CN109666701A - 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种人源化动物模型的制备方法，利用同源重组的方式将人PD‑1基因的编码序列导入动物基因组中，从而制备出基因修饰人源化动物，该动物体内能正常表达人或人源化PD‑1蛋白，可以作为人PD‑1、PD‑L1等信号机理研究、调节剂筛选、毒理研究的动物模型，这对于研究人PD‑1、PD‑L1基因的功能，以及以PD‑1、PD‑L1为靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

一种PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用
技术领域
本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及基于CRISPR/Cas9技术的PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
背景技术
人源化动物模型是指带有人类功能性基因、细胞或组织的动物模型。这种模型通常作为研究人类疾病的活体替代模型，在阐明发病机制、药物筛选等方面具有巨大的优势和广泛的应用前景。
研究人类复杂疾病的发病机制，筛选有效药物，需要理想的动物模型来进行大量的体内试验。小鼠是应用最为广泛的生物模型之一，但考虑到小鼠与人类在生理、病理等诸多方面存在差异，构建具有人类功能性基因、细胞或组织的人源化小鼠模型尤为重要。利用基因修饰的方法，将人类基因“放置”在大鼠或小鼠染色体上所制备的人源化基因动物模型，可以在抑制动物内源基因表达的同时，获得表达人源基因的蛋白，是进行一些人类疾病机理研究和药物研发的重要方法。
肿瘤免疫疗法是当前肿瘤治疗领域中最具前景的研究方向之一，《Science》杂志将肿瘤免疫疗法评为2013年十大科学突破第一位。目前，针对PD-1/PD-L1通路抑制剂的研究受到了特别的关注。
PD-1(programmed death-1)主要表达于T细胞及初级B细胞表面，PD-1的两个配体(PD-L1和PD-L2)，广泛表达于抗原提呈细胞(APCs)等。PD-1与其受体的相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用。在许多人类肿瘤组织中均可检测到PD-L1蛋白的表达，肿瘤部位的微环境可诱导肿瘤细胞上的PD-L1的表达，表达的PD-L1有利于肿瘤的发生和生长，诱导抗肿瘤T细胞的凋亡，进而逃避免疫系统的攻击。抑制PD-1与其配体的结合，可以使肿瘤细胞暴露于免疫系统的杀伤视野，进而达到杀伤肿瘤组织及治疗癌症的作用。
目前有国内外很多大公司开始正在加紧开发抗PD-1药物。最熟悉的全球制药巨头当属BMS和默沙东，两家公司的Opdivo和Keytruda均已用于黑色素瘤和肺癌适应症治疗。2015年11月，FDA批准Opdivo用于晚期肾细胞癌，Opdivo头颈癌关键III期临床已成功完成。在2016年1月举办ASCO GI 2016上公布的结果显示，这两款药在管癌、胃癌显示积极疗效。在我国，2015年底，君实生物成为首家PD-1单抗获批临床的企业；2016年1月，百济神州的PD-1单抗BGB-A317通过FDA的新药研究申请审评，获准在美国开展临床试验；2月19日，恒瑞医药开发的注射用SHR-1210(PD-1单克隆抗体)获得药物临床试验批件，主要适应症为实体瘤；2月22日，沃森生物发布公告称，其子公司嘉和生物研发的抗PD-1单抗(杰诺单抗注射液)产品临床研究申请获得受理，主要的潜在适应症包括各种血癌及黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌等多种实体瘤。截止2016年3月，国内已有两家PD-1单抗药物获得了临床试验批件，另有两家正在受理中。
药厂之间激烈的竞争表明了对该类药物高度认同，PD-1抑制剂可能成为医药史上一个重要的里程碑。美国国家癌症研究所(NCI)将PD-1列为140种癌症免疫治疗途径和分子中的第二最有前景的潜在靶点。
由于免疫疗法有较明显的免疫毒性，如皮炎、大肠炎、垂体炎等，这种副作用与免疫应答程度直接相关，很难通过剂量调整避免。PD-1单抗nivolumab、MK-3475都报道了肺炎这一严重不良反应，因此严格的药物筛选程序非常重要。但由于人类生理与动物生理有显著的差别，利用动物模型得到的实验结果有时不能适用到人体上，而人源化动物模型则能很好地“复制”人类某些功能，这种模型通常被用做人类疾病体内研究的活体替代模型。人源化动物模型的应用很广泛，比如在肿瘤、艾滋病、传染病、人类退化性疾病、血液病研究领域等都有很强的适用性。
目前已有一些PD-1基因相关的动物模型，如Nihimura等人早在2001年已经制备了PD-1敲除的BALB/c小鼠，这些模型主要用于研究PD-1基因的功能(基因型、功能、调控)及相关疾病机制研究。鉴于PD-1基因在肿瘤和免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了使临床前期的药效试验更有效并提高研发成功率，针对现有技术的不足和缺陷，特提出本发明。
发明内容
为了解决上述问题，本申请发明人惊奇的发现利用创造性劳动筛选设计独特的sgRNA序列或靶向载体，在非人动物Pd-1基因上导入人PD-1基因的编码序列或含有人PD-1基因的编码序列和动物Pd-1基因编码序列的重组DNA片段，本申请发明人成功制备PD-1基因人源化动物模型，该模型体内可正常表达人或人源化PD-1蛋白，可用于人PD-1基因功能研究、人PD-1/PD-L1信号通路研究、人PD-1、PD-L1抗体的筛选和评价。
利用本发明制备的动物模型可用于针对人PD-1、PD-L1靶位点的药物筛选、药效研究，免疫相关疾病和肿瘤治疗等应用，加快新药研发过程，节约时间和成本，降低药物开发风险。对于研究PD-1、PD-L1蛋白的功能和肿瘤药物筛选提供了有力工具。
由于人PD-1蛋白序列与啮齿类，如小鼠PD-1蛋白序列的一致性(Identities)为58％，存在显著差异，所以，一般情况下识别人PD-1蛋白的抗体，无法识别小鼠PD-1蛋白。对于内源性PD-1基因的小鼠模型，甚至具有人源化PD-1基因的小鼠模型(如，具有部分人源化PD-1序列)不一定可以用于测试多种抗人抗体的功效和毒性。本发明所述的PD-1基因修饰人源化动物模型及构建方法，对PD-1蛋白胞外区人源化序列的替换范围较大，可以有效的结合更多种类的抗人PD-1抗体，用于筛选、评估PD-1信号通路的调节剂和测试多种抗人PD-1抗体的药效和毒性。
本发明所述的PD-1抗体包括但不限于Nivolumab、Pembrolizumab及其他任何靶向人PD-1的抗体。
同时利用本模型可以与其它人源化动物模型(包括但不限于，人源化OX-40抗体动物模型)交配、体外授精或直接进行基因编辑/修饰得到双人源动物模型，可用于联合用药情况下筛选抗体及联合用药的药效评价等。
本发明的第一方面，涉及一种构建人源化非人动物模型的方法，所述人源化非人动物模型基因组中含有人PD-1基因，所述的人PD-1基因通过非人动物内源性调控元件调控。
优选的，所述的人PD-1基因为人PD-1基因的编码序列，所述的人PD-1基因的编码序列通过非人动物内源性调控元件调控。
优选的，所述的人源化非人动物模型基因组中含有重组DNA片段，所述重组DNA片段包括人PD-1基因和非人动物Pd-1基因，所述重组DNA片段通过非人动物内源性调控元件调控。进一步优选的，所述的重组DNA片段为人PD-1基因的编码序列与非人动物Pd-1基因的编码序列的拼接序列。
本发明所述的重组DNA片段包括编码胞外结构域、跨膜区和胞内结构域的序列，其中，重组DNA片段中编码胞外结构域的序列包含编码人PD-1蛋白序列的全部或部分，重组DNA片段中编码胞内结构域的序列包含编码非人动物PD-1蛋白序列的全部或部分，所述编码人PD-1蛋白的序列与编码所述非人动物PD-1蛋白的序列通过序列拼接连接于内源性非人动物Pd-1基因的启动子后；优选的，重组DNA片段中编码跨膜区的部分包含编码非人动物PD-1蛋白序列的全部或部分。
优选的，所述的非人动物为啮齿类动物。进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的小鼠为C57BL/6或BALB/c小鼠。
本发明所述的人源化非人动物模型基因组中还含有辅助序列，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA；优选的，所述的辅助序列与人PD-1基因的编码序列通过序列拼接或所述的辅助序列与所述的重组DNA片段通过序列拼接。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的辅助序列位于人PD-1基因的编码序列后。
本发明所述的方法，使用基因编辑技术进行PD-1基因人源化非人动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行PD-1人源化非人动物模型的构建。
优选的，所述的方法，包括导入人PD-1基因或重组DNA片段，使得该人PD-1基因或重组DNA片段在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人或人源化PD-1蛋白，同时消除或降低了非人动物或其子代的内源/动物来源的PD-1蛋白的表达。
进一步优选的，所述的方法，包括在非人动物或其子代基因组中Pd-1基因座导入人PD-1基因的编码序列或重组DNA片段，使得非人动物或其子代体内表达人PD-1蛋白，同时非人动物或其子代的体内内源/动物来源的Pd-1蛋白不表达。
更进一步优选的，所述人PD-1基因的编码序列或重组DNA片段导入非人动物或其子代基因组中Pd-1基因座的起始密码子后。
优选的，所述的方法包括：
(a)构建含有人PD-1基因编码序列或重组DNA片段的载体，通过基因工程方法将所述人PD-1基因编码序列或重组DNA片段的载体导入非人动物的基因组，使得非人动物基因组中的内源/动物来源的Pd-1基因缺失或使得内源/动物来源的PD-1蛋白不表达或不具有功能；并且
(b)在所述非人动物体内表达人或人源化PD-1蛋白。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法为导入人PD-1基因的编码序列，使得该人PD-1基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人PD-1蛋白，同时消除或降低了非人动物或其子代的内源/动物来源的PD-1蛋白的表达。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法为导入所述的重组DNA片段，使得该重组DNA片段在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化PD-1蛋白，同时消除或降低了非人动物或其子代的内源/动物来源的PD-1蛋白的表达。所述的重组DNA片段为人PD-1基因的编码序列与非人动物Pd-1基因的编码序列的拼接序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法为导入人PD-1基因的编码序列、WPRE和polyA的拼接序列，使得该人PD-1基因的编码序列在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人PD-1蛋白，同时消除或降低了非人动物或其子代的内源/动物来源的PD-1蛋白的表达。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的方法为导入所述的重组DNA片段、WPRE和polyA的拼接序列，使得该重组DNA片段在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化PD-1蛋白，同时消除或降低了非人动物或其子代的内源/动物来源的PD-1蛋白的表达。所述的重组DNA片段为人PD-1基因的编码序列与非人动物Pd-1基因的编码序列的拼接序列。
本发明所述的方法，包括将所述的人PD-1基因或重组DNA片段导入非人动物的第1号外显子和/或第2号外显子和/或第3号外显子和/或第4号外显子和/或第5号外显子位置。
优选的，用人PD-1基因编码序列或重组DNA片段替换动物Pd-1基因编码序列的第1号外显子及其后所有外显子的全部或部分。
进一步优选的，用人PD-1基因编码序列或重组DNA片段替换动物第1号外显子或第1号外显子、第2号外显子或第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子或第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子或第1号外显子、第2号外显子、第3号外显子、第4号外显子、第5号外显子。其中，所述人PD-1基因编码序列或重组DNA片段后导入辅助序列。
本发明所述的方法，包括将所述的人PD-1基因或重组DNA片段导入非人动物的第1号外显子位置。优选的，使用sgRNA靶向小鼠的Pd-1基因，所述的sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：11-19任一项所示。进一步优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：16。
优选的，所述的小鼠Pd-1基因的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示或与SEQ ID NO：1所示的序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度。所述的小鼠PD-1蛋白的全部或部分序列如SEQ ID NO：2所示或与SEQ ID NO：2所示序列具有至少大约70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或至少100％同一性程度。
优选的，所述的方法，包括以下步骤：
(a)提供一种细胞，所述细胞包括靶向非人动物Pd-1基因的靶向载体以及一种或多种靶位点的序列如11-19所示的sgRNA序列的体外转录产物，优选的所述细胞为受精卵细胞；
(b)将所述细胞在培养液中进行培养；
(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性的后代基因改造人源化非人类哺乳动物中的种系传递。
本发明的第二方面，涉及一种上述的方法构建的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，所述的人源化动物模型或其子代表达人或人源化PD-1蛋白。所述的人源化非人动物模型或其子代可以稳定传代。
优选的，所述的非人动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠。
本发明的第三方面，涉及一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。
优选的，所述的待改变的转换区位于Pd-1基因的起始密码子后；进一步优选的，所述的待改变的转换区位于Pd-1基因的第1号外显子。
优选的，所述靶向载体还包括可选择的基因标记。
优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。
优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
优选的，所述的5’臂序列如SEQ ID NO：7所示；所述3’臂序列如SEQ ID NO：8所示。
优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段来自人；进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段为人PD-1基因，或人PD-1基因的编码序列，或人PD-1基因、WPRE、polyA，或人PD-1基因的编码序列、WPRE、polyA，或重组DNA片段，或重组DNA片段、WPRE、polyA。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的重组DNA片段包括人PD-1基因序列的全部或部分和动物Pd-1基因序列的部分。进一步优选的，所述的重组DNA片段中编码胞外结构域的序列包含人PD-1基因序列的全部或部分和/或重组DNA片段中编码跨膜区和胞内结构域的序列包含动物Pd-1基因序列的部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：39所示。
本发明的第四方面，涉及一种能够特异的靶向Pd-1基因的sgRNA序列，同时所述的sgRNA在待改变的非人动物Pd-1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则。所述的sgRNA序列在小鼠Pd-1基因的靶位点位于小鼠Pd-1基因的第1号外显子上；所述的sgRNA序列靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：11-19任一项所示；优选的，sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：16所示。优选的，所述sgRNA序列的体外转录产物的制备方法，包括如下步骤：
