CN114853877A

CN114853877A - Cd93基因人源化非人动物及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN114853877A
Application number: CN202210466611.XA
Authority: CN
Inventors: 李惠琳; 尚诚彰
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2022-04-29
Publication date: 2022-08-05

Abstract

本发明提供了一种CD93基因人源化的非人动物及其构建方法和应用。本发明还提供了一种人源化CD93蛋白、一种人源化CD93基因以及靶向CD93基因的靶向载体及其应用。本发明还提供了包含CD93基因人源化的多基因修饰的非人动物的构建方法，以及制备获得的CD93基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物在靶向人CD93信号通路药物的筛选、药效评价中的应用。

Description

CD93基因人源化非人动物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CD93基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

CD93(Cluster of differention 93)是一种C型凝集素跨膜受体，不仅在细胞-细胞粘附过程中发挥作用，而且在宿主防御中发挥作用。目前已知CD93主要在血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞等多种细胞中表达。在免疫系统中，CD93也表达于中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体，直到脾脏T2期，以及树突状细胞和自然杀伤细胞的一个子集。CD93在晚期B细胞分化过程中重新表达，CD93可作为浆细胞成熟的标志物。CD93在Ⅳ级胶质瘤血管中的表达与低级别胶质瘤或正常脑组织不同，其高表达与患者生存率低有关。目前研究发现，CD93主要参与粘附、迁移和吞噬，并且与肿瘤的发生发展有着密切的联系，被认为是肿瘤治疗的有吸引力的候选靶点之一。并且，CD93与免疫疾病的发生发展也密切相关，研究发现，实验性腹膜炎时CD93缺乏小鼠白细胞浸润增加，并且CD93基因敲除小鼠的大脑和脊髓炎症也增加。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generation and utility of geneticallyhumanized mouse models,Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。

鉴于CD93在肿瘤、免疫性疾病等多种疾病发生过程中的广泛参与性以及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化CD93信号通路相关的非人动物模型。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种人源化CD93蛋白，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93蛋白的信号肽、胞外区、跨膜区和/或胞质区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93蛋白的胞外区。优选包含人CD93蛋白的胞外区的至少100、150、200、300、400、500或559个连续的氨基酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：2第22-580位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第22-580位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第22-580位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ IDNO：2第22-580位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93蛋白还包含人CD93蛋白的信号肽。优选包含人CD93蛋白的信号肽的至少5、10、15、20或21个连续的氨基酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：2第1-21位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-21位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-21位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-21位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93蛋白的胞外区和信号肽，优选包含SEQ ID NO：2第1-580位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-580位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-580位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ IDNO：2第1-580位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93蛋白还包含非人动物CD93蛋白的跨膜区和/或胞质区。优选包含SEQ ID NO：1第573-593位、594-644或573-644位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：1第573-593位、594-644或573-644位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：1第573-593位、594-644或573-644位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含与SEQ ID NO：1第573-593位、594-644或573-644位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93蛋白的胞外区和信号肽，以及非人动物CD93蛋白的跨膜区和胞质区。

优选的，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93基因的全部或部分编码的氨基酸序列。进一步优选的，包含人CD93基因的1号外显子和/或2号外显子编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93基因的1号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，其中，人CD93基因的1号外显子的部分至少包含100、200、500、1000、1500、1738、1739、1740、1741、1742、1743、1744、1745、2000、2066bp的连续核苷酸序列，优选包含编码信号肽和/或胞外区的核苷酸序列。优选还包含非人动物CD93基因的2号外显子编码的氨基酸序列。进一步优选还包含非人动物CD93基因的1号外显子的部分编码的氨基酸序列，更进一步优选还包含非人动物CD93基因的1号外显子的部分和2号外显子编码的氨基酸序列，其中，非人动物CD93基因的1号外显子的部分至多包含50、100、150、190、191、192、193、194bp的连续核苷酸序列，优选包含编码跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，

D)与SEQ ID NO：7所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种编码上述人源化CD93蛋白的核酸。

本发明的第三方面，提供了一种人源化CD93基因，所述的人源化CD93基因包含人CD93基因的部分。

优选的，所述的人源化CD93基因包含编码人CD93蛋白的核苷酸序列，优选包含编码人CD93蛋白的胞外区(至少100、150、200、300、400、500或559个连续的氨基酸序列)和/或信号肽(至少5、10、15、20或21个连续的氨基酸序列)的核苷酸序列。进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第1-21、22-580或1-580位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ IDNO：2第1-21、22-580或1-580位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2第1-21、22-580或1-580位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2第1-21、22-580或1-580位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的人源化CD93基因还包含编码非人动物CD93蛋白的核苷酸序列，优选包含编码非人动物CD93蛋白的跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列。优选包含编码SEQ ID NO：1第573-593位、594-644或573-644位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1第573-593位、594-644或573-644位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1第573-593位、594-644或573-644位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：1第573-593位、594-644或573-644位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93基因编码上述人源化CD93蛋白。

优选的，所述的人源化CD93基因包含人CD93基因的1号外显子的全部或部分，其中，人CD93基因的1号外显子的部分至少包含100、200、500、1000、1500、1738、1739、1740、1741、1742、1743、1744、1745、2000、2066bp的连续核苷酸序列，优选包含编码胞外区和/或信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选所述的人源化CD93基因还包含非人动物CD93基因的2号外显子。进一步优选还包含非人动物CD93基因1号外显子的部分和/或1-2号内含子，优选包含非人动物CD93基因的1号外显子的部分和2号外显子的核苷酸序列，其中，非人动物CD93基因1号外显子的部分至多包含50、100、150、190、191、192、193、194bp的连续核苷酸序列，优选包含编码跨膜区和/或胞质区的核苷酸序列。

所述的人源化CD93基因包含人CD93基因的部分与非人动物CD93基因的部分，其中，人CD93基因的部分与非人动物CD93基因的部分连接位置包含SEQ ID NO：12和/或SEQID NO：13所示。在本发明的一个具体实施方式中，包含人CD93基因的1号外显子的部分、非人动物CD93基因1号外显子的部分、非人动物2号外显子，优选还包含非人动物1-2号内含子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CD93基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

B)与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，

D)具有SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD93基因包含SEQ ID NO：10、11、12和/或13所示的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CD93基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第四方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含A)-D)组中的一种：

A)编码人或人源化CD93蛋白的核苷酸序列；

B)编码人CD93蛋白的胞外区、跨膜区、胞质区和/或信号肽的核苷酸序列，优选编码人CD93蛋白的胞外区的核苷酸序列。优选还包含编码人CD93蛋白信号肽的核苷酸序列；进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第1-21、22-580或1-580位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2第1-21、22-580或1-580位所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2第1-21、22-580或1-580位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2第1-21、22-580或1-580位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸的核苷酸序列；

C)人或人源化CD93基因的核苷酸序列；或，

D)人CD93基因的1号至2号外显子的全部或部分，优选人CD93基因的1号和/或2号外显子的全部或部分，进一步优选人CD93基因的1号外显子的全部或部分，其中，人CD93基因的1号外显子的部分至少包含100、200、500、1000、1500、1738、1739、1740、1741、1742、1743、1744、1745、2000、2066bp的连续核苷酸序列，优选包含编码信号肽和/或胞外区的核苷酸序列。进一步优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。

所述的5’臂为与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，其选自非人动物CD93基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂序列包含SEQ ID NO：3或8所示。

所述的3’臂为与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，其选自非人动物CD93基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列包含SEQ ID NO：4或9所示。

优选的，所述的靶向载体还包含SEQ ID NO：10、11、12和/或13。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CD93基因的1号至2号外显子上，进一步优选位于非人动物CD93基因的1号和/或2号外显子上。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统具有两个Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)，优选分别同向连接在抗性基因的两侧。。

本发明的第五方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物CD93基因，其靶位点位于CD93基因的1号外显子上。

优选的，所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列包含SEQ ID NO：28-34任一项所示，3’端靶位点序列包含SEQ ID NO：35-42任一项所示。

本发明的第六方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。

本发明的第七方面，提供了一种包含上述sgRNA的载体。

本发明的第八方面，提供了一种包含上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子和/或上述载体的细胞。

本发明的第九方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA、上述的DNA分子、上述载体和/或上述细胞在CD93基因编辑中的应用。

本发明的第十方面，提供了一种CD93基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达上述的人或人源化CD93蛋白，和/或，所述的非人动物的基因组中包含上述的人或人源化CD93基因。

根据本发明的一些实施例，编码该人或人源化CD93蛋白的核苷酸序列或者该人或人源化CD93基因的核苷酸序列可操作地连接到至少一条染色体中内源性CD93基因座处的内源性调控元件。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人CD93基因的部分。优选包含人CD93基因的1号至2号外显子的全部或部分。进一步优选包含人CD93基因的1号和/或2号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含人CD93基因的1号外显子的全部或部分。所述的人CD93基因的1号外显子的部分至少包含100、200、500、1000、1500、1738、1739、1740、1741、1742、1743、1744、1745、2000、2066bp的连续核苷酸序列，优选包含编码信号肽和/或胞外区的核苷酸序列。优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含编码人CD93蛋白的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含编码人CD93蛋白胞外区、跨膜区、胞内区和/或信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含编码人CD93蛋白的胞外区的核苷酸序列。优选还包含编码人CD93蛋白的信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物基因组中包含编码SEQ ID NO：2第1-21、1-580或22-580位的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-21、1-580或22-580位的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-21、1-580或22-580位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-21、1-580或22-580位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。优选的，所述的非人动物的内源CD93蛋白表达降低或缺失。

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。

根据本发明的一些实施例，人或人源化CD93基因或其他基因相对于内源被修饰的基因座可以是杂合的，也可以是纯合的。

本发明所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。再进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-小鼠、Rag2^-/--IL2rg^-/-小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第十一方面，提供了一种CD93基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失CD93基因的1号至2号外显子的全部或部分。优选缺失CD93基因的1号和/或2号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物缺失CD93基因的1号外显子。

本发明的第十二方面，提供了一种CD93基因缺失的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括采用上述靶向载体和/或sgRNA进行非人动物的制备。

本发明的第十三方面，提供了一种CD93基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达上述的人或人源化CD93蛋白，和/或，所述非人动物的基因组中包含上述的人或人源化CD93基因。

优选的，所述的非人动物的内源CD93蛋白表达降低或缺失。

所述的非人动物的基因组中包含编码人CD93蛋白的全部或部分核苷酸序列，优选包含编码人CD93蛋白的胞外区、跨膜区、信号肽和/或胞质区的全部或部分核苷酸序列。

所述的非人动物的基因组中包含编码人CD93蛋白的胞外区和/或信号肽的核苷酸序列，优选包含编码SEQ ID NO：2第1-21、1-580或22-580位的核苷酸序列。或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-21、1-580或22-580位的核苷酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与编码SEQ ID NO：2第1-21、1-580或22-580位的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或者，包含具有编码SEQ ID NO：2第1-21、1-580或22-580位的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含编码人源化CD93蛋白的核苷酸序列。

所述的非人动物的基因组中包含人CD93基因的部分，优选包含人CD93基因的1号至2号外显子的全部或部分，进一步优选包含人CD93基因的1号和/或2号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含人CD93基因的1号外显子的全部或部分，其中，所述的人CD93基因的1号外显子的部分至少包含100、200、500、1000、1500、1738、1739、1740、1741、1742、1743、1744、1745、2000、2066bp的连续核苷酸序列，优选包含编码信号肽和/或胞外区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含上述的人源化CD93基因。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物CD93基因座：

A)编码人或人源化CD93蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD93基因的核苷酸序列；或，

优选的，所述的A)-D)核苷酸序列在非人动物中通过调控元件进行调控。所述的调控元件可以是内源性或者外源性。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的内源性调控元件来自非人动物CD93基因。所述的外源性调控元件来自人CD93基因。

