CN112779284B

CN112779284B - Thpo基因人源化的非人动物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN112779284B
Application number: CN202011193599.7A
Authority: CN
Inventors: 沈月雷; 黄蕤; 郭雅南; 白阳; 姚佳维; 郭朝设; 张美玲
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date: 2019-11-01
Filing date: 2020-10-30
Publication date: 2022-12-20
Anticipated expiration: 2040-10-30
Also published as: CN112779284A; US20220408704A1; WO2021083366A1

Abstract

本发明提供了一种THPO基因人源化的非人动物的构建方法及构建的人源化的非人动物的应用，所述的方法包括利用同源重组的方式将编码人THPO蛋白的序列导入动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化THPO蛋白，促进人T细胞和NK细胞的发育，可以作为人THPO信号机理研究、肿瘤等疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。本发明还提供了一种THPO基因的靶向载体、一种靶向THPO基因的sgRNA以及其在制备人源化THPO基因中的应用。

Description

THPO基因人源化的非人动物的构建方法及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于基因编辑的THPO基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。其中，免疫缺陷动物由于缺乏免疫力，容易接受异种细胞或组织，在组织或细胞人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。已有研究表明作为受体鼠，目前普遍使用的免疫缺陷动物排序如下：NOD-Prkdc^scidIL-2rγ^nul小鼠〉NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)〉Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)〉NOD/SCID〉裸鼠，表明NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^nul小鼠是目前最佳的移植受体鼠(Ito R et al.Cell MolImmunol.2012May；9(3):208-14)。

一个理想的免疫系统人源化小鼠不仅要有人源的多谱系免疫系统，还应该使各细胞亚群的比例与人类接近，且具有功能。尽管NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠机体免疫功能严重缺陷，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏，是最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，并已广泛用于新的人源化小鼠模型研发，但由于鼠的细胞因子不能很好的作用于人的造血细胞，在移植人造血干细胞后，人源细胞的发育和功能上存有缺陷。且NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠在重建前需要进行辐照清髓，该程序需要有放射源且会对小鼠产生多种副作用，包括造血系统、胃肠道、肌肉和神经组织的坏死和凋亡，可导致小鼠消瘦、感染甚至死亡，进而影响药效评价结果。

血小板生成素(Thrombopoietin，THPO)是调节巨核细胞和血小板生成的主要细胞因子，于1994年被分离纯化并进行表征，主要在骨髓、肝脏和肾脏合成并释放到血液循环中。人THPO位于人染色体3q27.1，分子量为35-38KD；有2个结构域，其N端结构域与促红细胞生成素(EPO)高度同源，是受体结合位点，C端结构域为高度糖基化的特异性部分，在促进THPO的合成及分泌、保持蛋白稳定性、调控循环中的半衰期有关。THPO通过与其受体c-Mpl结合可以激活一系列信号通路参与造血细胞增殖、分化、成熟和抗凋亡等过程，主要作用包括促进巨核细胞增殖与分化成熟，增加巨核细胞提及与数量及血小板特异性表面抗原的表达，刺激多能造血干细胞分化为粒系、红系、单核系、巨核系的集落单位。已有研究发现，敲除THPO或其受体基因的小鼠外周血、骨髓巨核细胞及巨核祖细胞减少85％-90％。此外，THPO与其他造血生长因子存在相加或协同作用，共同促进红系和粒系祖细胞增殖。

由于免疫缺陷模式动物是肿瘤临床治疗研究重要的工具和保障，本发明旨在克服现有不足，提供一种THPO细胞因子人源化小鼠模型，该小鼠遗传背景单一，实验结果稳定可靠，不用辐照清髓即可进行人造血干细胞免疫系统重建，且移植后成功率高、寿命长等优点。除可用于人源细胞移植生长以外，还可与多种细胞因子基因人源化小鼠配合用于新的人源化动物模型研发与药效检测应用等方面。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种THPO基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人THPO基因的部分。

优选的，包含人THPO基因的第2外显子至第6外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人THPO基因的第2外显子的全部或部分，第3外显子的全部、第4外显子的全部、第5外显子的全部，和第6外显子的部分或全部。

其中，第2外显子的部分至少包含从起始密码子至2号外显子的最后一个核苷酸，第6外显子的部分至少包含从第6外显子的第一个核苷酸至终止密码子的核苷酸序列。

其中，所述的起始密码子可以来源于人或者非人动物。

其中，第2外显子的部分为不含UTR区的第2外显子的核苷酸序列。第6外显子的部分为不含UTR区的第6外显子的核苷酸序列。

优选的，包含编码人THPO蛋白的核酸序列。进一步优选的，包含编码SEQ ID NO：4所示氨基酸序列的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含人THPO基因的cDNA序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。

所述的5’臂选自THPO基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ ID NO：7所示。

所述的3’臂选自THPO基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：8所示。

优选的，所述的靶向载体包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自THPO基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自THPO基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。

优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列来自人。进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列为人THPO基因核苷酸序列的全部或部分。更进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列为人THPO基因的cDNA序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列包括人THPO基因的第2外显子至第6外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列包括人THPO基因的第2外显子、第3外显子、第4外显子、第5外显子或第6外显子中的一个或两个以上的组合。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列包括人THPO基因的不含UTR区的第2外显子的全部、第3外显子的全部、第4外显子的全部、第5外显子的全部，和不含UTR区的第6外显子的全部。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列包括编码人THPO蛋白的核酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列包括编码SEQID NO：4所示氨基酸序列的核酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ IDNO：9所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于THPO基因的第2外显子至第6外显子。

优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂核苷酸长度为1419bp。更进一步优选的，所述5’臂序列如SEQ IDNO：7所示。

优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000082.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，3’臂核苷酸长度为1645bp。更进一步优选的，所述3’臂序列如SEQ ID NO：8所示。

优选的，所述的靶向载体还包括可选择的标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。

本发明的第二方面，提供了一种靶向THPO基因的sgRNA，所述sgRNA靶向非人动物THPO基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物THPO基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。

优选的，所述sgRNA在非人动物THPO基因的靶位点位于非人动物THPO基因的第2外显子、第2-3内含子和/或第6外显子上。

进一步优选的，所述的靶向THPO基因的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ IDNO：10-16任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：17-24任一项所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向THPO基因的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：13所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：24所示。

本发明的第三方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。

优选的，所述DNA分子的双链选自SEQ IDNO：25和SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：31，SEQ IDNO：26和SEQ ID NO：28，或SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32。

本发明的第四方面，提供了一种包含上述sgRNA，和/或上述DNA分子的载体。

本发明的第五方面，提供了一种包含上述sgRNA的sgRNA载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)提供一种sgRNA，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列，所述sgRNA靶向非人动物THPO基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物THPO基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；

(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，并将所述片段DNA通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

(3)将步骤(1)获得的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；

(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

优选的，所述的制备方法包括以下步骤：

(1)将序列如SEQ ID NO：10-16所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：17-24所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：33所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；

进一步优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：24，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：30所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：32所示，其中SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28为一组，SEQ ID NO：30和SEQ IDNO：32为另一组。

本发明的第六方面，提供了一种包含上述靶向载体，上述sgRNA，上述DNA分子，和/或上述载体的细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞包含上述的靶向载体和上述的sgRNA。

本发明的第七方面，提供了一种上述靶向载体，上述sgRNA，上述DNA分子，上述载体，上述制备方法制备的sgRNA载体，或上述的细胞在THPO基因修饰中的应用。优选的，所述的应用为敲除、插入或替换THPO基因的第2外显子至第6外显子的全部或部分。

本发明的第八方面，提供了一种嵌合THPO基因，所述的嵌合THPO基因包含人THPO基因的部分。

优选的，包含人THPO基因的第2外显子至第6外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的人THPO基因的部分包括人THPO基因的第2外显子、第3外显子、第4外显子、第5外显子或第6外显子中的一个或两个以上的组合。

更进一步优选的，包含人THPO基因的第2外显子的全部或部分，第3外显子的全部、第4外显子的全部、第5外显子的全部，和第6外显子的部分或全部。

其中，所述的起始密码子可以来源于人或者非人动物。

优选的，包含人THPO基因的cDNA序列。更进一步优选的，包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合THPO基因包括非人动物THPO基因的部分，和人THPO基因的部分的拼接。

优选的，所述嵌合THPO基因编码的氨基酸序列连续5-353个氨基酸与人THPO蛋白序列一致。进一步优选的，所述嵌合THPO基因编码的氨基酸序列连续10-100个氨基酸与人THPO蛋白序列一致。

优选的，所述嵌合THPO基因编码的氨基酸序列至少50个与人THPO蛋白序列相同，进一步优选的，所述嵌合THPO基因编码的氨基酸序列至少100个与人THPO蛋白序列相同。在本发明的一个具体实施方式中，所述嵌合THPO基因编码的氨基酸序列有353个与人THPO蛋白序列相同。