(1)提供一种sgRNA序列，设计获得上游序列和下游序列，所述sgRNA序列靶向非人动物Pd-1基因，同时所述sgRNA在待改变的非人动物Pd-1基因上的靶序列上是唯一的，且符合5’-NNN(20)-NGG3’或5’-CCN-N(20)-3’的序列排列规则；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA、sgRNA scaffold的片段DNA；
(3)将步骤(2)获得的片段DNA进行体外转录，得到sgRNA体外转录产物。
在本发明的一个具体实施方式中，所述sgRNA序列的体外转录产物的制备方法，包括如下步骤：
(1)将序列如SEQ ID NO：11-19所示的任一项sgRNA靶序列，设计获得上游序列和下游序列；
优选的，所述sgRNA靶序列为SEQ ID NO：16，获得的上游序列如SEQ ID NO：20所示；下游序列如SEQ ID NO：21所示；
(2)合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：22所示；
(3)将步骤(2)获得的片段DNA进行体外转录，得到sgRNA体外转录产物。
本发明的第五方面，涉及一种包含所述能够特异的靶向Pd-1基因的sgRNA序列的构建体。优选的，所述的构建体为能够产生上述所述的sgRNA序列，用于敲除、替换或插入Pd-1基因的第1号外显子的全部或部分。
本发明的第六方面，涉及一种细胞，所述的细胞包含上述的靶向载体，和/或一种或多种上述能够特异的靶向Pd-1基因的sgRNA序列，和/或一种或多种上述包含能够特异的靶向Pd-1基因的sgRNA序列的构建体，和/或包含能够特异的靶向Pd-1基因的sgRNA序列构建体的体外转录产物；优选的，所述细胞包含上述的靶向载体和一种或多种上述的构建体的体外转录产物。
本发明的第七方面，涉及一种Pd-1基因敲除动物模型构建的方法，将动物体内的Pd-1的第1号外显子全部或部分敲除，使得内源Pd-1蛋白失活；其中，使用sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：11-19任一项所示。
优选的，所述Pd-1基因敲除动物模型构建的方法，包括以下步骤：
第一步：按照上述sgRNA序列的体外转录产物的制备方法，获得片段DNA的体外转录产物；
第二步：将第一步获得的片段DNA的体外转录产物和Cas9mRNA进行混合，获得混合液，将混合液注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中，将注射后的受精卵转移至培养液中进行培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，得到F0代小鼠；
第三步：将F0代小鼠利用PCR技术进行检验，验证细胞中的Pd-1基因被敲除，获得Pd-1基因敲除阳性小鼠；
第四步：将第三步筛选的阳性小鼠通过杂交和自交的方式，扩大种群数量，建立稳定的Pd-1-/-小鼠。
本发明的第八方面，涉及一种PD-1基因人源化细胞株，其特征在于，所述人源化细胞株的基因组中包含人PD-1基因的编码序列或重组DNA片段，该人源化细胞株体内可表达人或人源化PD-1蛋白，同时内源Pd-1蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的重组DNA片段包含人PD-1基因和非人动物Pd-1基因。进一步优选的，所述的重组DNA片段为人PD-1基因的编码序列与非人动物Pd-1基因的编码序列的拼接序列。
优选的，所述的人PD-1基因的编码序列通过非人动物内源性调控元件调控。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞选自体细胞、干细胞、肿瘤细胞、T细胞和/或受精卵细胞。
优选的，所述的细胞株使用上述的能够特异的靶向PD-1基因的sgRNA、上述的载体通过对第1位外显子的部分或全部进行替换制备获得。
本发明的第九方面，涉及一种Pd-1基因缺失细胞株，使用上述的能够特异的靶向Pd-1基因的sgRNA敲除第1号外显子的部分或全部制备获得。
本发明的第十方面，涉及一种构建多基因人源化非人动物的方法，包括
(a)利用上述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代；
(b)将步骤(a)的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代与其他人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物的方法。
优选的，所述多基因人源化动物可以是双基因人源化动物、三基因人源化动物、四基因人源化动物、五基因人源化动物、六基因人源化动物、七基因人源化动物、八基因人源化动物或九基因人源化动物。
优选的，所述的步骤(b)中其他人源化动物选自基因OX-40、PD-L1、CD40、CD47、SIPRA、ICOS、GITR、TIGIT、4-1BB、TIM-3、LAG-3、CD28或CD27人源化中的一种或两种以上。
在本发明的一个具体实施方式中，构建的双人源化小鼠基因改造动物模型的方法，包括如下步骤：
(a)利用上述方法获得PD-1基因基因改造人源化小鼠；
(b)将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与其他人源化小鼠交配或直接进行基因编辑/修饰，并进行筛选，得到双人源化小鼠模型。
在本发明的一个实施例中，所述步骤(b)中，将步骤(a)获得的基因改造人源化小鼠与OX40人源化小鼠交配得到OX40和PD-1双人源化小鼠模型。
本发明的第十一方面，涉及上述的方法构建的多基因人源化非人动物模型或其子代。
本发明的第十二方面，涉及一种上述的靶向载体、上述的sgRNA序列或上述的构建体或上述的细胞在构建包含PD-1人源化非人动物或其子代中的应用。
本发明的第十三方面，涉及一种荷瘤动物模型，来源于上述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，或上述的多基因人源化非人动物模型或其子代。
本发明的第十四方面，涉及一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，或上述的多基因人源化非人动物模型或其子代，或上述的荷瘤动物模型。
本发明的第十五方面，涉及一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于来源于上述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，或上述的多基因人源化非人动物模型或其子代，或上述的荷瘤动物模型。
优选的，所述的组织或器官或其培养物为分离的组织或器官或其培养物，所述的组织或器官或其培养物选自的脾脏、淋巴结、骨髓、肿瘤或其培养物。
本发明的第十六方面，涉及一种荷瘤后的瘤组织，所述的荷瘤后的瘤组织来源于上述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，或上述的多基因人源化非人动物模型或其子代，或上述的荷瘤动物模型。
本发明的第十七方面，涉及一种嵌合PD-1蛋白，其特征在于，所述的嵌合PD-1蛋白包括胞外结构域、跨膜区和胞内结构域，其中，所述胞外结构域包含人PD-1蛋白的全部或部分，所述胞内结构域包含非人动物PD-1蛋白的全部或部分；优选的，所述跨膜区为非人动物来源。所述的人源化非人动物模型体内可表达人或人源化PD-1蛋白，所述的人源化PD-1蛋白为嵌合PD-1蛋白。
进一步优选的，所述的嵌合PD-1蛋白选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ IDNO：33所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：33所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：33所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：33所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
或
f)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：35所示；
g)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQID NO：35所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
h)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
i)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
j)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：35所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
进一步优选的，所述的嵌合PD-1蛋白选自下列组中的一种。
a)所述氨基酸序列中鼠PD-1蛋白序列如SEQ ID NO：2所示；
b)所述氨基酸序列中鼠PD-1蛋白序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQID NO：2所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列中鼠PD-1蛋白序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列中鼠PD-1蛋白序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列中鼠PD-1蛋白序列具有SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
本发明的第十八方面，涉及一种嵌合PD-1基因，所述的人源化非人动物模型基因组中包含嵌合PD-1基因，所述的嵌合PD-1基因表达人或人源化PD-1蛋白，所述的嵌合PD-1基因选自下列组中的一种：
a)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因编码人PD-1蛋白序列；
b)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因的DNA序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示；
c)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸杂交的基因序列；
d)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
e)所述的人PD-1基因的编码序列如SEQ ID NO：3所示；
f)所述的人PD-1基因的编码序列为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：3所示的核苷酸杂交的基因序列；
g)所述的人PD-1基因的编码序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
h)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因编码人源化PD-1蛋白序列；
i)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因的DNA序列如SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示；
j)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示的核苷酸杂交的基因序列；
k)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
l)所述的重组DNA片段编码人源化PD-1蛋白序列；
m)所述的重组DNA片段如SEQ ID NO：4所示；
n)所述的重组DNA片段为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：4所示的核苷酸杂交的基因序列；
o)所述的重组DNA片段转录的mRNA序列与SEQ ID NO：4所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
p)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因的mRNA序列如SEQ ID NO：34所示；
q)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：34所示的核苷酸杂交的基因序列；
r)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因的mRNA序列与SEQ ID NO：34所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
优选的，所述的嵌合基因选自：
a)所述鼠Pd-1基因序列如SEQ ID NO：1所示；
b)所述鼠Pd-1基因序列在低严谨条件下，与SEQ ID NO：1所示的核苷酸杂交的基因序列；
c)所述鼠Pd-1基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：1所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
d)所述的WPRE序列如SEQ ID NO：5所示；
e)所述的WPRE序列在低严谨条件下，与SEQ ID NO：5所示的核苷酸杂交的基因序列；
f)所述的WPRE序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：5所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
g)所述的polyA序列如SEQ ID NO：6所示；
h)所述的polyA序列在低严谨条件下，与SEQ ID NO：6所示的核苷酸杂交的基因序列；
i)所述的polyA序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：6所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
本发明的第十九方面，涉及人源化小鼠PD-1基因的基因组DNA，所述的基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与上述的基因序列一致或互补。
本发明的第二十方面，涉及一种表达人源化小鼠PD-1蛋白的构建体。
本发明的第二十一方面，涉及一种包含表达人源化小鼠PD-1蛋白的构建体的细胞。
本发明的第二十二方面，涉及一种包含上述细胞的组织。
本发明的第二十三方面，涉及一种上述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代、上述的多基因人源化非人动物模型或其子代、上述的荷瘤动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官、上述的嵌合PD-1蛋白、上述的嵌合PD-1基因、上述的基因组DNA、上述的构建体、上述的细胞、上述的组织在与PD-1基因或者蛋白相关的领域中的应用。
优选的，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人PD-1/PD-L1信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究PD-1基因功能研究、人PD-1抗体、PD-L1抗体，针对人PD-1、PD-L1靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
在本发明的一个具体实施方式中，将植入的肿瘤细胞改造为表达人或人源化PD-L1的肿瘤细胞，则制备得到的肿瘤模型还可以用来研究和筛选靶向人PD-L1的调节剂。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同源性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
本发明所述“癌”选自下组，该组由以下各项组成：白血病、淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自下组，该组由以下各项组成：急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；并且所述肉瘤选自下组，该组由以下各项组成：骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、腺泡状软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.in chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
图1：鼠野生型Pd-1基因示意图(非按比例)；
图2：改造后的人源化鼠PD-1基因示意图，插入片段为人编码区、WPRE及polyA，其中WPRE为土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、polyA为多聚腺苷酸，改造后的示意图中所示的鼠编码区由于所插入的序列部分存在终止密码子，使转录提前终止，使得鼠Pd-1基因不能正常转录和翻译(非按比例)；