优选的，非人动物CD93基因的1号外显子和/或2号外显子被替换，进一步优选地，非人动物的1-2号内含子被替换。

在本发明的一个具体实施方式中，非人动物CD93基因的1号至2号外显子被替换，或1号外显子的全部或部分被替换。

在一个优选的实施方式中，所述的导入为替换或插入，具体地，所述的导入非人动物CD93基因座为替换非人动物相应区域，优选为替换非人动物基因组中编码内源CD93蛋白胞外区(优选SEQ ID NO：1第23-572位)的核苷酸序列。进一步优选为替换非人动物基因组中编码内源CD93蛋白胞外区和信号肽(优选SEQ ID NO：1第1-572位)的核苷酸序列。更进一步优选为替换非人动物与NCBI登录号为NC_000068.8的第148283629至148285344位所示序列相同的核苷酸序列。相应的，可以用人CD93蛋白胞外区的核苷酸序列替换非人动物基因组中编码内源CD93蛋白的相应核苷酸序列，进一步地，还可以包括用人的跨膜区、胞内区和/或信号肽替换相应的非人动物的相应区域。例如，用于替换非人动物CD93基因座的核苷酸序列可以为NC_000020.11第23084453至23086192位所示的核苷酸序列。

优选的，人或人源化CD93基因相对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括修饰非人动物CD93基因的编码框，将编码人或人源化CD93蛋白的核苷酸序列或者人源化CD93基因的核苷酸序列插入非人动物CD93基因内源调控元件之后。其中，所述的修饰非人动物CD93基因的编码框可以采用敲除非人动物CD93基因的功能区或者采用插入一段序列，使得非人动物CD93蛋白不表达或表达降低或表达的蛋白无功能。进一步优选的，所述的修饰非人动物CD93基因的编码框可以为敲除非人动物CD93基因的外显子1至外显子2的全部或部分核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人或人源化CD93蛋白的核苷酸序列或者人源化CD93基因的核苷酸序列和/或辅助序列插入非人动物CD93基因内源调控元件之后。优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子、翻转序列或敲除序列，使得CD93基因人源化的动物模型体内表达人或人源化CD93蛋白，不表达非人动物CD93蛋白。进一步优选的，所述的辅助序列为WPRE、3’UTR和/或polyA。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码人CD93蛋白的全部或部分(优选为人CD93蛋白的胞外区、信号肽、胞内区和/或胞质区，进一步优选为胞外区，再进一步优选为胞外区和信号肽)插入或替换至非人动物CD93基因的相应区域(优选为编码非人动物CD93蛋白的胞外区的核苷酸序列，进一步优选为编码非人动物CD93蛋白的胞外区和信号肽的核苷酸序列)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码SEQ ID NO：2第1-580位的核苷酸序列插入或替换非人动物编码SEQ ID NO：1第1-572位的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码SEQ ID NO：2第1-580位与SEQ ID NO：1第573-644位的核苷酸序列插入或替换非人动物编码SEQ ID NO：1第1-644位的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将人CD93基因的部分(优选为人CD93基因的1号至2号外显子，进一步优选为人CD93基因1号和/或2号外显子，更进一步优选为人CD93基因的1号外显子的全部或部分，其中1号外显子的部分至少包含100、200、500、1000、1500、1738、1739、1740、1741、1742、1743、1744、1745、2000、2066bp的连续核苷酸序列)插入或替换至非人动物CD93基因的相应区域(优选为1号至2号外显子，进一步优选为1号和/或2号外显子，更进一步优选为1号外显子的全部或部分)。

优选的，使用基因编辑技术进行CD93基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行非人动物的构建。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CD93基因人源化的非人动物。

在本发明的另一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物的细胞中(优选为胚胎干细胞)，将阳性细胞导入已分离好的囊胚中，得到的嵌合囊胚移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CD93基因人源化的非人动物。

优选的，为提高重组效率，还可以使用sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物CD93基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的CD93基因上的靶序列上。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将CD93基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种基因修饰的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因修饰非人动物、三基因修饰非人动物、四基因修饰非人动物、五基因修饰非人动物、六基因修饰非人动物、七基因修饰非人动物或八基因修饰非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因相对于内源被修饰基因座均可以是纯合或杂合的。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和/或CD73。

本发明的第十四方面，提供了一种细胞、组织或器官，所述的细胞、组织或器官表达上述的人源化CD93蛋白，和/或，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含上述的人或人源化CD93基因。或者，所述的细胞、组织或器官来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第十五方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织表达上述的人源化CD93蛋白，和/或，所述的瘤组织的基因组中包含上述的人或人源化CD93基因。或者，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的非人动物，或者，上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第十六方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物(包括CD93基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物)。

本发明的第十七方面，提供了一种荷瘤或炎症的动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第十八方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型的构建方法，所述方法是利用上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的非人动物进行的。

本发明的第十九方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物在构建荷瘤或炎症的动物模型中的应用。

本发明的第二十方面，提供了一种上述的非人动物、上述构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症动物模型在制备治疗肿瘤或免疫相关疾病的药物中的用途。

本发明的第二十一方面，提供了一种CD93基因人源化的细胞，所述的细胞表达上述的人或人源化CD93蛋白；和/或，所述的细胞的基因组中包含上述的人或人源化CD93基因。

优选的，所述的细胞中内源CD93蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人CD93基因的1号至2号外显子。进一步优选包含人CD93基因的1号和/或2号外显子。更进一步优选的，包含人CD93基因的1号外显子的全部或部分。

优选的，所述的细胞的基因组中包含编码人CD93蛋白的胞外区、信号肽、胞内区和/或跨膜区的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码人CD93蛋白的胞外区的核苷酸序列。更进一步优选的，包含编码人CD93蛋白的胞外区和信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞的基因组中包含上述的人或人源化CD93基因。

本发明的第二十二方面，提供了上述细胞的构建方法，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入细胞CD93基因座：

A)编码人或人源化CD93蛋白的核苷酸序列；

C)人或人源化CD93基因的核苷酸序列；或，

所述的导入细胞CD93基因座为替换细胞CD93基因的相应区域，优选为替换基因组中编码内源CD93蛋白胞外区的核苷酸序列。进一步优选为替换基因组中编码内源CD93蛋白胞外区和信号肽的核苷酸序列。更进一步优选为替换与NCBI登录号为NC_000068.8的第148283629至148285344位所示序列相同的核苷酸序列。相应的，可以用人CD93蛋白胞外区的核苷酸序列替换非人动物基因组中编码内源CD93蛋白的相应核苷酸序列，进一步地，还可以包括用人的跨膜区、胞内区和/或信号肽替换相应的非人动物的相应区域。例如，用于替换非人动物CD93基因座的核苷酸序列可以为NC_000020.11第23084453至23086192位所示的核苷酸序列。

优选的，使用基因编辑技术进行CD93基因人源化的细胞的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA进行细胞的构建。

本发明的第二十三方面，提供了一种CD93基因缺失的细胞，所述的细胞缺失CD93基因的1号至2号外显子的全部或部分。优选缺失1号和/或2号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞缺失CD93基因的1号外显子的全部或部分。

本发明的第二十四方面，提供了一种CD93基因缺失的细胞的构建方法，包括使用上述的靶向载体和/或sgRNA进行CD93基因缺失的细胞的构建。

本发明的第二十五方面，提供了一种上述的人源化CD93蛋白、上述的人源化CD93基因、上述的细胞、上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物的应用，所述的应用包含：

A)涉及人类细胞的与CD93相关的免疫过程的产品开发中的应用；

B)作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的与CD93相关的模型系统中的应用；

C)涉及生产和利用动物实验疾病模型用于与CD93相关的病原学研究和/或用于开发诊断策略和/或用于开发治疗策略中的应用；

D)在体内研究人CD93信号通路调节剂的筛选、药效检测、评估疗效、验证或评价中的应用；或者，

E)研究CD93基因功能，研究针对人CD93靶位点的药物、药效，研究与CD93相关的免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的应用。

本发明的第二十六方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型用作人CD93特异性调节剂的筛选。

本发明的第二十七方面，提供了一种人CD93特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物或者采用上述方法构建的非人动物或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体，具体地，该药物可以为抗CD93抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述筛选方法不是治疗方法。该筛选方法对调节剂的效果进行检测和评价，以确定该调节剂是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十八方面，提供了一种人用药物筛选或评价的方法，所述的方法包括向个体体内移植人肿瘤细胞，向移入人肿瘤细胞的动物给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。其中，所述的个体选自上述的构建方法获得的CD93基因人源化的非人动物、上述的CD93基因人源化的非人动物、上述的构建方法获得的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症的动物模型。

优选的，所述药物筛选或评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

优选的，所述候选药物包括靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。

优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。

本发明所述“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CD93基因座”表示CD93基因1号至2号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的CD93基因座可以是CD93基因1号至2号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被替换的CD93基因座可以是CD93基因1号外显子上的任选一段的DNA片段。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“人源化CD93蛋白”，包含来源于人CD93蛋白的部分和非人CD93蛋白的部分，其中，所述“人CD93蛋白”为人CD93蛋白的全长氨基酸序列。所述的人CD93蛋白的部分与非人CD93蛋白的部分之间可以直接连接或者接头连接，所述的“接头”为柔性接头，优选为肽接头，其氨基酸数目和种类没有限定，只要可以连接人CD93蛋白的部分与非人CD93蛋白部分，且不影响人源化CD93蛋白的功能即可。优选的，所述的人源化CD93蛋白包含连续或间隔的5-652个氨基酸序列与人CD93蛋白的氨基酸序列一致，优选为连续或间隔的10-580、10-559个，更优选为5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、559、580、600、650或652个氨基酸序列与人CD93蛋白的氨基酸序列一致。

本发明所述的“人源化CD93基因”，包含来源于人CD93基因的部分和非人CD93基因的部分，所述的“人CD93基因”为人CD93基因的全长核苷酸序列。优选的，所述的人源化CD93基因包括连续或间隔的20bp-10277bp个核苷酸序列与人CD93基因的核苷酸序列一致，优选为连续或间隔的20-1872、20-1740bp个，更优选为20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1740、1800、1872、1900、2000、2500、3000、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000或10277个核苷酸序列与人CD93基因的核苷酸序列一致。

本发明所述的“细胞”可以为受精卵细胞或者其他体细胞，优选包括但不限于血小板、单核细胞、小胶质细胞和内皮细胞、中性粒细胞、活化的巨噬细胞、B细胞前体、树突状细胞、自然杀伤细胞、晚期B细胞或浆细胞等等。因此，根据细胞来源的不同，本申请所述的细胞一部分可以发育为动物个体，一部分不能发育为动物个体。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体；“部分”为整体中的局部，或者整体中的个体。

本发明所述的“1号至2号外显子”或“1号至2号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，即1号外显子、1-2号内含子和2号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“1-2号内含子”代表1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“CD93蛋白”，例如“人CD93蛋白”、“非人动物CD93蛋白”或“人源化CD93蛋白”，均包含信号肽、胞外区、胞内区和/或跨膜区，且本发明所述的“胞外区”均不包含信号肽。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物。在一个实施方式中，所述CD93基因人源化的非人动物是啮齿类动物。在一个实施方式中，所述啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdc^scid IL-2rg^null背景的小鼠。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：人和小鼠CD93基因结构对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠CD93基因人源化改造示意图(非按比例)；

图3：CD93打靶策略示意图(非按比例)；

图4：Flp-FRT介导的同源重组过程示意图(非按比例)；

图5：F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型对照，H₂O为水对照，PC为阳性对照；

图6：CD93打靶策略示意图(非按比例)；

图7A：识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)的sgRNA的相对活性检测结果，其中，Con为阴性对照，PC为阳性对照；

图7B：识别3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA15)的sgRNA的相对活性检测结果，其中，Con为阴性对照，PC为阳性对照；