在本发明的一个具体实施方式中，所述嵌合THPO基因包含下列组中的一种：

(a)嵌合THPO基因转录的mRNA序列为SEQ ID NO：5所示的序列；

(b)嵌合THPO基因序列包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

(c)嵌合THPO基因序列与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列的部分或全部的同源性程度为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(d)嵌合THPO基因的序列在严格条件下，与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列杂交；

(e)嵌合THPO基因的序列与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(f)嵌合THPO基因序列具有SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

其中，SEQ ID NO：5所示序列为THPO基因人源化小鼠THPO DNA的非模板链、编码链或有义链。

优选的，所述的嵌合THPO基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第九方面，提供了一种上述的嵌合THPO基因编码的人源化THPO蛋白。

本发明的第十方面，提供了一种THPO基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物的基因组中包括人THPO基因的部分。

本发明的第十一方面，提供了一种THPO基因人源化的非人动物，所述的非人动物的基因组中包括人THPO基因的部分。

优选的，所述的非人动物的基因组中包含人THPO基因的第2外显子至第6外显子的全部或部分。进一步优选的，包含人THPO基因的第2外显子的全部或部分，第3外显子的全部、第4外显子的全部、第5外显子的全部，和第6外显子的部分或全部，其中，第2外显子的部分至少包含从起始密码子至2号外显子的最后一个核苷酸，第6外显子的部分至少包含从第6外显子的第一个核苷酸至终止密码子的核苷酸序列。

优选的，包含编码人THPO蛋白的核酸序列。进一步优选的，包含人THPO基因的cDNA序列。更进一步优选的，包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

优选的，包含上述的嵌合THPO基因。

优选的，所述的人THPO基因或嵌合THPO基因通过内源性调控元件调控。

优选的，所述的非人动物体内造血干细胞的增值、分化受到抑制。

进一步优选的，所述的非人动物体内的造血干细胞缺失。

本发明所述的造血干细胞来源于外周血、骨髓、脐带血或胎盘。优选的，所述的造血干细胞来源于骨髓。

优选的，所述的非人动物体内增强异源人造血干细胞的形成、增值和/或分化。

优选的，所述的非人动物体内促进人T细胞和NK细胞的发育。

优选的，所述的非人动物的基因组中包括非人动物THPO基因的部分序列，所述的非人动物THPO基因的部分包括非人动物调控元件。进一步优选的，所述的非人动物调控元件包括启动子。更进一步优选的，所述的人THPO基因与启动子可操作性的连接在非人动物THPO基因座。

优选的，所述的非人动物表达人或人源化THPO蛋白，同时内源THPO蛋白表达降低或缺失。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物表达人THPO蛋白。

优选的，所述的THPO基因人源化的非人动物表达的蛋白序列连续5-353个氨基酸与人THPO蛋白序列一致。进一步优选的，所述的THPO基因人源化的非人动物表达的蛋白序列连续10-100个氨基酸与人THPO蛋白序列一致。

优选的，所述的THPO基因人源化的非人动物表达的蛋白序列至少50个与人THPO蛋白序列相同。更优选的，所述的THPO基因人源化的非人动物表达的蛋白序列至少100个与人THPO蛋白序列相同。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的THPO基因人源化的非人动物的基因组中嵌合THPO基因编码的蛋白包括SEQ ID NO：4第1-353位所示氨基酸序列的核酸序列的全部或部分。

优选的，所述的THPO基因人源化的非人动物的基因组中的THPO基因为纯合或杂合的。

优选的，所述的THPO基因人源化的非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人THPO基因。进一步优选的，所述的THPO基因人源化的非人动物的基因组中至少一个染色体上包含嵌合THPO基因。

优选的，所述的THPO基因人源化的非人动物中，至少一个细胞表达人或人源化THPO蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行THPO基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

本发明所述的非人动物是免疫缺陷的。

本发明所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备THPO基因人源化的非人动物或其子代的非人哺乳动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

本发明所述的非人动物为免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^nul小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)〉Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)、NOD/SCID、或者裸鼠。

优选的，所述的非人动物为小鼠，将人THPO基因的全部或部分插入或替换小鼠内源THPO基因构建THPO基因人源化的非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA，将人THPO基因的第2外显子至第6外显子插入或替换至非人动物THPO基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA，将人THPO基因的不含UTR区的第2外显子的全部、第3外显子的全部、第4外显子的全部、第5外显子的全部，和不含UTR区的第6外显子的全部，插入或替换至非人动物THPO基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA，将人THPO基因的cDNA序列插入或替换至非人动物THPO基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA，将包含SEQ ID NO：9的核苷酸序列插入或替换至非人动物THPO基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA将人THPO基因的第2外显子至第6外显子插入小鼠内源THPO基因座，并破坏小鼠内源THPO基因的编码框，以构建THPO基因人源化的非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA将人THPO基因的第2外显子至第6外显子替换小鼠内源THPO基因的第2外显子至第6外显子构建THPO基因人源化的非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA将人THPO基因的不含UTR区的第2外显子的全部、第3外显子的全部、第4外显子的全部、第5外显子的全部，和不含UTR区的第6外显子的全部，替换小鼠内源THPO基因的第2外显子至第6外显子构建THPO基因人源化的非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，使用上述的靶向载体和/或上述的sgRNA将人THPO基因的cDNA序列插入或替换小鼠内源THPO基因构建THPO基因人源化的非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括如下步骤：

1)提供一种上述的细胞，优选的，所述的细胞为受精卵细胞或者胚胎干细胞；

2)将步骤1)所述细胞在培养液中进行培养；

3)将培养后细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育；其中，所述非人哺乳动物为假孕雌性；

4)鉴定步骤3)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人哺乳动物中的种系传递。

优选的，所述受精卵来源于任何非人哺乳动物；进一步优选的，所述受精卵细胞来源于啮齿类动物；更进一步优选的，所述受精卵选自C57BL/6受精卵、FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵或DBA/2受精卵。

优选的，所述的胚胎干细胞来源于任何非人哺乳动物。进一步优选的，所述的胚胎干细胞来源于啮齿类动物。更进一步优选的，所述胚胎干细胞选自C57BL/6胚胎干细胞、FVB/N胚胎干细胞、129胚胎干细胞、BALB/c胚胎干细胞、DBA/1胚胎干细胞或DBA/2胚胎干细胞。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物为小鼠，所述的小鼠THPO基因的mRNA序列如SEQ ID NO：1中的全部或部分片段所示，所述小鼠THPO蛋白序列如SEQ IDNO：2中的全部或部分片段所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人THPO基因的mRNA序列如SEQ ID NO：3中的全部或部分片段所示，所述人THPO蛋白序列如SEQ ID NO：4中的全部或部分片段所示。

本发明的第十二方面，提供了一种制备多基因修饰的非人动物的方法，包括如下步骤：

(1)制备上述的THPO基因人源化的非人动物，或者，采用上述的THPO基因人源化的非人动物的构建方法获得的THPO基因人源化的非人动物；

(2)将步骤(1)获得的THPO基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括IL2RG基因敲除的非人动物、CSF2基因人源化的非人动物、IL3基因人源化的非人动物、CSF1基因人源化的非人动物或IL15基因人源化的非人动物中的一种或两种以上的组合。

优选的，所述的其他人源化动物为非人哺乳动物。更优选的，所述的非人哺乳动物可以为啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备THPO基因人源化的非人动物或其中子代的非人哺乳动物。最为优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

优选的，所述多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

优选的，所述多基因修饰的非人动物为双基因人源化的非人动物、三基因人源化的非人动物、四基因人源化的非人动物、五基因人源化的非人动物、六基因人源化的非人动物、七基因人源化的非人动物、八基因人源化的非人动物或九基因人源化的非人动物。

本发明的第十三方面，提供了一种上述的构建方法制备的THPO基因人源化的非人动物或者上述的方法制备的多基因修饰的非人动物或其子代。

本发明的第十四方面，提供了一种荷瘤或炎症的动物模型，所述的动物模型来源于上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物、上述的THPO基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因修饰的非人动物或者上述的多基因修饰的非人动物或其子代。或者上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物、上述的THPO基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因修饰的非人动物或者上述的多基因修饰的非人动物或其子代在制备荷瘤或炎症的动物模型中的用途。

优选的，所述动物模型的制备方法包括通过上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物或上述的方法制备的多基因修饰的非人动物的步骤。

更优选的，所述的动物模型的制备方法还包括在上述构建方法制备的THPO基因人源化的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第十五方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物、组织或器官或其培养物、荷瘤后的瘤组织，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物、上述的THPO基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代，或者，上述的荷瘤或炎性的动物模型。

