CN108531487B - 人源化sirpa基因改造动物模型的制备方法及应用 - Google Patents

人源化sirpa基因改造动物模型的制备方法及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108531487B
CN108531487B CN201810296193.8A CN201810296193A CN108531487B CN 108531487 B CN108531487 B CN 108531487B CN 201810296193 A CN201810296193 A CN 201810296193A CN 108531487 B CN108531487 B CN 108531487B
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
sequence
humanized
sirpa
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810296193.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108531487A (zh
Inventor
沈月雷
白阳
张美玲
黄蕤
尚诚彰
郭雅南
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baccetus (Beijing) Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.
BIOCYTOGEN JIANGSU GENE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.
Original Assignee
Jiangsu Gene Biotechnology Co Ltd
Beijing Biocytogen Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu Gene Biotechnology Co Ltd, Beijing Biocytogen Co Ltd filed Critical Jiangsu Gene Biotechnology Co Ltd
Priority to PCT/CN2018/081629 priority Critical patent/WO2018177441A1/en
Publication of CN108531487A publication Critical patent/CN108531487A/zh
Priority to US16/436,545 priority patent/US10973212B2/en
Application granted granted Critical
Publication of CN108531487B publication Critical patent/CN108531487B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety

Abstract

本发明公开了一种能够特异的靶向Sirpa基因的sgRNA、靶向载体、SIRPA基因人源化动物模型。本发明还公开了一种制备人源化动物模型的sgRNA载体的方法、一种人源化动物模型的制备方法以及相关应用。本发明还涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化SIRPA基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Description

