CN107815468A - 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及人源化基因的基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及人源化CTLA‑4基因动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Description

人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
技术领域
本申请涉及人源化基因动物模型的建立方法和应用，具体而言，涉及基于一种人源化CTLA-4基因动物模型的构建方法及其在生物医药的应用。
背景技术
癌症是目前导致人类死亡率最高的疾病之一。据世界卫生组织统计，2012 年全球恶性肿瘤发病和死亡病例数达到1400万和820万，中国新诊断癌症病例为307万，死亡人数220万。近年，针对免疫检查点的抗体药物研发被认为是有望攻克各类癌症的潜在靶点。传统的药物研发中，都是采用体外药效筛选的方式，该筛选方法不能模拟体内环境(如肿瘤微环境、基质细胞、胞外基质成分以及免疫细胞互动等)，造成研发失败率较高。另外，鉴于人和动物的差异，使用常规实验动物进行体内药理药效检测结果，并不能反映真实的疾病状态和靶位点的识别互动，导致许多临床试验的结果与动物实验的结果相去甚远。因此，开发适合人源抗体筛选和评价的人源化动物模型，将可显著提高新药开发效率，并降低研发成本。
细胞毒T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)是由CTLA-4基因编码的一种跨膜蛋白质，表达于活化的CD4+和CD8+T细胞。CTLA-4与其配体B7分子结合后产生抑制性信号，抑制T细胞激活，使肿瘤细胞免受T淋巴细胞攻击。因此，阻断CTLA-4的免疫效应可刺激免疫细胞大量增殖，从而诱导或增强抗肿瘤免疫反应。
CTLA-4是当前肿瘤靶向免疫治疗的热点，目前靶向CTLA-4的抗体有两种已广泛用于治疗黑色素瘤、肾癌、前列腺癌、肺癌等，分别为抗体Ipilimumab 和Tremelimumab，前者已于2010年批准上市，后者正处于Ⅲ期临床试验。2014 年，FDA批准PD-1抗体用于治疗CTLA-4无效的晚期黑色素瘤患者。因为 CTLA-4和PD-1抗体的机制不同，联合治疗可能是更有效的治疗方式，许多临床试验在进行中并已显示了较好的疗效。但仍有许多问题尚待进一步解决， CTLA-4的作用机制尚未完全阐明，且CTLA-4的不良反应比较严重，已有研究表明Ipilimumab与达卡巴嗪联用时32％的患者发生了与免疫相关的3-4度肝炎。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和治疗药物是不可缺少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠，豚鼠，地鼠(仓鼠)，兔，犬，猴，猪，鱼等。然而，人类和动物的基因和蛋白质序列还是存在不少差异，许多人类蛋白质不能与动物的同源蛋白质结合而产生生物活性，导致许多临床试验的结果也与动物实验的结果不相符。大量的临床研究急需更好的动物模型。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类细胞或基因替代或置换动物的内源性同类细胞或基因，以建立更接近人类的生物体系或疾病模型，建立人源化实验动物模型(humanized animal model)，已经为临床上新的治疗方法或手段提供了重要工具。其中基因人源化动物模型，即，利用基因遗传操作技术，用人类正常或突变基因替换动物同类基因，可在动物体内建立更接近人类的正常或突变基因体系的基因人源化动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化还可改进和提升细胞人源化小鼠模型，更重要的是，由于人类基因片段的存在，动物体内可表达或部分表达含有人类功能的蛋白质，从而大大减少人和动物的临床实验差异，为在动物水平进行药物筛选提供了可能。
发明内容
发明概述
为了解决上述问题，本申请发明人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列，使非人动物CTLA-4基因的特定片段被人CTLA-4基因特定片段替换，本申请发明人成果得到世界首例CTLA-4基因人源化小鼠。成功制备 CTLA-4基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达CTLA-4蛋白，可用于 CTLA-4基因功能研究、人源CTLA-4抗体的筛选和评价。
利用本发明的制备方法成功制备CTLA-4基因人源化的模式动物，该模型体内可正常表达CTLA-4蛋白，可用于CTLA-4基因功能研究、人源CTLA-4抗体的筛选和评价。利用本发明制备的动物模型可用于针对人CTLA-4靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。综合来说，对于研究CTLA-4蛋白的功能和肿瘤药物筛选提供了有力工具。
另外，本发明得到了CTLA-4基因敲除的小鼠，同时本发明的小鼠可与PD-1 等其它免疫调节因子人源小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，得到双人源化或多因子人源化鼠。可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价。
发明的详细说明
本发明涉及一种导入人CTLA-4基因的非人动物或其子代的制备方法，其导入人CTLA-4基因、使得该人CTLA-4基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的CTLA-4蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的CTLA-4基因的表达。
本发明还涉及一种制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系基因组中插入一段外源CTLA-4基因，所述方法包括：
(a)构建含有人CTLA-4基因的载体，通过基因工程方法将所述人CTLA-4基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的CTLA-4 基因缺失或使得内源/动物来源的CTLA-4基因不具有功能；并且
(b)在所述非人动物体内表达人源CTLA-4基因。
本发明涉及一种制备基因修饰/改造的非人动物的方法，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的CTLA-4基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含在内源/动物来源的CTLA-4基因座用人CTLA-4胞外域编码序列取代内源/动物来源的CTLA-4胞外域编码序列的部分或全部。
本发明还涉及一种人源化动物模型构建的方法，动物模型基因组中包括 CTLA-4基因，CTLA-4基因的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中CTLA-4基因的胞内参与信号传导的部分为动物来源，CTLA-4基因的胞外区域包含人CTLA-4基因的部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的CTLA-4启动子后；优选的，CTLA-4基因的跨膜区为动物来源。
在本发明的一个实施例中，其中，动物来源部分包括动物来源CTLA-4基因的第1号外显子、第2号外显子的部分序列、第3号外显子及其后所有外显子的全部序列；和/或所述人CTLA-4基因部分为编码人类CTLA-4多肽的氨基酸的第2号外显子的部分或全部序列。
在本发明的一个实施例中，其中，动物来源的Ctla-4基因为啮齿类动物来源的Ctla-4基因。
在本发明的一个实施例中，啮齿类动物为小鼠。
本发明涉及一种人源化动物模型构建的方法，所述小鼠Ctla-4的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：34中的全部或部分片段所示。
在本发明的一个实施例中，所述小鼠Ctla-4的蛋白序列的全部或部分片段如 SEQID NO：35中的全部或部分片段所示。
在本发明的一个实施例中，所述人CTLA-4基因的全部或部分片段的人 CTLA-4mRNA序列如SEQ ID NO：36中的全部或部分片段所示。
在本发明的另一个实施例中，所述人CTLA-4全部或部分片段的蛋白序列如 SEQID NO：37中的全部或部分片段所示。
在本发明的一个实施例中，动物模型基因组中包括嵌合CTLA-4基因，所述嵌合CTLA-4基因包括小鼠来源的Ctla-4基因部分和人源的CTLA-4基因部分，所述嵌合CTLA-4基因mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的全部或部分序列具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。
优选的，动物模型基因组中包括嵌合CTLA-4基因，所述嵌合CTLA-4基因包括动物来源的Ctla-4基因部分和人源的CTLA-4基因部分，所述嵌合CTLA-4 基因的嵌合mRNA序列如SEQ ID NO：40的全部或部分所示。
在本发明的一个实施例中，所述动物模型基因组中包括嵌合CTLA-4基因，所述嵌合CTLA-4基因包括动物来源的Ctla-4基因部分和人源的CTLA-4基因部分，编码所述嵌合CTLA-4基因的蛋白序列与SEQ ID NO：41所示的序列的部分或全部具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。
在本发明的一个实施例中，所述动物模型基因组中包括嵌合CTLA-4基因，所述嵌合CTLA-4基因包括动物来源的Ctla-4基因部分和人源的CTLA-4基因部分，所述嵌合CTLA-4基因的蛋白序列如SEQ ID NO：41的部分或全部所示。
同时，本发明涉及一种人源化动物模型构建的方法，将动物来源的Ctla-4 的第2号外显子全部或部分序列替换为人源CTLA-4的第2号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-12任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ IDNO：13-24任一项所示。
本发明还涉及一种Ctla-4敲除动物模型构建的方法，将动物体内的Ctla-4 的第2号外显子全部或部分敲除，使得内源CTLA-4蛋白失活；其中，使用sgRNA 靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：1-12任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：13-24任一项所示。
本发明还涉及一种制备sgRNA载体的方法，包括以下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：1-12所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO： 13-24所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：18，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：30所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：28或SEQ IDNO：32所示，其中SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28为A组，SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及 sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：33所示，将上述片段通过EcoRI和 BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B 组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
本发明还涉及一种Ctla-4基因敲除动物模型的制备方法，包括以下步骤：
第一步：获得sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Ctla-4基因被敲除，获得Ctla-4基因敲除阳性小鼠；
第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Ctla-4-/-小鼠；
优选的，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示。
本发明涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的 DNA片段(5’臂)，其选自CTLA-4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)期望的/供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂)，其选自CTLA-4基因基因组DNA 的100-10000个长度的核苷酸。
优选的，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂)选自与NCBI 登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂)选自NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。
更优选的，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂)选自NCBI 登录号为NC_000067.6的第60910913-60912430位核苷酸；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂)选自NCBI登录号为NC_000067.6的第60912743-60913715位核苷酸。
在本发明的一个实施例中，靶向载体中选择的基因组核苷酸的长度为1.5kb 和1kb；
优选的，所述5’臂长度为1518bp；
更优选的，3’臂长度为973bp；
优选的，待改变的转换区位于CTLA-4基因第2外显子。
更优选的，靶向载体还包括可选择的基因标记。
在本发明的一个实施例中，5’臂序列如SEQ ID NO：42所示；3’臂序列如SEQ IDNO：48所示。
在本发明的一个实施例中期望的转换区来自人。
优选的，靶向载体中期望的转换区为人源CTLA-4的核苷酸序列部分或全部，优选的所述核苷酸序列如人源CTLA-4DNA序列的第一外显子、第二外显子、第三外显子、第四外显子或第五外显子所示；在本发明的一个实施例中，核苷酸序列编码NCBI登录号NP_005205.2所示人源CTLA-4蛋白；更优选的，期望的转换区序列如SEQ ID NO：45所示。
本发明还涉及一种包含上述靶向载体的细胞。
此外，本发明还涉及一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，所述sgRNA 序列靶向CTLA-4基因，同时所述sgRNA在待改变的CTLA-4基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；优选的，所述sgRNA在小鼠CTLA-4基因的靶位点位于小鼠CTLA-4 基因的第2外显子上。
优选的，sgRNA序列的上游序列如SEQ ID NO：25所示，下游序列如SEQ ID NO： 27所示，sgRNA序列识别5’端靶位点；更优选的，在SEQ ID NO：25的5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其SEQ ID NO：27的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸。
或者
sgRNA序列的上游序列如SEQ ID NO：29所示，下游序列如SEQ ID NO：31 所示，所述sgRNA序列识别3’端靶位点；更优选的，在SEQ ID NO：29的5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其SEQ ID NO：31的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸。
在本发明的一个实施例中涉及含有sgRNA序列的构建体。
在本发明的另一个实施例中涉及含有所述构建体的细胞。
另外，本发明还涉及一种非人类哺乳动物细胞，其包括上述任一种靶向载体、一种或多种本发明所述的sgRNA构建体的体外转录产物；优选的，该细胞还包括 Cas9mRNA或其体外转录产物。
在本发明的一个实施例中所述细胞中的基因是杂合的。
在本发明的另一个实施例中所述细胞中的基因是纯合的。
优选的，非人类哺乳动物细胞是小鼠细胞。
更优选的，所述细胞为受精卵细胞。
此外，本发明还涉及一种建立CTLA-4基因人源化动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)提供根据上述任一项所述的细胞，优选的所述细胞为受精卵细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
优选的，本方法中的非人类哺乳动物是小鼠。
更优选的，本方法中的小鼠为C57BL/6小鼠。
在本发明的一个实施例中，步骤c中的非人类哺乳动物为假孕雌性。
此外，本发明还涉及一种建立双人源化小鼠基因改造动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)利用建立CTLA-4基因人源化动物模型的方法获得CTLA-4基因人源化的基因改造人源化小鼠；
(b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到双人源化小鼠模型。
优选的，在建立双人源化小鼠基因改造动物模型的方法中的步骤(b)为：将PD-1人源化小鼠直接进行基因编辑/修饰得到CTLA-4和PD-1双人源化小鼠模型。
本发明还涉及由上述方法产生的非人类哺乳动物。
优选的，基因组中含有人源基因。
在一个实施例中所述非人类哺乳动物是啮齿动物，优选的是小鼠。
本发明还涉及一种制备多基因人源化动物模型的方法，包括(a)利用本发明所述方法获得动物模型；(b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。
优选的，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
本发明还涉及由此产生的非人类哺乳动物或其后代。
本发明还涉及一种荷瘤非人类动物在制备动物模型中的用途，荷瘤非人类动物通过本发明任一项所述的方法获得的。
此外，本发明还涉及一种嵌合CTLA-4蛋白，其选自下列组中的一种：
