CN111837036A - 具有人或嵌合基因的基因修饰的非人动物 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及表达人或嵌合(例如，人源化)IL6R和/或IL6的基因修饰的非人动物，及其使用方法。

Description

具有人或嵌合基因的基因修饰的非人动物
优先权要求
本申请要求2018年12月17日提交的中国专利申请号为201811543170.9的权益。前述全部内容通过引用并入本文中。
技术领域
本发明涉及表达人或嵌合(例如，人源化)基因的基因修饰的动物，及其使用方法。
背景技术
白介素6(IL6)是由几种不同细胞产生的细胞因子。它具有促炎细胞因子和抗炎肌细胞因子的作用。有大量证据表明，靶向IL6/IL6R通路可以成为治疗人免疫相关疾病(例如，过敏和自身免疫疾病)的治疗策略。
针对靶向IL6/IL6R通路的治疗药物的传统药物研发通常使用体外筛选方法。然而，这些筛选方法仍与体内环境(例如，细胞微环境、细胞外基质成分和免疫细胞相互作用等)不同，导致药物开发失败的可能性很高。需要适合于人抗体筛选和疗效评价的人源化动物模型。
发明内容
本公开涉及一种具有人IL6R和/或IL6或者嵌合IL6R和/或IL6的动物模型。该动物模型可以在其体内表达人IL6R和/或IL6或者嵌合IL6R和/或IL6(例如，人源化IL6R和/或IL6)蛋白。它可用于IL6R和/或IL6基因的功能的研究，并且可用于抗人IL6R和抗IL6抗体的筛选和评价。另外，通过本文描述的方法制备的动物模型可以用于药物筛选、药效学研究、免疫相关疾病(例如，自身免疫疾病、过敏)的治疗。它们还可用于促进新药的开发和设计，并节省时间和成本。总之，本公开提供了用于研究IL6R和/或IL6蛋白的功能的强有力工具，以及用于筛选免疫相关疾病的治疗的平台。
一方面，本公开涉及一种基因修饰的非人动物，其基因组包括至少一条染色体，所述染色体包含编码人或嵌合白介素6受体(IL6R)的序列。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6R基因座的内源性调控元件。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6R基因座的人IL6R调控元件。
在一些实施方式中，所述至少一条染色体包括一个或多个内源性IL6R外显子，并且所述一个或多个内源性IL6R外显子失活。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列包括编码与人IL6R(NP_000556.1；SEQ ID NO：62)的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列的序列。
在一些实施方式中，所述动物包括与SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67或SEQ ID NO：65的1-1407bp的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
在一些实施方式中，所述动物是哺乳动物，例如，猴、啮齿动物或小鼠。在一些实施方式中，所述动物是小鼠。在一些实施方式中，所述动物不表达内源性IL6R。在一些实施方式中，与野生型动物中IL6R表达水平相比，所述动物中IL6R(例如，内源性IL6R)表达水平降低。
在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6R的细胞。
在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6R的细胞，并且表达的人或嵌合IL6R与内源性IL6结合。
在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6R的细胞，并且表达的人或嵌合IL6R与人IL6结合。
一方面，本公开涉及一种基因修饰的非人动物。
在一些实施方式中，所述动物的基因组包括在内源性IL6R基因座上插入编码人或嵌合IL6R的序列。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列可操控的连接到内源性IL6R基因座的内源性调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人或嵌合IL6R。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列可操控的连接到内源性IL6R基因座的人调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人或嵌合IL6R。
在一些实施方式中，所述动物不表达内源性IL6R。在一些实施方式中，与野生型动物中IL6R表达水平相比，所述动物中IL6R(例如，内源性IL6R)表达水平降低。
在一些实施方式中，在内源性IL6R基因座上插入的序列编码的氨基酸序列与人IL6R(SEQ ID NO：62)的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
在一些实施方式中，插入的序列进一步包括土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)和/或polyA(多聚腺苷酸化)信号序列。
在一些实施方式中，对于在内源性IL6R基因座的插入，所述动物是杂合子的。在一些实施方式中，对于在内源性IL6R基因座的插入，所述动物是纯合子的。
一方面，本公开涉及非人动物，所述的非人动物包括至少一个细胞，所述细胞包含编码嵌合IL6R多肽的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合IL6R多肽包括至少50个连续的氨基酸残基，所述氨基酸残基与人IL6R的相应连续的氨基酸序列具有同一性。
在一些实施方式中，所述动物表达嵌合IL6R。