本发明的第十六方面，提供了一种THPO基因人源化的细胞或细胞株、组织或器官，所述的细胞或细胞株、组织或器官的基因组中包括上述的嵌合THPO基因。

优选的，所述的细胞或细胞株、组织或器官表达人或人源化THPO蛋白，同时内源THPO蛋白表达降低或缺失。

本发明的第十七方面，提供了来源于上述的嵌合THPO基因、上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物、上述的THPO基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎性的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织，或者上述的细胞或细胞株在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用。

本发明的第十八方面，提供了来源于上述的嵌合THPO基因、上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物、上述的THPO基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎性的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织，或者上述的细胞或细胞株在生产和利用动物实验疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。

优选的，所述的应用为人造血干细胞的形成、功能研究和/或构建疾病模型。

本发明的第十九方面，提供了来源于上述的嵌合THPO基因、上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物、上述的THPO基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎性的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织，或者上述的细胞或细胞株在筛选、验证、评价或研究THPO基因功能、人THPO信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。

本发明的第二十方面，提供了上述的嵌合THPO基因、上述的人源化THPO蛋白、上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因修饰的非人动物，或者上述的细胞、组织或者器官在制备荷瘤或炎症的动物模型中的用途，或者在人源细胞移植、免疫系统重建中的用途，或者在筛选靶向人的抗体、筛选或评估药物。

本发明的第二十一方面，提供了一种免疫系统重建的方法，所述的方法包括向个体施加人造血干细胞或外周血单核细胞，以在非人动物体内重建免疫系统，所述的个体选自上述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物、上述的THPO基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因修饰的非人动物、上述的多基因修饰的非人动物或其子代，或者，上述的荷瘤或炎性的动物模型。

优选的，所述的免疫系统为人免疫系统。

优选的，所述的个体在施加人造血干细胞或外周血单核细胞之前不被辐照。

优选的，所述个体被施加人造血干细胞或外周血单核细胞以发展人免疫系统后具有以下一个或多个特征：

(a)人CD45+细胞的百分比大于不包括红细胞的总血细胞的20％或30％，优选在施加人造血干细胞后第16、20、24、26、28或30周或之后；

(b)人CD3+细胞的百分比大于人CD45+细胞的5％或10％，优选在施加人造血干细胞后第12、16、20、24、26、28或30周或之后；

(c)人CD19+细胞的比例大于人CD45+细胞的40％，50％或60％，优选在第4、8、12、16、20、24、26、28周或之后，或在施加人造血干细胞后的30天；

(d)人CD56+细胞的百分比大于人CD45+细胞的2％或5％，优选在施加人造血干细胞后第16、20、24、26、28或30周或之后；

(e)人CD33+细胞的百分比大于人CD45+细胞的2％或5％，优选在第4、8、12、16、20、24、26、28、30周或之后；

(f)人CD14+细胞的比例大于人CD33+细胞的50％或60％，优选在施加人造血干细胞后第16、20、24、26、28或30周或之后；和/或，

(g)人CD66b+细胞的百分比大于人CD33+细胞的5％或10％，优选在施加人造血干细胞后第16、20、24、26、28或30周或之后。

优选的，所述的免疫系统重建的非人动物或其子代的存活率大于50％，60％或70％(例如，在施加人造血干细胞后约100、110、120、130、140、150或160天或之后)。

优选的，所述重建的成功率大于50％，60％，70％或80％(例如，在施加人造血干细胞后的第16周或之后，或20周)。

优选的，所述的注射为尾静脉注射。

优选的，所述注射人造血干细胞的量为1.5×10⁵人造血干细胞(HSC)。

优选的，所述的免疫系统重建的标注为hCD45占总活细胞的比例≥25％。

优选的，所述的方法还包括注射人造血干细胞后每间隔一段时间取外周血(PB)进行检测验证是否成功以及观察非人动物存活情况。其中，在本发明的一个具体实施方式中，所述的一段时间为4周。

优选的，所述取外周血(PB)进行检测验证包括检测表达人白细胞表面分子标记(CD45⁺)的细胞、T细胞(CD3+)、B细胞(CD19+)、NK细胞(CD56+)、单核细胞(CD14+)、粒细胞(CD66b+)和髓系细胞(CD33+)的发育情况。

本发明的第二十二方面，提供了一种上述的方法制备获得的免疫系统重建的非人动物或其子代。

本发明的第二十三方面，提供了一种抗体筛选的方法，所述的方法包括在上述免疫系统重建的非人动物或其子代体内移植人肿瘤细胞后，给予待筛选的抗体，对给予抗体的非人动物或子代进行检测、效果评价。

优选的，所述的抗体筛选的方法不是治疗方法。该方法用来筛选抗体，对不同抗体的药效进行检测和比较，以确定哪些抗体可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同抗体的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十四方面，提供了一种药物筛选或评价的方法，所述的方法包括在上述的免疫系统重建的非人动物或其子代体内移植人肿瘤细胞，向移入人肿瘤细胞的动物给予候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较。

优选的，所述的药物筛选或评价为人用药物筛选或评价。

优选的，所述药物筛选或评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

优选的，所述候选药物包括THPO靶向药物。进一步优选的，所述的靶向药物为抗原结合蛋白。在本发明的一个具体实施方式中，所述的抗原结合蛋白为抗体。

优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

本发明的第二十五方面，提供了一种治疗方案的评价方法，所述的评价方法包括向上述免疫系统重建的非人动物或其子代植入人肿瘤细胞，向植入人肿瘤细胞的个体施加治疗方案，对施加治疗方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价。

优选的，所述治疗方案是CAR-T。

优选的，所述治疗方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对治疗方案的效果进行检测和评价，以确定该治疗方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

通过上述的技术方案，本发明取得了良好的技术效果，包括：在THPO基因人源化的非人动物体内正常表达人或人源化THPO蛋白，无需辐照清髓即可进行免疫系统重建，且免疫系统重建后的非人动物存活率高、体内能够有效的促进人源细胞的发育，提高人组织和细胞的存活率，即促进人免疫细胞分化和发育。

本发明所述的细胞或细胞株、组织、器官不是动物品种，其不会发育为个体。

本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“THPO基因座”表示THPO基因1号至6号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被插入或替换的THPO基因座可以是THPO基因2号至6号外显子上的任选一段的DNA片段。优选为2号至6号外显子上的任选一段的DNA序列。

本发明所述的“外显子”又称表达序列，表示真核生物基因的一部分，其在剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质，所述的外显子包括UTR区。

本发明所述的“第2-3内含子”表示第2外显子与第3外显子之间的内含子。

本发明所述的“THPO基因的cDNA”表示THPO基因对应的cDNA，即THPO基因转录为mRNA，后逆转录为cDNA。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdc^scid IL-2rg^null背景的小鼠。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：鼠THPO基因和人THPO基因对比示意图(非按比例)；

图2：人源化THPO小鼠基因示意图(非按比例)；

图3：THPO基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图4：sgRNA1-sgRNA7相对活性检测结果，其中，con为阴性对照，pc为阳性对照，纵坐标为Cas9/sgRNA活性相对值；

图5：sgRNA8-sgRNA15相对活性检测结果，其中，con为阴性对照，pc为阳性对照，纵坐标为Cas9/sgRNA活性相对值；

图6：F0代小鼠PCR检测结果，其中，M为Marker，H₂O为水对照，WT为野生型对照，+为阳性对照，F0-1、F0-2和F0-3为阳性小鼠编号；

图7：F1代小鼠PCR检测结果，其中，M为Marker，H₂O为水对照，WT为野生型对照，+为阳性对照，F1-11、F1-12、F1-18、F1-19、F1-21、F1-25和F1-26为阳性小鼠编号；

图8：F1代小鼠Southern检测结果，其中，WT为野生型对照，F1-11、F1-12、F1-18、F1-19、F1-21、F1-25和F1-26为阳性小鼠编号；

图9：免疫重建实验的生存曲线图，其中，纵坐标为存活率(％)，横坐标为天数(Days)；

图10：免疫重建实验过程中，THPO B-NDG与B-NDG小鼠体内的人白细胞(CD45+)占总活细胞的比例(％)结果；

图11：免疫重建实验过程中，THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠中，重建成功(hCD45占总活细胞的比例≥25％)小鼠占该组存活小鼠的百分比；

图12：流式分析外周血中人T细胞的发育情况，具体为THPO B-NDG与B-NDG小鼠体内的人CD3+CD45+T细胞占人CD45+细胞的比例(％)；

图13：流式分析外周血中人B细胞的发育情况，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人B细胞(CD19+)占人CD45细胞的比例(％)；

图14：流式分析外周血中人NK细胞的发育情况，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人NK(CD56+)细胞占人CD45+细胞的比例(％)；

图15：流式分析外周血中人髓系细胞的发育情况，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人髓系细胞(CD33+)占人CD45+细胞的比例(％)；

