CN113046389A

CN113046389A - 一种ccr2基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

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Publication number: CN113046389A
Application number: CN202110218561.9A
Authority: CN
Inventors: 沈月雷; 郭雅南; 白阳; 姚佳维; 尚诚彰
Original assignee: Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co ltd; Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co ltd; Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2020-02-28
Filing date: 2021-02-26
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2041-02-26
Also published as: CN113046389B

Abstract

本发明提供了一种CCR2基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。本发明还提供了一种人源化CCR2蛋白、人源化CCR2基因以及构建非人动物的靶向载体。本发明制备的CCR2基因人源化的非人动物体内正常表达人或人源化CCR2蛋白，可以应用于针对人CCR2靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病和肿瘤治疗，加快新药研发过程，节约时间和成本。对于研究CCR2蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。

Description

一种CCR2基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰技术领域，具体地说，涉及一种CCR2基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

白细胞浸润入炎性部位被称为趋化因子的8-10kD蛋白调控。此类趋化因子根据其N末端半胱氨酸残基的间隔分成4类，命名为CC、CXC、XC和CX3C。趋化因子可介导一系列对白细胞的促炎效应，例如触发趋化作用、脱粒、脂质介体(mediator)的合成以及整联蛋白激活。

CC chemokine receptor2(简称CCR2)是一种CC类趋化因子受体，属于G蛋白偶联受体。在炎症中，如动脉粥样硬化中很重要。CCR2蛋白仅在嗜碱性细胞和单核细胞中表达。CCR2有四个已知的配体，CCL2(MCP-1)，CCL8(MCP-2)，CCL7(MCP-3)和CCL13。CCR2是CCL2的关键功能受体，通过激活PI3K级联反应、小G蛋白Rac和片状突起介导的趋化和迁移诱导。

骨髓来源的抑制细胞(MDSCs，骨髓来源的一群异质性细胞，是树突状细胞(dendritic cells，DCs)、巨噬细胞和(或)粒细胞的前体)，能有效地帮助肿瘤躲避机体对肿瘤细胞的细胞毒性免疫反应。抑制CCR2，从而使CCR2控制的MDSCs释放对肿瘤细胞的细胞毒免疫反应，提高患者生存。ChemoCentryx公司的CCR2抑制剂CCX872，也称为CCX872-b，是一种有效的口服活性CCR2拮抗剂，具有潜在的免疫调节和抗肿瘤活性。CCR2是单抗药物Plozalizumab的靶点，目前处于一期临床阶段用于黑色素瘤的治疗，以及动脉粥样硬化和多发性骨髓瘤。CCR2促进癌细胞的转移，并与自身免疫相关的I型糖尿病、糖尿病肾病、多发性硬化症、哮喘、动脉粥样硬化、神经性疼痛和类风湿关节炎有关，但CCR2拮抗剂在很大程度上并不成功，目前仍有多种拮抗剂在临床试验中。

有研究表明，靶向敲除小鼠CCL2-1和CCR2基因会导致单核细胞招募受损，并产生与T-helper反应相关的细胞因子缺陷。敲除小鼠体内的CCR2可以防止动脉粥样硬化的发生。而试验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工作，目前CCR2人源化动物模型还未见报道。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种CCR2基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR2蛋白。

优选的，所述的非人动物内源CCR2蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化CCR2蛋白包含人CCR2蛋白的全部或部分，所述的人源化CCR2蛋白的氨基酸序列中连续10-100个氨基酸与人CCR2蛋白的氨基酸序列一致。

优选的，所述的人源化CCR2蛋白的氨基酸序列中连续100-374个氨基酸与人CCR2蛋白的氨基酸序列一致。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR2蛋白的氨基酸序列中连续20、50、80、100、150、200、250、300、350、374个氨基酸与人CCR2蛋白的氨基酸序列一致。

优选的，所述的人CCR2蛋白的部分还包含信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。进一步优选的，所述的人CCR2蛋白的部分包含胞外区的全部或部分。

更优选的，所述的非人动物体内表达上述的人或人源化CCR2蛋白。

优选的，所述的人CCR2蛋白的部分氨基酸序列包含人CCR2基因的第2号外显子和/或第3号外显子编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2蛋白的部分氨基酸序列包含人CCR2基因的第2号外显子和第3号外显子编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CCR2蛋白还包含非人动物CCR2蛋白的部分。

优选的，所述的非人动物CCR2蛋白的部分包含信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。进一步优选的，所述的非人动物CCR2蛋白的部分还包含胞外区的全部或部分。

进一步优选的，所述的非人动物CCR2蛋白的部分氨基酸序列还包含非人动物CCR2基因的第3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR2蛋白选自下列组中的一种：

(A)所述人源化CCR2蛋白中来源于人CCR2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的全部或部分；

(B)所述人源化CCR2蛋白中来源于人CCR2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)所述人源化CCR2蛋白中来源于人CCR2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

(D)所述人源化CCR2蛋白中来源于人CCR2蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

(A)所述人源化CCR2蛋白氨基酸序列为包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的全部或部分；

(B)所述人源化CCR2蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)所述人源化CCR2蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；

(D)所述人源化CCR2蛋白氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人或人源化CCR2基因。

优选的，所述的人源化CCR2基因的核苷酸序列中连续20个以上核苷酸与人CCR2基因的核苷酸序列一致。

进一步优选的，所述的人源化CCR2基因的核苷酸序列中连续20-2333个核苷酸与人CCR2基因的核苷酸序列一致。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR2基因的核苷酸序列中至少连续50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1125、1200、1300、1400、1500、1600、1610、1700、1800、1848、1900、2000、2100、2200、2333个核苷酸与人CCR2基因的核苷酸序列一致。

优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子至第3号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的一种或两种或三种的组合的全部或部分。再进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的两种或三种连续外显子的全部或部分；即所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子，优选还包括第1-2号内含子。或者所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子，优选还包括第1-2号内含子、2-3号内含子。或者所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子、第3号外显子，优选的还包括第2-3号内含子。

最为优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子的全部或部分、第3号外显子的全部或部分，更优选的还包括第2-3号内含子。

优选的，所述的人CCR2基因的部分包括人CCR2基因第2号外显子全部或部分、第3号外显子全部或部分，其与SEQ ID NO:3的相应第2号外显子全部或部分、第3号外显子全部或部分至少具有50％、60％、70％、80％、90％或至少95％同一性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因第2号外显子的部分为第2号外显子上编码区对应的核苷酸序列，或所述人CCR2基因第2号外显子的部分为第2号外显子上起始密码子开始至最后一个核苷酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因第3号外显子的部分为第3号外显子上编码区对应的核苷酸序列，或所述第3号外显子的部分为第3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的人CCR2基因的部分核苷酸序列包含编码胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分核苷酸序列包含编码信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因的部分核苷酸序列包含编码人CCR2蛋白的CDS序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：

a)为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

d)具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

e)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：39所示核苷酸序列的全部或部分；

f)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：39所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

g)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：39所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

h)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：39所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CCR2基因编码上述的人源化CCR2蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR2基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(c)包含与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；

(d)包含具有SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所示核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；

(e)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的全部或部分；

(f)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(g)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(h)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含非人动物CCR2基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物CCR2基因的部分包括非人动物CCR2基因第1号外显子、第2号外显子；优选的，所述非人动物CCR2基因第1号外显子、第2号外显子与SEQ ID NO:1的相应第1号外显子、第2号外显子至少具有50％、60％、70％、80％、90％或至少95％同一性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CCR2基因包含非人动物CCR2基因的第1号外显子、第2号外显子，和人CCR2基因的第2号外显子的全部或部分、第3号外显子的全部或部分。优选的还包括：非人动物第1-2号内含子、人第2-3号内含子。更优选的，还包括非人动物第3号外显子的部分。最为优选的，所述的非人动物第3号外显子的部分可以为非编码区。

优选的，所述的构建方法包括将人CCR2基因的部分核苷酸序列可操作的连接在非人动物CCR2基因座上。

优选的，所述的人或人源化CCR2基因在非人动物体内通过外源或内源调控元件进行调控。更有选的，所述的人或人源化CCR2基因在非人动物体内通过内源调控元件进行调控。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的调控元件为启动子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述人源化CCR2基因连接至非人动物CCR2启动子之后。

优选的，所述的构建方法包括将人CCR2基因的部分核苷酸序列插入到非人动物基因座或替换非人动物CCR2基因的全部或部分核苷酸序列获得。进一步优选的，将人CCR2基因的第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的一种、两种、三种、连续两种或连续三种外显子的组合的全部或部分核苷酸序列插入或替换非人动物CCR2基因的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的，将人CCR2基因的第2号外显子的部分和第3号外显子的部分插入或替换至非人动物CCR2基因的全部或部分核苷酸序列，最为优选的插入的序列还包括第2-3号内含子，其中，所述第2号外显子的部分为第2号外显子上起始密码子开始至最后一个核苷酸，所述第3号外显子的部分为第3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的构建方法包括将编码人CCR2蛋白的全部或部分核苷酸序列插入到非人动物基因座或替换非人动物CCR2基因的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，将编码人CCR2蛋白的CDS序列插入或替换非人动物CCR2基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的插入位点为CCR2基因的内源调控元件之后。进一步优选的，插入位点位于起始密码子上。更进一步优选的，所述插入位点位于起始密码子之前，5’UTR之后。

优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源CCR2基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源CCR2基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人CCR2基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中至少一个染色体上包含上述人源化CCR2基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化CCR2蛋白。进一步优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达上述人源化CCR2蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，使用靶向载体和/或sgRNA进行非人动物的构建。进一步优选的，所述的靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人CCR2基因的部分。

优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子至第3号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的一种或两种或三种的组合的全部或部分。更进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的两种或三种连续外显子的全部或部分。即所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子，优选还包括第1-2号内含子；或者所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子、第3号外显子，优选的还包括第2-3号内含子；或者所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子、第第3号外显子，优选还包括第1-2号内含子、2-3号内含子。

最为优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子的全部或部分、第3号外显子的全部或部分，优选还包括第2-3号内含子。

a)为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的全部或部分；

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’同源臂，其选自CCR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’同源臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’同源臂序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：36所示。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’同源臂，其选自CCR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’同源臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述3’同源臂序列如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：37所示。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于CCR2基因的第3号外显子或第2-3号内含子上。

优选的，所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：19-26任一项所示。

优选的，所述的sgRNA靶向的3’端靶位点序列如SEQ ID NO：27-34任一项所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ IDNO：19所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：29所示。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备CCR2人源化的非人动物的非人哺乳动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdcscid IL-2rγnul小鼠、NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-(NRG)小鼠、Rag 2-/--IL2rg-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了上述任一构建方法获得的CCR2基因人源化的非人动物或其后代。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人CCR2基因的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因第2号外显子的部分为第2号外显子上编码区对应的核苷酸序列，所述第2号外显子的部分为第2号外显子上起始密码子开始至最后一个核苷酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因第3号外显子的部分为第3号外显子上编码区对应的核苷酸序列，所述第3号外显子的部分为第3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

a)为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的全部或部分；

优选的，所述的待改变的转换区位于第2号外显子至第3号外显子上。进一步优选的，所述的待改变的转换区位于第1-2号内含子至第3号外显子上。更进一步优选的，所述的带改变的转换区位于第3号外显子上。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

本发明的第四方面，提供了一种sgRNA，所述sgRNA靶向CCR2基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CCR2基因上的靶序列上是唯一的。

本发明的第五方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。

优选的，所述的DNA分子为sgRNA的序列的5’端加上TAGG，其互补链加上AAAC获得的。

本发明的第六方面，提供了一种包含上述的sgRNA或上述的DNA分子的sgRNA载体。

本发明的第七方面，提供了一种sgRNA载体的制备方法，所述的制备方法包括提供一种sgRNA，所述的sgRNA靶向CCR2基因，同时所述sgRNA在待改变的CCR2基因上的靶序列上是唯一的。优选的，所述的sgRNA的靶位点位于CCR2基因的第3号外显子或第2-3号内含子上。

优选的，所述的制备方法包括以下步骤：

(i)提供一种sgRNA，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述的sgRNA靶向CCR2基因，同时所述sgRNA在待改变的CCR2基因上的靶序列上是唯一的，所述的sgRNA的靶位点位于CCR2基因的第3号外显子或第2-3号内含子上；

(ii)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

(iii)将步骤(i)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(ii)所述的pT7-sgRNA载体的双链；

(iv)将步骤(iii)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

进一步优选的，所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：19-26任一项所示。最为优选的，如SEQ ID NO：19所示；

进一步优选的，所述的sgRNA靶向的3’端靶位点序列如SEQ ID NO：27-34任一项所示。最为优选的，如SEQ ID NO：29所示。

进一步优选的，所述的步骤(ii)中所述T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：35所示。

本发明的第八方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子和/或上述的sgRNA载体的细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞包含上述任一靶向载体和上述任一sgRNA。

本发明的第九方面，提供了上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述的sgRNA载体、上述制备方法获得的sgRNA载体，或上述的细胞在CCR2基因修饰中的应用。

