CN111073907A - 人源化细胞因子csf1基因改造非人动物的构建方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人源化基因改造非人动物，具体涉及表达人源化细胞因子蛋白的一种人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法及其在生物医药领域的应用。具体涉及表达人或人源化CSF1蛋白的动物模型。在一些例子中，表达人CSF1蛋白的经遗传修饰的非人动物还含有IL2rg缺失，和/或含有IL3、CSF2等更多基因人源化。

Description

人源化细胞因子CSF1基因改造非人动物的构建方法及应用
技术领域
本申请涉及人源化CSF1基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化细胞因子CSF1蛋白改造动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
细胞的分化、发育、增殖乃至活化，均受到多个细胞因子信号的协同作用，其中巨噬细胞集落刺激因子M-CSF(Macrophage-colony stimulating factor，又称colony-stimulating factor 1，CSF1)是骨髓祖细胞分化为单核细胞谱系细胞(monocyte lineagecells)，如巨噬细胞，破骨细胞和小胶质细胞所必须的细胞因子，在单核巨噬细胞的存活、增殖、分化及维持活性促进造血功能中具有重要作用。除了此之外，已有研究表明CSF1在破骨细胞的分化、雌性生殖道细胞的分化、胎盘的形成及血管和淋巴的发育过程也有重要作用，并做为促炎因子参与炎性反应，是肿瘤和炎症的有效标志。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。其中，免疫缺陷动物由于缺乏免疫力，容易接受异种细胞或组织，在组织或细胞人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。已有研究表明作为受体鼠，目前普遍使用的免疫缺陷动物排序如下：NOD-PrkdcscidIL-2rγnul小鼠〉NOD-Rag 1-/--IL2rg-/-〉Rag 2-/--IL2rg-/-〉NOD/scid〉裸鼠，表明NOD-Prkdcscid IL-2rγnul小鼠是目前最佳的移植受体鼠(Ito R et al.Cell MolImmunol.2012May；9(3):208-14)。
一个理想的免疫系统人源化小鼠不仅要有人源的多谱系免疫系统，还应该使各细胞亚群的比例与人类接近，且具有功能。尽管NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠机体免疫功能严重缺陷，对人源细胞和组织几乎没有排斥反应，少量细胞即可成瘤(依赖于细胞系或细胞类型)，同时也没有B淋巴细胞泄漏，是最适合人源细胞或组织移植的工具小鼠，并已广泛用于新的人源化小鼠模型研发，但由于鼠的细胞因子不能很好的作用于人的造血细胞，在移植人造血干细胞后，人源细胞的发育和功能上存有缺陷(Watanabe Y et al.,IntImmunol.2009Jul；21(7):843-58)。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generation and utility of geneticallyhumanized mouse models,Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。百奥赛图公司已经成功制备了NOD-Prkdcscid IL-2rγnull小鼠(命名为B-NDG小鼠)，为了进一步优化已有模型，解决临床转换方面存在的不足和需求，本领域急需制备新的动物模型。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法，所述的人源化CSF1基因改造非人动物体内表达人或人源化CSF1蛋白。
优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含编码人CSF1蛋白的核苷酸序列。
更优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包括人CSF1基因的外显子1至外显子8的部分或全部，所述的人CSF1基因通过内源性调控元件调控，使得该非人动物体内表达人CSF1蛋白。
优选的，所述的外显子1至外显子8的部分为至少30、60、90个与人CSF1基因的核苷酸序列相同，且人源化CSF1基因改造非人动物体内产生的CSF1蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
进一步优选的，所述的外显子1至外显子8的部分或全部包含人CSF1基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7或外显子8核苷酸序列中的任一种或两种或三种以上的组合。所述的三种以上包括三种、四种、五种、六种、七种或八种。
再进一步优选的，所述的外显子1至外显子8的部分或全部包含人CSF1基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7或外显子8核苷酸序列中连续两个或连续三个以上外显子核苷酸序列的组合。所述的连续三个以上包括连续连续三个、连续四个、连续五个、连续六个、连续七个或连续八个。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包括人CSF1基因的外显子1的部分核苷酸序列、外显子2的全部核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列、外显子7的全部核苷酸序列和外显子8的部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1基因改造非人动物体的基因组中包括人CSF1基因的外显子1的起始密码子至外显子8的终止密码子的核苷酸序列。
本发明所述的构建方法中使用基因编辑技术进行人源化CSF1基因改造非人动物的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
进一步优选的，使用靶向CSF1基因的sgRNA序列将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因的内源调控元件之后。更进一步优选的，插入位点为起始密码子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括使用靶向CSF1基因的sgRNA序列将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因的起始密码子前或者用编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换非人动物CSF1基因的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，并使得所述人源化非人动物体内表达人CSF1蛋白；
其中，所述的sgRNA序列在待改变的CSF1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则；
优选的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：18-26任一项所示。
