CN113774086A - A2ar基因人源化非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种A2AR基因人源化的非人动物及其构建方法、一种人源化A2AR蛋白、一种人源化A2AR基因、一种A2AR基因的靶向载体和其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将编码人A2AR蛋白的核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化A2AR蛋白，可以作为人A2AR信号机理研究、心脑血管疾病、神经性疾病、肿瘤及自身免疫性疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点、神经靶点以及防治心脑血管疾病靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

A2AR基因人源化非人动物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种A2AR基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

A2AR全称Adenosine A2a Receptor，又称ADORA2A，属于G蛋白偶联受体家族，在机体中广泛分布，在中枢神经系统、外周、心、肝、肺、肾等组织均有表达；在细胞水平上，A2AR除了表达于γ氨基酸(GCBA)能神经元、多巴胺能神经元、外周组织实质细胞外，在T细胞、B细胞、中性粒细胞、小胶质细胞、单核巨噬细胞、血小板、内皮细胞、成纤维细胞、NK细胞等多种免疫细胞上呈现高水平表达，参与心血管系统、泌尿系统、免疫系统、神经系统等多种生理病理过程的调节。

在肿瘤微环境中，免疫细胞上的A2AR通过与免疫抑制代谢物——腺苷相结合，抑制免疫细胞响应能力，效应T细胞的A2AR被激活后阻断T细胞激活受体信号传递，抑制干扰素分泌和细胞毒作用；APC细胞表面的A2AR被激活后会抑制Th1型细胞因子分泌，诱导免疫耐受，效应T细胞和APC细胞的相互作用会抑制抗癌细胞的活化；Treg表面的A2AR被激活后会引起细胞增殖，抑制免疫反应。此外，腺苷还能促进癌细胞的增殖、存活和转移活性。

A2AR在腺苷介导的对抗心肌缺血再灌注损伤(IRI)机制中起重要作用，A2AR与腺苷结合后激活腺苷酸环化酶，促使环腺苷酸cAMP含量增加，细胞内游离钙减少，从而抑制多种因素诱发的血小板聚集释放反应，减少血栓形成。同时抑制中性粒细胞及内皮细胞，从而阻止IRI中性白细胞与内皮细胞相互作用所生成的炎性物质，降低TNFα、IL6 mRNA和NF-κB水平。

A2AR在中枢神经系统中主要表达于纹状体、听神经核和嗅结，在皮层、海马、下丘脑及小脑等部位也有少量表达。研究发现，阻断A2AR活性可以减少缺血性脑损伤，缩小梗死面积，改善神经功能。同时，拮抗或阻断A2AR能有效减轻运动障碍，还可明显减轻帕金森氏病的进展。

此外，A2AR同时广泛存在于关节、皮肤等部分，其激活还可以促进皮肤伤口愈合；还有研究表明，A2A受体激动剂可以降低器官移植中的排斥反应。大量临床研究和动物实验研究已经证实，A2AR是多种疾病治疗的重要靶标。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即，利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N,Snaith M,Wolf CR,Seibler J.Generation and utility of geneticallyhumanized mouse models,Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。

目前关于A2AR基因的动物模型主要为基因敲除鼠，而且主要用于新生儿缺氧缺血性脑病相关疾病机制研究。鉴于A2AR在肿瘤、自身免疫性疾病、心脑血管疾病、神经性疾病等多种疾病发生过程中的广泛参与性以及靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化A2AR信号通路相关的非人动物模型。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种A2AR基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化A2AR蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源A2AR蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的人源化A2AR蛋白包含人A2AR蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人A2AR蛋白的全部或部分由人A2AR基因的任一转录本翻译，进一步优选的，翻译自转录本NM_001278497.1。

优选的，所述的人源化A2AR蛋白包含与SEQ ID NO：2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化A2AR蛋白包含人A2AR核苷酸序列的3号和/或4号外显子编码的氨基酸序列，进一步优选的，所述的人源化A2AR蛋白包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子编码的氨基酸序列，更优选的，包含从人A2AR核苷酸序列的起始密码子开始至终止密码子为止编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化A2AR蛋白至少包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9编码的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR蛋白中包含的人A2AR蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的全部或部分；

B)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

C)包含SEQ ID NO：2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，

D)包含SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物体内包含人或人源化A2AR基因。

优选的，所述的非人动物体内包含编码人A2AR蛋白的全部或部分核苷酸序列；进一步优选的，包含编码与SEQ ID NO：2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物体内包含人A2AR核苷酸序列的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子的全部或部分，更优选的，包含人A2AR核苷酸序列的3号和/或4号外显子的全部或部分，优选还包含3-4号内含子，其中，所述人A2AR的核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR基因中至少包含SEQ ID NO：6、7、8所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：6、7、8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物体内包含的人A2AR核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：

(A)包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(C)包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR基因还包括非人动物A2AR基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分和/或3号外显子的部分；优选的，所述的非人动物A2AR基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分和/或3号外显子的部分与NC_000076.6相应的1号外显子、2号外显子、3号外显子至少具有70％、75％、80％、85％、90％或至少95％的同一性；进一步优选的，所述的非人动物A2AR基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分和/或3号外显子的部分与SEQ ID NO：1相应的1号外显子、2号外显子、3号外显子一致。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(d)包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化A2AR基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

优选的，所述的人A2AR核苷酸序列的部分或人源化A2AR基因的核苷酸序列可操作的连接至内源调控元件后。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了一种A2AR基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化A2AR蛋白。

优选的，所述的非人动物为上述的A2AR基因人源化的非人动物。

优选的，所述的人源化A2AR基因在非人动物体内通过内源或外源调控元件进行调控。进一步优选的，所述的调控元件为启动子。

优选的，所述的构建方法包括用包含人A2AR核苷酸序列的部分插入或替换到非人动物A2AR基因座上；进一步优选的，用包含人A2AR核苷酸序列的1号至4号外显子的全部或部分插入或替换到非人动物A2AR基因座上，更优选的，用包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子的全部或部分插入或替换到非人动物A2AR基因座上，更进一步优选的，用包含人A2AR核苷酸序列的3号和/或4号外显子的全部或部分插入或替换到非人动物A2AR基因座上，更进一步优选的，用包含人A2AR的基因的核苷酸序列的3号外显子的部分、4号外显子的部分核苷酸序列插入或替换至非人动物基因座上，进一步优选的，包含3-4号内含子；其中，所述人A2AR的核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止，优选的，用包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9的核苷酸序列插入或替换至非人动物基因座上。

优选的，所述的构建方法包括用包含人A2AR的基因的核苷酸序列的3号至4号外显子全部或部分插入非人动物A2AR核苷酸序列的1号至3号外显子的全部或部分；其中，所述人A2AR的核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止，进一步优选的，用包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9的核苷酸序列替换非人动物A2AR核苷酸序列的2号至3号外显子的全部或部分；所述非人动物A2AR核苷酸序列包含编码非人动物2号外显子的部分、3号外显子的部分核苷酸序列，优选的，包含2-3号内含子，其中，所述非人动物A2AR核苷酸序列的2号外显子的部分至少包含从非人动物A2AR核苷酸序列的起始密码子开始至2号外显子最后1个核苷酸为止，3号外显子的部分至少包含从3号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人A2AR蛋白的全部或部分核苷酸序列插入或替换到非人动物A2AR基因座上，进一步优选的，用包含编码与SEQ ID NO：2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含编码与SEQ IDNO：2所示氨基酸序列一致的核苷酸序列插入或替换到非人动物A2AR基因座上。