优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换非人动物CCR2基因的全部或部分核苷酸序列。

本发明的第十方面，提供了一种CCR2基因敲除的非人动物的构建方法，所述的非人动物缺失CCR2基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物缺失CCR2基因的第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的一种、两种、三种、连续两种或连续三种外显子的全部或部分核苷酸序列。进一步优选为缺失CCR2基因的第2号外显子的全部或部分和第3号外显子的全部或部分核苷酸序列，最为优选缺失的序列还包括第2-3号内含子。

在本发明的一个具体实施方式中，缺失的第2号外显子的部分为第2号外显子上编码区对应的核苷酸序列，所述第2号外显子的部分为第2号外显子上起始密码子开始至最后一个核苷酸。

在本发明的一个具体实施方式中，缺失的第3号外显子的部分为第3号外显子上编码区对应的核苷酸序列，所述第3号外显子的部分为第3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的构建方法包括使用sgRNA进行非人动物的构建。

本发明的第十一方面，提供了一种上述任一构建方法获得的CCR2基因敲除的非人动物或其后代。

本发明的第十二方面，提供了一种人源化CCR2蛋白，所述的人源化CCR2蛋白包含人CCR2蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CCR2蛋白的氨基酸序列中连续10-100个氨基酸与人CCR2蛋白的氨基酸序列一致。

优选的，所述的人CCR2蛋白的部分还包含信号肽、跨膜区和/或胞质区的全部或部分。进一步优选的，所述的人CCR2蛋白的部分包含胞外区的全部或部分。优选的，所述的人CCR2蛋白的部分氨基酸序列包含人CCR2基因的第2号外显子和/或第3号外显子编码的氨基酸序列。

本发明的第十三方面，提供了一种人源化CCR2基因，所述的人源化CCR2基因包含人CCR2基因的部分。

优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子至第3号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的一种或两种或三种的组合的全部或部分。再进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的两种或三种连续外显子的全部或部分。即所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子、第3号外显子，优选的还包括第2-3号内含子。或者所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子，优选还包括第1-2号内含子、2-3号内含子。或者所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子，优选还包括第1-2号内含子。

最为优选的，所述的人CCR2基因的部分包含人CCR2基因第2号外显子的全部或部分和第3号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因的部分还包含第2-3号内含子。

优选的，所述的人源化CCR2基因还包含非人动物CCR2基因的部分。

优选的，所述的非人动物CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的一种或两种或三种的组合的全部或部分。进一步优选的，所述的非人动物CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的两种或三种连续外显子的全部或部分。即所述的非人动物CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子，优选还包括第1-2号内含子。或者所述的非人动物CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子，优选还包括第1-2号内含子、2-3号内含子。或者所述的非人动物CCR2基因的部分包含第2号外显子、第3号外显子，优选的还包括第2-3号内含子。

优选的，所述的非人动物CCR2基因的部分包括非人动物CCR2基因第1号外显子、第2号外显子；优选的，所述非人动物CCR2基因第1号外显子、第2号外显子与SEQ ID NO:1的相应第1号外显子、第2号外显子至少具有50％、60％、70％、80％、90％或至少95％同一性。

a)为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的全部或部分；

优选的，所述的人源化CCR2基因编码上述的人源化CCR2蛋白。

优选的，所述的人源化CCR2基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

优选的，所述的人源化CCR2基因中包含非人动物CCR2启动子。

本发明的第十四方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

i)提供上述的非人动物，或者采用上述的构建方法获得的非人动物；

ii)将步骤i)获得的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因CD137、LAG-3、CTLA-4、TIM-3、BTLA、4-1BB、CD27、CD28、CD47、TIGIT、GITR、OX40、PD-1或PD-L1人源化的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

本发明的第十五方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或其子代。

优选的，所述的非人动物包括CCR2基因人源化的非人动物、CCR2基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物。

本发明的第十六方面，提供了一种动物肿瘤或炎症模型，所述的动物肿瘤或炎症模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的非人动物或其子代。

优选的，所述的炎症选自动脉粥样硬化或类风湿关节炎等。

本发明的第十七方面，提供了一种动物肿瘤或炎症模型的制备方法，所述的制备方法包括采用上述的构建方法制备非人动物的步骤。优选的，所述的制备方法还包括植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第十八方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的非人动物或其子代在制备动物肿瘤或炎症模型中的应用。

本发明的第十九方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物肿瘤或炎症模型。

本发明的第二十方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物肿瘤或炎症模型。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。

本发明的第二十一方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的动物肿瘤或炎症模型。

本发明的第二十二方面，提供了一种CCR2基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化CCR2蛋白。

优选的，所述的细胞表达上述人源化CCR2蛋白。

优选的，所述细胞中内源CCR2蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人CCR2基因的部分。进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子至第3号外显子的全部或部分。更进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的一种或两种或三种的组合的全部或部分。再进一步优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的两种或三种连续外显子的全部或部分；即所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子，优选还包括第1-2号内含子。或者所述的人CCR2基因的部分包含第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子，优选还包括第1-2号内含子、2-3号内含子。或者所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子、第3号外显子，优选的还包括第2-3号内含子。

最为优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子的全部或部分和第3号外显子的全部或部分，再优选还包括第2-3号内含子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因第2号外显子的部分为第2号外显子上编码区对应的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人CCR2基因第3号外显子的部分为第3号外显子上编码区对应的核苷酸序列。

优选的，所述细胞的基因组中包含非人动物CCR2基因的部分。进一步优选的，所述的非人动物CCR2基因的部分包括非人动物CCR2基因第1号外显子、第2号外显子；优选的，所述非人动物CCR2基因第1号外显子、第2号外显子与SEQ ID NO:1的相应第1号外显子、第2号外显子至少具有50％、60％、70％、80％、90％或至少95％同一性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞的基因组中包含上述的人源化CCR2基因。

本发明的第二十三方面，提供了一种CCR2基因敲除的细胞，所述的细胞中缺失CCR2基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的细胞缺失CCR2基因的第1号外显子、第2号外显子和第3号外显子中的一种、两种、三种、连续两种或连续三种外显子的全部或部分核苷酸序列。最为优选为缺失CCR2基因的第2号外显子的全部或部分和第3号外显子全部或部分的核苷酸序列，更优选缺失的序列还包括第2-3号内含子。

在本发明的一个具体实施方式中，缺失的第2号外显子的部分为第2号外显子上编码区对应的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，缺失的第3号外显子的部分为第3号外显子上编码区对应的核苷酸序列。

本发明的第二十四方面，提供了一种表达上述的人源化CCR2蛋白的构建体。优选的，所述的构建体包含上述人源化CCR2基因。

本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第二十六方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的人源化CCR2蛋白、上述的人源化CCR2基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物肿瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或者上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CCR2功能、人CCR2信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

本发明的第二十八方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物肿瘤或炎症模型用作人CCR2特异性调节剂的筛选。

本发明的第二十九方面，提供了一种人CCR2特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物肿瘤或炎症模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体结合蛋白或疫苗。所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述人CCR2特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第三十方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物肿瘤或炎症模型。

优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白或疫苗。所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第三十一方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物肿瘤或炎症模型在制备人CCR2特异性调节剂中的用途。

本发明的第三十二方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的动物肿瘤或炎症模型在制备治疗肿瘤、炎症或自身免疫疾病的药物中的用途。

优选的，所述的炎症或自身免疫疾病包括但不限于I型糖尿病、糖尿病肾病、多发性硬化症、哮喘、动脉粥样硬化、神经性疼痛或类风湿关节炎。

本发明所述的肿瘤包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤包括但不限于多发性骨髓瘤或黑色素瘤。

通过本发明的构建方法成功构建CCR2基因人源化的非人动物，在非人动物体内成功表达了人或人源化CCR2蛋白，本发明构建的非人动物可以应用于针对人CCR2靶位点的药物筛选、药效评估、免疫疾病和肿瘤治疗，加快新药研发过程，节约时间和成本。对于研究CCR2蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。例如“第1号外显子至第3号外显子的全部”为整体，即第1号外显子至第3号外显子的全部核苷酸序列；“第1号外显子至第3号外显子的部分”为整体的局部或组成整体的个体，即第1号外显子至第3号外显子中的一个或两个或三个或两个连续或三个连续或间断的核苷酸序列。

本发明所述的“第1号外显子至第3号外显子”为CCR2基因上的连续的区域，包括从第1号外显子的第一个核苷酸开始至第3号外显子的最后一个核苷酸为止。也就是说，是包括第1-2号内含子和第2-3号内含子的核苷酸序列的。

本发明所述的“人源化CCR2蛋白”，包含来源于人CCR2蛋白的部分和非人CCR2蛋白的部分。其中，所述的“人CCR2蛋白”为人CCR2蛋白的全长氨基酸序列，同“人CCR2蛋白的全部”。所述的“人CCR2蛋白的部分”为连续5-374个氨基酸与人CCR2蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续10-100或100-374个，最为优选为连续20、50、80、100、150、200、250、300、350、374个氨基酸与人CCR2蛋白的氨基酸序列一致。

本发明所述的“人源化CCR2基因”，包含来源于人CCR2基因的部分和非人CCR2基因的部分。其中，所述的“人CCR2基因”为人CCR2基因的全长核苷酸序列。所述的“人CCR2基因的部分”为连续20个以上核苷酸与人CCR2基因的核苷酸序列一致，优选为连续20-2333，最为优选为连续50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1100、1125、1200、1300、1400、1500、1600、1610、1700、1800、1848、1900、2000、2100、2200、2333个核苷酸与人CCR2基因的核苷酸序列一致。

本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdc^scid IL-2rg^null背景的小鼠。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠与人CCR2基因的对比示意图(非按比例)。

图2：改造后的人源化小鼠的CCR2基因示意图(非按比例)，其中，Exon3和Exon4编码区及其之间的内含子来自人CCR2基因，UTR区来自小鼠。

图3：打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)。

图4：细胞的PCR检测结果，其中，Zl-1、Zl-2为克隆编号，WT为野生型小鼠对照，H₂O为水对照，M为Marker。

图5：FRT重组过程示意图(非按比例)。

图6：F1代人源化小鼠(已去Neo)示例性的PCR鉴定结果，其中，左图条带分别为M为Marker，F1-1至F1-5为小鼠编号，右图条带分别为WT为野生型对照，H₂O为水对照，M为Marker。

图7：F1代人源化小鼠(已去Neo)示例性的southern鉴定结果，其中，F1-1至F1-5为小鼠编号，WT为野生型对照。

图8：打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)。

图9：sgRNA活性检测结果，其中，Con为阴性对照，PC为阳性对照，图A为靶向5’端靶位点的sgRNA活性检测结果，图B为靶向3’端靶位点的sgRNA活性检测结果。

图10：质粒酶切结果图，其中，1-4为质粒编号，ck为未经酶切的质粒对照，M为Marker。

图11：F0代人源化小鼠体细胞基因型的PCR鉴定结果图，其中，F0-1、F0-2、F0-3为小鼠编号，PC为阳性质粒，WT为野生型对照，H₂O为水对照，M为Marker。

图12：F1代人源化小鼠鼠尾PCR检测结果图，其中，F1-1、F1-2、F1-3、F1-4和F1-5为小鼠编号，M为Marker，WT为野生型对照，H₂O为水对照。

图13：F1代人源化小鼠southern鉴定结果，其中，F1-1、F1-2、F1-3、F1-4和F1-5为小鼠编号，WT为野生型对照。

图14：流式检测表达情况，其中，A、C为野生型小鼠检测结果，B、D为人源化杂合性小鼠检测结果。

图15：流式检测表达情况，其中，A、C为野生型小鼠检测结果，B、D为人源化纯合子小鼠检测结果。

图16：基因敲除小鼠PCR检测，其中，KO-1至KO-6为小鼠编号，WT为野生型对照，M为Marker，H₂O为水对照。

具体实施方式

实施例中所使用的材料、试剂及设备详细信息如下：

Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；

大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104-02；

EcoRI，ScaI，HindIII，BbsI，SmaI，ApaI，PstI，BglII酶购自NEB，货号分别为；R3101M，R3122M，R3104M，R0539L，R0141L，R0114L，R3140M，R0144L；

Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

AIO试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-004；

UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

B-hPD-1小鼠、B-hCTLA-4小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司；

流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur；

pT7-sgRNA质粒来源：Takara，货号3299；

APC anti-mouse CD192(CCR2)Antibody，厂家Biolegend，货号：150627；

PE anti-human CD192(CCR2)Antibody，厂家Biolegend，货号：357205；

V450 Rat Anti-mouse CD11b，厂家BD Horizon，货号560455。

实施例1CCR2基因人源化小鼠

小鼠CCR2基因(NCBI Gene ID：12772，位于9号染色体NC_000075.6的第124101918至124109140位，基于转录本NM_009915.2(SEQ ID NO：1)及其编码蛋白NP_034045.1(SEQID NO：2))。人CCR2基因(NCBI Gene ID：729230，位于3号染色体NC_000003.12的第46353744至46360940位，基于转录本NM_001123041.2(SEQ ID NO：3)及其编码蛋白NP_001116513.2(SEQ ID NO：4))对比示意图如图1所示。