进一步优选的，使用靶向载体将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因的内源调控元件之后。更进一步优选的，插入位点为起始密码子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括使用靶向载体将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因的起始密码子前或者用编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换非人动物CSF1基因的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，并使得所述人源化非人动物体内表达人CSF1蛋白；
其中，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸。
优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸。
优选的，所述的内源CSF1蛋白表达缺失或者所述的内源CSF1蛋白不表达。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将编码CSF1蛋白的核苷酸序列替换内源CSF1基因座的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，使得所述的非人动物表达人CSF1蛋白，且使得内源CSF蛋白不表达。
在本发明的一个具体实施方式中，所述构建方法包括将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物CSF1基因座，并破坏内源CSF1蛋白的编码框，使得所述的非人动物表达人CSF1蛋白，且使得内源CSF1蛋白不表达。
本发明的第二方面，提供了一种根据上述人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法构建获得的人源化CSF1基因改造非人动物。
本发明的第三方面，提供了一种人源化CSF1基因改造非人动物，所述的人源化CSF1基因改造非人动物体内表达人或人源化CSF1蛋白。
优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含编码人CSF1蛋白的核苷酸序列。
更优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包括人CSF1基因的外显子1至外显子8的部分或全部，所述的人CSF1基因通过内源性调控元件调控；该人源化CSF1非人动物体内表达人CSF1蛋白。
本发明所述的人源化CSF1基因改造非人动物或根据本发明所述的人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法构建的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包括嵌合CSF1基因，所述的嵌合CSF1基因编码人或人源化CSF1蛋白。
本发明的第四方面，提供了一种CSF1基因经遗传修饰的细胞，所述的细胞表达人或人源化CSF1蛋白。
优选的，所述细胞的基因组中包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述细胞的基因组中包含编码CSF1蛋白的核苷酸序列。
更优选的，所述细胞的基因组中包括人CSF1基因的外显子1至外显子8的部分或全部，所述的人CSF1基因通过内源性调控元件调控；该细胞表达人CSF1蛋白。
进一步优选的，所述细胞的基因组中包含外显子1的部分核苷酸序列、外显子2的全部核苷酸序列、外显子3的全部核苷酸序列、外显子4的全部核苷酸序列、外显子5的全部核苷酸序列、外显子6的全部核苷酸序列、外显子7的全部核苷酸序列和外显子8的部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述细胞的基因组中包括人CSF1基因的外显子1的起始密码子至外显子8的终止密码子的核苷酸序列。优选的，所述的细胞来源于啮齿类动物；优选的，所述的细胞来源于小鼠。
本发明的第五方面，提供了一种上述CSF1基因经遗传修饰的细胞的构建方法，所述的细胞表达人或人源化CSF1蛋白。
优选的，所述细胞的基因组中包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述细胞的基因组中包含编码人CSF1蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，所述细胞的基因组中包含人CSF1基因的外显子1至外显子8的部分或全部，所述的人CSF1基因通过内源性调控元件调控，使得该细胞表达人CSF1蛋白。
本发明所述的CSF1基因经遗传修饰的细胞的构建方法中使用基因编辑技术进行经遗传修饰的细胞的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
进一步优选的，使用靶向CSF1基因的sgRNA序列将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入细胞CSF1基因的内源调控元件之后。更进一步优选的，插入位点为起始密码子。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括使用靶向CSF1基因的sgRNA序列将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物细胞CSF1基因的起始密码子前或者用编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换非人动物细胞CSF1基因的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，并使得所述细胞表达人CSF1蛋白；
其中，所述的sgRNA序列在待改变的CSF1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则；
优选的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：18-26任一项所示。
进一步优选的，使用靶向载体将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入细胞CSF1基因的内源调控元件之后。更进一步优选的，插入位点为起始密码子。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的构建方法包括使用靶向载体将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入非人动物细胞CSF1基因的起始密码子前或者用编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换细胞CSF1基因的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，并使得所述细胞表达人CSF1蛋白；
其中，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸。
优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸。