a)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO：36所示的序列的部分或全部所示；b)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4 蛋白的mRNA序列与SEQID NO：36所示的序列同一性程度为至少大约为90％、 91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；c)嵌合CTLA-4 蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列与SEQ IDNO：36所示的核苷酸序列杂交；d)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：36所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；e)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列具有与 SEQ ID NO：36所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或f)嵌合CTLA-4蛋白序列中人CTLA-4的蛋白序列如SEQ ID NO：37 部分或全部序列所示；g)嵌合CTLA-4蛋白序列中人CTLA-4的蛋白序列与SEQ ID NO：37所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；h)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人 CTLA-4的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO：37所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；i)嵌合CTLA-4蛋白序列中人CTLA-4的蛋白序列与SEQ ID NO：37所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；g)嵌合CTLA-4蛋白序列中人CTLA-4的蛋白序列具有SEQ ID NO：37所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；或k)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:45 所示的序列的部分或全部；l)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、 92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；m)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列杂交；n)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:45所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；p)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:45 所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或 q)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列为SEQ ID NO：40所示的序列的部分或全部；r)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；s)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列杂交；t)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；u)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列具有与SEQ ID NO：40所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；或v)嵌合CTLA-4的嵌合蛋白序列为SEQID NO： 41的部分或全部；w)嵌合CTLA-4的蛋白序列与SEQ ID NO：41所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％；x)编码嵌合CTLA-4蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码 SEQ ID NO：41所示的蛋白的核苷酸序列杂交；y)嵌合CTLA-4的嵌合蛋白序列与SEQ ID NO：41所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、 3、2或不超过1个氨基酸；z)嵌合CTLA-4的嵌合蛋白序列具有SEQ IDNO： 41所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；或 A1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合CTLA-4蛋白的核苷酸的部分序列为SEQ ID NO:38所示的序列的部分或全部；B1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合CTLA-4 蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％； C1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合CTLA-4蛋白的核苷酸部分序列在严格条件下，与SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列杂交；D1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合 CTLA-4蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:38所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；E1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合 CTLA-4蛋白的核苷酸部分序列具有SEQ ID NO:38所示的，包括取代、缺失和/ 或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
本发明还涉及一种编码嵌合CTLA-4蛋白的基因，其中所述基因序列选自： a)上述基因编码中所述嵌合小鼠CTLA-4的蛋白序列；b)嵌合CTLA-4的mRNA 序列如SEQ ID NO：40所示；c)嵌合CTLA-4的mRNA序列在严格条件下，与 SEQ ID NO：40所示的核苷酸杂交的基因序列；d)嵌合CTLA-4的mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、 95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；e)编码嵌合CTLA-4 的蛋白的基因序列，所述蛋白与SEQ ID NO：41所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％； f)编码嵌合CTLA-4的蛋白的基因序列，所述蛋白的序列与SEQ ID NO：41的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基；和/或g)编码嵌合CTLA-4的蛋白的基因序列，所述蛋白具有SEQ ID NO：41所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；k)嵌合CTLA-4的基因序列如SEQ ID NO：38所示；l)嵌合CTLA-4的基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：38所示的核苷酸杂交的基因序列；和/或m)嵌合CTLA-4的基因序列与SEQ ID NO：38所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
此外，本发明还涉及编码嵌合CTLA-4蛋白的基因，其中嵌合小鼠 CTLA-4DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：38。
本发明还涉及一种人源化小鼠CTLA-4的基因组DNA，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与上述的基因序列一致或互补。在另一个实施例中，非人类哺乳动物表达人源化CTLA-4基因编码的蛋白质。此外，本发明还涉及使用上述方法获得的一种荷瘤非人类哺乳动物模型。优选的，非人类哺乳动物是啮齿动物；更优选的为小鼠。
本发明还涉及一种非人类动物在制备荷瘤动物模型中的用途，其特征在于所述非人类动物通过本发明所述的方法获得的。
本发明还涉及来源于本发明所述方法获得的非人类动物或其后代或动物模型的细胞或组织或器官或瘤组织或其培养物。
本发明还涉及来源于非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物的细胞或细胞系或原代细胞培养物；来源于非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物的组织或器官或其培养物；以及来源于非人类哺乳动物或其后代或荷瘤非人类哺乳动物荷瘤后的瘤组织。本发明还涉及一段人源化小鼠CTLA-4氨基酸序列，氨基酸序列选自：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示；
b)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：41所示的氨基酸序列具有至少90％的同一性程度；
c)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码序列 41所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：41所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：41所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、 6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
和/或
f)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：41所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
此外，本发明还涉及一段人源化小鼠CTLA-4的DNA序列，具体的，DNA序列选自：
a)所述DNA编码SEQ ID NO：41或其同源序列的人源化小鼠CTLA-4氨基酸序列；
b)所述DNA序列如SEQ ID NO：40所示；
c)在低严谨条件下，与SEQ ID NO：40所示的核苷酸杂交的DNA序列；
d)与SEQ ID NO：40所示的核苷酸具有至少90％同一性程度的DNA序列；
e)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸与SEQ ID NO：41所示的氨基酸具有至少90％的同一性程度；
f)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸的SEQ ID NO：41所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
g)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸的序列与SEQ ID NO：41的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸；
和/或
h)编码氨基酸的DNA序列，所述氨基酸具有SEQ ID NO：41所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
本发明涉及一段人源化小鼠CTLA-4的基因组DNA序列，其转录获得的mRNA 逆转录后得到的DNA序列，与SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：39其同源序列的DNA序列一致或互补。
本发明的任何一个方面的氨基酸序列，其与SEQ ID NO：41具有例如至少大约90％的同一性程度，并且其具有蛋白活性。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO： 41的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、 98％或至少99％。在替换的实施方案中，所述同一性程度为至少大约50％、51％、 52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％或至少大约59％。
在具体的实施方案中，本发明的氨基酸i)具有氨基酸序列；或ii)由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列具有如上所述的任何的同一性程度。
本发明的任何一个方面的核苷酸序列，其与SEQ ID NO：40具有例如至少大约90％的同一性程度。在具体的实施方案中，与SEQ ID NO：40的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在替换的实施方案中，所述同一性程度为至少大约50％、51％、52％、53％、54％、 55％、56％、57％、58％或至少大约59％。
本发明还涉及一种根据本发明所述的方法产生的非人动物或其后代在制备动物模型中的用途。
本发明还涉及一种根据本发明所述的方法获得非人动物或其后代在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
本发明还涉及一种根据本发明所述的方法获得非人动物或其后代在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
本发明还涉及一种根据本发明所述的方法获得非人动物或其后代在体内研究、人CTLA-4信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究CTLA-4基因功能研究、人源CTLA-4抗体、针对人CTLA-4 靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
优选的用于如上描述的方法的受精卵是C57BL/6受精卵。也可用于本发明方法中的本领域所使用的受精卵包括但不限于FVB/N受精卵、BALB/c受精卵、 DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。
受精卵可以来源于任何非人类动物。优选受精卵细胞来源于啮齿类。可以通过DNA的微注射来向受精卵引入遗传构建体。例如，可以通过微注射后培养受精卵、将培养的受精卵转移到假孕的非人类动物中并生育非人类哺乳动物来产生上文所述方法的非人类哺乳动物。
这里使用的术语“基因改造”描述人工引入并整合进生物的DNA产生的特定基因的蛋白质。
这里使用的术语“基因改造动物”描述基因组中含有外源DNA的动物。此基因改造DNA可能整合在基因组的某处。
本发明还提供由以上描述的任何方法所产生的非人类哺乳动物。在本发明的一个实施方案中，提供非人类哺乳动物，所述基因改造动物基因组中含有编码人源CTLA-4的DNA。
在一个优选的实施方案中，非人类哺乳动物含有如图2所描述的遗传构建体。在另一实施方案中，提供表达基因改造人源CTLA-4的非人类哺乳动物。在一个优选的实施方案中，组织特异性表达人源CTLA-4蛋白。
在另一实施方案中，基因改造动物中的人源CTLA-4的表达是可控的，如通过加入特异的诱导物或阻遏物物质。
非人类哺乳动物可以是任何本领域已知的、可以用于本发明方法的非人类动物。优选的非人类哺乳动物是哺乳动物，更优选的非人类哺乳动物是啮齿动物。本发明最优选的动物是小鼠。
可以对上文描述的非人类哺乳动物进行遗传、分子和行为分析。本发明也涉及本发明提供的非人类哺乳动物与相同或其它基因型交配或直接进行基因编辑/ 修饰后产生的后代。
本发明还提供来源于本发明提供的非人类哺乳动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。可以通过两种方法制备基于细胞培养的模型。可以从非人类哺乳动物中分离细胞培养物，或从使用同样的构建体、经标准的细胞转染技术建立的细胞培养物中制备细胞培养物。可以通过多种方法检测含有编码人源CTLA-4蛋白的DNA序列的遗传构建体的整合。对于本领域技术人员而言，显然存在许多可以用来检测外源DNA表达的分析方法，包括在RNA水平的方法(包括通过逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)或通过Southern印迹、原位杂交的mRNA 定量)和在蛋白质水平的方法(包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。此外，可以通过本领域技术人员众所周知的ELISA技术来定量目的基因的表达水平。可以使用许多标准分析来完成定量测量。例如，可使用RT-PCR和包括 RNA酶保护、Southern印迹分析、RNA斑点(RNAdot)分析在内的杂交方法测量转录水平。也可以使用免疫组织化学染色和流式细胞检测、Western印迹分析来评估是否存在人源CTLA-4蛋白质。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：MolecularCloningALaboratoryManual，2ndEd.， ed.BySambrook，FritschandManiatis(ColdSpringHarborLaboratoryPress：1989)； DNACloning，VolumesIandII(D.N.Glovered.，1985)；OligonucleotideSynthesis (M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；NucleicAcidHybridization (B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；TranscriptionAndTranslation (B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；CultureOfAnimalCells(R.I.Freshney， AlanR.Liss，Inc.，1987)；ImmobilizedCellsAndEnzymes(IRLPress，1986)； B.Perbal，APracticalGuideToMolecularCloning(1984)；theseries， MethodsInENZYMOLOGY(J.AbelsonandM.Simon，eds.-in-chief，AcademicPress， Inc.，NewYork)，specifically，Vols.154and155(Wuetal.eds.)andVol.185，″ GeneExpressionTechnology″(D.Goeddel，ed.)； GeneTransferVectorsForMammalianCells(J.H.MillerandM.P.Caloseds.，1987，ColdSpringHarborLaboratory)；ImmunochemicalMethodsInCellAndMolecular Biology(MayerandWalker，eds.，AcademicPress，London，1987)；HandbookOfExperimentalImmunology，VolumesV(D.M.WeirandC.C.Blackwell， eds.，1986)；andManipulatingtheMouseEmbryo，(ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：(A)为5’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA1-sgRNA12)；(B) 为3’端靶位点sgRNA活性检测结果(sgRNA13-sgRNA24)，其中Con为阴性对照，PC为阳性对照；