图16：流式分析外周血中人单核细胞的发育情况，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人单核细胞(CD14+)占人CD33+细胞的比例(％)；

图17：流式分析外周血中人粒细胞的发育情况，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人粒细胞(CD66b+)占人CD33+细胞的比例(％)；

图18：流式分析外周血中人T细胞的发育情况(30周)，具体为THPO B-NDG与B-NDG小鼠体内的人CD3+CD45+T细胞占人CD45+细胞的比例(％)；

图19：流式分析外周血中人B细胞的发育情况(30周)，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人B细胞(CD19+)占人CD45细胞的比例(％)；

图20：流式分析外周血中人NK细胞的发育情况(30周)，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人NK(CD56+)细胞占人CD45+细胞的比例(％)；

图21：流式分析外周血中人髓系细胞的发育情况(30周)，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人髓系细胞(CD33+)占人CD45+细胞的比例(％)；

图22：流式分析外周血中人单核细胞的发育情况(30周)，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人单核细胞(CD14+)占人CD33+细胞的比例(％)；

图23：流式分析外周血中人粒细胞的发育情况(30周)，具体为THPO B-NDG小鼠与B-NDG小鼠体内的人粒细胞(CD66b+)占人CD33+细胞的比例(％)。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

NOD-Prkdc^scid IL-2rg^null(B-NDG)小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号B-CM-001或B-CM-002；

NOD/scid小鼠、CSF2或IL3或CSF1或IL15基因人源化小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司；

UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；

Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；

Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

骨架载体来源Takara，货号3299；

BamHI、EcoRI、NdeI和PstI酶购自NEB，货号分别为；R3136M、R3101M、R0539L和R0187M。

实施例1 THPO基因人源化小鼠

本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人THPO蛋白的核酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化THPO蛋白。小鼠THPO基因(NCBI Gene ID：21832，Primary source：MGI:101875，UniProt ID：P40226)(基于NM_001173505.1→NP_001166976.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：1所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示)和人THPO基因(NCBI Gene ID：7066，Primary source：HGNC:11795，UniProt ID：P40225)(基于NM_000460.4→NP_000451.1的转录本，其mRNA序列如SEQ IDNO：3所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示)对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在内源小鼠THPO基因座引入编码人THPO蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人THPO蛋白。例如，可用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在内源小鼠THPO基因座敲进一段含有编码人THPO蛋白的序列，同时破坏小鼠THPO基因的编码框，期望得到的人源化小鼠体内可表达人THPO蛋白且不表达内源性THPO蛋白。最终得到的改造后的人源化小鼠THPO基因示意图如图2所示，人源化小鼠THPO基因转录的mRNA序列如SEQ IDNO：5所示，THPO基因的DNA序列(嵌合THPO基因DNA)如SEQ ID NO：6所示：

ttccttgaaacctgatgaacgattcactatttctgtcattttcaggacagagtccttggcccacctctctcccacccgactctgccgaaagaagcacagaagctcaagccgcctccatggccccaggaaagattcaggggagaggccccatacagggagccacttcagttagacaccctggccagaatggagctgactgaattgctcctcgtggtcatgc ttctcctaactgcaaggctaacgctgtccagcccggctcctcctgcttgtgacctccgagtcctcagtaaactgct tcgtgactcccatgtccttcacagcagactgagccagtgcccagaggttcaccctttgcctacacctgtcctgctg cctgctgtggactttagcttgggagaatggaaaacccagatggaggagaccaaggcacaggacattctgggagcag tgacccttctgctggagggagtgatggcagcacggggacaactgggacccacttgcctctcatccctcctggggca gctttctggacaggtccgtctcctccttggggccctgcagagcctccttggaacccagcttcctccacagggcagg accacagctcacaaggatcccaatgccatcttcctgagcttccaacacctgctccgaggaaaggtgcgtttcctga tgcttgtaggagggtccaccctctgcgtcaggcgggccccacccaccacagctgtccccagcagaacctctctagt cctcacactgaacgagctcccaaacaggacttctggattgttggagacaaacttcactgcctcagccagaactact ggctctgggcttctgaagtggcagcagggattcagagccaagattcctggtctgctgaaccaaacctccaggtccc tggaccaaatccccggatacctgaacaggatacacgaactcttgaatggaactcgtggactctttcctggaccctc acgcaggaccctaggagccccggacatttcctcaggaacatcagacacaggctccctgccacccaacctccagcct ggatattctccttccccaacccatcctcctactggacagtatacgctcttccctcttccacccaccttgcccaccc ctgtggtccagctccaccccctgcttcctgacccttctgctccaacgcccacccctaccagccctcttctaaacac atcctacacccactcccagaatctgtctcaggaagggtagcatatgcgcgggcactggcccagtgagcgtctgcagcttctctcggggacaagcttcccca

其中，SEQ ID NO：6仅仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中单直线下划线区域为编码人THPO蛋白的核酸序列(简称人源序列)。

鉴于人THPO或小鼠THPO具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

进一步的设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠THPO上游和下游的同源臂序列，以及包含编码人THPO蛋白的人源序列(简称A片段)。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO:7)与NCBI登录号为NC_000082.6的第20730495-20729077位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO:8)与NCBI登录号为NC_000082.6的第20725412-20723772位核苷酸序列相比有99％的一致性，区别在于在20725408位和20725409位之间插入T；A片段(SEQ ID NO:9)的含有人THPO的编码序列，与NCBI登录号为NM_000460.4的第279-1337bp位核苷酸序列相同

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’端靶位点(sgRNA8-sgRNA15)的sgRNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点分别位于THPO基因第2外显子、第2-3内含子和第6外显子上，各sgRNA在THPO上的靶位点序列如下：

sgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-CAGAATGGAGCTGACTGGTAAGG-3’

sgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-TAAGGCTACATGAAGGGCTAGGG-3’

sgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-GCTAGGGACAAGTTCAAGAATGG-3’

sgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-GGACAAGTTCAAGAATGGCTTGG-3’

sgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-TTCAAGAATGGCTTGGCCGCAGG-3’

sgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO：15)：5’-GAATGGCTTGGCCGCAGGGCAGG-3’

sgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO：16)：5’-GGCTTGGCCGCAGGGCAGGTGGG-3’

sgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO：17)：5’-TGTTTCCTGAGACAAATTCCTGG-3’

sgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO：18)：5’-TCATCCCAGGAATTTGTCTCAGG-3’

sgRNA10靶位点序列(SEQ ID NO：19)：5’-GGATGAGGGTACATTGTGACTGG-3’

sgRNA11靶位点序列(SEQ ID NO：20)：5’-GGATGAGGGGCGGTAGAGTTAGG-3’

sgRNA12靶位点序列(SEQ ID NO：21)：5’-GGCGGTAGAGTTAGGCATGGTGG-3’

sgRNA13靶位点序列(SEQ ID NO：22)：5’-GAGTTAGGCATGGTGGTGGAAGG-3’

sgRNA14靶位点序列(SEQ ID NO：23)：5’-GGCATGGTGGTGGAAGGGTCAGG-3’

sgRNA15靶位点序列(SEQ ID NO：24)：5’-GAGACAAATTCCTGGGATGAGGG-3’

利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，其中，sgRNA9和sgRNA13相对活性较低，这可能是由于靶位点序列的特殊性导致，但根据我们的实验及其具体活性值，sgRNA9和sgRNA13的相对活性值仍显著高于阴性对照组值，仍可判断sgRNA9和sgRNA13是具有活性的，并且活性满足基因打靶实验要求，除SEQ ID NO：10-24以外，其他不具备活性的sgRNA结果未显示，具体检测结果见表1和图4、5。从中随机选择sgRNA4和sgRNA15进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(序列见表2)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-THPO-4和pT7-THPO-15。

表1 sgRNA活性UCA检测结果

表2 sgRNA4和sgRNA15序列列表

pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：33)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。取小鼠的原核期受精卵，例如，NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null(B-NDG)小鼠，或NOD/scid小鼠的受精卵，利用显微注射仪将pT7-THPO-4、pT7-THPO-15质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的THPO基因突变小鼠品系。

使用NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null(如，B-NDG)小鼠受精卵进行注射时，因其具有较高的免疫缺陷程度，得到的THPO基因突变小鼠背景明确且具有高度免疫缺陷。选择NOD/scid小鼠的受精卵进行注射，得到经鉴定正确的突变体可进一步的与NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠进行交配或体外授精，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到THPO基因突变与IL-2rg基因敲除的杂合动物模型(NOD/scid背景)，再将杂合子相互交配可以得到重度免疫缺陷的THPO基因突变小鼠。可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠(NOD/scid背景)的鉴定结果见图6。结合5’端引物检测结果和3’端引物检测结果可知，图6中编号为F0-1至F0-3的3只小鼠均为阳性小鼠。PCR分析包括下述引物：