优选的，所述的CSF1基因经遗传修饰的细胞中内源CSF1蛋白表达缺失或所述的内源CSF1蛋白不表达。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的经遗传修饰的细胞的构建方法包括将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换内源CSF1基因座的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，使得所述的细胞表达人CSF1蛋白，且使得内源CSF1蛋白不表达。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的CSF1基因经遗传修饰的细胞的构建方法包括将编码人CSF1蛋白的核苷酸序列插入细胞CSF1基因座，并破坏内源CSF1蛋白的编码框，使得所述的细胞表达人CSF1蛋白，且使得内源CSF1蛋白不表达。
本发明所述的CSF1基因经遗传修饰的细胞或根据本发明所述的经遗传修饰的细胞的构建方法构建的细胞的基因组中包括嵌合CSF1基因，所述的嵌合CSF1基因编码人或人源化CSF1蛋白。
本发明的第六方面，提供了一种CSF1基因的靶向载体，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述3’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。
优选的，所述的供体DNA序列如SEQ ID NO：8所示。
优选的，所述的待改变的转换区位于CSF1基因的外显子1至外显子8。
优选的，所述的靶向载体还包括可选择的基因标记。
优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
本发明的第七方面，提供了一种特异性靶向CSF1基因的sgRNA序列，所述的sgRNA序列在待改变的CSF1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG-3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列的排列规则。
优选的，所述的sgRNA序列在非人动物CSF1基因的靶位点位于非人动物CSF1基因的外显子1和/或外显子8上；
更优选的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：18-26任一项所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ IDNO：13所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：24所示。
本发明的第八方面，提供了一种构建人源化CSF1基因改造非人动物的载体，所述的载体产生上述的sgRNA序列。
本发明的第九方面，提供了一种构建人源化CSF1基因改造非人动物载体的方法，所述的方法包括如下步骤：
1)将序列如SEQ ID NO：9-17所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：18-26所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，将上述片段依次通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
3)分别合成步骤1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；
4)将步骤3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
优选的，所述的sgRNA靶序列为SEQ ID NO：13和/或SEQ ID NO：24。
在本发明的一个具体实施方式中，所述含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA序列如SEQ ID NO：27所示。所述的正向寡核苷酸SEQ ID NO：29或SEQ ID NO：33；所述的反向寡核苷酸SEQ ID NO：31或SEQ ID NO：35。
本发明的第十方面，提供了一种上述的靶向载体、上述的sgRNA序列或上述的载体在基因编辑CSF1基因的应用。
本发明的第十一方面，提供了一种CSF1基因敲除非人动物的制备方法，包括如下步骤：
a)按照上述的构建人源化CSF1基因改造非人动物载体的方法步骤1)-4)，获得sgRNA载体；
b)将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9 mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
c)将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的CSF1基因被敲除，获得CSF1基因敲除阳性小鼠；
d)将步骤c)筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的CSF1基因敲除小鼠。
本发明的第十二方面，提供了一种人源化CSF1基因改造非人动物的制备方法，所述的方法包括如下步骤：
第一步：按照上述的构建人源化基因改造非人动物载体的步骤1)-4)，获得sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物、上述的CSF1基因的靶向载体和Cas9mRNA进行混合，将混合液注射至雌性动物受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体动物的输卵管中发育，得到F0代动物；
第三步：将F0代动物利用PCR技术进行检验，验证细胞中的CSF1基因人源化非人动物。
本发明的第十三方面，提供了一种制备多基因人源化非人动物的方法，包括如下步骤：
(a)制备上述的人源化CSF1基因改造非人动物或利用上述方法构建的非人动物；
(b)将步骤(a)制备获得的非人动物与其他基因人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。
优选的，所述的其他基因人源化动物选自基因IL6、IL15、IL3、CSF2或SIPRA人源化动物中的一种或两种以上的组合。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的多基因人源化动物为免疫缺陷的CSF1人源化基因改造非人动物，所述的免疫缺陷动物缺失IL-2Rγ链。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述的多基因人源化动物为IL3、CSF1和CSF2人源化动物。
优选的，所述多基因人源化非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。
本发明的第十四方面，提供了一种上述的方法制备的多基因人源化非人动物或其后代。
本发明的第十五方面，提供了一种荷瘤动物模型或其制备方法，所述的制备方法包括通过上述的方法制备的人源化CSF1基因改造非人动物或多基因人源化非人动物。以及，本发明还提供一种上述人源化CSF1基因改造非人动物或其后代或者包含人源化CSF1基因改造的多基因人源化非人动物或其后代在制备荷瘤动物模型中的用途。