在一些实施方式中，所述嵌合IL6R多肽包括与SEQ ID NO：62的同一性至少为90％、95％或99％的序列。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列可操控的连接至所述动物的内源性IL6R调控元件。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列整合到所述动物的内源性IL6R基因座。
在一些实施方式中，所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
在一些实施方式中，所述动物进一步包括编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6、IL33、IL13、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、具有Ig和ITIM结构域蛋白的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域分子-3(TIM-3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD137、TNF受体超家族成员4(OX40)、CD47或信号调节蛋白α(SIRPa))的序列。
在一些实施方式中，所述另外的人或嵌合蛋白是IL6。
一方面，本公开涉及一种制备基因修饰的非人动物的方法，其包括在所述动物的至少一个细胞的内源性IL6R基因座上插入编码人或嵌合IL6R的序列。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列包括一个或多个外显子，所述外显子选自人IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和外显子10。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列包括人IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10的至少30、50、100、200或300个核苷酸。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列编码的序列与SEQ ID NO：62的同一性至少为90％。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6R的序列受内源性IL6R调控元件的控制。
在一些实施方式中，所述动物是小鼠，并且所述基因座在小鼠IL6R基因的外显子1内。在一些实施方式中，将所述序列插入起始密码子之前。
在一些实施方式中，所述动物或小鼠进一步包括编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6、IL33、PD-1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137、OX40、CD47或SIRPa)的序列。
在一些实施方式中，所述另外的人或嵌合蛋白是IL6。
在一些实施方式中，所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
一方面，本公开涉及一种基因修饰的非人动物，其基因组包括至少一条染色体，所述染色体包含编码人或嵌合IL6的序列。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6基因座的内源性调控元件。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6基因座的人调控元件。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6的序列包括编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列与人IL6(NP_000591.1(SEQ ID NO：6)或NP_001305024.1(SEQ ID NO：8))的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
在一些实施方式中，所述动物包括与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：48的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
在一些实施方式中，所述动物表达与SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
在一些实施方式中，所述动物是哺乳动物，例如，猴、啮齿动物或小鼠。
在一些实施方式中，所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull动物。
在一些实施方式中，所述动物不表达内源性IL6。在一些实施方式中，与野生型动物中IL6表达水平相比，所述动物中IL6(例如，内源性IL6)表达水平降低。
在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人IL6的细胞。
在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6的细胞，并且表达的人或嵌合IL6与内源性IL6R结合。
在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6的细胞，并且表达的人或嵌合IL6与人IL6R结合。
一方面，本公开涉及一种基因修饰的非人动物。
在一些实施方式中，所述动物的基因组包括在内源性IL6基因座，编码内源性IL6区域的序列被编码人IL6相应区域的序列替换。
在一些实施方式中，所述编码人IL6相应区域的序列可操控的连接到内源性IL6基因座的内源性调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人IL6。
在一些实施方式中，所述编码人IL6相应区域的序列可操控的连接到内源性IL6基因座的人调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人IL6。
在一些实施方式中，所述动物不表达内源性IL6。在一些实施方式中，与野生型动物中IL6表达水平相比，所述动物中IL6(例如，内源性IL6)表达水平降低。