优选的，所述的人A2AR蛋白的全部或部分由人A2AR基因的任一转录本翻译，进一步优选的，翻译自转录本NM_001278497.1。

所述的构建方法包括用包含人或人源化A2AR基因的核苷酸序列导入非人动物A2AR基因座，优选用包含人A2AR基因的1号至4号外显子的全部或部分导入非人动物A2AR基因座，进一步优选用3号至4号外显子的全部或部分导入非人动物A2AR基因座，进一步优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：5的核苷酸序列导入非人动物A2AR基因座。

优选的，所述的插入或替换位点为A2AR基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源A2AR基因的编码框，随后进行插入操作，或者所述的插入步骤既可给内源A2AR基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化A2AR基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人A2AR蛋白或人源化A2AR蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人A2AR核苷酸序列的部分；进一步优选的，所述的人A2AR核苷酸序列的部分包含人A2AR的1号至4号外显子的全部或部分核苷酸序列；更优选的，所述的人A2AR核苷酸序列的部分包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子的全部或部分，更进一步优选的，所述的人A2AR核苷酸序列的部分包含人A2AR核苷酸序列的3号和/或4号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含3号外显子的部分和4号外显子的部分，其中，所述人A2AR的核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止，更进一步优选的，包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含与非人动物A2AR基因中的一段序列的5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物A2AR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：3所示。

优选的，所述的靶向载体还包含与非人动物A2AR基因中的一段序列的3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物A2AR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：4所示。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人A2AR核苷酸序列的部分。

优选的，所述的人A2AR核苷酸序列的部分包含人A2AR核苷酸序列的1号至4号外显子的全部或部分；进一步优选的，所述的人A2AR核苷酸序列的部分包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人A2AR核苷酸序列的部分包含人A2AR核苷酸序列的3号和/或4号外显子的全部或部分，更进一步优选的，包含3号外显子的部分和4号外显子的部分，其中，所述人A2AR的核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止，优选的，包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

优选的，所述的靶向载体还包含与非人动物A2AR基因中的一段序列的5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物A2AR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：3所示。

优选的，所述的靶向载体还包含与非人动物A2AR基因中的一段序列的3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物A2AR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述的非人动物A2AR基因中的一段序列位于非人动物A2AR基因座上，进一步优选的，所述的非人动物A2AR基因中的一段序列位于非人动物A2AR基因2号至3号外显子上。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因，进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因，更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因，进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统，进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)，所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。

本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在A2AR基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第六方面，提供了一种人源化A2AR蛋白，所述的人源化A2AR蛋白包含人A2AR蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人A2AR蛋白的全部或部分由人A2AR基因的任一转录本翻译，进一步优选的，翻译自转录本NM_001278497.1。优选的，所述的人源化A2AR蛋白包含与SEQ IDNO：2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列一致的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化A2AR蛋白包含人A2AR核苷酸序列的3号和/或4号外显子编码的氨基酸序列，更优选的，所述的人源化A2AR蛋白包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子编码的氨基酸序列，进一步优选的包含从人A2AR核苷酸序列的起始密码子开始至终止密码子为止编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化A2AR蛋白至少包含SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9编码的氨基酸序列，或包含与SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：9具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR蛋白中包含的人A2AR蛋白的部分氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的全部或部分；

B)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

C)包含SEQ ID NO：2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，

D)包含SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的第七方面，提供了一种人源化A2AR基因，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR基因的部分。

优选的，所述的人源化A2AR基因包含编码人A2AR蛋白的全部或部分核苷酸序列；优选的，包含编码与SEQ ID NO：2具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化A2AR基因编码上述的人源化A2AR蛋白。

优选的，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的1号外显子至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子的全部或部分，更优选的，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的3号和/或4号外显子的全部或部分，其中，所述人A2AR的核苷酸序列的3号外显子的部分至少包含从起始密码子开始至3号外显子最后一个核苷酸为止，4号外显子的部分至少包含从4号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子为止。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR基因中至少包含SEQ ID NO：6、7、8所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：6、7、8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR基因中包含的人A2AR核苷酸序列的部分选自下列组中的一种：

(A)包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(C)包含与SEQ ID NO：5示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR基因还包括非人动物A2AR基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分和/或3号外显子的部分；优选的，所述的非人动物A2AR基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分和/或3号外显子的部分与NC_000076.6相应的1号外显子、2号外显子、3号外显子至少具有70％、80％、90％或至少95％的同一性；进一步优选的，所述的非人动物A2AR基因的1号外显子的全部、2号外显子的部分和/或3号外显子的部分与SEQ ID NO：1相应的1号外显子、2号外显子、3号外显子一致。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、鸡、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物，进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子，更优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠，更进一步优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化A2AR基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(d)包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化A2AR基因还包括特异性诱导物或阻遏物，进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第八方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

I)提供上述的A2AR基因人源化的非人动物或A2AR基因敲除的非人动物，或者采用上述的构建方法获得的A2AR基因人源化的非人动物；

II)将步骤I)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括但不限于基因PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3或CD73修饰的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

本发明的第九方面，提供了一种上述构建方法获得的非人动物或其子代，所述的非人动物或其子代选自A2AR基因人源化的非人动物、A2AR基因敲除的非人动物或者多基因修饰的非人动物。

本发明的第十方面，提供了一种动物的疾病模型，所述的疾病模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物，或者，上述的非人动物或其子代，优选的，所述的疾病包括心脑血管疾病、神经性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。

本发明的第十一方面，提供了一种动物的疾病模型的制备方法，所述的制备方法包括上述A2AR基因人源化的非人动物、A2AR基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物的步骤；优选的，所述的疾病包括心脑血管疾病、神经性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤或炎症，进一步优选的，还包括植入肿瘤细胞的步骤。

本发明的第十二方面，提供了上述A2AR基因人源化的非人动物、上述A2AR基因敲除的非人动物、上述构建方法获得的A2AR基因人源化的非人动物、上述A2AR基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代在制备动物的疾病模型中的应用，优选的，所述的疾病包括心脑血管疾病、神经性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤或炎症。

本发明的第十三方面，提供了上述的非人动物或其子代、上述的构建方法获得的非人动物或上述的疾病模型在制备治疗心脑血管疾病、神经性疾病、自身免疫性疾病、肿瘤和/或炎症的药物中的应用。

本发明的第十四方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的疾病模型。

本发明的第十五方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的疾病模型。

本发明的第十六方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。

本发明的第十七方面，提供了一种A2AR基因人源化的细胞，所述的细胞表达人A2AR蛋白或人源化A2AR蛋白。

优选的，所述的人源化A2AR蛋白选自上述的人源化A2AR蛋白。

优选的，所述的细胞中内源A2AR蛋白的表达降低或缺失。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人A2AR核苷酸序列的部分，进一步优选的，所述的细胞包含上述的人源化A2AR基因。