为了实现本发明的目的，将小鼠CCR2基因3号外显子编码序列用人CCR2基因编码序列进行替换，最终得到改造后的人源化小鼠CCR2基因示意图(如图2所示)。人源化小鼠CCR2基因的核苷酸部分序列(人源化CCR2基因的DNA序列)如SEQ ID NO：5所示。

GACCACAGAATCAAAGGAAATGCTGTCCACATCTCGTTCTCGGTTTATCAGAAATACCAACGAGAGCG GTGAAGAAGTCACCACCTTTTTTGATTATGATTACGGTGCTCCCTGTCATAAATTTGACGTGAAGCAAATTGGGGC CCAACTCCTGCCTCCGCTCTACTCGCTGGTGTTCATCTTTGGTTTTGTGGGCAACATGCTGGTCGTCCTCATCTTA ATAAACTGCAAAAAGCTGAAGTGCTTGACTGACATTTACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGATCTGCTTTTTCTTA TTACTCTCCCATTGTGGGCTCACTCTGCTGCAAATGAGTGGGTCTTTGGGAATGCAATGTGCAAATTATTCACAGG GCTGTATCACATCGGTTATTTTGGCGGAATCTTCTTCATCATCCTCCTGACAATCGATAGATACCTGGCTATTGTC CATGCTGTGTTTGCTTTAAAAGCCAGGACGGTCACCTTTGGGGTGGTGACAAGTGTGATCACCTGGTTGGTGGCTG TGTTTGCTTCTGTCCCAGGAATCATCTTTACTAAATGCCAGAAAGAAGATTCTGTTTATGTCTGTGGCCCTTATTT TCCACGAGGATGGAATAATTTCCACACAATAATGAGGAACATTTTGGGGCTGGTCCTGCCGCTGCTCATCATGGTC ATCTGCTACTCGGGAATCCTGAAAACCCTGCTTCGGTGTCGAAACGAGAAGAAGAGGCATAGGGCAGTGAGAGTCA TCTTCACCATCATGATTGTTTACTTTCTCTTCTGGACTCCCTATAATATTGTCATTCTCCTGAACACCTTCCAGGA ATTCTTCGGCCTGAGTAACTGTGAAAGCACCAGTCAACTGGACCAAGCCACGCAGGTGACAGAGACTCTTGGGATG ACTCACTGCTGCATCAATCCCATCATCTATGCCTTCGTTGGGGAGAAGTTCAGAAGGTATCTCTCGGTGTTCTTCC GAAAGCACATCACCAAGCGCTTCTGCAAACAATGTCCAGTTTTCTACAGGGAGACAGTGGATGGAGTGACTTCAAC AAACACGCCTTCCACTGGGGAGCAGGAAGTCTCGGCTGGTTTATAAAACGAGGAGCAGTTTGATTGTTGTTTATAA AGGGAGATAACAATCTGTATATAACAACAAACTTCAAGGGTTTGTTGAACAATAGAAACCTGTAAAGCAGGTGCCC AGGAACCTCAGGGCTGTGTGTACTAATACAGACTATGTCACCCAATGCATATCCAACATGTGCTCAGGGAATAATC CAGAAAAACTGTGGGTAGAGACTTTGACTCTCCAGAAAGCTCATCTCAGCTCCTGAAAAATGCCTCATTACCTTGT GCTAATCCTCTTTTTCTAGTCTTCATAATTTCTTCACTCAATCTCTGATTCTGTCAATGTCTTGAAATCAAGGGCC AGCTGGAGGTGAAGAAGAGAATGTGACAGGCACAGATGAATGGGAGTGAGGGATAGTGGGGTCAGGGCTGAGAGGA GAAGGAGGGAGACATGAGCATGGCTGAGCCTGGACAAAGACAAAGGTGAGCAAAGGGCTCACGCATTCAGCCAGGA GATGATACTGGTCCTTAGCCCCATCTGCCACGTGTATTTAACCTTGAAGGGTTCACCAGGTCAGGGAGAGTTTGGG AACTGCAATAACCTGGGAGTTTTGGTGGAGTCCGATGATTCTCTTTTGCATAAGTGCATGACATATTTTTGCTTTA TTACAGTTTATCTATGGCACCCATGCACCTTACATTTGAAATCTATGAAATATCATGCTCCATTGTTCAGATGCTT CTTAGGCCACATCCCCCTGTCTAAAAATTCAGAAAATTTTTGTTTATAAAAGATGCATTATCTATGATATGCTAAT ATATGTATATGCAATATATATAGGCTCTTGCTTGATCTCTCCAGGAGGTAGTGATTATGAGAAGGGGGTGGAGAAT GATGAGTTCCTTCACCAGGAGCAAAGGACGGGGATCGTGTGGAACCACTGCAGAACTATTTCCGAAATCAACTAAG TGGAGAGAGCCAGGAAGGCTGCATCAGAACCCAGTAAAGCTTCTTGTCTGGATCTGAGCTGGTTTGTTTTGTGCTT GCTTTTCCCTGCCTTGCCACTCCCCTCACTCTTCTCTTTTCCCCACAGCCTTTTTCACATAGCTCTTGGCTGTAGG ATTGCCCCACTCCAAAAACCAGTGTGTGGAGGTCCAGGAGTGAGACCAGGAAAGAATGTGAAAGTGACTACACAAG GACTCCTCGATGGTCGTGGAAAAGGAAAGTCAATTGGCAGAGCCCCTGAAGCCAGTCTTCAGGACAAAGAAGGAGC CTAGAGTAAGTGACAGTTTGCCTTTTTTTAAGCA(SEQ ID NO：5)

其中，SEQ ID NO：5中仅仅列出涉及改造部分的DNA序列的部分序列，其中斜体下划线区域为人CCR2基因序列片段(SEQ ID NO：6)。改造后的人源化小鼠CCR2基因的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：4所示，其中人源化小鼠CCR2基因的mRNA序列中包含的来源于人CCR2基因的mRNA如SEQ ID NO：39所示，得到如图2所示的人源化CCR2基因。打靶示意图如图3所示，小鼠和人CCR2的DNA分别来自于细菌人工染色体(BAC)编号MSMG01-529G5和CH17-415H16。其中，靶向载体上含有5’同源臂、3’同源臂以及包含人CCR2基因核苷酸序列的A片段，其中5’同源臂与NCBI登录号NC_000075.6的第124103380-124105684位核苷酸序列相同(如SEQ ID NO：7所示)；3’同源臂与NCBI登录号NC_000075.6的第124109462—124115245位核苷酸序列相同(如SEQ ID NO：8所示)；A片段上包含的人CCR2基因核苷酸序列与SEQ ID NO：6核苷酸序列相同。

靶向载体的A片段上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。Neo盒上游与小鼠CCR2基因座的连接设计为

其中，双下划线

中G为与Neo盒连接的鼠的最后一个核苷酸，单下划线GATA中G为Neo盒第一个核苷酸序列。Neo盒下游与小鼠CCR2基因座的连接设计为

其中，双下划线

中第二个C为Neo盒最后一个核苷酸，单下划线CCAC中第一个C为小鼠第一个核苷酸。人CCR2基因片段上游与小鼠CCR2基因座的连接设计为：

其中，双下划綫

中最后一个A为小鼠最后一个核苷酸，单下划线ATGC中A为人CCR2第一个核苷酸。人CCR2基因片段下游与小鼠CCR2基因的连接设计为：

其中双下划线

中G为人最后一个核苷酸，AGTAA中第一个A为小鼠第一个核苷酸。

经过扩增、酶切、合成的步骤构建靶向载体。随机选择两个质粒送到测序公司测序，将构建正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，筛选的阳性细胞使用引物为：ZL-F：5’-CTCATAATTTGGTCAGCAAGATGGTT-3’(SEQ ID NO：13)；ZL-R：5’-CCCTGAGCACATGTTGGATATGCAT-3’(SEQ ID NO：14)，目的扩增条带2715bp为阳性克隆(图4)，从图4可以看出，2个细胞均为阳性克隆。测序进一步验证2个细胞均为阳性克隆，将验证正确的阳性克隆(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到表达人CCR2蛋白的CCR2基因人源化纯合子小鼠。

可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去Neo)的鉴定结果见图6，结果显示，5只F1小鼠全部为阳性杂合小鼠。其中，PCR测定包括下述引物：L-GT-F：5’-GCCAAGGATGTTAAGGAAATGGTTGC-3’(SEQ ID NO：15)，L-GT-R：5’-GACCCTTTAATACAGTTCCTC-3’(SEQ ID NO：16)，F1人源化小鼠扩增条带为约486bp(～486bp)，野生型扩增条带1608bp。使用5’探针(5’Probe)进行Southern Blot检测，引物序列为：

P1-F：5’-TGTGACATGCAAGCTTCATTTGGCTAT-3’(SEQ ID NO：17)

P1-R：5’-AACTTCCCTTCTCTTGTGAAGCCCA-3’(SEQ ID NO：18)

预计检测结果如表1所示。实际结果如图7所示，在BglII酶切及5’Probe探针检测条件下，野生型的C57BL/6小鼠基因组检测出4.9kb条带，F1小鼠检测出4.9kb条带及6.2kb条带，没有其它杂带产生，与预期结果一致(预期检测结果如表1)。说明这5只小鼠全部为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的B-hCCR2人源化基因工程小鼠。

表1探针检测结果

引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，以图2所示的结果为例，设计了如图8所示的打把策略示意图，本实施例中设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA8)、3’端靶位点(sgRNA9-sgRNA16)的sgRNA序列。5’端靶位点位于CCR2基因第3号外显子或2-3号内含子上、3’端靶位点位于第3号外显子上，sgRNA靶位点序列如下：

sgRNA-1靶位点序列:5’-GAGATGTTGATAGTATGCCG TGG-3’(SEQ ID NO：19)

sgRNA-2靶位点序列:5’-GATACTGCTTAAATGGCGCA AGG-3’(SEQ ID NO：20)

sgRNA-3靶位点序列:5’-TTAAATGGCGCAAGGCTATT TGG-3’(SEQ ID NO：21)

sgRNA-4靶位点序列:5’-TTAAGCAGTATCCCCATCTT TGG-3’(SEQ ID NO：22)

sgRNA-5靶位点序列:5’-AGATGGGGATACTGCTTAAA TGG-3’(SEQ ID NO：23)

sgRNA-6靶位点序列:5’-AGTATCCAAGAGCTTGATGA AGG-3’(SEQ ID NO：24)

sgRNA-7靶位点序列:5’-GCGCAAGGCTATTTGGATTA AGG-3’(SEQ ID NO：25)

sgRNA-8靶位点序列:5’-ATCATCGTAGTCATACGGTG TGG-3’(SEQ ID NO：26)

sgRNA-9靶位点序列:5’-GGGGAGCAAGAGGTCTCGGT TGG-3’(SEQ ID NO：27)

sgRNA-10靶位点序列:5’-TCTACATTCACTCCTTCCAC TGG-3’(SEQ ID NO：28)

sgRNA-11靶位点序列:5’-GGGAGCAAGAGGTCTCGGTT GGG-3’(SEQ ID NO：29)

sgRNA-12靶位点序列:5’-CACTGGGGAGCAAGAGGTCT CGG-3’(SEQ ID NO：30)

sgRNA-13靶位点序列:5’-AAGACAGTGGTTCTTACTTT GGG-3’(SEQ ID NO：31)

sgRNA-14靶位点序列:5’-CGAGACCTCTTGCTCCCCAG TGG-3’(SEQ ID NO：32)

sgRNA-15靶位点序列:5’-TCCTTCCACTGGGGAGCAAG AGG-3’(SEQ ID NO：33)

sgRNA-16靶位点序列:5’-GCTGTCTCCCTATAGAAAAC TGG-3’(SEQ ID NO：34)

利用UCA试剂盒检测sgRNA的活性，检测结果参见图9和表2，可见sgRNA

具有不同活性，其中虽然sgRNA3、sgRNA12、sgRNA15活性相对较低，这可能由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验，sgRNA3、sgRNA12、sgRNA15的数值仍显著高于对照组数值，仍可判断sgRNA3、sgRNA12、sgRNA15是具有活性的，活性满足基因打靶实验要求。随机选择的sgRNA-1和sgRNA-11进行后续实验。在其5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其互补链加上AAAC得到反向寡核苷酸，退火后将退火产物连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-CRR2-1和pT7-CRR2-11。

表2 UCA检测结果

由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA如SEQ ID NO：35所示。

进一步的，设计了图8所示的打靶策略和包含5’同源臂、人CCR2片段、3’同源臂的载体。5’端同源臂序列为NCBI登录号为NC_000075.6的第124104354-124105684位核苷酸(SEQ ID NO：36)，3’同源臂序列为NCBI登录号为NC_000072.6的第124106807-124108270位核苷酸(SEQ ID NO：37)。以C57BL/6小鼠基因组DNA为模板PCR扩增获得5’端同源臂片段和3’端同源臂片段，以人基因组DNA为模板PCR扩增获得人DNA片段，通过AIO试剂盒将片段连接至试剂盒配备的pClon-4G质粒上，最终获得载体pClon-4G-CCR2。随机挑选4个pClon-4G-CCR2克隆，使用3组酶进行酶切验证，结果如图10所示，HindIII+EcoRI酶切后检测出大小分别为5187bp、2190bp、1254bp三条目的条带，SmaI+ApaI酶切后检测出大小分别为3726bp、2975bp、1930bp三条目的条带，SacI+PstI酶切后检测出大小分别为4403bp、2803bp、1425bp三条目的条带。酶切结果均与预期一致，将质粒送到测序公司测序，结果显示正确。