人源化SIRPA基因改造动物模型的制备方法及应用
技术领域
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化SIRPA基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
免疫疗法通过激活免疫系统攻击并杀死癌细胞，是近年来肿瘤研究的一个重要领域。目前和肿瘤免疫治疗相关的一些药物已经用于治疗，已有药品上市并应用在多个适应症，如靶向T细胞共刺激分子CTLA-4、PD-1及其配体的单克隆抗体已经取得确切疗效，但病人的平均应答率较低，临床实践已经证明，单一的免疫治疗策略治疗效果有限，在临床中一般需要结合两种或多种免疫治疗手段进行。开发更多可以用于提高免疫系统对肿瘤识别及杀伤能力的药物一直是免疫学研究的热点之一。
SIRPα(Signal regulatory proteinα)是SIRP家族中的一个典型的抑制性免疫受体，其可以选择性地表达于髓系细胞和神经细胞膜表面，在T、B、NK和NKT细胞中则表达较少。作为一种跨膜蛋白，其胞质区在大鼠、小鼠和人中高度保守，包含多个酪氨酸残基，可构成免疫受体酪氨酸抑制基序(immunoreceptor tyrosine inhibitory motif，ITIM)。ITIM的磷酸化，可招募含SH2结构域的酪氨酸磷酸酶SHP1和SHP2(Oshima,K.et.al.2002；Cant，C.A.et.al.2001)，进而启动下游的信号传导，实现细胞功能的负调节。在胞外区总共存在三种免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，分别为一个类IgV结构域和两个类IgC结构域，其中两个类IgC结构域有可能通过选择性剪切而被移除(Liu,Y.et al.2007)。N末端的IgV可以与SIRPα的配体CD47相互作用介导信号传导。CD47是一种广泛表达的类Ig膜蛋白，可与多种细胞表面受体相互作用。CD47可诱导SIRPα的ITIM磷酸化，启动信号级联放大反应，抑制巨噬细胞的吞噬作用(Matozaki,T.et al.2009；Ke Zen,et al.2013)。CD47-SIRPα的相互作用在巨噬细胞的吞噬、免疫系统的调节等活动中发挥着重要作用。
已有研究证明SIRPα在多种免疫过程中起重要作用，在感染、肿瘤和自身免疫/炎性疾病治疗领域具有巨大应用价值。CD47在肿瘤组织中具有较高的表达量，通过阻断CD47与SIRPα之间的相互作用可促进巨噬细胞的吞噬功能。CD47-SIRPα通路中CD47将信号传递给靶细胞后，使巨噬细胞中的SIRPα招募SHP-1形成复合体，介导SHP-1依赖的抑制性信号，进而影响吞噬作用(Ishikawa S,T.et al.2006；Blazar,B.R.et al.2001)。目前的研究表明，对于SIRPα在免疫过程中的调节功能是双向的，SIRPα可通过抑制MAPK、IKK、NF-κ、IRF3的激活，减少炎症因子和IFNβ的释放发挥负向调节功能。激活CD47-SIRPα通路可以抑制树突细胞成熟及其活性，还可使成熟的树突细胞减少炎性因子的产生。SIRPα还可在树突细胞表面大量表达，提升其抗原提呈能力，发挥一定的正向调节作用(Hagnerud,S.etal.2006)。除此之外，SIRPα突变小鼠体内的胰岛素分泌水平较对照小鼠相比明显减少，可以推测SIRPα的缺失可能会导致糖尿病的发生(Kobayashi,M.et al.2008)。
目前尚未有针对SIRPα靶点的药物上市，但已有研究表明SIRPα抗体(如MY-1)在小鼠体内具备良好的肿瘤抑制作用。SIRPα抗体不仅可以破坏SIRPα-CD47的结合来影响巨噬细胞的吞噬作用，而且经过MY-1的培养，可使NK细胞和T细胞数量增多，调节免疫反应(Tadahiko Yet al,2017)。可以预计，随着研究的不断深入，未来会有更多的机构和生物医药企业参与到针对SIRPα靶点的药物研发中来。
已知实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源基因已经实现，通过这种方式开发的基因人源化动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的重要发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因序列替换动物基因组的同源基因序列，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升异种细胞或组织移植生长的效率，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达部分或全部人源蛋白，可作为识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
目前已有的与SIRPA基因相关的动物模型主要是Sirpa基因敲除小鼠，主要应用于Sirpa基因的生物学功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制的研究(Yamao.et.al.2002)。研究发现，Sirpa-/-突变小鼠可正常发育，较野生型相比血小板减少，体内循环血小板的寿命也有所减少。另外，其腹膜巨噬细胞(peritoneal macrophages，PEMs)的吞噬活性明显比野生型小鼠更强，这也进一步证明了SIRPα负向调节巨噬细胞的吞噬作用。SIRPα存在明显的多态性，并且IgV的多态性决定了其与CD47的亲和性，在不同的小鼠品系中，SIRPα和hCD47的结合力也有所差异，其中NOD小鼠中SIRPα与hCD47的结合能力最强，BALB/c小鼠中的结合能力次之，在C57BL/6小鼠中的结合能力较差甚至不能结合。因此，根据不同的研究目的，应选择合适的小鼠开展相关研究。
鉴于SIRPA基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了进一步的研究SIRPA相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性和研发成功率，本发明在世界范围内提供一种建立SIRPA基因人源化改造动物模型的新方法，并得到SIRPA基因人源化动物。具体来说，本发明的目的是制备一种非人动物模型，该动物体内可正常表达SIRPα蛋白，且表达的SIRPα蛋白能被识别并结合抗人SIRPα的抗体。该方法在药物筛选、有效性验证等方面有着广阔的应用前景。此外，本方法得到的非人动物还可与其它免疫检查点人源化非人动物，如CD47、PD-1等基因人源化小鼠交配得到SIRPA和CD47、PD-1等双基因或多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对多个信号通路的人用药及联合用药的药效研究。
发明内容
为了解决上述问题，本申请发明人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物Sirpa基因的特定片段被人SIRPA基因特定片段替换，本申请发明人成果得到世界首例SIRPA基因人源化小鼠。成功制备SIRPA基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达SIRPA蛋白，可用于SIRPA基因功能研究、人源SIRPA抗体的筛选和评价。
利用本发明制备的动物模型可用于针对人SIRPA靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究SIRPA蛋白的功能和肿瘤药物筛选提供了有力工具。
同时还得到基因敲除动物模型。以及利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化PD-1、CD47抗体动物模型)交配或直接进行基因编辑/修饰得到双人源动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。
本发明涉及Sirpα基因，全称为signal-regulatory protein alpha，其中sirpalpha＝Sirpa，其中signal-regulatory protein alpha基因在动物中表示为Sirpa，在人基因组中表示为SIRPA或SIRPa，动物蛋白表示为SIRPa蛋白。
本发明的第一方面，涉及一种人源化动物模型构建的方法，所述动物模型基因组中含有人SIRPA基因，所述人SIRPA基因在动物细胞中表达并且促进该细胞产生人或人源化SIRPα蛋白。优选的，所述人SIRPA基因受动物内源性调控元件调控。进一步优选的，所述调控元件为动物内源启动子。
优选的，所述人源化动物模型基因组中包含人源化SIRPA基因，所述人源化SIRPA基因编码的多肽包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中，所述胞内参与信号传导的部分为动物来源，所述胞外区域包含人SIRPA基因编码的部分片段，同时所述人源化SIRPA基因的动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Sirpa基因启动子后；优选的，人源化SIRPA基因编码的跨膜区为动物来源。进一步优选的，所述人SIRPA基因受动物内源性调控元件调控。更进一步优选的，所述调控元件为动物内源启动子。
优选的，所述人SIRPA基因部分为编码人SIRPα蛋白的氨基酸的第3号外显子的全部或部分序列；和/或所述动物来源部分包括动物来源Sirpa基因的1号外显子全部序列、2号外显子部分序列、3号外显子及其后所有外显子的全部序列。
优选的，使用基因编辑技术进行SIRPA人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行SIRPA人源化动物的构建。
优选的，将动物来源的Sirpa的第2号外显子全部或部分序列替换为人SIRPA的第3号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向技术实现上述替换；优选的，所述sgRNA在待改变的非人动物Sirpa基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；更优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：38-47任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：48-58任一项所示。进一步优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：44和/或SEQ ID NO：54。
优选的，所述非人动物在其种系基因组中插入一段外源SIRPA基因，所述方法包括：
(a)构建含有人SIRPA基因的载体，通过基因工程方法将所述人SIRPA基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中内源的Sirpa基因缺失或使得内源的Sirpa蛋白不表达或不具有功能；并且
(b)在所述非人动物体内表达人源SIRPA蛋白。
优选的，所述人源化动物模型包含人SIRPA基因编码的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含动物来源的Sirpa基因座，用人SIRPA基因编码的胞外域序列取代动物来源的Sirpa基因编码的胞外域序列的部分或全部。
优选的，所述的人源化动物模型构建的方法，包括如下步骤：
(a)提供一种细胞，所述细胞包括靶向非人动物Sirpa基因的靶向载体以及一种或多种靶位点的序列如SEQ ID NO：38-58所示的sgRNA序列的体外转录产物，优选的所述细胞为受精卵细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
优选的，本发明所述动物为非人哺乳动物；进一步优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物；最优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
本发明的第二方面，涉及一种嵌合SIRPα蛋白，所述人源化动物模型包含嵌合SIRPα蛋白，所述嵌合SIRPα蛋白选自下列组中的一种：
a)嵌合SIRPα蛋白序列为SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26或SEQ IDNO：27或SEQ ID NO：28的部分或全部；
b)嵌合SIRPα蛋白序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26或SEQ IDNO：27或SEQ ID NO：28所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)编码嵌合SIRPα蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：25或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的蛋白的核苷酸序列杂交；
d)嵌合SIRPα的蛋白序列与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26或SEQID NO：27或SEQ ID NO：28所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)嵌合SIRPα蛋白序列具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26或SEQID NO：27或SEQ ID NO：28所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
和/或
f)嵌合SIRPα蛋白序列中人SIRPα的蛋白序列如SEQ ID NO：4或登录号为NP_001035111.1、NP_001035112.1、NP_001317657.1、XP_005260727.1、XP_006723608.1、XP_011527475.1的序列部分或全部序列所示；
g)嵌合SIRPα蛋白序列中人SIRPα的蛋白序列与SEQ ID NO：4或登录号为NP_001035111.1、NP_001035112.1、NP_001317657.1、XP_005260727.1、XP_006723608.1、XP_011527475.1的序列所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)嵌合SIRPα蛋白序列中编码人SIRPα的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO：4或登录号为NP_001035111.1、NP_001035112.1、NP_001317657.1、XP_005260727.1、XP_006723608.1、XP_011527475.1的序列所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；
i)嵌合SIRPα蛋白序列中人SIRPα的蛋白序列与SEQ ID NO：4或登录号为NP_001035111.1、NP_001035112.1、NP_001317657.1、XP_005260727.1、XP_006723608.1、XP_011527475.1的序列所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
j)嵌合SIRPα蛋白序列中人SIRPα的蛋白序列具有SEQ ID NO：4或登录号为NP_001035111.1、NP_001035112.1、NP_001317657.1、XP_005260727.1、XP_006723608.1、XP_011527475.1的序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
或
k)嵌合SIRPα蛋白序列中动物来源的sirpα蛋白序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16所示的序列部分或全部序列所示；
l)嵌合SIRPα蛋白序列中动物来源的sirpα蛋白序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16序列所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
m)嵌合SIRPα蛋白序列中编码动物sirpα蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16序列所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；
n)嵌合SIRPα蛋白序列中动物来源的sirpα蛋白序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16序列所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
o)嵌合SIRPα蛋白序列中动物来源的sirpα蛋白序列与SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
本发明的第三方面，涉及一种人源化SIRPA基因，所述人源化SIRPA基因为嵌合SIRPA基因，所述人源化动物模型包含人源化SIRPA基因，所述人源化SIRPA基因选自下列组中的一种：
a)所述基因编码权利要求10中所述嵌合SIRPα蛋白序列；
b)人源化SIRPA基因的mRNA序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24所示；
c)人源化SIRPA基因的mRNA序列在严格条件下，与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24所示的核苷酸杂交的基因序列；
d)人源化SIRPA基因的mRNA序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
e)人源化SIRPA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
f)人源化SIRPA基因的核苷酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO：5所示的核苷酸杂交的基因序列；
g)人源化SIRPA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：5所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
h)人源化SIRPA基因的核苷酸序列与SEQ ID NO：5所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
i)人源化SIRPA基因的核苷酸序列具有SEQ ID NO：5所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
或
j)人源化SIRPA基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示；
k)人源化SIRPA基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：17或SEQ IDNO：18或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示的核苷酸杂交的基因序列；
l)人源化SIRPA基因序列与SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18或SEQID NO：19或SEQ ID NO：20所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
和/或
m)人源化SIRPA基因中来自人SIRPA基因的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示的序列或登录号为NM_001040022.1、NM_001040023.1、NM_001330728.1、XM_005260670.3、XM_006723545.3、XM_011529173.2的序列的部分或全部所示；
n)人源化SIRPA基因中来自人SIRPA基因的mRNA序列与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：31所示的序列或登录号为NM_001040022.1、NM_001040023.1、NM_001330728.1、XM_005260670.3、XM_006723545.3、XM_011529173.2的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
o)人源化SIRPA基因中来自人SIRPA基因的mRNA序列与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：31或登录号为NM_001040022.1、NM_001040023.1、NM_001330728.1、XM_005260670.3、XM_006723545.3、XM_011529173.2的序列所示的核苷酸序列杂交；
p)人源化SIRPA基因中来自人SIRPA基因的mRNA序列与SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：31或登录号为NM_001040022.1、NM_001040023.1、NM_001330728.1、XM_005260670.3、XM_006723545.3、XM_011529173.2的序列所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
q)人源化SIRPA基因中来自人SIRPA基因的mRNA序列具有与SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：31或登录号为NM_001040022.1、NM_001040023.1、NM_001330728.1、XM_005260670.3、XM_006723545.3、XM_011529173.2的序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
r)人源化SIRPA基因中来自动物Sirpa基因的mRNA序列如SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示的序列的部分或全部所示；
s)人源化SIRPA基因中来自动物Sirpa基因的mRNA序列与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
t)人源化SIRPA基因中来自动物Sirpa基因的mRNA序列与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的序列所示的核苷酸序列杂交；
u)人源化SIRPA基因中来自动物Sirpa基因的mRNA序列与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
v)人源化SIRPA基因中来自动物Sirpa基因的mRNA序列与SEQ ID NO：1或SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15的序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，嵌合小鼠SIRPA的DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24。
本发明的第四方面，涉及人源化小鼠SIRPA的基因组DNA，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与上述的基因序列一致或互补。
本发明的第五方面，涉及一种表达人源化小鼠嵌合SIRPA蛋白的构建体。
本发明的第六方面，涉及一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第七方面，涉及一种包含上述细胞的组织。
本发明的第八方面，涉及所述的人源化动物模型构建的方法构建的人源化动物模型或其后代。
本发明的第九方面，涉及一种SIRPA基因人源化细胞株，使用靶向Sirpa基因的sgRNA序列或编码sgRNA的DNA分子或包含sgRNA的载体将动物的第2号外显子的部分或全部替换为人SIRPA基因制备获得。
本发明的第十方面，涉及一种Sirpa基因缺失细胞株，使用靶向Sirpa基因的sgRNA或编码sgRNA的DNA分子或包含sgRNA的载体敲除动物的第2号外显子的部分或全部制备获得。
优选的，所述动物为非人哺乳动物；进一步优选的，所述非人哺乳动物为啮齿类动物；最优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
在本发明的一个具体实施例中，小鼠Sirpa的mRNA序列的全部或部分片段如SEQID NO：1或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：15中的全部或部分片段所示；小鼠Sirpa的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：10或SEQID NO：12或SEQ ID NO：14或SEQ ID NO：16中的全部或部分片段所示。
本发明所述的人SIRPA基因的全部或部分片段的人SIRPA mRNA序列如SEQ ID NO：3；人SIRPA全部或部分片段的蛋白序列如SEQ ID NO：4中的全部或部分片段所示。或人SIRPA mRNA序列→蛋白序列为NCBI登录号为
NM_001040022.1→NP_001035111.1、NM_001040023.1→NP_001035112.1、
NM_001330728.1→NP_001317657.1、XM_005260670.3→XP_005260727.1、
XM_006723545.3→XP_006723608.1、XM_011529173.2→XP_011527475.1中的全部或部分片段所示。
在本发明的一个具体实施例中，所述动物模型基因组中包括嵌合SIRPA基因，所述嵌合SIRPA基因包括小鼠来源的Sirpa基因部分和人源的SIRPA基因部分，所述嵌合SIRPA基因mRNA序列与SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24所示的全部或部分序列具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性；或所述动物模型基因组中包括嵌合SIRPA基因，所述嵌合SIRPA基因包括动物来源的Sirpa基因部分和人源的SIRPA基因部分，所述嵌合、SIRPA基因的嵌合mRNA序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24的全部或部分所示；或所述动物模型基因组中包括嵌合SIRPA基因，所述嵌合SIRPA基因包括动物来源的Sirpa基因部分和人源的SIRPA基因部分，编码所述嵌合SIRPA基因的蛋白序列与SEQID NO：8或SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示的序列的部分或全部具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性；或所述动物模型基因组中包括嵌合SIRPA基因，所述嵌合SIRPA基因包括动物来源的Sirpa基因部分和人源的SIRPA基因部分，所述嵌合SIRPA基因的蛋白序列如SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：25或SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28的部分或全部所示。
本发明的第十一方面，涉及一种Sirpa敲除动物模型构建的方法，将动物体内的Sirpa的第2号外显子全部或部分敲除，使得内源Sirpa蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：38-47任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：48-58任一项所示；优选的，所述sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：44所示，3’端靶位点序列如SEQID NO：54所示。
本发明的第十二方面，涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Sirpa基因，同时所述sgRNA序列在待改变的非人动物Sirpa基因的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。
优选的，所述sgRNA在非人动物Sirpa基因的靶位点位于非人动物Sirpa基因的第2外显子上；优选的，所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：38-47任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：48-58任一项所示；进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：44所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ IDNO：54所示。
优选的，所述非人动物为啮齿类动物；优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
本发明的第十三方面，涉及一种编码上述所述的sgRNA的DNA分子；优选的，所述的DNA分子的DNA双链序列分别如SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61，或SEQ ID NO：63和SEQ IDNO：65所示。
本发明的第十四方面，涉及一种构建动物模型的载体，所述载体能够产生上述的sgRNA序列，用于敲除或替换Sirpa基因的第2位外显子的部分或全部。
本发明的第十五方面，涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
(1)提供一种sgRNA序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Sirpa基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Sirpa基因的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
优选的，一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：38-47所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：48-58所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：44和SEQ ID NO：54，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：60或SEQ ID NO：64所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：62或SEQ IDNO：66所示，其中SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：62为A组，SEQ ID NO：64和SEQ ID NO：66为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：67所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
本发明的第十六方面，涉及一种由上述的方法获得的sgRNA载体。
本发明的第十七方面，涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自Sirpa基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自Sirpa基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
优选的，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000068.7至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000068.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000068.7的第129607346-129608914位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段即3’臂，其选自如所示的NCBI登录号为NC_000068.7的第129609239-129610638位核苷酸。
优选的，所述的待改变的转换区位于Sirpa基因的第2号外显子。
在本发明的一个具体实施例中，所述5’臂序列如SEQ ID NO：29，所述3’臂序列如SEQ ID NO：30所示。
优选的，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。最优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
进一步优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。最优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
进一步优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。最优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
本发明所述的替换的供体DNA序列片段来自人；优选的，所述替换的供体DNA序列为人SIRPA基因的核苷酸序列部分或全部；进一步优选的，所述核苷酸序列包括人SIRPA基因DNA序列的第3号外显子的全部或部分。
优选的，所述人SIRPA基因的核苷酸序列选自NCBI登录号为NC_000020.11的第1915110-1915433位核苷酸(NC_018931.2的第1895992-1896315位核苷酸)；进一步优选的，所述人SIRPA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：31所示。
本发明的第十八方面，涉及一种细胞，所述细胞包含上述的靶向载体、一种或多种上述的sgRNA序列、一种或多种上述的载体和/或一种或多种上述的载体的体外转录产物。
本发明的第十九方面，涉及上述的靶向载体、上述的sgRNA序列、上述的载体或上述的细胞在基因修饰Sirpa基因座中的应用。
优选的，所述基因修饰Sirpa基因座包括替换或敲除Sirpa基因。
本发明的第二十方面，涉及一种Sirpa基因敲除动物模型的制备方法，包括以下步骤：
第一步：按照上述所述的步骤1-4，获得sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
第三步：将F0代动物利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Sirpa基因被敲除，获得Sirpa基因敲除阳性动物；
第四步：将第三步筛选的阳性动物通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Sirpa-/-动物；
优选的，所述动物为小鼠，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：68-71所示。
本发明的第二十一方面，涉及一种建立SIRPA基因人源化动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)提供一种细胞，所述细胞包括上述所述的靶向载体以及一种或多种靶位点的序列如SEQ ID NO：38-58所示的sgRNA序列的体外转录产物，优选的所述细胞为受精卵细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
优选的，所述非人类哺乳动物为啮齿类动物，所述啮齿类动物为小鼠。
本发明的第二十二方面，涉及一种制备多基因人源化动物模型的方法，包括以下步骤：
(a)利用上述所述方法获得动物模型；
(b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。
本发明所述的多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
本发明的第二十三方面，涉及根据上述所述的方法制备获得的多基因人源化动物模型及后代。
优选的，所述动物模型为非人类哺乳动物；进一步优选的，所述非人类哺乳动物为啮齿动物；最优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
在本发明的具体实施方式中，建立双人源化小鼠基因改造动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)利用上述所述方法获得SIRPA基因改造人源化小鼠；
(b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到双人源化小鼠模型。
优选的，所述其他人源化动物选自基因CD47、PD-1、CD27、CD28、CTLA-4、LAG-3、BTLA、PD-L1、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137或OX-40人源化动物中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(b)中，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与CD47人源化小鼠交配得到SIRPA和CD47双人源化小鼠模型。
本发明的具体实施方式中，涉及建立三基因人源化小鼠基因改造动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)利用上述所述的方法获得双人源化小鼠基因改造动物模型；
(b)将步骤(a)获得的双人源化小鼠基因改造动物模型与其他人源化小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到三基因人源化小鼠模型。
在本发明的一个具体实施例中，步骤(b)中将SIRPA和CD47双人源化小鼠模型与PD-1人源化小鼠交配得到CD47、SIRPA和PD-1三基因人源化小鼠基因改造动物模型。
本发明的第二十四方面，涉及一种可稳定传代的人源化基因工程非人类哺乳动物，所述非人类哺乳动物体内表达上述所述的嵌合SIRPA蛋白，其中所述非人类哺乳动物由上述所述的方法制备获得。
本发明的第二十五方面，涉及一种荷瘤动物模型，所述模型动物通过上述人源化动物模型构建的方法或上述制备多基因人源化动物模型的方法制备获得。优选的，所述荷瘤动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述啮齿类动物为小鼠。
本发明的第二十六方面，涉及细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于所述的人源化动物模型、所述的多基因人源化动物模型或其后代、所述的可稳定传代的人源化基因工程非人类哺乳动物、所述的荷瘤动物模型。
本发明的第二十七方面，涉及组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于所述的人源化动物模型、所述的多基因人源化动物模型或其后代、所述的可稳定传代的人源化基因工程非人类哺乳动物、所述的荷瘤动物模型。
本发明的第二十八方面，涉及荷瘤后的瘤组织，所述荷瘤后的瘤组织来源于所述的人源化动物模型、所述的多基因人源化动物模型或其后代、所述的可稳定传代的人源化基因工程非人类哺乳动物、所述的荷瘤动物模型。
本发明还涉及一种根据上述所述的方法产生的非人动物或其后代在制备动物模型中的用途。
本发明所述的非人哺乳动物也可以基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术获得。
优选的，采用ES细胞基因同源重组技术制备获得SIRPA基因人源化小鼠。
将小鼠Sirpa基因的第2号外显子全部或部分用人SIRPA基因片段替换，步骤包括：设计包含5’同源臂(4481bp)、3’同源臂(4003bp)和人源化基因片段(324bp)的重组载体，在重组载体上构建用于阳性克隆筛选的抗性基因，优选为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，优选为Frt或LoxP重组位点。进一步的，在重组载体3’同源臂下游构建具有负筛选标记的编码基因，优选为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，优选为酶切连接。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，优选为C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与上述所述方法一致。
本发明还涉及根据上述所述的方法得到的非人类动物或其后代或上述所述的动物模型或其后代或荷瘤动物模型作为人信号机理研究、调节剂筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、毒理研究的动物模型的应用；或者，在涉及细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或者，在用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者，在筛选、验证、评价、评估或研究SIRPA抗体药物和药效、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
本发明的嵌合SIRPA基因，包括具有第3号外显子人SIRPA基因的全部或部分序列，或其与人SIRPA基因中的第3号外显子具有至少50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％同一性的序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
本发明所述“癌”选自下组，该组由以下各项组成：白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自下组，该组由以下各项组成：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.in chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：鼠Sirpa基因与人SIRPA基因对比示意图；
图2：人源化小鼠SIRPA基因示意图；
图3：打靶策略示意图；
图4：pClon-4G-SIRPA质粒酶切结果图，图中1、2、3分别指3个pClon-4G-SIRPA克隆，ck代表未经酶切的质粒对照；
图5：5’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA1-sgRNA10)及3’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA11-sgRNA21)，其中Con.为阴性对照，PC为阳性对照；
图6：pT7-sgRNA G2质粒图谱示意图；
图7：F0代小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，M为Marker，+为阳性对照，H2O为水对照，F0-1、F0-2、F0-3为F0代小鼠编号；
图8：F1代小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，M为Marker，+为阳性对照，H2O为水对照，F1-1至F1-16为F1代B-hSIRPA小鼠编号；
图9：F1代小鼠Southern blot结果，WT为野生型，F1-1、F1-2、F1-3、F1-6、F1-10、F1-12、F1-13、F1-14、F1-15、F1-16为F1代小鼠编号；
图10：流式分析结果，其中，图10A、D为未经刺激的野生型C57BL/6小鼠，图B、E为用鼠CD3抗体激活的野生型C57BL/6小鼠，图C、F为用抗鼠CD3抗体激活的B-hSIRPA纯合小鼠，再分别用鼠Sirpa抗体mSirpa PE(图10A、B、C)和人SIRPa抗体hSIRPa APC(图10D、E、F)，进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析；
图11：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为B-hSIRPA纯合子小鼠，GAPDH为内参对照；
图12：F1代Sirpa基因敲除小鼠PCR鉴定结果，其中M为Marker，+为阳性对照，WT为野生型，H2O为水对照，F1-KO-1、F1-KO-2、F1-KO-3、F1-KO-4、F1-KO-5、F1-KO-6为F1代小鼠编号；
图13：双人源化CD47/SIRPA鼠尾PCR鉴定结果，其中，M为Marker，-为野生型对照，H2O为水对照，6433至6439为小鼠编号，图13A为CD47基因的检测结果，其中+为CD47基因纯合子对照；图13B为SIRPA基因的检测结果，其中+为SIRPA基因杂合子对照；
图14：流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6小鼠，图B、E为用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活的C57BL/6小鼠，图C、F为用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活的双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠，再分别用鼠源Cd47抗体mCd47AF647(图A、B、C)或人源CD47抗体hCD47PE(图D、E、F)和鼠源T细胞表面抗体mTcR抗对T细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，用流式细胞仪检测分析；
图15：流式分析结果，其中，图A、D为未经刺激的C57BL/6小鼠，图B、E为用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活的C57BL/6小鼠，图C、F为用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活的双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠，再分别用鼠源Sirpa抗体mSirpa PE(图A、B、C)或人源SIRPa抗体hSIRPa APC(图D、E、F)对T细胞胞外蛋白进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析；图16：双重人源化CD47/SIRPA小鼠RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/H为双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠，GAPDH为内参对照；
图17：基于胚胎干细胞的打靶策略示意图；
图18：将改造后的小鼠结肠癌细胞MC38-hCD47植入B-hSIRPA小鼠体内，并利用4种抗人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1-G5各组实验动物体重测量结果；
图19：将改造后的小鼠结肠癌细胞MC38-hCD47植入B-hSIRPA小鼠体内，并利用4种抗人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1-G5各组实验动物体重变化；
图20：将改造后的小鼠结肠癌细胞MC38-hCD47植入B-hSIRPA小鼠体内，并利用4种抗人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验(10mg/kg)，图为G1-G5各组实验动物肿瘤体积测量结果；
图21：将过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化CD47/SIRPA小鼠体内，并利用人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验周期内小鼠体重情况；
图22：将过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化CD47/SIRPA小鼠体内，并利用人CD47抗体进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验周期内肿瘤体积测量结果；
图23：将过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化CD47/SIRPA小鼠体内，并利用人SIRPA抗体进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验周期内小鼠体重情况；
图24：将过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38植入双重人源化CD47/SIRPA小鼠体内，并利用人SIRPA抗体进行抗肿瘤药效试验结果，图为实验周期内肿瘤体积测量结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本申请实施例所用的小鼠品系、生化试剂、实验仪器为：
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
CD47人源化小鼠来自百奥赛图公司；
EcoRI、BamHI、ASeI酶购自NEB，货号分别为：R3101M、R3136M、R0526S；
Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-001；
逆转录试剂盒来源TakaRa，货号6110A；
大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104－02；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
AIO试剂盒来源百奥赛图公司，货号BCG-DX-004；
pHSG299质粒购自Takara，货号3299；
Anti-mCD3购自BD公司，货号：553057；
PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)购自Biolegend，货号为：109228；
Alexa
Figure BDA0001618775620000231
647anti-mouse CD47(mCD47Aleax Fluor 647，简称mCD47 AF647)购自Biolegend，货号为：127510；
PE anti-human CD47(hCD47PE)购自Biolegend，货号为：323108；
PE anti-mouse CD172a(SIRPα)Antibody(mSirpa PE)购自Biolegend，货号为：144012；
APC anti-human CD172a/b(SIRPα/β)Antibody(hSIRPa APC)购自Biolegend，货号为：323810；
流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur。
实施例1序列设计
非人动物，如小鼠的Sirpa基因和人的SIRPA基因均含有多个转录本，本实施例的序列设计主要以其中一个转录本为例进行阐述。即，将小鼠Sirpa基因(Gene ID：19261)第2号外显子的主要部分(基于NCBI登录号为NM_007547.4→NP_031573.2的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：1所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示)用人SIRPA基因(Gene ID：140885)的相应片段替换(基于NCBI登录号为NM_080792.2→NP_542970.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：3所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示)，其中，鼠Sirpa与人SIRPA基因对比示意图见图1，最终得到的改造后的人源化小鼠SIRPA基因示意图见图2，人源化小鼠SIRPA基因DNA序列(嵌合SIRPA基因DNA)如SEQ ID NO：5所示：
Figure BDA0001618775620000241
SEQ ID NO：5仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为人SIRPA基因序列。
改造后的人源化小鼠SIRPA的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。