在一些实施方式中，替换的基因座包括与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：48的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
在一些实施方式中，所述动物是小鼠，并且替换的内源性IL6区域是内源性小鼠IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
在一些实施方式中，对于在内源性IL6基因座的替换，所述动物是杂合子的。
在一些实施方式中，对于在内源性IL6基因座的替换，所述动物是纯合子的。
一方面，本公开涉及一种非人动物，包括至少一个细胞，所述细胞包含编码人或嵌合IL6多肽的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述人或嵌合IL6多肽包括至少50个连续的氨基酸残基，所述氨基酸残基与人IL6的相应连续的氨基酸序列具有同一性。
在一些实施方式中，所述人或嵌合IL6多肽具有至少100个连续的氨基酸残基，所述氨基酸残基与人IL6的相应连续的氨基酸序列具有同一性。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列可操控的连接至所述动物的内源性IL6调控元件。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列可操控的连接至所述动物的人IL6调控元件。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列整合到所述动物的内源性IL6基因座。
在一些实施方式中，所述动物进一步包括编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6R、IL33、IL13、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、具有Ig和ITIM结构域蛋白的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域分子-3(TIM-3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD137、TNF受体超家族成员4(OX40)、CD47或SIRPa)的序列。
在一些实施方式中，所述另外的人或嵌合蛋白是IL6R。
在一些实施方式中，所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
一方面，本公开涉及一种制备基因修饰的非人动物的方法，其包括在所述动物的至少一个细胞的内源性IL6基因座中编码内源性IL6区域的序列被替换为编码人IL6相应区域的序列。
在一些实施方式中，所述编码人IL6相应区域的序列包括人IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
在一些实施方式中，所述编码IL6相应区域的序列包括人IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5的至少100、150或200个核苷酸。
在一些实施方式中，所述编码人IL6相应区域的序列编码的序列与SEQ ID NO：6或8的同一性至少为90％。
在一些实施方式中，替换的基因座包括与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ IDNO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：48的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
在一些实施方式中，所述动物是小鼠，并且所述基因座是小鼠IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5。
一方面，本公开涉及一种制备基因修饰的表达嵌合IL6的小鼠细胞的方法，所述方法包括：在小鼠内源性IL6基因座，编码小鼠IL6区域的核苷酸序列被替换为编码人IL6相应区域的核苷酸序列，从而产生基因修饰的小鼠细胞，其包括编码嵌合IL6的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述小鼠细胞表达嵌合IL6。
在一些实施方式中，所述编码嵌合IL6的核苷酸序列可操控的连接至内源性IL6调控区域，例如，启动子。
在一些实施方式中，所述编码嵌合IL6的核苷酸序列可操控的连接至人IL6调控区域，例如，启动子。
在一些实施方式中，所述动物或小鼠进一步包括编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6R、IL33、IL13、PD-1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137、OX40、CD47或SIRPa)的序列。
在一些实施方式中，所述另外的人或嵌合蛋白是IL6R。
在一些实施方式中，所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
一方面，本公开涉及一种确定IL6-IL6R通路抑制剂治疗免疫疾病的有效性的方法，其包括：将所述IL6-IL6R通路抑制剂给药至本文所述的动物；以及确定所述IL6-IL6R通路抑制剂的抑制作用。
在一些实施方式中，所述免疫疾病是过敏。在一些实施方式中，所述免疫疾病是自身免疫疾病。在一些实施方式中，所述免疫疾病是多发性硬化症、哮喘、过敏、关节炎或自身免疫性脑脊髓炎。
一方面，本公开涉及一种确定IL6-IL6R通路抑制剂减轻炎症的有效性的方法，其包括：将所述IL6-IL6R通路抑制剂给药至本文所述的动物；以及确定所述IL6-IL6R通路抑制剂的抑制作用。
一方面，本公开涉及一种确定IL6-IL6R通路抑制剂治疗自身免疫疾病的有效性的方法，其包括：将所述IL6-IL6R通路抑制剂给药至本文所述的动物；以及确定所述IL6-IL6R通路抑制剂的抑制作用。