优选的，所述的荷瘤动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的非人动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第十六方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法构建的人源化CSF1基因改造非人动物、上述的人源化CSF1基因改造非人动物、上述的多基因人源化非人动物或其后代、或上述的荷瘤动物模型。
本发明的第十七方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的人源化CSF1基因改造非人动物、上述的多基因CSF1人源化非人动物或其后代、或上述的荷瘤动物模型。优选的，所述的组织为胸腺组织、脾组织、表皮组织或肠组织。
本发明的第十八方面，提供了一种嵌合CSF1基因，所述的嵌合CSF1基因包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列和非人动物CSF1基因的部分核苷酸序列，且所述的嵌合CSF1基因编码人或人源化CSF1蛋白。
优选的，所述的嵌合CSF1基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；
b)在严格条件下，与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列杂交；
c)与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
d)具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或，
e)来源于人CSF1基因的部分为与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
f)来源于人CSF1基因的部分在严格条件下，与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列杂交；
g)来源于人CSF1基因的部分为与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
h)来源于人CSF1基因的部分为具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或，
i)编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：4所述氨基酸序列的部分或全部；
j)编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
k)编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
l)编码的氨基酸序列具有SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
或，
m)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；
n)转录的mRNA序列在严格条件下，与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列杂交；
o)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
p)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述的非人动物为小鼠。
本发明所述的非人动物遗传背景是免疫缺陷的；优选的，所述的非人动物为IL-2Rγ链缺失的小鼠；更优选的，所述的非人动物为B-NDG小鼠。
本发明的第十九方面，提供了一种包含上述的嵌合CSF1基因的构建体。
本发明的第二十方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第二十一方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
本发明的第二十二方面，提供了来源于上述的构建方法构建的人源化CSF1基因改造非人动物、上述的人源化CSF1基因改造非人动物、上述的CSF1基因经遗传修饰的细胞、上述方法制备的CSF1基因经遗传修饰的细胞、上述的方法制备的CSF1基因敲除非人动物、上述的多基因人源化非人动物或其后代或上述的荷瘤动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或者，在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者，在筛选、验证、评价或研究CSF1基因功能、针对CSF1靶位点的药物、人造血干细胞的形成、功能研究和/或构建疾病模型药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途，其中，所述疾病为肿瘤或新生血管疾病。
优选的，所述的应用选自人造血干细胞的形成、功能研究和/或构建疾病模型。
优选的，所述应用包括使用人PBMC在非人动物体内进行人免疫系统重建和/或移植人肿瘤细胞后，对抗人单抗、双抗或联合用药的药效评价、药物筛选，或人CAR-T体内抑瘤效果评估或筛选。
优选的，所述应用不是治疗方法。该评价方法应用对药物或者CAR-T方案的效果进行检测和评价，以确定该药物或者CAR-T方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第二十三方面，提供了一种免疫系统重建的方法，所述的方法包括使用人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)进行本发明所述的人源化CSF1基因改造非人动物的免疫系统重建，包括将人肿瘤细胞移入所述的非人动物体内，向移入肿瘤细胞的非人动物给予所述肿瘤相应药物，对给予药物的非人动物进行检测。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的存活力和/或增值速率；所述检测的方法为流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述移入的方法为鼠尾注射和/或股骨内注射和/或胫骨内注射。
优选的，所述肿瘤细胞选自B细胞淋巴瘤细胞株、人外周血细胞或脐带血细胞中的一种或两种以上的组合；优选的，所述人外周血细胞选自CD34+细胞或多发性骨髓瘤细胞。
本发明构建的人源化CSF1基因改造非人动物或通过本发明所述的方法构建的人源化CSF1基因改造非人动物有助于改善免疫系统重建时的细胞分化，优选的促进骨髓细胞分化，同时移植造血干细胞后，可调节巨噬细胞的成熟。
本发明所述的“人源化CSF1蛋白”包含来源于人CSF1蛋白的部分和非人CSF1蛋白的部分，其中，所述的“人CSF1蛋白”为人CSF1蛋白的全长氨基酸序列。
本发明所述的“人CSF1基因”为人CSF1基因的全长核苷酸序列，所述“人源序列”为嵌合CSF1基因中来源于人的CSF1基因的序列部分。
本发明所述的“部分或全部”，“全部”为整体；“部分”为整体中的局部，或者整体中的个体。例如，“外显子1至外显子8的全部”为整体，即外显子1至外显子8的全部核苷酸序列；“外显子1至外显子8的部分”为整体的局部或整体的个体，即外显子1至外显子8中的一个或两个以上连续或间隔的核苷酸序列。