5’端引物：

L-GT-F(SEQ ID NO：38)：5’-TGGGCAGGCTTGTGACCCTACTAC-3’

L-GT-R(SEQ ID NO：39)：5’-CCAGGGACCTGGAGGTTTGGTT-3’

3’端引物：

R-GT-F(SEQ ID NO：40)：5’-CACAGCTGTCCCCAGCAGAACC-3’

R-GT-R(SEQ ID NO：41)：5’-GGCTGCCTGGGACTTTGTCAGTGC-3’

将F0鉴定为阳性的人源化小鼠(NOD/scid背景)与野生型NOD/scid小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，鉴定结果见图7。进一步的将PCR鉴定为阳性的7只F1小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用NdeI或PstI酶消化基因组，转膜，杂交。探针P1、P2分别位于3’同源臂外侧及A片段上。探针合成引物如下：

P1-F(SEQ ID NO：34)：5’-ATGCTCACCAGATGGCTCAG-3’

P1-R(SEQ ID NO：35)：5’-CTGGGTTTGTCACAGGAGCT-3’

P2-F(SEQ ID NO：36)：5’-GCTGACTGAATTGCTCCTCGTG-3’

P2-R(SEQ ID NO：37)：5’-CCAAGGAGGAGACGGACCTGTCC-3’

Southern blot检测结果见图8。综合P1、P2探针的结果表明，7只小鼠均无随机插入，证实7只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入，编号分别为F1-11、F1-12、F1-18、F1-19、F1-21、F1-25、F1-26。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的THPO人源化基因工程小鼠。

实施例2含有人THPO的基因工程人源化小鼠免疫重建及验证

选择6周龄的THPO人源化小鼠(B-NDG背景，n＝20，后续简称“THPO小鼠”)和B-NDG小鼠(n＝20)，B-NDG小鼠经辐照(2.0Gy)清髓预处理后，与未经辐照的THPO小鼠均经尾静脉注射1.5×10⁵人造血干细胞(HSC)，以在小鼠体内重建免疫系统，重建成功的标准为hCD45占总活细胞的比例≥25％。注射移植后每四周取外周血(PB)进行流式细胞检测以评估重建是否成功，观察小鼠状态并记录的存活情况。

实验结果显示，实验结束时(第20周，具体为注射后第140天)时THPO小鼠存活率为70％，B-NDG小鼠存活率为30％，存在显著差异(P＝0.0021，图9)。流式检测结果显示第4周起可以在所有小鼠体内检测到表达人白细胞表面分子标记(CD45⁺)的细胞，但整体来看，B-NDG小鼠体内的观察到的人白细胞的百分比在整个实验周期内呈现先上升后下降的趋势，而在THPO小鼠则持续呈现上升的趋势(图10)。

从整个实验周期的数据来看，THPO小鼠体内的人白细胞的比例、重建成功的比例自第16周起高于B-NDG小鼠(见图11)。进一步通过流式分析外周血中T细胞(CD3+)、B细胞(CD19+)、髓系细胞(CD33+)、NK细胞(CD56+)、单核细胞(CD14+)和粒细胞(CD66b+)的发育(图12至图17)。检测结果表明THPO小鼠与B-NDG小鼠体内的各类细胞分化比例比较接近，表明改造后的小鼠可不经辐照允许人造血干细胞的稳定移植。流式检测门控策略：人白细胞被定位为完整的、单一的、活的细胞，hCD45+，mCD45-。在人白细胞群中，T细胞(CD3+)被定为完整的、单一的、活的，hCD45+，mCD45-，hCD3+，hCD19-；B细胞被定为完整的、单一的、活的，hCD45+，mCD45-，hCD3-，hCD19+；NK细胞被定为完整的、单一的、活的，hCD45+，mCD45-，hCD3-，hCD56+。髓系细胞被定为完整的、单一的、活的，hCD45+，mCD45-，hCD33+。髓系细胞群中，单核细胞被定为完整的、单一的、活的，hCD45+，mCD45-，hCD33+，hCD14+；粒细胞被定为完整的、单一的、活的，hCD45+，mCD45-，hCD33+，hCD66b+。

以上数据表明经本方法改造的THPO基因人源化小鼠可以不经清髓直接进行HSC免疫重建，且在体内能够有效的促进人源细胞的发育，提高人组织和细胞的移植率。

为进一步验证本方法制备的THPO基因人源化小鼠的免疫重建情况和生存情况，本实验继续测定了20周至30周时B-NDG小鼠和THPO小鼠外周血中T细胞(CD3+)、B细胞(CD19+)、NK细胞(CD56+)、髓系细胞(CD33+)、单核细胞(CD14+)和粒细胞(CD66b+)的发育情况(图18至图23)。结果表明，30周时THPO小鼠存活且体内仍能检测到T细胞、B细胞、NK细胞、髓系细胞、单核细胞和粒细胞。

综合以上数据进一步表明，THPO小鼠可不经辐照允许人造血干细胞的稳定移植，重建成功比例自第16周起高于B-NDG小鼠，第20周之后THPO小鼠存活数量高于B-NDG小鼠，第30周仍然有THPO小鼠存活，生存期大于B-NDG小鼠，可为药物筛选和药效验证提供了更长的实验窗口期。

重建后的人源化免疫系统小鼠可用于建立异种移植肿瘤模型，这类模型可广泛应用于针对人用药物的筛选、药效学研究等，提高药物的临床转化率。具体来说，可以在THPOB-NDG小鼠移植CD34+细胞后接种肿瘤组织，待肿瘤生长至一定体积后分组、给药，定期测量肿瘤体积、小鼠体重和死亡情况，可用于评估、筛选待测药物或其组合的药效、安全性等。

实施例3含有人THPO的双基因或多基因人源化小鼠

利用本方法或制得的THPO小鼠还可以制备双基因人源化或多基因人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，例如，选择CSF2或IL3或CSF1或IL15基因人源化小鼠的受精卵细胞按照本方法进行基因编辑，可以进一步得到CSF2或IL3或CSF1或IL15基因与THPO基因修饰的双基因人源化小鼠模型。也可将本方法得到的THPO小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配或体外受精，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到THPO人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。

实施例4基于胚胎干细胞的制备方法

采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于利用胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因打靶技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得THPO基因人源化小鼠。

根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠THPO基因示意图(图2、3)，发明人设计了新的打靶策略并设计了新的靶向载体。鉴于本发明的目的之一是破坏小鼠THPO基因编码框，并在鼠THPO基因座插入编码人THPO蛋白的核酸序列，为此，发明人设计了包含5’同源臂、3’同源臂人源化基因片段的靶向载体，在靶向载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的靶向载体转染小鼠胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的靶向载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例1一致。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司