图8：F0代PCR鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型对照，H₂O为水对照；

图9：F1代PCR鉴定结果，其中，M为Marker，WT为野生型对照，H₂O为水对照，PC为阳性对照；

图10：F1代Southern blot检测结果，其中，WT为野生型对照；

图11：人CD93和鼠CD93的流式检测结果，其中，ISO为同型对照，WT为野生型C57BL/6小鼠，H/+为CD93基因人源化杂合子小鼠；

图12：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和CD93基因人源化纯合子小鼠(H/H)脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图13：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和CD93基因人源化纯合子小鼠(H/H)脾脏中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图14：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和CD93基因人源化纯合子小鼠(H/H)淋巴结中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图15：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和CD93基因人源化纯合子小鼠(H/H)淋巴结中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图16：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和CD93基因人源化纯合子小鼠(H/H)血液中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图17：C57BL/6野生型小鼠(+/+)和CD93基因人源化纯合子小鼠(H/H)血液中T细胞亚群占比的流式检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45 Antibody，来源于Biolegend，货号103138；

Pacific Blue^TM anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody，来源于Biolegend，货号103227；

PE anti-mouse CD93(AA4.1,early B lineage)Antibody，来源于Biolegend，货号136503；

APC anti-human CD93 Antibody，来源于Biolegend，货号336119；

PE Rat IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody，来源于Biolegend，货号400508；

APC Mouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody，来源于Biolegend，货号400119；

Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit，来源于Biolegend，货号423106；

Purified anti-mouse CD16/32Antibody，来源于Biolegend，货号101302；

PerCP anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)Antibody，来源于Biolegend，货号108426；

Brilliant Violet 421^TM anti-mouse CD4，来源于Biolegend，货号100438；

FITC anti-mouse F4/80，来源于Biolegend，货号123108；

PE anti-mouse CD8a Antibody，来源于Biolegend，货号100708；

PE/Cy^TM 7 Mouse anti-mouse NK1.1，来源于Biolegend，货号552878；

APC anti-mouse/rat Foxp3，来源于eBioscience，货号17-5773-82；

FITC anti-Mouse CD19，来源于Biolegend，货号115506；

PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain，来源于Biolegend，货号109228；

Brilliant Violet 605^TManti-mouse CD11c，来源于Biolegend，货号117334；

PE anti-mouse/human CD11b，来源于Biolegend，货号101208。

实施例1 CD93基因人源化小鼠的制备

本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人源化CD93蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人源化CD93蛋白。小鼠CD93基因(NCBI Gene ID：17064，Primary source：MGI:106664，UniProt ID：O89103，位于2号染色体NC_000068.8的第148278571位至第148285455位，基于转录本NM_010740.3及其编码蛋白NP_034870.1(SEQ ID NO：1))和人CD93基因(NCBI Gene ID：22918，Primary source：HGNC：15855，UniProt ID：Q9NPY3，位于20号染色体NC_000020.11的第23076554-23086830位，基于转录本NM_012072.4及其编码蛋白NP_036204.2(SEQ ID NO：2))。对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CD93基因座引入编码人CD93蛋白的核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CD93蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源CD93基因座上用人CD93基因的核苷酸序列(例如DNA序列、cDNA序列等)替换小鼠相应序列，如将至少包含小鼠CD93基因外显子1的部分序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化CD93基因座(示意图如图2所示)，实现对小鼠CD93基因的人源化改造。

进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠CD93基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CD93序列的A1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000068.8第148285345至148290026位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000068.8第148274543至148278013位核苷酸序列相同；A1片段中包含的人CD93序列如SEQ ID NO：5所示。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中，Neo盒5’端与鼠的连接设计为

其中，序列“AGGGTT”的最后一个“T”是鼠的最后一个核苷酸，序列

的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与鼠的连接设计为

内，其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列

的第一个“T”是鼠的第一个核苷酸。人CD93序列5’端与鼠CD93序列的连接设计为

其中，序列“AGAAGA”的最后一个“A”是鼠的最后一个核苷酸，序列

的第一个“A”是人的第一个核苷酸；人CD93序列3’端与鼠的连接设计为

内，其中序列“AAAAG”的最后一个“G”是人的最后一个核苷酸，序列

的第一个“C”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CD93的mRNA序列如SEQ ID NO：6所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：7所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR(PCR引物详见表1)和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用SpeI或ScaI或EcoRI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，酶、探针及目的片段长度如表2所示)检测，Southern Blot检测结果表明，经PCR验证为阳性的胚胎干细胞均为阳性克隆，且无随机插入。

表1 PCR检测引物序列及目的片段长度

表2 Southern Blot酶和探针表

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				SpeI	5’Probe	20.9kb	15.8kb
ScaI	3’Probe	8.9kb	10.7kb
				EcoRI	Neo Probe	--	6.3kb

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

5’Probe-F：5’-AAGCATCGTGGCCTTTATTTCCCCA-3’(SEQ ID NO：18)，

5’Probe-R：5’-TGGGCACAAAGATCCCAGCTTACTA-3’(SEQ ID NO：19)；

3’探针(3’Probe)：

3’Probe-F：5’-TCAAGGAAGATTCAGAGGAACAGGG-3’(SEQ ID NO：20)，

3’Probe-R：5’-AGCCACTCAACACCACAAGAGATTC-3’(SEQ ID NO：21)；

Neo探针(Neo Probe)：

Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：22)，

Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：23)。

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图4)后，再通过互相交配即可得到人源化CD93基因纯合子小鼠。示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图5，其中，编号为F1-01至F1-08的8只小鼠均为阳性杂合小鼠。PCR测定引物如表3所示。

表3 PCR检测引物序列及目的片段长度

此外，还可引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，以图2所示的CD93基因人源化小鼠为例，设计如图6所示的打靶策略。图中显示了靶向载体上含有小鼠CD93上游和下游的同源臂序列，以及人CD93 DNA片段。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：8)与NCBI登录号为NC_000068.8的第148285345至148286724位序列相同；上述下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：9)与NCBI登录号为NC_000068.8的第148282209至148283628位核苷酸序列相同；人CD93 DNA片段序列(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000020.11的第23084453至23086192位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠CD93的mRNA序列如SEQ ID NO：6所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：7所示。打靶载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的打靶载体用于后续实验。

设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA15)的sgRNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点分别位于小鼠CD93基因第1号外显子上游和第1号外显子下游，各sgRNA的靶位点序列如下：

sgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO：28)：5’-GGCACTCAGCTTGCCCCAATGGG-3’

sgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO：29)：5’-ATTCTCATTGCAGCGATGCTGGG-3’

sgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO：30)：5’-CTGCCTGCTATACAGCCCATTGG-3’

sgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO：31)：5’-TCACAGGCTGTGGTGTGCGAGGG-3’

sgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO：32)：5’-CACAGGCTGTGGTGTGCGAGGGG-3’

sgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO：33)：5’-TCTTGCCACCGTGAAGAGTGAGG-3’

sgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO：34)：5’-CCAAGGGTGCCTTGGTCTTCAGG-3’

sgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO：35)：5’-TTGCTGTGGCCGGAGGTCGTGGG-3’

sgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO：36)：5’-ATCTGATGTCTGGTTCGAGTTGG-3’

sgRNA10靶位点序列(SEQ ID NO：37)：5’-TGTCGGCTTGCTGTGGCCGGAGG-3’

sgRNA11靶位点序列(SEQ ID NO：38)：5’-ACATACCTCCCCACGACCTCCGG-3’

sgRNA12靶位点序列(SEQ ID NO：39)：5’-ATGCAGCCGACAGCTATTCCTGG-3’

sgRNA13靶位点序列(SEQ ID NO：40)：5’-GAACTGGGCATTTCAGTAGGAGG-3’

sgRNA14靶位点序列(SEQ ID NO：41)：5’-CTTAGAGCCACTAGGAGAACTGG-3’

sgRNA15靶位点序列(SEQ ID NO：42)：5’-TCATAAACGGAGAGCCAAGAAGG-3’

利用UCA试剂盒检测各sgRNA的活性结果见图7A、图7B，选择sgRNA3和sgRNA10进行后续实验。在其互补链两端分别加上互补序列得到反向寡核苷酸，将寡核苷酸通过互补序列连接至pCS-4G-sgRNA质粒(质粒先用BamHI和XhoI线性化)，获得表达载体pCS-4G-sgRNA3和pCS-4G-sgRNA10。

取小鼠的原核期受精卵，例如C57BL/6小鼠，利用显微注射仪将pCS-4G-sgRNA3和pCS-4G-sgRNA10质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的CD93基因人源化小鼠品系。

可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的鉴定结果见图8。结合5’端引物(A-L-GT-F/A-L-GT-R，见表4)检测结果和3’端引物(A-R-GT-F/A-R-GT-R)检测结果可知，图8中编号为F0-01、F0-03和F0-06的3只小鼠为阳性小鼠。PCR分析包括表4所示引物。

表4 F0代PCR检测引物序列及目的片段长度

将F0鉴定为阳性的人源化小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，PCR引物与F0代基因型鉴定相同。鉴定结果如图9所示，显示编号为F1-01到F1-08的8只小鼠均为阳性小鼠。

进一步的将PCR鉴定为阳性的F1小鼠进行Southern blot检测(具体探针及目的片段的长度见表5)，确认是否存在随机插入。剪尾提取基因组DNA，选用AseI或ScaI酶消化基因组，转膜，杂交。探针A Probe、3’Probe分别位于A2片段上和3’同源臂外侧。探针合成引物如下：

3’Probe-F(SEQ ID NO：47)：5’-CGGGCTCAGTGGGATGCCTGAAAT-3’，

3’Probe-R(SEQ ID NO：48)：5’-CAGTTGAAGTCCTACACAGCAGCCTG-3’；

A Probe-F(SEQ ID NO：49)：5’-CACCGTGCCCCGTGCTGCAACA-3’，

A Probe-R(SEQ ID NO：50)：5’-CTTTTGCCCGTCAGTGCCATCG-3’；

表5具体探针及目的片段的长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段
				AseI	A Probe	--	13.7kb
ScaI	3’Probe	3.5kb	4.7kb

Southern blot检测示例性结果见图10。综合A Probe、3’Probe探针的结果表明，编号为F1-01到F1-08的8只小鼠无随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的CD93人源化基因工程小鼠。

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化CD93蛋白的表达情况，如流式细胞术检测(FACS)等。选取7周龄雌性野生型C57BL/6小鼠(+/+)和CD93基因人源化杂合子小鼠(H/+)各1只，脱颈安乐死后取骨髓细胞，分别用人鼠CD45R/B220交叉识别抗体PacificBlue^TM anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody(mB220)、抗鼠CD45抗体BrilliantViolet 510^TM anti-mouse CD45Antibody、抗鼠CD93抗体PE anti-mouse CD93(AA4.1,early B lineage)Antibody(mCD93)或抗人CD93抗体APC anti-human CD93 Antibody(hCD93)识别染色后进行流式检测，其中分别PE Rat IgG2a,κIsotype Ctrl Antibody、APCMouse IgG1,κIsotype Ctrl Antibody作为ISO同型对照，结果如图11所示。流式分析结果表明，在野生型小鼠骨髓细胞中检测到鼠CD93的表达(图11B)，但未检测到人源化CD93的表达(图11E)；在CD93基因人源化杂合子小鼠体内检测到人源化CD93的表达(图11F)，也检测到鼠CD93的表达(图11C)。

实施例2 CD93基因人源化小鼠免疫分型检测

采用流式细胞术检测CD93基因人源化小鼠体内白细胞免疫分型情况。具体来说，选取野生型C57BL/6小鼠(+/+)与实施例1制得的CD93基因人源化纯合子小鼠(H/H)各3只，脱颈安乐死后分别取脾脏、淋巴结和血液样本并制备单细胞悬液，用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45Antibody、抗鼠Gr-1抗体PerCP anti-mouseLy-6G/Ly-6C(Gr-1)antibody、抗鼠CD4抗体Brilliant Violet 421^TM anti-mouse CD4antibody、抗鼠F4/80抗体FITC anti-mouse F4/80antibody、抗鼠CD8a抗体PE anti-mouseCD8a antibody、抗鼠NK抗体PE/Cy^TM 7 Mouse anti-mouse NK1.1 antibody、抗鼠Foxp3抗体APC anti-mouse/rat Foxp3antibody、抗鼠CD19抗体FITC anti-Mouse CD19 antibody、抗鼠TCRβ抗体PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain antibody、抗鼠CD11c抗体BrilliantViolet 605^TManti-mouse CD11c antibody、抗鼠CD11b抗体PE anti-mouse/human CD11bantibody识别染色后进行流式细胞术检测。