鉴于人的SIRPA基因和小鼠的Sirpa基因有多个转录本，本实施例中的人源化序列设计的方法同样适用于其它转录本的人源化改造。可将上述小鼠Sirpa基因的转录本替换为其他转录本，如NCBI登录号为NM_001177647.2→NP_001171118.1(其mRNA序列及蛋白序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示)、NM_001291019.1→NP_001277948.1(其mRNA序列及蛋白序列如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示)、NM_001291020.1→NP_001277949.1(其mRNA序列及蛋白序列如SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14所示)、NM_001291021.1→NP_001277950.1(其mRNA序列及蛋白序列如SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16所示)等。同样，也可以将上述人SIRPA基因的转录本替换为其他转录本，如NCBI登录号为NM_001040022.1→NP_001035111.1，NM_001040023.1→NP_001035112.1，NM_001330728.1→NP_001317657.1，XM_005260670.3→XP_005260727.1，XM_006723545.3→XP_006723608.1，XM_011529173.2→XP_011527475.1。
基于这些转录本改造后的人源化小鼠SIRPA的CDS区序列分别如SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20，mRNA序列分别如SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24，及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：28所示。
实施例2载体pClon-4G-SIRPA的设计及构建
根据序列设计，发明人进一步的设计了如图3所示的打靶方案和包含5’同源臂、人SIRPA基因片段、3’同源臂的载体。其中5’同源臂(SEQ ID NO：29)为NCBI登录号为NC_000068.7的第129607346-129608914位核苷酸，3’同源臂(SEQ ID NO：30)为NCBI登录号为NC_000068.7的第129609239-129610638位核苷酸，人SIRPA(SEQ ID NO：31)基因片段为NCBI登录号为NC_000020.11的第1915110-1915433位核苷酸。
载体的构建过程如下：设计扩增3段同源重组片段(LR，A，RR)的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。其中，5’同源臂对应LR片段，人SIRPA基因片段对应A片段，3’同源臂对应RR片段，引物序列如下：
LR(1620bp)：
F：5’-tacctttaagaaggagatatacatgctcgagcacatctgccatgaaaattggatct-3’(SEQID NO：32)
R：5’-atcacctgcagctcctcctcccccgtggctcctgggaagaaagat-3’(SEQ ID NO：33)
A(364bp)：
F：5’-tcttcccaggagccacgggggaggaggagctgcaggtgattcagc-3’(SEQ ID NO：34)
R：5’-agtacatagacctctgttcctgctccagacttaaactccacgtca-3’(SEQ ID NO：35)
RR(1453bp)：
F：5’-tggagtttaagtctggagcaggaacagaggtctatgtactcggtaag-3’(SEQ ID NO：36)
R：5’-tcggttgttagcagccggatctcaggcggccgcgttcaggacagctcccactggtggg-3’(SEQ ID NO：37)
以C57BL/6小鼠DNA或BAC文库为模板PCR扩增获得LR、RR片段，以人DNA或BAC文库为模板PCR扩增获得A片段。通过AIO试剂盒将片段连接至试剂盒配备的pClon-4G质粒上，最终获得载体pClon-4G-SIRPA。
实施例3载体pClon-4G-SIRPA的验证
随机挑选3个pClon-4G-SIRPA克隆，使用2种限制性内切酶进行酶切验证，其中，EcoRI应出现1371bp+5439bp，BamHI应出现52bp+321bp+900bp+5537bp。酶切结果参见图4，编号为1、2、3的质粒酶切结果均符合预期，表明质粒酶切验证结果正确。质粒1、2经测序公司测序验证正确，选择质粒2进行后续实验。
实施例4Sirpa基因sgRNA的设计
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
根据打靶方案，设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA10)、3’端靶位点(sgRNA11-sgRNA21)的sgRNA序列。
以小鼠为例，根据Sirpa基因的功能和序列特征，5’端靶位点和3’端靶位点均位于小鼠Sirpa基因的第2号外显子上，各sgRNA在Sirpa上的靶位点序列如下：
sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：38)：5’-AGTTCCTTCCCCGTGGCTCCTGG-3’
sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：39)：5’-AGCCACGGGGAAGGAACTGAAGG-3’
sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：40)：5’-CACCTTCAGTTCCTTCCCCGTGG-3’
sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：41)：5’-AAATCAGTGTCTGTTGCTGCTGG-3’
sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：42)：5’-CACTTTGACCTCCTTGTTGCCGG-3’
sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：43)：5’-TTGACCTCCTTGTTGCCGGTGGG-3’
sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：44)：5’-GGGTCCCACCGGCAACAAGGAGG-3’
sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：45)：5’-TGTTGCCGGTGGGACCCATTAGG-3’
sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：46)：5’-ACTCCTCTGTACCACCTAATGGG-3’
sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：47)：5’-CTGTAGATCAACAGCCGGCTTGG-3’
sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：48)：5’-CGAAACTGTAGATCAACAGCCGG-3’
sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：49)：5’-CTGTTGATCTACAGTTTCGCAGG-3’
sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：50)：5’-TCTGAAACATTTCTAATTCGAGG-3’
sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：51)：5’-TACTACTAAGAGAAACAATATGG-3’
sgRNA-15靶位点序列(SEQ ID NO：52)：5’-CTGGGGTGACATTACTGATACGG-3’
sgRNA-16靶位点序列(SEQ ID NO：53)：5’-AATGTCACCCCAGCAGATGCTGG-3’
sgRNA-17靶位点序列(SEQ ID NO：54)：5’-GTAGATGCCAGCATCTGCTGGGG-3’
sgRNA-18靶位点序列(SEQ ID NO：55)：5’-CCTGACACAGAAATACAATCTGG-3’
sgRNA-19靶位点序列(SEQ ID NO：56)：5’-CACAGAAATACAATCTGGAGGGG-3’
sgRNA-20靶位点序列(SEQ ID NO：57)：5’-ACAATCTGGAGGGGGAACAGAGG-3’
sgRNA-21靶位点序列(SEQ ID NO：58)：5’-GGAACAGAGGTCTATGTACTCGG-3’
实施例5sgRNA的筛选
利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图5。从中优先选择sgRNA-7和sgRNA-17并在其上游序列的5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，在其互补链(下游序列)的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸，合成正向、反向寡核苷酸后进行后续实验。具体序列如下：
sgRNA-7：
上游序列：5’-GTCCCACCGGCAACAAGG-3’(SEQ ID NO：59)
正向寡核苷酸：5’-TAGGGTCCCACCGGCAACAAGG-3’(SEQ ID NO：60)
下游序列：5’-CCTTGTTGCCGGTGGGAC-3’(SEQ ID NO：61)
反向寡核苷酸：5’-AAACCCTTGTTGCCGGTGGGAC-3’(SEQ ID NO：62)
sgRNA-17：
上游序列：5’-TAGATGCCAGCATCTGCTG-3’(SEQ ID NO：63)
正向寡核苷酸：5’-TAGGTAGATGCCAGCATCTGCTG-3’(SEQ ID NO：64)
下游序列：5’-CAGCAGATGCTGGCATCTA-3’(SEQ ID NO：65)
反向寡核苷酸：5’-AAACCAGCAGATGCTGGCATCTA-3’(SEQ ID NO：66)
表1UCA检测结果
Figure BDA0001618775620000271
实施例6pT7-sgRNA G2质粒构建
pT7-sgRNA G2质粒来源：pT7-sgRNA G2载体图谱，参见图6。
由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：67)并通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体pHSG299质粒上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：67)：
gaattctaatacgactcactatagggggtcttcgagaagacctgttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttaaaggatcc
实施例7pT7-sgRNA-S7和pT7-sgRNA-S17重组表达载体的构建
将实施例5中获得的正向、反向寡核苷酸退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒，获得表达载体pT7-sgRNA-S7和pT7-sgRNA-S17。连接反应体系见表2。
表2连接反应体系(10μL)
sgRNA退火产物 1μL(0.5μM)
pT7-sgRNA G2载体 1μL(10ng)
T4DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4 DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG 4000 1μL
H<sub>2</sub>O 补至10μL
反应条件为：室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5mL)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-sgRNA-S7和pT7-sgRNA-S17进行后续实验。
实施例8显微注射及胚胎移植
取小鼠的受精卵，如，C57BL/6小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-sgRNA-S7、pT7-sgRNA-S17质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA，pClon-4G-SIRPA质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系，将得到的免疫节点人源化小鼠命名为B-hSIRPA。
实施例9基因改造人源化小鼠的鉴定
1、F0代基因型鉴定
分别使用两对引物得到的F0代B-hSIRPA小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置L-GT-F位于5’同源臂左侧，R-GT-R位于3’同源臂右侧，R-GT-F和L-GT-R均位于人源化片段上，具体序列如下：
5’端引物：
上游引物：L-GT-F：5’-CATCAAGCCTGTTCCCTCCTTGTGT-3’(SEQ ID NO：68)
下游引物：R-GT-R：5’-CTTAAACTCCACGTCATCGGGGCTC-3’(SEQ ID NO：69)3’端引物：
上游引物：R-GT-F：5’-TCAAAAAGAAGGCCACTTCCCCCGGG-3’(SEQ ID NO：70)
下游引物：L-GT-R：5’-CAAGCTGTAGAGACAGATGGGCAGG-3’(SEQ ID NO：71)
PCR反应体系(20μL)如表3所示：
表3PCR反应体系(20μL)
2×PCR buffer 10μL
dNTP(2mM) 4μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 100ng
KOD-FX(1U/μL) 0.4μL
H<sub>2</sub>O 补至20μL
PCR扩增反应条件如表4所示：
表4PCR扩增反应条件
Figure BDA0001618775620000291
如果重组载体插入位置正确，则应只有1条PCR条带，5’端引物产物长度应为2047bp，3’端引物产物长度应为1836bp。
F0代小鼠PCR鉴定结果见图7，其中编号为F0-1、F0-2、F0-3的3只小鼠为阳性小鼠。
2、F1代基因型鉴定
将F0代中鉴定为阳性的小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。F1代小鼠PCR实验结果见图8，显示有10只F1代小鼠为阳性，具体编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-6、F1-10、F1-12、F1-13、F1-14、F1-15、F1-16。
进一步的，应用Southern blot方法对PCR确认为阳性的10只小鼠进行确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用AseI酶消化基因组，转膜，杂交。探针P1、P2分别位于5’同源臂片段上及3’同源臂外侧。探针合成引物如下：
P1-F：5’-GCAGGACAGTGAGCAACTGATGACA-3’(SEQ ID NO：72)
P1-R：5’-GCACAGTGGCCTAACTACCTTCCTG-3’(SEQ ID NO：73)
P2-F：5’-GGTAGTGCCCATGAAGCTGGTACTC-3’(SEQ ID NO：74)
P2-R：5’-GGCCACCACATTATGGCTTTCTCCT-3’(SEQ ID NO：75)
制备成功的基因工程小鼠经探针杂交分别产生2.8kb或5.2kb大小的条带，而野生型小鼠基因组均产生8.0kb大小的条带。
实验结果显示杂交条带大小均与预期相符，证实除F1-14外，其余9只小鼠均不存在随机插入，编号分别为F1-1、F1-2、F1-3、F1-6、F1-10、F1-12、F1-13、F1-15、F1-16。Southern blot检测结果见图9。
这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的B-hSIRPA人源化基因工程小鼠。
3、人源化小鼠的SIRPA表达情况分析
进一步的，将鉴定为阳性的F1代小鼠互相交配，可得到B-hSIRPA人源化基因工程小鼠纯合子。选取1只鉴定为阳性的B-hSIRPA纯合子小鼠(4-6周龄)，另选2只同背景的野生型小鼠(如C57BL/6小鼠)作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分别进行FACS检测和RT-PCR检测。
FACS检测：用鼠SIRPA抗体mSirpa PE及人源SIRPA抗体hSIRPa APC对T细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果如图10显示，与未经刺激(图10A、D)和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠(图10B、E)相比，鼠SIRPA抗体可以检测到C57BL/6小鼠和B-hSIRPA纯合子活化脾脏细胞内表达鼠SIRPa蛋白的细胞(图10A、B、C)，这表明鼠SIRPA抗体与人或人源化SIRPA可能有交叉；但人SIRPA抗体只能在B-hSIRPA内检测到表达人源化SIRPa蛋白的细胞(图10F)，未经CD3刺激的野生型C57BL/6小鼠及经刺激后活化脾脏细胞内均未检测到表达人或人源化SIRPa蛋白的细胞(图10D、E)。
RT-PCR检测：提取野生型C57BL/6小鼠和B-hSIRPA纯合子脾脏细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA；
利用引物：
mSirpa RT-PCR F2：5’-TTGCTGCTGGGGATTCGAC-3’(SEQ ID NO：76)，和
mSirpa RT-PCR R2：5’-CTGCTGGGGTGACATTACTGAT-3’(SEQ ID NO：77)
扩增大小为210bp的鼠Sirpa片段；
利用引物
hSIRPa RT-PCR F1：5’-CCTGACAAGTCCGTGTTGG-3’(SEQ ID NO：78)，和
hSIRPa RT-PCR R1：5’-CTCCTCTGAACCACTGGATGG-3’(SEQ ID NO：79)
扩增大小为100bp的人SIRPA片段。
PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。
实验结果显示(见图11)，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠Sirpa的mRNA表达，B-hSIRPA纯合子小鼠活化细胞中可检测到人SIRPA的mRNA表达。
实施例10基因敲除小鼠的鉴定
由于Cas9的切割造成DNA双链断裂，而同源重组的修复方式会产生插入/缺失突变，可能在制备SIRPA基因人源化小鼠的同时，得到鼠SIRPA蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物进行检测，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：
KO-F：5’-GTCTTGAGTTACAGGCTCATGTGGGG-3’(SEQ ID NO：80)
KO-R：5’-CCCATTATACCTGCTGCGAGCCAC-3’(SEQ ID NO：81)
PCR扩增体系及反应条件同见表5、表6。野生型小鼠PCR产物长度应为610bp，基因敲除小鼠产物长度应为约420bp。PCR结果见图12。所检测的6只小鼠均为Sirpa基因敲除杂合小鼠。
表5PCR扩增反应体系(20μL)
2×PCR buffer 10μL
dNTP(2mM) 4μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 100ng
KOD-FX(1U/μL) 0.4μL
ddH<sub>2</sub>O 补至20μL
表6PCR扩增反应
Figure BDA0001618775620000321
实施例11双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
包含人源SIRPA基因的小鼠(如利用本方法或制得的B-hSIRPA动物模型)还可以用于制备双重人源化或多重人源化动物模型。如，前述实施例8中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞进行注射，或对B-hSIRPA小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到SIRPA人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的B-hSIRPA动物模型纯合或杂合子与其它基因突变或基因修饰纯合或杂合动物模型交配或进行体外受精(IVF)，再对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到SIRPA人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子动物模型。
以双重人源化CD47/SIRPA小鼠的生成为例，由于小鼠CD47与SIRPA基因不在同一条染色体上，可通过将B-hSIRPA小鼠与包含人源CD47基因的小鼠(如B-hCD47小鼠)以自然交配或体外受精的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终得到双重人源化CD47/SIRPA小鼠。
分别使用4对引物对双重人源化CD47/SIRPA小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，具体序列及产物长度见表7，反应体系和条件见表8、9。多只双重人源化CD47/SIRPA小鼠的鉴定结果见图13，其中图13A中，编号为6434、6436的小鼠是CD47基因野生型，编号为6433、6435、6438、6439的小鼠为CD47纯合子小鼠，编号为6437的小鼠是CD47杂合子小鼠，图13B中，编号为6433、6435、6436的小鼠是SIRPA基因野生型，编号为6437、6438的小鼠为SIRPA纯合子小鼠，编号为6434、6439的小鼠是SIRPA杂合子小鼠，综合两组结果表明，编号为6438的小鼠为双重人源化CD47H/H/SIRPAH/H纯合子小鼠，编号为6439的小鼠为双重人源化CD47H/H/SIRPAH/+杂合子小鼠，编号为6437的小鼠为双重人源化CD47H/+/SIRPAH/H杂合子小鼠。
表7序列及产物长度
Figure BDA0001618775620000331
Figure BDA0001618775620000341
表8反应体系(20μL)
2×Master Mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA(100-200ng/20ml) 2μL
ddH<sub>2</sub>O 补至20μL
表9反应条件
Figure BDA0001618775620000342
进一步的，对双重人源化CD47/SIRPA小鼠的表达情况进行检测。选取1只双重人源化CD47/SIRPA小鼠纯合子(4-6周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，24h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分别进行FACS检测和RT-PCR检测。
FACS检测：用鼠CD47抗体mCD47AF647(图14A、B、C)或人CD47抗体hCD47PE(图14D、E、F)和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ，或鼠Sirpa抗体mSirpa PE(图15A、B、C)或人SIRPa抗体hSIRPa APC(图15D、E、F)，对T细胞胞外蛋白进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果如图14、15显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，人CD47抗体和人SIRPa抗体可以检测到人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠脾脏内表达人源化CD47和人源化SIRPa蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠(图14D、E或15D、E)的脾脏内未检测到表达人或人源化CD47和人或人源化SIRPa蛋白的细胞。
RT-PCR检测：提取野生型C57BL/6小鼠和双人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠脾脏细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA，利用引物mCD47 RT-PCR F2：5’-GTCATCCCTTGCATCGTCCG-3’(SEQ ID NO：87)和mCD47 RT-PCR R2：5’-GTCATCCCTTGCATCGTCCG-3’(SEQ ID NO：88)扩增大小为230bp的鼠Cd47片段；
利用引物hCD47RT-PCR F1：5’-ACACTGTCGTCATTCCATGCT-3’(SEQ ID NO：89)，和hCD47RT-PCR R1：5’-CCTGTGTGTGAGACAGCATCA-3’(SEQ ID NO：90)扩增大小为226bp的人CD47片段；
利用引物mSirpa RT-PCR F2(SEQ ID NO：76)，和mSirpa RT-PCR R2：(SEQ ID NO：77)扩增大小为210bp的鼠Sirpa片段；
利用引物hSIRPa RT-PCR F1(SEQ ID NO：78)，和hSIRPa RT-PCR R1(SEQ ID NO：79)扩增大小为100bp的人SIRPA片段；
PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。
实验结果显示(见图16)，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠Cd47和Sirpa的mRNA表达，双重人源化CD47/SIRPA纯合子小鼠活化细胞中可检测到人CD47和SIRPA的mRNA表达。
上述得到的双重人源化CD47/SIRPA小鼠可以用于制备三人源化CD47/SIRPA/PD-1小鼠。由于小鼠CD47或SIRPA基因与PD-1基因均不在同一条染色体上，可通过将双重人源化CD47/SIRPA小鼠与包含人PD-1基因的小鼠(如B-hPD-1小鼠)以自然交配或体外受精的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终可得到三人源化CD47/SIRPA/PD-1小鼠。
实施例12基于胚胎干细胞的制备方法
采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得SIRPA基因人源化小鼠。
根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠SIRPA基因示意图(图2)，发明人设计了图17所示的打靶策略，图17中还显示了重组载体的设计。鉴于本发明的目的之一是将小鼠Sirpa基因的2号外显子全部或部分用人SIRPA基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂(4268bp)、3’同源臂(4653bp)和人源化基因片段(324bp)的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例9一致。
实施例13B-hSIRPA基因人源化动物模型体内药效验证
取B-hSIRPA纯合小鼠(9周龄)，皮下接种经过改造的小鼠结肠癌细胞MC38-hCD47(该细胞表达人源化CD47且不表达鼠CD47)，细胞接种量为5×105/100μLPBS。待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择4种抗人SIRPA抗体(Ab1、Ab2、Ab3、Ab4，均为采用常规方法免疫小鼠得到)进行注射治疗，剂量为10mg/kg，对照组注射等体积的生理盐水。给药频率为每3天给药1次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时应执行安乐死结束试验。
整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好，在实验终点时(分组后第21天)，所有治疗组和对照组小鼠体重均出现增长，且在整个实验周期内小鼠体重和体重变化均无明显区别(图18、19)；但从肿瘤体积测量结果上看(图20)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积增长呈现不同程度的抑制和/或缩小。表明抗人SIRPA抗体在小鼠体内有不同的抑制肿瘤效果。
表10中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后14天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后第21天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
表10肿瘤体积、存活率及肿瘤抑制率
Figure BDA0001618775620000371
从表10可见，结合图12可知在实验终点时(分组后第21天)，各组动物体重均出现增长且无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对4种抗人SIRPA抗体耐受良好。但Ab2(G3)和Ab4(G5)治疗组均死亡1只小鼠，表明这两种抗体可能有一定毒性。从肿瘤体积测量结果来看，对照组(G1)平均肿瘤体积为1469±433mm3，治疗组平均肿瘤体积分别为797±261mm3(G2)、397±89mm3(G3)、229±102mm3(G4)、815±514mm3(G5)，所有治疗组小鼠肿瘤体积均小于对照组(G1)，TGITV分别为50.6％、80.7％、93.4％、49.2％，表明4种抗人SIRPA抗体具有不同的抑制肿瘤生长效果，在相同的给药剂量和频次下，抗体Ab2(G3)、Ab3(G4)具有明显的抑瘤效果(TGITV＞60％)且优于Ab1和Ab4抗体。由此证明不同的SIRPA抗体在B-hSIRPA小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长能力，表现出不同的疗效。
上述研究结果证明人源化SIRPA动物模型可作为体内药效研究的活体模型，用于SIRPA信号通路调节剂的筛选、评估和治疗实验，并可用于在动物体内评估靶向人SIRPA抗体的有效性，以及评估靶向SIRPA的治疗效果等。
实施例14双重人源化CD47/SIRPA小鼠动物模型体内药效验证
取双重人源化CD47/SIRPA小鼠(7-9周)，皮下接种过表达人CD47的小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择抗人CD47抗体AB1、AB2、AB3中的1种或抗人SIRPA抗体Ab-S1、Ab-S2、Ab-S3中的1种(以上抗体均为采用常规方法免疫小鼠得到)，给药剂量为3mg/kg，每周1、4给药，共给药6次。对照组注射生理盐水。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束实验。
整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好。在各实验终点时，各组动物体重增长良好，所有治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异，表明动物对所述3种抗人CD47抗体及3种抗人SIRPA抗体均耐受良好。所有实验治疗组和对照组小鼠体重(图21、23)在整个实验周期内均无明显区别，但从肿瘤体积测量结果上看(图22、24)，所有对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，人CD47抗体实验组中，所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积呈现不同程度的缩小，表明3种抗人CD47抗体具有不同程度的抑瘤作用；抗人SIRPA抗体实验组中，不同治疗组小鼠肿瘤体积被抑制程度较低，表明这3种抗人SIRPA抗体在本次实验中的肿瘤抑制率不高，但所有6种抗体均未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。
表11中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时(第0天)和分组后14天时的肿瘤体积及实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(TumorGrowth Inhibition value，TGITV)。
在实验终点时，所有小鼠均存活，人CD47抗体实验组中，对照组(G1)平均肿瘤体积为2166±335mm3，AB1治疗组(G2)为2007±438mm3，AB2抗体治疗组(G3)为1227±229mm3，AB3抗体治疗组(G4)为828±139mm3，使用AB1治疗组(G2)与对照组(G1)小鼠肿瘤体积大小差别不大，但G3、G4组与对照组(G1)的瘤体积相比均具有显著的差异(P＜0.05)，TGITV分别为46.7％、65.6％，表明在相同的给药剂量和频次下，表明3种人CD47单抗具有不同的抑瘤作用，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。
人SIRPA抗体实验组中，抗体Ab-S1(G2)、Ab-S2(G3)治疗组与对照组(G1)相比，肿瘤体积差别不明显，抗体Ab-S3治疗组(G4)的小鼠平均肿瘤体积为820±88mm3，与对照组(G1)相比，肿瘤体积呈一定程度的缩小，表明这3种抗人SIRPA单抗在抑制肿瘤生长方面具有不同的作用，抗体Ab-S3体内治疗肿瘤效果明显优于抗体Ab-S1、Ab-S2。
本实验证明了双重人源化CD47/SIRPA小鼠可用于筛选靶向人CD47、SIRPA的药物(如，抗体)及体内药效检测。
表11肿瘤体积、存活率及肿瘤抑制率
Figure BDA0001618775620000391
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 人源化SIRPA基因改造动物模型的制备方法及应用
<130> 1
<160> 90
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4031
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
cccgccggcc tggcccggcg tcacgctccc ggagtctccc cgctcggcgg cgtctcattg 300
tgggaggggg tcagatcacc ccgccgggcg gtggcgctgg ggggcagcgg agggggaggg 360
gccttagtcg ttcgcccgcg ccgcccgccc gcctgccgag cgcgctcacc gccgctctcc 420
ctccttgctc tgcagccgcg gcccatggag cccgccggcc cggcccctgg ccgcctaggg 480
ccgctgctgc tctgcctgct gctctccgcg tcctgtttct gtacaggagc cacggggaag 540
gaactgaagg tgactcagcc tgagaaatca gtgtctgttg ctgctgggga ttcgaccgtt 600
ctgaactgca ctttgacctc cttgttgccg gtgggaccca ttaggtggta cagaggagta 660
gggccaagcc ggctgttgat ctacagtttc gcaggagaat acgttcctcg aattagaaat 720
gtttcagata ctactaagag aaacaatatg gacttttcca tccgtatcag taatgtcacc 780
ccagcagatg ctggcatcta ctactgtgtg aagttccaga aaggatcatc agagcctgac 840
acagaaatac aatctggagg gggaacagag gtctatgtac tcgccaaacc ttctccaccg 900
gaggtatccg gcccagcaga caggggcata cctgaccaga aagtgaactt cacctgcaag 960
tctcatggct tctctccccg gaatatcacc ctgaagtggt tcaaagatgg gcaagaactc 1020
caccccttgg agaccaccgt gaaccctagt ggaaagaatg tctcctacaa catctccagc 1080
acagtcaggg tggtactaaa ctccatggat gttaattcta aggtcatctg cgaggtagcc 1140
cacatcacct tggatagaag ccctcttcgt gggattgcta acctgtctaa cttcatccga 1200
gtttcaccca ccgtgaaggt cacccaacag tccccgacgt caatgaacca ggtgaacctc 1260
acctgccggg ctgagaggtt ctaccccgag gatctccagc tgatctggct ggagaatgga 1320
aacgtatcac ggaatgacac gcccaagaat ctcacaaaga acacggatgg gacctataat 1380
tacacaagct tgttcctggt gaactcatct gctcatagag aggacgtggt gttcacgtgc 1440
caggtgaagc acgaccaaca gccagcgatc acccgaaacc ataccgtgct gggatttgcc 1500
cactcgagtg atcaagggag catgcaaacc ttccctgata ataatgctac ccacaactgg 1560
aatgtcttca tcggtgtggg cgtggcgtgt gctttgctcg tagtcctgct gatggctgct 1620
ctctacctcc tccggatcaa acagaagaaa gccaaggggt caacatcttc cacacggttg 1680
cacgagcccg agaagaacgc cagggaaata acccagatcc aggacacaaa tgacatcaac 1740
gacatcacat acgcagacct gaatctgccc aaagagaaga agcccgcacc ccgggcccct 1800
gagcctaaca accacacaga atatgcaagc attgagacag gcaaagtgcc taggccagag 1860
gataccctca cctatgctga cctggacatg gtccacctca gccgggcaca gccagccccc 1920
aagcctgagc catctttctc agagtatgct agtgtccagg tccagaggaa gtgaatgggg 1980
ctgtggtctg tactaggccc catccccaca agttttcttg tcctacatgg agtggccatg 2040
acgaggacat ccagccagcc aatcctgtcc ccagaaggcc aggtggcacg ggtcctagga 2100
ccaggggtaa gggtggcctt tgtcttccct ccgtggctct tcaacacctc ttgggcaccc 2160
acgtcccctt cttccggagg ctgggtgttg cagaaccaga gggcgaactg gagaaagctg 2220
cctggaatcc aagaagtgtt gtgcctcggc ccatcactcg tgggtctgga tcctggtctt 2280
ggcaacccca ggttgcgtcc ttgatgttcc agagcttggt cttctgtgtg gagaagagct 2340
caccatctct acccaacttg agctttggga ccagactccc tttagatcaa accgccccat 2400
ctgtggaaga actacaccag aagtcagcaa gttttcagcc aacagtgctg gcctccccac 2460
ctcccaggct gactagccct ggggagaagg aaccctctcc tcctagacca gcagagactc 2520
cctgggcatg ttcagtgtgg ccccacctcc cttccagtcc cagcttgctt cctccagcta 2580
gcactaactc agcagcatcg ctctgtggac gcctgtaaat tattgagaaa tgtgaactgt 2640
gcagtcttaa agctaaggtg ttagaaaatt tgatttatgc tgtttagttg ttgttgggtt 2700
tcttttcttt ttaatttctt tttctttttt gatttttttt ctttccctta aaacaacagc 2760
agcagcatct tggctctttg tcatgtgttg aatggttggg tcttgtgaag tctgaggtct 2820
aacagtttat tgtcctggaa ggattttctt acagcagaaa cagatttttt tcaaattccc 2880
agaatcctga ggaccaagaa ggatccctca gctgctactt ccagcaccca gcgtcactgg 2940
gacgaaccag gccctgttct tacaaggcca catggctggc cctttgcctc catggctact 3000
gtggtaagtg cagccttgtc tgacccaatg ctgacctaat gttggccatt ccacattgag 3060
gggacaaggt cagtgatgcc ccccttcact cacaagcact tcagaggcat gcagagagaa 3120
gggacactcg gccagctctc tgaggtaatc agtgcaagga ggagtccgtt ttttgccagc 3180
aaacctcagc aggatcacac tggaacagaa cctggtcata cctgtgacaa cacagctgtg 3240
agccagggca aaccacccac tgtcactggc tcgagagtct gggcagaggc tctgaccctc 3300
caccctttaa actggatgcc ggggcctggc tgggcccaat gccaagtggt tatggcaacc 3360
ctgactatct ggtcttaaca tgtagctcag gaagtggagg cgctaatgtc cccaatccct 3420
ggggattcct gattccagct attcatgtaa gcagagccaa cctgcctatt tctgtaggtg 3480
cgactgggat gttaggagca cagcaaggac ccagctctgt agggctggtg acctgatact 3540
tctcataatg gcatctagaa gttaggctga gttggcctca ctggcccagc aaaccagaac 3600
ttgtctttgt ccgggccatg ttcttgggct gtcttctaat tccaaagggt tggttggtaa 3660
agctccaccc ccttctcctc tgcctaaaga catcacatgt gtatacacac acgggtgtat 3720
agatgagtta aaagaatgtc ctcgctggca tcctaatttt gtcttaagtt tttttggagg 3780
gagaaaggaa caaggcaagg gaagatgtgt agctttggct ttaaccaggc agcctggggg 3840
ctcccaagcc tatggaaccc tggtacaaag aagagaacag aagcgccctg tgaggagtgg 3900
gatttgtttt tctgtagacc agatgagaag gaaacaggcc ctgttttgta catagttgca 3960
acttaaaatt tttggcttgc aaaatatttt tgtaataaag atttctgggt aacaataaaa 4020
aaaaaaaaaa a 4031
<210> 2
<211> 509
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 2
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys
20 25 30
Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe
165 170 175
Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu
180 185 190
His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn
210 215 220
Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro
225 230 235 240
Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr
245 250 255
Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu
260 265 270
Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp
275 280 285
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn
305 310 315 320
Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His
325 330 335
Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala
340 345 350
His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn Ala
355 360 365
Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu
370 375 380
Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Ile Gln Asp Thr Asn Asp Ile Asn
420 425 430
Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu Lys Lys Pro Ala
435 440 445
Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu
450 455 460
Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu
465 470 475 480
Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro
485 490 495
Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg Lys
500 505
<210> 3
<211> 3868
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 3
cgctcgctcg cagagaagcc gcggcccatg gagcccgccg gcccggcccc cggccgcctc 60
gggccgctgc tctgcctgct gctcgccgcg tcctgcgcct ggtcaggagt ggcgggtgag 120
gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtgttgg ttgcagctgg agagacagcc 180
actctgcgct gcactgcgac ctctctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 240
gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 300
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 360
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 420
gtggagttta agtctggagc aggcactgag ctgtctgtgc gcgccaaacc ctctgccccc 480
gtggtatcgg gccctgcggc gagggccaca cctcagcaca cagtgagctt cacctgcgag 540
tcccacggct tctcacccag agacatcacc ctgaaatggt tcaaaaatgg gaatgagctc 600
tcagacttcc agaccaacgt ggaccccgta ggagagagcg tgtcctacag catccacagc 660
acagccaagg tggtgctgac ccgcgaggac gttcactctc aagtcatctg cgaggtggcc 720
cacgtcacct tgcaggggga ccctcttcgt gggactgcca acttgtctga gaccatccga 780
gttccaccca ccttggaggt tactcaacag cccgtgaggg cagagaacca ggtgaatgtc 840
acctgccagg tgaggaagtt ctacccccag agactacagc tgacctggtt ggagaatgga 900
aacgtgtccc ggacagaaac ggcctcaacc gttacagaga acaaggatgg tacctacaac 960
tggatgagct ggctcctggt gaatgtatct gcccacaggg atgatgtgaa gctcacctgc 1020
caggtggagc atgacgggca gccagcggtc agcaaaagcc atgacctgaa ggtctcagcc 1080
cacccgaagg agcagggctc aaataccgcc gctgagaaca ctggatctaa tgaacggaac 1140
atctatattg tggtgggtgt ggtgtgcacc ttgctggtgg ccctactgat ggcggccctc 1200
tacctcgtcc gaatcagaca gaagaaagcc cagggctcca cttcttctac aaggttgcat 1260
gagcccgaga agaatgccag agaaataaca caggacacaa atgatatcac atatgcagac 1320
ctgaacctgc ccaaggggaa gaagcctgct ccccaggctg cggagcccaa caaccacacg 1380
gagtatgcca gcattcagac cagcccgcag cccgcgtcgg aggacaccct cacctatgct 1440
gacctggaca tggtccacct caaccggacc cccaagcagc cggcccccaa gcctgagccg 1500
tccttctcag agtacgccag cgtccaggtc ccgaggaagt gaatgggacc gtggtttgct 1560
ctagcaccca tctctacgcg ctttcttgtc ccacagggag ccgccgtgat gagcacagcc 1620
aacccagttc ccggagggct ggggcggtgc aggctctggg acccaggggc cagggtggct 1680
cttctctccc cacccctcct tggctctcca gcacttcctg ggcagccacg gccccctccc 1740
cccacattgc cacatacctg gaggctgacg ttgccaaacc agccagggaa ccaacctggg 1800