图2：pT7-sgRNA质粒图谱示意图；
图3：人与鼠CTLA-4基因对比示意图；
图4：人源化CTLA-4小鼠基因示意图；
图5：打靶策略示意图；
图6：(A)pClon-4G-CTLA-4质粒酶切结果，其中M为Marker，ck为未经酶切的质粒对照；(B)Marker分子量说明；
图7：(A)为鼠尾PCR鉴定结果(5’端)，其中，WT为野生型，M为 Marker，编号为1、3、6、7是阳性小鼠；(B)为鼠尾PCR鉴定结果(3’端)，其中，WT为野生型，M为Marker，编号为1、3、6、7是阳性小鼠；
图8：鼠尾PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，M为Marker，编号为F1-1， F1-2，F1-4，F1-5，F1-6，F1-8，F1-9，F1-12，F1-19的小鼠为F1代B-hCTLA-4 阳性小鼠；
图9：F1代小鼠Southern blot结果，其中M为标记，WT为野生型，编号为F1-1，F1-2，F1-4，F1-5，F1-6，F1-8，F1-9，F1-12，F1-19的小鼠无随机插入；
图10：流式分析结果，其中，取C57BL/6小鼠和CTLA-4人源化小鼠，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用抗鼠(图B、C)和抗人(图D、 E)CTLA-4荧光抗体进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析可见：与对照组(图 B)相比，可在CTLA-4人源化F1杂合鼠脾脏内，检测到表达人CTLA-4蛋白的细胞；而在C57BL/6小鼠的脾脏内，未检测到表达人CTLA-4蛋白的细胞，其中，图A为未经抗鼠CD3抗体刺激的C57BL/6小鼠的流式结果；
图11：流式分析结果，其中，取野生型C57BL/6小鼠和B-hCTLA-4纯合子、 B-hCTLA-4杂合子小鼠各1只，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用抗鼠Ctla-4抗体mPD-1APC(图A、C、E)和抗人CTLA-4抗体hCTLA-4PE (图B、D、F)与鼠源T细胞表面抗体mTcRβPerCP进行细胞染色，经流式细胞仪检测分析可见：与对照组(图A、B)相比，可在B-hCTLA-4纯合子、杂合子小鼠脾脏内，检测到表达人CTLA-4蛋白的细胞(图D、F)；而在C57BL/6 小鼠的脾脏内，未检测到表达人CTLA-4蛋白的细胞(图B)；
图12：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/+为 B-hCTLA-4杂合子小鼠,H/H为B-hCTLA-4纯合子小鼠；GAPDH为内参对照；
图13：基因敲除小鼠PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，编号为EK16-8、 EK16-15、EK16-16、EK16-18、EK16-20、EK16-21的小鼠均为阳性基因敲除小鼠；
图14：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hCTLA-4小鼠体内，并利用不同剂量的人CTLA-4抗体Yervoy进行抗肿瘤药效试验(1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg)， G1-G4各组实验动物平均体重增长无显著差异；
图15：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hCTLA-4小鼠体内，并利用不同剂量的人CTLA-4抗体Yervoy进行抗肿瘤药效试验(1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg)， G2-G4治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于G1对照组，且具有显著差异；
图16：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hCTLA-4小鼠体内，使用阳性对照药Yervoy或3种抗人CTLA-4抗体Ab-A、Ab-B和Ab-C中的任1种进行抗肿瘤药效试验，G1-G5各组实验动物平均体重增长无显著差异；
图17：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hCTLA-4小鼠体内，使用阳性对照药Yervoy或3种抗人CTLA-4抗体Ab-A、Ab-B和Ab-C中的任1种进行抗肿瘤药效试验，其中使用Ab-A抗体治疗(G3)与Yervoy治疗组(G2)小鼠肿瘤体积大小差别不大，且G2、G3组与对照组(G1)的瘤体积相比均具有显著的差异(P＜0.05)；而使用Ab-B、Ab-C抗体治疗(G4、G5)的小鼠肿瘤体积明显大于Yervoy治疗组(G2)及Ab-A抗体治疗(G3)，表明在相同的给药剂量和频次下，抗人Ab-A抗体与阳性对照品Yervoy药效相似，在抑制肿瘤生长上效果相当，而抗人CTLA-4抗体Ab-B和Ab-C药效不如Yervoy或Ab-A抗体；
图18：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hCTLA-4小鼠体内，并利用不同剂量的抗人CTLA-4抗体Ab-A进行抗肿瘤药效试验(3mg/kg、1mg/kg和0.3mg/kg)， G1-G4各组实验动物平均体重增长无显著差异；
图19：将小鼠结肠癌细胞MC38植入B-hCTLA-4小鼠体内，并利用不同剂量的抗人CTLA-4抗体Ab-A进行抗肿瘤药效试验(3mg/kg、1mg/kg和0.3mg/kg)， G2-G4治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于G1对照组，且具有显著差异和剂量相关性；
图20：鼠尾PCR鉴定结果，其中，+为CTLA-4基因纯合子对照，-为野生型对照(图A、B)，WT为野生型，-/-为PD-1基因人源化小鼠纯合子，+/-为 PD-1基因人源化小鼠杂合子(图C、D)；图A、B的结果表明编号为D-1～D-13、 D-15～D-16的小鼠为CTLA-4基因纯合子、图C、D的结果表明编号为D-1～D-16 的小鼠为PD-1纯合子，综合两组结果表明，编号为D-1～D-13、D-15～D-16的 15只小鼠为双基因纯合子；
图21：流式分析结果，其中，取C57BL/6小鼠和双重人源化CTLA-4/PD-1 杂合子，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用鼠源CTLA-4抗体 mCTLA-4APC(图A、B、C)或人源CTLA-4抗体hCTLA-4PE(图D、E、F)，或鼠源PD-1抗体mPD-1PE(图G、H、I)或人源PD-1抗体hPD-1FITC(图J、K、 L)，和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行细胞标记，可在双重人源化CTLA-4/PD-1杂合子的杂合鼠脾脏内，表达人CTLA-4和PD-1蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人CTLA-4或PD-1蛋白的细胞；
图22：将小鼠结肠癌细胞MC38植入CTLA-4/PD-1纯合小鼠体内，并利用 Yervoy和Keytruda中的1种或2种联用进行抗肿瘤药效试验，G1-G4各组实验动物平均体重增长无显著差异；
图23：将小鼠结肠癌细胞MC38植入CTLA-4/PD-1纯合小鼠体内，并利用 Yervoy和Keytruda中的1种或2种联用进行抗肿瘤药效试验，G2-G4各治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于对照组，且Yervoy和Keytruda联用治疗组(G4) 的小鼠荷瘤体积明显小于单独使用Yervoy(G2)或Keytruda(G3)治疗组，表明联合用药的疗效优于Yervoy或Keytruda单独使用的疗效；
图24：基于胚胎干细胞的打靶策略示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；
大肠杆菌TOP10感受态细胞购自Tiangen公司，货号为CB104－02；
HindIII，BamHI，XhoI，EcoRI，SmaI，BbsI，SspI、EcoNI酶购自NEB，货号分别为R3104M，R3136M，R0146M，R3101M，R0141S，R0539L，R3132M， R3101M；
卡那霉素购自Amresco,货号为0408；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
AIO试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-004；
UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
逆转录试剂盒来源TakaRa，货号6110A；
小鼠结肠癌细胞MC38购自上海酶研生物技术有限公司；
鼠CD3抗体来源BD，货号为563123；
mTcRβPerCP来源Biolegend，货号为109228；
mPD-1PE来源Biolegend，货号为109104；
mCTLA-4APC来源Biolegend，货号为106310；
hCTLA-4PE来源Biolegend，货号为349906；
hPD-1FITC来源Biolegend，货号为329904；
CTLA-4抗体Yervoy来源百时美施贵宝；
PD-1抗体Keytruda来源默沙东；
CTLA-4抗体Ab-A、Ab-B和Ab-C来源百奥赛图；
人IgG抗体来源北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，货号为AG-0011。
实施例1 pT7-C-7、pT7-C-18的构建
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
设计并合成识别5’端靶位点(sgRNA1-sgRNA12)、3’端靶位点 (sgRNA13-sgRNA24)的向导RNA序列。5’端靶位点和3’端靶位点均位于小鼠Ctla-4基因的第二外显子上，各sgRNA在Ctla-4上的靶位点序列如下：
sgRNA-1靶位点序列(SEQ ID NO：1)：5’-ggtcacctgtatggctgacatgg-3’
sgRNA-2靶位点序列(SEQ ID NO：2)：5’-tgaaggttgggtcacctgtatgg-3’
sgRNA-3靶位点序列(SEQ ID NO：3)：5’-acaggtgacccaaccttcagtgg-3’
sgRNA-4靶位点序列(SEQ ID NO：4)：5’-gacccaaccttcagtggtgttgg-3’
sgRNA-5靶位点序列(SEQ ID NO：5)：5’-agccaacaccactgaaggttggg-3’
sgRNA-6靶位点序列(SEQ ID NO：6)：5’-ctgctagccaacaccactgaagg-3’
sgRNA-7靶位点序列(SEQ ID NO：7)：5’-gtggtgttggctagcagccatgg-3’
sgRNA-8靶位点序列(SEQ ID NO：8)：5’-atggaaagctggcgacaccatgg-3’
sgRNA-9靶位点序列(SEQ ID NO：9)：5’-tgtgatggtgaatattcacatgg-3’
sgRNA-10靶位点序列(SEQ ID NO：10)：5’-accatcacacaacactgatgagg-3’
sgRNA-11靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-acctcatcagtgttgtgtgatgg-3’
sgRNA-12靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-acacaacactgatgaggtccggg-3’
sgRNA-13靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-aggtccgggtgactgtgctgcgg-3’
sgRNA-14靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-tctgccgcagcacagtcacccgg-3’
sgRNA-15靶位点序列(SEQ ID NO：15)：5’-tggcacagacctcagtcatttgg-3’
sgRNA-16靶位点序列(SEQ ID NO：16)：5’-actttgtgggcatgggcaacggg-3’
sgRNA-17靶位点序列(SEQ ID NO：17)：5’-ttgcccatgcccacaaagtatgg-3’
sgRNA-18靶位点序列(SEQ ID NO：18)：5’-ccgccatactttgtgggcatggg-3’
sgRNA-19靶位点序列(SEQ ID NO：19)：5’-atgcccacaaagtatggcggtgg-3’
sgRNA-20靶位点序列(SEQ ID NO：20)：5’-tacccaccgccatactttgtggg-3’
sgRNA-21靶位点序列(SEQ ID NO：21)：5’-ggactgagagctgttgacacggg-3’
sgRNA-22靶位点序列(SEQ ID NO：22)：5’-tgtcaacagctctcagtccttgg-3’
sgRNA-23靶位点序列(SEQ ID NO：23)：5’-gttcactctgctttcattaaagg-3’
sgRNA-24靶位点序列(SEQ ID NO：24)：5’-attaaaggtaccactgcagaagg-3’
利用UCA试剂盒检测多个向导sgRNA的活性，参见图1(A)和(B)，从结果可见向导sgRNA具有不同活性。从中优先选择2个(分别是sgRNA7和 sgRNA18)进行后续实验。在其5’端加上TAGG得到正向寡核苷酸，其互补链加上AAAC得到反向寡核苷酸，退火后以酶切连接(BbsI)的方式，将其分别其连接至pT7-sgRNA质粒，获得表达载体pT7-C-7和pT7-C-18。
表1 pT7-C-7和pT7-C-18序列列表
连接反应为：
表2
双链片段 1μL(0.5μM)
pT7-sgRNA载体 1μL(10ng)
T4DNA Ligase 1μL(5U)
10×T4DNA Ligase buffer 1μL
50％PEG4000 1μL
H2O 补至10μL
反应条件：
室温连接10-30min，转化至30μL TOP10感受态细胞中，然后取200μL涂布于Kan抗性的平板，37℃培养至少12小时后挑选2个克隆接种含有Kan抗性的LB培养基(5ml)中，37℃，250rpm摇培至少12小时。
随机挑选克隆送测序公司进行测序验证，选择连接正确的表达载体pT7-C-7 和pT7-C-18进行后续实验。
pT7-sgRNA质粒来源：
pT7-sgRNA载体图谱，参见图2。该质粒骨架来源Takara，货号3299。由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
实施例2载体pClon-4G-CTLA-4的构建
将小鼠Ctla 4基因(Gene ID：12477)第2号外显子的部分编码序列(基于NCBI登录号为NM_009843.4→NP_033973.2的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO:34所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO:35所示)用人同源CTLA4基因 (Gene ID：1493)相应编码序列替换(基于NCBI登录号为NM_005214.4→ NP_005205.2的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO:36所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO:37所示)，其中，鼠Ctla 4与人CTLA4对比示意图见图3，最终得到的改造后的人源化小鼠CTLA4基因示意图见图4，人源化小鼠CTLA4基因 DNA序列(嵌合CTLA4基因DNA)如SEQ ID NO:38所示：
SEQ ID NO:38仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中斜体下划线区域为人源CTLA4基因序列片段。
改造后的人源化小鼠CTLA4的CDS区、mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ IDNO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41所示。
发明人进一步设计了图5所示的打靶策略和包含5’同源臂、人CTLA4基因片段、3’同源臂的载体。过程如下：
1、设计同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：5’端同源臂(SEQ ID NO：42)，为NCBI登录号为NC_000067.6的第60910913- 60912430位核苷酸：