本发明所述的“连续两个或连续三个以上外显子”是指例如外显子1、2，外显子2、3，外显子1、2、3，外显子2、3、4，以及连续4个、5个、6个、7个或8个外显子。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I andII(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.in chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：鼠CSF1基因和人CSF1基因对比示意图(非按比例)；
图2：人源化CSF1小鼠基因示意图(非按比例)；
图3：CSF1基因打靶策略及打靶载体设计示意图(非按比例)；
图4A：5’端sgRNA检测结果，其中，NC为阴性对照，PC为阳性对照，blank为空白对照；
图4B：3’端sgRNA检测结果，其中，NC为阴性对照，PC为阳性对照，blank为空白对照；
图5：鼠尾PCR鉴定结果(F0)，其中图A为5’端引物检测结果，图B为3’端引物检测结果，M为Marker，WT为NOD/scid小鼠，+为阳性对照，H2O为水对照；
图6：鼠尾PCR鉴定结果(F1)，其中，M为Marker，WT为NOD/scid小鼠，H2O为水对照，+为阳性对照，其中图A为5’端引物检测结果，图B为3’端引物检测结果；
图7：F1代小鼠Southern blot结果，其中WT为NOD/scid小鼠，上图为5’探针(P1探针)的检测结果，下图为A探针(P2探针)的检测结果；
图8：ELISA检测结果，其中，+/+代表B-NDG小鼠，B-hCSF-1(H/H)代表hGM-CSF纯合子小鼠，图(A)为检测鼠CSF1蛋白表达结果，图(B)为检测人CSF1蛋白表达结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
NOD-Prkdcscid IL-2rgnull(B-NDG)小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号B-CM-001；
NOD/scid小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司；
UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；
Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
BamHI、EcoRI、BbsI、BglII和NcoI酶购自NEB，货号分别为；R3136M、R3101M、R0539L、R0144M和R3193M；
LPS(Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4)来源Sigma-Aldrich，货号为L2630；
Human M-CSF ELISA(Human CSF-1)来源RayBiotech,Inc.，货号为ELH-MCSF-5；
Mouse M-CSF ELISA(Mouse CSF-1)来源RayBiotech,Inc.，货号为ELM-MCSF-5。
本发明计划对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人CSF1蛋白的核苷酸序列，得到经基因改造的非人动物体内可表达人或人源化CSF1蛋白。该非人动物的背景可以是免疫缺陷的。此外，还可以根据不同的研究需要在经遗传修饰的非人动物体内引入其他基因修饰，如IL6，IL15，IL3，CSF2，SIPRA等基因或其任一组合进行人源化修饰，得到双基因或多基因人源化修饰非人动物，用于进行人造血干细胞的形成、功能研究和/或构建疾病模型。
实施例1CSF1基因人源化小鼠
小鼠CSF1基因(NCBI Gene ID：12977，Primary source：MGI:1339753，UniProtID：P07141)(基于NM_007778.4→NP_031804.3的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：1所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示)和人CSF1基因(NCBI Gene ID：1435，Primarysource：HGNC:2432，UniProt ID：P09603)(基于NM_000757.5→NP_000748.3的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：3所示，对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示)对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠CSF1基因座引入编码人CSF1蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人CSF1蛋白。例如，可用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在内源小鼠CSF1起始密码子上(ATG)，在ATG前插入可表达人CSF1蛋白的编码序列，同时破坏小鼠CSF1基因的编码框(例如删除小鼠内源CSF1基因外显子1至外显子8的全部或部分核苷酸序列)，期望得到的人源化小鼠体内可表达如SEQ ID NO：4所示的人CSF1蛋白而不表达内源性CSF1蛋白，改造后的人源化小鼠CSF1基因示意图如图2所示，最终得到的人源化小鼠CSF1基因DNA序列(嵌合CSF1基因DNA)如SEQ ID NO：5所示：
Figure BDA0002337045960000151
SEQ ID NO：5仅仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为编码人CSF1蛋白的核苷酸序列(简称人源序列)。最终得到的人源化小鼠CSF1基因转录的mRNA序列如SEQ ID NO：48所示，鉴于人CSF1或小鼠CSF1具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本，如，当选择小鼠转录本为NM_001113530.1→NP_001107002.1时，人源化小鼠CSF1基因转录得到的mRNA序列如SEQ ID NO：49所示。
引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，进一步的设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠CSF1上游和下游的同源臂序列(内源CSF1基因ATG上游1393bp和TAG下游1385bp的小鼠DNA)，以及1665bp编码人CSF1蛋白的序列。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：6)与NCBI登录号为NC_000069.6的第107761456-107760064位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：7)与NCBI登录号为NC_000069.6的第107746738-107745360位核苷酸序列相同；人源序列(SEQ ID NO：8)与SEQID NO：5中斜体下划线区域相同，与NCBI登录号为NM_000757.5(SEQ ID NO：3)序列的第414-2078位核苷酸序列仅有一处序列不相同，具体为该序列的第1879位C>T。靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的载体质粒用于后续实验。