脾脏中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图12和图13所示，淋巴结中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图14和图15所示，血液中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图16和图17所示。从图中可以看出，CD93基因人源化纯合子小鼠脾脏、淋巴结和血液样本中T细胞、B细胞、NK细胞、DC细胞(Dendritic cell)、粒细胞(Granulocyte)、单核细胞(Monocyte)、巨噬细胞(Macrophage)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图12、图14、图16)，CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞和Tregs细胞等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠基本一致(图13、图15、图17)，表明CD93基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞的分化、发育和在淋巴组织中的分布。

实施例3体内药效验证

利用本方法制得的CD93人源化小鼠可以用于评估靶向人CD93的调节剂的药效。例如，取CD93人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm³后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人CD93的药物，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，可通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估靶向人CD93的药物的体内安全性和体内药效。

实施例4双基因或多基因人源化小鼠

利用本方法或制得的CD93基因人源化小鼠还可以制备双基因修饰或多基因修饰的小鼠模型。如前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、CD73等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化CD93小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得CD93与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的CD93小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到CD93基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人CD93和其它基因调节剂的体内药效验证等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> CD93基因人源化非人动物及其构建方法和应用

<130> BHCD93.002CN1-P0102021030172Z

<150> 202110485868.5

<151> 2021-04-30

<160> 52

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 644

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Met Ala Ile Ser Thr Gly Leu Phe Leu Leu Leu Gly Leu Leu Gly Gln

1 5 10 15

Pro Trp Ala Gly Ala Ala Ala Asp Ser Gln Ala Val Val Cys Glu Gly

20 25 30

Thr Ala Cys Tyr Thr Ala His Trp Gly Lys Leu Ser Ala Ala Glu Ala

35 40 45

Gln His Arg Cys Asn Glu Asn Gly Gly Asn Leu Ala Thr Val Lys Ser

50 55 60

Glu Glu Glu Ala Arg His Val Gln Gln Ala Leu Thr Gln Leu Leu Lys

65 70 75 80

Thr Lys Ala Pro Leu Glu Ala Lys Met Gly Lys Phe Trp Ile Gly Leu

85 90 95

Gln Arg Glu Lys Gly Asn Cys Thr Tyr His Asp Leu Pro Met Arg Gly

100 105 110

Phe Ser Trp Val Gly Gly Gly Glu Asp Thr Ala Tyr Ser Asn Trp Tyr

115 120 125

Lys Ala Ser Lys Ser Ser Cys Ile Phe Lys Arg Cys Val Ser Leu Ile

130 135 140

Leu Asp Leu Ser Leu Thr Pro His Pro Ser His Leu Pro Lys Trp His

145 150 155 160

Glu Ser Pro Cys Gly Thr Pro Glu Ala Pro Gly Asn Ser Ile Glu Gly

165 170 175

Phe Leu Cys Lys Phe Asn Phe Lys Gly Met Cys Arg Pro Leu Ala Leu

180 185 190

Gly Gly Pro Gly Arg Val Thr Tyr Thr Thr Pro Phe Gln Ala Thr Thr

195 200 205

Ser Ser Leu Glu Ala Val Pro Phe Ala Ser Val Ala Asn Val Ala Cys

210 215 220

Gly Asp Glu Ala Lys Ser Glu Thr His Tyr Phe Leu Cys Asn Glu Lys

225 230 235 240

Thr Pro Gly Ile Phe His Trp Gly Ser Ser Gly Pro Leu Cys Val Ser

245 250 255

Pro Lys Phe Gly Cys Ser Phe Asn Asn Gly Gly Cys Gln Gln Asp Cys

260 265 270

Phe Glu Gly Gly Asp Gly Ser Phe Arg Cys Gly Cys Arg Pro Gly Phe

275 280 285

Arg Leu Leu Asp Asp Leu Val Thr Cys Ala Ser Arg Asn Pro Cys Ser

290 295 300

Ser Asn Pro Cys Thr Gly Gly Gly Met Cys His Ser Val Pro Leu Ser

305 310 315 320

Glu Asn Tyr Thr Cys Arg Cys Pro Ser Gly Tyr Gln Leu Asp Ser Ser

325 330 335

Gln Val His Cys Val Asp Ile Asp Glu Cys Gln Asp Ser Pro Cys Ala

340 345 350

Gln Asp Cys Val Asn Thr Leu Gly Ser Phe His Cys Glu Cys Trp Val

355 360 365

Gly Tyr Gln Pro Ser Gly Pro Lys Glu Glu Ala Cys Glu Asp Val Asp

370 375 380

Glu Cys Ala Ala Ala Asn Ser Pro Cys Ala Gln Gly Cys Ile Asn Thr

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Tyr Cys Ser Cys Lys Glu Gly Tyr Ile Val Ser Gly

405 410 415

Glu Asp Ser Thr Gln Cys Glu Asp Ile Asp Glu Cys Ser Asp Ala Arg

420 425 430

Gly Asn Pro Cys Asp Ser Leu Cys Phe Asn Thr Asp Gly Ser Phe Arg

435 440 445

Cys Gly Cys Pro Pro Gly Trp Glu Leu Ala Pro Asn Gly Val Phe Cys

450 455 460

Ser Arg Gly Thr Val Phe Ser Glu Leu Pro Ala Arg Pro Pro Gln Lys

465 470 475 480

Glu Asp Asn Asp Asp Arg Lys Glu Ser Thr Met Pro Pro Thr Glu Met

485 490 495

Pro Ser Ser Pro Ser Gly Ser Lys Asp Val Ser Asn Arg Ala Gln Thr

500 505 510

Thr Gly Leu Phe Val Gln Ser Asp Ile Pro Thr Ala Ser Val Pro Leu

515 520 525

Glu Ile Glu Ile Pro Ser Glu Val Ser Asp Val Trp Phe Glu Leu Gly

530 535 540

Thr Tyr Leu Pro Thr Thr Ser Gly His Ser Lys Pro Thr His Glu Asp

545 550 555 560

Ser Val Ser Ala His Ser Asp Thr Asp Gly Gln Asn Leu Leu Leu Phe

565 570 575

Tyr Ile Leu Gly Thr Val Val Ala Ile Ser Leu Leu Leu Val Leu Ala

580 585 590

Leu Gly Ile Leu Ile Tyr His Lys Arg Arg Ala Lys Lys Glu Glu Ile

595 600 605

Lys Glu Lys Lys Pro Gln Asn Ala Ala Asp Ser Tyr Ser Trp Val Pro

610 615 620

Glu Arg Ala Glu Ser Gln Ala Pro Glu Asn Gln Tyr Ser Pro Thr Pro

625 630 635 640

Gly Thr Asp Cys

<210> 2

<211> 652

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Ala Thr Ser Met Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

Gln Pro Gly Ala Gly Thr Gly Ala Asp Thr Glu Ala Val Val Cys Val

20 25 30

Gly Thr Ala Cys Tyr Thr Ala His Ser Gly Lys Leu Ser Ala Ala Glu

35 40 45

Ala Gln Asn His Cys Asn Gln Asn Gly Gly Asn Leu Ala Thr Val Lys

50 55 60

Ser Lys Glu Glu Ala Gln His Val Gln Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu

65 70 75 80

Arg Arg Glu Ala Ala Leu Thr Ala Arg Met Ser Lys Phe Trp Ile Gly

85 90 95

Leu Gln Arg Glu Lys Gly Lys Cys Leu Asp Pro Ser Leu Pro Leu Lys

100 105 110

Gly Phe Ser Trp Val Gly Gly Gly Glu Asp Thr Pro Tyr Ser Asn Trp

115 120 125

His Lys Glu Leu Arg Asn Ser Cys Ile Ser Lys Arg Cys Val Ser Leu

130 135 140

Leu Leu Asp Leu Ser Gln Pro Leu Leu Pro Ser Arg Leu Pro Lys Trp

145 150 155 160

Ser Glu Gly Pro Cys Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Asn Ile Glu

165 170 175

Gly Phe Val Cys Lys Phe Ser Phe Lys Gly Met Cys Arg Pro Leu Ala

180 185 190

Leu Gly Gly Pro Gly Gln Val Thr Tyr Thr Thr Pro Phe Gln Thr Thr

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Glu Ala Val Pro Phe Ala Ser Ala Ala Asn Val Ala

210 215 220

Cys Gly Glu Gly Asp Lys Asp Glu Thr Gln Ser His Tyr Phe Leu Cys

225 230 235 240

Lys Glu Lys Ala Pro Asp Val Phe Asp Trp Gly Ser Ser Gly Pro Leu

245 250 255

Cys Val Ser Pro Lys Tyr Gly Cys Asn Phe Asn Asn Gly Gly Cys His

260 265 270

Gln Asp Cys Phe Glu Gly Gly Asp Gly Ser Phe Leu Cys Gly Cys Arg

275 280 285

Pro Gly Phe Arg Leu Leu Asp Asp Leu Val Thr Cys Ala Ser Arg Asn

290 295 300

Pro Cys Ser Ser Ser Pro Cys Arg Gly Gly Ala Thr Cys Val Leu Gly

305 310 315 320

Pro His Gly Lys Asn Tyr Thr Cys Arg Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu

325 330 335

Asp Ser Ser Gln Leu Asp Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Gln Asp Ser

340 345 350

Pro Cys Ala Gln Glu Cys Val Asn Thr Pro Gly Gly Phe Arg Cys Glu

355 360 365

Cys Trp Val Gly Tyr Glu Pro Gly Gly Pro Gly Glu Gly Ala Cys Gln

370 375 380

Asp Val Asp Glu Cys Ala Leu Gly Arg Ser Pro Cys Ala Gln Gly Cys

385 390 395 400

Thr Asn Thr Asp Gly Ser Phe His Cys Ser Cys Glu Glu Gly Tyr Val

405 410 415

Leu Ala Gly Glu Asp Gly Thr Gln Cys Gln Asp Val Asp Glu Cys Val

420 425 430

Gly Pro Gly Gly Pro Leu Cys Asp Ser Leu Cys Phe Asn Thr Gln Gly

435 440 445

Ser Phe His Cys Gly Cys Leu Pro Gly Trp Val Leu Ala Pro Asn Gly

450 455 460

Val Ser Cys Thr Met Gly Pro Val Ser Leu Gly Pro Pro Ser Gly Pro

465 470 475 480

Pro Asp Glu Glu Asp Lys Gly Glu Lys Glu Gly Ser Thr Val Pro Arg

485 490 495

Ala Ala Thr Ala Ser Pro Thr Arg Gly Pro Glu Gly Thr Pro Lys Ala

500 505 510

Thr Pro Thr Thr Ser Arg Pro Ser Leu Ser Ser Asp Ala Pro Ile Thr

515 520 525

Ser Ala Pro Leu Lys Met Leu Ala Pro Ser Gly Ser Pro Gly Val Trp

530 535 540

Arg Glu Pro Ser Ile His His Ala Thr Ala Ala Ser Gly Pro Gln Glu

545 550 555 560

Pro Ala Gly Gly Asp Ser Ser Val Ala Thr Gln Asn Asn Asp Gly Thr

565 570 575

Asp Gly Gln Lys Leu Leu Leu Phe Tyr Ile Leu Gly Thr Val Val Ala

580 585 590

Ile Leu Leu Leu Leu Ala Leu Ala Leu Gly Leu Leu Val Tyr Arg Lys

595 600 605

Arg Arg Ala Lys Arg Glu Glu Lys Lys Glu Lys Lys Pro Gln Asn Ala

610 615 620

Ala Asp Ser Tyr Ser Trp Val Pro Glu Arg Ala Glu Ser Arg Ala Met

625 630 635 640

Glu Asn Gln Tyr Ser Pro Thr Pro Gly Thr Asp Cys

645 650

<210> 3

<211> 4682

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

agatgagaaa agggtgcagg acctaagtct cacatgacct tttctttgag tttcattatt 60

tttcatggct cctgagtgtg ttcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtatg ttaatctatt 120