本发明的第十八方面，提供了一种A2AR基因敲除的细胞，所述的细胞中缺失A2AR基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的细胞缺失A2AR基因的2号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列。

本发明的第十九方面，提供了一种表达上述的人源化A2AR蛋白的构建体，优选的，所述的构建体中包含上述人源化A2AR基因。

本发明的第二十方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。

本发明的第二十一方面，提供了一种包含上述细胞的组织。

本发明的第二十二方面，提供了来源于上述的人源化A2AR蛋白、上述的人源化A2AR基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的疾病模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究A2AR功能、人A2AR信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，心脑血管疾病、神经性疾病或免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

本发明的第二十三方面，提供了上述A2AR基因人源化的非人动物、上述A2AR基因敲除的非人动物、上述构建方法获得的A2AR基因人源化的非人动物、上述A2AR基因敲除的非人动物或多基因修饰的非人动物或其子代在制备人A2AR特异性调节剂或者筛选人A2AR特异性调节剂的产品中的应用。

本发明的第二十四方面，提供了一种人A2AR特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向个体施加调节剂，检测调节效果；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物，进一步优选的，所述的药物为化学药、核苷类药物或抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述的筛选方法还包括向个体植入肿瘤的步骤。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述人A2AR特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十五方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行调节效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的疾病模型。

优选的，所述的评价方法还包括向个体植入肿瘤细胞。

优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗，进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白，所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法，该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十六方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或疾病模型在制备治疗心脑血管疾病、神经性疾病、肿瘤、炎症或自身免疫性疾病的药物中的用途。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤选自B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤。优选包括B或T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病(AML)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)和多发性骨髓瘤(MM)、鼻咽癌、肺癌。

本发明所述的“自身免疫性疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“炎症”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症(浆液性炎、纤维素性炎、化脓性炎、出血性炎、坏死性炎、卡他性炎)、增生性炎症、特异性炎症(结核、梅毒、麻疯、淋巴肉芽肿等)。

本发明所述的“心血管疾病”包括但不限于冠心病(心脏病发作)、脑血管疾病(中风)、高血压(血压升高)、周围血管疾病、风湿性心脏病、先天性心脏病、深静脉血栓和肺栓塞、心力衰竭以及心肌病。

本发明所述的“神经性疾病”包括但不限于脑血管疾病、周期性麻痹、进行性肌营养不良、强直性肌营养不良、共济失调。

本发明保护的主题“细胞”、“细胞或细胞系或原代细胞培养物”、“组织”、“组织或器官或其培养物”均不能发育为动物，其中，所述的细胞不是干细胞或受精卵细胞，所述的细胞可以是体细胞、淋巴细胞(优选为T细胞或B细胞)或肿瘤细胞等等，所述的组织可以是脾脏、淋巴结、骨髓、肿瘤或其培养物等等。

本发明所述的A2AR基因人源化的非人动物体内可以正常表达人A2AR蛋白或人源化A2AR蛋白。可用于针对人A2AR靶位点的药物筛选、药效评估、心脑血管疾病、神经性疾病、自身免疫性疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。对于研究A2AR蛋白功能及相关疾病药物筛选提供了有效的保障。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化A2AR蛋白”，包含来源于人A2AR蛋白的部分。其中，所述的“人A2AR蛋白”同“人A2AR蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人A2AR蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人A2AR蛋白的部分”，为连续或间隔的5-412个氨基酸序列与人A2AR蛋白的氨基酸序列一致。优选为连续或间隔10-412，更优选为连续5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、350、400、410、412个氨基酸序列与人A2AR蛋白的氨基酸序列一致。

本发明所述的“人源化A2AR基因”，包含来源于人A2AR核苷酸序列的部分和非人A2AR基因的部分。其中，所述的“人A2AR核苷酸序列”同“人A2AR核苷酸序列的全部”，即其核苷酸序列与人A2AR核苷酸序列的全长核苷酸序列一致。所述的“人A2AR核苷酸序列的部分”为连续或间隔的20-18764bp个核苷酸序列与人A2AR核苷酸序列一致，优选为20-8085个，更优选为20、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、8085、9000、10000、11000、12000、13000、14000、15000、16000、17000、18000、18500、18600、18700、18764bp个核苷酸序列与人A2AR核苷酸序列一致。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“1号至4号外显子”包含1号外显子、1-2号内含子、2号外显子、2-3号内含子、3号外显子、3-4号内含子、4号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人A2AR核苷酸序列的3号外显子的部分，包含连续或间隔的5-606bp个，优选10-332bp个核苷酸序列与人A2AR核苷酸序列的3号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化A2AR基因”中包含的“3号外显子的部分”至少包括从3号外显子编码氨基酸序列的起始密码子开始至1号外显子的最后一个核苷酸序列为止。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“A2AR基因座”表示A2AR基因1号至3号外显子上的任选一段的DNA片段。优选为1号外显子、2号外显子、3号外显子或其期间的内含子中的任一个或两个或多个的组合，或一个或两个或多个的全部或部分，更优选为A2AR基因的2号至3号外显子上。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述的“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除，且是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述的“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、NOD-Prkdcscid IL-2rgnull背景的小鼠。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sa mbrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA C loning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.G aited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A Practical Guide ToMolecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelson andM.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154a nd155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，e d.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.，1987，ColdSpring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And Mole cularBiology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbo ok OfExperimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；andManipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor Laboratory Pres s，ColdSpring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：人和小鼠A2AR基因对比示意图(非按比例)；

图2：人源化A2AR基因座示意图，其中，chiExon1对应mExon1，chiExon2和chiExon3对应hExon4和mExon3(非按比例)；

图3：A2AR打靶策略示意图(非按比例)；

图4：F1代A2AR人源化小鼠基因型检测结果，其中PC为阳性对照，WT为野生型对照，H₂O为水对照，F1-01、F1-02为小鼠编号；

图5：C57BL/6小鼠和A2AR基因人源化小鼠体内A2AR RT-PCR检测结果，其中+/+为C57BL/6小鼠，H/H为A2AR基因人源化纯合子小鼠，H₂O为水对照，GAPDH为甘油醛-3-磷酸脱氢酶内参；

图6：C57BL/6小鼠和A2AR基因人源化小鼠体内A2AR流式检测结果，其中，WT为野生型C57BL/6小鼠，H/H为A2AR基因人源化纯合子小鼠；

图7：C57BL/6野生型小鼠和A2AR基因人源化纯合子小鼠脾脏中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图8：C57BL/6野生型小鼠和A2AR基因人源化纯合子小鼠脾脏中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图9：C57BL/6野生型小鼠和A2AR基因人源化纯合子小鼠外周血中白细胞亚群占比的流式检测结果；