atgagcaaagggtgcttgcagaaagtctctgatagtagagatgaaggctaggcagacacctgctgtttcacccgctaagct gatggagtaaccatggcaactgccaccatattgttctcttttctgaggacagatgctaatcagtacaggtgctttcagaagagactagggtatctatatagcctggtttatggataggagaggtggtcttggaaactaagcctggggtagtattcaagattgcaatacactgaaaactaattattgtcttgtttttacaatctatgttagtaaactaccaatgacattgttcagtttaagttttgggtgtaatcttcaatactgaccggaaaacatccaggttagttatgaaaaggcaatatgacagaaagccacttttgtgtgctgagagtacaacccgagatcgtgtgtattctaggcaagcactctaccaccgacctacatctccagcccttctgcctgtggttctttgtcttgtaaagcaatgtcttgttgtttagctgatgctggccttgcacttgctatgtagccttcatctgctggctgctaggactgcagatttgtaccaccaataccggactgcaaacccactaatttctaatgatgaaggcatgtttgtatagagagctggactcctttcttctgtagtatacagggaggaaagagaaaacaacaaaaacagcagcagcagcagcagcaacaacaacaacaacaaaaaccccaaggacaaggaaagtgttaagtgaaggaaagaagggaggcagaagaggtggcagggaagcaggggaagcccacagaagttaaagcagggttgtctcaacccagagaggaaatgaccctggtgccctcagctctgtggcttccttgactgatgtatacaccactctaccacagtgatgccaggaaaagggtgaccaatgcattgacctgaggttcaactgctcctggttgacagaggtacgcttataaataagtaggtaggaaaattttgaagcttactttgagagatgaggcaaggttctgcacctcaagctccaggaatgtctcgactgccattcactatgtttcctgcgtgatatagttctattatcaccaaagaaggcgctgtactgacatgtaggctacccccttttcttactgcaggggagaataaatgaaaggaagaattatttgccaaaatgacacattttatgagagccagatcttctttttgctataccagtattctccttgccatagccaactgtcttcaataaactatcaataaggggatcttggagagtgactgactacagctgaaagatgggaagtggagtgccagggtggatgggtggagaggcaaagggtgaagggagtgatgagtttgttgaggggtgagcttgcaggagttcatccaagatgaacctcccctggcctcaggtgtggcctaatagttcaaaccgtggatgatcatgagcccactaagtgccctttggactttccatgtcagccatacag
上游引物(F): 5’ -TTTAAGAAGGAGATATACATGCTCGAGATGAGCAAAGGGTGCTTGCAGAAAGTC-3’(SEQ ID NO：43)
下游引物(R):5’ -ACCACAGCAGGCTGGGCCACCTGTATGGCTGACATGGAAAGTCCA-3’ (SEQID NO：44)
2、设计期望的转换区的引物以及相关序列，具体为：
人DNA片段总长度为312bp，为NCBI登录号为NC_000002.12的第203870594-203870905位核苷酸：
gtggcccagcctgctgtggtactggccagcagccgaggcatcgccagctttgtgtgtgagtatgcatctccaggcaaagccactgaggtccgggtgacagtgcttcggcaggctgacagccaggtgactgaagtctgtgcggcaacctacatgatggggaatgagttgaccttcctagatgattccatctgcacgggcacctccagtggaaatcaagtgaacctcactatccaaggactgagggccatggacacgggactctacatctgcaaggtggagctcatgtacccaccgccatactacctgggcata(SEQ ID NO：45)
扩增引物分别为：
F:5’-TGGACTTTCCATGTCAGCCATACAGGTGGCCCAGCCTGCTGTGG-3’ (SEQ ID NO：46)
R:5’-TAAATCTGCGTCCCGTTGCCTATGCCCAGGTAGTATGGCGG-3’(SEQ ID NO：47)
3、设计同源重组片段的上游引物和与其匹配的下游引物以及相关序列。具体为：3’同源臂(SEQ ID NO：48)，为NCBI登录号为NC_000067.6的第60912743- 60913715位核苷酸：
ggcaacgggacgcagatttatgtcattggtgagcaaagccattccactaagaacaagtctgttgcattattattgtctttacaccagaatagttttgttccttggtttggagtccttcatagttaggtctgtgatgcatagctaggaattccctagtagatagtagtcttgcttatactgagaagttacataaccatcactctgattgcaatgaaacgcatttggggatgtgttttttatactgcttgctgatagtctaggacacttgttcttgaagtttagtcttgtccctttgatggcactctgggaaagtcatgtattaaataagtagccagacttccctatagtttaccaatacaagttagggttgactagcaaaacctggaacctctaacttccttttactacccatgaggaactaggaccccacaattggaaactctctcaggaggttgatgcttcgtcttctgttgcagatccagaaccatgcccggattctgacttcctcctttggatccttgtcgcagttagcttggggttgtttttttacagtttcctggtcactgctgtttctttgagcaagatggtgagtgtgatgttgacgtttccccacagttaatggggatacttttagttgtaccctactgaccaattggtgttgagttgaagcaataaacaaggagcaggaaggatagggtaaagaacacgctagaaccccatgcacttgccttagaggtttcgggatgactaatactgtacgtgagcatgtttgacagtgaatgtttgtgtgcttctgagcagggtttcagtttgagtaactgtttgaacaacatggagcagctgttttggttgtcactgtcatggcaatgtccttaatcctaggacacacagcagtctctgggcaaccctttctagttagaaccacctagatggattttt gtcctttaccaagcaccatctcttggtccctctt
上游引物：
F:5’-CGCCATACTACCTGGGCATAGGCAACGGGACGCAGATTTATG-3’ (SEQ ID NO：49)
下游引物：
R:5’ -TTGTTAGCAGCCGGATCTCAGGCGGCCGCAAGAGGGACCAAGAGATGGT GCT-3’(SEQ IDNO：50)
以C57BL/6小鼠DNA为模板PCR扩增获得第2外显子5’端同源臂片段 (SEQ ID NO：42)和3’端同源臂片段(SEQ ID NO：48)，以人DNA为模板PCR扩增获得人DNA片段(SEQ IDNO：45)，通过AIO试剂盒将片段连接至试剂盒配备的pClon-4G质粒上，最终获得载体pClon-4G-CTLA-4。
实施例3载体pClon-4G-CTLA-4的验证
随机挑选3个pClon-4G-CTLA-4克隆，使用3组酶进行酶切验证，其中， HindIII应出现1070bp+5250bp，BamHI+XhoI应出现2348bp+3972bp，EcoRI+SmaI 应出现2818bp+3502bp，酶切结果均符合预期，参见图6，其中编号1和2的质粒经测序公司测序验证正确。选择质粒1进行后续实验。
实施例4显微注射及胚胎移植
取小鼠的原核期受精卵，例如，C57BL/6背景小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的Cas9mRNA、pClon-4G-CTLA-4质粒和pT7-C-7、pT7-C-18质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。将得到的免疫节点人源化小鼠命名为 B-hCTLA-4。
实施例5基因改造人源化小鼠模型的鉴定
1、基因型鉴定
对得到的7只F0代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物针对CTLA-4 基因的第2外显子，引物位置PCR-1位于5’同源臂左侧，PCR-4位于3’同源臂右侧，PCR-2和PCR-3均位于人源化片段上，具体序列如下：
5’端引物：
PCR-1：5’-GAAAGGCTAATACCAGGCTTGTTATGTGC-3’；(SEQ ID NO： 51)
PCR-2：5’-TCAACTCATTCCCCATCATGTAGGTTGC-3’(SEQ ID NO：52)
3’端引物：
PCR-3：5’-GAGTATGCATCTCCAGGCAAAGCCA-3’(SEQ ID NO：53)
PCR-4：5’-CACTGAGCTAGGGAGGGCATCAAGG-3’(SEQ ID NO：54)
如果重组载体插入正确，则应只有1条PCR条带，5’端引物产物长度应为1924bp，3’端引物产物长度应为1325bp。
PCR反应体系(20μL)如下：
表3
PCR扩增反应条件如下：
表4
(*a每个循环降0.7℃)
7只小鼠中共有4只经鉴定为阳性小鼠。4只小鼠的PCR鉴定结果，见图7。
进一步的，将F0鉴定为阳性的小鼠与野生型小鼠交配得到F1代小鼠。对 F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。 F1代小鼠PCR实验结果见图8，显示有9只F1代小鼠为阳性小鼠，具体编号为： F1-1，F1-2，F1-4，F1-5，F1-6，F1-8，F1-9，F1-12，F1-19。
应用Southern blot方法对PCR确认为阳性的9只小鼠(F1-1，F1-2，F1-4， F1-5，F1-6，F1-8，F1-9，F1-12，F1-19)进行确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用SspI、EcoNI酶分别消化基因组，转膜，杂交。探针 P1、P2分别位于5’同源臂外侧及人源化片段上。探针合成引物如下：
P1-F(SEQ ID NO:55)：5’-tgtgttaaagcaacacagcgtggtc-3’
P1-R(SEQ ID NO:56)：5’-aactgttgttgccgtttggtccttg-3’
P2-F(SEQ ID NO:57)：5’-agaagaccattgcttttggctgttt-3’
P2-R(SEQ ID NO:58)：5’-acatggaaaagtgcagaactaaaga-3’
野生型的C56BL/6小鼠基因组经P1、P2探针杂交分别产生3.6kb和6.1kb 的条带，制备成功的基因工程纯合子小鼠则分别产生5.4kb和12.6kb大小的条带，杂合子小鼠分别产生3.6kb+5.4kb和6.1kb+12.6kb大小的条带，不会有其它杂交条带产生。
实验结果显示杂交条带大小均与预期相符，证实这9只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入，分别为F1-1，F1-2，F1-4，F1-5，F1-6，F1-8，F1-9，F1-12， F1-19。Southernblot检测结果见图9。
这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的B-hCTLA-4人源化基因工程小鼠。
2、蛋白表达鉴定
选取1只上述经PCR鉴定为人源化的F0代小鼠，另选1只野生型C57BL/6 小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射15μg鼠CD3抗体，24h后再腹腔注射15μg鼠CD3 抗体。第39h时取脾脏，用注射器尾部对脾脏进行研磨，过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次。抗体避光染色30-45min， PBS清洗细胞1次，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果参见图10显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，可用荧光标记的抗人CTLA-4抗体检测到人源化小鼠脾脏内表达人CTLA-4蛋白的细胞；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人CTLA-4蛋白的细胞。表明本方法制备得到的CTLA-4基因改造人源化小鼠可以表达人CTLA-4蛋白，并被抗人抗体识别。该模型小鼠可用于抗人CTLA-4抗体的筛选和检测。
将前述得到的F1代阳性小鼠互相交配，可得到B-hCTLA-4人源化基因工程小鼠纯合子。选取2只B-hCTLA-4小鼠(1只纯合子、1只杂合子，3-8周龄)，另选1只野生型C57BL/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体， 28h后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用 PBS清洗细胞1次，分别进行FACS检测和RT-PCR检测。
FACS检测：用鼠源Ctla-4抗体mCtla-4APC或人源CTLA-4抗体 hCTLA-4APC和鼠源T细胞表面抗体mTcRβPerCP对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果如图11显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠相比，鼠源Ctla-4抗体可以检测到B-hCTLA-4杂合子、C57BL/6对照鼠脾脏内表达鼠 Ctla-4蛋白的细胞(图11A、E)；而在B-hCTLA-4纯合子的脾脏内未检测到表达鼠CTLA-4蛋白的细胞(图11C)，人源CTLA-4抗体可以检测到B-hCTLA-4 纯合子、杂合子小鼠脾脏内表达人CTLA-4蛋白的细胞(图11D、F)；而在C57BL/6 对照鼠的脾脏内未检测到表达人CTLA-4蛋白的细胞(图11B)。
RT-PCR检测：提取野生型C57BL/6小鼠和B-hCTLA-4纯合子、杂合子小鼠脾脏细胞总RNA，利用逆转录试剂盒逆转录成cDNA；
利用引物：
mCTLA-4 RT-PCR F1：5’-ACCCCTTGAGGTTAGCCCT-3’(SEQ ID NO:59)，和
mCTLA-4 RT-PCR R1：5’-TTGTAGAACAGCTATACGACCCA-3’(SEQ ID NO:60)
扩增大小为122bp的鼠Ctla-4片段；
利用引物
hCTLA-4 RT-PCR F1：5’-ATACTGTGCTAACAGGCCTCA-3’(SEQ ID NO:61)，和
hCTLA-4 RT-PCR R1：5’-ACCCATTGTCATTAGGAAGCACT-3’(SEQ ID NO:62)
扩增大小为152bp的人CTLA-4片段。
PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃， 30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。
实验结果显示，见图12，野生型C57BL/6小鼠和B-hCTLA-4杂合子活化细胞中可检测到鼠Ctla-4的mRNA表达(图12A)，B-hCTLA-4纯合子和杂合子小鼠活化细胞中可检测到人CTLA-4的mRNA表达(图12B)。
实施例6基因敲除小鼠的鉴定
由于Cas9的切割造成DNA双链断裂，而同源重组的修复方式会产生插入/ 缺失突变，可能在制备CTLA-4基因人源化小鼠的同时，得到CTLA-4蛋白功能丧失的基因敲除小鼠。为此设计一对引物，分别位于5’端靶位点左侧和3’端靶位点右侧，序列如下：
5’-GCATCAAGCTTGGTACCGATACAGCTGAAAGATGGGAAGTGGAGT-3’ (SEQ ID NO：63)；
5’-ACTTAATCGTGGAGGATGATCACATCCCCAAATGCGTTTCATTGC-3’ (SEQ ID NO：64)
野生型小鼠应只有1条PCR条带，产物长度应为790bp，杂合子应还有1条 PCR条带，产物长度应为约510bp；纯合子应只有这1条PCR条带。PCR反应体系及条件同实施例5，经鉴定为Ctla-4敲除小鼠，PCR结果参见图13。
实施例7 B-hCTLA-4基因人源化动物模型体内药效验证
Yervoy(ipilimumab)是一种抗CTLA-4全人源单克隆抗体，能够阻断CTLA-4 与其配体(CD80/CD85)的相互作用，由百时美施贵宝开发，在2011年经FDA 批准用于治疗晚期黑色素瘤，是最早被批准的抗人CTLA-4抗体。因此，本实施例选择已经被广泛验证的针对人CTLA-4信号通路的上市药品Yervoy(ipilimumab) 进行人源化动物模型的体内药效验证。
具体方法如下：取B-hCTLA-4纯合小鼠(6-8周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5×105/100μl PBS)，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择不同剂量的Yervoy(1～10mg/kg) 进行注射治疗，对照组注射等体积的空白溶剂。给药频率为每3天给药1次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时应执行安乐死。
整体来看，实验过程中，各组动物健康状态良好，所有治疗组和对照组小鼠体重在整个实验周期内均无明显区别(图14)，但对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积均出现不同程度的缩小和/或消失(图15)。可见在使用不同剂量的针对人CTLA-4信号通路的药物 Yervoy治疗后，明显的抑制了小鼠体内的肿瘤生长。
表5中列出了分组时和分组后13天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后23 天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumor free)的情况、肿瘤(体积) 抑制率(TumorGrowth Inhibition value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
在实验终点时(分组后第23天)，各组动物体重均出现增长且无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对Yervoy耐受良好。从肿瘤体积测量结果来看，对照组(G1)平均肿瘤体积为1608±741mm3；治疗组15只小鼠中有9只小鼠在实验终点肿瘤消失(60％)，具体结果为：在1mg/kg(G2)、3mg/kg(G3)、10mg/kg(G4) 剂量水平下的平均肿瘤体积分别为133±180mm3、0±0mm3、23±20mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，且与对照组的肿瘤体积相比均具有显著差异(p＜0.05)。整体上看给药3周后得到最佳的治疗效果，停药后低剂量的治疗组出现明显的肿瘤生长，TGITV分别为99.8％、109.1％、97.4％。