图3：改造后的人源化鼠PD-1基因示意图，插入片段为人编码序列、鼠编码序列、WPRE及polyA，其中WPRE为土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件、polyA为多聚腺苷酸，改造后的示意图中由于所插入的序列部分存在终止密码子，故终止密码子之后的鼠编码区转录提前终止，使得终止密码子之后的鼠Pd-1基因不能正常转录和翻译(非按比例)；图4：在鼠Pd-1基因的编码起始密码子(ATG)的序列后插入人编码区、WPRE及polyA的人源化鼠PD-1基因打靶策略示意图(非按比例)；
图5：在鼠Pd-1基因的编码起始密码子(ATG)的序列后插入人编码序列、鼠编码序列、WPRE及polyA的人源化鼠PD-1基因打靶策略示意图(非按比例)；
图6：pUC57-huPD-1质粒酶切电泳结果图，图中1、2、3、4分别指4个pUC57-huPD-1克隆，ck代表未经酶切的质粒对照，M为Marker；
图7：pUC57-chiPD-1质粒酶切电泳结果图，图中1*、2*、3*、4*分别指4个pUC57-chiPD-1克隆，ck代表未经酶切的质粒对照，M为Marker；
图8：sgRNA活性检测结果，其中Con.为阴性对照，PC为阳性对照；
图9：阳性小鼠PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水对照，M为Marker，编号为F0-1、F0-2、F0-6、F0-7的小鼠为表达人PD-1的阳性小鼠；
图10：阳性小鼠PCR鉴定结果，其中，WT为野生型，H2O为水对照，M为Marker，+为阳性对照，编号为F0-1-chi、F0-2-chi、F0-3-chi、F0-5-chi、F0-6-chi和F0-7-chi的小鼠为表达人源化PD-1的阳性小鼠；
图11：鼠尾PCR鉴定结果(F1)，其中，图A为5’端引物PCR结果，图B为3’端引物PCR结果，WT为野生型，+为阳性对照，M为Marker，H2O为水对照，结果表明：编号F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5的小鼠均为表达人PD-1的阳性小鼠；
图12：鼠尾PCR鉴定结果(F1)，其中，图A为5’端引物PCR结果，图B为3’端引物PCR结果，WT为野生型，+为阳性对照，M为Marker，H2O为水对照，结果表明：编号F1-2-chi、F1-3-chi、F1-4-chi、F1-5-chi的小鼠均为表达人源化PD-1的阳性小鼠；
图13：F1代小鼠Southern blot结果，其中WT为野生型，综合P1、P2探针的结果表明，编号F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5的PD-1阳性F1代小鼠(表达人PD-1的)无随机插入；
图14：F1代小鼠Southern blot结果，其中WT为野生型，综合P1、P2探针的结果表明，编号F1-2-chi、F1-3-chi、F1-4-chi、F1-5-chi的PD-1阳性F1代小鼠(表达人源化PD-1的)无随机插入；
图15：流式分析结果，图A、D、G为未经T细胞激活的野生型C57BL/6小鼠细胞，图B、E、H为用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活的野生型C57BL/6小鼠细胞，图C、F、I为经用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活的表达人PD-1的小鼠杂合子细胞，再分别用抗鼠Pd-1抗体mPd-1PE(图A、B、C)和抗人PD-1抗体hPD-1APC(图D、E、F)或抗人PD-1抗体hPD-1FITC(图G、H、I)，进行细胞标记，经流式细胞仪检测分析；
图16：流式分析结果，其中，图A、D为未经T细胞激活的野生型C57BL/6小鼠细胞，图B、E为用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活的野生型C57BL/6小鼠细胞，图C、F为经用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活的表达人源化PD-1的小鼠杂合子细胞，分别用抗鼠CD3抗体刺激脾脏内T细胞激活，再用抗鼠Pd-1抗体mPd-1PE(图A、B、C)和抗人PD-1抗体hPD-1FITC(图D、E、F)进行细胞标记，经流式细胞仪检测；
图17：流式分析结果，与对照组相比(图A)，抗人PD-1抗体Nivolumab(图B)和Keytruda(图C)与表达人PD-1的小鼠杂合子体内活化的T细胞有很好的结合；
图18：流式分析结果，与对照组相比(图A)，抗人PD-1抗体Nivolumab(图B)和Keytruda(图C)与表达人源化PD-1的小鼠杂合子体内活化的T细胞有很好的结合；
图19：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/+为表达人PD-1的小鼠杂合子，GAPDH为内参对照；
图20：RT-PCR检测结果，其中，+/+为野生型C57BL/6小鼠，H/+为表达人源化PD-1的小鼠杂合子，GAPDH为内参对照；
图21：将小鼠结肠癌细胞MC38植入表达人PD-1的小鼠纯合子体内，并利用2种不同剂量的PD-1抗体(Nivolumab、Pembrolizumab)进行抗肿瘤药效试验，各组实验动物平均体重无显著差异；
图22：将小鼠结肠癌细胞MC38植入表达人PD-1的小鼠纯合子体内，并利用2种不同剂量的PD-1抗体(Nivolumab、Pembrolizumab)进行抗肿瘤药效试验，各组实验动物平均体重变化无显著差异；
图23：将小鼠结肠癌细胞MC38植入表达人PD-1的小鼠纯合子体内，并利用2种不同剂量的PD-1抗体(Nivolumab、Pembrolizumab)进行抗肿瘤药效试验，其中，所有治疗组(G2-G7)实验动物肿瘤平均体积呈现明显差异，且治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于G1对照组；
图24：将小鼠结肠癌细胞MC38植入表达人源化PD-1的小鼠纯合子体内，并利用2种不同剂量的PD-1抗体(Nivolumab、Pembrolizumab)进行抗肿瘤药效试验，各组实验动物平均体重无显著差异；
图25：将小鼠结肠癌细胞MC38植入表达人源化PD-1的小鼠纯合子体内，并利用2种不同剂量的PD-1抗体(Nivolumab、Pembrolizumab)进行抗肿瘤药效试验，各组实验动物平均体重变化无显著差异；
图26：将小鼠结肠癌细胞MC38植入表达人源化PD-1的小鼠纯合子体内，并利用2种不同剂量的PD-1抗体(Nivolumab、Pembrolizumab)进行抗肿瘤药效试验，其中，所有治疗组(G2-G7)实验动物肿瘤平均体积呈现明显差异，且治疗组实验动物肿瘤平均体积明显小于G1对照组。
具体实施方式
本申请实施例所用的小鼠品系、生化试剂、实验仪器为：
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
BamHI、ScaI、SalI、NcoI、AseI酶购自NEB，货号分别为R3136M、R3122M、R3138M、R3193M、R0526S；
UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号为BCG-DX-001；
MEGAshortscript T7 Kit来源Thermo Fisher，货号为AM1354；
Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e(mCD3)购自BD公司，货号：553057；
PE anti-mouse CD279(PD-1)Antibody(mPD-1PE)来源Biolegend，货号109104；
PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain(mTcRβPerCP)购自Biolegend，货号为：109228；
FITC anti-human CD279(PD-1)Antibody(hPD-1FITC)来源Biolegend，货号329904；
APC anti-Human CD279(hPD-1APC)来源BD Pharmingen，货号为558694；
Alexa 647 AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific(Anti-Fab AF647)来源Jackson，货号分别为109-606-098；
流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur。
实施例1序列设计
在小鼠Pd-1基因(Gene ID：18566，示意图见图1)中编码起始密码子(ATG)的序列后(基于NCBI登录号为NM_008798.2→NP_032824.1的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示)插入可表达人或人源化PD-1蛋白的编码序列，例如，可表达人PD-1蛋白的编码序列如SEQ ID NO：3，或是一段包含人PD-1基因序列的重组DNA片段(SEQ ID NO：4)，其编码的人源化(嵌合)PD-1蛋白序列如SEQ ID NO：33所示。上述人PD-1基于NCBI登录号为NM_005018.2→NP_005009.2的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：34所示，蛋白序列如SEQ ID NO：35所示。
为了让人PD-1蛋白在小鼠体内可以更稳定、更好的表达，在人PD-1编码序列后插入辅助序列WPRE(土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件)和polyA(多聚腺苷酸)，所述WPRE序列如SEQ ID NO：5所示，所述polyA序列如SEQ ID NO：6所示。
最终得到的改造后的人源化小鼠PD-1基因示意图见图2、3，该小鼠通过内源性启动子调控人源PD-1序列的表达，体内表达的PD-1蛋白为人或人源化PD-1蛋白(序列分别如SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：33所示)；并进一步的设计了如图4、5所示的打靶策略。由于所插入的重组序列后存在终止密码子，使图2、3所示人源化鼠PD-1基因的Exon2至Exon5不能正常转录和翻译。
鉴于人PD-1或小鼠Pd-1具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
实施例2载体构建和验证
以C57BL/6背景小鼠为例，根据序列设计，分别构建两种打靶载体，其中一种打靶载体(pUC57-huPD-1)的5’同源臂(SEQ ID NO：7)选自NCBI登录号为NC_000067.6的第94052491-94053890位核苷酸；3’同源臂(SEQ ID NO：8)选自NCBI登录号为NC_000067.6的第94051015-94052414位核苷酸；A片段(SEQ ID NO：9)为包含编码人PD-1蛋白和辅助序列WPRE、polyA的DNA片段。最终得到的基因改造后的人源化小鼠DNA序列如SEQ ID NO：10所示。SEQ ID NO：10仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中单下划线为人PD-1编码序列，斜体下划波浪线为WPRE序列，双下划线为polyA序列。
基因改造后的人源化小鼠DNA序列(SEQ ID NO：10)
另一个打靶载体(pUC57-chiPD-1)仅A片段序列不同，即，pUC57-chiPD-1载体中A’片段(SEQ ID NO：39)为包含重组序列(SEQ ID NO：4)、辅助序列WPRE和polyA的DNA片段。最终得到的基因改造后的人源化鼠DNA序列如SEQ ID NO：36所示。SEQ ID NO：36仅列出涉及改造部分的DNA序列，其中单下划线部分为人PD-1编码序列，双下划线部分为鼠PD-1编码序列，斜体部分为WPRE序列，波浪下划线部分为polyA序列。
基因改造后的人源化小鼠DNA序列(SEQ ID NO：36)
由外部合成公司根据设计的打靶载体序列进行序列合成(使用合成公司提供的pUC57质粒作为骨架质粒)，合成得到多个pUC57-huPD-1和pUC57-chiPD-1质粒。分别随机挑选4个，使用3组限制性内切酶进行酶切验证，其中，pUC57-huPD-1质粒使用ScaI酶应出现3175bp+4031bp，SalI应出现1647bp+5559bp，NcoI+ScaI应出现998bp+2177bp+4031bp；pUC57-chiPD-1质粒使用ScaI酶应出现3167bp+4024bp，NdeI应出现3032bp+4159bp，BamHI+NotI应出现2769bp+4422bp。
酶切结果参见图6、7，其中图6中所有pUC57-huPD-1质粒的酶切结果均符合预期，表明这些质粒酶切验证结果正确，编号为1和2的质粒经测序公司测序验证正确；图7中编号为2*、4*的pUC57-chiPD-1质粒酶切符合预期的，编号为2*的质粒进一步经测序公司测序验证正确。选择质粒2和2*进行后续试验。
实施例3 Pd-1基因sgRNA的设计
靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。
以小鼠为例，根据打靶策略，设计并合成识别靶位点的sgRNA序列，靶位点均位于小鼠Pd-1基因的第一外显子上，各sgRNA在PD-1上的靶位点序列如下：
sgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-tctgggcatgtgggtccggcagg-3’
sgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-tgtgggtccggcaggtaccctgg-3’
sgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-ctgcagttgagctggcaatcagg-3’
sgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-aggtaccctggtcattcacttgg-3’
sgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO：15)：5’-tgaatgaccagggtacctgccgg-3’
sgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO：16)：5’-agttgagctggcaatcagggtgg-3’
sgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO：17)：5’-cagggtggcttctaggtatgtgg-3’
sgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO：18)：5’-acagcccaagtgaatgaccaggg-3’
sgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO：19)：5’-gccaggggctctgggcatgtggg-3’
实施例4 sgRNA的筛选
利用UCA试剂盒检测实施例3筛选得到的多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果参见图8，具体数值如表1：
表1 sgRNA的活性检测结果
从中优先sgRNA6，进行后续实验。sgRNA6的序列如下：
上游序列：5’-TTGAGCTGGCAATCAGGG-3’(SEQ ID NO：20)
下游序列：5’-CCCTGATTGCCAGCTCAA-3’(SEQ ID NO：21)
由外部合成公司根据上下游序列合成含有T7启动子、sgRNA6和sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：22)，使用T7体外试剂盒(使用MEGAshortscript T7 Kit，按照说明书方法进行转录)直接将DNA片段进行转录得到体外转录产物。
实施例5显微注射及胚胎移植
取C57BL/6背景小鼠的受精卵，利用显微注射仪将预混好的实施例4得到的DNA体外转录产物和Cas9mRNA，pUC57-huPD-1或pUC57-chiPD-1质粒注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到C57BL/6背景的首建鼠(即Founder鼠，为F0代)。将获得的小鼠通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的小鼠品系。
实施例6基因改造人源化小鼠的鉴定
1、基因型鉴定
分别使用两对引物对实施例5得到的F0代小鼠的鼠尾基因组DNA进行PCR分析，引物位置L-GT-F位于5’同源臂左侧，R-GT-R位于3’同源臂右侧，R-GT-F和L-GT-R均位于A片段上，具体序列如下：
5’端引物：
上游引物：L-GT-F(SEQ ID NO：23)：5’-CCAGAAGAAGGTACAGCAGAAGGGG-3’
下游引物：L-GT-R(SEQ ID NO：24)：5’-AAGCAGCGTATCCACATAGCGTAAA-3’
