat 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

aagtcgcttc ttgctgtcta tgg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

aacgtttgtg attttagatg agg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gtatatgtga acatatccag cgg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

agagggtgtg caaagatgtt cgg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

gaagaaagtt ttacggttgt tgg 23

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

gggtgctaat tactgttcta 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

tagaacagta attagcaccc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

gaagaaagtt ttacggttgt 20

<210> 20

<211> 5386

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ataaagatga gtgggtggtt gagggggaat ctgtaccatc tacccaccta cccatccatc 60

catacataca tccatccaag gtagtgatgc agccattttc tccttcaccc agtgtgtatg 120

tgtctgtgag agtgacatct ttcctttcct ttttctctct gattcaaaaa gagttaacca 180

gcctggccag tgaagggctt ctggctgcct ggcaataaat cctttattta atcccctgtt 240

gttaagcaac aggtgataat tcctctgaag cctttggctt ctggcccaag aacaatgaag 300

aatcaagagt aaatattatt tatactaaga aacctttatt cttgaaaaat caagttttgg 360

tccccaccct tctactgctc tcccaattgg ctactatcca gaaagagcca gtgttctgga 420

aagctcaagg aaaaccatgg agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag 480

agagagagag aaggaaggag aaagagagag agagagagag agagaaggaa ggagagagag 540

agagagagag agagagagag agagagagag agagagagag acatcttatt agttaccaag 600

gagtgacaag caacatatgt cagttaaggt ttcatactgc ccaaattcaa agtaagttac 660

ttcctggtag tgtggttttt atattaacat tcattttctc tatacttggg gagtgtttta 720

tccagaaaaa cataaacagt atatttcttg cctcaagcag ttaactcaag cgtttagcaa 780

atgcatatgt cataccatag ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataacagt 840