在一些实施方式中，所述自身免疫疾病是多发性硬化症。在一些实施方式中，所述自身免疫疾病是关节炎。
在一些实施方式中，所述IL6-IL6R通路抑制剂是抗人IL6抗体。在一些实施方式中，所述IL6-IL6R通路抑制剂是抗人IL6R抗体。
在一些实施方式中，所述抑制作用通过爪厚和/或关节炎评分评价。
在一些实施方式中，所述抑制作用通过行为评分、脑/脊髓IHC病理学、血清/脑匀浆Th17型多细胞因子检测和/或中枢神经系统(CNS)和脾脏流式细胞术评价。
一方面，本公开涉及一种确定抗IL6R抗体或抗IL6抗体的毒性的方法，该方法包括：将所述抗IL6R抗体或抗IL6抗体给药至本文所述的动物；以及确定所述动物的体重变化。
在一些实施方式中，本文所述的方法进一步包括进行血液检查(例如，确定红细胞计数)。
一方面，本公开涉及一种基因修饰的非人动物。
在一些实施方式中，所述动物的基因组包括在内源性IL6R基因座，编码内源性IL6R区域的序列被编码人IL6R相应区域的序列替换。
在一些实施方式中，所述编码人IL6R相应区域的序列可操控的连接到内源性IL6R基因座的内源性调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人或嵌合IL6R。
在一些实施方式中，所述动物不表达内源性IL6R，或与野生型动物中IL6R表达水平相比，所述动物内源性IL6R表达水平降低。
在一些实施方式中，所述动物是小鼠，并且替换的内源性IL6R区域是小鼠内源性IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10。
在一些实施方式中，对于在内源性IL6R基因座的替换，所述动物是杂合子的。在一些实施方式中，对于在内源性IL6R基因座的替换，所述动物是纯合子的。
一方面，本公开涉及一种制备基因修饰的非人动物的方法，其包括所述动物的至少一个细胞的内源性IL6R基因座上编码的内源性IL6R区域的序列被替换为编码人IL6R相应区域的序列。
在一些实施方式中，所述编码人IL6R相应区域的序列包括人IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10。
在一些实施方式中，所述编码IL6R相应区域的序列包括人IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10的至少30、50、100、200或300个核苷酸。
在一些实施方式中，所述编码人IL6R相应区域的序列编码的序列与SEQ ID NO：62的同一性至少为90％。
在一些实施方式中，所述动物是小鼠，并且所述基因座是小鼠IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10。
一方面，本公开涉及一种非人动物，所述非人动物包含至少一个细胞，所述细胞包含编码嵌合IL6R多肽的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述嵌合IL6R多肽包括至少50个连续的氨基酸残基，所述氨基酸残基与人IL6R的相应连续的氨基酸序列具有同一性。
在一些实施方式中，所述动物表达嵌合IL6R。
在一些实施方式中，所述嵌合IL6R多肽包括与SEQ ID NO：62的同一性至少为90％、95％或99％的序列。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列可操控的连接至所述动物的内源性IL6R调控元件。
在一些实施方式，所述核苷酸序列整合到所述动物的内源性IL6R基因座。
一方面，本公开涉及一种制备基因修饰的表达嵌合IL6R的小鼠细胞的方法，所述方法包括：在内源性小鼠IL6R基因座，编码小鼠IL6R区域的核苷酸序列被替换为编码人IL6R相应区域的核苷酸序列，从而产生基因修饰的小鼠细胞，所述小鼠细胞包括编码嵌合IL6R的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述小鼠细胞表达嵌合IL6R。
在一些实施方式中，所述编码嵌合IL6R的核苷酸序列可操控的连接至内源性IL6R调控区域，例如，启动子。
在一些实施方式中，所述动物进一步包括编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6、IL33、IL13、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、具有Ig和ITIM结构域蛋白的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域分子-3(TIM-3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD137、TNF受体超家族成员4(OX40)、CD47或信号调节蛋白α(SIRPa))的序列。
在一些实施方式中，所述另外的人或嵌合蛋白是IL6。
在一些实施方式中，所述动物或小鼠进一步包括编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6、IL33、PD-1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137、OX40、CD47或SIRPa)的序列。
在一些实施方式中，所述另外的人或嵌合蛋白是IL6。
一方面，本公开涉及一种包括核苷酸序列的核酸。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列是以下一种：SEQ ID NO：11、12、13、48、49、50、65、66或67；或者与SEQ ID NO：11、12、13、48、49、50、65、66或67的同一性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列。
一方面，本公开涉及一种包括本文所述核酸的细胞。
一方面，本公开涉及一种包括本文所述核酸的动物。