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA9)、3’端靶位点(sgRNA10-sgRNA18)的sgRNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点分别位于CSF1基因第1号外显子和第8号外显子，各sgRNA在CSF1上的靶位点序列如下：
sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：9)：5’-CAGCTGCCCGTATGACCGCG CGG-3’
sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-GCTGCCCGTATGACCGCGCG GGG-3’
sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-TATGACCGCGCGGGGCGCCG CGG-3’
sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-TGACCGCGCGGGGCGCCGCG GGG-3’
sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-CGAAGAAGGGCAGCGCCCCG CGG-3’
sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-CGCGGGGCGCTGCCCTTCTT CGG-3’
sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：15)：5’-GGTTGCAGCTTACCGAAGAA GGG-3’
sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：16)：5’-CGGTTGCAGCTTACCGAAGA AGG-3’
sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：17)：5’-AAGCTGCAACCGTGGCGCGC GGG-3’
sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：18)：5’-ATAGAAAGGATTCTATGGTA AGG-3’
sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：19)：5’-CCAGTATAGAAAGGATTCTA TGG-3’
sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：20)：5’-GTGGAACTGCCAGTATAGAA AGG-3’
sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：21)：5’-CACCTGTCTGTCCTCATCCT GGG-3’
sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：22)：5’-GACCCAGGATGAGGACAGAC AGG-3’
sgRNA-15靶位点序列(SEQ ID NO：23)：5’-GTCTGTCCTCATCCTGGGTC AGG-3’
sgRNA-16靶位点序列(SEQ ID NO：24)：5’-CAGCTCCCTGACCCAGGATG AGG-3’
sgRNA-17靶位点序列(SEQ ID NO：25)：5’-ATCCTGGGTCAGGGAGCTGC AGG-3’
sgRNA-18靶位点序列(SEQ ID NO：26)：5’-TGCCTGCAGCTCCCTGACCC AGG-3’
利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见表1和图4。从中优先选择2个(分别是sgRNA-5和sgRNA-16)进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(序列见表2)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-CSF1-5和pT7-CSF1-16。
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：27)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
表1 UCA检测结果
Figure BDA0002337045960000171
表2 sgRNA-5和sgRNA-16序列列表
Figure BDA0002337045960000181
取NOD/scid小鼠的原核期受精卵，利用显微注射仪将预混好的pT7-CSF1-5、pT7-CSF1-16质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA，打靶载体质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(founder鼠，即F0代)。
可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的鉴定结果见图5。结合5’端引物检测结果和3’端引物检测结果可知，图5中编号为F0-45、F0-46和F0-47的小鼠为阳性小鼠。PCR分析包括下述引物：
5’端引物：
上游引物：L-GT-F(SEQ ID NO：36)：5’-CCACCCACAAGTTGAGAACCACCAG-3’；
下游引物：L-GT-R(SEQ ID NO：37)：5’-GTCCTTGACAACTGGGGTCTCTGGC-3’
3’端引物：
上游引物：R-GT-F(SEQ ID NO：38)：5’-CTGCAGGAACTCTCTTTGAGGCTGA-3’；
下游引物：R-GT-R(SEQ ID NO：39)：5’-AGCATCAGCCATATACAACAGAGCAGA-3’
将F0鉴定为阳性的CSF1人源化小鼠与NOD/scid小鼠交配得到F1代小鼠，PCR结果见图6，显示有6只F1代小鼠为阳性小鼠，编号分别为：F1-3、F1-6、F1-8、F1-11、F1-13、F1-14。
进一步的对这6只F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用BglII酶或NcoI酶消化基因组，转膜，杂交。探针P1、P2分别位于5’同源臂外侧及人源片段上。
F1代PCR分析包括下述引物：
5’端引物：
上游引物：WT-F(SEQ ID NO：40)：5’-AGCCAGGGTGATTTCCCATAAACCA-3’；
下游引物：5’MSD-R(SEQ ID NO：41)：5’-GGATGATGCCACACTCGGATCTTGT-3’
3’端引物：
上游引物：3’MSD-F(SEQ ID NO：42)：5’-GGAGCTTGAGGGCCTATAGGTGGT-3’；
下游引物：WT-R(SEQ ID NO：43)：5’-AGTAACTGGTCCAGGGCAGGGATT-3’
探针合成引物如下：
P1-F(SEQ ID NO：44)：5’-TGCACTTATGTGATGGATGGCTGAG-3’
