CN117467704B - 构建apod条件敲入小鼠模型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，属于动物模型构建技术领域。为解决现有研究APOD的小鼠模型不能用于准确的研究APOD在某一组织的功能的问题，本发明提供了构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，通过CRISPR/Cas9技术在小鼠的Rosa26基因位点定点敲入CAG‑LSL‑Apod‑Wpre‑pA表达框。本发明实现了高效率基因敲入，构建了能够稳定表达APOD基因的小鼠模型。将其用于研究APOD在某一组织中的功能时，可以准确调控APOD的表达，提高了APOD功能研究结果的可靠性。
Description
技术领域
本发明属于动物模型构建技术领域，尤其涉及构建APOD条件敲入小鼠模型的方法。
背景技术
载脂蛋白D (Apolipoprotein D，Apo D)是一个分子量约为33kDa的糖蛋白，在人类中由APOD基因编码。它最初是在人血浆的高密度脂蛋白中被分离出来的，不同于其他主要在肝脏中产生的脂蛋白，Apo D主要产生于大脑和睾丸。Apo D在结构上与其他类型的载脂蛋白存在很大的差异，被归入脂肪促成素家族。
Apo D可以与胆固醇、黄体酮、胆红素等多种疏水性小分子结合。另外，Apo D在多种脊索动物的各类组织中广泛表达，揭示了Apo D在脊椎动物中重要的生理功能。最近的研究表明，Apo D可以作为多种癌症及神经系统疾病的早期诊断标记，因而备受关注。
目前对Apo D的研究集中在基因表达、组织分布和具体功能上。研究APOD的小鼠模型主要是常规的基因敲除或过表达，由于这两种方法是全身性调控APOD的表达，因此不能准确的研究APOD在某一组织的功能。
发明内容
为解决现有研究APOD的小鼠模型不能用于准确的研究APOD在某一组织的功能的问题，本发明提供了构建APOD条件敲入小鼠模型的方法。
本发明的技术方案：
构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，通过CRISPR/Cas9技术在小鼠的Rosa26基因位点定点敲入CAG-LSL-Apod-Wpre-pA表达框；具体包括如下步骤：
步骤一、通过体外转录的方式构建小鼠Rosa26基因位点的Cas9 mRNA和gRNA；
步骤二、通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体；
步骤三、将步骤一所得Cas9 mRNA、gRNA和步骤二所得同源重组载体共同注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；
步骤四、对F0代小鼠进行基因型鉴定，将阳性F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配得到F1代小鼠，对F1代小鼠进行基因型鉴定，阳性F1代小鼠即为所述小鼠模型。
进一步的，步骤一所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步的，步骤一所述Cas9 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
进一步的，步骤二所述同源重组载体包括5’同源臂、CAG-LSL-Apod-Wpre-pA和3’同源臂；所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CAG-LSL-Apod-Wpre-pA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
进一步的，步骤三所述注射到C57BL/6J小鼠受精卵的注射剂量为10 pl，培养基为KSOM，培养条件为37℃，5%CO2。
进一步的，步骤四所述对F0代小鼠和F1代小鼠进行基因型鉴定的方法是用PCR检测同源臂，所述PCR检测的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物1和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物2，PCR扩增得到3.6kb片段表示5’同源臂含有阳性基因组，PCR扩增得到5.2kb片段表示5’同源臂含有阴性基因组。
进一步的，步骤四所述对F0代小鼠和F1代小鼠进行基因型鉴定的方法是用PCR检测同源臂，所述PCR检测的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物3和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物4，PCR扩增得到3.6kb片段表示3’同源臂含有阳性基因组，PCR扩增得到6.5kb片段表示3’同源臂含有阴性基因组。
进一步的，对所述小鼠模型的基因型进行鉴定采用PCR扩增的方法，PCR扩增所用引物对包括核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的引物5和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物6，以及核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的引物7和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物8；PCR扩增得到的野生型基因片段大小为967bp，纯合子基因片段大小为346bp。
本发明的有益效果：