gttagtttgt ttgtacagag tatatttaaa attgccaatg gaaaatgtga acttccttga 180

gtcacatggg ataatagtgt cttagtgact cagttctcag aactcaggtt ctgtctagtc 240

ccttacactc taatactagc attcactgtg aatccactta tagattgtag aatcgtaggg 300

gcttggccat cataccttct gagtgacccc cccaactatt ataagcttac tctctgagaa 360

gcaaggataa ttttgaaact ggctccgagt ctggacacac caagacacaa attcattacg 420

taacaatgct tctgtgcttc ctataggaaa gacatccaga gcccattcaa ggatagttgg 480

aaacagattt tcaaaaacga ataatctcag aggaagccag tttgtctagt ccctgacttt 540

ctgaggtcac aggctcaaat ttaccctccc agaacaggat aactcactag cctggaggac 600

agtgaatagc aaagagaagc catgactttc tttctctcct ctagagaaat tcctcacaac 660

tgacgaggga ggcaactgga acttgtgaca aatggctttc ttttgctggt ccactggtca 720

ataaagggct tttaaattag aaatctattt gtttgtttgt ttgtttgttt gttatgtgtg 780

tgtatgtgtg tgtttgtgta ggtcagagga caactcatag gagtcagttt ttcttctact 840

atgtggatcc gggggctcaa actcaggttg tcaggcttgt ccaaaagtgc ctttacttgt 900

ttacccacta aaataaaaag agacctgtta gcattccttc taggctccac cccacttact 960

gggcaacaac caggtatgcc tggctcagta taaaagaggc tgtttgttcc ctcctcactc 1020

tcttcctagc ttactctctt accctcttac tctcttccct ttctgtccct tctctcttca 1080

ttctcctccc acactctctc catggcctct actcctctct ctctttccct ctcctcttcc 1140

cctccccact tctcactctc tgtctccact cctgtcccaa gtcccttttc catgtcctaa 1200

ataaagtcta ttcttaggag gaagggatgc ctcagaatgg gcccttagag gcatcccctc 1260

ccctgaacct taccgcatct ctatcaaaca tatcctggtt ctttattctg tcttataaaa 1320

cacaacaaag ccttgttttc atccgttata cattttctgt gaatgaatca ccacctgctt 1380

ccctgcatct gttaggtttt caacctgggc ctgccctgtg tttagctgct ggctctgtgg 1440

aatgtattga ccctctgccc agggacaccc tgatttctgg ctcactgttg aaatgtgtcc 1500

ttcatcacca aggcagcagc tgctgaggtc actggggcca ccctgtttcc catcattctc 1560

ttgcgccttc tccattctat ctgctacaag gctcataaca cagtgcagcc catgctctca 1620

ccaccatgtt ggtgacaatg ctgccaagta cacagtaggt gatcattgtg cactcaagga 1680

agaagaaacc acaaaggcat acacaggcac ctatggatgg taggagatgc tgtgggctac 1740

actattacat agtttgtctc tacacctcca ggagggagag agagagagag agacagagag 1800

agacagagag aagccagata aatcctggaa tgacttctaa gcaacaaacc tgctgctaac 1860

tgagactgaa ctgatcattc cagttccagt gagatgtgag ataccttttt aaaatcaatt 1920

cagaaaaaaa gctcagagta ctcagcaaga ctgcaaagga gaaataggga actataggct 1980

aagtctcgcc aggcttggga ttgttctgga acagtcccca cattcttttc tggtcctgga 2040

agcccaagtt tgcatgctga ccatcaccta actccacttc tcagtgtcta caaaaagttc 2100

ttatgttatc tcttcagttt tccccaaagg attccaaaga aaatcccaaa tcatttcatg 2160

tcctggggct ctactgtctt ctgtatcctg cctcccatgc ctcaggctct aggctcagtg 2220

caaccaaccc cttgtccaca aggccatggt gtatattctt tcccacatgt gccccattct 2280

tagatatctt ccccttagaa cattgtttct taatctgtgg ttgcgaccct ttcaggagtt 2340

aagtgactca caggagccac atatcatata tcctgaatgt cacatattta cattataatt 2400

cataacagtt gcaaaattac agttaaaagg tagtaatgaa aataatttta tggtgggggg 2460

ggtggtcact gcagcatgag gaagtgtatt aaggggtcac agcattagga aggtaaagaa 2520

ccactgcctc agagtctaac tccgttgccc tttttattcc cttccgtact gcctacttcc 2580

cactaccagc ttcggattct gataatggtc ttttctgcca ccccttgctt tgccttatgt 2640

tgccttcaat gaagtgaatc aatactgaat tgttcacatt tgtcactttt tgaaatcatg 2700

aaggtaagaa tacctccctg taattagtgt ttagcctggt atccaatatg aaaagttatt 2760

agactggtag atggctgagt agatggatgg attagtgcat ggctgagtag ctaagtggat 2820

gatgaggtgg atggaatgct atggacacct gagaaaaggt ttgagtgaat tcttgggaat 2880

caggtcttgt tagttctgaa ctccagatag cattccccta aaaacctgcc tagacaatat 2940

cctgaacccc aataaaagct ttgatatcct ctcttcctct ctccatcctt ctcccccctt 3000

cctccctagt ctccccctat cttctctctg tccttccctc tccttatttc tctcccctcc 3060

ctctcccttt cagtgttgcc atagttcccc acttcccact aacattgaga tctgtggtaa 3120

cacaaatctc ttaattcaca tgttcttttg ggttgcttcc tcttgcaagt cacgaccaca 3180

ctcacaaccg tgggcatctt gggaagaaga aattgcatct aataaagaaa acaaaacaaa 3240

acaaaacacc cccccacccc accccaaaaa atctatcagg acatttgccc gtgtcaagcc 3300

ctgcctctgg aaggggcata tgatctggca ggccaagact agaaattgca aagtgacctc 3360

aaaagcaagt gagagaacag tgtagccagc tgccagcaat agaggagtga gtgctcaaga 3420

tctgcccaga atcctgcctc agctggatcc tgcctccact gggatgactc tgtgaagtgg 3480

cttttaacct atcttaggag gctgggctca ttagcacact tgtgtggcct cattctgtta 3540

ctactttcct ttatctctta atctaacact ttctccaaag tgttagactc tgagtctagc 3600

tggggtcaag tagaatatgg tggtggttgg ggacaggggc agttaaacgt agtttccacc 3660

ttccagtggc tagctttgat tgagacaggc cttggcccag gtgctgtgag ctgtaacgcc 3720

tgcccgggtg ttgattctta catcgtgatt ttgagctgca gcctctgatt gtgctcctgt 3780

gcctttgaac tccgcctaag ccttgggtta gggaatatga caaggcaggc caggttcatt 3840

ttcccatctt tctgatcttt tggggaccct gacacttcat ttatagtgca ctaggaaacc 3900

ctgaaaacta ttttcacctt tttaaaaaat atatatattc tcatggagat tgacattgtt 3960

ggaaacccag aaattcccac agccaaaatc ctatttaaaa gcttcctgtc tatttaaagt 4020

tcatgatggg aagaataaaa gaaaaaaacg actccaaaaa cagagacagg gtacaagata 4080

ggaaaaaaaa gcagatccag tttgcttcta aaaaaggccg aaaactataa tctttccatg 4140

cccttgtgtc tcaagcgtca catatttttc tttcccttct ggtggtttgc aatctgaagt 4200

ggaattttat catgggttac ttggatgata cttttcaagt ctctaccctc ccacccccca 4260

aagtctctgc tcactggaca gcatgccact ggggctcttt gtggtatggg aaagtgaacg 4320

gactcaaaat aaagcagcca tatctcttgg atcctctgtg tttccacagc tctgagccag 4380

agactgccct ctgaacaaca aaaccgtgat gaaggcaaca ggagtcagaa ggctattcat 4440

ggcaggaaac cccagcatcc ggtgagaaat aagaagtagg agagcacagg atgcgccctg 4500

ggtcaggagg acgtgaaaag cgagtctttg taaccttctc aatgccagag ctgtggtagt 4560

gtgaaagcag cagtgcgcct ctgctccctt cagagcacag cctggtgtca aggtccaggt 4620

tccaccggct gctgctgtca ccgcagggga gtctagcccc tcccagaagg agacacagaa 4680

ga 4682

<210> 4

<211> 3471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

taagtgagat aaagggctct attctataat gctaatcaca taggacaatt tcaataaata 60

tccattaaaa ttaaataaag cagatcttct agtagttaag ccgctaacaa aatacattga 120

cacattggga aatctcaatt tattctgaga cttccaacac acacacacac acacacacac 180

acacacacac acacacaccc tatagacata gacacaacat acaaacacaa acacacaatc 240

ttaacatcta tttcataatg aatcaaccag agatcaatgt tccctggttt agggaaagct 300

cccattttaa tagcagcatc ttctccttcc tgtaaattac ttagatgtca ggtaagtctt 360

gtcaaaagtg tttacccaaa tgctcaatat acagagttac ttgtatccgt ggtacatctt 420

cattgtcatc agacagttga ctgagattga agagtcatag agacagtgcg gacattctgt 480

ggtattcagt tgagttaagt gagcatgcta agttctcggc caatgcttaa atgtatttaa 540

taagaaggga gagtagtatc agagaaaaac atgcctccaa accaaaacat cctcagctta 600

gacttcctct aaatggtatt ttcatgtgac acaggctttc gaagagagtc tctggacttg 660

ttcttcaagc ctcttgatgt tcccagggag atccttttca taggaaaaag agaagaaaga 720

tctagggctg gtggtacaca ctatctgaga acttgagagg gagagtcaga agacaagttc 780

atggtcagct tgagctatgt aatgagagtc tttcttgaaa ataacgtgaa atttaaaaaa 840

ggacggagca aagacaggaa gggggaatga aggaagggag aaaggaaaga agaaagcagg 900

aaaagacaaa ctaaaagaac tgaataagtt tttagaccaa aaattattca aagaagttca 960

atttgacaga ccttcaccgg gctgcttagc tcagtgaggg cactgtcttg cctccaggaa 1020

gcacactgct agaggtggtc acagccactg tgtctcaatt aatcctattt gttgtttttg 1080

tttgtttgtt tgtttttaat tgagattcat ttccgttttc ttgggtactg atctgatttc 1140

ctatgttcca ccctggttca tagtgtttaa attgatggaa ggaagaagaa ggaggaggaa 1200

agcaaagaag ggagggaaga aggggagggg aggggaggaa ggaggaggaa gggatgagag 1260

aagggatgga ggggagggga agggaaggga gggcaggaga ggaaggagga ggaagggagg 1320

agagaaggaa gggaggggag gagaggagag agaacacaat ggagcagggt cagccgctgc 1380

ggtggtgatg gtccctggga tcagctatca cagctctcgc ttcagctgca gtaggacttt 1440

tttcctcaaa gtcacacaga tcaccttggc catatttgaa gaagcaaagt gtctgggtag 1500

accctcatgg agacaacaca tcctctgtct agtgttcatg tcctcttatg ctgaagaatg 1560

cagcttctct cttccatatt aagctaaaca caatgttcag aagaatatgt atgaagccat 1620

aagctgagcc tatgactact tctgttacat tggatccttc gcaattaaaa ttcgacagta 1680

aagtggtaac taaaaataag aatgttaaat tttatctttt tttactttcc aggatcttgc 1740

ccctccccta agatcatgta cagaaatatt tttccttcat tgtcaaaact accaactctc 1800

ctgccacaca agagtgccgt gcgaatttaa ttcctacatc ctcctctacc gcactttgcc 1860

cactgctgct cagccctcca ggacttgctg agcagtcttc cttccatgtt aaggtctgtc 1920

aaaatctccc agggttttat cagttctggt tctggaaaga gctgtgttgt attagtgact 1980

gaaaacatac ttggtaggtt gctgcttttg tagttataat ttcttactat aactgcaaat 2040

tcaaattaca tgtctgactt taataaggtt ttattctatt gtaattttcc ccttttaata 2100

tcactgtttc atcacaaggc gctacctttc actttgtgtg ggttcttttt tgtttctttc 2160

ttctttttaa tctaataatt tttttgtttt ttttttctat gaagccacac tatttgcatt 2220

tccaaggttg tgggtgccta gaggtttagt ttatacattc ccttctgaat ggtagtgtac 2280