上述研究结果表明不同剂量的抗人CTLA-4抗体Yervoy对B-hCTLA-4小鼠体内的肿瘤具有明显的抑制作用和/或消除作用(TGItv＞60％)且在体内表现出不同疗效，由此证明B-hCTLA-4小鼠模型可被用于体内评估靶向人CTLA-4药物的有效性，以及评估治疗效果。
表5
以上实施例已证实B-hCTLA-4小鼠模型对已广泛验证的靶向人CTLA-4的抑制剂有响应并表现出一定的肿瘤生长抑制的剂量相关性。以下实施例将选择多个抗人CTLA-4抗体，以进一步的验证B-hCTLA-4小鼠可作为体内研究的活体动物模型，用于人CTLA-4信号通路调节剂的筛选、评估和研究。
实施例8 B-hCTLA-4基因人源化动物模型用于抗人CTLA-4调节剂的筛选
试验1：取B-hCTLA-4纯合小鼠(4-8周龄)，右侧皮下种5×105小鼠结肠癌细胞MC38后，待肿瘤体积约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择阳性对照Yervoy或3种抗人CTLA-4抗体Ab-A、Ab-B和Ab-C 中的任1种，给药剂量均为3mg/kg，对照组注射空白溶剂。给药方式：腹腔注射，每3天给药1次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后如有单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时执行安乐死结束实验。
表6中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后 20天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后第28天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value， TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
表6
整体来看，实验过程中动物健康状态良好。在实验终点时，各组动物体重增长良好，所有治疗组与对照组相比，动物体重无显著性差异(P＞0.05)，表明动物对阳性对照Yervoy和3种抗人CTLA-4抗体耐受良好。所有实验治疗组和对照组小鼠体重(图16)在整个实验周期内均无明显区别，但从肿瘤体积测量结果上看(图17)，所有对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠与对照组相比，肿瘤体积呈现不同程度的缩小和/或消失，表明4种抗人CTLA-4的抗体具有不同的抑瘤作用，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。
在实验终点时，对照组(G1)平均肿瘤体积为2914±1429mm3，Yervoy治疗组(G2)为6±13mm3，Ab-A抗体治疗组(G3)为3±7mm3，Ab-B抗体治疗组(G4)为1767±2302mm3，Ab-C抗体治疗组(G5)为1800±1527mm3，使用Ab-A抗体(G3)与Yervoy(G2)治疗组小鼠肿瘤体积大小差别不大，且 G2、G3组与对照组(G1)的瘤体积相比均具有显著的差异(P＜0.05)，TGITV分别为104.6％、104.7％，在实验终点时(分组后第28天)，每组5只小鼠中均有4只小鼠在实验终点肿瘤消失(80％)；而使用Ab-B或Ab-C抗体治疗(G4、 G5)的小鼠肿瘤体积明显大于Yervoy治疗组(G2)及Ab-A抗体治疗(G3)，在实验终点时未出现肿瘤消失小鼠。以上结果表明在相同的给药剂量和频次下，抗人CTLA-4抗体Ab-A与阳性对照Yervoy药效相似，抑制肿瘤生长上效果相当，而抗人CTLA-4抗体Ab-B、Ab-C抗体药效不如阳性对照Yervoy和Ab-A抗体。本实验证明了B-hCTLA-4小鼠可用于筛选抗人CTLA-4药物(如，抗体) 及体内药效检测。
试验2：取B-hCTLA-4纯合小鼠(4-8周龄)，右侧皮下种5×105小鼠结肠癌细胞MC38后，待肿瘤体积生长到约100mm3后随机分为对照组或治疗组(n＝5/ 组)。治疗组随机选择不同剂量的抗人CTLA-4抗体Ab-A(0.3～3mg/kg)进行注射治疗，对照组注射等体积的空白溶剂。给药方式：腹腔注射，每3天给药1 次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后如有单只小鼠肿瘤体积达到 3000mm3时执行安乐死结束实验。
表7中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后 15天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后第22天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠(tumorfree)的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value， TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
表7
在本实验过程中，各组动物健康状态良好。在实验终点时，各组动物体重增长良好，且所有治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异(P＞0.05)，再次确认了动物对抗人CTLA-4抗体Ab-A耐受良好。所有实验治疗组和对照组小鼠体重(图18)在整个实验周期内均无明显区别，但从肿瘤体积测量结果上看(图 19)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而3个治疗组15只小鼠中，有3只小鼠在实验终点肿瘤消失。整体上看给药3周时得到最佳的治疗效果，停药后低剂量的治疗组出现明显的肿瘤生长。在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为2879±1141mm3，治疗组在3mg/kg(G2)、1mg/kg(G3)、0.3mg/kg(G4)剂量水平下的平均肿瘤体积分别为49±66mm3、601±1178mm3、983±885mm3，所有治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，TGITV分别为103.0％、82.9％、69.0％，表明不同剂量的Ab-A抗体对肿瘤具有明显的抑制作用(TGITV＞60％)，剂量高的治疗效果越好，证明不同剂量的抗人CTLA-4抗体Ab-A在B-hCTLA-4小鼠体内表现出的疗效不同，并表现出肿瘤生长抑制的剂量相关性。
以上实施表明B-hCTLA-4动物模型小鼠可作为体内研究的活体替代模型，用于人CTLA-4信号通路调节剂的筛选、药效检测和疗效评估。
实施例9双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
包含人源CTLA-4基因的小鼠(如B-hCTLA-4动物模型)还可以用于制备双人源化或多人源化动物模型。如，前述实施例4中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞或B-hCTLA-4小鼠的受精卵细胞进行注射来完成基因编辑，可以进一步得到CTLA-4人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的 B-hCTLA-4动物模型纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合动物模型交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到CTLA-4人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。
以双重人源化CTLA-4/PD-1小鼠的生成为例，由于小鼠Ctla-4与Pd-1基因位于同一条染色体上，在实施例4显微注射时，可选择B-hPD-1小鼠的受精卵细胞代替野生型小鼠受精卵细胞进行基因编辑，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双重人源化CTLA-4/PD-1小鼠。
分别使用4对引物对双重人源化CTLA-4/PD-1小鼠的鼠尾基因组DNA进行 PCR分析，具体序列及产物长度见表8，反应体系和条件见表9、10。多只双重人源化CTLA-4/PD-1小鼠的鉴定结果见图20，其中图20A、B表明编号为 D-1～D-13、D-15～D-16的小鼠为CTLA-4纯合子小鼠、图20C、D表明编号为 D-1～D-16的小鼠为PD-1纯合子小鼠，综合两组结果表明，编号为D-1～D-13、 D-15～D-16的15只小鼠为双基因纯合子。
表8引物序列
表9 PCR反应体系(20μL)如下：
2×Master Mix 10μL
上游引物(10μM) 0.5μL
下游引物(10μM) 0.5μL
鼠尾基因组DNA 200ng
KOD-Plus-(1U/μL) 0.6μL
ddH2O 补至20μL
表10 PCR扩增反应条件如下：
进一步的对双重人源化CTLA-4/PD-1小鼠的表达情况进行检测。选取1只双重人源化CTLA-4/PD-1杂合子(6周龄)，另选2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3抗体，28h后脱颈安乐死后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，然后用鼠源CTLA-4抗体mCTLA-4APC(图21A、B、C)或人源CTLA-4抗体 hCTLA-4PE(图21D、E、F)，或鼠源PD-1抗体mPD-1PE(图21G、H、I)或人源 PD-1抗体hPD-1FITC(图21J、K、L)，和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。流式分析结果如图21显示，与未经刺激和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的 C57BL/6小鼠相比，人源CTLA-4抗体和人源PD-1抗体可以检测到人源化 CTLA-4/PD-1杂合子小鼠脾脏内表达人CTLA-4和PD-1蛋白的细胞；而在 C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人CTLA-4或PD-1蛋白的细胞。
实施例10双重人源化或多重人源化小鼠的体内药效验证
本实施例以双重人源化CTLA-4/PD-1小鼠为例，阐述如何利用双基因或多基因人源化小鼠进行体内药效验证及抗体的联合用药验证和筛选。本实施例中选择已被广泛验证的抗人PD-1抗体Keytruda(pembrolizumab)和抗人CTLA-4抗体 Yervoy(ipilimumab)进行实验。
取CTLA-4/PD-1纯合小鼠(6-8周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5 ×105/100μlPBS)，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择上述2种抗体中的1种或2种进行注射治疗，对照组注射人IgG，具体给药量和方案、频率见表11。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时应执行安乐死。
表11
整体来看，实验过程中，各组动物健康状态良好，所有治疗组和对照组小鼠体重在整个实验周期内均无明显区别(图22)，但对照组(G1)小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组(G2至G4)小鼠与对照组相比，肿瘤体积均出现不同程度的缩小(图23)，表明经过不同药物或药物联用治疗后，小鼠体内肿瘤生长受到明显抑制。
表12中列出了分组时和分组后10天时的肿瘤体积、实验结束时(分组后 17天)的肿瘤体积、小鼠存活情况情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
在实验终点时(分组后第17天)，各组动物体重均出现增长且无显著性差异(p＞0.05)，表明动物对使用的两种抗体Keytruda和Yervoy及其组合耐受良好。从肿瘤体积测量结果来看，对照组(G1)平均肿瘤体积为888±333mm3；单独使用Yervoy治疗组(G2)平均肿瘤体积为605±479mm3，单独使用Keytruda治疗组(G3)平均肿瘤体积为626±174mm3，Yervoy与Keytruda联用治疗组(G4) 平均肿瘤体积为175±110mm3，可见在上述给药方式和剂量水平下，所有治疗组小鼠的肿瘤体积明显小于对照组，且Yervoy与Keytruda联用治疗组(G4)的小鼠荷瘤体积明显小于单独使用Yervoy(G2)或Keytruda(G3)，所有治疗组与对照组的肿瘤体积相比均具有显著差异(p＜0.05)。此外，TGITV值也表明上述两种抗体联用的疗效优于抗体单独使用的疗效。同时使用抗人PD-1抗体药Keytruda或抗人CTLA-4抗体药Yervoy，可以更高效的抑制肿瘤细胞的生长。
表12
实施例11基于胚胎干细胞的制备方法
采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶 (兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得CTLA-4基因人源化小鼠。
根据本发明的基因编辑策略和人源化小鼠CTLA-4基因示意图(图4)，发明人设计了图24所示的打靶策略，图24中还显示了重组载体的设计。鉴于本发明的目的之一是将小鼠Ctla-4基因的2号外显子全部或部分用人CTLA-4基因片段替换，为此，发明人设计了包含5’同源臂(4291bp)、3’同源臂(3979bp)和人源化基因片段(312bp)的重组载体，并在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot 技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或 Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(Neo等)后，再通过互相交配即可得到CTLA-4基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例5一致。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
<130> 1
<160> 71
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggtcacctgt atggctgaca tgg 23
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<211> 23
<212> DNA
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<211> 23
<212> DNA
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> DNA
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acctcatcag tgttgtgtga tgg 23
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<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
atgcccacaa agtatggcgg tgg 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tacccaccgc catactttgt ggg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggactgagag ctgttgacac ggg 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
tgtcaacagc tctcagtcct tgg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gttcactctg ctttcattaa agg 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
attaaaggta ccactgcaga agg 23
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tgttggctag cagcca 16
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
taggtgttgg ctagcagcca 20
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tggctgctag ccaaca 16
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
aaactggctg ctagccaaca 20
<210> 29
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccatactttg tgggcat 17
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
taggccatac tttgtgggca t 21
<210> 31
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
atgcccacaa agtatgg 17
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
aaacatgccc acaaagtatg g 21
<210> 33
<211> 132
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
tttaaaggat cc 132
<210> 34
<211> 1933
<212> DNA/RNA
<213> 鼠(Mouse)
<400> 34
ctacacatat gtagcacgta ccttggatca aagctgtcta tataaagtcc ccgagtctgt 60
gtgggttcaa acacatctca aggcttctgg atcctgttgg gttttactct gctccctgag 120
gacctcagca catttgcccc ccagccatgg cttgtcttgg actccggagg tacaaagctc 180
aactgcagct gccttctagg acttggcctt ttgtagccct gctcactctt cttttcatcc 240
cagtcttctc tgaagccata caggtgaccc aaccttcagt ggtgttggct agcagccatg 300
gtgtcgccag ctttccatgt gaatattcac catcacacaa cactgatgag gtccgggtga 360