本发明提供的构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方法在小鼠的Rosa26基因位点定点敲入CAG-LSL-Apod-Wpre-pA表达框，实现了高效率基因敲入，构建了能够稳定表达APOD基因的小鼠模型。将其用于研究APOD在某一组织中的功能时，可以准确调控APOD的表达，提高了APOD功能研究结果的可靠性。
附图说明
图1为F0代小鼠和F1代小鼠基因型鉴定策略示意图；
图2为F0代小鼠双臂同源重组阳性的PCR鉴定电泳图，图中2表示F0代小鼠编号，wt表示野生型对照，M表示1kb DNA ladder；
图3为F1代小鼠双臂同源重组阳性的PCR鉴定电泳图，图中1、3、4、6、7、8表示F1代小鼠编号，wt表示野生型对照，M表示1kb DNA ladder；
图4为F1代小鼠基因型PCR鉴定电泳图，图中He均表示F1代小鼠，wt均表示野生小鼠，左图中M表示1kb DNA ladder，右图中M表示DL2000 DNA marker。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下列实施例中未具体注明的工艺设备或装置均采用本领域内的常规设备或装置，若未特别指明，本发明实施例中所用的原料等均可市售获得；若未具体指明，本发明实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例
本实施例提供了一种构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式在小鼠Rosa26基因位点定点敲入CAG-LSL-Apod-Wpre-pA表达框。
本实施例构建APOD条件敲入小鼠模型的方法具体包括如下步骤：
步骤一、通过体外转录的方式构建小鼠Rosa26基因位点的Cas9 mRNA和gRNA。
本实施例小鼠为C57BL/6J小鼠，插入位点基因名称（Ensembl）为Gt(ROSA)26Sor(ENSMUSG00000086429)，简称：Rosa26。插入位点染色体位置（Ensembl）：Chromosome 6：113,076,031。根据Rosa26基因序列信息，设计了gRNA，gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为GGGGACACACTAAGGGAGCTTGG；Cas9 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本实施例中Cas9 mRNA和gRNA的核苷酸片段由上海南方模式生物科技股份有限公司合成制备。
步骤二、通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体donor vector，该同源重组载体包括核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的3.3kb的5’同源臂、核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的CAG-LSL-Apod-Wpre-pA和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的3.3kb的3’同源臂；
本实施例中5’同源臂、CAG-LSL-Apod-Wpre-pA和3’同源臂的核苷酸片段由上海南方模式生物科技股份有限公司合成制备。
步骤三、将步骤一所得Cas9 mRNA、gRNA和步骤二所得同源重组载体共同显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，注射剂量为10 pl，培养基为KSOM，37℃、5%CO2条件下培养24小时后移植到代孕雌鼠中，获得F0代小鼠；
步骤四、对步骤三所得F0代小鼠进行基因型鉴定，鉴定策略如图1所示，基因型鉴定的方法是用PCR检测F0代小鼠的5’同源臂和3’同源臂是否含有阳性基因组。
5’同源臂PCR检测的引物核苷酸序列分别为：
SEQ ID NO.6所示的引物1：F-GGCGGGAGGTAGGTGGGGTGAGG；
SEQ ID NO.7所示的引物2：R-TGAGGGCAATCTGGGAAGGTT；
PCR扩增得到3.6kb片段表示5’同源臂含有阳性基因组，PCR扩增得到5.2kb片段表示5’同源臂不含有阳性基因组；
3’同源臂PCR检测的引物核苷酸序列分别为：
SEQ ID NO.8所示的引物3：F-GGGGGAGGGGAGTGTTGC；
SEQ ID NO.9所示的引物4：R-TTCTTCCTGCCTGCCTTCTGTGAC；
PCR扩增得到3.6kb片段表示3’同源臂含有阳性基因组，PCR扩增得到6.5kb片段表示3’同源臂不含有阳性基因组。
图2为本实施例F0代小鼠双臂同源重组阳性的PCR鉴定电泳图，图中2表示F0代小鼠编号，wt表示野生型对照，M表示DNA ladder；图2显示，F0代小鼠5’同源臂和3’同源臂均含有阳性基因组，表明F0代小鼠的Rosa26基因位点成功敲入了CAG-LSL-Apod-Wpre-pA表达框。
将阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配，繁育得到F1代小鼠，以引物1-引物4为扩增引物组，用PCR检测F1代小鼠的5’同源臂和3’同源臂是否含有阳性基因组。
图3为F1代小鼠双臂同源重组阳性的PCR鉴定电泳图，图中1、3、4、6、7、8表示F1代小鼠编号，wt表示野生型对照，M表示DNA ladder；图3显示，F1代小鼠5’同源臂和3’同源臂均含有阳性基因组，表明F1代小鼠的Rosa26基因位点成功敲入了CAG-LSL-Apod-Wpre-pA表达框。
对F1代小鼠进行基因型鉴定，采用PCR扩增的方法，PCR扩增所用引物核苷酸序列分别为：
SEQ ID NO.10所示的引物5：F-TCAGATTCTTTTATAGGGGACACA；