tatgttgatc cattacaatg gttctcaacc tgtgggtcat aactcccttg gcaaacctcg 2340

atctccaaaa atatttacat tatgattcat aacagtagca aaattacagt tatgaagcag 2400

tgacaagaat aattttatgg ttggggtcac cacaagagga ggcagtgtat taaagcatta 2460

ggaaggttga gagtctctga tctattagaa agtataccct actaggctgc ccctacatct 2520

ggtctctaat acgttacagc catccagatc agggactgac atgtgatgat acttgataaa 2580

ttcataccaa atacttgact gactgggaga tcgcagtcag aggcagcatg aatcatttca 2640

aggccttgag gatactgttg gaggcctgca ctttccatga gcatttcctg actacccatc 2700

tcctgagacc cttcaggtac ctctctggct gctcctttgc cttgtattta cttgtgggaa 2760

ctgtctacat tcaagctcgc acccctgctt gcctggacat tggtcatcat gcctatctgg 2820

tctccagatc tttccatcca ccctccttat taatcctccc ttgcacctcc atgaaaatac 2880

ctcatggaaa caacaagagg ggcaataatg tcactggaag catgggataa ctatgcaaac 2940

acatatgaag tatctcattg gatacccagc tcctattgag cagtgataaa gagctgttca 3000

gatgctatag atggtaagtc ccaaaagttt caggtgacca aatactgaac acagtgactt 3060

tcctcttgga gtagtagggt ctcagagtgc agatgagaca ctatcaggta gaatttgacc 3120

taagttcaac aactggctac agtctgctag gggaacactt gtgttcctta tacctggttt 3180

ctaagtcctc aatacttatt ccttactaac tccttccctc aggggacctc agtctctgag 3240

aaaggaattg gcttttggaa tttctctaat ttccctcacc acaatagtca agtagctata 3300

tgtcctggct tcctggcaag tgtaaggcac ttgtgagggc aaaggctgat tctttattct 3360

accctaactc atattccagt ctcagctaca gttagacaga aggcgagcag gatacattat 3420

ttcatattat ttcataatat taaggccatt gaccttccca gcatctatag g 3471

<210> 5

<211> 1740

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggccacct ccatgggcct gctgctgctg ctgctgctgc tcctgaccca gcccggggcg 60

gggacgggag ctgacacgga ggcggtggtc tgcgtgggga ccgcctgcta cacggcccac 120

tcgggcaagc tgagcgctgc cgaggcccag aaccactgca accagaacgg gggcaacctg 180

gccactgtga agagcaagga ggaggcccag cacgtccagc gagtactggc ccagctcctg 240

aggcgggagg cagccctgac ggcgaggatg agcaagttct ggattgggct ccagcgagag 300

aagggcaagt gcctggaccc tagtctgccg ctgaagggct tcagctgggt gggcgggggg 360

gaggacacgc cttactctaa ctggcacaag gagctccgga actcgtgcat ctccaagcgc 420

tgtgtgtctc tgctgctgga cctgtcccag ccgctccttc ccagccgcct ccccaagtgg 480

tctgagggcc cctgtgggag cccaggctcc cccggaagta acattgaggg cttcgtgtgc 540

aagttcagct tcaaaggcat gtgccggcct ctggccctgg ggggcccagg tcaggtgacc 600

tacaccaccc ccttccagac caccagttcc tccttggagg ctgtgccctt tgcctctgcg 660

gccaatgtag cctgtgggga aggtgacaag gacgagactc agagtcatta tttcctgtgc 720

aaggagaagg cccccgatgt gttcgactgg ggcagctcgg gccccctctg tgtcagcccc 780

aagtatggct gcaacttcaa caatgggggc tgccaccagg actgctttga agggggggat 840

ggctccttcc tctgcggctg ccgaccagga ttccggctgc tggatgacct ggtgacctgt 900

gcctctcgaa acccttgcag ctccagccca tgtcgtgggg gggccacgtg cgtcctggga 960

ccccatggga aaaactacac gtgccgctgc ccccaagggt accagctgga ctcgagtcag 1020

ctggactgtg tggacgtgga tgaatgccag gactccccct gtgcccagga gtgtgtcaac 1080

acccctgggg gcttccgctg cgaatgctgg gttggctatg agccgggcgg tcctggagag 1140

ggggcctgtc aggatgtgga tgagtgtgct ctgggtcgct cgccttgcgc ccagggctgc 1200

accaacacag atggctcatt tcactgctcc tgtgaggagg gctacgtcct ggccggggag 1260

gacgggactc agtgccagga cgtggatgag tgtgtgggcc cggggggccc cctctgcgac 1320

agcttgtgct tcaacacaca agggtccttc cactgtggct gcctgccagg ctgggtgctg 1380

gccccaaatg gggtctcttg caccatgggg cctgtgtctc tgggaccacc atctgggccc 1440

cccgatgagg aggacaaagg agagaaagaa gggagcaccg tgccccgtgc tgcaacagcc 1500

agtcccacaa ggggccccga gggcaccccc aaggctacac ccaccacaag tagaccttcg 1560

ctgtcatctg acgcccccat cacatctgcc ccactcaaga tgctggcccc cagtgggtcc 1620

ccaggcgtct ggagggagcc cagcatccat cacgccacag ctgcctctgg cccccaggag 1680

cctgcaggtg gggactcctc cgtggccaca caaaacaacg atggcactga cgggcaaaag 1740

<210> 6

<211> 6662

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtgcgcctc tgctcccttc agagcacagc ctggtgtcaa ggtccaggtt ccaccggctg 60

ctgctgtcac cgcaggggag tctagcccct cccagaagga gacacagaag aatggccacc 120

tccatgggcc tgctgctgct gctgctgctg ctcctgaccc agcccggggc ggggacggga 180

gctgacacgg aggcggtggt ctgcgtgggg accgcctgct acacggccca ctcgggcaag 240

ctgagcgctg ccgaggccca gaaccactgc aaccagaacg ggggcaacct ggccactgtg 300

aagagcaagg aggaggccca gcacgtccag cgagtactgg cccagctcct gaggcgggag 360

gcagccctga cggcgaggat gagcaagttc tggattgggc tccagcgaga gaagggcaag 420

tgcctggacc ctagtctgcc gctgaagggc ttcagctggg tgggcggggg ggaggacacg 480

ccttactcta actggcacaa ggagctccgg aactcgtgca tctccaagcg ctgtgtgtct 540

ctgctgctgg acctgtccca gccgctcctt cccagccgcc tccccaagtg gtctgagggc 600

ccctgtggga gcccaggctc ccccggaagt aacattgagg gcttcgtgtg caagttcagc 660

ttcaaaggca tgtgccggcc tctggccctg gggggcccag gtcaggtgac ctacaccacc 720

cccttccaga ccaccagttc ctccttggag gctgtgccct ttgcctctgc ggccaatgta 780

gcctgtgggg aaggtgacaa ggacgagact cagagtcatt atttcctgtg caaggagaag 840

gcccccgatg tgttcgactg gggcagctcg ggccccctct gtgtcagccc caagtatggc 900

tgcaacttca acaatggggg ctgccaccag gactgctttg aaggggggga tggctccttc 960

ctctgcggct gccgaccagg attccggctg ctggatgacc tggtgacctg tgcctctcga 1020

aacccttgca gctccagccc atgtcgtggg ggggccacgt gcgtcctggg accccatggg 1080

aaaaactaca cgtgccgctg cccccaaggg taccagctgg actcgagtca gctggactgt 1140

gtggacgtgg atgaatgcca ggactccccc tgtgcccagg agtgtgtcaa cacccctggg 1200

ggcttccgct gcgaatgctg ggttggctat gagccgggcg gtcctggaga gggggcctgt 1260

caggatgtgg atgagtgtgc tctgggtcgc tcgccttgcg cccagggctg caccaacaca 1320

gatggctcat ttcactgctc ctgtgaggag ggctacgtcc tggccgggga ggacgggact 1380

cagtgccagg acgtggatga gtgtgtgggc ccggggggcc ccctctgcga cagcttgtgc 1440

ttcaacacac aagggtcctt ccactgtggc tgcctgccag gctgggtgct ggccccaaat 1500

ggggtctctt gcaccatggg gcctgtgtct ctgggaccac catctgggcc ccccgatgag 1560

gaggacaaag gagagaaaga agggagcacc gtgccccgtg ctgcaacagc cagtcccaca 1620

aggggccccg agggcacccc caaggctaca cccaccacaa gtagaccttc gctgtcatct 1680

gacgccccca tcacatctgc cccactcaag atgctggccc ccagtgggtc cccaggcgtc 1740

tggagggagc ccagcatcca tcacgccaca gctgcctctg gcccccagga gcctgcaggt 1800

ggggactcct ccgtggccac acaaaacaac gatggcactg acgggcaaaa gctgcttctg 1860

ttttacatcc tggggacggt ggtggccatc tcactcttgc tggtgctggc cctagggatt 1920

ctcatttatc ataaacggag agccaagaag gaggagataa aagagaagaa gcctcagaat 1980

gcagccgaca gctattcctg ggttccagag cgagcagaga gccaagcccc ggagaatcag 2040

tacagcccaa caccagggac agactgctga agactatgtg gccttagaga cagctgccac 2100

taccttcaga gctaccttct tagatgaggg ggaagccaca tcattctgaa tgacttgact 2160

ggactctcag caaaaaaatt gtgcaccttc cacttaagaa cctggtggct tgggataggc 2220

aggtattttc ttggtgcctt tgatatgtct gggggtgaaa gctgtgtgtt ggtttgtcat 2280

tgtggggagt tttgtggata ttgacagacc tcactcaaac acccttttca aatccaatag 2340

caactggttc ctctggttcc taattagggg gaaaggagtc agaggggtgg gacagggtgg 2400

ggggatgggg cttcaaagtt ttttcttatc acttgattta tcatcgaagg agttactggt 2460

gctaattaca atggaaacag ttcctttcca tcacaggaca gacagcaaac caatttaaaa 2520

ctacttaact aggtgagagt gctctaccct tcctataggg actttttcag gatggctgcc 2580

tttgtgtaca tttgccttct ggcatttccc cttcacgtcc cccccccccc cccagccccc 2640

ttggtattgt tgaaactgtc agaatgagag gaagttcaac caactgctta gggagtaagc 2700

tggcaggaag tttagatatt gtatcccctc actcttaact ttctgatagc cttgggttta 2760

tgggcaagca aagttacaag ttgggaagtt gcttcaagtg agtgagaggt cttggtaaaa 2820

gcataatcca gagggggagg caggagggga ttgttttaac agatatttga atgaaaatat 2880

cagaatgaac tgatgctaac acacacctga ttattgagaa acaataacaa aactcctaga 2940

ttcatttgtc tttgcgctag cacaggcccc aactccactg cagggcaccc tgtctacctt 3000

tatactgtcc ctaactggaa gctggtactg taggctcaga aagccttagg aggctttcat 3060

tctgaacgta aggaaaggat gtgtgagcca ggtgatgggc tctattttaa atgctcccat 3120

ttaagtttac cttagtccac ttcacagtta aaagtacatc tggaggactt gagccctatc 3180

ttgttggcgt gacacatacc aaaccaagga ttagtcatga agaaagttct ctctctctct 3240

ttttttttct taaaaaaaaa aaaaaggaga tagaggggaa agggaaaggg gaagagagaa 3300

cagctaaaaa atgtccagcc tttaaaactg cttagagcca tcttatgatt gacatgttta 3360

tttcaaagtg tccatttaca aaagtgtccc ttaaacttgc aaaagtgtcc cttaaacttg 3420

ctgacggtaa tgttgtttca gctgcacagg tctgtctggg gactggaagg catccctggt 3480

gagtcacttc agtatctctg ggaggcttca tcttagttgt ctctgctgtt tgaaaagctg 3540

agacatggaa tgtgtctcca tcatgagatt cagagtcttt gttctcagac tagagaactt 3600

tggtttctag gaacaaaggc acccatccct caagttgata tccaggaatc gaacgttaat 3660

aacaagcaga ttcaagacct ttggaaatat cttagagaaa tatattagag aaataccttt 3720

ttttggccaa tttaaaatga agatattttt attagtctct ctctctcctc cctctctctc 3780

tctctctctt ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctgaaa acacaaggtg 3840