图10：C57BL/6野生型小鼠和A2AR基因人源化纯合子小鼠外周血中T细胞亚群占比的流式检测结果；

图11：A2AR人源化小鼠和C57BL/6小鼠的cAMP检测结果，其中，G1组为C57BL/6脾细胞，G2组为C57BL/6骨髓细胞，G3组为A2AR人源化小鼠脾细胞，G4组为A2AR人源化小鼠骨髓细胞；

图12：A2AR重组后细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

C57BL/6小鼠和Flp工具鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD45 Antibody购自Biolegend，货号103138；

PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain Antibody购自Biolegend，货号109228；

Adenosine A2aR Antibody(7F6-G5-A2)(m/hA2AR-PE)购自Novus Biological，货号NBP1-39474；

Brilliant Violet 421^TManti-mouse CD4(mCD4-BV421)购自Biolegend，货号100438；

Purified anti-mouse CD16/32Antibody(mCD4)购自Biolegend，货号101302；

FITC anti-mouse F4/80Antibody(mF4/80-FITC)购自Biolegend，货号123108；

PE anti-mouse CD8a Antibody(mCD8a-PE)购自Biolegend，货号100708；

PE/Cy^TM7Mouse anti-mouse NK1.1 Antibody(mNK1.1-PE)购自BD Pharminge n，货号552878；

APC anti-mouse/rat Foxp3 Antibody(mFoxp3-APC)购自eBioscience，货号17-5773-82；

FITC anti-Mouse CD19 Antibody(mCD19-FITC)购自Biolegend，货号115506；

PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain Antibody(mTCRβ)购自Biolegend，货号109228；

APC Hamster Anti-Mouse TCRβChain Antibody(mTCRβ-APC)购自BD Pharmingen，货号553174；

Brilliant Violet 605^TManti-mouse CD11c Antibody(mCD11c)购自Biolegend，货号117334；

PE anti-mouse/human CD11b Antibody(m/hCD11c-PE)购自Biolegend，货号101208；

Ultra cAMP Kit，购自PerkinElmer，货号TRF0262。

实施例1 A2AR基因人源化小鼠的制备

小鼠A2AR基因(NCBI Gene ID：11540，Primary source：MGI：99402，UniProt I D：Q60613，位于10号染色体NC_000076.6的第75316877至75334792位，基于转录本NM_009630.3及其编码蛋白NP_033760.2(SEQ ID NO：1))和人A2AR基因(NCBI G ene ID：135，Primary source：HGNC：263，UniProt ID：P29274，位于22号染色体N C_000022.11的第24423597至24442360位，基于转录本NM_001278497.1及其编码蛋白NP_001265426.1(SEQID NO：2))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源A2AR基因座引入编码人A2AR蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化A2AR蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源A2AR基因座上用人A2AR基因的核苷酸序列(例如DNA序列、cDNA序列等)替换小鼠相应序列，如将至少包含小鼠A2AR基因的起始密码子ATG至终止密码子TGA的约7.9kb的序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化A2AR基因座(示意图如图2所示)，实现对小鼠A2AR基因的人源化改造，其中，需要说明的是，该人源化改造方法适用于人A2AR基因任意转录本对小鼠A2AR基因的各转录本的改造。

进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠A2AR基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人A2AR DNA序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000076.6第75321789至75326028位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000076.6第75335143至75339958位核苷酸序列相同；人A2AR DNA片段(SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000022.11的第24433405至24441489位核苷酸序列相同。A片段中人A2AR DNA片段上游与小鼠的连接设计为

其中序列“ccgcc”中的最后一个“c”是鼠的最后一个核苷酸，序列

中的“a”是人的第一个核苷酸，人A2AR DNA片段下游与小鼠的连接设计为

其中序列“cctga”中的“a”是人的最后一个核苷酸，序列

中的第一个“g”是小鼠的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠的连接设计为

内，其中序列“gcgcc”的最后一个“c”是小鼠的最后一个核苷酸，序列

的“C”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠的连接设计为

内，其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列

的第一个“c”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠A2AR的mRNA序列如SEQ ID NO：9所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入野生型小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR检测外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术(《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型小鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到A2AR基因人源化纯合子小鼠。

可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(PCR检测引物序列及目的片段长度如表1所示)。示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图4，其中，编号为F1-01、F1-02的2只小鼠为阳性杂合小鼠。

表1 PCR检测引物序列及目的片段长度

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人A2AR的mRNA和蛋白表达情况，例如可以使用RT-PCR检测A2AR人源化小鼠体内A2AR mRNA的表达。具体来说，分别选取野生型C57BL/6小鼠和本方法制备的A2AR基因人源化纯合子小鼠各1只，脱颈安乐死后取脾脏细胞，设计如表2所示引物序列对C57BL/6小鼠和A2AR基因人源化纯合子小鼠脾脏细胞的mRNA表达情况进行检测。结果显示，在C57BL/6小鼠脾脏细胞中仅检测到鼠A2AR mRNA的表达；在A2AR基因人源化纯合子小鼠脾脏细胞中只能检测到人源化A2AR mRNA的表达，未检测到鼠A2ARmRNA的表达(图5)。

表2 RT-PCR检测引物序列及目的片段长度

经PCR鉴定为阳性的克隆再通过Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，分别用AseI或ScaI或SspI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，酶、探针及目的片段长度如表3所示)检测，Southern Blot检测结果如图4所示，分别用SacI、NcoI、HindIII或DraIII消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，酶、探针及目的片段长度如表3所示，Southern Blot检测结果如图12所示，实验结果表明9个经PCR验证为阳性的胚胎干细胞中，ES-01、ES-03、ES-04和ES-07为阳性克隆。

表3 Southern Blot酶和探针表

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				SacI	3’Probe	11.6kb	9.7kb
NcoI	5’Probe	5.5kb	7.8kb
				HindIII	Neo Probe	--	17.4kb
DraIII	Neo Probe	--	7.1kb

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

5’Probe-F：5’-GGGGTTCTTCCTGCATCTCCAGTTAC-3’(SEQ ID NO：25)，

5’Probe-R：5’-ACTAAACATCAAACCCACAGGAGAGGGA-3’(SEQ ID NO：26)；

3’探针(3’Probe)：

3’Probe-F：5’-TCAATCCTACACTTTCCCGTCTGT-3’(SEQ ID NO：27)，

3’Probe-R：5’-TCTCTCCCAGGTCTTCTCCAGCA-3’(SEQ ID NO：28)；

Neo探针(Neo Probe)：

Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGA-3’(SEQ ID NO：29)，

Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAG-3’(SEQ ID NO：30)。

进一步采用流式细胞术检测A2AR基因人源化小鼠体内A2AR蛋白的表达情况。选取8周龄野生型C57BL/6小鼠和13周龄A2AR基因人源化纯合子小鼠各1只，腹腔注射7.5ug/200uL抗鼠CD3抗体(mCD3)刺激24小时后取脾脏细胞，经固定和破膜后分别用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD45、鼠源T细胞表面抗体Per CP/Cy5.5 anti-mouseTCRβchain、抗鼠CD4抗体Brilliant Violet 421^TManti-mouse CD 4(mCD4-BV421)以及抗鼠/人A2AR交叉抗体Adenosine A2aR Antibody(7F6-G5-A2)(m/hA2AR-PE)对小鼠的脾脏细胞识别染色后进行流式检测，检测结果如图6所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠(图6A)和A2AR基因人源化纯合子小鼠(图6B)脾脏中均能检测人或鼠A2AR蛋白的表达。结合图5的RT-PCR检测，可以确定图6的流式检测结果中，C57BL/6小鼠体内表达的只能是鼠A2AR蛋白，A2AR基因人源化纯合子小鼠体内表达的是人A2AR蛋白。以上表明本实施例成功构建出可表达人A2AR蛋白的A2AR基因人源化小鼠。