aattagcacc cactactcat tctttctggc atttgtgtga actctaggat ttatggataa 900

atgcctagaa gcagcatctt ctatagagat cttaagccca tgaattagag aggacctgac 960

tcagtttcac agattaattc accccacatt gatatggaaa gcaacatttt atttgatcaa 1020

atgcatcttt ggtgaatttc aagccatctg atgatgggaa aattaaatgt agaagtctat 1080

gcctcaaaga cccactaagt tataaaacaa taattgtggt aggccaacaa ttgctttaac 1140

ctttattaag cattgtcttt tatttattca taggctcttg caggatggat tttcaagggt 1200

cagttccgac ctatagctat gacatcgatt atggtatgtc agcaccctgc caaaaaatca 1260

atgtgaaaca aattgcggct cagctcctgc ccccactcta ctccctggta ttcatctttg 1320

gttttgtggg taacatgatg gtcttcctca tcttgataag ctgcaaaaag ctgaagagcg 1380

tgactgatat ctacctgctc aacctggcca tctctgacct gctcttcctg ctcacactac 1440

cattctgggc tcactatgct gcaaatgagt gggtctttgg gaacataatg tgtaaagtat 1500

tcacagggct ctatcacatt ggttattttg gtggaatctt cttcattatc ctcctgacaa 1560

ttgataggta cttggctatt gtccatgctg tgtttgcttt aaaagtcaga acggtcaact 1620

ttggggtgat aacaagtgta gtcacttggg cggtggctgt gtttgcctct ctcccagaaa 1680

taatctttac cagatctcag aaagaaggtt ttcattatac atgcagtcct cattttccac 1740

acactcagta tcatttctgg aagagtttcc aaacattaaa gatggtcatc ttgagcctga 1800

tcctgcctct acttgtcatg gtcatctgct actcaggaat tctccacacc ctgtttcgct 1860

gtaggaatga gaagaagagg cacagggctg tgaggctcat ctttgccatc atgattgtct 1920

actttctctt ctggactccc tacaacattg tcctcctcct gaccaccttc caggaattct 1980

ttggactgaa taactgcagt agttctaata gactagacca ggccatgcag gcaacagaga 2040

ctcttggaat gacacactgc tgcctaaacc ctgtcatcta tgcctttgtt ggagagaagt 2100

tccggagtta tctctcagtg ttcttccgaa aacacatggt caaacgcttt tgcaaacggt 2160

gttcaatttt ccagcaagac aatcctgatc gtgcaagctc agtctatacc cgatccacag 2220

gagaacatga agtttctact ggtttatgac ctggttgact tttgtgtatc acgtagtttt 2280

tctatgcagc ttgggagtag gaatggttct tttaaaaaaa gaaattagta tcatagaggg 2340

cccaagatac atgcatcttt ttgatattta tttttagata gattgggtct tttaaaactg 2400

aatggggagg ttggggtgga ggagcaggga gaacgagtct tttatcaggg ccgggaaata 2460

tgcacaaaga gacttgaggc aggtgccatg acccatatgc aaagggacgg acacagggcc 2520

gatgctgtgg cctagagatg acgtgtctca ccgctgggtt cctgaaaggc ggctgtaaat 2580

atgcctgatt gccataaagt cgcttcttgc tgtctatgga tgtgcctgac tgccaacagg 2640

gaagaaccac ttctgcctat aaaacgtaga gtcagcagaa cttggggtaa atcggagtta 2700

gaggtgcata agaaccccta ggcttagtta ggttgaaata cccattgagg aaacagcaaa 2760

tacaaaggaa gaataaagag tttagccggg aaggtagtct cattttacag ccggaatata 2820

atgttatctc aggctagcat tttgttcctg ccttcagacc taaatcctac cacaccggga 2880

ctgtgaaaca cctggattat gaatcatgag cctgaggtct aggaataata ataacgtttg 2940

tgattttaga tgagggctgt ttccatagtt tgaagccaga actttatcat cttgagcaga 3000

agctccaaga gatgaggaaa gagcaccaat ttttctctaa tttacttagc agtcatcatc 3060

tctggaagat tcattttaga aacaagttgt tgtgcccctc agaagccatg agagtataac 3120

gactgctctc tgtgttccag gctgagtatg aggacttcag tcacactttc cagatggctt 3180

ctccacacaa acaatgctaa gtttggccat ttcagaggtt taggattttt tgttgttttt 3240

gcagttgata ttttgaattt tagagcagtt gagatcttcc tagtgaaggc tagaggagga 3300

aagaaagggg ttagaatctc tcaggagatt aaagtttctg cctaacaaga ggtgttactg 3360

gtttttctca agctccgatt gtgaaaccag aggcctggga ctgtcagcag gaagtgagca 3420

tttgcttttt tcttccttgt gatccacatt cctcccccac tctgttgctc agactggcgt 3480

caagctcacg atcctcctgc ttacatctca agttctgaga ttacaagtat atgtgaacat 3540

atccagcggt tattttattc attagcatat agaaagttat acgttctttg aagataatga 3600

gtcttataaa aagtgctttg taaaaaaaat tgcattttat actttcaatc aagtgtacat 3660

ttagtgagta gtacgtaaaa ttatgagagt attttgtaag tagttgtttt ggagaacgcc 3720

cccaataata cttgtttaaa tatagcgttc ttggattaag tgggtggtgg tgatgataat 3780

atttccttga aagtattttt agccgttaac tttcttcctt aaacaatttt tcataataat 3840

ttgttcttaa agatgttatg tccaagcatg cagtttcgga gcagtgttgc tttgaaagag 3900

tgtaaatttt aaattgtgct tactctcaat caaaagagtt ttaacatatt tacgaattta 3960

tttcagaagt caagaatctg gttgaaaata aagatatgca actttatggt ctggtatttg 4020

agtgggagtc agagagggtg aggcctttct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 4080