aagtggccag aactgcctgg ggtccaagaa ctcttgtgcc tccgtccatc accatgtggg 1860
ttttgaagac cctcgactgc ctccccgatg ctccgaagcc tgatcttcca gggtggggag 1920
gagaaaatcc cacctcccct gacctccacc acctccacca ccaccaccac caccaccacc 1980
accactacca ccaccaccca actggggcta gagtggggaa gatttcccct ttagatcaaa 2040
ctgccccttc catggaaaag ctggaaaaaa actctggaac ccatatccag gcttggtgag 2100
gttgctgcca acagtcctgg cctcccccat ccctaggcta aagagccatg agtcctggag 2160
gaggagagga cccctcccaa aggactggag acaaaaccct ctgcttcctt gggtccctcc 2220
aagactccct ggggcccaac tgtgttgctc cacccggacc catctctccc ttctagacct 2280
gagcttgccc ctccagctag cactaagcaa catctcgctg tggacgcctg taaattactg 2340
agaaatgtga aacgtgcaat cttgaaactg aggtgttaga aaacttgatc tgtggtgttt 2400
tgttttgttt tttttcttaa aacaacagca acgtgatctt ggctgtctgt catgtgttga 2460
agtccatggt tgggtcttgt gaagtctgag gtttaacagt ttgttgtcct ggagggattt 2520
tcttacagcg aagacttgag ttcctccaag tcccagaacc ccaagaatgg gcaagaagga 2580
tcaggtcagc cactccctgg agacacagcc ttctggctgg gactgacttg gccatgttct 2640
cagctgagcc acgcggctgg tagtgcagcc ttctgtgacc ccgctgtggt aagtccagcc 2700
tgcccagggc tgctgagggc tgcctcttga cagtgcagtc ttatcgagac ccaatgcctc 2760
agtctgctca tccgtaaagt ggggatagtg aagatgacac ccctccccac cacctctcat 2820
aagcacttta ggaacacaca gagggtaggg atagtggccc tggccgtcta tcctacccct 2880
ttagtgaccg cccccatccc ggctttctga gctgatcctt gaagaagaaa tcttccattt 2940
ctgctctcaa accctactgg gatcaaactg gaataaattg aagacagcca gggggatggt 3000
gcagctgtga agctcgggct gattccccct ctgtcccaga aggttggcca gagggtgtga 3060
cccagttacc ctttaacccc cacccttcca gtcgggtgtg agggcctgac cgggcccagg 3120
gcaagcagat gtcgcaagcc ctatttattc agtcttcact ataactctta gagttgagac 3180
gctaatgttc atgactcctg gccttgggat gcccaaggga tttctggctc aggctgtaaa 3240
agtagctgag ccatcctgcc cattcctgga ggtcctacag gtgaaactgc aggagctcag 3300
catagaccca gctctctggg ggatggtcac ctggtgattt caatgatggc atccaggaat 3360
tagctgagcc aacagaccat gtggacagct ttggccagag ctcccgtgtg gcatctggga 3420
gccacagtga cccagccacc tggctcaggc tagttccaaa ttccaaaaga ttggcttgta 3480
aaccttcgtc tccctctctt ttacccagag acagcacata cgtgtgcaca cgcatgcaca 3540
cacacattca gtattttaaa agaatgtttt cttggtgcca ttttcatttt attttatttt 3600
ttaattcttg gagggggaaa taagggaata aggccaagga agatgtatag ctttagcttt 3660
agcctggcaa cctggagaat ccacatacct tgtgtattga accccaggaa aaggaagagg 3720
tcgaaccaac cctgcggaag gagcatggtt tcaggagttt attttaagac tgctgggaag 3780
gaaacaggcc ccattttgta tatagttgca acttaaactt tttggcttgc aaaatatttt 3840
tgtaataaag atttctgggt aataatga 3868
<210> 4
<211> 504
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 4
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val
370 375 380
Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys
385 390 395 400
Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn
405 410 415
Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn
435 440 445
Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser
450 455 460
Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg
465 470 475 480
Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr
485 490 495
Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 5
<211> 348
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gagccacggg ggaggaggag ctgcaggtga ttcagcctga caagtccgtg ttggttgcag 60
ctggagagac agccactctg cgctgcactg cgacctctct gatccctgtg gggcccatcc 120
agtggttcag aggagctgga ccaggccggg aattaatcta caatcaaaaa gaaggccact 180
tcccccgggt aacaactgtt tcagacctca caaagagaaa caacatggac ttttccatcc 240
gcatcggtaa catcacccca gcagatgccg gcacctacta ctgtgtgaag ttccggaaag 300
ggagccccga tgacgtggag tttaagtctg gagcaggaac agaggtct 348
<210> 6
<211> 1530
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggagcccg ccggcccggc ccctggccgc ctagggccgc tgctgctctg cctgctgctc 60
tccgcgtcct gtttctgtac aggagccacg ggggaggagg agctgcaggt gattcagcct 120
gacaagtccg tgttggttgc agctggagag acagccactc tgcgctgcac tgcgacctct 180
ctgatccctg tggggcccat ccagtggttc agaggagctg gaccaggccg ggaattaatc 240
tacaatcaaa aagaaggcca cttcccccgg gtaacaactg tttcagacct cacaaagaga 300
aacaacatgg acttttccat ccgcatcggt aacatcaccc cagcagatgc cggcacctac 360
tactgtgtga agttccggaa agggagcccc gatgacgtgg agtttaagtc tggagcagga 420
acagaggtct atgtactcgc caaaccttct ccaccggagg tatccggccc agcagacagg 480
ggcatacctg accagaaagt gaacttcacc tgcaagtctc atggcttctc tccccggaat 540
atcaccctga agtggttcaa agatgggcaa gaactccacc ccttggagac caccgtgaac 600
cctagtggaa agaatgtctc ctacaacatc tccagcacag tcagggtggt actaaactcc 660
atggatgtta attctaaggt catctgcgag gtagcccaca tcaccttgga tagaagccct 720
cttcgtggga ttgctaacct gtctaacttc atccgagttt cacccaccgt gaaggtcacc 780
caacagtccc cgacgtcaat gaaccaggtg aacctcacct gccgggctga gaggttctac 840
cccgaggatc tccagctgat ctggctggag aatggaaacg tatcacggaa tgacacgccc 900
aagaatctca caaagaacac ggatgggacc tataattaca caagcttgtt cctggtgaac 960
tcatctgctc atagagagga cgtggtgttc acgtgccagg tgaagcacga ccaacagcca 1020
gcgatcaccc gaaaccatac cgtgctggga tttgcccact cgagtgatca agggagcatg 1080
caaaccttcc ctgataataa tgctacccac aactggaatg tcttcatcgg tgtgggcgtg 1140
gcgtgtgctt tgctcgtagt cctgctgatg gctgctctct acctcctccg gatcaaacag 1200
aagaaagcca aggggtcaac atcttccaca cggttgcacg agcccgagaa gaacgccagg 1260
gaaataaccc agatccagga cacaaatgac atcaacgaca tcacatacgc agacctgaat 1320
ctgcccaaag agaagaagcc cgcaccccgg gcccctgagc ctaacaacca cacagaatat 1380
gcaagcattg agacaggcaa agtgcctagg ccagaggata ccctcaccta tgctgacctg 1440
gacatggtcc acctcagccg ggcacagcca gcccccaagc ctgagccatc tttctcagag 1500
tatgctagtg tccaggtcca gaggaagtga 1530
<210> 7
<211> 4031
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
cccgccggcc tggcccggcg tcacgctccc ggagtctccc cgctcggcgg cgtctcattg 300
tgggaggggg tcagatcacc ccgccgggcg gtggcgctgg ggggcagcgg agggggaggg 360
gccttagtcg ttcgcccgcg ccgcccgccc gcctgccgag cgcgctcacc gccgctctcc 420
ctccttgctc tgcagccgcg gcccatggag cccgccggcc cggcccctgg ccgcctaggg 480
ccgctgctgc tctgcctgct gctctccgcg tcctgtttct gtacaggagc cacgggggag 540
gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtgttgg ttgcagctgg agagacagcc 600
actctgcgct gcactgcgac ctctctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 660
gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 720
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 780
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 840
gtggagttta agtctggagc aggaacagag gtctatgtac tcgccaaacc ttctccaccg 900
gaggtatccg gcccagcaga caggggcata cctgaccaga aagtgaactt cacctgcaag 960
tctcatggct tctctccccg gaatatcacc ctgaagtggt tcaaagatgg gcaagaactc 1020
caccccttgg agaccaccgt gaaccctagt ggaaagaatg tctcctacaa catctccagc 1080
acagtcaggg tggtactaaa ctccatggat gttaattcta aggtcatctg cgaggtagcc 1140
cacatcacct tggatagaag ccctcttcgt gggattgcta acctgtctaa cttcatccga 1200
gtttcaccca ccgtgaaggt cacccaacag tccccgacgt caatgaacca ggtgaacctc 1260
acctgccggg ctgagaggtt ctaccccgag gatctccagc tgatctggct ggagaatgga 1320
aacgtatcac ggaatgacac gcccaagaat ctcacaaaga acacggatgg gacctataat 1380
tacacaagct tgttcctggt gaactcatct gctcatagag aggacgtggt gttcacgtgc 1440
caggtgaagc acgaccaaca gccagcgatc acccgaaacc ataccgtgct gggatttgcc 1500
cactcgagtg atcaagggag catgcaaacc ttccctgata ataatgctac ccacaactgg 1560
aatgtcttca tcggtgtggg cgtggcgtgt gctttgctcg tagtcctgct gatggctgct 1620
ctctacctcc tccggatcaa acagaagaaa gccaaggggt caacatcttc cacacggttg 1680
cacgagcccg agaagaacgc cagggaaata acccagatcc aggacacaaa tgacatcaac 1740
gacatcacat acgcagacct gaatctgccc aaagagaaga agcccgcacc ccgggcccct 1800
gagcctaaca accacacaga atatgcaagc attgagacag gcaaagtgcc taggccagag 1860
gataccctca cctatgctga cctggacatg gtccacctca gccgggcaca gccagccccc 1920
aagcctgagc catctttctc agagtatgct agtgtccagg tccagaggaa gtgaatgggg 1980
ctgtggtctg tactaggccc catccccaca agttttcttg tcctacatgg agtggccatg 2040
acgaggacat ccagccagcc aatcctgtcc ccagaaggcc aggtggcacg ggtcctagga 2100
ccaggggtaa gggtggcctt tgtcttccct ccgtggctct tcaacacctc ttgggcaccc 2160
acgtcccctt cttccggagg ctgggtgttg cagaaccaga gggcgaactg gagaaagctg 2220
cctggaatcc aagaagtgtt gtgcctcggc ccatcactcg tgggtctgga tcctggtctt 2280
ggcaacccca ggttgcgtcc ttgatgttcc agagcttggt cttctgtgtg gagaagagct 2340
caccatctct acccaacttg agctttggga ccagactccc tttagatcaa accgccccat 2400
ctgtggaaga actacaccag aagtcagcaa gttttcagcc aacagtgctg gcctccccac 2460
ctcccaggct gactagccct ggggagaagg aaccctctcc tcctagacca gcagagactc 2520
cctgggcatg ttcagtgtgg ccccacctcc cttccagtcc cagcttgctt cctccagcta 2580
gcactaactc agcagcatcg ctctgtggac gcctgtaaat tattgagaaa tgtgaactgt 2640
gcagtcttaa agctaaggtg ttagaaaatt tgatttatgc tgtttagttg ttgttgggtt 2700
tcttttcttt ttaatttctt tttctttttt gatttttttt ctttccctta aaacaacagc 2760
agcagcatct tggctctttg tcatgtgttg aatggttggg tcttgtgaag tctgaggtct 2820
aacagtttat tgtcctggaa ggattttctt acagcagaaa cagatttttt tcaaattccc 2880
agaatcctga ggaccaagaa ggatccctca gctgctactt ccagcaccca gcgtcactgg 2940
gacgaaccag gccctgttct tacaaggcca catggctggc cctttgcctc catggctact 3000
gtggtaagtg cagccttgtc tgacccaatg ctgacctaat gttggccatt ccacattgag 3060
gggacaaggt cagtgatgcc ccccttcact cacaagcact tcagaggcat gcagagagaa 3120
gggacactcg gccagctctc tgaggtaatc agtgcaagga ggagtccgtt ttttgccagc 3180
aaacctcagc aggatcacac tggaacagaa cctggtcata cctgtgacaa cacagctgtg 3240
agccagggca aaccacccac tgtcactggc tcgagagtct gggcagaggc tctgaccctc 3300
caccctttaa actggatgcc ggggcctggc tgggcccaat gccaagtggt tatggcaacc 3360
ctgactatct ggtcttaaca tgtagctcag gaagtggagg cgctaatgtc cccaatccct 3420
ggggattcct gattccagct attcatgtaa gcagagccaa cctgcctatt tctgtaggtg 3480
cgactgggat gttaggagca cagcaaggac ccagctctgt agggctggtg acctgatact 3540
tctcataatg gcatctagaa gttaggctga gttggcctca ctggcccagc aaaccagaac 3600
ttgtctttgt ccgggccatg ttcttgggct gtcttctaat tccaaagggt tggttggtaa 3660
agctccaccc ccttctcctc tgcctaaaga catcacatgt gtatacacac acgggtgtat 3720
agatgagtta aaagaatgtc ctcgctggca tcctaatttt gtcttaagtt tttttggagg 3780
gagaaaggaa caaggcaagg gaagatgtgt agctttggct ttaaccaggc agcctggggg 3840
ctcccaagcc tatggaaccc tggtacaaag aagagaacag aagcgccctg tgaggagtgg 3900
gatttgtttt tctgtagacc agatgagaag gaaacaggcc ctgttttgta catagttgca 3960
acttaaaatt tttggcttgc aaaatatttt tgtaataaag atttctgggt aacaataaaa 4020
aaaaaaaaaa a 4031
<210> 8
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Glu
20 25 30
Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala
35 40 45
Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val
50 55 60
Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp
85 90 95
Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile
100 105 110
Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly
115 120 125
Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe
165 170 175
Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu
180 185 190
His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn
210 215 220
Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro
225 230 235 240
Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr
245 250 255
Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu
260 265 270
Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp
275 280 285
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn
305 310 315 320
Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His
325 330 335
Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala
340 345 350
His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn Ala
355 360 365
Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu
370 375 380
Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Ile Gln Asp Thr Asn Asp Ile Asn
420 425 430
Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu Lys Lys Pro Ala
435 440 445
Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu
450 455 460
Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu
465 470 475 480
Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro
485 490 495
Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg Lys
500 505
<210> 9
<211> 3377
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 9
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
cccgccggcc tggcccggcg tcacgctccc ggagtctccc cgctcggcgg cgtctcattg 300
tgggaggggg tcagatcacc ccgccgggcg gtggcgctgg ggggcagcgg agggggaggg 360
gccttagtcg ttcgcccgcg ccgcccgccc gcctgccgag cgcgctcacc gccgctctcc 420
ctccttgctc tgcagccgcg gcccatggag cccgccggcc cggcccctgg ccgcctaggg 480
ccgctgctgc tctgcctgct gctctccgcg tcctgtttct gtacaggagc cacggggaag 540
gaactgaagg tgactcagcc tgagaaatca gtgtctgttg ctgctgggga ttcgaccgtt 600
ctgaactgca ctttgacctc cttgttgccg gtgggaccca ttaggtggta cagaggagta 660
gggccaagcc ggctgttgat ctacagtttc gcaggagaat acgttcctcg aattagaaat 720
gtttcagata ctactaagag aaacaatatg gacttttcca tccgtatcag taatgtcacc 780
ccagcagatg ctggcatcta ctactgtgtg aagttccaga aaggatcatc agagcctgac 840
acagaaatac aatctggagg gggaacagag gtctatgtac tcgataataa tgctacccac 900
aactggaatg tcttcatcgg tgtgggcgtg gcgtgtgctt tgctcgtagt cctgctgatg 960
gctgctctct acctcctccg gatcaaacag aagaaagcca aggggtcaac atcttccaca 1020
cggttgcacg agcccgagaa gaacgccagg gaaataaccc agatccagga cacaaatgac 1080
atcaacgaca tcacatacgc agacctgaat ctgcccaaag agaagaagcc cgcaccccgg 1140
gcccctgagc ctaacaacca cacagaatat gcaagcattg agacaggcaa agtgcctagg 1200
ccagaggata ccctcaccta tgctgacctg gacatggtcc acctcagccg ggcacagcca 1260
gcccccaagc ctgagccatc tttctcagag tatgctagtg tccaggtcca gaggaagtga 1320
atggggctgt ggtctgtact aggccccatc cccacaagtt ttcttgtcct acatggagtg 1380
gccatgacga ggacatccag ccagccaatc ctgtccccag aaggccaggt ggcacgggtc 1440
ctaggaccag gggtaagggt ggcctttgtc ttccctccgt ggctcttcaa cacctcttgg 1500
gcacccacgt ccccttcttc cggaggctgg gtgttgcaga accagagggc gaactggaga 1560
aagctgcctg gaatccaaga agtgttgtgc ctcggcccat cactcgtggg tctggatcct 1620
ggtcttggca accccaggtt gcgtccttga tgttccagag cttggtcttc tgtgtggaga 1680
agagctcacc atctctaccc aacttgagct ttgggaccag actcccttta gatcaaaccg 1740
ccccatctgt ggaagaacta caccagaagt cagcaagttt tcagccaaca gtgctggcct 1800
ccccacctcc caggctgact agccctgggg agaaggaacc ctctcctcct agaccagcag 1860
agactccctg ggcatgttca gtgtggcccc acctcccttc cagtcccagc ttgcttcctc 1920
cagctagcac taactcagca gcatcgctct gtggacgcct gtaaattatt gagaaatgtg 1980
aactgtgcag tcttaaagct aaggtgttag aaaatttgat ttatgctgtt tagttgttgt 2040
tgggtttctt ttctttttaa tttctttttc ttttttgatt ttttttcttt cccttaaaac 2100
aacagcagca gcatcttggc tctttgtcat gtgttgaatg gttgggtctt gtgaagtctg 2160
aggtctaaca gtttattgtc ctggaaggat tttcttacag cagaaacaga tttttttcaa 2220
attcccagaa tcctgaggac caagaaggat ccctcagctg ctacttccag cacccagcgt 2280
cactgggacg aaccaggccc tgttcttaca aggccacatg gctggccctt tgcctccatg 2340
gctactgtgg taagtgcagc cttgtctgac ccaatgctga cctaatgttg gccattccac 2400
attgagggga caaggtcagt gatgcccccc ttcactcaca agcacttcag aggcatgcag 2460
agagaaggga cactcggcca gctctctgag gtaatcagtg caaggaggag tccgtttttt 2520
gccagcaaac ctcagcagga tcacactgga acagaacctg gtcatacctg tgacaacaca 2580
gctgtgagcc agggcaaacc acccactgtc actggctcga gagtctgggc agaggctctg 2640
accctccacc ctttaaactg gatgccgggg cctggctggg cccaatgcca agtggttatg 2700
gcaaccctga ctatctggtc ttaacatgta gctcaggaag tggaggcgct aatgtcccca 2760
atccctgggg attcctgatt ccagctattc atgtaagcag agccaacctg cctatttctg 2820
taggtgcgac tgggatgtta ggagcacagc aaggacccag ctctgtaggg ctggtgacct 2880
gatacttctc ataatggcat ctagaagtta ggctgagttg gcctcactgg cccagcaaac 2940
cagaacttgt ctttgtccgg gccatgttct tgggctgtct tctaattcca aagggttggt 3000
tggtaaagct ccaccccctt ctcctctgcc taaagacatc acatgtgtat acacacacgg 3060
gtgtatagat gagttaaaag aatgtcctcg ctggcatcct aattttgtct taagtttttt 3120
tggagggaga aaggaacaag gcaagggaag atgtgtagct ttggctttaa ccaggcagcc 3180
tgggggctcc caagcctatg gaaccctggt acaaagaaga gaacagaagc gccctgtgag 3240
gagtgggatt tgtttttctg tagaccagat gagaaggaaa caggccctgt tttgtacata 3300
gttgcaactt aaaatttttg gcttgcaaaa tatttttgta ataaagattt ctgggtaaca 3360
ataaaaaaaa aaaaaaa 3377
<210> 10
<211> 291
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 10
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys
20 25 30
Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Asp Asn Asn Ala Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val
145 150 155 160
Gly Val Ala Cys Ala Leu Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr
165 170 175
Leu Leu Arg Ile Lys Gln Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr
180 185 190
Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Ile Gln
195 200 205
Asp Thr Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro
210 215 220
Lys Glu Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr
225 230 235 240
Glu Tyr Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr
245 250 255
Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro
260 265 270
Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val
275 280 285
Gln Arg Lys
290
<210> 11
<211> 4043
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 11
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
cccgccggcc tggcccggcg tcacgctccc ggagtctccc cgctcggcgg cgtctcattg 300
tgggaggggg tcagatcacc ccgccgggcg gtggcgctgg ggggcagcgg agggggaggg 360
gccttagtcg ttcgcccgcg ccgcccgccc gcctgccgag cgcgctcacc gccgctctcc 420
ctccttgctc tgcagccgcg gcccatggag cccgccggcc cggcccctgg ccgcctaggg 480
ccgctgctgc tctgcctgct gctctccgcg tcctgtttct gtacaggagc cacggggaag 540
gaactgaagg tgactcagcc tgagaaatca gtgtctgttg ctgctgggga ttcgaccgtt 600
ctgaactgca ctttgacctc cttgttgccg gtgggaccca ttaggtggta cagaggagta 660
gggccaagcc ggctgttgat ctacagtttc gcaggagaat acgttcctcg aattagaaat 720
gtttcagata ctactaagag aaacaatatg gacttttcca tccgtatcag taatgtcacc 780
ccagcagatg ctggcatcta ctactgtgtg aagttccaga aaggatcatc agagcctgac 840
acagaaatac aatctggagg gggaacagag gtctatgtac tcgccaaacc ttctccaccg 900
gaggtatccg gcccagcaga caggggcata cctgaccaga aagtgaactt cacctgcaag 960
tctcatggct tctctccccg gaatatcacc ctgaagtggt tcaaagatgg gcaagaactc 1020
caccccttgg agaccaccgt gaaccctagt ggaaagaatg tctcctacaa catctccagc 1080
acagtcaggg tggtactaaa ctccatggat gttaattcta aggtcatctg cgaggtagcc 1140
cacatcacct tggatagaag ccctcttcgt gggattgcta acctgtctaa cttcatccga 1200
gtttcaccca ccgtgaaggt cacccaacag tccccgacgt caatgaacca ggtgaacctc 1260
acctgccggg ctgagaggtt ctaccccgag gatctccagc tgatctggct ggagaatgga 1320
aacgtatcac ggaatgacac gcccaagaat ctcacaaaga acacggatgg gacctataat 1380
tacacaagct tgttcctggt gaactcatct gctcatagag aggacgtggt gttcacgtgc 1440
caggtgaagc acgaccaaca gccagcgatc acccgaaacc ataccgtgct gggatttgcc 1500
cactcgagtg atcaagggag catgcaaacc ttccctgata ataatgctac ccacaactgg 1560
aatgtcttca tcggtgtggg cgtggcgtgt gctttgctcg tagtcctgct gatggctgct 1620
ctctacctcc tccggatcaa acagaagaaa gccaaggggt caacatcttc cacacggttg 1680
cacgagcccg agaagaacgc cagggaaata acccaggtac agtctttgat ccaggacaca 1740
aatgacatca acgacatcac atacgcagac ctgaatctgc ccaaagagaa gaagcccgca 1800
ccccgggccc ctgagcctaa caaccacaca gaatatgcaa gcattgagac aggcaaagtg 1860
cctaggccag aggataccct cacctatgct gacctggaca tggtccacct cagccgggca 1920
cagccagccc ccaagcctga gccatctttc tcagagtatg ctagtgtcca ggtccagagg 1980
aagtgaatgg ggctgtggtc tgtactaggc cccatcccca caagttttct tgtcctacat 2040
ggagtggcca tgacgaggac atccagccag ccaatcctgt ccccagaagg ccaggtggca 2100
cgggtcctag gaccaggggt aagggtggcc tttgtcttcc ctccgtggct cttcaacacc 2160
tcttgggcac ccacgtcccc ttcttccgga ggctgggtgt tgcagaacca gagggcgaac 2220
tggagaaagc tgcctggaat ccaagaagtg ttgtgcctcg gcccatcact cgtgggtctg 2280
gatcctggtc ttggcaaccc caggttgcgt ccttgatgtt ccagagcttg gtcttctgtg 2340
tggagaagag ctcaccatct ctacccaact tgagctttgg gaccagactc cctttagatc 2400
aaaccgcccc atctgtggaa gaactacacc agaagtcagc aagttttcag ccaacagtgc 2460
tggcctcccc acctcccagg ctgactagcc ctggggagaa ggaaccctct cctcctagac 2520
cagcagagac tccctgggca tgttcagtgt ggccccacct cccttccagt cccagcttgc 2580
ttcctccagc tagcactaac tcagcagcat cgctctgtgg acgcctgtaa attattgaga 2640
aatgtgaact gtgcagtctt aaagctaagg tgttagaaaa tttgatttat gctgtttagt 2700
tgttgttggg tttcttttct ttttaatttc tttttctttt ttgatttttt ttctttccct 2760
taaaacaaca gcagcagcat cttggctctt tgtcatgtgt tgaatggttg ggtcttgtga 2820
agtctgaggt ctaacagttt attgtcctgg aaggattttc ttacagcaga aacagatttt 2880
tttcaaattc ccagaatcct gaggaccaag aaggatccct cagctgctac ttccagcacc 2940
cagcgtcact gggacgaacc aggccctgtt cttacaaggc cacatggctg gccctttgcc 3000
tccatggcta ctgtggtaag tgcagccttg tctgacccaa tgctgaccta atgttggcca 3060
ttccacattg aggggacaag gtcagtgatg ccccccttca ctcacaagca cttcagaggc 3120
atgcagagag aagggacact cggccagctc tctgaggtaa tcagtgcaag gaggagtccg 3180
ttttttgcca gcaaacctca gcaggatcac actggaacag aacctggtca tacctgtgac 3240
aacacagctg tgagccaggg caaaccaccc actgtcactg gctcgagagt ctgggcagag 3300
gctctgaccc tccacccttt aaactggatg ccggggcctg gctgggccca atgccaagtg 3360
gttatggcaa ccctgactat ctggtcttaa catgtagctc aggaagtgga ggcgctaatg 3420
tccccaatcc ctggggattc ctgattccag ctattcatgt aagcagagcc aacctgccta 3480
tttctgtagg tgcgactggg atgttaggag cacagcaagg acccagctct gtagggctgg 3540
tgacctgata cttctcataa tggcatctag aagttaggct gagttggcct cactggccca 3600
gcaaaccaga acttgtcttt gtccgggcca tgttcttggg ctgtcttcta attccaaagg 3660
gttggttggt aaagctccac ccccttctcc tctgcctaaa gacatcacat gtgtatacac 3720
acacgggtgt atagatgagt taaaagaatg tcctcgctgg catcctaatt ttgtcttaag 3780
tttttttgga gggagaaagg aacaaggcaa gggaagatgt gtagctttgg ctttaaccag 3840
gcagcctggg ggctcccaag cctatggaac cctggtacaa agaagagaac agaagcgccc 3900
tgtgaggagt gggatttgtt tttctgtaga ccagatgaga aggaaacagg ccctgttttg 3960
tacatagttg caacttaaaa tttttggctt gcaaaatatt tttgtaataa agatttctgg 4020
gtaacaataa aaaaaaaaaa aaa 4043
<210> 12
<211> 513
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 12
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys
20 25 30
Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe
165 170 175
Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu
180 185 190
His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn
210 215 220
Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro
225 230 235 240
Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr
245 250 255
Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu
260 265 270
Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp
275 280 285
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn
305 310 315 320
Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His
325 330 335
Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala
340 345 350
His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn Ala
355 360 365
Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu
370 375 380
Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln Ser Leu Ile Gln Asp Thr
420 425 430
Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu
435 440 445
Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr
450 455 460
Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr
465 470 475 480
Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro
485 490 495
Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg
500 505 510
Lys
<210> 13
<211> 3845
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 13
aagctcccct gccgcgggca gcctcttgcc cactggagtc taaggactgg ccgggtgaga 60
ggccgagacc agggggcgat cggccgccac ttccccagtc caccttaaga ggaccaagta 120
gccagcccgc cgcgccgacc tcagaaaaac aagtttgcgc aaagtggtgc gcggccagcc 180
tctgggcaga gggagcggtg cttccaccgc ctggcagccc tgcgcgcggc ggcgcagccg 240
cggcccatgg agcccgccgg cccggcccct ggccgcctag ggccgctgct gctctgcctg 300
ctgctctccg cgtcctgttt ctgtacagga gccacgggga aggaactgaa ggtgactcag 360
cctgagaaat cagtgtctgt tgctgctggg gattcgaccg ttctgaactg cactttgacc 420
tccttgttgc cggtgggacc cattaggtgg tacagaggag tagggccaag ccggctgttg 480
atctacagtt tcgcaggaga atacgttcct cgaattagaa atgtttcaga tactactaag 540
agaaacaata tggacttttc catccgtatc agtaatgtca ccccagcaga tgctggcatc 600
tactactgtg tgaagttcca gaaaggatca tcagagcctg acacagaaat acaatctgga 660
gggggaacag aggtctatgt actcgccaaa ccttctccac cggaggtatc cggcccagca 720
gacaggggca tacctgacca gaaagtgaac ttcacctgca agtctcatgg cttctctccc 780
cggaatatca ccctgaagtg gttcaaagat gggcaagaac tccacccctt ggagaccacc 840
gtgaacccta gtggaaagaa tgtctcctac aacatctcca gcacagtcag ggtggtacta 900
aactccatgg atgttaattc taaggtcatc tgcgaggtag cccacatcac cttggataga 960
agccctcttc gtgggattgc taacctgtct aacttcatcc gagtttcacc caccgtgaag 1020
gtcacccaac agtccccgac gtcaatgaac caggtgaacc tcacctgccg ggctgagagg 1080
ttctaccccg aggatctcca gctgatctgg ctggagaatg gaaacgtatc acggaatgac 1140