gagagtaatg ggaaaaagat cgggctcagt gggatgcctg aaatgagtgc atttaaaaat 3900

caactcagca tctggctttc agttgaagtt tgggtgtttg gaacaggatc cctggcaata 3960

actgagattg gcagctaatc cattaccagc agaccagcat taccagcctt tcagatcatt 4020

cagatgaatt tagagccatg gtagtatctg catatacgga catgacccta aaagcatcac 4080

ttttacctcc aggccttcaa ctgctcacct ttatggctgg agatgaggaa gataactgaa 4140

tctaggctcc ccacagctgt gtttgatcta tgcccaggct gctgtgtagg acttcaactg 4200

accaggatga cttaggggat agacatgaag ctccatttcc aatactccta ggggtacagg 4260

atccactctg tgggacccac aacagggaag ggaatgatga ggaacatatt ttctcaaagt 4320

gtgctttcag catgagccac tcccgtggag acagagctct ctcatctcct gacctgccaa 4380

agccttcagg agaaccatac ctcatgtggc aaagccaatg gagccactca ctgttcctaa 4440

atgggtgctt tattttcaca tatattcttt tttttttttt tttttgagac agggtttctc 4500

tgtatagccc tggctgtcct ggaactcact cagtagacca ggctggcctc gaactcagaa 4560

gtctgcctgc ctctgcctcc caagtgctgg gattaaaggt gtgcgccacc actgcccagc 4620

ctcacatata ttcttgctgt cctcatactt gagactggaa aattctggct tagggcatct 4680

aagaggcaaa gcaataaata agtgaacttc tactggacca aaggtgtgtt aggctatgcc 4740

ttctctaccc acgacatcag tgagcagaga cagaacactc ctctgcctgt gaggaccaga 4800

ggaagtacta cttggcaaca gaattttctt aagtccagac ctggaaaaac tgtattttgg 4860

aggggcatac cttcaggcct ccagcctacc cattactgag ttgtaggtgg ccatcactgt 4920

cctttgtatt ttatgtggtt ctggcgatgg tagccagcac atgagtatgg tagacactag 4980

ccttccagga tccctatact cctagtacct tgcattattt ttgttcatta ttaaagatag 5040

tcaaaaagca atacctcctc acccccagta atttgaggag ttaaacaaac aaacaaacaa 5100

acaaactact cagaaagaag tgcctggaga gagagagagc cctaaacact atttgcaaag 5160

gaagtctagc ctcagttttc cctggtgtct agcatggctt tgatgcaacc ccaaatgtat 5220

gcattttctg gctttggaga cccacttatc attatcatta ctaccatcac caccaccact 5280

accaccaccg tcaccatcac tgtcatcacc agctcagggt gctacgcatc atcatggtgt 5340

tttattaatg acagtaactg gatgaatccc acctgtctct aactgagagc aaaaaggcca 5400

gacagaagag gagcagaaag aagagaagcg ggctgctttc cttcagcttc atacccgggg 5460

aaaccgagta agcctctggg aaggtctacc ctgattcctt ccccagagca ctggataatg 5520

tggaatgaaa cacaaatact tttgagtaca tgttcacagt gcagggcaag ctgccgagaa 5580

agaactcttt acctcctcat caagttttcc tcctctttga gttcctaacc atgagcctcg 5640

cgtggactgt tatcaccaac caaactttca ataggtggat gggatcacta ggtcattttg 5700

ttctgcctct cttttctcat aaatatttct gcccaaacta aaggaacaga gatgagattt 5760

gaccaaaaaa ggaaaaaaaa aagattactc cattcaaaat aacatatttt ttgaaagcaa 5820

atataggaaa gccttttcct attatttttt ttcttcttag cttccccatt gtctgaattg 5880

ggaaaacagg aaagcattgc tttctagcac ctgcaaaatg gtttaatgcc cctgcatatt 5940

tccatgtcct tccaacaata gatttagcat gggaatctga aatagacgcc ctgaaaacat 6000

ctgtctcttc cccagctcct aaacccaggc tttgattatg tatggtttgt gaaatctatc 6060

atccaaaacg gggacagaca cacctcaatc ctccatgggg tcaacaacta tataccccca 6120

gtgacccctt aggcaaggac ttgttgagaa ctgcatcaca ttttgacctg ttctcaacag 6180

tacccatcta tttcaggtgg gatctctgga cctttcctcc ttcccatctt gtctgcaatg 6240

tggcaaatgg cttctttttg catttttact ccgcccccac cccaagctga agttcatttg 6300

cagatcagcg attaagtctg aattgtgtgg tggtcagtct tgtttccttt tgtcaggggt 6360

tattgtaaat gttagtaatt tcgcctcaag ccctcagtaa gaacataaat attttaaaat 6420

atgtgcgttt gaaatctgtt tcatgcatcc tggaactgtg ggatgctcag gcaagagtga 6480

ctttagtctt tcagtgaatg ttgcccagaa tgtgggtagg gaaggctcac aggttactct 6540

cctccttaga gctacaacat aacattctga ggggagtcac agggttgcct ttaaaaagtg 6600

ggagctatgt catgctttga gctttctgtt aagcacctct cctaataaac tctgaaaaaa 6660

ta 6662

<210> 7

<211> 652

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Ala Thr Ser Met Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr

1 5 10 15

Gln Pro Gly Ala Gly Thr Gly Ala Asp Thr Glu Ala Val Val Cys Val

20 25 30

Gly Thr Ala Cys Tyr Thr Ala His Ser Gly Lys Leu Ser Ala Ala Glu

35 40 45

Ala Gln Asn His Cys Asn Gln Asn Gly Gly Asn Leu Ala Thr Val Lys

50 55 60

Ser Lys Glu Glu Ala Gln His Val Gln Arg Val Leu Ala Gln Leu Leu

65 70 75 80

Arg Arg Glu Ala Ala Leu Thr Ala Arg Met Ser Lys Phe Trp Ile Gly

85 90 95

Leu Gln Arg Glu Lys Gly Lys Cys Leu Asp Pro Ser Leu Pro Leu Lys

100 105 110

Gly Phe Ser Trp Val Gly Gly Gly Glu Asp Thr Pro Tyr Ser Asn Trp

115 120 125

His Lys Glu Leu Arg Asn Ser Cys Ile Ser Lys Arg Cys Val Ser Leu

130 135 140

Leu Leu Asp Leu Ser Gln Pro Leu Leu Pro Ser Arg Leu Pro Lys Trp

145 150 155 160

Ser Glu Gly Pro Cys Gly Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ser Asn Ile Glu

165 170 175

Gly Phe Val Cys Lys Phe Ser Phe Lys Gly Met Cys Arg Pro Leu Ala

180 185 190

Leu Gly Gly Pro Gly Gln Val Thr Tyr Thr Thr Pro Phe Gln Thr Thr

195 200 205

Ser Ser Ser Leu Glu Ala Val Pro Phe Ala Ser Ala Ala Asn Val Ala

210 215 220

Cys Gly Glu Gly Asp Lys Asp Glu Thr Gln Ser His Tyr Phe Leu Cys

225 230 235 240

Lys Glu Lys Ala Pro Asp Val Phe Asp Trp Gly Ser Ser Gly Pro Leu

245 250 255

Cys Val Ser Pro Lys Tyr Gly Cys Asn Phe Asn Asn Gly Gly Cys His

260 265 270

Gln Asp Cys Phe Glu Gly Gly Asp Gly Ser Phe Leu Cys Gly Cys Arg

275 280 285

Pro Gly Phe Arg Leu Leu Asp Asp Leu Val Thr Cys Ala Ser Arg Asn

290 295 300

Pro Cys Ser Ser Ser Pro Cys Arg Gly Gly Ala Thr Cys Val Leu Gly

305 310 315 320

Pro His Gly Lys Asn Tyr Thr Cys Arg Cys Pro Gln Gly Tyr Gln Leu

325 330 335

Asp Ser Ser Gln Leu Asp Cys Val Asp Val Asp Glu Cys Gln Asp Ser

340 345 350

Pro Cys Ala Gln Glu Cys Val Asn Thr Pro Gly Gly Phe Arg Cys Glu

355 360 365

Cys Trp Val Gly Tyr Glu Pro Gly Gly Pro Gly Glu Gly Ala Cys Gln

370 375 380

Asp Val Asp Glu Cys Ala Leu Gly Arg Ser Pro Cys Ala Gln Gly Cys

385 390 395 400

Thr Asn Thr Asp Gly Ser Phe His Cys Ser Cys Glu Glu Gly Tyr Val

405 410 415

Leu Ala Gly Glu Asp Gly Thr Gln Cys Gln Asp Val Asp Glu Cys Val

420 425 430

Gly Pro Gly Gly Pro Leu Cys Asp Ser Leu Cys Phe Asn Thr Gln Gly

435 440 445

Ser Phe His Cys Gly Cys Leu Pro Gly Trp Val Leu Ala Pro Asn Gly

450 455 460

Val Ser Cys Thr Met Gly Pro Val Ser Leu Gly Pro Pro Ser Gly Pro

465 470 475 480

Pro Asp Glu Glu Asp Lys Gly Glu Lys Glu Gly Ser Thr Val Pro Arg

485 490 495

Ala Ala Thr Ala Ser Pro Thr Arg Gly Pro Glu Gly Thr Pro Lys Ala

500 505 510

Thr Pro Thr Thr Ser Arg Pro Ser Leu Ser Ser Asp Ala Pro Ile Thr

515 520 525

Ser Ala Pro Leu Lys Met Leu Ala Pro Ser Gly Ser Pro Gly Val Trp

530 535 540

Arg Glu Pro Ser Ile His His Ala Thr Ala Ala Ser Gly Pro Gln Glu

545 550 555 560

Pro Ala Gly Gly Asp Ser Ser Val Ala Thr Gln Asn Asn Asp Gly Thr

565 570 575

Asp Gly Gln Lys Leu Leu Leu Phe Tyr Ile Leu Gly Thr Val Val Ala

580 585 590

Ile Ser Leu Leu Leu Val Leu Ala Leu Gly Ile Leu Ile Tyr His Lys

595 600 605

Arg Arg Ala Lys Lys Glu Glu Ile Lys Glu Lys Lys Pro Gln Asn Ala

610 615 620

Ala Asp Ser Tyr Ser Trp Val Pro Glu Arg Ala Glu Ser Gln Ala Pro

625 630 635 640

Glu Asn Gln Tyr Ser Pro Thr Pro Gly Thr Asp Cys

645 650

<210> 8

<211> 1380

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gcctctggaa ggggcatatg atctggcagg ccaagactag aaattgcaaa gtgacctcaa 60