3’端引物：
上游引物：R-GT-F(SEQ ID NO：25)：5’-GTGCCTGTGTTCTCTGTGGACTATG-3’
下游引物：R-GT-R(SEQ ID NO：26)：5’-CTGGTCTTGAACTTTGATGGGCACG-3’
PCR反应体系(20μL)如表2所示：
表2 PCR反应体系(20μL)
2×PCR buffer 10μL
dNTP(2μM) 4μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
鼠尾基因组DNA 100ng
KOD-FX(1U/μL) 0.4μL
H<sub>2</sub>O 补至20μL
PCR扩增反应条件如表3所示：
表3 PCR扩增反应条件
如果重组载体插入位置正确，则应只有1条PCR条带，5’端引物产物长度应为2648bp，3’端引物产物长度应为2637bp或3070bp。在获得的7只F0代小鼠中共有4只经鉴定为表达人PD-1的阳性小鼠，分别为F0-1、F0-2、F0-6和F0-7，鉴定结果见图9。
对获得的F0代小鼠也获得多只鉴定为表达人源化PD-1的阳性小鼠，例如F0-1-chi、F0-2-chi、F0-3-chi、F0-5-chi、F0-6-chi和F0-7-chi，见图10。
2、F1代基因型鉴定
将F0代鉴定为阳性的小鼠与野生型C57BL/6小鼠交配得到F1代小鼠。对F1代鼠尾基因组DNA进行PCR分析。PCR条件及引物同F0代基因型鉴定。PCR(图11、12)实验结果与预期相符，显示分别由5只F1代表达人PD-1的小鼠(编号分别为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5)和4只F1代表达人源化PD-1的小鼠(编号为：F1-2-chi、F1-3-chi、F1-4-chi、F1-5-chi)为阳性小鼠表明使用本方法能构建出可稳定传代的PD-1基因人源化工程小鼠。
应用Southern blot对上述9只F1代阳性小鼠进行检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用AseI或ScaI酶分别消化基因组，转膜，杂交。探针P1、P2分别位于3’同源臂外侧及WPRE片段上。探针合成引物如下：
P1-F(SEQ ID NO：27)：5’-tcaacctcccaatgctaaccagaac-3’
P1-R(SEQ ID NO：28)：5’-cagactgttggatcaagtgctgtct-3’
P2-F(SEQ ID NO：29)：5’-gtggatacgctgctttaatgcc-3’
P2-R(SEQ ID NO：30)：5’-aagggagatccgactcgtctgag-3’
野生型的C57BL/6小鼠基因组经P1探针杂交只产生14.3kb的条带，P2探针无条带，制备成功的基因工程纯合子小鼠经P1探针杂交分别产生6.6kb和4.0kb大小的条带，杂合子小鼠分别产生14.3kb+6.6kb和4.0kb大小的条带，不会有其它杂交条带产生。
Southern blot检测结果见图13、14。实验结果(图13、14)显示9只小鼠均无随机插入，证实这5只表达人PD-1的小鼠(F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5)和4只表达人源化PD-1的小鼠(编号为：F1-2-chi、F1-3-chi、F1-4-chi、F1-5-chi)为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。
这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的PD-1基因人源化工程小鼠。
3、人源化小鼠的表达情况分析
取1只本方法得到的杂合子小鼠(3周龄)，另取2只野生型C57BL/6小鼠作为对照，给小鼠腹腔注射7.5μg鼠CD3(mCD3)抗体，24h后脱颈安乐死后取脾脏，研磨后过70μm细胞筛网，将过滤好的细胞悬液离心弃上清，加入红细胞裂解液，裂解5min后加入PBS溶液中和裂解反应，离心弃上清后用PBS清洗细胞1次，分为两组分别进行FACS检测。
第一组包括3只小鼠处理后的脾细胞，具体过程如下：用鼠Pd-1抗体PE anti-mouse CD279(PD-1)Antibody(mPD-1PE)和鼠源T细胞表面抗体PerCP/Cy55 Anti-mouseTCR Beta Chain Antibody(mTcRβPerCP)及人PD-1抗体APC anti-Human CD279(hPD-1APC)或抗人PD-1抗体FITC anti-human CD279(PD-1)Antibody(hPD-1FITC)和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。第二组只选择杂合子小鼠处理后的脾细胞，将其分为3份，随机选择1份为对照，另外2份随机加入抗人PD-1抗体药Nivolumab和Keytruda，然后用抗人Anti-Fab AF647(Alexa647AffiniPure F(ab')2Fragment Goat Anti-Human IgG,FcγFragment Specific)和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ对T细胞胞外蛋白同时进行染色，用PBS清洗细胞后，进行流式检测蛋白表达。
第一组的流式分析结果(如图15、16)显示，与未经刺激(图15A、D、G或图16A、D)和经过鼠CD3抗体刺激脾脏中T细胞激活后的C57BL/6小鼠(图15B、E、H或图16B、E)相比，人源PD-1抗体可以检测到人源化小鼠脾脏内表达人或人源化PD-1蛋白的细胞(图15F、15I、16F)；而在C57BL/6对照鼠的脾脏内未检测到表达人或人源化PD-1蛋白的细胞。
第二组的流式分析结果(如图17、18)显示，与对照组(图17A或18A)相比，人PD-1抗体Nivolumab(图17B、18B)和Keytruda(图17C、18C)与人源化PD-1小鼠杂合子体内活化的T细胞有很好的结合。
进一步的利用引物：mPD-1RT-PCR F3：5’-CCTGGCTCACAGTGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：31)，和mPD-1RT-PCR R3：5’-CAGGGCTCTCCTCGATTTTT-3’(SEQ ID NO：32)扩增大小为297bp的鼠Pd-1片段；
利用引物hPD-1RT-PCR F3：5’-CCCTGCTCGTGGTGACCGAA-3’(SEQ ID NO：37)，和hPD-1RT-PCR R3：5’-GCAGGCTCTCTTTGATCTGC-3’(SEQ ID NO：38)扩增大小为297bp的人PD-1片段。
PCR反应体系20μL，反应条件：95℃，5min；(95℃，30sec；60℃，30sec；72℃，30sec，35个循环)；72℃，10min；4℃保温。使用GAPDH作为内参。
实验结果显示(见图19、20)，野生型C57BL/6小鼠活化细胞中可检测到鼠Pd-1的mRNA表达但未检测到人或人源化PD-1的表达，hPD-1杂合子小鼠活化细胞中可同时检测到鼠Pd-1和人或人源化PD-1的mRNA表达。
实施例7基因改造人源化小鼠体内药效验证
取上述PD-1基因人源化工程小鼠纯合子(5-8周)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5×105/100μL PBS)，待肿瘤体积生长到约100mm3后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组(n＝5/组)。治疗组随机选择2种抗人PD-1抗体(Nivolumab、Pembrolizumab)，剂量分别为1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg，对照组注射等体积的生理盐水。给药频率为每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次并称量小鼠的体重，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm3时应执行安乐死结束试验。
整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好，在实验终点时，所有治疗组和对照组在整个实验周期内小鼠体重和体重变化均无明显区别(图21、22，图24、25)；但从肿瘤体积测量结果上看(图23，图26)，对照组小鼠肿瘤在实验周期内均持续生长，而所有治疗组小鼠，与对照组相比肿瘤体积增长呈现不同程度的抑制和/或缩小。表明这2种抗人PD-1抗体未对动物产生明显毒性作用，安全性较好，且具有不同的体内抑制肿瘤效果。
表4和表5中分别列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后11或14天时的肿瘤体积、实验结束时的肿瘤体积、小鼠存活情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGITV)以及治疗组与对照组的小鼠体重、肿瘤体积之间的统计学差异(P值)。
表4使用hu鼠的肿瘤体积、存活情况及体积抑制率
表5使用chi鼠的肿瘤体积、存活情况及体积抑制率
从表4、5可见，结合图21、22和图24、25可知在实验终点时，各组动物体重均出现增长且无明显差异，表明动物对2种抗人PD-1抗体耐受良好。从肿瘤体积测量结果来看，实验终点时，所有G2～G7治疗组小鼠肿瘤体积均明显小于对照组(G1)，表明不同剂量的抗人PD-1抗体Nivolumab和Pembrolizumab具有不同的抑制肿瘤生长效果，剂量高的治疗效果越好。
由此证明广泛使用的2种抗人PD-1抗体在PD-1基因人源化工程小鼠体内表现出不同的抑制肿瘤生长能力，且未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。
将植入的肿瘤细胞改造为表达人或人源化PD-L1的肿瘤细胞，则制备得到的肿瘤模型还可以用来研究和筛选靶向人PD-L1的调节剂。上述研究结果证明人源化PD-1动物模型可作为体内药效研究的活体模型，用于PD-1/PD-L1信号通路调节剂的筛选、评估和治疗实验，并可用于在动物体内评估靶向人PD-1/PD-L1信号通路的抗体的有效性及治疗效果等。
实施例8双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
包含人源PD-1基因的小鼠还可以用于制备双重人源化或多重人源化动物模型。如，前述实施例5中，显微注射及胚胎移植过程使用的受精卵细胞选择来源于其它基因修饰小鼠的受精卵细胞进行注射，或对PD-1基因人源化工程小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到PD-1人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。另外，也可将本方法得到的PD-1基因人源化动物模型纯合或杂合子与其它基因修饰纯合或杂合动物模型交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到PD-1人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合动物模型，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子动物模型。
以双重人源化PD-1/OX40小鼠的生成为例，由于小鼠Pd-1与Ox40基因不在同一条染色体上，可通过将本发明得到的PD-1基因人源化工程小鼠与包含人源OX40基因的小鼠(如B-hOX40小鼠)以自然交配或体外受精的方式进行繁殖，通过阳性子代小鼠的筛选和交配扩繁，最终得到双重PD-1/OX40人源化小鼠。
实施例9基于胚胎干细胞的制备方法
采用其它基因编辑系统和制备方法也可以得到本发明的非人哺乳动物，包括但不限于基于胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)的基因同源重组技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。本实施例以传统的ES细胞基因同源重组技术为例，阐述如何采用其它方法制备获得PD-1基因人源化小鼠。
鉴于本发明的目的之一是将小鼠PD-1基因的第1号外显子全部或部分用含有人PD-1基因的片段替换，根据本发明的基因编辑策略(图4、5)和人源化小鼠PD-1基因示意图(图2、3)，发明人设计了包含5’同源臂、3’同源臂和人源化基因片段的重组载体，在重组载体上构建了用于阳性克隆筛选的抗性基因，如新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统，如Frt或LoxP重组位点。进一步的，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。将构建正确的重组载体转染小鼠胚胎干细胞，如C57BL/6小鼠的胚胎干细胞，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的重组载体转染细胞进行筛选，并利用Southern Blot技术进行DNA重组鉴定。将筛选出的正确阳性克隆按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》中的方法将阳性克隆细胞(黑色鼠)通过显微注射进入已分离好的囊胚中(白色鼠)，注射后的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选基因正确重组的F0代嵌合鼠用于后续繁殖和鉴定。将F0代嵌合鼠与野生型鼠交配获得F1代鼠，通过提取鼠尾基因组和PCR检测，挑选可以稳定遗传的基因重组阳性F1代杂合子小鼠。再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得基因重组阳性F2代纯合子鼠。此外，可将F1代杂合鼠与Flp或Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(neo等)后，再通过互相交配即可得到基因人源化纯合子小鼠。对获得的F1代杂合或F2代纯合鼠进行基因型和表型检测的方法与前述实施例6一致。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 一种PD-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用
<130> 1
<160> 39
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1972
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠（Mouse）
<400> 1
tgagcagcgg ggaggaggaa gaggagactg ctactgaagg cgacactgcc aggggctctg 60
ggcatgtggg tccggcaggt accctggtca ttcacttggg ctgtgctgca gttgagctgg 120
caatcagggt ggcttctaga ggtccccaat gggccctgga ggtccctcac cttctaccca 180
gcctggctca cagtgtcaga gggagcaaat gccaccttca cctgcagctt gtccaactgg 240
tcggaggatc ttatgctgaa ctggaaccgc ctgagtccca gcaaccagac tgaaaaacag 300
gccgccttct gtaatggttt gagccaaccc gtccaggatg cccgcttcca gatcatacag 360
ctgcccaaca ggcatgactt ccacatgaac atccttgaca cacggcgcaa tgacagtggc 420
atctacctct gtggggccat ctccctgcac cccaaggcaa aaatcgagga gagccctgga 480
gcagagctcg tggtaacaga gagaatcctg gagacctcaa caagatatcc cagcccctcg 540
cccaaaccag aaggccggtt tcaaggcatg gtcattggta tcatgagtgc cctagtgggt 600
atccctgtat tgctgctgct ggcctgggcc ctagctgtct tctgctcaac aagtatgtca 660
gaggccagag gagctggaag caaggacgac actctgaagg aggagccttc agcagcacct 720
gtccctagtg tggcctatga ggagctggac ttccagggac gagagaagac accagagctc 780
cctaccgcct gtgtgcacac agaatatgcc accattgtct tcactgaagg gctgggtgcc 840
tcggccatgg gacgtagggg ctcagctgat ggcctgcagg gtcctcggcc tccaagacat 900
gaggatggac attgttcttg gcctctttga ccagattctt cagccattag catgctgcag 960