取C57BL/6小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-CCR2-1、pT7-CCR2-11质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA，pClon-4G-CCR2质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。将获得的F0代小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。

通过PCR鉴定F0代小鼠体细胞基因型，引物序列如表3所示，图11A中编号为F0-1、F0-2、F0-3三只小鼠均扩增得到2715bp的片段，WT和H₂O无扩增条带结果。图11B中编号为F0-1、F0-2、F0-3三只小鼠均得到3041bp的片段，PC得到同样片段大小片段(PC为阳性质粒)，WT和H₂O未得到目的条带。结果表明，获得了编号为F0-1、F0-2、F0-3的阳性小鼠。

表3F0小鼠检测引物

Mut：成功重组结果

将F0鉴定为阳性的小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配得到F1代小鼠。对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。PCR实验结果与预期相符(参见图12)，显示5只F1代小鼠均为阳性小鼠，编号分别为：F1-1、F1-2、F1-3、F1-4和F1-5。

应用Southern Blot对上述5只F1代阳性小鼠进行检测，剪取鼠尾提取基因组DNA，选用Scal和BglII酶消化基因组，转膜，杂交。探针P1、P2分别位于5’同源臂外侧及人源片段上。探针合成引物如下：

表4探针合成引物

引物	引物序列(5’-3’)
		P1-F	TGTGACATGCAAGCTTCATTTGGCTAT(SEQ ID NO：42)
P1-R	AACTTCCCTTCTCTTGTGAAGCCCA(SEQ ID NO：43)
		P2-F	TACCTGGCTATTGTCCATGCTGTGT(SEQ ID NO：44)
P2-R	TGGTCCAGTTGACTGGTGCTTTCAC(SEQ ID NO：45)

表5探针检测结果

限制性内切酶	探针	WT	成功重组
				ScaI	A Probe(3’)	--	7.3kb
BglII	5’Probe	4.9kb	6.2kb

Southern blot检测结果见图13，在Scal酶且P1探针检测条件下，野生型的C57BL/6小鼠基因组检测不出条带，杂合子小鼠检测出7.3kb条带；在BglII酶切及5’Probe探针检测条件下，野生型的C57BL/6小鼠基因组检测出4.9kb条带，没有其它杂带产生，人源化杂合小鼠基因组检测出4.9kb条带及6.2kb条带，即检测结果与预期结果一致(预期检测结果如表5)，无杂带产生。说明这5只小鼠为全部为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的B-hCCR2人源化基因工程小鼠。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。

实施例2人源化小鼠的表达情况分析

选取1只阳性F1代B-hCCR2杂合子小鼠，另选1只野生型C57BL/6小鼠作为对照，取小鼠的骨髓，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，再用鼠mCCR2-APC和人hCCR2-PE进行细胞标记，再使用mCD11b-V450标记小鼠体内嗜碱性细胞、单核细胞、中性粒细胞，NK细胞等，PBS清洗细胞1次，进行蛋白表达FACS检测，结果如图14。其中，A、C为野生型小鼠检测结果，B、D为CCR2人源化杂合性小鼠检测结果。结果在人源化小鼠体内检测到了hCCR2，说明人源化小鼠骨髓细胞中表达了人CCR2蛋白(图14D)；而在野生型小鼠骨髓细胞中未检测到人CCR2蛋白(图14C)。

进一步的，将鉴定为阳性的F1代小鼠互相交配，可得到CCR2人源化基纯合子F2代小鼠。选取1只纯合的B-hCCR2人源化小鼠，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，采用与F1代方法一致的FACS方法检测，CCR2蛋白的表达情况如图15所示。图15A、图15C使用野生型小鼠，图15B、图15D使用CCR2人源化纯合鼠，在CCR2人源化纯合小鼠体内检测到表达人CCR2蛋白(图15D)，野生型C57BL/6小鼠体内未检测到人CCR2蛋白(图15C)。

实施例3基因敲除小鼠的制备及鉴定

利用显微注射仪将预混好的pT7-CCR2-1、pT7-CCR2-11质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因敲除小鼠。

为此设计两对引物，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如表6，F0小鼠进行检测。结果如图16所示，使用KO-F和KO-R1引物结果如图A所示KO-1、KO-2、KO-3、KO-4、KO-5和KO-6六只小鼠扩增出406bp目的条带，如图B所示，WT扩增出406bp大小片段。使用KO-F和KO-R2引物扩增结果如图C所示KO-1、KO-2、KO-3、KO-4、KO-5和KO-6六只小鼠扩增出约486bp目的条带，如图D所示，WT扩增出1608bp片段，对照H₂O均为扩增得到目的条带，结果表明KO-1、KO-2、KO-3、KO-4、KO-5和KO-6六只小鼠全部为基因敲除小鼠。

表6基因敲除小鼠检测引物

mut：KO成功结果

实施例4双重基因人源化小鼠

PD-1/CCR2双重基因人源化小鼠制备，使用PD-1人源化小鼠与本发明实施例1获得的纯合的CCR2人源化小鼠交配，对其后代进行筛选，经过多代筛选，得到PD-1/CCR2双重基因人源化小鼠。

实施例5双重基因人源化小鼠

CTLA4/CCR2双重基因人源化小鼠制备，使用CTLA4人源化小鼠与本发明实施例2获得的纯合的CCR2人源化小鼠交配，对其后代进行筛选，经过多代筛选，得到CTLA4/CCR2双重基因人源化小鼠。

实施例6多基因人源化小鼠

通过使用实施例4和实施例5获得的纯合小鼠进行交配，经过多代筛选，即可获得多重人源化小鼠。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

百奥赛图江苏基因生物技术有限公司

<120> 一种CCR2基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

<130> 1

<160> 48

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3589

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

tgccatcata aaggagccat acctgtaaat gccatgcaag ttcagctgcc tgcaaagacc 60

agaagagggc attggattca ccacatgtgc taagaattga acttgaatca tctgcaaaaa 120

caaatcaaag gaaatggaag acaataatat gttacctcag ttcatccacg gcatactatc 180

aacatctcat tctctattta cacgaagtat ccaagagctt gatgaagggg ccaccacacc 240

gtatgactac gatgatggtg agccttgtca taaaaccagt gtgaagcaaa ttggagcttg 300

gatcctgcct ccactctact ccctggtatt catctttggt tttgtgggca acatgttggt 360

cattataatt ctgataggct gtaaaaagct gaagagcatg actgatatct atctgctcaa 420

cttggccatc tctgacctgc tcttcctgct cacattacca ttctgggctc actatgctgc 480

aaatgagtgg gtctttggga atataatgtg taaagtattc acagggctct atcacattgg 540

ttattttggt ggaatctttt tcattatcct cctgacaatt gataggtact tggctattgt 600

tcatgctgtg tttgctttaa aagccaggac agttaccttt ggggtgataa caagtgtagt 660

cacttgggtg gtggctgtgt ttgcctctct accaggaatc atatttacta aatccaaaca 720

agatgatcac cattacacct gtggccctta ttttacacaa ctatggaaga atttccaaac 780

aataatgaga aatatcttga gcctgatcct gcctctactt gtcatggtca tctgctactc 840

aggaattctc cacaccctgt ttcgctgtag gaatgagaag aagaggcaca gggctgtgag 900

gctcatcttt gccatcatga ttgtctactt tctcttctgg actccataca atattgttct 960

cttcttgacc accttccagg aatccttggg aatgagtaac tgtgtgattg acaagcactt 1020

agaccaggcc atgcaggtga cagagactct tggaatgaca cactgctgca ttaatcctgt 1080

catttatgcc tttgttggag agaagttccg aaggtatctc tccatatttt tcagaaagca 1140

cattgctaaa cgtctctgca aacagtgccc agttttctat agggagacag cagatcgagt 1200

gagctctaca ttcactcctt ccactgggga gcaagaggtc tcggttgggt tgtaaagtaa 1260

gtgacagttt gccttttttt aagcagggaa ggagggagca gtttgtacat agcaacaagc 1320

ctcaaagaca gtggttctta ctttgggtca tgatccctat gtgggggtca aatgaccctt 1380

tcacagaggt cactaaaacc attagaaaac ataggtattt acattataat tcataacagt 1440

agcaaaatta cagctatgaa gtagcagcaa aaataatttt attgttgtag atcaccacaa 1500

catgaggaac tgtattaaag ggtcacagga ttaggaaggt ttcaaaccac tgctcatgga 1560

tatattgaac aatagagacc tttaaatcag gtgcccagaa cgttataatt atgccgtgac 1620

tgaaccatat ctcttcttgt atatataata catgtttgag aaatatttta gaataataat 1680

tggtaaattc ttcagctttc cagggaactc tatccctatg aggagcctct ttgccttgtg 1740

gcaatattat tttaccaatc ttcaccatgt ttttccttac ttataacatg aaagacatgg 1800

aatttaagaa aggagggcat gaggctgcca ggactgagtg agaaggagga gatatgcact 1860

gttgctcctg agtgaaaatg gaaatgaaag tgagcagggc tctcaaattt ctttctcatt 1920

tgggaagaaa tgtcttgctc tttggttcct tctcctatct gtgtttaatt ttggaggctt 1980

tatcaggttg tggaaaatct agaaactgta ataggttgtt ggaaacctca tttgagtacc 2040

atagtccttt tatacataat tgcacaacac atttttgctt tgttattttt ttttatcttt 2100

gacaacatgg acaatttttt tcaatatcac actccactgt tgatatgttt ctcaagccac 2160

agttccttac atgatattta taaaattatt gtttataaaa tatgcattat tagtgattag 2220

actaaaaata ataagggctc ttgtttgatc tttccttctg ctttccaggg agagcagaag 2280

gctaaaagta gtgaatgacc aagaataagg agaaaagcca actccttcat caggcacaga 2340

gagctgcagc aaaaaggcag agatctgtgg gacagaggaa gtggtgtgct tagaactaca 2400

tagaatcaga agcaaaatgg atgccttagc actgaggaaa ggtttctgtc aggttataaa 2460

ctggttttat attattgctg ctattttctg cctcctcagt acctttgcaa ctgcctcttt 2520

cctcatagca tttatctctc aacctcttcc tgggaaaggt gtatatggaa tagccaaaca 2580

tgaaaacctg gatagttcta tgagaaaaaa aaaaaacact gttatattat gtttttgtgg 2640

gtaaaacaaa actggatgaa gcagggacag aagtcttgct ttgaaaataa tacttgggaa 2700

catatcttaa ttacaggcaa aataaacctg gataaaaatg attataaatg gagtgggaag 2760

aagtatgtca cagattatct tccaatgcct tatttttgga tataaacata attcaaatat 2820

ttaaaaattg aaaatagaaa aaaaaataaa atcaagactg gaaacttcaa cttctaaatg 2880

tgatgaaata cctttgtaag agctcttatc ttgccaaggt tgaaaatagt tcattagtta 2940

taaaagaaat tctgactttg agcttatgaa ctaacataga cagctcagga ttaacaggga 3000

cttgtggttt gtggtctgtg ggcttatcca agcatggtga tttagactct aaggtccgtc 3060

tggatcctag catatgctac atagatgtca tgtgtgcatg caagtggtgt acttgctctt 3120

tcaccaaact cctttggatc ttttgtccta aatgtgatct tggtgaaaga ttgtcctttg 3180

agtgagtggg aactcctaag tcaaatcaac ttcttatcaa ggatttaaaa gtaaatatgc 3240

aaaggagaga agttagagaa actcctctca taagaaaaat gtcttccctg aattgagcca 3300

aaaatgttct tccctgtcca ctaatgcgtt tcttatctaa cagaagcaag aaacaaagga 3360

acagacaact tgagagttaa aagtcattgt ggtctggctt tgctaccaca tgatgagaag 3420

aaatttctga aagaagtagg ggatgagagt atcaccttca gatagcctaa cagtttcatt 3480

ttaatgataa tgagatgcaa atacctgtaa aactatgatt tagaaaataa accaatgctc 3540

tatctatatt gctagaaata ttaaaaagaa acaagcatat gctttgtta 3589

<210> 2

<211> 373

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 2

Met Glu Asp Asn Asn Met Leu Pro Gln Phe Ile His Gly Ile Leu Ser

1 5 10 15

Thr Ser His Ser Leu Phe Thr Arg Ser Ile Gln Glu Leu Asp Glu Gly

20 25 30

Ala Thr Thr Pro Tyr Asp Tyr Asp Asp Gly Glu Pro Cys His Lys Thr

35 40 45

Ser Val Lys Gln Ile Gly Ala Trp Ile Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu

50 55 60

Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Ile Ile Ile Leu

65 70 75 80

Ile Gly Cys Lys Lys Leu Lys Ser Met Thr Asp Ile Tyr Leu Leu Asn

85 90 95

Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala

100 105 110

His Tyr Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ile Met Cys Lys Val

115 120 125

Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile Phe Phe Ile

130 135 140

Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe

145 150 155 160

Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Ile Thr Ser Val Val

165 170 175

Thr Trp Val Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Ile Ile Phe Thr

180 185 190

Lys Ser Lys Gln Asp Asp His His Tyr Thr Cys Gly Pro Tyr Phe Thr

195 200 205

Gln Leu Trp Lys Asn Phe Gln Thr Ile Met Arg Asn Ile Leu Ser Leu

210 215 220

Ile Leu Pro Leu Leu Val Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly Ile Leu His

225 230 235 240

Thr Leu Phe Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg Ala Val Arg

245 250 255

Leu Ile Phe Ala Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp Thr Pro Tyr

260 265 270

Asn Ile Val Leu Phe Leu Thr Thr Phe Gln Glu Ser Leu Gly Met Ser

275 280 285

Asn Cys Val Ile Asp Lys His Leu Asp Gln Ala Met Gln Val Thr Glu

290 295 300

Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Val Ile Tyr Ala Phe

305 310 315 320

Val Gly Glu Lys Phe Arg Arg Tyr Leu Ser Ile Phe Phe Arg Lys His

325 330 335

Ile Ala Lys Arg Leu Cys Lys Gln Cys Pro Val Phe Tyr Arg Glu Thr

340 345 350

Ala Asp Arg Val Ser Ser Thr Phe Thr Pro Ser Thr Gly Glu Gln Glu

355 360 365

Val Ser Val Gly Leu

370

<210> 3

<211> 2689

<212> DNA/RNA

<213> 人(human)

<400> 3

tttattctct ggaacatgaa acattctgtt gtgctcatat catgcaaatt atcactagta 60

ggagagcaga gagtggaaat gttccaggta taaagaccca caagataaag aagctcagag 120

tcgttagaaa caggagcaga tgtacagggt ttgcctgact cacactcaag gttgcataag 180

caagatttca aaattaatcc tattctggag acctcaaccc aatgtacaat gttcctgact 240

ggaaaagaag aactatattt ttctgatttt ttttttcaaa tctttaccat tagttgccct 300

gtatctccgc cttcactttc tgcaggaaac tttatttcct acttctgcat gccaagtttc 360

tacctctaga tctgtttggt tcagttgctg agaagcctga cataccagga ctgcctgaga 420

caagccacaa gctgaacaga gaaagtggat tgaacaagga cgcatttccc cagtacatcc 480

acaacatgct gtccacatct cgttctcggt ttatcagaaa taccaacgag agcggtgaag 540

aagtcaccac cttttttgat tatgattacg gtgctccctg tcataaattt gacgtgaagc 600

aaattggggc ccaactcctg cctccgctct actcgctggt gttcatcttt ggttttgtgg 660

gcaacatgct ggtcgtcctc atcttaataa actgcaaaaa gctgaagtgc ttgactgaca 720

tttacctgct caacctggcc atctctgatc tgctttttct tattactctc ccattgtggg 780

ctcactctgc tgcaaatgag tgggtctttg ggaatgcaat gtgcaaatta ttcacagggc 840

tgtatcacat cggttatttt ggcggaatct tcttcatcat cctcctgaca atcgatagat 900

acctggctat tgtccatgct gtgtttgctt taaaagccag gacggtcacc tttggggtgg 960

tgacaagtgt gatcacctgg ttggtggctg tgtttgcttc tgtcccagga atcatcttta 1020

ctaaatgcca gaaagaagat tctgtttatg tctgtggccc ttattttcca cgaggatgga 1080

ataatttcca cacaataatg aggaacattt tggggctggt cctgccgctg ctcatcatgg 1140

tcatctgcta ctcgggaatc ctgaaaaccc tgcttcggtg tcgaaacgag aagaagaggc 1200

atagggcagt gagagtcatc ttcaccatca tgattgttta ctttctcttc tggactccct 1260

ataatattgt cattctcctg aacaccttcc aggaattctt cggcctgagt aactgtgaaa 1320

gcaccagtca actggaccaa gccacgcagg tgacagagac tcttgggatg actcactgct 1380

gcatcaatcc catcatctat gccttcgttg gggagaagtt cagaagcctt tttcacatag 1440

ctcttggctg taggattgcc ccactccaaa aaccagtgtg tggaggtcca ggagtgagac 1500

caggaaagaa tgtgaaagtg actacacaag gactcctcga tggtcgtgga aaaggaaagt 1560

caattggcag agcccctgaa gccagtcttc aggacaaaga aggagcctag agacagaaat 1620

gacagatctc tgctttggaa atcacacgtc tggcttcaca gatgtgtgat tcacagtgtg 1680

aatcttggtg tctacgttac caggcaggaa ggctgagagg agagagactc cagctgggtt 1740

ggaaaacagt attttccaaa ctaccttcca gttcctcatt tttgaataca ggcatagagt 1800

tcagactttt tttaaatagt aaaaataaaa ttaaagctga aaactgcaac ttgtaaatgt 1860

ggtaaagagt tagtttgagt tactatcatg tcaaacgtga aaatgctgta ttagtcacag 1920

agataattct agctttgagc ttaagaattt tgagcaggtg gtatgtttgg gagactgctg 1980

agtcaaccca atagttgttg attggcagga gttggaagtg tgtgatctgt gggcacatta 2040

gcctatgtgc atgcagcatc taagtaatga tgtcgtttga atcacagtat acgctccatc 2100

gctgtcatct cagctggatc tccattctct caggcttgct gccaaaagcc ttttgtgttt 2160

tgttttgtat cattatgaag tcatgcgttt aatcacattc gagtgtttca gtgcttcgca 2220

gatgtccttg atgctcatat tgttccctat tttgccagtg ggaactccta aatcaagttg 2280

gcttctaatc aaagctttta aaccctattg gtaaagaatg gaaggtggag aagctccctg 2340

aagtaagcaa agactttcct cttagtcgag ccaagttaag aatgttctta tgttgcccag 2400

tgtgtttctg atctgatgca agcaagaaac actgggcttc tagaaccagg caacttggga 2460

actagactcc caagctggac tatggctcta ctttcaggcc acatggctaa agaaggtttc 2520

agaaagaagt ggggacagag cagaactttc accttcatat atttgtatga tcctaatgaa 2580

tgcataaaat gttaagttga tggtgatgaa atgtaaatac tgtttttaac aactatgatt 2640

tggaaaataa atcaatgcta taactatgtt gaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2689

<210> 4

<211> 374

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 4

Met Leu Ser Thr Ser Arg Ser Arg Phe Ile Arg Asn Thr Asn Glu Ser

1 5 10 15

Gly Glu Glu Val Thr Thr Phe Phe Asp Tyr Asp Tyr Gly Ala Pro Cys

20 25 30

His Lys Phe Asp Val Lys Gln Ile Gly Ala Gln Leu Leu Pro Pro Leu

35 40 45

Tyr Ser Leu Val Phe Ile Phe Gly Phe Val Gly Asn Met Leu Val Val

50 55 60

Leu Ile Leu Ile Asn Cys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Thr Asp Ile Tyr

65 70 75 80

Leu Leu Asn Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Leu Ile Thr Leu Pro

85 90 95

Leu Trp Ala His Ser Ala Ala Asn Glu Trp Val Phe Gly Asn Ala Met

100 105 110

Cys Lys Leu Phe Thr Gly Leu Tyr His Ile Gly Tyr Phe Gly Gly Ile

115 120 125

Phe Phe Ile Ile Leu Leu Thr Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His

130 135 140

Ala Val Phe Ala Leu Lys Ala Arg Thr Val Thr Phe Gly Val Val Thr

145 150 155 160

Ser Val Ile Thr Trp Leu Val Ala Val Phe Ala Ser Val Pro Gly Ile

165 170 175

Ile Phe Thr Lys Cys Gln Lys Glu Asp Ser Val Tyr Val Cys Gly Pro

180 185 190

Tyr Phe Pro Arg Gly Trp Asn Asn Phe His Thr Ile Met Arg Asn Ile

195 200 205

Leu Gly Leu Val Leu Pro Leu Leu Ile Met Val Ile Cys Tyr Ser Gly

210 215 220

Ile Leu Lys Thr Leu Leu Arg Cys Arg Asn Glu Lys Lys Arg His Arg

225 230 235 240

Ala Val Arg Val Ile Phe Thr Ile Met Ile Val Tyr Phe Leu Phe Trp

245 250 255

Thr Pro Tyr Asn Ile Val Ile Leu Leu Asn Thr Phe Gln Glu Phe Phe

260 265 270

Gly Leu Ser Asn Cys Glu Ser Thr Ser Gln Leu Asp Gln Ala Thr Gln

275 280 285

Val Thr Glu Thr Leu Gly Met Thr His Cys Cys Ile Asn Pro Ile Ile

290 295 300

Tyr Ala Phe Val Gly Glu Lys Phe Arg Ser Leu Phe His Ile Ala Leu

305 310 315 320

Gly Cys Arg Ile Ala Pro Leu Gln Lys Pro Val Cys Gly Gly Pro Gly

325 330 335

Val Arg Pro Gly Lys Asn Val Lys Val Thr Thr Gln Gly Leu Leu Asp

340 345 350

Gly Arg Gly Lys Gly Lys Ser Ile Gly Arg Ala Pro Glu Ala Ser Leu

355 360 365

Gln Asp Lys Glu Gly Ala

370

<210> 5

<211> 2382

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaccacagaa tcaaaggaaa tgctgtccac atctcgttct cggtttatca gaaataccaa 60

cgagagcggt gaagaagtca ccaccttttt tgattatgat tacggtgctc cctgtcataa 120

atttgacgtg aagcaaattg gggcccaact cctgcctccg ctctactcgc tggtgttcat 180

ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcgt cctcatctta ataaactgca aaaagctgaa 240

gtgcttgact gacatttacc tgctcaacct ggccatctct gatctgcttt ttcttattac 300

tctcccattg tgggctcact ctgctgcaaa tgagtgggtc tttgggaatg caatgtgcaa 360

attattcaca gggctgtatc acatcggtta ttttggcgga atcttcttca tcatcctcct 420

gacaatcgat agatacctgg ctattgtcca tgctgtgttt gctttaaaag ccaggacggt 480

cacctttggg gtggtgacaa gtgtgatcac ctggttggtg gctgtgtttg cttctgtccc 540

aggaatcatc tttactaaat gccagaaaga agattctgtt tatgtctgtg gcccttattt 600

tccacgagga tggaataatt tccacacaat aatgaggaac attttggggc tggtcctgcc 660

gctgctcatc atggtcatct gctactcggg aatcctgaaa accctgcttc ggtgtcgaaa 720

cgagaagaag aggcataggg cagtgagagt catcttcacc atcatgattg tttactttct 780

cttctggact ccctataata ttgtcattct cctgaacacc ttccaggaat tcttcggcct 840

gagtaactgt gaaagcacca gtcaactgga ccaagccacg caggtgacag agactcttgg 900

gatgactcac tgctgcatca atcccatcat ctatgccttc gttggggaga agttcagaag 960

gtatctctcg gtgttcttcc gaaagcacat caccaagcgc ttctgcaaac aatgtccagt 1020

tttctacagg gagacagtgg atggagtgac ttcaacaaac acgccttcca ctggggagca 1080

ggaagtctcg gctggtttat aaaacgagga gcagtttgat tgttgtttat aaagggagat 1140

aacaatctgt atataacaac aaacttcaag ggtttgttga acaatagaaa cctgtaaagc 1200

aggtgcccag gaacctcagg gctgtgtgta ctaatacaga ctatgtcacc caatgcatat 1260

ccaacatgtg ctcagggaat aatccagaaa aactgtgggt agagactttg actctccaga 1320

aagctcatct cagctcctga aaaatgcctc attaccttgt gctaatcctc tttttctagt 1380

cttcataatt tcttcactca atctctgatt ctgtcaatgt cttgaaatca agggccagct 1440

ggaggtgaag aagagaatgt gacaggcaca gatgaatggg agtgagggat agtggggtca 1500

gggctgagag gagaaggagg gagacatgag catggctgag cctggacaaa gacaaaggtg 1560

agcaaagggc tcacgcattc agccaggaga tgatactggt ccttagcccc atctgccacg 1620

tgtatttaac cttgaagggt tcaccaggtc agggagagtt tgggaactgc aataacctgg 1680

gagttttggt ggagtccgat gattctcttt tgcataagtg catgacatat ttttgcttta 1740

ttacagttta tctatggcac ccatgcacct tacatttgaa atctatgaaa tatcatgctc 1800

cattgttcag atgcttctta ggccacatcc ccctgtctaa aaattcagaa aatttttgtt 1860

tataaaagat gcattatcta tgatatgcta atatatgtat atgcaatata tataggctct 1920

tgcttgatct ctccaggagg tagtgattat gagaaggggg tggagaatga tgagttcctt 1980

caccaggagc aaaggacggg gatcgtgtgg aaccactgca gaactatttc cgaaatcaac 2040

taagtggaga gagccaggaa ggctgcatca gaacccagta aagcttcttg tctggatctg 2100

agctggtttg ttttgtgctt gcttttccct gccttgccac tcccctcact cttctctttt 2160

ccccacagcc tttttcacat agctcttggc tgtaggattg ccccactcca aaaaccagtg 2220

tgtggaggtc caggagtgag accaggaaag aatgtgaaag tgactacaca aggactcctc 2280

gatggtcgtg gaaaaggaaa gtcaattggc agagcccctg aagccagtct tcaggacaaa 2340

gaaggagcct agagtaagtg acagtttgcc tttttttaag ca 2382

<210> 6

<211> 2333

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atgctgtcca catctcgttc tcggtttatc agaaatacca acgagagcgg tgaagaagtc 60