acgcccaaga atctcacaaa gaacacggat gggacctata attacacaag cttgttcctg 1200
gtgaactcat ctgctcatag agaggacgtg gtgttcacgt gccaggtgaa gcacgaccaa 1260
cagccagcga tcacccgaaa ccataccgtg ctgggatttg cccactcgag tgatcaaggg 1320
agcatgcaaa ccttccctga taataatgct acccacaact ggaatgtctt catcggtgtg 1380
ggcgtggcgt gtgctttgct cgtagtcctg ctgatggctg ctctctacct cctccggatc 1440
aaacagaaga aagccaaggg gtcaacatct tccacacggt tgcacgagcc cgagaagaac 1500
gccagggaaa taacccaggt acagtctttg atccaggaca caaatgacat caacgacatc 1560
acatacgcag acctgaatct gcccaaagag aagaagcccg caccccgggc ccctgagcct 1620
aacaaccaca cagaatatgc aagcattgag acaggcaaag tgcctaggcc agaggatacc 1680
ctcacctatg ctgacctgga catggtccac ctcagccggg cacagccagc ccccaagcct 1740
gagccatctt tctcagagta tgctagtgtc caggtccaga ggaagtgaat ggggctgtgg 1800
tctgtactag gccccatccc cacaagtttt cttgtcctac atggagtggc catgacgagg 1860
acatccagcc agccaatcct gtccccagaa ggccaggtgg cacgggtcct aggaccaggg 1920
gtaagggtgg cctttgtctt ccctccgtgg ctcttcaaca cctcttgggc acccacgtcc 1980
ccttcttccg gaggctgggt gttgcagaac cagagggcga actggagaaa gctgcctgga 2040
atccaagaag tgttgtgcct cggcccatca ctcgtgggtc tggatcctgg tcttggcaac 2100
cccaggttgc gtccttgatg ttccagagct tggtcttctg tgtggagaag agctcaccat 2160
ctctacccaa cttgagcttt gggaccagac tccctttaga tcaaaccgcc ccatctgtgg 2220
aagaactaca ccagaagtca gcaagttttc agccaacagt gctggcctcc ccacctccca 2280
ggctgactag ccctggggag aaggaaccct ctcctcctag accagcagag actccctggg 2340
catgttcagt gtggccccac ctcccttcca gtcccagctt gcttcctcca gctagcacta 2400
actcagcagc atcgctctgt ggacgcctgt aaattattga gaaatgtgaa ctgtgcagtc 2460
ttaaagctaa ggtgttagaa aatttgattt atgctgttta gttgttgttg ggtttctttt 2520
ctttttaatt tctttttctt ttttgatttt ttttctttcc cttaaaacaa cagcagcagc 2580
atcttggctc tttgtcatgt gttgaatggt tgggtcttgt gaagtctgag gtctaacagt 2640
ttattgtcct ggaaggattt tcttacagca gaaacagatt tttttcaaat tcccagaatc 2700
ctgaggacca agaaggatcc ctcagctgct acttccagca cccagcgtca ctgggacgaa 2760
ccaggccctg ttcttacaag gccacatggc tggccctttg cctccatggc tactgtggta 2820
agtgcagcct tgtctgaccc aatgctgacc taatgttggc cattccacat tgaggggaca 2880
aggtcagtga tgcccccctt cactcacaag cacttcagag gcatgcagag agaagggaca 2940
ctcggccagc tctctgaggt aatcagtgca aggaggagtc cgttttttgc cagcaaacct 3000
cagcaggatc acactggaac agaacctggt catacctgtg acaacacagc tgtgagccag 3060
ggcaaaccac ccactgtcac tggctcgaga gtctgggcag aggctctgac cctccaccct 3120
ttaaactgga tgccggggcc tggctgggcc caatgccaag tggttatggc aaccctgact 3180
atctggtctt aacatgtagc tcaggaagtg gaggcgctaa tgtccccaat ccctggggat 3240
tcctgattcc agctattcat gtaagcagag ccaacctgcc tatttctgta ggtgcgactg 3300
ggatgttagg agcacagcaa ggacccagct ctgtagggct ggtgacctga tacttctcat 3360
aatggcatct agaagttagg ctgagttggc ctcactggcc cagcaaacca gaacttgtct 3420
ttgtccgggc catgttcttg ggctgtcttc taattccaaa gggttggttg gtaaagctcc 3480
acccccttct cctctgccta aagacatcac atgtgtatac acacacgggt gtatagatga 3540
gttaaaagaa tgtcctcgct ggcatcctaa ttttgtctta agtttttttg gagggagaaa 3600
ggaacaaggc aagggaagat gtgtagcttt ggctttaacc aggcagcctg ggggctccca 3660
agcctatgga accctggtac aaagaagaga acagaagcgc cctgtgagga gtgggatttg 3720
tttttctgta gaccagatga gaaggaaaca ggccctgttt tgtacatagt tgcaacttaa 3780
aatttttggc ttgcaaaata tttttgtaat aaagatttct gggtaacaat aaaaaaaaaa 3840
aaaaa 3845
<210> 14
<211> 513
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 14
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys
20 25 30
Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe
165 170 175
Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu
180 185 190
His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn
210 215 220
Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro
225 230 235 240
Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr
245 250 255
Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu
260 265 270
Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp
275 280 285
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn
305 310 315 320
Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His
325 330 335
Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala
340 345 350
His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn Ala
355 360 365
Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu
370 375 380
Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln Ser Leu Ile Gln Asp Thr
420 425 430
Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu
435 440 445
Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr
450 455 460
Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr
465 470 475 480
Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro
485 490 495
Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg
500 505 510
Lys
<210> 15
<211> 3389
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 15
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
cccgccggcc tggcccggcg tcacgctccc ggagtctccc cgctcggcgg cgtctcattg 300
tgggaggggg tcagatcacc ccgccgggcg gtggcgctgg ggggcagcgg agggggaggg 360
gccttagtcg ttcgcccgcg ccgcccgccc gcctgccgag cgcgctcacc gccgctctcc 420
ctccttgctc tgcagccgcg gcccatggag cccgccggcc cggcccctgg ccgcctaggg 480
ccgctgctgc tctgcctgct gctctccgcg tcctgtttct gtacaggagc cacggggaag 540
gaactgaagg tgactcagcc tgagaaatca gtgtctgttg ctgctgggga ttcgaccgtt 600
ctgaactgca ctttgacctc cttgttgccg gtgggaccca ttaggtggta cagaggagta 660
gggccaagcc ggctgttgat ctacagtttc gcaggagaat acgttcctcg aattagaaat 720
gtttcagata ctactaagag aaacaatatg gacttttcca tccgtatcag taatgtcacc 780
ccagcagatg ctggcatcta ctactgtgtg aagttccaga aaggatcatc agagcctgac 840
acagaaatac aatctggagg gggaacagag gtctatgtac tcgataataa tgctacccac 900
aactggaatg tcttcatcgg tgtgggcgtg gcgtgtgctt tgctcgtagt cctgctgatg 960
gctgctctct acctcctccg gatcaaacag aagaaagcca aggggtcaac atcttccaca 1020
cggttgcacg agcccgagaa gaacgccagg gaaataaccc aggtacagtc tttgatccag 1080
gacacaaatg acatcaacga catcacatac gcagacctga atctgcccaa agagaagaag 1140
cccgcacccc gggcccctga gcctaacaac cacacagaat atgcaagcat tgagacaggc 1200
aaagtgccta ggccagagga taccctcacc tatgctgacc tggacatggt ccacctcagc 1260
cgggcacagc cagcccccaa gcctgagcca tctttctcag agtatgctag tgtccaggtc 1320
cagaggaagt gaatggggct gtggtctgta ctaggcccca tccccacaag ttttcttgtc 1380
ctacatggag tggccatgac gaggacatcc agccagccaa tcctgtcccc agaaggccag 1440
gtggcacggg tcctaggacc aggggtaagg gtggcctttg tcttccctcc gtggctcttc 1500
aacacctctt gggcacccac gtccccttct tccggaggct gggtgttgca gaaccagagg 1560
gcgaactgga gaaagctgcc tggaatccaa gaagtgttgt gcctcggccc atcactcgtg 1620
ggtctggatc ctggtcttgg caaccccagg ttgcgtcctt gatgttccag agcttggtct 1680
tctgtgtgga gaagagctca ccatctctac ccaacttgag ctttgggacc agactccctt 1740
tagatcaaac cgccccatct gtggaagaac tacaccagaa gtcagcaagt tttcagccaa 1800
cagtgctggc ctccccacct cccaggctga ctagccctgg ggagaaggaa ccctctcctc 1860
ctagaccagc agagactccc tgggcatgtt cagtgtggcc ccacctccct tccagtccca 1920
gcttgcttcc tccagctagc actaactcag cagcatcgct ctgtggacgc ctgtaaatta 1980
ttgagaaatg tgaactgtgc agtcttaaag ctaaggtgtt agaaaatttg atttatgctg 2040
tttagttgtt gttgggtttc ttttcttttt aatttctttt tcttttttga ttttttttct 2100
ttcccttaaa acaacagcag cagcatcttg gctctttgtc atgtgttgaa tggttgggtc 2160
ttgtgaagtc tgaggtctaa cagtttattg tcctggaagg attttcttac agcagaaaca 2220
gatttttttc aaattcccag aatcctgagg accaagaagg atccctcagc tgctacttcc 2280
agcacccagc gtcactggga cgaaccaggc cctgttctta caaggccaca tggctggccc 2340
tttgcctcca tggctactgt ggtaagtgca gccttgtctg acccaatgct gacctaatgt 2400
tggccattcc acattgaggg gacaaggtca gtgatgcccc ccttcactca caagcacttc 2460
agaggcatgc agagagaagg gacactcggc cagctctctg aggtaatcag tgcaaggagg 2520
agtccgtttt ttgccagcaa acctcagcag gatcacactg gaacagaacc tggtcatacc 2580
tgtgacaaca cagctgtgag ccagggcaaa ccacccactg tcactggctc gagagtctgg 2640
gcagaggctc tgaccctcca ccctttaaac tggatgccgg ggcctggctg ggcccaatgc 2700
caagtggtta tggcaaccct gactatctgg tcttaacatg tagctcagga agtggaggcg 2760
ctaatgtccc caatccctgg ggattcctga ttccagctat tcatgtaagc agagccaacc 2820
tgcctatttc tgtaggtgcg actgggatgt taggagcaca gcaaggaccc agctctgtag 2880
ggctggtgac ctgatacttc tcataatggc atctagaagt taggctgagt tggcctcact 2940
ggcccagcaa accagaactt gtctttgtcc gggccatgtt cttgggctgt cttctaattc 3000
caaagggttg gttggtaaag ctccaccccc ttctcctctg cctaaagaca tcacatgtgt 3060
atacacacac gggtgtatag atgagttaaa agaatgtcct cgctggcatc ctaattttgt 3120
cttaagtttt tttggaggga gaaaggaaca aggcaaggga agatgtgtag ctttggcttt 3180
aaccaggcag cctgggggct cccaagccta tggaaccctg gtacaaagaa gagaacagaa 3240
gcgccctgtg aggagtggga tttgtttttc tgtagaccag atgagaagga aacaggccct 3300
gttttgtaca tagttgcaac ttaaaatttt tggcttgcaa aatatttttg taataaagat 3360
ttctgggtaa caataaaaaa aaaaaaaaa 3389
<210> 16
<211> 295
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 16
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys
20 25 30
Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Asp Asn Asn Ala Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val
145 150 155 160
Gly Val Ala Cys Ala Leu Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr
165 170 175
Leu Leu Arg Ile Lys Gln Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr
180 185 190
Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln
195 200 205
Ser Leu Ile Gln Asp Thr Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp
210 215 220
Leu Asn Leu Pro Lys Glu Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro
225 230 235 240
Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg
245 250 255
Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser
260 265 270
Arg Ala Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala
275 280 285
Ser Val Gln Val Gln Arg Lys
290 295
<210> 17
<211> 876
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
atggagcccg ccggcccggc ccctggccgc ctagggccgc tgctgctctg cctgctgctc 60
tccgcgtcct gtttctgtac aggagccacg ggggaggagg agctgcaggt gattcagcct 120
gacaagtccg tgttggttgc agctggagag acagccactc tgcgctgcac tgcgacctct 180
ctgatccctg tggggcccat ccagtggttc agaggagctg gaccaggccg ggaattaatc 240
tacaatcaaa aagaaggcca cttcccccgg gtaacaactg tttcagacct cacaaagaga 300
aacaacatgg acttttccat ccgcatcggt aacatcaccc cagcagatgc cggcacctac 360
tactgtgtga agttccggaa agggagcccc gatgacgtgg agtttaagtc tggagcagga 420
acagaggtct atgtactcga taataatgct acccacaact ggaatgtctt catcggtgtg 480
ggcgtggcgt gtgctttgct cgtagtcctg ctgatggctg ctctctacct cctccggatc 540
aaacagaaga aagccaaggg gtcaacatct tccacacggt tgcacgagcc cgagaagaac 600
gccagggaaa taacccagat ccaggacaca aatgacatca acgacatcac atacgcagac 660
ctgaatctgc ccaaagagaa gaagcccgca ccccgggccc ctgagcctaa caaccacaca 720
gaatatgcaa gcattgagac aggcaaagtg cctaggccag aggataccct cacctatgct 780
gacctggaca tggtccacct cagccgggca cagccagccc ccaagcctga gccatctttc 840
tcagagtatg ctagtgtcca ggtccagagg aagtga 876
<210> 18
<211> 1540
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
atggagcccg ccggcccggc ccctggccgc ctagggccgc tgctgctctg cctgctgctc 60
tccgcgtcct gtttctgtac aggagccacg ggggaggagg agctgcaggt gattcagcct 120
gacaagtccg tgttggttgc agctggagag acagccactc tgcgctgcac tgcgacctct 180
ctgatccctg tggggcccat ccagtggttc agaggagctg gaccaggccg ggaattaatc 240
tacaatcaaa aagaaggcca cttcccccgg gtaacaactg tttcagacct cacaaagaga 300
aacaacatgg acttttccat ccgcatcggt aacatcaccc cagcagatgc cggcacctac 360
tactgtgtga agttccggaa agggagcccc gatgacgtgg agtttaagtc tggagcagga 420
acagaggtct atgtactcgc caaaccttct ccaccggagg tatccggccc agcagacagg 480
ggcatacctg accagaaagt gaacttcacc tgcaagtctc atggcttctc tccccggaat 540
atcaccctga agtggttcaa agatgggcaa gaactccacc ccttggagac caccgtgaac 600
cctagtggaa agaatgtctc ctacaacatc tccagcacag tcagggtggt actaaactcc 660
atggatgtta attctaaggt catctgcgag gtagcccaca tcaccttgga tagaagccct 720
cttcgtggga ttgctaacct gtctaacttc atccgagttt cacccaccgt gaaggtcacc 780
caacagtccc cgacgtcaat gaaccaggtg aacctcacct gccgggctga gaggttctac 840
cccgaggatc tccagctgat ctggctggag aatggaaacg tatcacggaa tgacacgccc 900
aagaatctca caaagaacac ggatgggacc tataattaca caagcttgtt cctggtgaac 960
tcatctgctc atagagagga cgtggtgttc acgtgccagg tgaagcacga ccaacagcca 1020
gcgatcaccc gaaaccatac cgtgctggga tttgcccact cgagtgatca agggagcatg 1080
caaaccttcc ctgataataa tgctacccac aactggaatg tcttcatcgg tgtgggcgtg 1140
gcgtgtgctt tgctcgtagt cctgctgatg gctgctctct acctcctccg gatcaaacag 1200
aagaaagcca aggggtcaac atcttccaca cggttgcacg agcccgagaa gaacgccagg 1260
gaaataaccc aggtacagtc tttgatccag gacacaaatg acatcaacga catcacatac 1320
gcagacctga atctgcccaa agagaagaag cccgcacccc gggcccctga gcctaacaac 1380
cacacagaat atgcaagcat tgagacaggc aaagtgccta ggccagagga taccctcacc 1440
tatgctgacc tggacatggt ccacctcagc cgggcacagc cagcccccaa gcctgagcca 1500
tctttctcag agtatgctag tgtccaggtc cagaggaagt 1540
<210> 19
<211> 1540
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atggagcccg ccggcccggc ccctggccgc ctagggccgc tgctgctctg cctgctgctc 60
tccgcgtcct gtttctgtac aggagccacg ggggaggagg agctgcaggt gattcagcct 120
gacaagtccg tgttggttgc agctggagag acagccactc tgcgctgcac tgcgacctct 180
ctgatccctg tggggcccat ccagtggttc agaggagctg gaccaggccg ggaattaatc 240
tacaatcaaa aagaaggcca cttcccccgg gtaacaactg tttcagacct cacaaagaga 300
aacaacatgg acttttccat ccgcatcggt aacatcaccc cagcagatgc cggcacctac 360
tactgtgtga agttccggaa agggagcccc gatgacgtgg agtttaagtc tggagcagga 420
acagaggtct atgtactcgc caaaccttct ccaccggagg tatccggccc agcagacagg 480
ggcatacctg accagaaagt gaacttcacc tgcaagtctc atggcttctc tccccggaat 540
atcaccctga agtggttcaa agatgggcaa gaactccacc ccttggagac caccgtgaac 600
cctagtggaa agaatgtctc ctacaacatc tccagcacag tcagggtggt actaaactcc 660
atggatgtta attctaaggt catctgcgag gtagcccaca tcaccttgga tagaagccct 720
cttcgtggga ttgctaacct gtctaacttc atccgagttt cacccaccgt gaaggtcacc 780
caacagtccc cgacgtcaat gaaccaggtg aacctcacct gccgggctga gaggttctac 840
cccgaggatc tccagctgat ctggctggag aatggaaacg tatcacggaa tgacacgccc 900
aagaatctca caaagaacac ggatgggacc tataattaca caagcttgtt cctggtgaac 960
tcatctgctc atagagagga cgtggtgttc acgtgccagg tgaagcacga ccaacagcca 1020
gcgatcaccc gaaaccatac cgtgctggga tttgcccact cgagtgatca agggagcatg 1080
caaaccttcc ctgataataa tgctacccac aactggaatg tcttcatcgg tgtgggcgtg 1140
gcgtgtgctt tgctcgtagt cctgctgatg gctgctctct acctcctccg gatcaaacag 1200
aagaaagcca aggggtcaac atcttccaca cggttgcacg agcccgagaa gaacgccagg 1260
gaaataaccc aggtacagtc tttgatccag gacacaaatg acatcaacga catcacatac 1320
gcagacctga atctgcccaa agagaagaag cccgcacccc gggcccctga gcctaacaac 1380
cacacagaat atgcaagcat tgagacaggc aaagtgccta ggccagagga taccctcacc 1440
tatgctgacc tggacatggt ccacctcagc cgggcacagc cagcccccaa gcctgagcca 1500
tctttctcag agtatgctag tgtccaggtc cagaggaagt 1540
<210> 20
<211> 888
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
atggagcccg ccggcccggc ccctggccgc ctagggccgc tgctgctctg cctgctgctc 60
tccgcgtcct gtttctgtac aggagccacg ggggaggagg agctgcaggt gattcagcct 120
gacaagtccg tgttggttgc agctggagag acagccactc tgcgctgcac tgcgacctct 180
ctgatccctg tggggcccat ccagtggttc agaggagctg gaccaggccg ggaattaatc 240
tacaatcaaa aagaaggcca cttcccccgg gtaacaactg tttcagacct cacaaagaga 300
aacaacatgg acttttccat ccgcatcggt aacatcaccc cagcagatgc cggcacctac 360
tactgtgtga agttccggaa agggagcccc gatgacgtgg agtttaagtc tggagcagga 420
acagaggtct atgtactcga taataatgct acccacaact ggaatgtctt catcggtgtg 480
ggcgtggcgt gtgctttgct cgtagtcctg ctgatggctg ctctctacct cctccggatc 540
aaacagaaga aagccaaggg gtcaacatct tccacacggt tgcacgagcc cgagaagaac 600
gccagggaaa taacccaggt acagtctttg atccaggaca caaatgacat caacgacatc 660
acatacgcag acctgaatct gcccaaagag aagaagcccg caccccgggc ccctgagcct 720
aacaaccaca cagaatatgc aagcattgag acaggcaaag tgcctaggcc agaggatacc 780
ctcacctatg ctgacctgga catggtccac ctcagccggg cacagccagc ccccaagcct 840
gagccatctt tctcagagta tgctagtgtc caggtccaga ggaagtga 888
<210> 21
<211> 3377
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
cccgccggcc tggcccggcg tcacgctccc ggagtctccc cgctcggcgg cgtctcattg 300
tgggaggggg tcagatcacc ccgccgggcg gtggcgctgg ggggcagcgg agggggaggg 360
gccttagtcg ttcgcccgcg ccgcccgccc gcctgccgag cgcgctcacc gccgctctcc 420
ctccttgctc tgcagccgcg gcccatggag cccgccggcc cggcccctgg ccgcctaggg 480
ccgctgctgc tctgcctgct gctctccgcg tcctgtttct gtacaggagc cacgggggag 540
gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtgttgg ttgcagctgg agagacagcc 600
actctgcgct gcactgcgac ctctctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 660
gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 720
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 780
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 840
gtggagttta agtctggagc aggaacagag gtctatgtac tcgataataa tgctacccac 900
aactggaatg tcttcatcgg tgtgggcgtg gcgtgtgctt tgctcgtagt cctgctgatg 960
gctgctctct acctcctccg gatcaaacag aagaaagcca aggggtcaac atcttccaca 1020
cggttgcacg agcccgagaa gaacgccagg gaaataaccc agatccagga cacaaatgac 1080
atcaacgaca tcacatacgc agacctgaat ctgcccaaag agaagaagcc cgcaccccgg 1140
gcccctgagc ctaacaacca cacagaatat gcaagcattg agacaggcaa agtgcctagg 1200
ccagaggata ccctcaccta tgctgacctg gacatggtcc acctcagccg ggcacagcca 1260
gcccccaagc ctgagccatc tttctcagag tatgctagtg tccaggtcca gaggaagtga 1320
atggggctgt ggtctgtact aggccccatc cccacaagtt ttcttgtcct acatggagtg 1380
gccatgacga ggacatccag ccagccaatc ctgtccccag aaggccaggt ggcacgggtc 1440
ctaggaccag gggtaagggt ggcctttgtc ttccctccgt ggctcttcaa cacctcttgg 1500
gcacccacgt ccccttcttc cggaggctgg gtgttgcaga accagagggc gaactggaga 1560
aagctgcctg gaatccaaga agtgttgtgc ctcggcccat cactcgtggg tctggatcct 1620
ggtcttggca accccaggtt gcgtccttga tgttccagag cttggtcttc tgtgtggaga 1680
agagctcacc atctctaccc aacttgagct ttgggaccag actcccttta gatcaaaccg 1740
ccccatctgt ggaagaacta caccagaagt cagcaagttt tcagccaaca gtgctggcct 1800
ccccacctcc caggctgact agccctgggg agaaggaacc ctctcctcct agaccagcag 1860
agactccctg ggcatgttca gtgtggcccc acctcccttc cagtcccagc ttgcttcctc 1920
cagctagcac taactcagca gcatcgctct gtggacgcct gtaaattatt gagaaatgtg 1980
aactgtgcag tcttaaagct aaggtgttag aaaatttgat ttatgctgtt tagttgttgt 2040
tgggtttctt ttctttttaa tttctttttc ttttttgatt ttttttcttt cccttaaaac 2100
aacagcagca gcatcttggc tctttgtcat gtgttgaatg gttgggtctt gtgaagtctg 2160
aggtctaaca gtttattgtc ctggaaggat tttcttacag cagaaacaga tttttttcaa 2220
attcccagaa tcctgaggac caagaaggat ccctcagctg ctacttccag cacccagcgt 2280
cactgggacg aaccaggccc tgttcttaca aggccacatg gctggccctt tgcctccatg 2340
gctactgtgg taagtgcagc cttgtctgac ccaatgctga cctaatgttg gccattccac 2400
attgagggga caaggtcagt gatgcccccc ttcactcaca agcacttcag aggcatgcag 2460
agagaaggga cactcggcca gctctctgag gtaatcagtg caaggaggag tccgtttttt 2520
gccagcaaac ctcagcagga tcacactgga acagaacctg gtcatacctg tgacaacaca 2580
gctgtgagcc agggcaaacc acccactgtc actggctcga gagtctgggc agaggctctg 2640
accctccacc ctttaaactg gatgccgggg cctggctggg cccaatgcca agtggttatg 2700
gcaaccctga ctatctggtc ttaacatgta gctcaggaag tggaggcgct aatgtcccca 2760
atccctgggg attcctgatt ccagctattc atgtaagcag agccaacctg cctatttctg 2820
taggtgcgac tgggatgtta ggagcacagc aaggacccag ctctgtaggg ctggtgacct 2880
gatacttctc ataatggcat ctagaagtta ggctgagttg gcctcactgg cccagcaaac 2940
cagaacttgt ctttgtccgg gccatgttct tgggctgtct tctaattcca aagggttggt 3000
tggtaaagct ccaccccctt ctcctctgcc taaagacatc acatgtgtat acacacacgg 3060
gtgtatagat gagttaaaag aatgtcctcg ctggcatcct aattttgtct taagtttttt 3120
tggagggaga aaggaacaag gcaagggaag atgtgtagct ttggctttaa ccaggcagcc 3180
tgggggctcc caagcctatg gaaccctggt acaaagaaga gaacagaagc gccctgtgag 3240
gagtgggatt tgtttttctg tagaccagat gagaaggaaa caggccctgt tttgtacata 3300
gttgcaactt aaaatttttg gcttgcaaaa tatttttgta ataaagattt ctgggtaaca 3360
ataaaaaaaa aaaaaaa 3377
<210> 22
<211> 4043
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
cccgccggcc tggcccggcg tcacgctccc ggagtctccc cgctcggcgg cgtctcattg 300
tgggaggggg tcagatcacc ccgccgggcg gtggcgctgg ggggcagcgg agggggaggg 360
gccttagtcg ttcgcccgcg ccgcccgccc gcctgccgag cgcgctcacc gccgctctcc 420
ctccttgctc tgcagccgcg gcccatggag cccgccggcc cggcccctgg ccgcctaggg 480
ccgctgctgc tctgcctgct gctctccgcg tcctgtttct gtacaggagc cacgggggag 540
gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtgttgg ttgcagctgg agagacagcc 600
actctgcgct gcactgcgac ctctctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 660
gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 720
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 780
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 840
gtggagttta agtctggagc aggaacagag gtctatgtac tcgccaaacc ttctccaccg 900
gaggtatccg gcccagcaga caggggcata cctgaccaga aagtgaactt cacctgcaag 960
tctcatggct tctctccccg gaatatcacc ctgaagtggt tcaaagatgg gcaagaactc 1020
caccccttgg agaccaccgt gaaccctagt ggaaagaatg tctcctacaa catctccagc 1080
acagtcaggg tggtactaaa ctccatggat gttaattcta aggtcatctg cgaggtagcc 1140
cacatcacct tggatagaag ccctcttcgt gggattgcta acctgtctaa cttcatccga 1200
gtttcaccca ccgtgaaggt cacccaacag tccccgacgt caatgaacca ggtgaacctc 1260
acctgccggg ctgagaggtt ctaccccgag gatctccagc tgatctggct ggagaatgga 1320
aacgtatcac ggaatgacac gcccaagaat ctcacaaaga acacggatgg gacctataat 1380
tacacaagct tgttcctggt gaactcatct gctcatagag aggacgtggt gttcacgtgc 1440
caggtgaagc acgaccaaca gccagcgatc acccgaaacc ataccgtgct gggatttgcc 1500
cactcgagtg atcaagggag catgcaaacc ttccctgata ataatgctac ccacaactgg 1560
aatgtcttca tcggtgtggg cgtggcgtgt gctttgctcg tagtcctgct gatggctgct 1620
ctctacctcc tccggatcaa acagaagaaa gccaaggggt caacatcttc cacacggttg 1680
cacgagcccg agaagaacgc cagggaaata acccaggtac agtctttgat ccaggacaca 1740
aatgacatca acgacatcac atacgcagac ctgaatctgc ccaaagagaa gaagcccgca 1800
ccccgggccc ctgagcctaa caaccacaca gaatatgcaa gcattgagac aggcaaagtg 1860
cctaggccag aggataccct cacctatgct gacctggaca tggtccacct cagccgggca 1920
cagccagccc ccaagcctga gccatctttc tcagagtatg ctagtgtcca ggtccagagg 1980
aagtgaatgg ggctgtggtc tgtactaggc cccatcccca caagttttct tgtcctacat 2040
ggagtggcca tgacgaggac atccagccag ccaatcctgt ccccagaagg ccaggtggca 2100
cgggtcctag gaccaggggt aagggtggcc tttgtcttcc ctccgtggct cttcaacacc 2160
tcttgggcac ccacgtcccc ttcttccgga ggctgggtgt tgcagaacca gagggcgaac 2220
tggagaaagc tgcctggaat ccaagaagtg ttgtgcctcg gcccatcact cgtgggtctg 2280
gatcctggtc ttggcaaccc caggttgcgt ccttgatgtt ccagagcttg gtcttctgtg 2340
tggagaagag ctcaccatct ctacccaact tgagctttgg gaccagactc cctttagatc 2400
aaaccgcccc atctgtggaa gaactacacc agaagtcagc aagttttcag ccaacagtgc 2460
tggcctcccc acctcccagg ctgactagcc ctggggagaa ggaaccctct cctcctagac 2520
cagcagagac tccctgggca tgttcagtgt ggccccacct cccttccagt cccagcttgc 2580
ttcctccagc tagcactaac tcagcagcat cgctctgtgg acgcctgtaa attattgaga 2640
aatgtgaact gtgcagtctt aaagctaagg tgttagaaaa tttgatttat gctgtttagt 2700
tgttgttggg tttcttttct ttttaatttc tttttctttt ttgatttttt ttctttccct 2760
taaaacaaca gcagcagcat cttggctctt tgtcatgtgt tgaatggttg ggtcttgtga 2820
agtctgaggt ctaacagttt attgtcctgg aaggattttc ttacagcaga aacagatttt 2880
tttcaaattc ccagaatcct gaggaccaag aaggatccct cagctgctac ttccagcacc 2940
cagcgtcact gggacgaacc aggccctgtt cttacaaggc cacatggctg gccctttgcc 3000
tccatggcta ctgtggtaag tgcagccttg tctgacccaa tgctgaccta atgttggcca 3060
ttccacattg aggggacaag gtcagtgatg ccccccttca ctcacaagca cttcagaggc 3120
atgcagagag aagggacact cggccagctc tctgaggtaa tcagtgcaag gaggagtccg 3180
ttttttgcca gcaaacctca gcaggatcac actggaacag aacctggtca tacctgtgac 3240
aacacagctg tgagccaggg caaaccaccc actgtcactg gctcgagagt ctgggcagag 3300
gctctgaccc tccacccttt aaactggatg ccggggcctg gctgggccca atgccaagtg 3360
gttatggcaa ccctgactat ctggtcttaa catgtagctc aggaagtgga ggcgctaatg 3420
tccccaatcc ctggggattc ctgattccag ctattcatgt aagcagagcc aacctgccta 3480
tttctgtagg tgcgactggg atgttaggag cacagcaagg acccagctct gtagggctgg 3540
tgacctgata cttctcataa tggcatctag aagttaggct gagttggcct cactggccca 3600
gcaaaccaga acttgtcttt gtccgggcca tgttcttggg ctgtcttcta attccaaagg 3660
gttggttggt aaagctccac ccccttctcc tctgcctaaa gacatcacat gtgtatacac 3720
acacgggtgt atagatgagt taaaagaatg tcctcgctgg catcctaatt ttgtcttaag 3780
tttttttgga gggagaaagg aacaaggcaa gggaagatgt gtagctttgg ctttaaccag 3840
gcagcctggg ggctcccaag cctatggaac cctggtacaa agaagagaac agaagcgccc 3900
tgtgaggagt gggatttgtt tttctgtaga ccagatgaga aggaaacagg ccctgttttg 3960
tacatagttg caacttaaaa tttttggctt gcaaaatatt tttgtaataa agatttctgg 4020
gtaacaataa aaaaaaaaaa aaa 4043
<210> 23
<211> 3845
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