ctgtgctgcg gcagacaaat gaccaaatga ctgaggtctg tgccacgaca ttcacagaga 420
agaatacagt gggcttccta gattacccct tctgcagtgg tacctttaat gaaagcagag 480
tgaacctcac catccaagga ctgagagctg ttgacacggg actgtacctc tgcaaggtgg 540
aactcatgta cccaccgcca tactttgtgg gcatgggcaa cgggacgcag atttatgtca 600
ttgatccaga accatgcccg gattctgact tcctcctttg gatccttgtc gcagttagct 660
tggggttgtt tttttacagt ttcctggtca ctgctgtttc tttgagcaag atgctaaaga 720
aaagaagtcc tcttacaaca ggggtctatg tgaaaatgcc cccaacagag ccagaatgtg 780
aaaagcaatt tcagccttat tttattccca tcaactgaaa ggccgtttat gaagaagaag 840
gagcatactt cagtctctaa aagctgaggc aatttcaact ttccttttct ctccagctat 900
ttttacctgt ttgtatattt taaggagagt atgcctctct ttaatagaaa gctggatgca 960
aaattccaat taagcatact acaatttaaa gctaaggagc atgaacagag agctgggata 1020
tttctgttgt gtcagaacca ttttactaaa agcatcactt ggaagcagca taaggatata 1080
gcattatggt gtggggtcaa gggaacatta gggaatggca cagcccaaag aaaggaaggg 1140
ggtgaaggaa gagattatat tgtacacatc ttgtatttac ctgagagatg tttatgactt 1200
aaataatttt taaatttttc atgctgttat tttctttaac aatgtataat tacacgaagg 1260
tttaaacatt tattcacaga gctatgtgac atagccagtg gttccaaagg ttgtagtgtt 1320
ccaagatgta tttttaagta atattgtaca tgggtgtttc atgtgctgtt gtgtatttgc 1380
tggtggtttg aatataaaca ctatgtatca gtgtcgtccc acagtgggtc ctggggaggt 1440
ttggctgggg agcttaggac actaatccat caggttggac tcgaggtcct gcaccaactg 1500
gcttggaaac tagatgaggc tgtcacaggg ctcagttgca taaaccgatg gtgatggagt 1560
gtaaactggg tctttacact cattttattt tttgtttctg cttttgtttt cttcaatgat 1620
ttgcaaggaa accaaaagct ggcagtgttt gtatgaacct gacagaacac tgtcttcaag 1680
gaaatgcctc attcctgaga ccagtaggtt tgttttttta ggaagttcca atactaggac 1740
cccctacaag tactatggct cctcgaaaac acaaagttaa tgccacagga agcagcagat 1800
ggtaggatgg gatgcacaag agttcctgaa aactaacact gttagtgttt tttttttaac 1860
tcaatatttt ccatgaaaat gcaaccacat gtataatatt tttaattaaa taaaagtttc 1920
ttgtgattgt ttt 1933
<210> 35
<211> 223
<212> PRT
<213> 鼠(Mouse)
<400> 35
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Thr Gln Pro Ser Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser His Gly Val Ala Ser Phe Pro Cys Glu Tyr Ser Pro Ser His
50 55 60
Asn Thr Asp Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Thr Asn Asp Gln
65 70 75 80
Met Thr Glu Val Cys Ala Thr Thr Phe Thr Glu Lys Asn Thr Val Gly
85 90 95
Phe Leu Asp Tyr Pro Phe Cys Ser Gly Thr Phe Asn Glu Ser Arg Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Leu
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Phe Val Gly Met Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 36
<211> 2033
<212> DNA/RNA
<213> 人(Human)
<400> 36
cttctgtgtg tgcacatgtg taatacatat ctgggatcaa agctatctat ataaagtcct 60
tgattctgtg tgggttcaaa cacatttcaa agcttcagga tcctgaaagg ttttgctcta 120
cttcctgaag acctgaacac cgctcccata aagccatggc ttgccttgga tttcagcggc 180
acaaggctca gctgaacctg gctaccagga cctggccctg cactctcctg ttttttcttc 240
tcttcatccc tgtcttctgc aaagcaatgc acgtggccca gcctgctgtg gtactggcca 300
gcagccgagg catcgccagc tttgtgtgtg agtatgcatc tccaggcaaa gccactgagg 360
tccgggtgac agtgcttcgg caggctgaca gccaggtgac tgaagtctgt gcggcaacct 420
acatgatggg gaatgagttg accttcctag atgattccat ctgcacgggc acctccagtg 480
gaaatcaagt gaacctcact atccaaggac tgagggccat ggacacggga ctctacatct 540
gcaaggtgga gctcatgtac ccaccgccat actacctggg cataggcaac ggaacccaga 600
tttatgtaat tgatccagaa ccgtgcccag attctgactt cctcctctgg atccttgcag 660
cagttagttc ggggttgttt ttttatagct ttctcctcac agctgtttct ttgagcaaaa 720
tgctaaagaa aagaagccct cttacaacag gggtctatgt gaaaatgccc ccaacagagc 780
cagaatgtga aaagcaattt cagccttatt ttattcccat caattgagaa accattatga 840
agaagagagt ccatatttca atttccaaga gctgaggcaa ttctaacttt tttgctatcc 900
agctattttt atttgtttgt gcatttgggg ggaattcatc tctctttaat ataaagttgg 960
atgcggaacc caaattacgt gtactacaat ttaaagcaaa ggagtagaaa gacagagctg 1020
ggatgtttct gtcacatcag ctccactttc agtgaaagca tcacttggga ttaatatggg 1080
gatgcagcat tatgatgtgg gtcaaggaat taagttaggg aatggcacag cccaaagaag 1140
gaaaaggcag ggagcgaggg agaagactat attgtacaca ccttatattt acgtatgaga 1200
cgtttatagc cgaaatgatc ttttcaagtt aaattttatg ccttttattt cttaaacaaa 1260
tgtatgatta catcaaggct tcaaaaatac tcacatggct atgttttagc cagtgatgct 1320
aaaggttgta ttgcatatat acatatatat atatatatat atatatatat atatatatat 1380
atatatatat atatatattt taatttgata gtattgtgca tagagccacg tatgtttttg 1440
tgtatttgtt aatggtttga atataaacac tatatggcag tgtctttcca ccttgggtcc 1500
cagggaagtt ttgtggagga gctcaggaca ctaatacacc aggtagaaca caaggtcatt 1560
tgctaactag cttggaaact ggatgaggtc atagcagtgc ttgattgcgt ggaattgtgc 1620
tgagttggtg ttgacatgtg ctttggggct tttacaccag ttcctttcaa tggtttgcaa 1680
ggaagccaca gctggtggta tctgagttga cttgacagaa cactgtcttg aagacaatgg 1740
cttactccag gagacccaca ggtatgacct tctaggaagc tccagttcga tgggcccaat 1800
tcttacaaac atgtggttaa tgccatggac agaagaaggc agcaggtggc agaatggggt 1860
gcatgaaggt ttctgaaaat taacactgct tgtgttttta actcaatatt ttccatgaaa 1920
atgcaacaac atgtataata tttttaatta aataaaaatc tgtggtggtc gttttaaaaa 1980
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 2033
<210> 37
<211> 223
<212> PRT
<213> 人(Human)
<400> 37
Met Ala Cys Leu Gly Phe Gln Arg His Lys Ala Gln Leu Asn Leu Ala
1 5 10 15
Thr Arg Thr Trp Pro Cys Thr Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Cys Lys Ala Met His Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Ala Ala Val Ser Ser Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Leu Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 38
<211> 361
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ccatgtcagc catacaggtg gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg 60
ccagctttgt gtgtgagtat gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc 120
ttcggcaggc tgacagccag gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg 180
agttgacctt cctagatgat tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc 240
tcactatcca aggactgagg gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca 300
tgtacccacc gccatactac ctgggcatag gcaacgggac gcagatttat gtcattggtg 360
a 361
<210> 39
<211> 672
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atggcttgtc ttggactccg gaggtacaaa gctcaactgc agctgccttc taggacttgg 60
ccttttgtag ccctgctcac tcttcttttc atcccagtct tctctgaagc catacaggtg 120
gcccagcctg ctgtggtact ggccagcagc cgaggcatcg ccagctttgt gtgtgagtat 180
gcatctccag gcaaagccac tgaggtccgg gtgacagtgc ttcggcaggc tgacagccag 240
gtgactgaag tctgtgcggc aacctacatg atggggaatg agttgacctt cctagatgat 300
tccatctgca cgggcacctc cagtggaaat caagtgaacc tcactatcca aggactgagg 360
gccatggaca cgggactcta catctgcaag gtggagctca tgtacccacc gccatactac 420
ctgggcatag gcaacgggac gcagatttat gtcattgatc cagaaccatg cccggattct 480
gacttcctcc tttggatcct tgtcgcagtt agcttggggt tgttttttta cagtttcctg 540
gtcactgctg tttctttgag caagatgcta aagaaaagaa gtcctcttac aacaggggtc 600
tatgtgaaaa tgcccccaac agagccagaa tgtgaaaagc aatttcagcc ttattttatt 660
cccatcaact ga 672
<210> 40
<211> 1933
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ctacacatat gtagcacgta ccttggatca aagctgtcta tataaagtcc ccgagtctgt 60
gtgggttcaa acacatctca aggcttctgg atcctgttgg gttttactct gctccctgag 120
gacctcagca catttgcccc ccagccatgg cttgtcttgg actccggagg tacaaagctc 180
aactgcagct gccttctagg acttggcctt ttgtagccct gctcactctt cttttcatcc 240
cagtcttctc tgaagccata caggtggccc agcctgctgt ggtactggcc agcagccgag 300
gcatcgccag ctttgtgtgt gagtatgcat ctccaggcaa agccactgag gtccgggtga 360
cagtgcttcg gcaggctgac agccaggtga ctgaagtctg tgcggcaacc tacatgatgg 420
ggaatgagtt gaccttccta gatgattcca tctgcacggg cacctccagt ggaaatcaag 480
tgaacctcac tatccaagga ctgagggcca tggacacggg actctacatc tgcaaggtgg 540
agctcatgta cccaccgcca tactacctgg gcataggcaa cgggacgcag atttatgtca 600
ttgatccaga accatgcccg gattctgact tcctcctttg gatccttgtc gcagttagct 660
tggggttgtt tttttacagt ttcctggtca ctgctgtttc tttgagcaag atgctaaaga 720
aaagaagtcc tcttacaaca ggggtctatg tgaaaatgcc cccaacagag ccagaatgtg 780
aaaagcaatt tcagccttat tttattccca tcaactgaaa ggccgtttat gaagaagaag 840
gagcatactt cagtctctaa aagctgaggc aatttcaact ttccttttct ctccagctat 900
ttttacctgt ttgtatattt taaggagagt atgcctctct ttaatagaaa gctggatgca 960
aaattccaat taagcatact acaatttaaa gctaaggagc atgaacagag agctgggata 1020
tttctgttgt gtcagaacca ttttactaaa agcatcactt ggaagcagca taaggatata 1080
gcattatggt gtggggtcaa gggaacatta gggaatggca cagcccaaag aaaggaaggg 1140
ggtgaaggaa gagattatat tgtacacatc ttgtatttac ctgagagatg tttatgactt 1200
aaataatttt taaatttttc atgctgttat tttctttaac aatgtataat tacacgaagg 1260
tttaaacatt tattcacaga gctatgtgac atagccagtg gttccaaagg ttgtagtgtt 1320
ccaagatgta tttttaagta atattgtaca tgggtgtttc atgtgctgtt gtgtatttgc 1380
tggtggtttg aatataaaca ctatgtatca gtgtcgtccc acagtgggtc ctggggaggt 1440
ttggctgggg agcttaggac actaatccat caggttggac tcgaggtcct gcaccaactg 1500