<120> THPO基因人源化的非人动物的构建方法及应用

<130> 1

<160> 41

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2262

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

gaggaggggc tgtaccccaa ccagtgtctt cctacctact tgttccccag agtgctgcct 60

gctgtgcacc tgggtcctga ggcccttctc cacccggaca gagtccttgg cccacctctc 120

tcccacccga ctctgccgaa agaagcacag aagctcaagc cgcctccatg gccccaggaa 180

agattcaggg gagaggcccc atacagggag ccacttcagt tagacaccct ggccagaatg 240

gagctgactg atttgctcct ggcggccatg cttcttgcag tggcaagact aactctgtcc 300

agccccgtag ctcctgcctg tgaccccaga ctcctaaata aactgctgcg tgactcccac 360

ctccttcaca gccgactgag tcagtgtccc gacgtcgacc ctttgtctat ccctgttctg 420

ctgcctgctg tggactttag cctgggagaa tggaaaaccc agacggaaca gagcaaggca 480

caggacattc taggggcagt gtcccttcta ctggagggag tgatggcagc acgaggacag 540

ttggaaccct cctgcctctc atccctcctg ggacagcttt ctgggcaggt tcgcctcctc 600

ttgggggccc tgcagggcct cctaggaacc cagcttcctc tacagggcag gaccacagct 660

cacaaggacc ccaatgccct cttcttgagc ttgcaacaac tgcttcgggg aaaggtgcgc 720

ttcctgcttc tggtagaagg tcccaccctc tgtgtcagac ggaccctgcc aaccacagct 780

gtcccaagca gtacttctca actcctcaca ctaaacaagt tcccaaacag gacttctgga 840

ttgttggaga cgaacttcag tgtcacagcc agaactgctg gccctggact tctgagcagg 900

cttcagggat tcagagtcaa gattactcct ggtcagctaa atcaaacctc caggtcccca 960

gtccaaatct ctggatacct gaacaggaca cacggacctg tgaatggaac tcatgggctc 1020

tttgctggaa cctcacttca gaccctggaa gcctcagaca tctcgcccgg agctttcaac 1080

aaaggctccc tggcattcaa cctccagggt ggacttcctc cttctccaag ccttgctcct 1140

gatggacaca cacccttccc tccttcacct gccttgccca ccacccatgg atctccaccc 1200

cagctccacc ccctgtttcc tgacccttcc accaccatgc ctaactctac cgcccctcat 1260

ccagtcacaa tgtaccctca tcccaggaat ttgtctcagg aaacatagcg cgggcactgg 1320

cccagtgagc gtctgcagct tctctcgggg acaagcttcc ccaggaaggc tgagaggcag 1380

ctgcatctgc tccagatgtt ctgctttcac ctaaaaggcc ctggggaagg gatacacagc 1440

actggagatt gtaaaatttt aggagctatt tttttttaac ctatcagcaa tattcatcag 1500

agcagctagc gatctttggt ctattttcgg tataaatttg aaaatcacta attctctata 1560

tgtgctttca tacattaagt ctgcaaatgc ctaggcaggt cttgcctttt aacccaggta 1620

gatgctacac catatcagaa aacaaaaggg aactttcctt tgcttcaagt ttaagccttc 1680

ccgcgcctcc aacaccccca caatgccctc cttcccttca ctgtaattct cagtgagact 1740

gtatggtcct cgagatatac tgctcttgat aaagaattaa caggctatca cttagaaaga 1800

ctgtccctac ttaagagaca aaactgaacc tgtaagagaa taactgggag cacccaaaag 1860

ccaataaaaa tcagggacca atgttcttca ctggggcaac agagctcctg gaccctgcct 1920

cccaagaaag ctaacaggaa gcctgggagc tccacacccc aggtaaggct gtgcagctgg 1980

ctcagtaaag agcagacttg gatgtggcag ctgagcaaag agcatcagca gctcagcagg 2040

ggctcagcca ggcctgggct cctgcttccc tcctgtggag gtcaggcgga agtgcaggaa 2100

gtggcaagag gcaggctcct cggctcacac agcaggacaa gcacagagcg cttgaaggct 2160

ctttataatt tccacaaatg cacctaaaaa gcagccctgt gtggccactc caaactttat 2220

tggaaccctc ccaaatgaag gcagacttat aggactttcc aa 2262

<210> 2

<211> 356

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 2

Met Glu Leu Thr Asp Leu Leu Leu Ala Ala Met Leu Leu Ala Val Ala

1 5 10 15

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Val Ala Pro Ala Cys Asp Pro Arg Leu

20 25 30

Leu Asn Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Leu Leu His Ser Arg Leu Ser

35 40 45

Gln Cys Pro Asp Val Asp Pro Leu Ser Ile Pro Val Leu Leu Pro Ala

50 55 60

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Thr Glu Gln Ser Lys

65 70 75 80

Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Ser Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

85 90 95

Ala Ala Arg Gly Gln Leu Glu Pro Ser Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

100 105 110

Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Gly Leu

115 120 125

Leu Gly Thr Gln Leu Pro Leu Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

130 135 140

Pro Asn Ala Leu Phe Leu Ser Leu Gln Gln Leu Leu Arg Gly Lys Val

145 150 155 160

Arg Phe Leu Leu Leu Val Glu Gly Pro Thr Leu Cys Val Arg Arg Thr

165 170 175

Leu Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Ser Thr Ser Gln Leu Leu Thr Leu

180 185 190

Asn Lys Phe Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Ser

195 200 205

Val Thr Ala Arg Thr Ala Gly Pro Gly Leu Leu Ser Arg Leu Gln Gly

210 215 220

Phe Arg Val Lys Ile Thr Pro Gly Gln Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser

225 230 235 240

Pro Val Gln Ile Ser Gly Tyr Leu Asn Arg Thr His Gly Pro Val Asn

245 250 255

Gly Thr His Gly Leu Phe Ala Gly Thr Ser Leu Gln Thr Leu Glu Ala

260 265 270

Ser Asp Ile Ser Pro Gly Ala Phe Asn Lys Gly Ser Leu Ala Phe Asn

275 280 285

Leu Gln Gly Gly Leu Pro Pro Ser Pro Ser Leu Ala Pro Asp Gly His

290 295 300

Thr Pro Phe Pro Pro Ser Pro Ala Leu Pro Thr Thr His Gly Ser Pro

305 310 315 320

Pro Gln Leu His Pro Leu Phe Pro Asp Pro Ser Thr Thr Met Pro Asn

325 330 335

Ser Thr Ala Pro His Pro Val Thr Met Tyr Pro His Pro Arg Asn Leu

340 345 350

Ser Gln Glu Thr

355

<210> 3

<211> 1918

<212> DNA/RNA

<213> 人(human)

<400> 3

agaagtggcc caggcaggcg tatgacctgc tgctgtggag gggctgtgcc ccaccgccac 60

atgtcttcct acccatctgc tccccagagg gctgcctgct gtgcacttgg gtcctggagc 120

ccttctccac ccggatagat tcttcaccct tggcccgcct ttgccccacc ctactctgcc 180

cagaagtgca agagcctaag ccgcctccat ggccccagga aggattcagg ggagaggccc 240

caaacaggga gccacgccag ccagacaccc cggccagaat ggagctgact gaattgctcc 300

tcgtggtcat gcttctccta actgcaaggc taacgctgtc cagcccggct cctcctgctt 360

gtgacctccg agtcctcagt aaactgcttc gtgactccca tgtccttcac agcagactga 420

gccagtgccc agaggttcac cctttgccta cacctgtcct gctgcctgct gtggacttta 480

gcttgggaga atggaaaacc cagatggagg agaccaaggc acaggacatt ctgggagcag 540

tgacccttct gctggaggga gtgatggcag cacggggaca actgggaccc acttgcctct 600

catccctcct ggggcagctt tctggacagg tccgtctcct ccttggggcc ctgcagagcc 660

tccttggaac ccagcttcct ccacagggca ggaccacagc tcacaaggat cccaatgcca 720

tcttcctgag cttccaacac ctgctccgag gaaaggtgcg tttcctgatg cttgtaggag 780

ggtccaccct ctgcgtcagg cgggccccac ccaccacagc tgtccccagc agaacctctc 840

tagtcctcac actgaacgag ctcccaaaca ggacttctgg attgttggag acaaacttca 900

ctgcctcagc cagaactact ggctctgggc ttctgaagtg gcagcaggga ttcagagcca 960

agattcctgg tctgctgaac caaacctcca ggtccctgga ccaaatcccc ggatacctga 1020

acaggataca cgaactcttg aatggaactc gtggactctt tcctggaccc tcacgcagga 1080

ccctaggagc cccggacatt tcctcaggaa catcagacac aggctccctg ccacccaacc 1140

tccagcctgg atattctcct tccccaaccc atcctcctac tggacagtat acgctcttcc 1200

ctcttccacc caccttgccc acccctgtgg tccagctcca ccccctgctt cctgaccctt 1260

ctgctccaac gcccacccct accagccctc ttctaaacac atcctacacc cactcccaga 1320

atctgtctca ggaagggtaa ggttctcaga cactgccgac atcagcattg tctcgtgtac 1380

agctcccttc cctgcagggc gcccctggga gacaactgga caagatttcc tactttctcc 1440

tgaaacccaa agccctggta aaagggatac acaggactga aaagggaatc atttttcact 1500

gtacattata aaccttcaga agctattttt ttaagctatc agcaatactc atcagagcag 1560

ctagctcttt ggtctatttt ctgcagaaat ttgcaactca ctgattctct acatgctctt 1620

tttctgtgat aactctgcaa aggcctgggc tggcctggca gttgaacaga gggagagact 1680

aaccttgagt cagaaaacag agaaagggta atttcctttg cttcaaattc aaggccttcc 1740

aacgccccca tcccctttac tatcattctc agtgggactc tgatcccata ttcttaacag 1800

atctttactc ttgagaaatg aataagcttt ctctcagaaa tgctgtccct atacactaga 1860

caaaactgag cctgtataag gaataaatgg gagcgccgaa aagctcccta aaaagcaa 1918

<210> 4

<211> 353

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 4

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

1 5 10 15

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

20 25 30

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser

35 40 45

Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala

50 55 60

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys

65 70 75 80

Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

85 90 95

Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

100 105 110

Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu

115 120 125

Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

130 135 140

Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val

145 150 155 160

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala

165 170 175

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu

180 185 190

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr

195 200 205

Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly

210 215 220

Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu

225 230 235 240

Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly

245 250 255

Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro

260 265 270

Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu

275 280 285

Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr

290 295 300

Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu

305 310 315 320

His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser

325 330 335

Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu

340 345 350

Gly

<210> 5

<211> 2259

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaggaggggc tgtaccccaa ccagtgtctt cctacctact tgttccccag agtgctgcct 60