进一步对野生型C57BL/6小鼠和A2AR人源化纯合子小鼠脾脏和外周血中的白细胞和T细胞免疫分型情况进行流式检测。取6周龄野生型C57BL/6小鼠和A2AR基因人源化纯合子小鼠各3只，取外周血后，安乐死，取脾脏细胞。经固定和破膜后分别用抗鼠CD16/32抗体Purified anti-mouse CD16/32Antibody、抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TManti-mouse CD45 Antibody、抗鼠Gr-1抗体PerCP anti-mouse Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)Antibody、抗鼠CD4抗体Brilliant Violet 421^TManti-mouse CD4 Antibody、抗鼠F4/80抗体FITC anti-mouse F4/80Antibody、抗鼠CD8a抗体PE anti-mouse CD8a Antibod y、抗鼠NK1.1抗体PE/Cy^TM7Mouse anti-mouse NK1.1 Antibody、抗鼠Foxp3抗体APC anti-mouse/rat Foxp3Antibody、抗鼠CD19抗体FITC anti-Mouse CD19 Antibod y、抗鼠TCRβ抗体PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain Antibody、抗鼠TCRβ抗体AP C Hamster Anti-Mouse TCRβChainAntibody、抗鼠CD11c抗体Brilliant Violet 605^TMa nti-mouse CD11c Antibody、抗人/鼠CD11b抗体PE anti-mouse/human CD11b Antibody对小鼠的脾脏细胞和外周血细胞识别染色后进行流式检测，脾脏中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图7和图8所示，外周血中白细胞亚型和T细胞亚型检测结果分别如图9和图10所示，从图中可以看出，A2AR基因人源化纯合子小鼠脾脏样本中B细胞(B Cell)、T细胞(T Cell)、NK细胞(NK Cell)、CD4+T细胞(CD4)、CD8+T细胞(CD8)、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞(DC Cell)、巨噬细胞(Macrophage)和单核细胞(Monocyte)等白细胞亚型与C57BL/6野生型小鼠一致(图7和9)，CD4+T细胞(CD4)、CD8+T细胞(CD8)和Tregs细胞(Treg cell)等T细胞亚型百分比与C57BL/6野生型小鼠一致(图8和10)。上述结果表明A2AR基因的人源化改造没有影响小鼠体内白细胞和T细胞的分化、发育和在脾脏和外周血中的分布。

进一步通过cAMP检测，验证A2AR基因人源化纯合子小鼠的胞内信号通路。CGS21680是诺华公司研制的A2AR激动剂，目前处于临床前开发阶段，该药物对人和鼠的A2AR均具有亲和性。取6周龄野生型C57BL/6小鼠和A2AR基因人源化纯合子小鼠各1只，安乐死，提取脾脏细胞和骨髓细胞，与不同浓度的A2AR激动剂CGS21680(0n M、0.5μM、5μM、50μM和500μM)进行孵育后，利用

Ultra cAMP Kit试剂盒检测cAMP含量。检测结果如图11所示，在本底水平(CGS21680浓度为0nM、0.5μM、5μM和50μM)，A2AR人源化纯合子小鼠脾细胞和骨髓细胞cAMP水平与C57BL/6小鼠无显著差异，A2AR基因人源化纯合子小鼠(G3和G4)与C57BL/6鼠(G1和G2)的A2AR对于介导cAMP通路功能无明显差异；在较强的刺激下(CGS21680浓度为500μM)，相较于C57BL/6，A2AR人源化纯合子小鼠脾细胞和骨髓细胞cAMP水平显著高于C57BL/6小鼠，表明高浓度CGS21680下，A2AR人源化纯合子小鼠对C GS21680刺激的敏感性高于野生小鼠。说明本发明实施例的A2AR基因的人源化小鼠的A2AR蛋白能正常表达，并介导下游cAMP通路。

实施例2体内药效验证

利用本方法制得的A2AR人源化小鼠可以用于评估靶向人A2AR的调节剂的药效。例如，取A2AR人源化小鼠纯合子皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38，待肿瘤体积生长到约100mm³后根据肿瘤体积分为对照组或治疗组，治疗组随机选择靶向人A2AR的化合物X、Y、Z等，对照组注射等体积的生理盐水。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重，可通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小即可有效评估化合物的体内安全性和体内药效。

实施例3双基因或多基因人源化小鼠

利用本方法或制得的A2AR基因人源化小鼠还可以制备双基因修饰或多基因修饰的小鼠模型。如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3、CD73等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在人源化A2AR小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得A2AR与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的A2AR小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到A2AR基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人A2AR和其它基因调节剂的体内药效验证等。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> A2AR基因人源化非人动物及其构建方法和应用

<130> 1

<150> 2020108489134

<151> 2020-08-21

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 410

<212> PRT

<213> Mouse

<400> 1

Met Gly Ser Ser Val Tyr Ile Met Val Glu Leu Ala Ile Ala Val Leu

1 5 10 15

Ala Ile Leu Gly Asn Val Leu Val Cys Trp Ala Val Trp Ile Asn Ser

20 25 30

Asn Leu Gln Asn Val Thr Asn Phe Phe Val Val Ser Leu Ala Ala Ala

35 40 45

Asp Ile Ala Val Gly Val Leu Ala Ile Pro Phe Ala Ile Thr Ile Ser

50 55 60

Thr Gly Phe Cys Ala Ala Cys His Gly Cys Leu Phe Phe Ala Cys Phe

65 70 75 80

Val Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ile Phe Ser Leu Leu Ala Ile Ala

85 90 95

Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Ile Arg Ile Pro Leu Arg Tyr Asn Gly Leu