P1-R(SEQ ID NO：45)：5’-TAACTGGGCAGTTGGAATGGATGAG-3’
P2-F(SEQ ID NO：46)：5’-ACTTCCTCTCAGCATCTTCTCCACT-3’
P2-R(SEQ ID NO：47)：5’-CTGTGTCAGTCAAAGGAACGGAGTT-3’
Southern blot检测结果见图7。综合P1、P2探针的结果表明，6只小鼠中均无随机插入，证实这6只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的CSF1人源化基因工程小鼠。
此外，由于Cas9的切割造成基因组DNA的双链断裂，通过染色体同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，可能得到CSF1蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。
实施例2具有重度免疫缺陷的CSF1和人源化细胞因子小鼠的生成
为了生成包含人CSF1且具有重度免疫缺陷的小鼠，可将实施例1制备的CSF1人源化小鼠杂合子与B-NDG小鼠交配或体外受精(IVF)，根据孟德尔遗传规律，对其后代进行筛选可有一定几率得到CSF1人源化与IL-2Rγ链缺失的杂合小鼠，再将杂合子相互交配得到双基因或多基因修饰的纯合子。
在实施例1中显微注射过程使用B-NDG小鼠的受精卵细胞替代NOD/scid小鼠，直接得到表达人CSF1蛋白的B-NDG小鼠。
可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人CSF1蛋白的表达情况，例如使用ELISA方法等。选择B-NDG小鼠、B-NDG-hCSF1纯合子小鼠各1只，腹腔注射20μg/200μL的LPS，刺激2小时后取脾脏，研磨、反复冻融后取研磨液，稀释5倍进行ELISA检测。结果(见图8)可见，在B-NDG-hCSF1纯合子小鼠脾脏研磨液中检测到人CSF1的表达(图8B)，无法检测到鼠CSF1的表达(图8A)，而在B-NDG小鼠脾脏研磨液中未检测到人CSF1的表达(图8B)，只能检测到鼠CSF1的表达(图8A)。
实施例3含有人CSF1的双基因或多基因人源化小鼠
利用本方法或制得的CSF1小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞，例如，选择IL3或IL15或CSF2基因人源化小鼠的受精卵细胞应用本方法进行基因编辑，可以得到IL3或IL15或CSF2与CSF1双基因修饰的人源化小鼠模型。
将本方法得到的CSF1小鼠纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合小鼠交配或体外受精，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到CSF1人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。其中，IL3基因人源化小鼠是用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在内源小鼠IL3起始密码子(ATG)后用一段人IL3蛋白的编码序列(SEQ ID NO：50)替换小鼠IL3基因的整个编码框，该人源化小鼠体内可表达人IL3蛋白且不表达内源性IL3蛋白。CSF2基因人源化小鼠采用了同样的策略，用于替换的人CSF2蛋白编码序列如SEQ ID NO：51所示，该人源化小鼠体内可表达人CSF2蛋白且不表达内源性CSF2蛋白。IL15人源化小鼠策略类似，用含有人IL15蛋白编码序列(SEQ ID NO：52)替换了内源小鼠IL15的1号外显子，该序列后存在辅助序列WPRE(土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件)和/或polyA(多聚腺苷酸)使转录提前终止，人源化小鼠体内可表达人IL15蛋白。
以三重人源化IL3/CSF2/CSF1小鼠的生成为例，由于小鼠的CSF2与IL3基因均位于11号染色体上，CSF1基因位于3号染色体上，先得到双重人源化CSF2/IL3后，将其与CSF1人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化三重人源化GM-CSF2/IL3/CSF1小鼠。
实施例4基于胚胎干细胞的制备方法
采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得CSF1基因人源化小鼠。
根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠CSF1基因示意图(图2、3)，发明人设计了新的打靶策略并设计了新的重组载体。鉴于本发明的目的之一是破坏小鼠CSF1基因编码框，并在鼠CSF1基因座插入编码人CSF1蛋白的核苷酸序列，为此，发明人设计了包含5’同源臂、3’同源臂人源化基因片段的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例1一致。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (14)

1.一种人源化CSF1基因改造非人动物的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1基因改造非人动物体内表达人或人源化CSF1蛋白。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列，优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包含编码人CSF1蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，所述的人源化CSF1基因改造非人动物的基因组中包括人CSF1基因的外显子1至外显子8的部分或全部，所述的人CSF1基因通过内源性调控元件调控，使得该非人动物体内表达人CSF1蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括使用靶向CSF1基因的sgRNA序列和/或靶向载体用编码人CSF1蛋白的核苷酸序列替换非人动物CSF1基因的外显子1至外显子8的部分核苷酸序列，使得所述人源化非人动物体内表达人CSF1蛋白；
其中，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列；
所述的sgRNA序列在待改变的CSF1基因上的靶序列上是唯一的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：18-26任一项所示。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1基因改造非人动物基因组中包括嵌合CSF1基因，所述的嵌合CSF1基因编码人或人源化CSF1蛋白；所述的嵌合CSF1基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；
b)与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
c)具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