accacctttt ttgattatga ttacggtgct ccctgtcata aatttgacgt gaagcaaatt 120

ggggcccaac tcctgcctcc gctctactcg ctggtgttca tctttggttt tgtgggcaac 180

atgctggtcg tcctcatctt aataaactgc aaaaagctga agtgcttgac tgacatttac 240

ctgctcaacc tggccatctc tgatctgctt tttcttatta ctctcccatt gtgggctcac 300

tctgctgcaa atgagtgggt ctttgggaat gcaatgtgca aattattcac agggctgtat 360

cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg 420

gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca 480

agtgtgatca cctggttggt ggctgtgttt gcttctgtcc caggaatcat ctttactaaa 540

tgccagaaag aagattctgt ttatgtctgt ggcccttatt ttccacgagg atggaataat 600

ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc 660

tgctactcgg gaatcctgaa aaccctgctt cggtgtcgaa acgagaagaa gaggcatagg 720

gcagtgagag tcatcttcac catcatgatt gtttactttc tcttctggac tccctataat 780

attgtcattc tcctgaacac cttccaggaa ttcttcggcc tgagtaactg tgaaagcacc 840

agtcaactgg accaagccac gcaggtgaca gagactcttg ggatgactca ctgctgcatc 900

aatcccatca tctatgcctt cgttggggag aagttcagaa ggtatctctc ggtgttcttc 960

cgaaagcaca tcaccaagcg cttctgcaaa caatgtccag ttttctacag ggagacagtg 1020

gatggagtga cttcaacaaa cacgccttcc actggggagc aggaagtctc ggctggttta 1080

taaaacgagg agcagtttga ttgttgttta taaagggaga taacaatctg tatataacaa 1140

caaacttcaa gggtttgttg aacaatagaa acctgtaaag caggtgccca ggaacctcag 1200

ggctgtgtgt actaatacag actatgtcac ccaatgcata tccaacatgt gctcagggaa 1260

taatccagaa aaactgtggg tagagacttt gactctccag aaagctcatc tcagctcctg 1320

aaaaatgcct cattaccttg tgctaatcct ctttttctag tcttcataat ttcttcactc 1380

aatctctgat tctgtcaatg tcttgaaatc aagggccagc tggaggtgaa gaagagaatg 1440

tgacaggcac agatgaatgg gagtgaggga tagtggggtc agggctgaga ggagaaggag 1500

ggagacatga gcatggctga gcctggacaa agacaaaggt gagcaaaggg ctcacgcatt 1560

cagccaggag atgatactgg tccttagccc catctgccac gtgtatttaa ccttgaaggg 1620

ttcaccaggt cagggagagt ttgggaactg caataacctg ggagttttgg tggagtccga 1680

tgattctctt ttgcataagt gcatgacata tttttgcttt attacagttt atctatggca 1740

cccatgcacc ttacatttga aatctatgaa atatcatgct ccattgttca gatgcttctt 1800

aggccacatc cccctgtcta aaaattcaga aaatttttgt ttataaaaga tgcattatct 1860

atgatatgct aatatatgta tatgcaatat atataggctc ttgcttgatc tctccaggag 1920

gtagtgatta tgagaagggg gtggagaatg atgagttcct tcaccaggag caaaggacgg 1980

ggatcgtgtg gaaccactgc agaactattt ccgaaatcaa ctaagtggag agagccagga 2040

aggctgcatc agaacccagt aaagcttctt gtctggatct gagctggttt gttttgtgct 2100

tgcttttccc tgccttgcca ctcccctcac tcttctcttt tccccacagc ctttttcaca 2160

tagctcttgg ctgtaggatt gccccactcc aaaaaccagt gtgtggaggt ccaggagtga 2220

gaccaggaaa gaatgtgaaa gtgactacac aaggactcct cgatggtcgt ggaaaaggaa 2280

agtcaattgg cagagcccct gaagccagtc ttcaggacaa agaaggagcc tag 2333

<210> 7

<211> 2305

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

aggaggtaga ataaatagga accattttag gtcaagagac aagaacagag taaatcacta 60

aggcataaag gaagtggtga gtttggagga aatggagaga agacagttgt gggtgtgcac 120

aggactggga atgtgagagc aggtcaacca ctgtgaagtc ccaccacatc caagtcatgt 180

ggctattggg ggtttcagga tgaggagtac atatgcactg ttaactgttg gggcagacag 240

aatgagaggg atgagctatg agtgaaggag agatcaatat gaagtggata gcagatgaga 300

caagaaacta gcagcccata gaaggcaaca aggatgaatt tgaaaagaat gtaggggtag 360

aattcctatg gcacaattct aacatagaac attcatctgt agcacatgat gagccttcac 420

ctcagatgga cctcacagca acttagggag tttctataca ggaaagcaga tgcttgactt 480

taagttaccc agctttcatg ttagaggcag gagtttttta tttttgaaat ctcattgatt 540

attttattta ttttatatgt gtgtgtctgc accagtaaat gccatgcaag ttcagctgcc 600

tgcaaagacc agaagagggc attggattca ccacatgtgc taagaattga acttgaatca 660

tctgcaaaaa cagtaggtac tcttaactgc tgaatcatct gtctagttat ctaatttgga 720

ggcaggtttt gaaactaatc ttgttggttc tgacaaacag cctttaattt tctgaagagg 780

aattatttgg aataatacta gagttttctt ataaaaatgt actggatgat aataactaag 840

atgaagttct cataatttgg tcagcaagat ggttcctgtg ttaaagtact tgccgtgaaa 900

acctagtcac ctgagttcaa atccctgtag cttatatagg agggaaagag caaattatct 960

tctgacctcc aaacacttac agcagtgtat gtgtgtaccc ctcatgtata agtcatagca 1020

gatgctagtt aaatattgac catgtagaca aattcatgat gagataccat gaaatgtgaa 1080

aaattaaact ctggtgtttc agagaaggtg ggacttgaac atagagcctt ggaaaacata 1140

agcatatagg agagtaaaaa tcctgagatc agctgatata attcagataa aaatctgaat 1200

tagaagaatt ttgaagcaag aataaaaaga aaaaaaggca aaagttggca aaagccaaat 1260

acagtgcctt gaggttttat gaagtttgca gggatatgtc acagaaatat taataagcag 1320

ccacgtaggt gtctttctag aagctaaaag caatattttt aagatttatc tgttttttta 1380

ttttgtgtaa gtatctgtgc cttaagtcac atatagttta tgtgacttaa gtgtgtgcag 1440

gtgccaatgg agttcaaaaa gtgatagatc cactaaaact ggaattacag gtggttatga 1500

gctccctgct gtgggtatag gaaatcaact tgggttctat gcaagaaaag taagtgcctt 1560

tgacccctga gccatctcta atcccttcaa aagagtttta aatgggggaa attcatgctc 1620

aatgaaaaga atttggaatg acattaaggt atttgaacat taaattaaca ttgcaacctt 1680

atcaaaagtg tgagtgagag caaggggaag atgaaagttg agagggttat tagaatgctt 1740

ttgggtacaa tgaatagatg atgaaattta taatggttta ttttctttct gaaataagaa 1800

gtcagaaagt gagccctctg tatggcttgt gtacaatgtc taggtctttt gtttataatc 1860

ccaagcataa agcctatgct acacaagttg aaataggaga aggggcctat tctcttctgt 1920

atctcttttg ttgtggaaga aactccctag aaaccttaga gcagactcta attacatctt 1980

attggtcata aacctggtca taaacctggt caccacatgc agagaagtag taaatgaaga 2040

catgtaccct ttgtagcctt acattgagaa acatgctcac caggaaatgc caaggatgtt 2100

aaggaaatgg ttgcagagtt gaaaagttgt gactcctgtt aggaataaaa gaaaagtaat 2160

gtacacaagg tatcaaagag atgactataa aggagaaacc aaagatgggg atactgctta 2220

aatggcgcaa ggctatttgg attaaggaat ttggcatttg tgttacaaat aatcattttg 2280

ttctctgacc acagaatcaa aggaa 2305

<210> 8

<211> 5784

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccactgggtc agggggttat ttgttaaata aaatgctgat caatacacat gggacaggat 60