100 105 110

Val Thr Gly Met Arg Ala Lys Gly Ile Ile Ala Ile Cys Trp Val Leu

115 120 125

Ser Phe Ala Ile Gly Leu Thr Pro Met Leu Gly Trp Asn Asn Cys Ser

130 135 140

Gln Lys Asp Glu Asn Ser Thr Lys Thr Cys Gly Glu Gly Arg Val Thr

145 150 155 160

Cys Leu Phe Glu Asp Val Val Pro Met Asn Tyr Met Val Tyr Tyr Asn

165 170 175

Phe Phe Ala Phe Val Leu Leu Pro Leu Leu Leu Met Leu Ala Ile Tyr

180 185 190

Leu Arg Ile Phe Leu Ala Ala Arg Arg Gln Leu Lys Gln Met Glu Ser

195 200 205

Gln Pro Leu Pro Gly Glu Arg Thr Arg Ser Thr Leu Gln Lys Glu Val

210 215 220

His Ala Ala Lys Ser Leu Ala Ile Ile Val Gly Leu Phe Ala Leu Cys

225 230 235 240

Trp Leu Pro Leu His Ile Ile Asn Cys Phe Thr Phe Phe Cys Ser Thr

245 250 255

Cys Gln His Ala Pro Pro Trp Leu Met Tyr Leu Ala Ile Ile Leu Ser

260 265 270

His Ser Asn Ser Val Val Asn Pro Phe Ile Tyr Ala Tyr Arg Ile Arg

275 280 285

Glu Phe Arg Gln Thr Phe Arg Lys Ile Ile Arg Thr His Val Leu Arg

290 295 300

Arg Gln Glu Pro Phe Arg Ala Gly Gly Ser Ser Ala Trp Ala Leu Ala

305 310 315 320

Ala His Ser Thr Glu Gly Glu Gln Val Ser Leu Arg Leu Asn Gly His

325 330 335

Pro Leu Gly Val Trp Ala Asn Gly Ser Ala Pro His Ser Gly Arg Arg

340 345 350

Pro Asn Gly Tyr Thr Leu Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Thr Gln Gly

355 360 365

Ser Pro Gly Asp Val Glu Leu Leu Thr Gln Glu His Gln Glu Gly Gln

370 375 380

Glu His Pro Gly Leu Gly Asp His Leu Ala Gln Gly Arg Val Gly Thr

385 390 395 400

Ala Ser Trp Ser Ser Glu Phe Ala Pro Ser

405 410

<210> 2

<211> 412

<212> PRT

<213> Human

<400> 2

Met Pro Ile Met Gly Ser Ser Val Tyr Ile Thr Val Glu Leu Ala Ile

1 5 10 15

Ala Val Leu Ala Ile Leu Gly Asn Val Leu Val Cys Trp Ala Val Trp

20 25 30

Leu Asn Ser Asn Leu Gln Asn Val Thr Asn Tyr Phe Val Val Ser Leu

35 40 45

Ala Ala Ala Asp Ile Ala Val Gly Val Leu Ala Ile Pro Phe Ala Ile

50 55 60

Thr Ile Ser Thr Gly Phe Cys Ala Ala Cys His Gly Cys Leu Phe Ile

65 70 75 80

Ala Cys Phe Val Leu Val Leu Thr Gln Ser Ser Ile Phe Ser Leu Leu

85 90 95

Ala Ile Ala Ile Asp Arg Tyr Ile Ala Ile Arg Ile Pro Leu Arg Tyr

100 105 110

Asn Gly Leu Val Thr Gly Thr Arg Ala Lys Gly Ile Ile Ala Ile Cys

115 120 125

Trp Val Leu Ser Phe Ala Ile Gly Leu Thr Pro Met Leu Gly Trp Asn

130 135 140

Asn Cys Gly Gln Pro Lys Glu Gly Lys Asn His Ser Gln Gly Cys Gly

145 150 155 160

Glu Gly Gln Val Ala Cys Leu Phe Glu Asp Val Val Pro Met Asn Tyr

165 170 175

Met Val Tyr Phe Asn Phe Phe Ala Cys Val Leu Val Pro Leu Leu Leu

180 185 190

Met Leu Gly Val Tyr Leu Arg Ile Phe Leu Ala Ala Arg Arg Gln Leu

195 200 205

Lys Gln Met Glu Ser Gln Pro Leu Pro Gly Glu Arg Ala Arg Ser Thr

210 215 220

Leu Gln Lys Glu Val His Ala Ala Lys Ser Leu Ala Ile Ile Val Gly

225 230 235 240

Leu Phe Ala Leu Cys Trp Leu Pro Leu His Ile Ile Asn Cys Phe Thr

245 250 255

Phe Phe Cys Pro Asp Cys Ser His Ala Pro Leu Trp Leu Met Tyr Leu

260 265 270

Ala Ile Val Leu Ser His Thr Asn Ser Val Val Asn Pro Phe Ile Tyr

275 280 285

Ala Tyr Arg Ile Arg Glu Phe Arg Gln Thr Phe Arg Lys Ile Ile Arg

290 295 300

Ser His Val Leu Arg Gln Gln Glu Pro Phe Lys Ala Ala Gly Thr Ser

305 310 315 320

Ala Arg Val Leu Ala Ala His Gly Ser Asp Gly Glu Gln Val Ser Leu

325 330 335

Arg Leu Asn Gly His Pro Pro Gly Val Trp Ala Asn Gly Ser Ala Pro

340 345 350

His Pro Glu Arg Arg Pro Asn Gly Tyr Ala Leu Gly Leu Val Ser Gly

355 360 365

Gly Ser Ala Gln Glu Ser Gln Gly Asn Thr Gly Leu Pro Asp Val Glu

370 375 380

Leu Leu Ser His Glu Leu Lys Gly Val Cys Pro Glu Pro Pro Gly Leu

385 390 395 400

Asp Asp Pro Leu Ala Gln Asp Gly Ala Gly Val Ser

405 410

<210> 3

<211> 4240

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggtaaggctg ggattgtaga acccaggaag aaacccactg cagctgcaat gggcagtgtg 60