aagctcccct gccgcgggca gcctcttgcc cactggagtc taaggactgg ccgggtgaga 60
ggccgagacc agggggcgat cggccgccac ttccccagtc caccttaaga ggaccaagta 120
gccagcccgc cgcgccgacc tcagaaaaac aagtttgcgc aaagtggtgc gcggccagcc 180
tctgggcaga gggagcggtg cttccaccgc ctggcagccc tgcgcgcggc ggcgcagccg 240
cggcccatgg agcccgccgg cccggcccct ggccgcctag ggccgctgct gctctgcctg 300
ctgctctccg cgtcctgttt ctgtacagga gccacggggg aggaggagct gcaggtgatt 360
cagcctgaca agtccgtgtt ggttgcagct ggagagacag ccactctgcg ctgcactgcg 420
acctctctga tccctgtggg gcccatccag tggttcagag gagctggacc aggccgggaa 480
ttaatctaca atcaaaaaga aggccacttc ccccgggtaa caactgtttc agacctcaca 540
aagagaaaca acatggactt ttccatccgc atcggtaaca tcaccccagc agatgccggc 600
acctactact gtgtgaagtt ccggaaaggg agccccgatg acgtggagtt taagtctgga 660
gcaggaacag aggtctatgt actcgccaaa ccttctccac cggaggtatc cggcccagca 720
gacaggggca tacctgacca gaaagtgaac ttcacctgca agtctcatgg cttctctccc 780
cggaatatca ccctgaagtg gttcaaagat gggcaagaac tccacccctt ggagaccacc 840
gtgaacccta gtggaaagaa tgtctcctac aacatctcca gcacagtcag ggtggtacta 900
aactccatgg atgttaattc taaggtcatc tgcgaggtag cccacatcac cttggataga 960
agccctcttc gtgggattgc taacctgtct aacttcatcc gagtttcacc caccgtgaag 1020
gtcacccaac agtccccgac gtcaatgaac caggtgaacc tcacctgccg ggctgagagg 1080
ttctaccccg aggatctcca gctgatctgg ctggagaatg gaaacgtatc acggaatgac 1140
acgcccaaga atctcacaaa gaacacggat gggacctata attacacaag cttgttcctg 1200
gtgaactcat ctgctcatag agaggacgtg gtgttcacgt gccaggtgaa gcacgaccaa 1260
cagccagcga tcacccgaaa ccataccgtg ctgggatttg cccactcgag tgatcaaggg 1320
agcatgcaaa ccttccctga taataatgct acccacaact ggaatgtctt catcggtgtg 1380
ggcgtggcgt gtgctttgct cgtagtcctg ctgatggctg ctctctacct cctccggatc 1440
aaacagaaga aagccaaggg gtcaacatct tccacacggt tgcacgagcc cgagaagaac 1500
gccagggaaa taacccaggt acagtctttg atccaggaca caaatgacat caacgacatc 1560
acatacgcag acctgaatct gcccaaagag aagaagcccg caccccgggc ccctgagcct 1620
aacaaccaca cagaatatgc aagcattgag acaggcaaag tgcctaggcc agaggatacc 1680
ctcacctatg ctgacctgga catggtccac ctcagccggg cacagccagc ccccaagcct 1740
gagccatctt tctcagagta tgctagtgtc caggtccaga ggaagtgaat ggggctgtgg 1800
tctgtactag gccccatccc cacaagtttt cttgtcctac atggagtggc catgacgagg 1860
acatccagcc agccaatcct gtccccagaa ggccaggtgg cacgggtcct aggaccaggg 1920
gtaagggtgg cctttgtctt ccctccgtgg ctcttcaaca cctcttgggc acccacgtcc 1980
ccttcttccg gaggctgggt gttgcagaac cagagggcga actggagaaa gctgcctgga 2040
atccaagaag tgttgtgcct cggcccatca ctcgtgggtc tggatcctgg tcttggcaac 2100
cccaggttgc gtccttgatg ttccagagct tggtcttctg tgtggagaag agctcaccat 2160
ctctacccaa cttgagcttt gggaccagac tccctttaga tcaaaccgcc ccatctgtgg 2220
aagaactaca ccagaagtca gcaagttttc agccaacagt gctggcctcc ccacctccca 2280
ggctgactag ccctggggag aaggaaccct ctcctcctag accagcagag actccctggg 2340
catgttcagt gtggccccac ctcccttcca gtcccagctt gcttcctcca gctagcacta 2400
actcagcagc atcgctctgt ggacgcctgt aaattattga gaaatgtgaa ctgtgcagtc 2460
ttaaagctaa ggtgttagaa aatttgattt atgctgttta gttgttgttg ggtttctttt 2520
ctttttaatt tctttttctt ttttgatttt ttttctttcc cttaaaacaa cagcagcagc 2580
atcttggctc tttgtcatgt gttgaatggt tgggtcttgt gaagtctgag gtctaacagt 2640
ttattgtcct ggaaggattt tcttacagca gaaacagatt tttttcaaat tcccagaatc 2700
ctgaggacca agaaggatcc ctcagctgct acttccagca cccagcgtca ctgggacgaa 2760
ccaggccctg ttcttacaag gccacatggc tggccctttg cctccatggc tactgtggta 2820
agtgcagcct tgtctgaccc aatgctgacc taatgttggc cattccacat tgaggggaca 2880
aggtcagtga tgcccccctt cactcacaag cacttcagag gcatgcagag agaagggaca 2940
ctcggccagc tctctgaggt aatcagtgca aggaggagtc cgttttttgc cagcaaacct 3000
cagcaggatc acactggaac agaacctggt catacctgtg acaacacagc tgtgagccag 3060
ggcaaaccac ccactgtcac tggctcgaga gtctgggcag aggctctgac cctccaccct 3120
ttaaactgga tgccggggcc tggctgggcc caatgccaag tggttatggc aaccctgact 3180
atctggtctt aacatgtagc tcaggaagtg gaggcgctaa tgtccccaat ccctggggat 3240
tcctgattcc agctattcat gtaagcagag ccaacctgcc tatttctgta ggtgcgactg 3300
ggatgttagg agcacagcaa ggacccagct ctgtagggct ggtgacctga tacttctcat 3360
aatggcatct agaagttagg ctgagttggc ctcactggcc cagcaaacca gaacttgtct 3420
ttgtccgggc catgttcttg ggctgtcttc taattccaaa gggttggttg gtaaagctcc 3480
acccccttct cctctgccta aagacatcac atgtgtatac acacacgggt gtatagatga 3540
gttaaaagaa tgtcctcgct ggcatcctaa ttttgtctta agtttttttg gagggagaaa 3600
ggaacaaggc aagggaagat gtgtagcttt ggctttaacc aggcagcctg ggggctccca 3660
agcctatgga accctggtac aaagaagaga acagaagcgc cctgtgagga gtgggatttg 3720
tttttctgta gaccagatga gaaggaaaca ggccctgttt tgtacatagt tgcaacttaa 3780
aatttttggc ttgcaaaata tttttgtaat aaagatttct gggtaacaat aaaaaaaaaa 3840
aaaaa 3845
<210> 24
<211> 3389
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
cccgccggcc tggcccggcg tcacgctccc ggagtctccc cgctcggcgg cgtctcattg 300
tgggaggggg tcagatcacc ccgccgggcg gtggcgctgg ggggcagcgg agggggaggg 360
gccttagtcg ttcgcccgcg ccgcccgccc gcctgccgag cgcgctcacc gccgctctcc 420
ctccttgctc tgcagccgcg gcccatggag cccgccggcc cggcccctgg ccgcctaggg 480
ccgctgctgc tctgcctgct gctctccgcg tcctgtttct gtacaggagc cacgggggag 540
gaggagctgc aggtgattca gcctgacaag tccgtgttgg ttgcagctgg agagacagcc 600
actctgcgct gcactgcgac ctctctgatc cctgtggggc ccatccagtg gttcagagga 660
gctggaccag gccgggaatt aatctacaat caaaaagaag gccacttccc ccgggtaaca 720
actgtttcag acctcacaaa gagaaacaac atggactttt ccatccgcat cggtaacatc 780
accccagcag atgccggcac ctactactgt gtgaagttcc ggaaagggag ccccgatgac 840
gtggagttta agtctggagc aggaacagag gtctatgtac tcgataataa tgctacccac 900
aactggaatg tcttcatcgg tgtgggcgtg gcgtgtgctt tgctcgtagt cctgctgatg 960
gctgctctct acctcctccg gatcaaacag aagaaagcca aggggtcaac atcttccaca 1020
cggttgcacg agcccgagaa gaacgccagg gaaataaccc aggtacagtc tttgatccag 1080
gacacaaatg acatcaacga catcacatac gcagacctga atctgcccaa agagaagaag 1140
cccgcacccc gggcccctga gcctaacaac cacacagaat atgcaagcat tgagacaggc 1200
aaagtgccta ggccagagga taccctcacc tatgctgacc tggacatggt ccacctcagc 1260
cgggcacagc cagcccccaa gcctgagcca tctttctcag agtatgctag tgtccaggtc 1320
cagaggaagt gaatggggct gtggtctgta ctaggcccca tccccacaag ttttcttgtc 1380
ctacatggag tggccatgac gaggacatcc agccagccaa tcctgtcccc agaaggccag 1440
gtggcacggg tcctaggacc aggggtaagg gtggcctttg tcttccctcc gtggctcttc 1500
aacacctctt gggcacccac gtccccttct tccggaggct gggtgttgca gaaccagagg 1560
gcgaactgga gaaagctgcc tggaatccaa gaagtgttgt gcctcggccc atcactcgtg 1620
ggtctggatc ctggtcttgg caaccccagg ttgcgtcctt gatgttccag agcttggtct 1680
tctgtgtgga gaagagctca ccatctctac ccaacttgag ctttgggacc agactccctt 1740
tagatcaaac cgccccatct gtggaagaac tacaccagaa gtcagcaagt tttcagccaa 1800
cagtgctggc ctccccacct cccaggctga ctagccctgg ggagaaggaa ccctctcctc 1860
ctagaccagc agagactccc tgggcatgtt cagtgtggcc ccacctccct tccagtccca 1920
gcttgcttcc tccagctagc actaactcag cagcatcgct ctgtggacgc ctgtaaatta 1980
ttgagaaatg tgaactgtgc agtcttaaag ctaaggtgtt agaaaatttg atttatgctg 2040
tttagttgtt gttgggtttc ttttcttttt aatttctttt tcttttttga ttttttttct 2100
ttcccttaaa acaacagcag cagcatcttg gctctttgtc atgtgttgaa tggttgggtc 2160
ttgtgaagtc tgaggtctaa cagtttattg tcctggaagg attttcttac agcagaaaca 2220
gatttttttc aaattcccag aatcctgagg accaagaagg atccctcagc tgctacttcc 2280
agcacccagc gtcactggga cgaaccaggc cctgttctta caaggccaca tggctggccc 2340
tttgcctcca tggctactgt ggtaagtgca gccttgtctg acccaatgct gacctaatgt 2400
tggccattcc acattgaggg gacaaggtca gtgatgcccc ccttcactca caagcacttc 2460
agaggcatgc agagagaagg gacactcggc cagctctctg aggtaatcag tgcaaggagg 2520
agtccgtttt ttgccagcaa acctcagcag gatcacactg gaacagaacc tggtcatacc 2580
tgtgacaaca cagctgtgag ccagggcaaa ccacccactg tcactggctc gagagtctgg 2640
gcagaggctc tgaccctcca ccctttaaac tggatgccgg ggcctggctg ggcccaatgc 2700
caagtggtta tggcaaccct gactatctgg tcttaacatg tagctcagga agtggaggcg 2760
ctaatgtccc caatccctgg ggattcctga ttccagctat tcatgtaagc agagccaacc 2820
tgcctatttc tgtaggtgcg actgggatgt taggagcaca gcaaggaccc agctctgtag 2880
ggctggtgac ctgatacttc tcataatggc atctagaagt taggctgagt tggcctcact 2940
ggcccagcaa accagaactt gtctttgtcc gggccatgtt cttgggctgt cttctaattc 3000
caaagggttg gttggtaaag ctccaccccc ttctcctctg cctaaagaca tcacatgtgt 3060
atacacacac gggtgtatag atgagttaaa agaatgtcct cgctggcatc ctaattttgt 3120
cttaagtttt tttggaggga gaaaggaaca aggcaaggga agatgtgtag ctttggcttt 3180
aaccaggcag cctgggggct cccaagccta tggaaccctg gtacaaagaa gagaacagaa 3240
gcgccctgtg aggagtggga tttgtttttc tgtagaccag atgagaagga aacaggccct 3300
gttttgtaca tagttgcaac ttaaaatttt tggcttgcaa aatatttttg taataaagat 3360
ttctgggtaa caataaaaaa aaaaaaaaa 3389
<210> 25
<211> 291
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Glu
20 25 30
Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala
35 40 45
Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val
50 55 60
Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp
85 90 95
Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile
100 105 110
Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly
115 120 125
Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Asp Asn Asn Ala Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val
145 150 155 160
Gly Val Ala Cys Ala Leu Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr
165 170 175
Leu Leu Arg Ile Lys Gln Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr
180 185 190
Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Ile Gln
195 200 205
Asp Thr Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro
210 215 220
Lys Glu Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr
225 230 235 240
Glu Tyr Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr
245 250 255
Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro
260 265 270
Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val
275 280 285
Gln Arg Lys
290
<210> 26
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Glu
20 25 30
Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala
35 40 45
Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val
50 55 60
Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp
85 90 95
Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile
100 105 110
Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly
115 120 125
Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe
165 170 175
Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu
180 185 190
His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn
210 215 220
Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro
225 230 235 240
Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr
245 250 255
Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu
260 265 270
Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp
275 280 285
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn
305 310 315 320
Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His
325 330 335
Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala
340 345 350
His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn Ala
355 360 365
Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu
370 375 380
Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln Ser Leu Ile Gln Asp Thr
420 425 430
Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu
435 440 445
Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr
450 455 460
Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr
465 470 475 480
Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro
485 490 495
Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg
500 505 510
Lys
<210> 27
<211> 513
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Glu
20 25 30
Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala
35 40 45
Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val
50 55 60
Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp
85 90 95
Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile
100 105 110
Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly
115 120 125
Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe
165 170 175
Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu
180 185 190
His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn
210 215 220
Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro
225 230 235 240
Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr
245 250 255
Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu
260 265 270
Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp
275 280 285
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn
305 310 315 320
Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His
325 330 335
Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala
340 345 350
His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn Ala
355 360 365
Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu
370 375 380
Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln Ser Leu Ile Gln Asp Thr
420 425 430
Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu
435 440 445
Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr
450 455 460
Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr
465 470 475 480
Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro
485 490 495
Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg
500 505 510
Lys
<210> 28
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Glu
20 25 30
Glu Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala
35 40 45
Gly Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val
50 55 60
Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile
65 70 75 80
Tyr Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp
85 90 95
Leu Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile
100 105 110
Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly
115 120 125
Ser Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Asp Asn Asn Ala Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val
145 150 155 160
Gly Val Ala Cys Ala Leu Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr
165 170 175
Leu Leu Arg Ile Lys Gln Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr
180 185 190
Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln
195 200 205
Ser Leu Ile Gln Asp Thr Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp
210 215 220
Leu Asn Leu Pro Lys Glu Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro
225 230 235 240
Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg
245 250 255
Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser
260 265 270
Arg Ala Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala
275 280 285
Ser Val Gln Val Gln Arg Lys
290 295
<210> 29
<211> 1569
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
cacatctgcc atgaaaattg gatctcaagg caagccctgg ctggggaaga aggagaggca 60
ggacagtgag caactgatga caggcccatc ccagggctct gagtgcttgc agtgacagca 120
gagctgatcc atggacctcc ccgccttagg ctctctccct ttgacagtgc agcaacacca 180
ggccattggc agataggcaa acacagtctc ttttactctg ccaacacaag aggggctacc 240
caaggatcct gctacagccc tgtctaatag acagagtcac attagaagct ggtggggatc 300
ccagttgggg accaagatca cctgactcac tgttgcagtc tgccactctt gctatcttcg 360
tcctcccttt cctgtcctcc cgtctgggcc actgtgtctc taatgtctat gtgtctgaat 420
gctcatgttc tacatccata agttcagcaa accatggttc aggaaggtag ttaggccact 480
gtgcttgggt ggcaaggatt ttaatccatt gaatcatccc ctagatgctg ctttttaaaa 540
atgacttatt ttattttaat tatgtatatc tattggtatg catgtgtgtg ggcacttgtg 600
aaggctagaa gcccctggat cccctgcact tggacgtaca gaccacatga tataagtgct 660
gggtatcgat cctgggtcct ctggaagatc agccagtgct cttaaccgct ggccatttct 720
ccagcccaga tgctgctttt taactcacca acttcagttt gtttgtttgt ttgtttgttt 780
gtattagaag tacatcaaga tgggctcatg ctacacattt cacagaaatg aaggccatca 840
aaaaccctgt ccatgctaaa gccacaactc cacagcattt ggcagagggt gagcacctgg 900
gcctactgat gactccaagt gatgcagcct tatgctaccg agccacacct aagacccagg 960
ttctcagctc tcctaccact agactgctga gacccgctgc tctgctcagg actcgatttc 1020
cagtacacaa tctccctctt tgaaaagtac cacacatcct ggggtctcct ccatctgtat 1080
ctctgctggg tttgttccct ctgtggggaa ttcacgctcc cattataact gacaaattca 1140
ggccgggcgt ggtggcacac gcctttaatc ccagcactcg ggagacagag gcaggcggat 1200
ttctgagttc gaggccagcc tggtctacag agtgagttcc aggacagcca gggctataca 1260
gagaaaccct gtctcgaaaa aaaccaaaat aaataagtaa gtaactgaca agttcagctc 1320
agacatgaca cttctccaaa gggcttgggc actctactat gctaagctat gtggcttagc 1380
actctgtgct ttagttttct tattagtctt gagttacagg ctcatgtggg gaataacaca 1440
tgctgaactt tgtgctgaac tcaataacat tgtgtgtgct caatcagtga aaatcattga 1500
taaacctgag cctgcaggat cccttaaggt tagtcatggc tgccatcttt cttcccagga 1560
gccacgggg 1569
<210> 30
<211> 1400
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggaacagagg tctatgtact cggtaagtaa gcctgtgcct tcttcatacc ctgatgtgta 60
gcatcaggtc agagaataac atcttggatc tcgtaagtgt ggctcgcagc aggtataatg 120
ggaggtcagg ttcatgatct aagctcaacc ttcaacagat cagagaagct gaggccaggt 180
gttagctcaa ggttccagtg ctagcaagaa agaaggcatc tgcatccctc atatgcccac 240
cccacagccc tctcttcctt gcccatggtt caagtaccag tgaataccag aatgcagatc 300
ccggcaggct ccttgctgcc caggcattaa gcatccccac aggtgagccc aggacacagg 360
agatgctgag aaagttctga acctctagga aacccagact ctccaccgtc acttacacaa 420
agactcagga taccctctcc attcagaagt cagggcctgt cagtgactgg gaaagctctc 480
ccaaatgcca ggcaggacac aaagcacccc tccattatgt gaatgcctcc attttactct 540
agcatctaga aattccacaa tttattgtag tcttctgttt gtagagaatt cagttcttcc 600
aaactgtgga cttttacaat agtgctgcac tggatgctca tcccacttgt ctaggacaga 660
gacgcccact gtgcaaggcc tacatcacat agctgtgttc gttttaattt gtatagatga 720
tagcagtttt ccctccaggc agcaaccaag tctccttgtc acctctgcac aaaagcaggg 780
caggtagctt atcctgatat gacagacact gaagctccca ggtagtgtgt cacttgccca 840
ggcaactaca actagcaagg ggcttcctgc cacatcttca tcacgtgtgg cttcatgcta 900
tatcttcttc atagcatttt ctccttaagc cagagcatac tcatactcta cctgtccagg 960
gtgtattagg acactgaata gccctttagg aagccatgag gaattgccca agaccttgct 1020
atttggagca agattggctt ctgtcaagtc ttcagtttct ctttgtgtaa ataacagtaa 1080
tggctccatt ttgagttcta tgagcatcaa gatattaaca aagccctaga tggggcgtca 1140
aggtcattac tgaggatgag aagtacagtg gccaggagga cagggggctg ggtttttaca 1200
gtttggaacc acaacgtaga taagccactc ctttgcctgt gtcctaggac aacccctcct 1260
cgtagcagcc ttggtgggct cctatgtcca ttccactctc gtagagtatg tggtcaggac 1320
tgaagcagtg acgtcttatc aaacacttag ccagcacctg acttgtagga agcatcccac 1380
cagtgggagc tgtcctgaac 1400
<210> 31
<211> 324
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca 60
gccactctgc gctgcactgc gacctctctg atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga 120
ggagctggac caggccggga attaatctac aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta 180
acaactgttt cagacctcac aaagagaaac aacatggact tttccatccg catcggtaac 240
atcaccccag cagatgccgg cacctactac tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat 300
gacgtggagt ttaagtctgg agca 324
<210> 32
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
tacctttaag aaggagatat acatgctcga gcacatctgc catgaaaatt ggatct 56
<210> 33
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
atcacctgca gctcctcctc ccccgtggct cctgggaaga aagat 45
<210> 34
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
tcttcccagg agccacgggg gaggaggagc tgcaggtgat tcagc 45
<210> 35
<211> 45
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
agtacataga cctctgttcc tgctccagac ttaaactcca cgtca 45
<210> 36
<211> 47
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tggagtttaa gtctggagca ggaacagagg tctatgtact cggtaag 47
<210> 37
<211> 58
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tcggttgtta gcagccggat ctcaggcggc cgcgttcagg acagctccca ctggtggg 58
<210> 38
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
agttccttcc ccgtggctcc tgg 23
<210> 39
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
agccacgggg aaggaactga agg 23
<210> 40
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
caccttcagt tccttccccg tgg 23
<210> 41
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aaatcagtgt ctgttgctgc tgg 23
<210> 42
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cactttgacc tccttgttgc cgg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttgacctcct tgttgccggt ggg 23
<210> 44
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gggtcccacc ggcaacaagg agg 23
<210> 45
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
tgttgccggt gggacccatt agg 23
<210> 46
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
actcctctgt accacctaat ggg 23
<210> 47
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ctgtagatca acagccggct tgg 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cgaaactgta gatcaacagc cgg 23
<210> 49
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ctgttgatct acagtttcgc agg 23
<210> 50
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
tctgaaacat ttctaattcg agg 23
<210> 51
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tactactaag agaaacaata tgg 23
<210> 52
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ctggggtgac attactgata cgg 23
<210> 53
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
aatgtcaccc cagcagatgc tgg 23
<210> 54
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gtagatgcca gcatctgctg ggg 23
<210> 55
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
cctgacacag aaatacaatc tgg 23
<210> 56
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cacagaaata caatctggag ggg 23
<210> 57
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
acaatctgga gggggaacag agg 23
<210> 58
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ggaacagagg tctatgtact cgg 23
<210> 59
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
gtcccaccgg caacaagg 18
<210> 60
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
tagggtccca ccggcaacaa gg 22
<210> 61
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ccttgttgcc ggtgggac 18
<210> 62
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
aaacccttgt tgccggtggg ac 22
<210> 63
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
tagatgccag catctgctg 19
<210> 64
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
taggtagatg ccagcatctg ctg 23
<210> 65
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
cagcagatgc tggcatcta 19
<210> 66
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aaaccagcag atgctggcat cta 23
<210> 67
<211> 132
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
tttaaaggat cc 132
<210> 68
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
catcaagcct gttccctcct tgtgt 25
<210> 69
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cttaaactcc acgtcatcgg ggctc 25
<210> 70
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
tcaaaaagaa ggccacttcc cccggg 26
<210> 71
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
caagctgtag agacagatgg gcagg 25
<210> 72
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
gcaggacagt gagcaactga tgaca 25
<210> 73
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
gcacagtggc ctaactacct tcctg 25
<210> 74
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
ggtagtgccc atgaagctgg tactc 25
<210> 75
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
ggccaccaca ttatggcttt ctcct 25
<210> 76
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
ttgctgctgg ggattcgac 19
<210> 77
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
ctgctggggt gacattactg at 22
<210> 78
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cctgacaagt ccgtgttgg 19
<210> 79
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
ctcctctgaa ccactggatg g 21
<210> 80
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
gtcttgagtt acaggctcat gtgggg 26
<210> 81
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cccattatac ctgctgcgag ccac 24
<210> 82
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
ggtaaattta tccccaagat gcatggta 28
<210> 83
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
acaaacattt cttcggtgct ttgcg 25
<210> 84
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tggggacagt ggacttgttt agagc 25
<210> 85
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
agctatgtgg cttagcactc tgtgc 25
<210> 86
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
cgaggaacgt attctcctgc gaaac 25
<210> 87
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
gtcatccctt gcatcgtccg 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
gtcatccctt gcatcgtccg 20
<210> 89
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
acactgtcgt cattccatgc t 21
<210> 90
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
cctgtgtgtg agacagcatc a 21