gcttattaaa ataatgtttt cctactgtgg catgcagtat gacaagcaga ctgtgggtct 120

atagattaag tgggtgatat gaaaacgggt atcactgcca tgattttcat gttgttcaga 180

ccttacagcc tagtccctgt agataggcag tgggtactga ggactcagat ataatcacat 240

aaacacaggg aaagaagagt atgtagaact ttttttgaga acccagaggt tgggggacca 300

actcaatgat ggccatatat cacaacatga acatctatag taggattttc ttgccacaga 360

acaaactgcc ttgtaggagt tgccttctgt gtatttccag aggtaagttc taaagtcatc 420

tggagaggag ctttgagtgg acagctggaa gaaagtggaa ataagtggaa aaaatggcct 480

tttgtctgta ctgtcaaagg agaggctgag tgtgtgcaga gggccctaca gctgcttgca 540

agaactccat taaaacctgc cctttcctgc ttttactcat tacttagact tctctaacaa 600

acaaaatggt tttaaatgag attatgcagc aagaatgatt acctcagtat ctctagggaa 660

ctacatcatg tgagataagg agtcttggct ttgagtgatt ctacaaggta gctcaggaat 720

atagtggaca aagaatgggc ataggtttag ggagtgacca aaagaggtta taatttgtta 780

gaagataggg acactttagc atattgtctt tgtccttgtt ctattgctgt gaagagatac 840

tatgaccatg gcaactctta taaaggaaag tacttaattg gacctagctt acagtttcag 900

aggcttagtc tattgtcata gtggcaggga gcatagcagc atgcatacat aacactgaag 960

aaatagctga aagatctata tccaaaggca gtaggaagag caagacctgg gtctggcttg 1020

ggtccttgaa acctcaaaga tcatccttag tgacacattt ccctcaataa agccacatct 1080

cataatactt tcaaattgtg gtactccctg gaaagtgcac attcgaatct atgagcctac 1140

gaggtgtcat tttcattcaa attaccacaa tctgatacct ggttcccata agcttgttac 1200

tgtaccataa tgcaaaaatg cattcagttc aacttcaaaa gtttccatag tttatcgcag 1260

tcttaatact gcttaaaagt ccaaagttca aaatcttctg agactcaagg aaatctctta 1320

actgtaactc ctgtaaaatt ggaataaaaa agcagaccac atattgccaa catacagtgg 1380

tgcagaatat acactaccat tacaaaaggg atgaacgaga gcatagtgaa gaaatgatgg 1440

acaaaagcaa aaccaaaaat cagcagggca aaccccaaac tttgcatctt tatgtctgat 1500

gtcaatgtgt tcttcagatc tccaacttct ttcagccttg ttgacttcaa catacttctc 1560

tctcttggtc ttgtttccac aacctgttag cagctctcct tggcagaaat accatgactc 1620

tgtcatttac aacatcttgg ggtcttcaac agaatccagg cttcactttc acagcttcat 1680

gtactggcct ctctgggctg ccatgcagag atacctcctg acattaatgg cttttcttag 1740

tcagggaagt agattccata acacttttct tgtatcctgg cctgtaaaac cagaaccaaa 1800

tggctaaagc tgctaaattc tacttagtaa ggctggaaac cataccccct cttgttcaat 1860

cacatttttt accagctttt tgttgttgat ttctttactg cttaagcttt tctttcattc 1920

ctttcacaag ctggaaactt agctggatgg ggtcatgtcc tgaagtcacc aattccttta 1980

ttccatatag caccaggtgt ttgtttaacc tttttatccc tttgagtact gggcttaact 2040

ccattatact ttctgatgct ctttttctcc tcaaagtata cattcttttt aatttttttc 2100

cttgtttggc ttgctccttt tcattataga gctgcataag agtgaccagt aaaatccacc 2160

ctacagagtc aatattatgc tgtcttgaaa tctcctctgc taatactatt aatctaaaac 2220

tcttcaattt agccttaggg atatttttgg gaaaaggaca taaagcagcc atattatttg 2280

acaaaatatt acaagaaaaa tctctaggac acttattaat attctctgaa acctttttag 2340

tcaggctgtc ataatctata ctgctcttac caccaccatc ttccacccac ctagtaatat 2400

ggcccattag accccactta aagcattcaa ctactttccc aaagtcccta aatccacatt 2460

ctgccaatgt ggattagcat taaagcagca tggttaggct tttcatagaa tactttgctc 2520

cttggtacca acttttgtct taatcactgt tctattacta tgaagagaca ccataaccat 2580

gacaatactt tcaaaggaaa gtatttattt gggatttgct tatagtttca gaggtttagt 2640

ccattatgat catggtgggg agcaaggtgg catgcaggca tagcactgaa gaagtagcta 2700

aaagttctat atctagatct acaggcagca ggaagagcaa gacactgggc ctgcttggcc 2760

ccttgaaaac ttaaagccta cccataatga cacatttcct ctaaaaaggc cacaactact 2820

ccaacaaggc gataactcct aatcctttca tatagtgcca ctccctggtg accaagcatt 2880

caaatctatg agcctatgag gagccattct tattcaaacc accatatata ttatatgtaa 2940

cattgagaag gttctggtat gatgaagtat gcagtgtgtt tgtgagtttg agtgtgtgtg 3000

tttgtgtgtg tgtgtgcctg tatatgtaaa tcaagacctg tatccttgct ggccccagca 3060

taaagtttgt tccacatcaa ctgagtaatt ttgggttcat tgacagtgac tattaaatca 3120

tttaatgtaa tctatttgaa atatgaaata attttctttc tcttgaataa agttcaattt 3180

gtccttagag tcaattgggt tatgaaaggc tatgcctaaa gcaagtatgg gttctgcctt 3240

ttctgtctca actccaccct tatccttagt cttggtttgt ggtctgcctc tagataacct 3300

cctgtacttc tcctttctag gcattggcta gccatgaaga aagaggatat ggccaggaga 3360

agaaaggcac acatgtgttt tcaataacta gtccctgcca taggcccttt tgtgttgaca 3420

aagatgccca gaaagatgaa ctctaatttt tcttccttca gaggacccag agctagtgat 3480

gatcaccatg actattagat atgcaagaat ttcttcaact gtgcttcttc caacccacca 3540

tttcttgggt gataatatta tctatctctg ttagtgggct cctcgataca actgtagact 3600

tgctgcctcc tttgataacc atgcaactta gtgaacatgc agtattgaga tacttttgtt 3660

tcttcattta tatacccagc atctatctcc catctccaat tccacccctt attcccctat 3720

tcaggtggat ggctgcccta tgaaggactg tgatataaga agtgcaacac ctccctattg 3780

tcagcctcta tttctaattt tccatcgagg tctgaaggga gggaatgaca gaagccatct 3840

atgaaaaact aaaaactacc aggtgatctt catgagatgg ttcactgtag actgtaaaac 3900

tatgatggat gaggccaaag ggaatacatt ttgggaaaga ttcctacgat taatgtgatt 3960

ttcctgttgt tactaaatac atataacaat catcaggtat tagtccatcc ttttgagcag 4020

atttctgcag atcaaccaaa ttgtaccatc ttgtagtgat gctatacaga caaataaatt 4080

atttcttttt tattagatat tttctttatt tacatttcaa atgctatccc aaaagttcac 4140

tgtaccctcc ccctaccctg ctcccctacc cacccactcc cacttcttga ccttgacatt 4200

cccctgtact ggggcatata aagtttgcaa gaccaagggg cctctcttcc caatgatagc 4260

cgactaggcc atcttctgca acatatgcag ctagagacac gagactatat atatttctta 4320

aatcttaatt atgatccttt aagaattcct gaaagtatac tagtcattct tgaacccttt 4380

atactaggag ttctgttacg gcctctgata tgaaaactgc aatgagaact ctgtcaatct 4440

tcaagtgtca tgagttaatt gcttctgaga tagaaagaag acatttacaa cttacaacac 4500

tttctaagag gttgtaaaac aaccaaaggt cataagaagg aactaatgat ttattgtagg 4560

tacaagaaca ggagataaaa tattgactgg ttttatctat acaaaacctc aatgatagct 4620

tagttatggt ctttaactct ccatgaacct gtagagctaa tgaaagataa ttgatgtcta 4680

gtctcaatgg gaacatatgt aagcattctc ttgtaaactt cttatttaat ttatgatttg 4740

aatttatatt tgaacttata gtgaactttt ctttaaaagg atgcttggga aaaccatgtg 4800

atctattcaa ttagaaaagg tataaaaaac aaggacttat cacattgcat gacactatta 4860

catcagaaca gcagggtaga ataatttaga aaataaaagg gaatttggaa attaagagaa 4920

aatttttgga aaatttttag agagaatttt tgaagaagag aatttttctg gagaaaaact 4980

tagaaataaa gattaaaatc acttttcaaa gagtttcctt ttcttcctgt gtctttcact 5040

ctcagtctga actcccatcc ctaagttcct gaggagataa aacaaaggct actttactta 5100

atcccctgcc ccccatttta caatcaagta ttgctaaaca accagagact ctgcagtttc 5160

tggtctcaga ggaaagacag gcagtccagc tacctctgca aagtaactta gacttaagac 5220

aggtaaacat tttaataata aaaagcaacc ctaatgtctg tcaaaaccaa gtcttgctcc 5280

cacagacact ttccccacag ctaccttcaa gagtgaacaa aaacaccaga gctggcctcc 5340

aacaagaggc ctcatcaaac ttgtcctctc ctaattggct acttatacag tattaggaag 5400

agttgatgag acagcacagg aatggttctg tcacttctta gtaagcctag gagaggtgtc 5460

taaccccaag tgtcagtggt ttcctctgta atggtaaagc acttaacact tttgccctga 5520

gccataggtt agagttgcca gttccagagt caccaggaga ttcttatgtg atatcctgtt 5580

atgcatagag ctgcaggtgt gatctgacca ggtgtgatga cagtggcatg ctaaaagcct 5640

taattggtag ttaaaaactg ctaccatctc caagattgcc ttagatccat gtcttagcac 5700

agcattaaat taagattcca aatacattgg aaagaattct gaactcagct aagtagttta 5760

tagcatgtcc agacatatct aatg 5784

<210> 9

<211> 91

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccagccatgg agaagaggag taagaaatcc atgtccacta tgataaggat atcgaattcc 60

gaagttccta ttctctagaa agtataggaa c 91

<210> 10

<211> 81

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ttcatcagtc aggtacataa tggtggatcc ccactgggtc agggggttat ttgttaaata 60

aaatgctgat caatacacat g 81

<210> 11

<211> 73

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atcattttgt tctctgacca cagaatcaaa ggaaatgctg tccacatctc gttctcggtt 60

tatcagaaat acc 73

<210> 12

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagagcccct gaagccagtc ttcaggacaa agaaggagcc tagagtaagt gacagtttgc 60

ctttttttaa gcagggaagg ag 82

<210> 13

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctcataattt ggtcagcaag atggtt 26

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccctgagcac atgttggata tgcat 25

<210> 15

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gccaaggatg ttaaggaaat ggttgc 26

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gaccctttaa tacagttcct c 21

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgtgacatgc aagcttcatt tggctat 27

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aacttccctt ctcttgtgaa gccca 25

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gagatgttga tagtatgccg tgg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gatactgctt aaatggcgca agg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ttaaatggcg caaggctatt tgg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttaagcagta tccccatctt tgg 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

agatggggat actgcttaaa tgg 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agtatccaag agcttgatga agg 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gcgcaaggct atttggatta agg 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atcatcgtag tcatacggtg tgg 23

<210> 27

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggggagcaag aggtctcggt tgg 23

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tctacattca ctccttccac tgg 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gggagcaaga ggtctcggtt ggg 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cactggggag caagaggtct cgg 23

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aagacagtgg ttcttacttt ggg 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cgagacctct tgctccccag tgg 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tccttccact ggggagcaag agg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gctgtctccc tatagaaaac tgg 23

<210> 35

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttaaaggat cc 132

<210> 36

<211> 1331

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

acttacagca gtgtatgtgt gtacccctca tgtataagtc atagcagatg ctagttaaat 60

attgaccatg tagacaaatt catgatgaga taccatgaaa tgtgaaaaat taaactctgg 120

tgtttcagag aaggtgggac ttgaacatag agccttggaa aacataagca tataggagag 180

taaaaatcct gagatcagct gatataattc agataaaaat ctgaattaga agaattttga 240

agcaagaata aaaagaaaaa aaggcaaaag ttggcaaaag ccaaatacag tgccttgagg 300

ttttatgaag tttgcaggga tatgtcacag aaatattaat aagcagccac gtaggtgtct 360

ttctagaagc taaaagcaat atttttaaga tttatctgtt tttttatttt gtgtaagtat 420

ctgtgcctta agtcacatat agtttatgtg acttaagtgt gtgcaggtgc caatggagtt 480

caaaaagtga tagatccact aaaactggaa ttacaggtgg ttatgagctc cctgctgtgg 540

gtataggaaa tcaacttggg ttctatgcaa gaaaagtaag tgcctttgac ccctgagcca 600

tctctaatcc cttcaaaaga gttttaaatg ggggaaattc atgctcaatg aaaagaattt 660

ggaatgacat taaggtattt gaacattaaa ttaacattgc aaccttatca aaagtgtgag 720

tgagagcaag gggaagatga aagttgagag ggttattaga atgcttttgg gtacaatgaa 780

tagatgatga aatttataat ggtttatttt ctttctgaaa taagaagtca gaaagtgagc 840

cctctgtatg gcttgtgtac aatgtctagg tcttttgttt ataatcccaa gcataaagcc 900

tatgctacac aagttgaaat aggagaaggg gcctattctc ttctgtatct cttttgttgt 960

ggaagaaact ccctagaaac cttagagcag actctaatta catcttattg gtcataaacc 1020

tggtcataaa cctggtcacc acatgcagag aagtagtaaa tgaagacatg taccctttgt 1080

agccttacat tgagaaacat gctcaccagg aaatgccaag gatgttaagg aaatggttgc 1140

agagttgaaa agttgtgact cctgttagga ataaaagaaa agtaatgtac acaaggtatc 1200

aaagagatga ctataaagga gaaaccaaag atggggatac tgcttaaatg gcgcaaggct 1260

atttggatta aggaatttgg catttgtgtt acaaataatc attttgttct ctgaccacag 1320

aatcaaagga a 1331

<210> 37

<211> 1464

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

agtaagtgac agtttgcctt tttttaagca gggaaggagg gagcagtttg tacatagcaa 60

caagcctcaa agacagtggt tcttactttg ggtcatgatc cctatgtggg ggtcaaatga 120

ccctttcaca gaggtcacta aaaccattag aaaacatagg tatttacatt ataattcata 180

acagtagcaa aattacagct atgaagtagc agcaaaaata attttattgt tgtagatcac 240

cacaacatga ggaactgtat taaagggtca caggattagg aaggtttcaa accactgctc 300

atggatatat tgaacaatag agacctttaa atcaggtgcc cagaacgtta taattatgcc 360

gtgactgaac catatctctt cttgtatata taatacatgt ttgagaaata ttttagaata 420

ataattggta aattcttcag ctttccaggg aactctatcc ctatgaggag cctctttgcc 480

ttgtggcaat attattttac caatcttcac catgtttttc cttacttata acatgaaaga 540

catggaattt aagaaaggag ggcatgaggc tgccaggact gagtgagaag gaggagatat 600

gcactgttgc tcctgagtga aaatggaaat gaaagtgagc agggctctca aatttctttc 660

tcatttggga agaaatgtct tgctctttgg ttccttctcc tatctgtgtt taattttgga 720

ggctttatca ggttgtggaa aatctagaaa ctgtaatagg ttgttggaaa cctcatttga 780

gtaccatagt ccttttatac ataattgcac aacacatttt tgctttgtta ttttttttta 840

tctttgacaa catggacaat ttttttcaat atcacactcc actgttgata tgtttctcaa 900

gccacagttc cttacatgat atttataaaa ttattgttta taaaatatgc attattagtg 960

attagactaa aaataataag ggctcttgtt tgatctttcc ttctgctttc cagggagagc 1020

agaaggctaa aagtagtgaa tgaccaagaa taaggagaaa agccaactcc ttcatcaggc 1080

acagagagct gcagcaaaaa ggcagagatc tgtgggacag aggaagtggt gtgcttagaa 1140

ctacatagaa tcagaagcaa aatggatgcc ttagcactga ggaaaggttt ctgtcaggtt 1200

ataaactggt tttatattat tgctgctatt ttctgcctcc tcagtacctt tgcaactgcc 1260

tctttcctca tagcatttat ctctcaacct cttcctggga aaggtgtata tggaatagcc 1320

aaacatgaaa acctggatag ttctatgaga aaaaaaaaaa acactgttat attatgtttt 1380

tgtgggtaaa acaaaactgg atgaagcagg gacagaagtc ttgctttgaa aataatactt 1440

gggaacatat cttaattaca ggca 1464

<210> 38

<211> 3592

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tgccatcata aaggagccat acctgtaaat gccatgcaag ttcagctgcc tgcaaagacc 60