SEQ ID NO.11所示的引物6：R-TAAAGGCCACTCAATGCTCACTAA；
SEQ ID NO.12所示的引物7：F-TGTACTCCTGCACCACCTTC；
SEQ ID NO.13所示的引物8：R-TGAAAGCCATACGGGAAGCAA；
PCR扩增得到的野生型基因片段大小应为967bp，阳性基因片段大小应为346bp。
图4为F1代小鼠基因型PCR鉴定电泳图，图中He表示F1代小鼠，wt表示野生小鼠，M表示DNA ladder，图4显示，F1代小鼠得到了SEQ ID NO.14所示的967bp的野生型基因片段和SEQ ID NO.15所示的346bp的阳性基因片段，由此可见，阳性F1代小鼠即为成功敲入CAG-LSL-Apod-Wpre-pA表达框的小鼠模型。
Claims (6)
1.构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，通过CRISPR/Cas9技术在小鼠的Rosa26基因位点定点敲入CAG-LSL-Apod-Wpre-pA表达框；具体包括如下步骤：
步骤一、通过体外转录的方式构建小鼠Rosa26基因位点的Cas9 mRNA和gRNA，所述gRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
步骤二、通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体，所述同源重组载体包括5’同源臂、CAG-LSL-Apod-Wpre-pA和3’同源臂；所述5’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述CAG-LSL-Apod-Wpre-pA的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述3’同源臂的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；
步骤三、将步骤一所得Cas9 mRNA、gRNA和步骤二所得同源重组载体共同注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，获得F0代小鼠；
步骤四、对F0代小鼠进行基因型鉴定，将阳性F0代小鼠与野生型C57BL/6J小鼠交配得到F1代小鼠，对F1代小鼠进行基因型鉴定，阳性F1代小鼠即为所述小鼠模型。
2.根据权利要求1所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤一所述Cas9 mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求2所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤三所述注射到C57BL/6J小鼠受精卵的注射剂量为10 pl，培养基为KSOM，培养条件为37℃，5%CO2。
4.根据权利要求3所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤四所述对F0代小鼠和F1代小鼠进行基因型鉴定的方法是用PCR检测同源臂，所述PCR检测的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示的引物1和核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的引物2，PCR扩增得到3.6kb片段表示5’同源臂含有阳性基因组，PCR扩增得到5.2kb片段表示5’同源臂不含有阳性基因组。
5.根据权利要求3所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，步骤四所述对F0代小鼠和F1代小鼠进行基因型鉴定的方法是用PCR检测同源臂，所述PCR检测的引物为核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的引物3和核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的引物4，PCR扩增得到3.6kb片段表示3’同源臂含有阳性基因组，PCR扩增得到6.5kb片段表示3’同源臂不含有阳性基因组。
6.根据权利要求3所述构建APOD条件敲入小鼠模型的方法，其特征在于，对所述小鼠模型的基因型进行鉴定采用PCR扩增的方法，PCR扩增所用引物对包括核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示的引物5和核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的引物6，以及核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示的引物7和核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的引物8；PCR扩增得到的野生型基因片段大小为967bp，阳性基因片段大小为346bp。
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| Apolipoprotein D modulates lipid mediators and osteopontin in an anti‑inflammatory direction;Makoto Kurano et al.;Inflammation Research;20221219;第第72卷卷(第第2期期);第264页左栏第3段至右栏第2段，第264页右栏第4段至第265页左栏第3段 * |
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