Claims (29)

1.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型的基因组中含有人SIRPA基因的第3外显子的部分序列，所述人SIRPA基因的第3外显子的部分序列如SEQID NO：31所示，所述人SIRPA基因在动物细胞中表达并且促进该细胞产生人源化SIRPα蛋白，其中，所述人SIRPA基因受动物内源性调控元件调控，所述调控元件为动物内源启动子。
2.根据权利要求1所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型基因组中包含人源化SIRPA基因，所述人源化SIRPA基因编码的多肽包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中，所述胞内参与信号传导的区域为动物来源，所述人源化SIRPA基因编码的跨膜区为动物来源，所述胞外区包含人SIRPA基因的SEQ ID NO：31，同时所述人源化SIRPA基因的动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的Sirpa基因启动子后。
3.根据权利要求2所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物来源部分包括动物来源Sirpa基因的第1外显子全部序列、第2外显子部分序列、第3外显子及其后所有外显子的全部序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行SIRPA基因人源化动物模型的构建，所述基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术或归巢核酸内切酶。
5.根据权利要求4所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述方法包括使用sgRNA靶向技术实现将动物来源的Sirpa基因第2外显子部分序列替换为人SIRPA基因第3外显子部分序列，所述的人SIRPA基因第3外显子部分序列如SEQ ID NO：31所示，其中，所述sgRNA在待改变的非人动物Sirpa基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；所述sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：38-47任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：48-58任一项所示。
6.根据权利要求1-3和5任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物为非人哺乳动物，所述非人哺乳动物为啮齿类动物，所述啮齿类动物为小鼠。
7. 根据权利要求1-3和5任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型包含嵌合SIRPα蛋白，所述的嵌合SIRPα蛋白序列如SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示。
8.根据权利要求1-3和5任一所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人源化动物模型包含人源化SIRPA基因，所述人源化SIRPA基因选自下列组中的一种：
a）所述基因编码权利要求7中所述嵌合SIRPα蛋白序列；
b）人源化SIRPA基因的mRNA序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：22或SEQID NO：23或SEQ ID NO：24所示；
c）人源化SIRPA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；或
d）人源化SIRPA基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：20所示。
9.一种用于构建人源化动物模型或敲除动物模型的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向非人动物Sirpa基因，同时所述sgRNA序列在待改变的非人动物Sirpa基因的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则，所述sgRNA在非人动物Sirpa基因的靶位点位于非人动物Sirpa基因的第2外显子上，所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：38-47任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：48-58任一项所示。
10.根据权利要求9所述的sgRNA序列，其特征在于，所述sgRNA序列靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：44所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：54所示。
11.根据权利要求9或10所述的sgRNA序列，其特征在于，所述非人动物为啮齿类动物，所述啮齿类动物为小鼠。
12.一种编码权利要求9-11任一所述的sgRNA序列的DNA分子，其特征在于，所述DNA分子的双链序列分别如SEQ ID NO：59和SEQ ID NO：61，或SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：65所示。
13.一种构建动物模型的载体，其特征在于，所述载体能够产生如权利要求9-11任一所述的sgRNA序列，用于敲除或替换Sirpa基因的第2外显子的部分核苷酸序列。
14.一种用于制备Sirpa基因人源化的靶向载体，其包含：a）与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自Sirpa基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b）插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c）与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自Sirpa基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，其中，所述待改变的转换区位于Sirpa基因的第2外显子，所述插入或替换的供体DNA序列包括人SIRPA基因DNA序列的第3外显子的部分，所述人SIRPA基因DNA序列的第3外显子的部分如SEQ ID NO：31所示。
15.根据权利要求14所述的靶向载体，其特征在于，a）与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000068.7的第129607346-129608914位核苷酸；c）与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自如NCBI登录号为NC_000068.7的第129609239-129610638位核苷酸。
16.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求14-15任一所述的靶向载体、一种或多种权利要求9-11任一所述的sgRNA序列、一种或多种权利要求13所述的载体和/或一种或多种权利要求13所述的载体的体外转录产物。
17.权利要求14-15任一所述的靶向载体、权利要求9-11任一所述的sgRNA序列、权利要求13所述的载体或权利要求16所述的细胞在基因修饰Sirpa基因座中的应用。
18.一种SIRPA基因人源化细胞株，其特征在于，使用权利要求9-11任一所述的sgRNA序列或权利要求12所述的编码sgRNA的DNA分子或权利要求13所述的载体将动物的第2外显子的部分替换为人SIRPA基因的第3外显子的部分序列制备获得，所述的人SIRPA基因的第3外显子的部分序列如SEQ ID NO：31所示。
19.一种制备多基因人源化动物模型的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（a）利用权利要求1-8任一所述方法获得动物模型；
（b）将步骤（a）获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述其他人源化动物选自基因CD47、PD-1、CD27、CD28、CTLA-4、LAG-3、BTLA、PD-L1、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137或OX-40人源化动物中的一种或两种以上的组合。
21.一种嵌合SIRPα蛋白，其特征在于，所述的嵌合SIRPα蛋白序列如SEQ ID NO：8、SEQID NO：25、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：27或SEQ ID NO：28所示。
22.一种编码权利要求21所述嵌合SIRPα蛋白的嵌合SIRPA基因，其特征在于，所述嵌合SIRPA基因为人源化SIRPA基因，所述人源化SIRPA基因选自下列组中的一种：
a）人源化SIRPA基因的mRNA序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23或SEQ ID NO：24所示；
b）人源化SIRPA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；或
c）人源化SIRPA基因的CDS编码序列如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQID NO：19或SEQ ID NO：20所示。
23.根据权利要求22所述的嵌合SIRPA基因，其特征在于，其中嵌合小鼠SIRPA的DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ IDNO：23或SEQ ID NO：24。
24.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代。
25.一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代。
26.来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代在作为人信号机理研究、调节剂筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、毒理研究的动物模型中的应用。
27.来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代在涉及细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
28.来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代在用于病原学研究、用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
29.来源于权利要求1-8任一所述的方法构建的人源化动物模型、权利要求19-20任一所述的方法制备的多基因人源化动物模型或其后代在筛选、验证、评价、评估或研究SIRPA抗体药物和药效、免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
CN201810296193.8A 2017-03-31 2018-03-30 人源化sirpa基因改造动物模型的制备方法及应用 Active CN108531487B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2018/081629 WO2018177441A1 (en) 2017-03-31 2018-04-02 GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
US16/436,545 US10973212B2 (en) 2017-03-31 2019-06-10 Genetically modified non-human animal with human or chimeric SIRPa