ctctcaagtg tgttaataat ttcagtaatg gaaattctat aacactggga tttctgtgca 4140

catgtttctt gtccagagag aggatagatc ctccaaggag agtctggaac aatgctgatt 4200

ttcagtctgc tacagcccca gcttccaaag agggtgtgca aagatgttcg ggctattaat 4260

gctcctaatg aaagagacaa acgagcagga agtaaaatgg gctctgagtg gtttagtaac 4320

ttctcaccag attcaaaggg ttgcttttca tctcttagat ttgaaggtag aaagtgttaa 4380

agaagagtgg aaggcagctg ggcttaggag aaaggagtca ggggaaggga gccctctatc 4440

tgctatgata aagccagctt ttgtggggat gagggaaagt gtgttaataa cttatcttgt 4500

ggctgtgaca aaatatctga caaaggcagc ttaaagaaga aagttttacg gtataacttc 4560

gtatagcata cattatacga agttattgtt ggtagtttga tggaatacat tctaccgtgg 4620

tgtgttagga gtgtgagctt ggtggtaatg tcacatctac atccaggaag caaagaattg 4680

aatgctggtg tcagctctct ttctcctctt tattcagtcc aattccccag tccataaaat 4740

ggtgttgttc atattcaggg tgggtcttct ctccttggct aatcctttgt ggaaacatcc 4800

tcataggtac agacagaaat gtttatccta ggtagttcta aatccagtaa agcaatcaat 4860

caatactaac cactacaaaa gctctctctc tctctctctc tccctctctc tctctctctt 4920

tctctctctc ccttttttta tggctgatgt acacactcct tcttaccttg ccatatgtta 4980

gatgaattta caaagaaaaa ccacttgagg tattgtataa ctatgtatat attttctttc 5040

ataatttaaa aaatacttta atgttccatt tggctccata ttgttacttt ttcgatgaat 5100

tataatttct gtgttattat aattctgtaa tacctcaaga gcttattttg ttttaaaaat 5160

aggggatttt gtttgtctat tttgagagtt tcttctgtag tccaggctgc cctggaactt 5220

cctctgtaga tcaggctggc ctcaaatatg aaatatgccc gcctctgctt ccaaattgct 5280

tggattaaag gtgtgcacta ccattacctg gctcaaagat gagttttaaa gcatacatag 5340

tgaaaaataa ccccttttcc tgattgagcc aagctatcaa aactgc 5386

Claims

1.一种内皮细胞条件性敲除CCR5基因小鼠模型的构建方法，其特征在于：首先，获得CCR5^loxp/loxp小鼠，然后与Tie-2-cre/ERT2小鼠交配，得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的杂合子小鼠，然后该杂合子小鼠进行相互交配，从而得到在内皮细胞中特异性敲除CCR5基因的纯合子小鼠；

其中，CCR5^loxp/loxp小鼠的构建方法包括以下步骤：

（1）将Cas9 mRNA、gRNA和Donor DNA混匀后，注射入小鼠的受精卵中，则Cas9蛋白在gRNA的靶向作用下对CCR5基因的DNA双链进行切割，从而诱发同源重组修复机制以DonorDNA为模板对损伤的CCR5基因进行修复，将LoxP序列整合到小鼠基因组中的特定位点；然后将受精卵移植入假孕母鼠的输卵管中；

所述gRNA的序列为：

下游靶点：CCR5-R：GAAGAAAGTTTTACGGTTGT；

所述Donor DNA的序列如SEQ ID NO.20所示；

（2）上述受精卵移植成功的小鼠出生后，选取雄性的5’端和3’端均有FloxP插入的小鼠，与野生型异性小鼠交配，得到F1代loxp杂合子小鼠；

（3）将上述F1代loxp杂合子小鼠进行相互近交，得到F2代小鼠，从F2代小鼠中选取CCR5loxp纯合子小鼠，CCR5 loxp纯合子小鼠相互近交产生F3代，得到稳定的CCR5 loxp纯合子小鼠品系。