tgtactgccc tgtcccctct gcttggccgg agcaggagca gtgtgtgcag gcctgcctgt 120

gagctcgtag acacatctag cagggtctgg agccaccacc tgggcctgtg tacacagagc 180

ttcgggtggc tcaggagaga tgtgggttgg gattaaatga ttttaattaa agtggctggt 240

tcaggatggg agcgaatggg gacgaagagg cggcaatgct aaatctgaat gctgggcggc 300

cgagcggctg ttccttcaag gctctcgact catgttccac agtatgtgcc tggaggtgac 360

ctgggacagt gtctgtgctc taccctgtcc ccaacagtga cccatcataa ggaaatgtat 420

tattaatatt taatttcccc ccttggctag caacagatga ctcaaggatt agtccgatag 480

agccaacaga gagggatagg aaattgctag atcctggcgc tacactggcc ccttctcctg 540

ggccccaaac cttcctgtga ccctggagca gcggttctca accttcctaa tgctgtgacc 600

ctttaataca gttcctcatg ttggagtaac ctcccccctg caccccaacc ataaaatgat 660

ttccgttgct acttcataac taattttgtt cctgttatga atcacagtgt aaatattctg 720

ggagatagag gttttccaaa agagacccac aggttaagga caacctgtgc cgcgggagct 780

tcacgaggag gaaggtctcc cgcagcatcc cttggcattc cctagcggct aagccacgct 840

ttaacattcc cggtaaagcc gagagtcttt tcacctgttt gggttctggc ttctcctcta 900

aaagattgag ttcaccagga aatcaaggac atagctttca gccactttcc aaaatgccat 960

gagcatgcat gagttcctca gtggggccca gtgtagtctt ggtattcaga tcgacagcca 1020

cctggacaac accgggctta gtggttcagc cgcagctagc atctcttggc cctgagtgct 1080

gctcagtccg gtcagtgaaa ccttagtagg cttggattgt cccagtggga acgttcatac 1140

tacaaagaaa agctacacgt caaggtgccc tggccctgag ctatttagct gtgtgcctac 1200

agctagacag cctcagcctt ctgcctacag ggctcctccc tcctgtctgt cctgagaatg 1260

tctcagagct ctactgatct gccggacttg gggctgggga aggcacaaag gaaaagaaga 1320

tttgggtttg gcagctgccc aggtggcccc aggatcagag gagctttccc ctgggatgcg 1380

aagcaataac taagggcctg caggaatgtt gaaggaaggg cagaggaaag ggccctggga 1440

caggaacctc tagcgtgtct cagccaaagc aaggcggcct ggcaggaggg ccagctgtgt 1500

tgagactgga gatctgcaga acagcttcgg cgcagtcagg aagagtactg gggtccagaa 1560

atatccaaca tgggcccagc acggaacacg agaagccttg agaactggca atactcaggc 1620

aggtaccaga gcggctggga gagcttcagg gaaaaaaaaa aaaaggcctg ggttaggccc 1680

ctgcatagct ggtgtcctgg tggctatgga gtcagtggtg ttacttgggg gaaaatactg 1740

gtggtgtgac cagaagcagc agcagggctt taggctcagg gatggagcca tctcacctcg 1800

acagaaatgt ttatgctcca ctgtgttcca ctggggacac tgaggatgga aaaatgttaa 1860

ggcctgggtc agccttttag catgggctgg tctgattgca gactgcttca gtgccctcta 1920

gtgaagattc cactagagaa gccctaaggg acataggtgg ttatcctttg tcccgaggag 1980

acgccagtca ggagagtcag cattcagggg ctcactggga ctgatggggc ctgaatggac 2040

agtgagtccg ctgctgcttc aaattctgaa agctagaaca ggagctattt tagtcatgga 2100

cctgttgtgg ccagatggac ccctgatgaa tgctgctgta aacacagagg gacatggtat 2160

gtacctggag gtggcacccg taccagatct ggccattctg tccagaatgt gagttataaa 2220

cagctcgttg gcaagtagct tgtgcaaagc tgggactcac aaggacttag ccataggtgt 2280

ctctgcctga ccttaggagc aatggcatca cttagggaca gtaattccgt cagttgctgc 2340

agactttgtc ttctccttcc aaaccttcag tcagcctcgt aggtgacaaa ggacaagctg 2400

cagctgtagc cacgctgact ctagactgaa gcactggcaa catcgcagaa gcaagcgtgc 2460

ggttcatttc ctttagctct ccattttacc tctcggccaa tttcaggtgg agaggaccct 2520

tctccccagt cctcctgttc cactcatcca tcctgtcctt gaggagagaa ggaaagatgt 2580

gtctacatgc aggggtctga aaattagcct ctagcttctt gttcctagca ggcacatctg 2640

aggtcccatg caggtcaagt actgcaaagg atggactgga gggcgggggt aggggtgtcg 2700

tgggatcctt tggttcttgc ctggggaata acaggctatt gggagagtcc tgcttacgat 2760

gaagttttgc aagctcatgg agcataccct ggggagtttg ggctcagctg gggccctgct 2820

gcggagagag caggacttcc cctttccagg ggtctcagct cttcctgtga gctgacactg 2880

tgactctagg gtagcctttc caaatctacg gataagcgct gaaaggagcc ctcggtatca 2940

tctgggaccc aaaggtgtta cagtctgact ggagaaacgg aggcccggga acgaaaagca 3000

ttcttgccca cggtcctcca atgagtcctt actgagcacc tgtttttcta agctgcattc 3060

cctgcctcag ttaggtaggc agagggacag gagaggcgag gtgtgggagg aaagcgggag 3120

gcggatccct cagagaaggg aagcaatcgc agcgcctgcc ctgcctggct gtgcagcctg 3180

ctggcaggag cgctcttgct ctcggagcag tgggcttggc ttggaccctg ctcttgctgc 3240

ctacaagggt aaggatgctt acttgctgaa actggaggat agataggacg ggaaggctcc 3300

cagatctctc cagaaaggag ctctggggag tgtctgaggt gaccttaggg gcaggggtgt 3360

ctctcaggtg gggatggtag tatcctgaag ggatggagca aaataaactg ggcttggagg 3420

atggctcaat gcgagaaggc agggggcagg tgggatgggg aaaggccaga gaggaaagaa 3480

cattcctgga aggagggcct tacgggactg gtagtagtgt agcggcccag aggactggcc 3540

aggcggcttc aggaagtttg aaaaggtaca taagggatgt caacataacg tcaacttgcc 3600

ttgactttaa cttgctccca tagattaaaa caaagtaaag ccaacaacaa aatcttcagc 3660

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagtggcgct ggaggaggcg gtcaggacgc gtggacctga agcgcccacg ttggggcgaa 60