d)来源于人CSF1基因的部分为与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)来源于人CSF1基因的部分为与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
f)来源于人CSF1基因的部分为具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
g)编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
i)编码的氨基酸序列具有SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
j)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；
k)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
l)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
5.一种CSF1基因经遗传修饰的细胞，其特征在于，所述的细胞表达人或人源化CSF1蛋白。
6.一种CSF1基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的供体DNA序列包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述5’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；或者，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000069.6至少具有90％同源性的核苷酸，优选的，所述3’臂核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示；或者，所述的供体DNA序列如SEQ ID NO：8所示；其中，所述的待改变的转换区位于CSF1基因的外显子1至外显子8。
8.一种特异性靶向CSF1基因的sgRNA序列，其特征在于，所述的sgRNA序列在待改变的CSF1基因上的靶序列上是唯一的，所述的sgRNA序列在非人动物CSF1基因的靶位点位于非人动物CSF1基因的外显子1和/或外显子8上；
进一步优选的，所述sgRNA靶向5’端靶位点序列如SEQ ID NO：9-17任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：18-26任一项所示。
9.一种制备多基因人源化非人动物的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)利用权利要求1-4任一所述方法获得的非人动物；
(b)将步骤(a)制备获得的非人动物与其他基因人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的其他基因人源化动物选自基因IL6、IL15、IL3、CSF2或SIPRA人源化动物中的一种或两种以上的组合。
11.一种嵌合CSF1基因，其特征在于，所述的嵌合CSF1基因包含人CSF1基因的全部或部分核苷酸序列和非人动物CSF1基因的部分核苷酸序列。
12.根据权利要求11所述的嵌合CSF1基因，其特征在于，所述的嵌合CSF1基因编码人或人源化CSF1蛋白，所述的嵌合CSF1基因的核苷酸序列选自：
a)与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；
b)与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
c)具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
d)来源于人CSF1基因的部分为与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)来源于人CSF1基因的部分为与SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
f)来源于人CSF1基因的部分为具有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：3所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
g)编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示氨基酸的序列同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
i)编码的氨基酸序列具有SEQ ID NO：4所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
j)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；
k)转录的mRNA序列与SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或
l)转录的mRNA序列具有SEQ ID NO：48或SEQ ID NO：49所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
13.根据权利要求1-4、8-12任一所述的构建方法、sgRNA序列、制备多基因人源化非人动物的方法、嵌合CSF1基因，其特征在于，所述的非人动物遗传背景是免疫缺陷的，优选的，所述的非人动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的非人动物为小鼠。
14.来源于权利要求1-4任一所述的构建方法构建的人源化CSF1基因改造非人动物、权利要求5所述的细胞或者权利要求9-10任一所述的方法获得的多基因人源化非人动物在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或者，在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者，在筛选、验证、评价或研究CSF1基因功能、针对CSF1靶位点的药物、人造血干细胞的形成、功能研究和/或构建疾病模型药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途，其中，所述疾病为肿瘤或新生血管疾病。
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Applicant after: BIOCYTOGEN JIANGSU GENE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Applicant after: Baccetus (Beijing) Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.

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Applicant before: BIOCYTOGEN JIANGSU GENE BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

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