本公开还涉及一种建立表达双人或嵌合(例如，人源化)基因的基因修饰的非人动物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)使用建立IL6R基因人源化动物模型的方法获得IL6R基因修饰的人源化小鼠；(b)将步骤(a)中获得的IL6R基因修饰的人源化小鼠与另一只人源化小鼠进行交配，然后进行筛选以获得双人源化小鼠模型。在一些实施方式中，在步骤(b)中，将步骤(a)中获得的IL6R基因修饰的人源化小鼠与IL6人源化小鼠交配以获得IL6R和IL6双人源化小鼠模型。
本公开还涉及一种建立表达双人或嵌合(例如，人源化)基因的基因修饰的非人动物的方法。所述方法包括以下步骤：(a)使用建立IL6基因人源化动物模型的方法获得IL6基因修饰的人源化小鼠；(b)将步骤(a)中获得的IL6基因修饰的人源化小鼠与另一只人源化小鼠进行交配，然后进行筛选以获得双人源化小鼠模型。在一些实施方式中，在步骤(b)中，将步骤(a)中获得的IL6基因修饰的人源化小鼠与IL6R人源化小鼠交配以获得IL6和IL6R双人源化小鼠模型。
本公开还涉及通过本文所述的方法产生的非人哺乳动物。在一些实施方式中，其基因组包含人类基因。
在一些实施方式中，所述非人哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方式中，所述非人哺乳动物是小鼠。在一些实施方式中，所述非人哺乳动物表达人IL6R和/或人IL6。
本公开还涉及一种非人哺乳动物的后代。
一方面，本公开涉及一种非人哺乳动物模型，所述非人哺乳动物模型通过本文所述方法获得。在一些实施方式中，所述非人哺乳动物是啮齿动物。在一些实施方式中，所述非人哺乳动物是小鼠。
本公开还涉及一种来源于非人哺乳动物或其后代，或者荷瘤非人哺乳动物的细胞(例如，干细胞或胚胎干细胞)或细胞系，或者其原代细胞培养物。本公开进一步涉及来源于非人哺乳动物或其后代，或者荷瘤非人哺乳动物的组织、器官或其培养物。
一方面，本公开涉及一种来源于非人哺乳动物或其患有肿瘤的后代或荷瘤的非人哺乳动物的肿瘤组织。
本公开进一步涉及一种人源化小鼠的IL6R和/或IL6基因组DNA序列，通过其转录获得的mRNA的反转录获得的DNA序列与所述DNA序列一致或互补；一种表达其氨基酸序列的构建体；一种含其构建体的细胞；一种包含其细胞的组织。
本公开进一步涉及非人哺乳动物或其后代、或荷瘤非人哺乳动物，通过本文所述的方法产生的动物模型在与人细胞的免疫过程相关产品的开发，人抗体的生产，或药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的用途。
本公开还涉及非人哺乳动物或其后代，或非人哺乳动物，通过本文所述方法产生动物模型在涉及人细胞的免疫过程的动物实验疾病模型的产生和利用、病原体研究或新诊断策略和/或治疗策略的开发中的用途。
本公开进一步涉及非人哺乳动物或其后代，或非人哺乳动物，通过本文所述方法产生动物模型在筛选、验证、评价或研究IL6R和/或IL6基因功能、人IL6R和/或IL6抗体、用于人IL6R和/或IL6靶向位点的药物或疗效以及用于免疫相关疾病的药物中的用途。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；另外，也可以使用本领域已知的合适方法和材料。材料、方法和实施例仅用于说明，而非进行限制。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过引用整体并入本文。在冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。
根据以下具体实施方式和附图以及权利要求，本发明的其他特征和优点将显而易见。
附图说明
图1A是显示小鼠IL6基因座(基于NM_031168.2)的示意图。
图1B是显示小鼠IL6基因座(基于NM_001314054.1)的示意图。
图1C是显示人IL6基因座(基于NM_000600.4)的示意图。
图1D是显示人IL6基因座(基于NM_001318095.1)的示意图。
图2是显示人源化IL6基因(替换编码序列、小鼠5’-UTR和小鼠3’-UTR)的示意图。
图3是显示人源化IL6基因座(替换编码序列和小鼠3’-UTR)的示意图。
图4是显示IL6基因打靶策略的示意图。
图5是显示CRE重组过程的示意图。
图6是显示IL6基因打靶策略的示意图。
图7A是显示sgRNA1-sgRNA7的活性测试结果的直方图。Con为阴性对照品；PC为阳性对照品。
图7B是显示sgRNA8-sgRNA15的活性测试结果的直方图。Con为阴性对照品；PC为阳性对照品。
图8A是显示了F0代小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中引物对L-GT-F1和L-GT-R用于扩增5'末端靶向位点基因片段。WT为野生型，H2O为空白对照品，M为Marker，+为阳性对照品。
图8B是显示了F0代小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中引物对R-GT-F和R-GT-R用于扩增3'末端靶向位点基因片段。WT为野生型，H2O为空白对照品，M为Marker，+为阳性对照品。
图9A显示了F1代小鼠(短片段替换)鼠尾PCR鉴定结果，其中引物对L-GT-F1和L-GT-R用于扩增5'末端靶向位点基因片段。WT为野生型，H2O为空白对照品，M为Marker，+为阳性对照品。
图9B显示了F1代小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中引物对R-GT-F和R-GT-R用于扩增3'末端靶向位点基因片段。WT为野生型，H2O为空白对照品，M为Marker，+为阳性对照品。
图10A是显示Southern印迹结果的图像，其中F1-026、F1-027、F1-029、F1-030、F1-032、F1-044、F1-045、F1-046、F1-047、F1-050和F1-052为小鼠的编号。
图10B是显示Southern印迹结果的图像，其中F1-022、F1-023、F1-025和F1-056为小鼠的编号。
图11A是显示小鼠IL6蛋白表达的ELISA检测结果的直方图。+/+代表B-NDG小鼠，h/+代表具有B-NDG背景的人源化IL6杂合子小鼠。