gctgtgcacc tgggtcctga ggcccttctc cacccggaca gagtccttgg cccacctctc 120

tcccacccga ctctgccgaa agaagcacag aagctcaagc cgcctccatg gccccaggaa 180

agattcaggg gagaggcccc atacagggag ccacttcagt tagacaccct ggccagaatg 240

gagctgactg aattgctcct cgtggtcatg cttctcctaa ctgcaaggct aacgctgtcc 300

agcccggctc ctcctgcttg tgacctccga gtcctcagta aactgcttcg tgactcccat 360

gtccttcaca gcagactgag ccagtgccca gaggttcacc ctttgcctac acctgtcctg 420

ctgcctgctg tggactttag cttgggagaa tggaaaaccc agatggagga gaccaaggca 480

caggacattc tgggagcagt gacccttctg ctggagggag tgatggcagc acggggacaa 540

ctgggaccca cttgcctctc atccctcctg gggcagcttt ctggacaggt ccgtctcctc 600

cttggggccc tgcagagcct ccttggaacc cagcttcctc cacagggcag gaccacagct 660

cacaaggatc ccaatgccat cttcctgagc ttccaacacc tgctccgagg aaaggtgcgt 720

ttcctgatgc ttgtaggagg gtccaccctc tgcgtcaggc gggccccacc caccacagct 780

gtccccagca gaacctctct agtcctcaca ctgaacgagc tcccaaacag gacttctgga 840

ttgttggaga caaacttcac tgcctcagcc agaactactg gctctgggct tctgaagtgg 900

cagcagggat tcagagccaa gattcctggt ctgctgaacc aaacctccag gtccctggac 960

caaatccccg gatacctgaa caggatacac gaactcttga atggaactcg tggactcttt 1020

cctggaccct cacgcaggac cctaggagcc ccggacattt cctcaggaac atcagacaca 1080

ggctccctgc cacccaacct ccagcctgga tattctcctt ccccaaccca tcctcctact 1140

ggacagtata cgctcttccc tcttccaccc accttgccca cccctgtggt ccagctccac 1200

cccctgcttc ctgacccttc tgctccaacg cccaccccta ccagccctct tctaaacaca 1260

tcctacaccc actcccagaa tctgtctcag gaagggtagc atatgcgcgg gcactggccc 1320

agtgagcgtc tgcagcttct ctcggggaca agcttcccca ggaaggctga gaggcagctg 1380

catctgctcc agatgttctg ctttcaccta aaaggccctg gggaagggat acacagcact 1440

ggagattgta aaattttagg agctattttt ttttaaccta tcagcaatat tcatcagagc 1500

agctagcgat ctttggtcta ttttcggtat aaatttgaaa atcactaatt ctctatatgt 1560

gctttcatac attaagtctg caaatgccta ggcaggtctt gccttttaac ccaggtagat 1620

gctacaccat atcagaaaac aaaagggaac tttcctttgc ttcaagttta agccttcccg 1680

cgcctccaac acccccacaa tgccctcctt cccttcactg taattctcag tgagactgta 1740

tggtcctcga gatatactgc tcttgataaa gaattaacag gctatcactt agaaagactg 1800

tccctactta agagacaaaa ctgaacctgt aagagaataa ctgggagcac ccaaaagcca 1860

ataaaaatca gggaccaatg ttcttcactg gggcaacaga gctcctggac cctgcctccc 1920

aagaaagcta acaggaagcc tgggagctcc acaccccagg taaggctgtg cagctggctc 1980

agtaaagagc agacttggat gtggcagctg agcaaagagc atcagcagct cagcaggggc 2040

tcagccaggc ctgggctcct gcttccctcc tgtggaggtc aggcggaagt gcaggaagtg 2100

gcaagaggca ggctcctcgg ctcacacagc aggacaagca cagagcgctt gaaggctctt 2160

tataatttcc acaaatgcac ctaaaaagca gccctgtgtg gccactccaa actttattgg 2220

aaccctccca aatgaaggca gacttatagg actttccaa 2259

<210> 6

<211> 1309

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttccttgaaa cctgatgaac gattcactat ttctgtcatt ttcaggacag agtccttggc 60

ccacctctct cccacccgac tctgccgaaa gaagcacaga agctcaagcc gcctccatgg 120

ccccaggaaa gattcagggg agaggcccca tacagggagc cacttcagtt agacaccctg 180

gccagaatgg agctgactga attgctcctc gtggtcatgc ttctcctaac tgcaaggcta 240

acgctgtcca gcccggctcc tcctgcttgt gacctccgag tcctcagtaa actgcttcgt 300

gactcccatg tccttcacag cagactgagc cagtgcccag aggttcaccc tttgcctaca 360

cctgtcctgc tgcctgctgt ggactttagc ttgggagaat ggaaaaccca gatggaggag 420

accaaggcac aggacattct gggagcagtg acccttctgc tggagggagt gatggcagca 480

cggggacaac tgggacccac ttgcctctca tccctcctgg ggcagctttc tggacaggtc 540

cgtctcctcc ttggggccct gcagagcctc cttggaaccc agcttcctcc acagggcagg 600

accacagctc acaaggatcc caatgccatc ttcctgagct tccaacacct gctccgagga 660

aaggtgcgtt tcctgatgct tgtaggaggg tccaccctct gcgtcaggcg ggccccaccc 720

accacagctg tccccagcag aacctctcta gtcctcacac tgaacgagct cccaaacagg 780

acttctggat tgttggagac aaacttcact gcctcagcca gaactactgg ctctgggctt 840

ctgaagtggc agcagggatt cagagccaag attcctggtc tgctgaacca aacctccagg 900

tccctggacc aaatccccgg atacctgaac aggatacacg aactcttgaa tggaactcgt 960

ggactctttc ctggaccctc acgcaggacc ctaggagccc cggacatttc ctcaggaaca 1020

tcagacacag gctccctgcc acccaacctc cagcctggat attctccttc cccaacccat 1080

cctcctactg gacagtatac gctcttccct cttccaccca ccttgcccac ccctgtggtc 1140

cagctccacc ccctgcttcc tgacccttct gctccaacgc ccacccctac cagccctctt 1200

ctaaacacat cctacaccca ctcccagaat ctgtctcagg aagggtagca tatgcgcggg 1260

cactggccca gtgagcgtct gcagcttctc tcggggacaa gcttcccca 1309

<210> 7

<211> 1419

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaagcacca tttggggtta agtgggggta tggtatgaag aacaaaaaag aaccgggctc 60

ttagctgggg gaggggcaag caaactggaa cctacaggca ctgacctttg tcaagaagag 120

tggagccttc ccagaatggg aggagcagga cagagcaggg aaagggggtt gggtagctgg 180

tttatgaggg attattcaca gactcagaat tcagcatagg tctggctgct ttggggccat 240

gagaaaataa gaaagggggt gcgtgcaggc ctggagaact ttgtccagag gaacgtaatc 300

ctaattccca ccctcatatg gtcattcttg ttagcttaag gttctgagtc tggcactggg 360

aagctgggtc aggtgagcca aggcacggaa agagggtaac aggagggggg cgtgtgtctg 420

ttgacagacc tacaggagat cccaatattg aatcaggtgc aggtctcggc tcaacttgtg 480

aaaagaggag ggtcctaatg cctctttgct caacttgtga aaagcgaggg tcccaggaag 540

ggcctggaag ggatctggag ggggcaggga ggcagatgca gttgccgtaa aaaaacgctg 600

gcagtgtcta aggtgaagga agccatgtga ggcagatatc atcttgctct gtaagtgcca 660

cccaggtctc tggcctcagg aaagaagtcc tagttctatt acccactttg acttgagtac 720

ttgaaaatcc aaagaaaagt cctgggtttt atttgtgggc caaaagggaa agaatgtcca 780

agtttctctt ttaattcctg cctctggtgg tctgttatgt ccttacccag tctgcctcag 840

tcccactccc aacaccgttc cttagtgcat gtgtccattt gcctgcccat ttgctttttc 900

ttcttggcct ggtgacccat tttccactct tctccaaact taacaacacc cctctctatt 960

cccgtcccac attctctccc agctaacaac caatgctcag aatttgagtc cacttaaaat 1020

gtgtgcgtaa catctcgctg ctcttagcag ggcaacaatt ggtagatggc accaagatct 1080

tatcagagtc actgaagagc tgttacaaga ggaggcacta taatgcttca gtcacaagaa 1140

aatatgggac cagttggaac acaaacagct ctggccctag ctggccagca gttcaaggcc 1200

tccaagcacc cgtttcccgt gccagaaagt cttttccttg aaacctgatg aacgattcac 1260

tatttctgtc attttcagga cagagtcctt ggcccacctc tctcccaccc gactctgccg 1320

aaagaagcac agaagctcaa gccgcctcca tggccccagg aaagattcag gggagaggcc 1380

ccatacaggg agccacttca gttagacacc ctggccaga 1419

<210> 8

<211> 1645

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tagcatatgc gcgggcactg gcccagtgag cgtctgcagc ttctctcggg gacaagcttc 60