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710205646 2017-03-31
CN2017102056467 2017-03-31
CN2017109533166 2017-10-13
CN201710953316 2017-10-13
CN2017110383085 2017-10-27
CN201711038308 2017-10-27

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108531487A CN108531487A (zh) 2018-09-14
CN108531487B true CN108531487B (zh) 2020-03-13

Family

ID=63483055

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810296193.8A Active CN108531487B (zh) 2017-03-31 2018-03-30 人源化sirpa基因改造动物模型的制备方法及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108531487B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588126B (zh) 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
CN109452229B (zh) * 2018-11-19 2021-10-22 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 狗源化pd-1基因改造动物模型的制备方法及应用
CN109486860B (zh) * 2018-12-04 2022-04-08 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种tigit人源化小鼠模型的构建方法及其应用
CN111304248B (zh) * 2018-12-25 2021-08-24 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化细胞因子il15基因改造非人动物的构建方法及应用
CN112430621B (zh) * 2019-08-09 2022-09-27 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il2ra基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN112553252B (zh) * 2019-09-06 2022-04-29 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Tnfr2基因人源化的非人动物的构建方法和应用
US20230058049A1 (en) * 2019-12-31 2023-02-23 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED IMMUNODEFICIENT NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPa/CD47
CN111647623B (zh) * 2020-07-14 2022-03-18 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种sirpa人源化动物模型的构建方法及其应用
CN114835798B (zh) * 2021-05-28 2024-02-23 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Cd36基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN113402621B (zh) * 2021-08-02 2021-12-10 中山大学 含有嵌合抗原受体的融合蛋白及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561095A (zh) * 2015-01-27 2015-04-29 长春力太生物技术有限公司 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104561095A (zh) * 2015-01-27 2015-04-29 长春力太生物技术有限公司 一种能够生产人神经生长因子的转基因小鼠的制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BC062197.1;Strausberg,R.L.等;《GENBANK》;20060804 *
KJ903815.1;Yang,X.等;《GENBANK》;20150319 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108531487A (zh) 2018-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108531487B (zh) 人源化sirpa基因改造动物模型的制备方法及应用
CN108588126B (zh) Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
CN107815468B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN107815465B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
US10973212B2 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric SIRPa
WO2018068756A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric btla
WO2018041121A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric ctla-4
CN111304248B (zh) 人源化细胞因子il15基因改造非人动物的构建方法及应用
CN109666701B (zh) 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用
CN109136261B (zh) 人源化cd28基因改造动物模型的制备方法及应用
CN109136274B (zh) 人源化cd40基因改造动物模型的制备方法及应用
CN107815467B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN109136275B (zh) 人源化gitr基因改造动物模型的制备方法及应用
CN111197058A (zh) 人源化cd73基因动物模型的制备方法及应用
CN111793647B (zh) Cd226基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN108070613B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN107955817B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN113122574A (zh) 一种免疫缺陷型人源化非人动物的构建方法
CN108070614B (zh) 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN112779284A (zh) Thpo基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN112553252B (zh) Tnfr2基因人源化的非人动物的构建方法和应用
CN112501206B (zh) Psma基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN112501205B (zh) Ceacam1基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN111304247B (zh) 人源化lag-3基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018233606A1 (en) GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC GITR

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20191216

Address after: 101111 floor 12, building 3, yard 88, Kechuang 6th Street, East District, economic and Technological Development Zone, Daxing District, Beijing

Applicant after: Beijing Biocytogen Co., Ltd.

Applicant after: Jiangsu gene Biotechnology Co., Ltd.

Address before: 101111 room 1201-1210, incubator center, 88 Chuang six street, Daxing District East Economic and Technological Development Zone, Beijing

Applicant before: Beijing Biocytogen Co., Ltd.

TA01 Transfer of patent application right
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP03 Change of name, title or address

Address after: 102609 No.12, Baoshen South Street, Daxing biomedical industry base, Zhongguancun Science and Technology Park, Daxing District, Beijing

Patentee after: Baccetus (Beijing) Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.

Patentee after: BIOCYTOGEN JIANGSU GENE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Address before: 101111 12th floor, building 3, courtyard 88, Kechuang 6th Street, Ludong District, Daxing District, Beijing

Patentee before: BEIJING BIOCYTOGEN Co.,Ltd.

Patentee before: BIOCYTOGEN JIANGSU GENE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

CP03 Change of name, title or address