accctccaca gagagcaccg gtccgtccct cagtcaagag gagcatgcag gctacagttc 1020
agccaaggct cccagggtct gagctagctg gagtgacagc ccagcgcctg caccaattcc 1080
agcacatgca ctgttgagtg agagctcact tcaggtttac cacaagctgg gagcagcagg 1140
cttcccggtt tcctattgtc acaaggtgca gagctggggc ctaagcctat gtctcctgaa 1200
tcctactgtt gggcacttct agggacttga gacactatag ccaatggcct ctgtgggttc 1260
tgtgcctgga aatggagaga tctgagtaca gcctgctttg aatggccctg tgaggcaacc 1320
ccaaagcaag ggggtccagg tatactatgg gcccagcacc taaagccacc cttgggagat 1380
gatactcagg tgggaaattc gtagactggg ggactgaacc aatcccaaga tctggaaaag 1440
ttttgatgaa gacttgaaaa gctcctagct tcgggggtct gggaagcatg agcacttacc 1500
aggcaaaagc tccgtgagcg tatctgctgt ccttctgcat gcccaggtac ctcagttttt 1560
ttcaacagca aggaaactag ggcaataaag ggaaccagca gagctagagc cacccacaca 1620
tccagggggc acttgactct ccctactcct cctaggaacc aaaaggacaa agtccatgtt 1680
gacagcaggg aaggaaaggg ggatataacc ttgacgcaaa ccaacactgg ggtgttagaa 1740
tctcctcatt cactctgtcc tggagttggg ttctggctct ccttcacacc taggactctg 1800
aaatgagcaa gcacttcaga cagtcagggt agcaagagtc tagctgtctg gtgggcaccc 1860
aaaatgacca gggcttaagt ccctttcctt tggtttaagc ccgttataat taaatggtac 1920
caaaagcttt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1972
<210> 2
<211> 288
<212> PRT
<213> 小鼠(mouse)
<400> 1
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala
165 170 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val
180 185 190
Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp
195 200 205
Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala
210 215 220
Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro
225 230 235 240
Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly
245 250 255
Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln
260 265 270
Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 3
<211> 867
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 540
ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atctgctccc gggccgcacg agggacaata 600
ggagccaggc gcaccggcca gcccctgaag gaggacccct cagccgtgcc tgtgttctct 660
gtggactatg gggagctgga tttccagtgg cgagagaaga ccccggagcc ccccgtgccc 720
tgtgtccctg agcagacgga gtatgccacc attgtctttc ctagcggaat gggcacctca 780
tcccccgccc gcaggggctc agctgacggc cctcggagtg cccagccact gaggcctgag 840
gatggacact gctcttggcc cctctga 867
<210> 4
<211> 867
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aggcatggtc attggtatca tgagtgccct agtgggtatc 540
cctgtattgc tgctgctggc ctgggcccta gctgtcttct gctcaacaag tatgtcagag 600
gccagaggag ctggaagcaa ggacgacact ctgaaggagg agccttcagc agcacctgtc 660
cctagtgtgg cctatgagga gctggacttc cagggacgag agaagacacc agagctccct 720
accgcctgtg tgcacacaga atatgccacc attgtcttca ctgaagggct gggtgcctcg 780
gccatgggac gtaggggctc agctgatggc ctgcagggtc ctcggcctcc aagacatgag 840
gatggacatt gttcttggcc tctttga 867
<210> 5
<211> 589
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589
<210> 6
<211> 208
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtgccttc tagttgccag ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc 60
tggaaggtgc cactcccact gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc 120
tgagtaggtg tcattctatt ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt 180
gggaagacaa tagcaggcat gctgggga 208
<210> 7
<211> 1400
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gtcttgctac cctgagcatg ccagaaagac ataaaggtat aaaggaggct ctgtaacagc 60
caggcgtggg gaggggatcc ccctagcttc tgcccacagg ccccatgctg agactggagg 120
cggccagtct gtgcctcaca ctctttttcc atttctgtgc tgttcaaagt aatgtttcct 180
tccccaccaa gctagtgcct ctgaacctgg gtggctgagg cagttgccag atggtttcca 240
ggcgggctgc ctattttagg gtggtgagac ccacacatct cattgctaat attagcagtt 300
tcgttttccc tttttttccc attcactgtg gcgaaacaca gagagcagaa tgattaaatc 360
atcagaatgc cccagaaatg actagccagc caggtactat gcatgcacac aagtcggccc 420
accccaccta atcccagaga gacaagcagg aggtgaggtg ggcctccacc tcctagggac 480
tgaggaaagt tgactgggaa agacctagaa attgagtcta ccccagcctg gtgttaggtt 540
tttctcaggg gaagagaaag atgcagggca gcagagctag caaacctaag acaactatag 600
aagcagagaa aacagtgaga tccgggcagc agatccagca tcttgaaagg aagaaaagcc 660
ttaagagaaa gcaagaccag gcccagggtc tttctgaacc tacaggggtg tctggagagg 720
aaaggcatcg tctcgggtcc taggaaatgt tcactatagc ccttcgaggc ctcctctgac 780
ccatcaaacg ggagcatgtg ggatagctgg gctcttgctc ctcagtagta aaggactaag 840
gcatagctca gggcattcaa ggccacgcat ggcagacaag gtaggggagg gtccagcttg 900
ccctcgctgc ggccataggt accaaagcca ggcctcgaca cccaccctcc aaagggacaa 960
gagtctggcc ctagtttcag tctctctcag ccctgggagc taaggctcga tcggggtacc 1020
aggaatggaa aagaccaaac ctacccacaa gaggggctag aaatggagag gaccccatag 1080
caggacaaga ggcaaggaca gctagtcaga gagaaccccc cctctctgct ccccaatctc 1140
tcactagtcc cttacctgct cctcccaggc atcgttccct cccactcccc tcccccttcc 1200
atgcccctcc cccacctcta gttgcctgtt ctcccaccct tgtggaggtg gaggaagagg 1260
gggcgggagc caagaacagg tctcctccct ccaacatgac ctgggacagt ttcctttccg 1320
ctacagacaa ctctgcctga gcagcgggga ggaggaagag gagactgcta ctgaaggcga 1380
cactgccagg ggctctgggc 1400
<210> 8
<211> 1400
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtatgtggct cctagggatg tgggatcaat tggggttggt ggctggggca gggcttgaag 60
aaacgttcac cctcggttcc tattactgga ggggaggaac acctgtgtcc ctggttacac 120
ggattggctc ctggttacac agattggctt taggtgggtt ttacaggtga aatgccccct 180
ggggctcaaa atccaccccc tccttgcttt tagacagaca gaacatttat ctaacgtcag 240
ttgatcttct gtgtccctct ctgtgaagcg atggtaggtc tgaacagagc tctgacctca 300
gccactgctt caggattctg gcaggccctg gtatccttgg cctttctcta tgtttttcta 360
tggttgggga catccctaca tggagcctgc cctacacact gtatagatga ctgaagatcc 420
aagagtataa tcagctgtct accctcatgg acaagcttcc cgtgctagca tttctggggg 480
actcccgagt tcatatccct ggcctcatag catcctgggg gtggggggtg tgtgaaacgg 540
agaggtccag gaatcctgct caaattcctc acagtgaaaa cacagctccc tgtactcctt 600
actcctcact accctgtacc ccttggcccc tgcccaccct ctggactgag ccaaccttca 660
ctgagaacct ggtcctggga ccagagggaa ctttgtttct cctggatgtc aacaaactcc 720
taggtcagag ctacacctgc ggcgcatgga attgtggcct agacaagctt atactcttgt 780
gctgccttaa catctttgac ctgcaatgat gttcctttgc tcatatgacg tcccagtcac 840
cttcacccca gcctcttcac taccgtgaaa acaggatggg actgggagct gggtgctggg 900
tgcttaccac cacaggccct ctcctgggtt gcaggctaag gctggttggg aagccaggga 960
cattttccct ccacgtaccc tcttaagata gcccatggtt tgctgtcaag actggatgga 1020
ggaaacagac ctgaacatgg tagatggtct gaggccctag ggtgaaagat gtcccttggg 1080
gaaaccttgt caggaaaccc acggagcaaa gtcggaagga ttatgtgtca ttggagagaa 1140
gcaactgaga cagaaagggg actatgactc actctggtga cctggcacac tgggcatgtc 1200
cgcaaatgaa gctttgatga gacaatatgg agatacagat gtatttatgc aggcctactg 1260
tagattgtct ctgacaaatg tctcaaagtg gcatgcctcc ttcacgacct gaatagctca 1320
acgtgggaca cctcacaggc cagtgccatt tggcagccgt ggacctttag tctagtgcat 1380
ttcttccctc ctgattggcc 1400
<210> 9
<211> 1696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aaccctggtg gttggtgtcg tgggcggcct gctgggcagc 540
ctggtgctgc tagtctgggt cctggccgtc atctgctccc gggccgcacg agggacaata 600
ggagccaggc gcaccggcca gcccctgaag gaggacccct cagccgtgcc tgtgttctct 660
gtggactatg gggagctgga tttccagtgg cgagagaaga ccccggagcc ccccgtgccc 720
tgtgtccctg agcagacgga gtatgccacc attgtctttc ctagcggaat gggcacctca 780
tcccccgccc gcaggggctc agctgacggc cctcggagtg cccagccact gaggcctgag 840
gatggacact gctcttggcc cctctgaaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 900
ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 960
cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 1020
tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 1080
actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 1140
tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 1200
gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 1260
aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 1320
tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 1380
ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 1440
tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 1500
ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 1560
tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 1620
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 1680
gggaattaat agtact 1696
<210> 10
<211> 1740
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgacactgcc aggggctctg ggcatgcaga tcccacaggc gccctggcca gtcgtctggg 60
cggtgctaca actgggctgg cggccaggat ggttcttaga ctccccagac aggccctgga 120
acccccccac cttctcccca gccctgctcg tggtgaccga aggggacaac gccaccttca 180
cctgcagctt ctccaacaca tcggagagct tcgtgctaaa ctggtaccgc atgagcccca 240
gcaaccagac ggacaagctg gccgccttcc ccgaggaccg cagccagccc ggccaggact 300
gccgcttccg tgtcacacaa ctgcccaacg ggcgtgactt ccacatgagc gtggtcaggg 360
cccggcgcaa tgacagcggc acctacctct gtggggccat ctccctggcc cccaaggcgc 420
agatcaaaga gagcctgcgg gcagagctca gggtgacaga gagaagggca gaagtgccca 480
cagcccaccc cagcccctca cccaggccag ccggccagtt ccaaaccctg gtggttggtg 540
tcgtgggcgg cctgctgggc agcctggtgc tgctagtctg ggtcctggcc gtcatctgct 600
cccgggccgc acgagggaca ataggagcca ggcgcaccgg ccagcccctg aaggaggacc 660
cctcagccgt gcctgtgttc tctgtggact atggggagct ggatttccag tggcgagaga 720
agaccccgga gccccccgtg ccctgtgtcc ctgagcagac ggagtatgcc accattgtct 780
ttcctagcgg aatgggcacc tcatcccccg cccgcagggg ctcagctgac ggccctcgga 840
gtgcccagcc actgaggcct gaggatggac actgctcttg gcccctctga aatcaacctc 900
tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc 960
tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca 1020
ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg 1080
tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca 1140
ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg 1200
cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg 1260
acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg 1320
ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg 1380
accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc 1440
ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgca tcgataccgt cgacctcgac 1500
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct 1560
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct 1620
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg 1680
ggaagacaat agcaggcatg ctggggaatt aatagtactg tatgtggctc ctagggatgt 1740
<210> 11
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tctgggcatg tgggtccggc agg 23
<210> 12
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgtgggtccg gcaggtaccc tgg 23
<210> 13
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ctgcagttga gctggcaatc agg 23
<210> 14
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aggtaccctg gtcattcact tgg 23
<210> 15
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tgaatgacca gggtacctgc cgg 23
<210> 16
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
agttgagctg gcaatcaggg tgg 23
<210> 17
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cagggtggct tctaggtatg tgg 23
<210> 18
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
acagcccaag tgaatgacca ggg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gccaggggct ctgggcatgt ggg 23
<210> 20
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ttgagctggc aatcaggg 18
<210> 21
<211> 18
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ccctgattgc cagctcaa 18
<210> 22
<211> 140
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gtaaaacgac ggccagtgaa ttctaatacg actcactata ggttgagctg gcaatcaggg 60
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 120
ggcaccgagt cggtgctttt 140
<210> 23
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ccagaagaag gtacagcaga agggg 25
<210> 24
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aagcagcgta tccacatagc gtaaa 25
<210> 25
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gtgcctgtgt tctctgtgga ctatg 25
<210> 26
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ctggtcttga actttgatgg gcacg 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
tcaacctccc aatgctaacc agaac 25
<210> 28
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
cagactgttg gatcaagtgc tgtct 25
<210> 29
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gtggatacgc tgctttaatg cc 22
<210> 30
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aagggagatc cgactcgtct gag 23
<210> 31
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
cctggctcac agtgtcagag 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
cagggctctc ctcgattttt 20
<210> 33
<211> 288
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Gly Met Val Ile Gly Ile Met Ser Ala
165 170 175
Leu Val Gly Ile Pro Val Leu Leu Leu Leu Ala Trp Ala Leu Ala Val
180 185 190
Phe Cys Ser Thr Ser Met Ser Glu Ala Arg Gly Ala Gly Ser Lys Asp
195 200 205
Asp Thr Leu Lys Glu Glu Pro Ser Ala Ala Pro Val Pro Ser Val Ala
210 215 220
Tyr Glu Glu Leu Asp Phe Gln Gly Arg Glu Lys Thr Pro Glu Leu Pro
225 230 235 240
Thr Ala Cys Val His Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Thr Glu Gly
245 250 255
Leu Gly Ala Ser Ala Met Gly Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Leu Gln
260 265 270
Gly Pro Arg Pro Pro Arg His Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 34
<211> 2115
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 34
agtttccctt ccgctcacct ccgcctgagc agtggagaag gcggcactct ggtggggctg 60
ctccaggcat gcagatccca caggcgccct ggccagtcgt ctgggcggtg ctacaactgg 120
gctggcggcc aggatggttc ttagactccc cagacaggcc ctggaacccc cccaccttct 180
ccccagccct gctcgtggtg accgaagggg acaacgccac cttcacctgc agcttctcca 240
acacatcgga gagcttcgtg ctaaactggt accgcatgag ccccagcaac cagacggaca 300
agctggccgc cttccccgag gaccgcagcc agcccggcca ggactgccgc ttccgtgtca 360
cacaactgcc caacgggcgt gacttccaca tgagcgtggt cagggcccgg cgcaatgaca 420
gcggcaccta cctctgtggg gccatctccc tggcccccaa ggcgcagatc aaagagagcc 480
tgcgggcaga gctcagggtg acagagagaa gggcagaagt gcccacagcc caccccagcc 540
cctcacccag gccagccggc cagttccaaa ccctggtggt tggtgtcgtg ggcggcctgc 600
tgggcagcct ggtgctgcta gtctgggtcc tggccgtcat ctgctcccgg gccgcacgag 660
ggacaatagg agccaggcgc accggccagc ccctgaagga ggacccctca gccgtgcctg 720
tgttctctgt ggactatggg gagctggatt tccagtggcg agagaagacc ccggagcccc 780
ccgtgccctg tgtccctgag cagacggagt atgccaccat tgtctttcct agcggaatgg 840
gcacctcatc ccccgcccgc aggggctcag ctgacggccc tcggagtgcc cagccactga 900
ggcctgagga tggacactgc tcttggcccc tctgaccggc ttccttggcc accagtgttc 960
tgcagaccct ccaccatgag cccgggtcag cgcatttcct caggagaagc aggcagggtg 1020
caggccattg caggccgtcc aggggctgag ctgcctgggg gcgaccgggg ctccagcctg 1080
cacctgcacc aggcacagcc ccaccacagg actcatgtct caatgcccac agtgagccca 1140
ggcagcaggt gtcaccgtcc cctacaggga gggccagatg cagtcactgc ttcaggtcct 1200
gccagcacag agctgcctgc gtccagctcc ctgaatctct gctgctgctg ctgctgctgc 1260
tgctgctgcc tgcggcccgg ggctgaaggc gccgtggccc tgcctgacgc cccggagcct 1320
cctgcctgaa cttgggggct ggttggagat ggccttggag cagccaaggt gcccctggca 1380
gtggcatccc gaaacgccct ggacgcaggg cccaagactg ggcacaggag tgggaggtac 1440
atggggctgg ggactcccca ggagttatct gctccctgca ggcctagaga agtttcaggg 1500
aaggtcagaa gagctcctgg ctgtggtggg cagggcagga aacccctcca cctttacaca 1560
tgcccaggca gcacctcagg ccctttgtgg ggcagggaag ctgaggcagt aagcgggcag 1620
gcagagctgg aggcctttca ggcccagcca gcactctggc ctcctgccgc cgcattccac 1680
cccagcccct cacaccactc gggagaggga catcctacgg tcccaaggtc aggagggcag 1740
ggctggggtt gactcaggcc cctcccagct gtggccacct gggtgttggg agggcagaag 1800
tgcaggcacc tagggccccc catgtgccca ccctgggagc tctccttgga acccattcct 1860
gaaattattt aaaggggttg gccgggctcc caccagggcc tgggtgggaa ggtacaggcg 1920
ttcccccggg gcctagtacc cccgccgtgg cctatccact cctcacatcc acacactgca 1980
cccccactcc tggggcaggg ccaccagcat ccaggcggcc agcaggcacc tgagtggctg 2040