图11B是显示人IL6蛋白表达的ELISA检测结果的直方图。+/+代表B-NDG小鼠，h/+代表具有B-NDG背景的人源化IL6杂合子小鼠。
图12显示了基因敲除小鼠鼠尾PCR鉴定结果。WT为野生型，H2O为空白对照品，M为Maker。
图13是显示小鼠和人IL6R基因座的示意图。
图14是显示人源化IL6R基因座的示意图。
图15是显示IL6R基因打靶策略的示意图。
图16A是显示小鼠IL6蛋白表达的ELISA检测结果的直方图。+/+代表C57BL/6小鼠，H/H代表人源化IL6纯合子小鼠，如图2所示。
图16B是显示人IL6蛋白表达的ELISA检测结果的直方图。+/+代表C57BL/6小鼠，H/H代表人源化IL6纯合子小鼠，如图2所示。
图17是显示Southern印迹结果。1-G01和1-H01为细胞克隆号。
图18是FLP重组过程的示意图。
图19A是F1代IL6R人源化小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中引物对IL6R-WT-F和IL6R-WT-R用于扩增野生型小鼠靶位点基因片段。WT为野生型，H2O为空白对照品，PC为阳性对照品。
图19B显示了F1代IL6R人源化小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中引物对IL6R-WT-F和IL6R-Mut-R用于在重组条带的5'末端扩增靶位点基因片段。WT为野生型，H2O为空白对照品，PC为阳性对照品。
图19C显示了F1代IL6R人源化小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中引物对IL6R-Frt-F和IL6R-Frt-R用于扩增抗性基因的3'末端扩增靶位点基因片段。WT为野生型，H2O为空白对照品，PC为阳性对照品。
图19D显示了F1代IL6R人源化小鼠鼠尾PCR鉴定结果，其中引物对IL6R-Flp-F和IL6R-Flp-R用于扩增以确认Flp的存在。WT为野生型，H2O为空白对照品，PC为阳性对照品。
图20A是显示野生型(WT)C57BL/6小鼠的流式细胞仪分析结果的图，其中用mIL-6RPE和mTcRβ-APC/Cy7染色细胞以检测IL6R蛋白表达。
图20B是显示IL6R人源化纯合子小鼠(IL6R H/H)的流式细胞仪分析结果的图，其中用mIL-6R PE和mTcRβ-APC/Cy7染色细胞以检测IL6R蛋白表达。
图20C是显示野生型(WT)C57BL/6小鼠的流式细胞仪分析结果的图，其中用hIL-6RPE和mTcRβ-APC/Cy7染色细胞以检测IL6R蛋白表达。
图20D是显示IL6R人源化纯合子小鼠(IL6R H/H)的流式细胞仪分析结果的图，其中用hIL-6R PE和mTcRβ-APC/Cy7染色细胞以检测IL6R蛋白表达。
图21A是显示小鼠IL6蛋白表达的ELISA检测结果的直方图。WT代表野生型C57BL/6小鼠，IL6H/HIL6RH/H代表具有C57BL/6背景的双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠。
图21B是显示人IL6蛋白表达的ELISA检测结果的直方图。WT代表野生型C57BL/6小鼠，IL6H/HIL6RH/H代表具有C57BL/6背景的双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠。
图22A是显示野生型(WT)C57BL/6小鼠的流式细胞仪分析结果的图，其中用mIL-6RPE和mTcRβ-APC/Cy7染色细胞以检测IL6R蛋白表达。
图22B是显示双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠(IL6H/HIL6RH/H)的流式细胞仪分析结果的图，其中用mIL-6R PE和mTcRβ-APC/Cy7染色细胞以检测IL6R蛋白表达。
图22C是显示野生型(WT)C57BL/6小鼠的流式细胞仪分析结果的图，其中用hIL-6RPE和mTcRβ-APC/Cy7染色细胞以检测IL6R蛋白表达。
图22D是显示双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠(IL6H/HIL6RH/H)的流式细胞仪分析结果的图，其中用hIL-6R PE和mTcRβ-APC/Cy7染色细胞以检测IL6R蛋白表达。
图23显示了小鼠IL6氨基酸序列(NP_112445.1；SEQ ID NO：2)和人IL6氨基酸序列(NP_000591.1；SEQ ID NO：6)之间的比对。
图24显示了小鼠IL6氨基酸序列(NP_001300983.1；SEQ ID NO：4)和人IL6氨基酸序列(NP_001305024.1；SEQ ID NO：8)之间的比对。
图25显示了小鼠IL6R氨基酸序列(NP_034689.2；SEQ ID NO：60)和人IL6R氨基酸序列(NP_000556.1；SEQ ID NO：62)之间的比对。
具体实施方式
本公开涉及一种具有人或嵌合的(例如，人源化的)IL6R和/或IL6的基因修饰的非人动物，及其使用方法。
IL6是一种多效性细胞因子，在受伤或感染后其被释放到循环中。IL6参与如造血、神经发育、炎症、免疫、生殖和骨骼代谢等过程。另外，已经报道了其参与诱导B细胞、T细胞和星形胶质细胞分化以及诱导肝细胞中急性期蛋白，如C反应蛋白(CRP)。IL6属于IL6型细胞因子家族，包括IL11、睫状神经营养因子(CTNF)、白血病抑制因子(LIF)、制瘤蛋白M(OSM)和心肌营养素样因子(CLF)。所有这些细胞因子共享一个四螺旋束蛋白动机。该蛋白家族通过包含糖蛋白130(gp130)的受体复合物发出信号，该糖蛋白是IL6家族细胞因子的常见信号传导蛋白。鼠IL6以种属特异性方式发挥作用，而人IL6对IL6R阳性鼠细胞也有活性。鼠与人IL6和IL6R之间的序列比对表明，人IL6和IL6R中单个氨基酸替换的关键位点导致超过70％的配体结合亲和力降低(根据Swissprot蛋白数据库)。鼠和人IL6之间的氨基酸同一性和相似性分别为41.6％和65％、对于IL6R，相应评分为53.4％和65.8％。IL6与其受体(IL6R)结合，并且该复合物募集两个广泛表达的gp130分子，这与在确定的细胞类型(如肝细胞和白细胞)上表达的IL6R相反。