cccaggaagg ctgagaggca gctgcatctg ctccagatgt tctgctttca cctaaaaggc 120

cctggggaag ggatacacag cactggagat tgtaaaattt taggagctat ttttttttaa 180

cctatcagca atattcatca gagcagctag cgatctttgg tctattttcg gtataaattt 240

gaaaatcact aattctctat atgtgctttc atacattaag tctgcaaatg cctaggcagg 300

tcttgccttt taacccaggt agatgctaca ccatatcaga aaacaaaagg gaactttcct 360

ttgcttcaag tttaagcctt cccgcgcctc caacaccccc acaatgccct ccttcccttc 420

actgtaattc tcagtgagac tgtatggtcc tcgagatata ctgctcttga taaagaatta 480

acaggctatc acttagaaag actgtcccta cttaagagac aaaactgaac ctgtaagaga 540

ataactggga gcacccaaaa gccaataaaa atcagggacc aatgttcttc actggggcaa 600

cagagctcct ggaccctgcc tcccaagaaa gctaacagga agcctgggag ctccacaccc 660

caggtaaggc tgtgcagctg gctcagtaaa gagcagactt ggatgtggca gctgagcaaa 720

gagcatcagc agctcagcag gggctcagcc aggcctgggc tcctgcttcc ctcctgtgga 780

ggtcaggcgg aagtgcagga agtggcaaga ggcaggctcc tcggctcaca cagcaggaca 840

agcacagagc gcttgaaggc tctttataat ttccacaaat gcacctaaaa agcagccctg 900

tgtggccact ccaaacttta ttggaaccct cccaaatgaa ggcagactta taggactttc 960

caagtaaacc cgagtctcag ctttgttggt gctagaggtt tacattgcgc aagaacaaaa 1020

actgtattgc caagggtcaa cctgcaatag ccagagtctt atgaaaagac tggtgagagc 1080

ttttccctct cttgtgtccc aaagtaaagg aggaaagacc accatgtagg tggaaaagcc 1140

aggatctcac agttccaaac acacacacac acacgtgtgg ggatgacaat tcagacagtg 1200

ccaggtgtct acacaggcag aacctaatga acggatcaac agatgcacat agctaaaact 1260

gttatcagaa tctcagtgtc agtttctatg tgacagagac cttcatcttc taattctagg 1320

ataaatatac tttgtaattt gtcgtaacac taaaagaggc taaatttaac atttaaaaag 1380

gaatttaggg ccagtgagat ggctcagtag ttgaacgtgt tttgttttgt gccagtctga 1440

cattaatctg atgtctggat cctatggaaa aggcaagaac tcccagaagt tgtcttccaa 1500

cttcattatg cacaccatca catgccaact cccacacttg cacatacaca tcacacatac 1560

acacatgata ataaaataaa atttaagtta aaaaaaaaaa aagctggaca taatggcaca 1620

tgcctgtaaa acccggcatt tcagc 1645

<210> 9

<211> 1059

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atggagctga ctgaattgct cctcgtggtc atgcttctcc taactgcaag gctaacgctg 60

tccagcccgg ctcctcctgc ttgtgacctc cgagtcctca gtaaactgct tcgtgactcc 120

catgtccttc acagcagact gagccagtgc ccagaggttc accctttgcc tacacctgtc 180

ctgctgcctg ctgtggactt tagcttggga gaatggaaaa cccagatgga ggagaccaag 240

gcacaggaca ttctgggagc agtgaccctt ctgctggagg gagtgatggc agcacgggga 300

caactgggac ccacttgcct ctcatccctc ctggggcagc tttctggaca ggtccgtctc 360

ctccttgggg ccctgcagag cctccttgga acccagcttc ctccacaggg caggaccaca 420

gctcacaagg atcccaatgc catcttcctg agcttccaac acctgctccg aggaaaggtg 480

cgtttcctga tgcttgtagg agggtccacc ctctgcgtca ggcgggcccc acccaccaca 540

gctgtcccca gcagaacctc tctagtcctc acactgaacg agctcccaaa caggacttct 600

ggattgttgg agacaaactt cactgcctca gccagaacta ctggctctgg gcttctgaag 660

tggcagcagg gattcagagc caagattcct ggtctgctga accaaacctc caggtccctg 720

gaccaaatcc ccggatacct gaacaggata cacgaactct tgaatggaac tcgtggactc 780

tttcctggac cctcacgcag gaccctagga gccccggaca tttcctcagg aacatcagac 840

acaggctccc tgccacccaa cctccagcct ggatattctc cttccccaac ccatcctcct 900

actggacagt atacgctctt ccctcttcca cccaccttgc ccacccctgt ggtccagctc 960

caccccctgc ttcctgaccc ttctgctcca acgcccaccc ctaccagccc tcttctaaac 1020

acatcctaca cccactccca gaatctgtct caggaaggg 1059

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagaatggag ctgactggta agg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

taaggctaca tgaagggcta ggg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctagggaca agttcaagaa tgg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggacaagttc aagaatggct tgg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ttcaagaatg gcttggccgc agg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaatggcttg gccgcagggc agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggcttggccg cagggcaggt ggg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

tgtttcctga gacaaattcc tgg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

tcatcccagg aatttgtctc agg 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatgagggt acattgtgac tgg 23

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggatgagggg cggtagagtt agg 23

<210> 21

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggcggtagag ttaggcatgg tgg 23

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gagttaggca tggtggtgga agg 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggcatggtgg tggaagggtc agg 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gagacaaatt cctgggatga ggg 23

<210> 25

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

acaagttcaa gaatggct 18

<210> 26

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

taggacaagt tcaagaatgg ct 22

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

agccattctt gaacttgt 18

<210> 28

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaacagccat tcttgaactt gt 22

<210> 29

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

agacaaattc ctgggatga 19

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

taggagacaa attcctggga tga 23

<210> 31

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

tcatcccagg aatttgtct 19

<210> 32

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

aaactcatcc caggaatttg tct 23

<210> 33

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttaaaggat cc 132

<210> 34

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

atgctcacca gatggctcag 20

<210> 35

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

ctgggtttgt cacaggagct 20

<210> 36

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gctgactgaa ttgctcctcg tg 22

<210> 37

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

ccaaggagga gacggacctg tcc 23

<210> 38

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

tgggcaggct tgtgacccta ctac 24

<210> 39

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

ccagggacct ggaggtttgg tt 22

<210> 40

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

cacagctgtc cccagcagaa cc 22

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

ggctgcctgg gactttgtca gtgc 24

Claims

1.一种THPO基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列，

所述的构建方法包括将SEQ ID NO：9引入至非人动物内源THPO基因座上；

所述的非人动物的基因组中包含嵌合THPO基因；所述的嵌合THPO基因包含下列组中的一种：

（a）嵌合THPO基因转录的mRNA序列为SEQ ID NO：5所示的序列；或，

（b）嵌合THPO基因序列包含SEQ ID NO：6所示核苷酸序列；

所述的非人动物表达人源化THPO蛋白，同时内源THPO蛋白表达降低或缺失；

所述的非人动物为NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的嵌合THPO基因通过内源性调控元件调控。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体和/或sgRNA，将包含SEQID NO：9的核苷酸序列替换至非人动物THPO基因座；

所述的sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：13所示，3’端靶位点序列如SEQ IDNO：24所示；

所述的靶向载体包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列。

4.一种THPO基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列，以及，5’臂和3’臂；

所述5’臂序列如SEQ ID NO：7所示；

所述3’臂序列如SEQ ID NO：8所示。

5.一种制备多基因修饰的非人动物的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）采用权利要求1-3任一所述的构建方法获得THPO基因人源化的非人动物；

（2）将步骤（1）获得的THPO基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的其他基因修饰的非人动物为IL2RG基因敲除的非人动物、CSF2基因人源化的非人动物、IL3基因人源化的非人动物、CSF1基因人源化的非人动物或IL15基因人源化的非人动物中的一种或两种以上的组合。

7.来源于权利要求1-3任一所述的构建方法构建的THPO基因人源化的非人动物或者权利要求5-6任一所述的方法制备的多基因修饰的非人动物的用途，其特征在于，所述的用途为非疾病的诊断和治疗目的，所述的用途包括：

A）在制备荷瘤或炎症的动物模型中的用途；

B）在人源细胞移植、免疫系统重建中的用途；或，

C）在筛选或评估药物中的用途。

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，C）中所述的药物为靶向人的抗体。