gggtgctttg ctgccggacc catcaccacc tcgcccttcc agagacagtt tcccctggtt 120

cccgcctcga ggcctcggtt tcccccagca gcggggcggg gcgggagcag cgctggtttc 180

gaagtcgcct gcagggtgcg cccatgagcg gcgcggccgg agctggagcc cgagcggtcg 240

ctgagacggt gggagccaga gcaagaggca ggtatctcag aaccctgaag ctgagtggag 300

ccaggcccgg accccctgta gaagtcatgg tttcgggaga tgcagaatta tccgtgagaa 360

agcctttggg aagctctccc tgggaacgct cgcggctctt gtgaggaaag ggctgcgggg 420

tttgagtggg tacacggctg ggctgcagct atggaccgag agctggccca ggcccgcatc 480

cttgctgagc ctgcccaagt gtggcttctc ccgccatgcc catcatgggc tcctcggtgt 540

acatcacggt ggagctggcc attgctgtgc tggccatcct gggcaatgtg ctggtgtgct 600

gggccgtgtg gctcaacagc aacctgcaga acgtcaccaa ctactttgtg gtgtcactgg 660

cggcggccga catcgcagtg ggtgtgctcg ccatcccctt tgccatcacc atcagcaccg 720

ggttctgcgc tgcctgccac ggctgcctct tcattgcctg cttcgtcctg gtcctcacgc 780

agagctccat cttcagtctc ctggccatcg ccattgaccg ctacattgcc atccgcatcc 840

cgctccggta caatggcttg gtgaccggca cgagggctaa gggcatcatt gccatctgct 900

gggtgctgtc gtttgccatc ggcctgactc ccatgctagg ttggaacaac tgcggtcagc 960

caaaggaggg caagaaccac tcccagggct gcggggaggg ccaagtggcc tgtctctttg 1020

aggatgtggt ccccatgaac tacatggtgt acttcaactt ctttgcctgt gtgctggtgc 1080

ccctgctgct catgctgggt gtctatttgc ggatcttcct ggcggcgcga cgacagctga 1140

agcagatgga gagccagcct ctgccggggg agcgggcacg gtccacactg cagaaggagg 1200

tccatgctgc caagtcactg gccatcattg tggggctctt tgccctctgc tggctgcccc 1260

tacacatcat caactgcttc actttcttct gccccgactg cagccacgcc cctctctggc 1320

tcatgtacct ggccatcgtc ctctcccaca ccaattcggt tgtgaatccc ttcatctacg 1380

cctaccgtat ccgcgagttc cgccagacct tccgcaagat cattcgcagc cacgtcctga 1440

ggcagcaaga acctttcaag gcagctggca ccagtgcccg ggtcttggca gctcatggca 1500

gtgacggaga gcaggtcagc ctccgtctca acggccaccc gccaggagtg tgggccaacg 1560

gcagtgctcc ccaccctgag cggaggccca atggctatgc cctggggctg gtgagtggag 1620

ggagtgccca agagtcccag gggaacacgg gcctcccaga cgtggagctc cttagccatg 1680

agctcaaggg agtgtgccca gagccccctg gcctagatga ccccctggcc caggatggag 1740

caggagtgtc ctgagggaaa gacattttaa tatttttggg ttggctggac caatctcatt 1800

aagagaagag aagaaacgcc cacgccagga aacccactgg gtgcccggct cccactctgc 1860

gggagcatca agctggagca gcatgaagcc cagtaagaaa ggcctggggc ggaggaggcg 1920

atgcttcggt ctatagggcc ccgagttagg tcagggctac agcagcatct tcgaaggcag 1980

ggcccagttc ccctgctcca gaagcgtcca caagagctgc cttgccttgt agagcagctg 2040

tggcttagag gcctggcctg atgctggggt atggctgcct caggcctcct gctaatacac 2100

tactctcccc agaccgccga ggcctcaggg agctgctgac ctagaagtgg cacttggcta 2160

tttttttttt ccaagaagat aacaatgtga ggaaaccctt tctattttat tgacttcccc 2220

tccctggctg ctgggtctgt ggtcgatcct gctgtgactc tcccctccac accccaccca 2280

ccaaggaatt gcagacggtc ctctcgggtt agcccaagct gccatgcact cagtcacagg 2340

gctatctccc gctaataaag ctgggctgga agacagaaac tatgaaaggc agggtgccag 2400

agtgtgggct cacgtctcag gattgagttt agagacatca agtcatggac ccgagctgga 2460

tagttcagag ctgccctgtg gggaggccct gcctactgcc tttccttcgg gggtggggtg 2520

gggtgggggt ggggcttgtt tgtttgtttg tgttttattt tccccctgag ataaaataaa 2580

atgagccaca ctgtgtttta aatttgcctg 2610

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gagcttctta cccaggagca cc 22

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccttcgaaga tgctgctgta gcc 23

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

agagagggga agtgacttgg ttga 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acttagagcc caggtgacag ggaca 25

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

gtcattcctc acaggcgtca 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

agggacggca tctcataggt 20

<210> 16

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gctccaattt cccacaacat tagt 24

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

acgtcaccaa cttcttcgtg gta 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

cgggtccatg acttgatgtc tct 23

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctactttgtg gtgtcactgg cg 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

agtgccactt ctaggtcagc ag 22

<210> 22

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcaccatctt ccaggagcga ga 22

<210> 23

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaaggccatg ccagtgagct t 21

<210> 24

<211> 140

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaccgagagc tggcccaggc ccgcatcctt gctgagcctg cccaagtgtg gcttctcccg 60

ccatgcccat catgggctcc tcggtgtaca tcacggtgga gctggccatt gctgtgctgg 120

ccatcctggg caatgtgctg 140

<210> 25

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggggttcttc ctgcatctcc agttac 26

<210> 26

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

actaaacatc aaacccacag gagaggga 28

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tcaatcctac actttcccgt ctgt 24

<210> 28

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

tctctcccag gtcttctcca gca 23

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ggatcggcca ttgaacaaga 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cagaagaact cgtcaagaag 20

Claims (15)

1.一种A2AR基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物基因组包含人或人源化A2AR基因，所述的非人动物体内表达人或人源化A2AR蛋白。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的1号外显子至4号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的3号和4号外显子的编码区。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化A2AR基因包含下列组中的一种：

(A)包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(C)包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化A2AR基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或

(d)包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化A2AR基因中包含SEQ IDNO：6和24所示核苷酸序列，或包含与SEQ ID NO：6和24具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％同一性的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化A2AR蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的全部或部分；

B)包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

C)包含SEQ ID NO：2所示所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或，

D)包含SEQ ID NO：2所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含人或人源化A2AR基因的核苷酸序列导入非人动物A2AR基因座，优选用包含人A2AR基因的1号至4号外显子的全部或部分导入非人动物A2AR基因座，进一步优选用3号至4号外显子的全部或部分导入非人动物A2AR基因座，进一步优选的，所述的构建方法包括用包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列导入非人动物A2AR基因座。

8.根据权利要求1-7任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物还包括其他基因修饰，优选的，所述的其他基因包含PD-1、PD-L1、CTLA4、OX40、LAG3、TIM3和CD73中的至少一种。

9.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含人A2AR核苷酸序列的部分，所述的人A2AR核苷酸序列的部分包含人A2AR的1号至4号外显子的全部或部分；优选的，所述的人A2AR核苷酸序列的部分包含人A2AR的3号至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含3号和4号外显子的编码区，优选的，包含编码SEQ ID NO：2的核苷酸序列，进一步优选的，包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列。

10.根据权利要求9所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物A2AR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；更优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQID NO：3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：3所示；和/或，所述的靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物A2AR基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000076.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：4所示。

11.一种人源化A2AR基因，其特征在于，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR基因的部分，优选的，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的1号外显子至4号外显子的全部或部分，优选的，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的3号至4号外显子的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化A2AR基因包含人A2AR核苷酸序列的3号和4号外显子的编码区。

12.根据权利要求11所述的人源化A2AR基因，其特征在于，所述的人源化A2AR基因中包含下列组中的一种：

(A)包含SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)包含与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(C)包含与SEQ ID NO：5示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或，

(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

13.根据权利要求11所述的人源化A2AR基因，其特征在于，所述的人源化A2AR基因的核苷酸序列转录的mRNA选自下列组中的一种：

(a)包含SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；

(b)包含与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的核苷酸序列；

(c)包含与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸的核苷酸序列；或

(d)包含SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

14.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述细胞、组织或器官来源于权利要求1-8任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代、或者来自权利要求1-8任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代制备的疾病模型，或者，所述的细胞、组织或者器官包含权利要求11-13任一所述的人源化A2AR基因。

15.权利要求1-8任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代、或者权利要求1-8任一所述的构建方法获得的非人动物或其子代制备的疾病模型、权利要求11-13所述的人源化A2AR基因、权利要求14所述的细胞、组织或器官的应用，其特征在于，所述应用包括：

在人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体中的应用；

作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；

在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者，

在筛选、验证、评价或研究A2AR功能、人A2AR信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，心脑血管疾病、神经性疾病或免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗炎症药物，开发和测试治疗性抗体和其它相关生物大分子药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

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