ggacaaggga tcccccttcc ctgtggttct attatattat aattataatt aaatatgaga 2100
gcatgctaag gaaaa 2115
<210> 35
<211> 288
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 35
Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro Asp Arg Pro Trp
20 25 30
Asn Pro Pro Thr Phe Ser Pro Ala Leu Leu Val Val Thr Glu Gly Asp
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser Glu Ser Phe Val
50 55 60
Leu Asn Trp Tyr Arg Met Ser Pro Ser Asn Gln Thr Asp Lys Leu Ala
65 70 75 80
Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp Cys Arg Phe Arg
85 90 95
Val Thr Gln Leu Pro Asn Gly Arg Asp Phe His Met Ser Val Val Arg
100 105 110
Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala Glu Leu Arg Val
130 135 140
Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Thr Leu Val Val Gly Val Val Gly Gly
165 170 175
Leu Leu Gly Ser Leu Val Leu Leu Val Trp Val Leu Ala Val Ile Cys
180 185 190
Ser Arg Ala Ala Arg Gly Thr Ile Gly Ala Arg Arg Thr Gly Gln Pro
195 200 205
Leu Lys Glu Asp Pro Ser Ala Val Pro Val Phe Ser Val Asp Tyr Gly
210 215 220
Glu Leu Asp Phe Gln Trp Arg Glu Lys Thr Pro Glu Pro Pro Val Pro
225 230 235 240
Cys Val Pro Glu Gln Thr Glu Tyr Ala Thr Ile Val Phe Pro Ser Gly
245 250 255
Met Gly Thr Ser Ser Pro Ala Arg Arg Gly Ser Ala Asp Gly Pro Arg
260 265 270
Ser Ala Gln Pro Leu Arg Pro Glu Asp Gly His Cys Ser Trp Pro Leu
275 280 285
<210> 36
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
tgccaggggc tctgggcatg cagatcccac aggcgccctg gccagtcgtc tgggcggtgc 60
tacaactggg ctggcggcca ggatggttct tagactcccc agacaggccc tggaaccccc 120
ccaccttctc cccagccctg ctcgtggtga ccgaagggga caacgccacc ttcacctgca 180
gcttctccaa cacatcggag agcttcgtgc taaactggta ccgcatgagc cccagcaacc 240
agacggacaa gctggccgcc ttccccgagg accgcagcca gcccggccag gactgccgct 300
tccgtgtcac acaactgccc aacgggcgtg acttccacat gagcgtggtc agggcccggc 360
gcaatgacag cggcacctac ctctgtgggg ccatctccct ggcccccaag gcgcagatca 420
aagagagcct gcgggcagag ctcagggtga cagagagaag ggcagaagtg cccacagccc 480
accccagccc ctcacccagg ccagccggcc agttccaagg catggtcatt ggtatcatga 540
gtgccctagt gggtatccct gtattgctgc tgctggcctg ggccctagct gtcttctgct 600
caacaagtat gtcagaggcc agaggagctg gaagcaagga cgacactctg aaggaggagc 660
cttcagcagc acctgtccct agtgtggcct atgaggagct ggacttccag ggacgagaga 720
agacaccaga gctccctacc gcctgtgtgc acacagaata tgccaccatt gtcttcactg 780
aagggctggg tgcctcggcc atgggacgta ggggctcagc tgatggcctg cagggtcctc 840
ggcctccaag acatgaggat ggacattgtt cttggcctct ttgaaatcaa cctctggatt 900
acaaaatttg tgaaagattg actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg 960
gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct 1020
cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc tttatgagga gttgtggccc gttgtcaggc 1080
aacgtggcgt ggtgtgcact gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg ggcattgcca 1140
ccacctgtca gctcctttcc gggactttcg ctttccccct ccctattgcc acggcggaac 1200
tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc actgacaatt 1260
ccgtggtgtt gtcggggaaa tcatcgtcct ttccttggct gctcgcctgt gttgccacct 1320
ggattctgcg cgggacgtcc ttctgctacg tcccttcggc cctcaatcca gcggaccttc 1380
cttcccgcgg cctgctgccg gctctgcggc ctcttccgcg tcttcgcctt cgccctcaga 1440
cgagtcggat ctccctttgg gccgcctccc cgcatcgata ccgtcgacct cgactgtgcc 1500
ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg 1560
tgccactccc actgtccttt cctaataaaa tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag 1620
gtgtcattct attctggggg gtggggtggg gcaggacagc aagggggagg attgggaaga 1680
caatagcagg catgctgggg aattaatagt actgtatgtg gc 1722
<210> 37
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
ccctgctcgt ggtgaccgaa 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gcaggctctc tttgatctgc 20
<210> 39
<211> 1696
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
atgcagatcc cacaggcgcc ctggccagtc gtctgggcgg tgctacaact gggctggcgg 60
ccaggatggt tcttagactc cccagacagg ccctggaacc cccccacctt ctccccagcc 120
ctgctcgtgg tgaccgaagg ggacaacgcc accttcacct gcagcttctc caacacatcg 180
gagagcttcg tgctaaactg gtaccgcatg agccccagca accagacgga caagctggcc 240
gccttccccg aggaccgcag ccagcccggc caggactgcc gcttccgtgt cacacaactg 300
cccaacgggc gtgacttcca catgagcgtg gtcagggccc ggcgcaatga cagcggcacc 360
tacctctgtg gggccatctc cctggccccc aaggcgcaga tcaaagagag cctgcgggca 420
gagctcaggg tgacagagag aagggcagaa gtgcccacag cccaccccag cccctcaccc 480
aggccagccg gccagttcca aggcatggtc attggtatca tgagtgccct agtgggtatc 540
cctgtattgc tgctgctggc ctgggcccta gctgtcttct gctcaacaag tatgtcagag 600
gccagaggag ctggaagcaa ggacgacact ctgaaggagg agccttcagc agcacctgtc 660
cctagtgtgg cctatgagga gctggacttc cagggacgag agaagacacc agagctccct 720
accgcctgtg tgcacacaga atatgccacc attgtcttca ctgaagggct gggtgcctcg 780
gccatgggac gtaggggctc agctgatggc ctgcagggtc ctcggcctcc aagacatgag 840
gatggacatt gttcttggcc tctttgaaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 900
ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 960
cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 1020
tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 1080
actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 1140
tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 1200
gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 1260
aaatcatcgt cctttccttg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 1320
tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 1380
ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 1440
tgggccgcct ccccgcatcg ataccgtcga cctcgactgt gccttctagt tgccagccat 1500
ctgttgtttg cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc 1560
tttcctaata aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg 1620
ggggtggggt ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg 1680
gggaattaat agtact 1696

Claims (38)

1.一种构建人源化非人动物模型的方法，其特征在于，所述人源化非人动物模型基因组中含有人PD-1基因，所述的人PD-1基因通过非人动物内源性调控元件调控。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人PD-1基因为人PD-1基因的编码序列，所述的人PD-1基因的编码序列通过非人动物内源性调控元件调控。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的人源化非人动物模型基因组中含有重组DNA片段，所述重组DNA片段包括人PD-1基因和非人动物Pd-1基因，所述重组DNA片段通过非人动物内源性调控元件调控。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的重组DNA片段为人PD-1基因的编码序列与非人动物Pd-1基因的编码序列的拼接序列。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述的重组DNA片段包括编码胞外结构域、跨膜区和胞内结构域的序列，其中，重组DNA片段中编码胞外结构域的序列包含编码人PD-1蛋白序列的全部或部分，重组DNA片段中编码胞内结构域的序列包含编码非人动物PD-1蛋白序列的全部或部分，所述编码人PD-1蛋白的序列与编码所述非人动物PD-1蛋白的序列通过序列拼接连接于内源性非人动物Pd-1基因的启动子后；优选的，重组DNA片段中编码跨膜区的部分包含编码非人动物PD-1蛋白序列的全部或部分。
6.根据权利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述的非人动物为啮齿类动物；优选的，所述的啮齿类动物为小鼠。
7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述的人源化非人动物模型基因组中还含有辅助序列，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA；优选的，所述的辅助序列与人PD-1基因的编码序列通过序列拼接或所述的辅助序列与所述的重组DNA片段通过序列拼接。
8.根据权利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行PD-1基因人源化非人动物模型的构建，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的DNA同源重组技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术；优选的，使用基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术进行PD-1人源化非人动物模型的构建。
9.根据权利要求1-8任一所述的方法，其特征在于，包括导入人PD-1基因或重组DNA片段，使得该人PD-1基因或重组DNA片段在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人或人源化PD-1蛋白，同时消除或降低了非人动物或其子代的内源/动物来源的PD-1蛋白的表达。
10.根据权利要求1-9任一所述的方法，其特征在于，包括将所述的人PD-1基因或重组DNA片段导入非人动物的第1号外显子位置。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，使用sgRNA靶向小鼠的Pd-1基因，所述的sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：11-19任一项所示；优选的，使用的sgRNA靶位点序列为SEQ ID NO：16。
12.根据权利要求1-11任一所述的方法，其特征在于，所述的人源化非人动物模型体内可表达人或人源化PD-1蛋白，所述的人源化PD-1蛋白选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：33所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：33所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：33所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：33所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
或