agaagagggc attggattca ccacatgtgc taagaattga acttgaatca tctgcaaaaa 120

caaatcaaag gaaatgctgt ccacatctcg ttctcggttt atcagaaata ccaacgagag 180

cggtgaagaa gtcaccacct tttttgatta tgattacggt gctccctgtc ataaatttga 240

cgtgaagcaa attggggccc aactcctgcc tccgctctac tcgctggtgt tcatctttgg 300

ttttgtgggc aacatgctgg tcgtcctcat cttaataaac tgcaaaaagc tgaagtgctt 360

gactgacatt tacctgctca acctggccat ctctgatctg ctttttctta ttactctccc 420

attgtgggct cactctgctg caaatgagtg ggtctttggg aatgcaatgt gcaaattatt 480

cacagggctg tatcacatcg gttattttgg cggaatcttc ttcatcatcc tcctgacaat 540

cgatagatac ctggctattg tccatgctgt gtttgcttta aaagccagga cggtcacctt 600

tggggtggtg acaagtgtga tcacctggtt ggtggctgtg tttgcttctg tcccaggaat 660

catctttact aaatgccaga aagaagattc tgtttatgtc tgtggccctt attttccacg 720

aggatggaat aatttccaca caataatgag gaacattttg gggctggtcc tgccgctgct 780

catcatggtc atctgctact cgggaatcct gaaaaccctg cttcggtgtc gaaacgagaa 840

gaagaggcat agggcagtga gagtcatctt caccatcatg attgtttact ttctcttctg 900

gactccctat aatattgtca ttctcctgaa caccttccag gaattcttcg gcctgagtaa 960

ctgtgaaagc accagtcaac tggaccaagc cacgcaggtg acagagactc ttgggatgac 1020

tcactgctgc atcaatccca tcatctatgc cttcgttggg gagaagttca gaagcctttt 1080

tcacatagct cttggctgta ggattgcccc actccaaaaa ccagtgtgtg gaggtccagg 1140

agtgagacca ggaaagaatg tgaaagtgac tacacaagga ctcctcgatg gtcgtggaaa 1200

aggaaagtca attggcagag cccctgaagc cagtcttcag gacaaagaag gagcctagag 1260

taagtgacag tttgcctttt tttaagcagg gaaggaggga gcagtttgta catagcaaca 1320

agcctcaaag acagtggttc ttactttggg tcatgatccc tatgtggggg tcaaatgacc 1380

ctttcacaga ggtcactaaa accattagaa aacataggta tttacattat aattcataac 1440

agtagcaaaa ttacagctat gaagtagcag caaaaataat tttattgttg tagatcacca 1500

caacatgagg aactgtatta aagggtcaca ggattaggaa ggtttcaaac cactgctcat 1560

ggatatattg aacaatagag acctttaaat caggtgccca gaacgttata attatgccgt 1620

gactgaacca tatctcttct tgtatatata atacatgttt gagaaatatt ttagaataat 1680

aattggtaaa ttcttcagct ttccagggaa ctctatccct atgaggagcc tctttgcctt 1740

gtggcaatat tattttacca atcttcacca tgtttttcct tacttataac atgaaagaca 1800

tggaatttaa gaaaggaggg catgaggctg ccaggactga gtgagaagga ggagatatgc 1860

actgttgctc ctgagtgaaa atggaaatga aagtgagcag ggctctcaaa tttctttctc 1920

atttgggaag aaatgtcttg ctctttggtt ccttctccta tctgtgttta attttggagg 1980

ctttatcagg ttgtggaaaa tctagaaact gtaataggtt gttggaaacc tcatttgagt 2040

accatagtcc ttttatacat aattgcacaa cacatttttg ctttgttatt tttttttatc 2100

tttgacaaca tggacaattt ttttcaatat cacactccac tgttgatatg tttctcaagc 2160

cacagttcct tacatgatat ttataaaatt attgtttata aaatatgcat tattagtgat 2220

tagactaaaa ataataaggg ctcttgtttg atctttcctt ctgctttcca gggagagcag 2280

aaggctaaaa gtagtgaatg accaagaata aggagaaaag ccaactcctt catcaggcac 2340

agagagctgc agcaaaaagg cagagatctg tgggacagag gaagtggtgt gcttagaact 2400

acatagaatc agaagcaaaa tggatgcctt agcactgagg aaaggtttct gtcaggttat 2460

aaactggttt tatattattg ctgctatttt ctgcctcctc agtacctttg caactgcctc 2520

tttcctcata gcatttatct ctcaacctct tcctgggaaa ggtgtatatg gaatagccaa 2580

acatgaaaac ctggatagtt ctatgagaaa aaaaaaaaac actgttatat tatgtttttg 2640

tgggtaaaac aaaactggat gaagcaggga cagaagtctt gctttgaaaa taatacttgg 2700

gaacatatct taattacagg caaaataaac ctggataaaa atgattataa atggagtggg 2760

aagaagtatg tcacagatta tcttccaatg ccttattttt ggatataaac ataattcaaa 2820

tatttaaaaa ttgaaaatag aaaaaaaaat aaaatcaaga ctggaaactt caacttctaa 2880

atgtgatgaa atacctttgt aagagctctt atcttgccaa ggttgaaaat agttcattag 2940

ttataaaaga aattctgact ttgagcttat gaactaacat agacagctca ggattaacag 3000

ggacttgtgg tttgtggtct gtgggcttat ccaagcatgg tgatttagac tctaaggtcc 3060

gtctggatcc tagcatatgc tacatagatg tcatgtgtgc atgcaagtgg tgtacttgct 3120

ctttcaccaa actcctttgg atcttttgtc ctaaatgtga tcttggtgaa agattgtcct 3180

ttgagtgagt gggaactcct aagtcaaatc aacttcttat caaggattta aaagtaaata 3240

tgcaaaggag agaagttaga gaaactcctc tcataagaaa aatgtcttcc ctgaattgag 3300

ccaaaaatgt tcttccctgt ccactaatgc gtttcttatc taacagaagc aagaaacaaa 3360

ggaacagaca acttgagagt taaaagtcat tgtggtctgg ctttgctacc acatgatgag 3420

aagaaatttc tgaaagaagt aggggatgag agtatcacct tcagatagcc taacagtttc 3480

attttaatga taatgagatg caaatacctg taaaactatg atttagaaaa taaaccaatg 3540

ctctatctat attgctagaa atattaaaaa gaaacaagca tatgctttgt ta 3592

<210> 39

<211> 1125

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atgctgtcca catctcgttc tcggtttatc agaaatacca acgagagcgg tgaagaagtc 60

accacctttt ttgattatga ttacggtgct ccctgtcata aatttgacgt gaagcaaatt 120

ggggcccaac tcctgcctcc gctctactcg ctggtgttca tctttggttt tgtgggcaac 180

atgctggtcg tcctcatctt aataaactgc aaaaagctga agtgcttgac tgacatttac 240

ctgctcaacc tggccatctc tgatctgctt tttcttatta ctctcccatt gtgggctcac 300

tctgctgcaa atgagtgggt ctttgggaat gcaatgtgca aattattcac agggctgtat 360

cacatcggtt attttggcgg aatcttcttc atcatcctcc tgacaatcga tagatacctg 420

gctattgtcc atgctgtgtt tgctttaaaa gccaggacgg tcacctttgg ggtggtgaca 480

agtgtgatca cctggttggt ggctgtgttt gcttctgtcc caggaatcat ctttactaaa 540

tgccagaaag aagattctgt ttatgtctgt ggcccttatt ttccacgagg atggaataat 600

ttccacacaa taatgaggaa cattttgggg ctggtcctgc cgctgctcat catggtcatc 660

tgctactcgg gaatcctgaa aaccctgctt cggtgtcgaa acgagaagaa gaggcatagg 720

gcagtgagag tcatcttcac catcatgatt gtttactttc tcttctggac tccctataat 780

attgtcattc tcctgaacac cttccaggaa ttcttcggcc tgagtaactg tgaaagcacc 840

agtcaactgg accaagccac gcaggtgaca gagactcttg ggatgactca ctgctgcatc 900

aatcccatca tctatgcctt cgttggggag aagttcagaa gcctttttca catagctctt 960

ggctgtagga ttgccccact ccaaaaacca gtgtgtggag gtccaggagt gagaccagga 1020

aagaatgtga aagtgactac acaaggactc ctcgatggtc gtggaaaagg aaagtcaatt 1080

ggcagagccc ctgaagccag tcttcaggac aaagaaggag cctag 1125

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ctctcggtgt tcttccgaaa gcaca 25

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

taagagctct tacaaaggta tttc 24

<210> 42

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tgtgacatgc aagcttcatt tggctat 27

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

aacttccctt ctcttgtgaa gccca 25

<210> 44

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tacctggcta ttgtccatgc tgtgt 25

<210> 45

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

tggtccagtt gactggtgct ttcac 25

<210> 46

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

gccaaggatg ttaaggaaat ggttgc 26

<210> 47

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

ggagtagagt ggaggcagga tccaa 25

<210> 48

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

gaccctttaa tacagttcct catg 24

Claims

1.一种CCR2基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CCR2蛋白。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCR2蛋白包含人CCR2蛋白的全部或部分，所述的人CCR2蛋白的部分包含胞外区的全部或部分；优选的，所述的人CCR2蛋白的部分包含胞外区、信号肽、跨膜区和胞质区的全部或部分。

3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCR2蛋白选自下列组中的一种：

4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人CCR2基因的部分；优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子的全部或部分、第3号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述人CCR2基因的部分还包括第2-3号内含子，其中，所述第2号外显子的部分为第2号外显子上起始密码子开始至最后一个核苷酸，所述第3号外显子的部分为第3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

5.根据权利要求1-4任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人CCR2基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：

a)为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的全部或部分；

6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CCR2基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：

7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人或人源化CCR2基因可操作的连接到内源调控元件。

8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将人CCR2基因的部分核苷酸序列插入到非人动物基因座或替换非人动物CCR2基因的全部或部分核苷酸序列获得；优选的，将人CCR2基因的第2号外显子的全部或部分和第3号外显子的全部或部分插入或替换至非人动物CCR2基因座，其中，所述第2号外显子的部分为第2号外显子上起始密码子开始至最后一个核苷酸，所述第3号外显子的部分为第3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

9.根据权利要求1-8任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将编码人CCR2蛋白的全部或部分核苷酸序列插入到非人动物基因座或替换非人动物CCR2基因的全部或部分核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体，将人CCR2基因的部分核苷酸序列插入到非人动物基因座或替换非人动物CCR2基因座；优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子的全部或部分、第3号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述人CCR2基因的部分还包括第2-3号内含子,其中，所述第2号外显子的部分为第2号外显子上起始密码子开始至最后一个核苷酸，所述第3号外显子的部分为第3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子，更优选的，所述的人CCR2基因的部分核苷酸序列包含编码人CCR2蛋白的CDS序列，所述的人CCR2基因的部分核苷酸序列包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列，

所述的靶向载体还包含5’同源臂和/或3’同源臂；

所述的5’同源臂选自CCR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’同源臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’同源臂序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：36所示；

所述的3’同源臂选自CCR2基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’同源臂与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’同源臂序列如SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：37所示。

11.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体DNA序列，所述的供体DNA序列包含人CCR2基因的部分，优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子的全部或部分、第3号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述人CCR2基因的部分还包括第2-3号内含子,其中，第2号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至第2号外显子的最后一个核苷酸，第3号外显子的部分至少包含从第3号外显子的第一个核苷酸开始至终止密码子的核苷酸序列；再进一步优选的，包含编码人CCR2蛋白的核酸序列；更进一步优选的，所述的靶向载体包含人CCR2基因的CDS序列；再进一步优选的，包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列。

12.根据权利要求11所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’同源臂和/或3’同源臂；

13.一种人源化CCR2基因，其特征在于，所述的人源化CCR2基因包含人CCR2基因的部分，优选的，所述的人CCR2基因的部分包含第2号外显子的全部或部分、第3号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述人CCR2基因的部分还包括第2-3号内含子，其中，所述第2号外显子的部分为第2号外显子上起始密码子开始至最后一个核苷酸，所述第3号外显子的部分为第3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

14.根据权利要求13所述的人源化CCR2基因，其特征在于，所述的人CCR2基因的部分核苷酸序列选自下列组中的一种：

a)为SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的全部或部分；

15.根据权利要求13所述的人源化CCR2基因，其特征在于，所述的人源化CCR2基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：

16.一种多基因修饰的非人动物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

i)采用权利要求1-10任一所述的构建方法获得的非人动物；

17.根据权利要求16所述的构建方法，其特征在于，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因CD137、LAG-3、CTLA-4、TIM-3、BTLA、4-1BB、CD27、CD28、CD47、TIGIT、GITR、OX40、PD-1或PD-L1人源化的非人动物。

18.一种包含CCR2基因人源化改造的细胞、组织或者器官，所述的细胞、组织或者器官包含权利要求13-15任一所述的人源化CCR2基因。

19.根据权利要求1-10、16-17任一所述的构建方法或方法，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

20.来源于权利要求1-10任一所述的构建方法构建的非人动物、权利要求16-17任一所述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、权利要求13-15任一所述的人源化CCR2基因或者权利要求18所述的细胞、组织或者器官在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究CCR2功能、人CCR2信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。