可溶性形式的IL6R(sIL6R)可以通过蛋白酶(如解联蛋白和金属蛋白酶17(ADAM17))加工受体或通过差异剪接产生。IL6R本身不是信号传导子，其功能是将IL6呈现给信号传导子gp130。这导致janus激酶2(JAK2)磷酸化gp130，并随后募集信号传导和转录激活因子(STAT1和STAT3)，随后将其二聚化，并在磷酸化后将它们转移到细胞核中，并介导确定的基因特征的转录。这种类型的信号传导称为顺式信号传导。sIL6R可以结合其配体IL6，并在表达gp130而不表达IL6R的细胞中诱导信号传导。这种信号传导被称为反式信号传导。与大多数可溶性受体相反，IL6-sIL6R复合物可以充当激动剂。由gp130的胞外域和人IgG的Fc部分组成的可溶性融合蛋白已显示由于IL6-sIL6R复合物的结合而抑制反式信号传导，而顺式信号传导则不受影响，因为该融合蛋白无法结合IL6(WEIDLE,ULRICH H.等人，"白介素6/白介素6受体相互作用及其作为治疗恶病质和癌症的治疗靶标的作用。"癌症基因组学-蛋白质组学7.6(2010):287-302)。
鉴于IL6在各种疾病过程中均具有重要作用，目前市售有三种靶向IL6通路的抗体药物，包括：例如，ACTEMRA(托珠单抗，靶向IL6R，用于治疗类风湿性关节炎、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征以及幼儿和青年的特发性关节炎)、SYLVANT(司妥昔单抗，靶向IL6，用于治疗Castleman病)、KEVZARA(全人源化白介素6受体单抗，靶向IL6R，用于治疗成人中度至重度活动性类风湿关节炎)。
实验动物模型是在临床试验之前研究这些抗体作用必不可少的研究工具。常见的实验动物包括小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、家兔、犬、猴、猪、鱼等。然而，人与动物的基因和蛋白序列之间存在差异，并且许多人蛋白无法与动物的同源蛋白结合以产生生物活性，从而导致许多临床试验的结果与动物试验的结果不符。大量临床研究迫切需要更好的动物模型。
具体地，小鼠IL6蛋白与人IL6蛋白的同一性仅约41％、而对于IL6R，同一性百分比仅约53％。因此，识别人IL6或IL6R蛋白的抗体不能识别小鼠IL6或IL6R。因此，在药物开发过程中，野生型小鼠不能用于筛选和评价靶向人IL6和IL6R的药物的疗效。此外，尽管免疫缺陷小鼠(如NOD-PrkdcscidIL-2rγnull小鼠)是最适合移植人细胞或组织的工具，但在人造血细胞中效果不佳。人造血细胞移植后，人衍生细胞的发育和功能存在缺陷(Watanabe等人，"人源化NOD/shi-scid/γcnull(NOG)小鼠(hu-HSC NOG小鼠)中人B和T细胞功能的分析"国际免疫学21.7(2009):843-858.)。
本公开提供了具有人或嵌合(例如，人源化)IL6R和/或IL6的转基因的非人动物。由于人IL6R和人IL6之间以及人造血细胞之间的相互作用，因此该动物模型可以真实地模拟人IL6R、人IL6和人造血细胞之间的相互作用，并概括了IL6阻断剂在人患者中的作用。
白介素6(IL6)
白介素6(IL6或IL-6)是一种促炎性细胞因子，由212个氨基酸组成，其N端信号肽为29个氨基酸，并且四螺旋束以上-上-下-下拓扑排列。
IL6是介导急性期反应的多效细胞因子。它不仅由免疫细胞作为细胞增殖、分化、活化和存活的介质而产生，而且由各种类型的实质细胞(如内皮细胞、角质形成细胞、脂肪细胞和肾小球膜细胞)通过模式识别受体作为一种先天反应而产生。它还调控急性期蛋白的产生，刺激成纤维细胞产生胶原蛋白，并发挥血管内皮活化作用和破骨细胞分化作用。
IL-6通过与膜结合的IL-6受体结合而通过细胞膜gp130作用于细胞，该膜结合的IL-6受体有限地参与白细胞和肝细胞。或者，IL-6可以通过可溶性IL-6受体和gp130相似地发挥作用。由于gp130广泛存在，因此IL-6具有作用于所有细胞的能力。使用衔接蛋白与gp130结合的IL-6刺激导致JAK/STAT通路和含JAK-SH2结构域的蛋白酪氨酸磷酸酶2-促分裂原激活的蛋白激酶通路被激活，从而导致细胞因子的产生。该信号传导受ADAM17正调控，ADAM17导致膜蛋白型IL-6受体(IL-6R)脱落，并通过在循环微泡中剪接可变的可溶性IL-6R，而受可溶性gp130和SOCS3负调控。
IL6及其功能的详细描述可以参见，例如，Akioka,Shinji."白介素-6在幼年特发性关节炎中的作用"现代风湿病学29.2(2019):275-286；Gelinas等人，"与修饰的核酸配体复合的白介素-6的晶体结构"生物化学杂志289.12(2014):8720-8734；其各自通过引用整体并入本文。
在人基因组中，IL6基因(基因ID：3569)具有多种亚型或多个转录本。转录本1具有5个外显子，即外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5。人转录本1mRNA的核苷酸序列是NM_000600.4(SEQ ID NO：5)，而相应的氨基酸序列是NP_000591.1(SEQ ID NO：6)。下面列出了人IL6转录本1核苷酸序列和氨基酸序列中每个外显子和每个区域的位置：
表1
Figure BDA0002644849280000191
Figure BDA0002644849280000201
转录本2具有4个外显子，即外显子1、外显子2、外显子3和外显子4。人转录本2mRNA的核苷酸序列是NM_001318095.1(SEQ ID NO：7)，相应的氨基酸序列是NP_001305024.1(SEQ ID NO：8)。下面列出了人IL6转录本2核苷酸序列和氨基酸序列中每个外显子和每个区域的位置：
表2
Figure BDA0002644849280000202
在小鼠基因组中，IL6基因(基因ID：16193)具有多种亚型或多个转录本。转录本1具有5个外显子，即外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5。小鼠转录本1mRNA的核苷酸序列是NM_031168.2(SEQ ID NO：1)，相应的氨基酸序列是NP_112445.1(SEQ ID NO：2)。下面列出小鼠IL6转录本1核苷酸序列和氨基酸序列中每个外显子和每个区域的位置：