f)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：35所示；
g)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQ IDNO：35所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
h)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
i)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
j)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：35所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
13.根据权利要求1-12任一所述的方法，其特征在于，所述的人源化非人动物模型基因组中包含嵌合PD-1基因，所述的嵌合PD-1基因表达人或人源化PD-1蛋白，所述的嵌合PD-1基因选自下列组中的一种：
a)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因编码人PD-1蛋白序列；
b)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因的DNA序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示；
c)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸杂交的基因序列；
d)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
e)所述的人PD-1基因的编码序列如SEQ ID NO：3所示；
f)所述的人PD-1基因的编码序列为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：3所示的核苷酸杂交的基因序列；
g)所述的人PD-1基因的编码序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
h)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因编码人源化PD-1蛋白序列；
i)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因的DNA序列如SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示；
j)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示的核苷酸杂交的基因序列；
k)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
l)所述的重组DNA片段编码人源化PD-1蛋白序列；
m)所述的重组DNA片段如SEQ ID NO：4所示；
n)所述的重组DNA片段为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：4所示的核苷酸杂交的基因序列；
o)所述的重组DNA片段转录的mRNA序列与SEQ ID NO：4所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
p)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因的mRNA序列如SEQ ID NO：34所示；
q)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：34所示的核苷酸杂交的基因序列；
r)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因的mRNA序列与SEQ ID NO：34所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
14.一种权利要求1-13任一所述的方法构建的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，其特征在于，所述的人源化动物模型或其子代表达人或人源化PD-1蛋白。
15.一种靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。
16.根据权利要求15所述的靶向载体，其特征在于，所述的待改变的转换区位于Pd-1基因的第1号外显子。
17.根据权利要求16所述的靶向载体，其特征在于，所述的5’臂序列如SEQ ID NO：7所示；所述3’臂序列如SEQ ID NO：8所示。
18.根据权利要求15-17任一所述的靶向载体，其特征在于，所述的插入或替换的供体DNA序列片段来自人；优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列如SEQ ID NO：3或SEQ IDNO：9或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：39所示。
19.一种能够特异的靶向Pd-1基因的sgRNA序列，其特征在于，所述的sgRNA序列在小鼠Pd-1基因的靶位点位于小鼠Pd-1基因的第1号外显子上；所述的sgRNA序列靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：11-19任一项所示；优选的，sgRNA靶向的靶位点序列如SEQ ID NO：16所示。
20.一种包含权利要求19所述sgRNA序列的构建体。
21.一种细胞，其特征在于，所述的细胞包含权利要求15-18任一所述的靶向载体，和/或一种或多种权利要求19所述的sgRNA序列，和/或一种或多种权利要求20所述的构建体，和/或权利要求20所述构建体的体外转录产物；优选的，所述细胞包含权利要求15-18任一所述的靶向载体和一种或多种权利要求20所述的构建体的体外转录产物。
22.一种PD-1基因人源化细胞株，其特征在于，所述人源化细胞株的基因组中包含人PD-1基因的编码序列或重组DNA片段，该人源化细胞株体内可表达人或人源化PD-1蛋白，同时内源Pd-1蛋白表达降低或缺失。
23.一种构建多基因人源化非人动物的方法，其特征在于，包括
(a)利用权利要求14所述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代；
(b)将步骤(a)的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代与其他人源化动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化非人动物的方法。
24.根据权利要求23所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)中其他人源化动物选自基因OX-40、PD-L1、CD40、CD47、SIPRA、ICOS、GITR、TIGIT、4-1BB、TIM-3、LAG-3、CD28或CD27人源化中的一种或两种以上。
25.根据权利要求23-24任一所述的方法构建的多基因人源化非人动物模型或其子代。
26.一种权利要求15-18任一所述的靶向载体、权利要求19所述的sgRNA序列或权利要求20所述的构建体或权利要求21所述的细胞在构建包含PD-1人源化非人动物或其子代中的应用。
27.一种荷瘤动物模型，其特征在于，来源于权利要求14所述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，或权利要求25所述的多基因人源化非人动物模型或其子代。
28.一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，其特征在于，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于权利要求14所述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，或权利要求25所述的多基因人源化非人动物模型或其子代，或权利要求27所述的荷瘤动物模型。
29.一种组织或器官或其培养物，其特征在于，所述组织或器官或其培养物来源于权利要求14所述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代，或权利要求25所述的多基因人源化非人动物模型或其子代，或权利要求27所述的荷瘤动物模型。
30.一种嵌合PD-1蛋白，其特征在于，所述的嵌合PD-1蛋白包括胞外结构域、跨膜区和胞内结构域，其中，所述胞外结构域包含人PD-1蛋白的全部或部分，所述胞内结构域包含非人动物PD-1蛋白的全部或部分；优选的，所述跨膜区为非人动物来源。
31.根据权利要求30所述的嵌合PD-1蛋白，其特征在于，所述的嵌合PD-1蛋白选自下列组中的一种：
a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；
b)由核酸序列编码的氨基酸序列，所述核酸序列在低严谨条件下，与编码SEQ ID NO：33所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
c)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：33所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)所述氨基酸序列与SEQ ID NO：33所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：33所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列；
或
f)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列如SEQ ID NO：35所示；
g)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列，在其核酸序列低严谨条件下，与编码SEQ IDNO：35所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
h)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸的同一性程度为至少大约为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
i)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列与SEQ ID NO：35所示的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；
j)所述氨基酸序列中人PD-1蛋白的序列具有SEQ ID NO：35所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸的氨基酸序列。
32.一种嵌合PD-1基因，其特征在于，所述的嵌合PD-1基因表达人或人源化PD-1蛋白，所述的嵌合PD-1基因选自下列组中的一种：
a)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因编码人PD-1蛋白序列；
b)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因的DNA序列如SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示；
c)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸杂交的基因序列；
d)所述的嵌合PD-1基因包含人PD-1基因的编码序列、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
e)所述的人PD-1基因的编码序列如SEQ ID NO：3所示；
f)所述的人PD-1基因的编码序列为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：3所示的核苷酸杂交的基因序列；
g)所述的人PD-1基因的编码序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：3所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
h)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因编码人源化PD-1蛋白序列；
i)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因的DNA序列如SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示；
j)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示的核苷酸杂交的基因序列；
k)所述的嵌合PD-1基因包含重组DNA片段、WPRE及polyA，所述的嵌合PD-1基因序列转录的mRNA序列与SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：36所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
l)所述的重组DNA片段编码人源化PD-1蛋白序列；
m)所述的重组DNA片段如SEQ ID NO：4所示；
n)所述的重组DNA片段为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：4所示的核苷酸杂交的基因序列；
o)所述的重组DNA片段转录的mRNA序列与SEQ ID NO：4所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；
或
p)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因的mRNA序列如SEQ ID NO：34所示；
q)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因为在低严谨条件下，与SEQ ID NO：34所示的核苷酸杂交的基因序列；
r)所述嵌合PD-1基因中人PD-1基因的mRNA序列与SEQ ID NO：34所示的核苷酸具有至少大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列。
33.人源化小鼠PD-1基因的基因组DNA，其特征在于，所述的基因组DNA序列转录获得的mRNA逆转录后得到的DNA序列，与权利要求32所述的基因序列一致或互补。
34.一种表达人源化小鼠PD-1蛋白的构建体。
35.一种包含权利要求34所述构建体的细胞。
36.一种包含权利要求35所述细胞的组织。
37.一种权利要求14所述的PD-1基因人源化非人动物模型或其子代、权利要求25所述的多基因人源化非人动物模型或其子代、权利要求27所述的荷瘤动物模型、权利要求28所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、权利要求29所述的组织或器官、权利要求30-31任一所述的嵌合PD-1蛋白、权利要求32所述的嵌合PD-1基因、权利要求33所述的基因组DNA、权利要求34所述的构建体、权利要求35所述的细胞、权利要求36所述的组织在与PD-1基因或者蛋白相关的领域中的应用。
38.根据权利要求37所述的应用，其特征在于，所述的应用包括在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用或在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用或在体内研究、人PD-1/PD-L1信号通路调节剂的筛选、药效检测、筛选文库、疗效评估、筛选、验证、评价或研究PD-1基因功能研究、人PD-1抗体、PD-L1抗体，针对人PD-1、PD-L1靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物方面的用途。
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Applicant after: Baccetus (Beijing) Pharmaceutical Technology Co.,Ltd.

Address before: 101111 room 1201-1210, incubation center, 88 Kechuang 6th Street, Ludong District, Daxing District, Beijing

Applicant before: BEIJING BIOCYTOGEN Co.,Ltd.

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GR01 Patent grant
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