gcttggaaac tagatgaggc tgtcacaggg ctcagttgca taaaccgatg gtgatggagt 1560
gtaaactggg tctttacact cattttattt tttgtttctg cttttgtttt cttcaatgat 1620
ttgcaaggaa accaaaagct ggcagtgttt gtatgaacct gacagaacac tgtcttcaag 1680
gaaatgcctc attcctgaga ccagtaggtt tgttttttta ggaagttcca atactaggac 1740
cccctacaag tactatggct cctcgaaaac acaaagttaa tgccacagga agcagcagat 1800
ggtaggatgg gatgcacaag agttcctgaa aactaacact gttagtgttt tttttttaac 1860
tcaatatttt ccatgaaaat gcaaccacat gtataatatt tttaattaaa taaaagtttc 1920
ttgtgattgt ttt 1933
<210> 41
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Met Ala Cys Leu Gly Leu Arg Arg Tyr Lys Ala Gln Leu Gln Leu Pro
1 5 10 15
Ser Arg Thr Trp Pro Phe Val Ala Leu Leu Thr Leu Leu Phe Ile Pro
20 25 30
Val Phe Ser Glu Ala Ile Gln Val Ala Gln Pro Ala Val Val Leu Ala
35 40 45
Ser Ser Arg Gly Ile Ala Ser Phe Val Cys Glu Tyr Ala Ser Pro Gly
50 55 60
Lys Ala Thr Glu Val Arg Val Thr Val Leu Arg Gln Ala Asp Ser Gln
65 70 75 80
Val Thr Glu Val Cys Ala Ala Thr Tyr Met Met Gly Asn Glu Leu Thr
85 90 95
Phe Leu Asp Asp Ser Ile Cys Thr Gly Thr Ser Ser Gly Asn Gln Val
100 105 110
Asn Leu Thr Ile Gln Gly Leu Arg Ala Met Asp Thr Gly Leu Tyr Ile
115 120 125
Cys Lys Val Glu Leu Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Tyr Leu Gly Ile Gly
130 135 140
Asn Gly Thr Gln Ile Tyr Val Ile Asp Pro Glu Pro Cys Pro Asp Ser
145 150 155 160
Asp Phe Leu Leu Trp Ile Leu Val Ala Val Ser Leu Gly Leu Phe Phe
165 170 175
Tyr Ser Phe Leu Val Thr Ala Val Ser Leu Ser Lys Met Leu Lys Lys
180 185 190
Arg Ser Pro Leu Thr Thr Gly Val Tyr Val Lys Met Pro Pro Thr Glu
195 200 205
Pro Glu Cys Glu Lys Gln Phe Gln Pro Tyr Phe Ile Pro Ile Asn
210 215 220
<210> 42
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
atgagcaaag ggtgcttgca gaaagtctct gatagtagag atgaaggcta ggcagacacc 60
tgctgtttca cccgctaagc tgatggagta accatggcaa ctgccaccat attgttctct 120
tttctgagga cagatgctaa tcagtacagg tgctttcaga agagactagg gtatctatat 180
agcctggttt atggatagga gaggtggtct tggaaactaa gcctggggta gtattcaaga 240
ttgcaataca ctgaaaacta attattgtct tgtttttaca atctatgtta gtaaactacc 300
aatgacattg ttcagtttaa gttttgggtg taatcttcaa tactgaccgg aaaacatcca 360
ggttagttat gaaaaggcaa tatgacagaa agccactttt gtgtgctgag agtacaaccc 420
gagatcgtgt gtattctagg caagcactct accaccgacc tacatctcca gcccttctgc 480
ctgtggttct ttgtcttgta aagcaatgtc ttgttgttta gctgatgctg gccttgcact 540
tgctatgtag ccttcatctg ctggctgcta ggactgcaga tttgtaccac caataccgga 600
ctgcaaaccc actaatttct aatgatgaag gcatgtttgt atagagagct ggactccttt 660
cttctgtagt atacagggag gaaagagaaa acaacaaaaa cagcagcagc agcagcagca 720
acaacaacaa caacaaaaac cccaaggaca aggaaagtgt taagtgaagg aaagaaggga 780
ggcagaagag gtggcaggga agcaggggaa gcccacagaa gttaaagcag ggttgtctca 840
acccagagag gaaatgaccc tggtgccctc agctctgtgg cttccttgac tgatgtatac 900
accactctac cacagtgatg ccaggaaaag ggtgaccaat gcattgacct gaggttcaac 960
tgctcctggt tgacagaggt acgcttataa ataagtaggt aggaaaattt tgaagcttac 1020
tttgagagat gaggcaaggt tctgcacctc aagctccagg aatgtctcga ctgccattca 1080
ctatgtttcc tgcgtgatat agttctatta tcaccaaaga aggcgctgta ctgacatgta 1140
ggctaccccc ttttcttact gcaggggaga ataaatgaaa ggaagaatta tttgccaaaa 1200
tgacacattt tatgagagcc agatcttctt tttgctatac cagtattctc cttgccatag 1260
ccaactgtct tcaataaact atcaataagg ggatcttgga gagtgactga ctacagctga 1320
aagatgggaa gtggagtgcc agggtggatg ggtggagagg caaagggtga agggagtgat 1380
gagtttgttg aggggtgagc ttgcaggagt tcatccaaga tgaacctccc ctggcctcag 1440
gtgtggccta atagttcaaa ccgtggatga tcatgagccc actaagtgcc ctttggactt 1500
tccatgtcag ccatacag 1518
<210> 43
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
tttaagaagg agatatacat gctcgagatg agcaaagggt gcttgcagaa agtc 54
<210> 44
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
accacagcag gctgggccac ctgtatggct gacatggaaa gtcca 45
<210> 45
<211> 312
<212> DNA
<213> 人(Human)
<400> 45
gtggcccagc ctgctgtggt actggccagc agccgaggca tcgccagctt tgtgtgtgag 60
tatgcatctc caggcaaagc cactgaggtc cgggtgacag tgcttcggca ggctgacagc 120
caggtgactg aagtctgtgc ggcaacctac atgatgggga atgagttgac cttcctagat 180
gattccatct gcacgggcac ctccagtgga aatcaagtga acctcactat ccaaggactg 240
agggccatgg acacgggact ctacatctgc aaggtggagc tcatgtaccc accgccatac 300
tacctgggca ta 312
<210> 46
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
tggactttcc atgtcagcca tacaggtggc ccagcctgct gtgg 44
<210> 47
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
taaatctgcg tcccgttgcc tatgcccagg tagtatggcg g 41
<210> 48
<211> 973
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
ggcaacggga cgcagattta tgtcattggt gagcaaagcc attccactaa gaacaagtct 60
gttgcattat tattgtcttt acaccagaat agttttgttc cttggtttgg agtccttcat 120
agttaggtct gtgatgcata gctaggaatt ccctagtaga tagtagtctt gcttatactg 180
agaagttaca taaccatcac tctgattgca atgaaacgca tttggggatg tgttttttat 240
actgcttgct gatagtctag gacacttgtt cttgaagttt agtcttgtcc ctttgatggc 300
actctgggaa agtcatgtat taaataagta gccagacttc cctatagttt accaatacaa 360
gttagggttg actagcaaaa cctggaacct ctaacttcct tttactaccc atgaggaact 420
aggaccccac aattggaaac tctctcagga ggttgatgct tcgtcttctg ttgcagatcc 480
agaaccatgc ccggattctg acttcctcct ttggatcctt gtcgcagtta gcttggggtt 540
gtttttttac agtttcctgg tcactgctgt ttctttgagc aagatggtga gtgtgatgtt 600
gacgtttccc cacagttaat ggggatactt ttagttgtac cctactgacc aattggtgtt 660
gagttgaagc aataaacaag gagcaggaag gatagggtaa agaacacgct agaaccccat 720
gcacttgcct tagaggtttc gggatgacta atactgtacg tgagcatgtt tgacagtgaa 780
tgtttgtgtg cttctgagca gggtttcagt ttgagtaact gtttgaacaa catggagcag 840
ctgttttggt tgtcactgtc atggcaatgt ccttaatcct aggacacaca gcagtctctg 900
ggcaaccctt tctagttaga accacctaga tggatttttg tcctttacca agcaccatct 960
cttggtccct ctt 973
<210> 49
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
cgccatacta cctgggcata ggcaacggga cgcagattta tg 42
<210> 50
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
ttgttagcag ccggatctca ggcggccgca agagggacca agagatggtg ct 52
<210> 51
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gaaaggctaa taccaggctt gttatgtgc 29
<210> 52
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
tcaactcatt ccccatcatg taggttgc 28
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
gagtatgcat ctccaggcaa agcca 25
<210> 54
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cactgagcta gggagggcat caagg 25
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tgtgttaaag caacacagcg tggtc 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
aactgttgtt gccgtttggt ccttg 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
agaagaccat tgcttttggc tgttt 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
acatggaaaa gtgcagaact aaaga 25
<210> 59
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
accccttgag gttagccct 19
<210> 60
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ttgtagaaca gctatacgac cca 23
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
atactgtgct aacaggcctc a 21
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
acccattgtc attaggaagc act 23
<210> 63
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gcatcaagct tggtaccgat acagctgaaa gatgggaagt ggagt 45
<210> 64
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
acttaatcgt ggaggatgat cacatcccca aatgcgtttc attgc 45
<210> 65
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
ccatcacaca acactgatga ggtcc 25
<210> 66
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
cacatcccca aatgcgtttc attgc 25
<210> 67
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
acagctgaaa gatgggaagt ggagt 25
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
cttccacatg agcgtggtca gggcc 25
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
ccaagggact attttagatg ggcag 25
<210> 70
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gaagctacaa gctcctaggt aggggg 26
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
acgggttggc tcaaaccatt aca 23

Claims (37)

1.导入人CTLA-4基因的非人动物或其子代的制备方法，其特征在于导入人CTLA-4基因、使得该人CTLA-4基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的CTLA-4蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的CTLA-4基因的表达。
2.一种制备非人动物的方法，所述非人动物在其种系基因组中插入一段外源CTLA-4基因，所述方法包括：
(a)构建含有人CTLA-4基因的载体，通过基因工程方法将所述人CTLA-4基因的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的CTLA-4基因缺失或使得内源/动物来源的CTLA-4基因不具有功能；并且
(b)在所述非人动物体内表达人源CTLA-4基因。
3.一种制备基因修饰/改造的非人动物的方法，修饰/改造后的非人动物包含内源/动物来源的CTLA-4基因的人源化序列或片段，其中所述人源化序列或片段包含在内源/动物来源的CTLA-4基因座用人CTLA-4胞外域编码序列取代内源/动物来源的CTLA-4胞外域编码序列的部分或全部。
4.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括CTLA-4基因，CTLA-4基因的组成包括胞外区、跨膜区以及胞内参与信号传导的区域，其中CTLA-4基因的胞内参与信号传导的部分为动物来源，CTLA-4基因的胞外区域包含人CTLA-4基因的部分片段，同时该动物来源部分和人源部分通过序列拼接连接于动物模型内源的CTLA-4启动子后；优选的，CTLA-4基因的跨膜区为动物来源。