aagcaagtga gagaacagtg tagccagctg ccagcaatag aggagtgagt gctcaagatc 120

tgcccagaat cctgcctcag ctggatcctg cctccactgg gatgactctg tgaagtggct 180

tttaacctat cttaggaggc tgggctcatt agcacacttg tgtggcctca ttctgttact 240

actttccttt atctcttaat ctaacacttt ctccaaagtg ttagactctg agtctagctg 300

gggtcaagta gaatatggtg gtggttgggg acaggggcag ttaaacgtag tttccacctt 360

ccagtggcta gctttgattg agacaggcct tggcccaggt gctgtgagct gtaacgcctg 420

cccgggtgtt gattcttaca tcgtgatttt gagctgcagc ctctgattgt gctcctgtgc 480

ctttgaactc cgcctaagcc ttgggttagg gaatatgaca aggcaggcca ggttcatttt 540

cccatctttc tgatcttttg gggaccctga cacttcattt atagtgcact aggaaaccct 600

gaaaactatt ttcacctttt taaaaaatat atatattctc atggagattg acattgttgg 660

aaacccagaa attcccacag ccaaaatcct atttaaaagc ttcctgtcta tttaaagttc 720

atgatgggaa gaataaaaga aaaaaacgac tccaaaaaca gagacagggt acaagatagg 780

aaaaaaaagc agatccagtt tgcttctaaa aaaggccgaa aactataatc tttccatgcc 840

cttgtgtctc aagcgtcaca tatttttctt tcccttctgg tggtttgcaa tctgaagtgg 900

aattttatca tgggttactt ggatgatact tttcaagtct ctaccctccc accccccaaa 960

gtctctgctc actggacagc atgccactgg ggctctttgt ggtatgggaa agtgaacgga 1020

ctcaaaataa agcagccata tctcttggat cctctgtgtt tccacagctc tgagccagag 1080

actgccctct gaacaacaaa accgtgatga aggcaacagg agtcagaagg ctattcatgg 1140

caggaaaccc cagcatccgg tgagaaataa gaagtaggag agcacaggat gcgccctggg 1200

tcaggaggac gtgaaaagcg agtctttgta accttctcaa tgccagagct gtggtagtgt 1260

gaaagcagca gtgcgcctct gctcccttca gagcacagcc tggtgtcaag gtccaggttc 1320

caccggctgc tgctgtcacc gcaggggagt ctagcccctc ccagaaggag acacagaaga 1380

<210> 9

<211> 1420

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ctgcttctgt tttacatcct ggggacggtg gtggccatct cactcttgct ggtgctggcc 60

ctagggattc tcatttatca taaacggaga gccaagaagg aggagataaa agagaagaag 120

cctcagaatg cagccgacag ctattcctgg gttccagagc gagcagagag ccaagccccg 180

gagaatcagt acaggtaaag tgccataggt tacttgggta gctgggcagc cagatgtagg 240

cctgggaggc acagaccaca gaactgagag cagagacaaa cagtcagcag gccatttgtt 300

gtttaaagcc aacctcagca gcccagtcca aaagtgccta tctgtcctat gagttcatgt 360

ggagtagcgg caaggggacc aaggatgcag atatggcaga gttccatggc atctcacact 420

gtaatcttct gttttccaca gcccaacacc agggacagac tgctgaagac tatgtggcct 480

tagagacagc tgccactacc ttcagagcta ccttcttaga tgagggggaa gccacatcat 540

tctgaatgac ttgactggac tctcagcaaa aaaattgtgc accttccact taagaacctg 600

gtggcttggg ataggcaggt attttcttgg tgcctttgat atgtctgggg gtgaaagctg 660

tgtgttggtt tgtcattgtg gggagttttg tggatattga cagacctcac tcaaacaccc 720

ttttcaaatc caatagcaac tggttcctct ggttcctaat tagggggaaa ggagtcagag 780

gggtgggaca gggtgggggg atggggcttc aaagtttttt cttatcactt gatttatcat 840

cgaaggagtt actggtgcta attacaatgg aaacagttcc tttccatcac aggacagaca 900

gcaaaccaat ttaaaactac ttaactaggt gagagtgctc tacccttcct atagggactt 960

tttcaggatg gctgcctttg tgtacatttg ccttctggca tttccccttc acgtcccccc 1020

ccccccccca gcccccttgg tattgttgaa actgtcagaa tgagaggaag ttcaaccaac 1080

tgcttaggga gtaagctggc aggaagttta gatattgtat cccctcactc ttaactttct 1140

gatagccttg ggtttatggg caagcaaagt tacaagttgg gaagttgctt caagtgagtg 1200

agaggtcttg gtaaaagcat aatccagagg gggaggcagg aggggattgt tttaacagat 1260

atttgaatga aaatatcaga atgaactgat gctaacacac acctgattat tgagaaacaa 1320

taacaaaact cctagattca tttgtctttg cgctagcaca ggccccaact ccactgcagg 1380

gcaccctgtc tacctttata ctgtccctaa ctggaagctg 1420

<210> 10

<211> 78

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gtgattttca gatggtgtgc ttggtaaaga agggttgaat tccgaagttc ctattctcta 60

gaaagtatag gaacttca 78

<210> 11

<211> 87

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aaagtatagg aacttcatca gtcaggtaca taatggtgga tcctaagtga gataaagggc 60

tctattctat aatgctaatc acatagg 87

<210> 12

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggagtctagc ccctcccaga aggagacaca gaagaatggc cacctccatg ggcctgctgc 60

tg 62

<210> 13

<211> 82

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ccgtggccac acaaaacaac gatggcactg acgggcaaaa gctgcttctg ttttacatcc 60

tggggacggt ggtggccatc tc 82

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gcatttatgc tgagtgtgat ggtgt 25

<210> 15

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gttctggttg cagtggttct g 21

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctcgactag agcttgcgga 20

<210> 17

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tagagttaag tttttagcac ttact 25

<210> 18

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aagcatcgtg gcctttattt cccca 25

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tgggcacaaa gatcccagct tacta 25

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tcaaggaaga ttcagaggaa caggg 25

<210> 21

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agccactcaa caccacaaga gattc 25

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggatcggcca ttgaacaaga t 21

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cagaagaact cgtcaagaag gc 22

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggcacaagga gctccggaac tc 22

<210> 25

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caagataggg ctcaagtcct cc 22

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gctgtggtag tgtgaaagca gcag 24

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ggtacgtaca gttgcccttc tctcg 25

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

ggcactcagc ttgccccaat ggg 23

<210> 29

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

attctcattg cagcgatgct ggg 23

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

ctgcctgcta tacagcccat tgg 23

<210> 31

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tcacaggctg tggtgtgcga ggg 23

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

cacaggctgt ggtgtgcgag ggg 23

<210> 33

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tcttgccacc gtgaagagtg agg 23

<210> 34

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

ccaagggtgc cttggtcttc agg 23

<210> 35

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ttgctgtggc cggaggtcgt ggg 23

<210> 36

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

atctgatgtc tggttcgagt tgg 23

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

tgtcggcttg ctgtggccgg agg 23

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

acatacctcc ccacgacctc cgg 23

<210> 39

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

atgcagccga cagctattcc tgg 23

<210> 40

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

gaactgggca tttcagtagg agg 23

<210> 41

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

cttagagcca ctaggagaac tgg 23

<210> 42

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tcataaacgg agagccaaga agg 23

<210> 43

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gttgccatag ttccccactt cccac 25

<210> 44

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

cgacatgggc tggagctgca agg 23

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gatgtgttcg actggggcag ctc 23

<210> 46

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

ccttggtttg gtatgtgtca cgcc 24

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

cgggctcagt gggatgcctg aaat 24

<210> 48

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

cagttgaagt cctacacagc agcctg 26

<210> 49

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

caccgtgccc cgtgctgcaa ca 22

<210> 50

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

cttttgcccg tcagtgccat cg 22

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

gagggcaccc ccaaggctac acc 23

<210> 52

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 52

gggctgctga ggttggcttt aaac 24

Claims

1.一种人源化CD93蛋白，其特征在于，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93蛋白的全部或部分。

2.根据权利要求1所述的人源化CD93蛋白，其特征在于，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93蛋白的胞外区和信号肽，优选还包含非人动物CD93蛋白的跨膜区和胞质区；优选的，所述的人CD93蛋白的胞外区和信号肽包含SEQ ID NO：2第1-580位所示氨基酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：2第1-580位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。

3.根据权利要求1或2所述的人源化CD93蛋白，其特征在于，所述的人源化CD93蛋白包含人CD93基因的1号外显子的全部或部分编码的氨基酸序列，其中，人CD93基因的1号外显子的部分至少包含100bp的连续核苷酸序列；优选还包含非人动物CD93基因的1号外显子的部分和2号外显子编码的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化CD93蛋白，其特征在于，所述的人源化CD93蛋白的氨基酸序列包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：7所示氨基酸序列；

B)与SEQ ID NO：7所示氨基酸序列同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

5.一种人源化CD93基因，其特征在于，所述的人源化CD93基因包含人CD93基因的部分。

6.根据权利要求5所述的人源化CD93基因，其特征在于，所述的人源化CD93基因编码权利要求1-4任一所述的人源化CD93蛋白。

7.根据权利要求5或6所述的人源化CD93基因，其特征在于，所述的人源化CD93基因包含人CD93基因的1号外显子的全部或部分，其中，人CD93基因的1号外显子的部分至少包含100bp的连续核苷酸序列；优选还包含非人动物CD93基因的1号外显子的部分和2号外显子的核苷酸序列；进一步优选的，所述的人源化CD93基因包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或者，包含具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

8.根据权利要求5-7任一所述的人源化CD93基因，其特征在于，所述的人源化CD93基因转录的mRNA包含下列组中的任一种：

A)SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

B)与SEQ ID NO：6所示核苷酸序列的同一性至少为85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

9.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含A)-D)组中的一种：

A)编码权利要求1-4任一所述的人源化CD93蛋白的核苷酸序列；

B)编码人CD93蛋白的胞外区的核苷酸序列，优选还包含编码人CD93蛋白信号肽的核苷酸序列，进一步优选包含编码SEQ ID NO：2第1-580位所示氨基酸的核苷酸序列；或者，包含编码与SEQ ID NO：2第1-580位所示氨基酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

C)权利要求5-8任一所述的人源化CD93基因的核苷酸序列；或，

D)人CD93基因的1号外显子的全部或部分，其中，1号外显子的部分至少包含100bp的连续核苷酸序列，优选包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列；或者，包含与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；

所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂序列包含SEQ ID NO：3或8；

所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000068.8至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述3’臂序列包含SEQ ID NO：4或9。

10.一种CD93基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化CD93蛋白；和/或，所述非人动物的基因组中包含人或人源化CD93基因；

优选的，所述人源化CD93蛋白为权利要求1-4任一所述的人源化CD93蛋白；

优选的，所述的人源化CD93基因为权利要求5-8任一所述的人源化CD93基因。

11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的内源CD93蛋白表达降低或缺失。

12.根据权利要求10或11所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将下列任一核苷酸序列导入非人动物CD93基因座：

A)编码权利要求1-4任一所述的人源化CD93蛋白的核苷酸序列；

C)权利要求5-8任一所述的人源化CD93基因的核苷酸序列；或，

优选的，A)-D)中任一核苷酸序列在非人动物中通过内源调控元件进行调控。

13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，任选地，所述的导入非人动物CD93基因座为替换非人动物相应区域，优选的，非人动物的1-2号外显子被替换，进一步优选地，非人动物CD93基因的1号外显子的全部或部分被替换。

14.根据权利要求10-13任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求9所述的靶向载体进行非人动物的构建。

15.根据权利要求10-14任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法进一步包括将CD93基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物；优选的，所述的其他基因选自PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。

16.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或器官表达权利要求1-4任一所述的人源化CD93蛋白，和/或，所述的细胞、组织或器官的基因组中包含权利要求5-8任一所述的人源化CD93基因，或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求10-15任一所述的构建方法获得的非人动物。

17.一种荷瘤后的瘤组织，其特征在于，所述的瘤组织表达权利要求1-4任一所述的人源化CD93蛋白，和/或，所述的瘤组织的基因组中包含权利要求5-8任一所述的人源化CD93基因，或者，所述的细胞、组织或器官来源于权利要求10-15任一所述的构建方法获得的非人动物。

18.一种权利要求1-4任一所述的人源化CD93蛋白、权利要求5-8任一所述的人源化CD93基因或权利要求10-15任一所述的构建方法获得的非人动物的应用，其特征在于，所述的应用包含：