5.一种如权利要求1-4所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，其中，动物来源部分包括动物来源CTLA-4基因的第1号外显子、第2号外显子的部分序列、第3号外显子及其后所有外显子的全部序列；和/或所述人CTLA-4基因部分为编码人类CTLA-4多肽的氨基酸的第2号外显子的部分或全部序列。
6.一种如权利要求1-5任一项方法，其特征在于，其中，动物来源的Ctla-4基因为啮齿类动物来源的Ctla-4基因。
7.一种如权利要求6所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，啮齿类动物为小鼠。
8.一种如权利要求7所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述小鼠Ctla-4的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：34中的全部或部分片段所示。
9.一种如权利要求7所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述小鼠Ctla-4的蛋白序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：35中的全部或部分片段所示。
10.一种如权利要求1-7任一项所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人CTLA-4基因的全部或部分片段的人CTLA-4mRNA序列如SEQ ID NO：36中的全部或部分片段所示。
11.一种如权利要求1-7任一项所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述人CTLA-4全部或部分片段的蛋白序列如SEQ ID NO：37中的全部或部分片段所示。
12.一种如权利要求1-7任一项所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合CTLA-4基因，所述嵌合CTLA-4基因包括小鼠来源的Ctla-4基因部分和人源的CTLA-4基因部分，所述嵌合CTLA-4基因mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的全部或部分序列具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。
13.一种如权利要求12所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合CTLA-4基因，所述嵌合CTLA-4基因包括动物来源的Ctla-4基因部分和人源的CTLA-4基因部分，所述嵌合CTLA-4基因的嵌合mRNA序列如SEQ ID NO：40的全部或部分所示。
14.一种如权利要求1-7任一项所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合CTLA-4基因，所述嵌合CTLA-4基因包括动物来源的Ctla-4基因部分和人源的CTLA-4基因部分，编码所述嵌合CTLA-4基因的蛋白序列与SEQ ID NO：41所示的序列的部分或全部具有至少80％、或至少90％、或至少95％、或至少99％、或至少99.9％的同源性。
15.一种如权利要求14所述的人源化动物模型构建的方法，其特征在于，所述动物模型基因组中包括嵌合CTLA-4基因，所述嵌合CTLA-4基因包括动物来源的Ctla-4基因部分和人源的CTLA-4基因部分，所述嵌合CTLA-4基因的蛋白序列如SEQ ID NO：41的部分或全部所示。
16.一种人源化动物模型构建的方法，其特征在于，将动物来源的Ctla-4的第2号外显子全部或部分序列替换为人源CTLA-4的第2号外显子全部或部分序列，其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点序列如SEQ ID NO：1-12任一项所示，3’端靶位点序列如SEQ ID NO：13-24任一项所示。
17.一种Ctla-4敲除动物模型构建的方法，其特征在于，将动物体内的Ctla-4的第2号外显子全部或部分敲除，使得内源Ctla-4蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向的5’端靶位点如SEQ ID NO：1-12任一项所示，3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：13-24任一项所示。
18.一种制备sgRNA载体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：1-12所示的任一项sgRNA靶序列和/或SEQ ID NO：13-24所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：18，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：30所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：32所示，其中SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：28为A组，SEQ ID NO：30和SEQ ID NO：32为B组；
(2)合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：33所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；
(3)分别合成步骤1中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤2所述的pT7-sgRNA载体的双链；
(4)将步骤3中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。
19.一种Ctla-4基因敲除动物模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步：按照权利要求18所述的步骤1-4，获得sgRNA载体；
第二步：将sgRNA载体的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Ctla-4基因被敲除，获得Ctla-4基因敲除阳性小鼠；
第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Ctla-4-/-小鼠；
优选的，所述第三步中使用的PCR检测引物对序列如SEQ ID NO：63和SEQ ID NO：64所示。
20.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段(5’臂)，其选自CTLA-4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)期望的/供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段(3’臂)，其选自CTLA-4基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。
21.一种用于构建人源化动物模型的sgRNA序列，所述sgRNA序列靶向CTLA-4基因，同时所述sgRNA在待改变的CTLA-4基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
优选的，所述sgRNA在小鼠CTLA-4基因的靶位点位于小鼠CTLA-4基因的第2外显子上；
更优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：1-12任一项所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：13-24任一项所示；
进一步优选的，sgRNA靶向的5’端靶位点的序列如SEQ ID NO：7所示，sgRNA靶向的3’端靶位点的序列如SEQ ID NO：18所示。
22.一种建立CTLA-4基因人源化动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)提供一种细胞，所述细胞包括权利要求20所述的靶向载体以及一种或多种靶位点的序列如1-24所示的sgRNA序列的体外转录产物，优选的所述细胞为受精卵细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
23.一种制备多基因人源化动物模型的方法，其特征在，
(a)利用权利要求1-17、19、22任意一项所述方法获得动物模型；
(b)将步骤(a)获得的动物模型与其他人源化动物交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到多基因人源化动物模型。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
25.一种建立双人源化小鼠基因改造动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)利用权利要求1-17、19、22任意一项所述方法获得CTLA-4基因改造人源化小鼠；
(b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到双人源化小鼠模型。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于步骤(b)中，将PD-1人源化小鼠直接进行基因编辑/修饰得到CTLA-4和PD-1双人源化小鼠模型。
27.由权利要求1-17、19或22-26中任一项的方法产生的非人类哺乳动物或其后代。
28.一种非人类动物在制备荷瘤动物模型中的用途，其特征在于所述非人类动物通过权利要求1-17、19或22-26任一项所述的方法获得的。
29.来源于根据权利要求1-17、19或22-26任一项所述的方法获得的非人类动物或其后代或动物模型的细胞或组织或器官或瘤组织或其培养物。
30.一种嵌合CTLA-4蛋白，其特征在于，选自下列组中的一种：
a)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列如SEQ ID NO：36所示的序列的部分或全部所示；
b)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：36所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
c)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：36所示的核苷酸序列杂交；
d)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列与SEQ ID NO：36所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
e)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4蛋白的mRNA序列具有与SEQ ID NO：36所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
f)嵌合CTLA-4蛋白序列中人CTLA-4的蛋白序列如SEQ ID NO：37部分或全部序列所示；
g)嵌合CTLA-4蛋白序列中人CTLA-4的蛋白序列与SEQ ID NO：37所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
h)嵌合CTLA-4蛋白序列中编码人CTLA-4的蛋白序列的核酸序列在严格条件下，与SEQID NO：37所示的蛋白序列的核苷酸序列杂交；
i)嵌合CTLA-4蛋白序列中人CTLA-4的蛋白序列与SEQ ID NO：37所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
g)嵌合CTLA-4蛋白序列中人CTLA-4的蛋白序列具有SEQ ID NO：37所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
或
k)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:45所示的序列的部分或全部；
l)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
m)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列在严格条件下，与SEQ ID NO:45所示的核苷酸序列杂交；
n)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列与SEQ ID NO:45所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
p)嵌合CTLA-4蛋白中编码人CTLA-4蛋白的核苷酸序列具有SEQ ID NO:45所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
q)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列为SEQ ID NO：40所示的序列的部分或全部；
r)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
s)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的核苷酸序列杂交；
t)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
u)嵌合CTLA-4的嵌合mRNA序列具有与SEQ ID NO：40所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列；
或
v)嵌合CTLA-4的嵌合蛋白序列为SEQ ID NO：41的部分或全部；
w)嵌合CTLA-4的蛋白序列与SEQ ID NO：41所示氨基酸的序列同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
x)编码嵌合CTLA-4蛋白的核酸序列在严格条件下，与编码SEQ ID NO：41所示的蛋白的核苷酸序列杂交；
y)嵌合CTLA-4的嵌合蛋白序列与SEQ ID NO：41所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
z)嵌合CTLA-4的嵌合蛋白序列具有SEQ ID NO：41所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列；
或
A1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合CTLA-4蛋白的核苷酸的部分序列为SEQ ID NO:38所示的序列的部分或全部；
B1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合CTLA-4蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:38所示的核苷酸序列的部分或全部的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合CTLA-4蛋白的核苷酸部分序列在严格条件下，与SEQID NO:38所示的核苷酸序列杂交；
D1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合CTLA-4蛋白的核苷酸部分序列与SEQ ID NO:38所示的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；
E1)嵌合CTLA-4蛋白中编码嵌合CTLA-4蛋白的核苷酸部分序列具有SEQ ID NO:38所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
31.编码嵌合CTLA-4蛋白的基因，其特征在于，其中所述基因序列选自：
a)所述基因编码权利要求30中所述嵌合小鼠CTLA-4的蛋白序列；
b)嵌合CTLA-4的mRNA序列如SEQ ID NO：40所示；
c)嵌合CTLA-4的mRNA序列在严格条件下，与SEQ ID NO：40所示的核苷酸杂交的基因序列；
d)嵌合CTLA-4的mRNA序列与SEQ ID NO：40所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
e)编码嵌合CTLA-4的蛋白的基因序列，所述蛋白与SEQ ID NO：41所示的氨基酸的同一性程度为至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
f)编码嵌合CTLA-4的蛋白的基因序列，所述蛋白的序列与SEQ ID NO：41的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸残基；g)编码嵌合CTLA-4的蛋白的基因序列，所述蛋白具有SEQ ID NO：41所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
k)嵌合CTLA-4的基因序列如SEQ ID NO：38所示；
l)嵌合CTLA-4的基因序列在严格条件下，与SEQ ID NO：38所示的核苷酸杂交的基因序列；和/或
m)嵌合CTLA-4的基因序列与SEQ ID NO：38所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
32.根据权利要求30所述的编码嵌合CTLA-4蛋白的基因，其特征在于，其中嵌合小鼠CTLA-4DNA的非模板链、编码链或有义链包含序列SEQ ID NO：38。
33.人源化小鼠CTLA-4的基因组DNA，其特征在于，所述基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与权利要求31-32任意一项所述的基因序列一致或互补。
34.一种根据权利要求1-17、19或22-26所述的方法产生的非人动物或其后代在制备动物模型中的用途。
35.一种根据权利要求1-17、19或22-26所述的方法获得非人动物或其后代或动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用。
36.一种根据权利要求1-17、19或22-26所述的方法获得非人动物或其后代或动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用。
37.一种根据权利要求1-17、19或22-26所述的方法获得非人动物或其后代或动物模型在体内研究、人CTLA-4信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究CTLA-4基因功能研究、人源CTLA-4抗体、针对人CTLA-4靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
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