表3
Figure BDA0002644849280000203
Figure BDA0002644849280000211
转录本2具有5个外显子，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5。小鼠转录本2mRNA的核苷酸序列是NM_001314054.1(SEQ ID NO：3)，相应的氨基酸序列是NP_001300983.1(SEQ ID NO：4)。下面列出了小鼠IL6转录本2核苷酸序列和氨基酸序列中每个外显子和每个区域的位置：
表4
Figure BDA0002644849280000212
Figure BDA0002644849280000221
小鼠IL6基因(基因ID：16193)位于小鼠基因组的5号染色体，其位于NC_000071.6(GRCm38.p4(GCF_000001635.24))的30013114至30019975。
5'-UTR是从30,013,114至30,013,191，外显子1是从30,013,114至30,013,210，第一内含子是从30,013,211至30,013,375，外显子2是从30,013,376至30,013,560，第二内含子是从30,013,561至30,014,831，外显子3是从30,014,832至30,014,945，第三内含子是从30,014,946至30,018,004，外显子4是从30,018,005至30,018,154，第四内含子是从30,018,155至30,019,380，外显子5是从30,019,381至30,019,975，3'-UTR是从30,019,549至30,019,975，基于转录本1(NM_031168.2)。
5'-UTR是从30,013,168至30,013,191，外显子1是从30,013,168至30,013,210，第一内含子是从30,013,211至30,013,375，外显子2是从30,013,376至30,013,560，第二内含子是从30,013,561至30,014,831，外显子3是从30,014,832至30,014,945，第三内含子是从30,014,946至30,018,004，外显子4是从30,018,005至30,018,154，第四内含子是从30,018,155至30,019,438，外显子5是从30,019,439至30,019,597，3'-UTR是从30,019,469至30,019,597，基于转录本2(NM_001314054.1)。
图23显示了人IL6氨基酸序列(NP_000591.1；SEQ ID NO：6)和小鼠IL6氨基酸序列(NP_112445.1；SEQ ID NO：2)之间的比对。图24显示了小鼠IL6氨基酸序列(NP_001300983.1；SEQ ID NO：4)和人IL6氨基酸序列(NP_001305024.1；SEQ ID NO：8)之间的比对。因此，人和小鼠IL6之间的相应氨基酸残基或区域也可见图23和图24
其他种属的IL6基因、蛋白和基因座在本领域中也是已知的。例如，褐家鼠的IL6的基因ID是24498，猕猴(Macaca mulatta)(猕猴(Rhesus monkey))的IL6的基因ID是705819，家犬(犬)的IL6的基因ID是403985，而家猫(Felis catus)(家猫(domestic cat))的IL6的基因ID是493687。这些基因的相关信息(例如，内含子序列、外显子序列、这些蛋白的氨基酸残基)可以在例如NCBI数据库中找到，其通过引用整体并入本文。
本公开提供了人或嵌合的(例如，人源化的)IL6核苷酸序列和/或氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠信号肽的完整序列、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5被相应的人序列替换。
在一些实施方式中，小鼠信号肽的“区域”或“部分”、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5被相应的人序列替换。
在一些实施方式中，所述“区域”或“部分”与信号肽、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5的同一性可以是至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一些实施方式中，小鼠信号肽的区域、部分或全部序列，外显子1，外显子2，外显子3，外显子4和/或外显子5被人信号肽的区域、部分或全部序列，外显子1，外显子2，外显子3，外显子4和/或外显子5替换。在一些实施方式中，小鼠信号肽的“区域”或“部分”、外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5缺失。
本公开还提供了嵌合的(例如，人源化的)IL6核苷酸序列和/或氨基酸序列，其中在一些实施方式中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列与小鼠IL6mRNA序列(例如，SEQ ID NO：1或3)、小鼠IL6氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：2或4)或其一部分(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5)具有同一性或从其来源；在一些实施方式中，至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列与人IL6 mRNA序列(例如，SEQ ID NO：5或7)、人IL6氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：6或8)或其一部分(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5)具有同一性或从其来源。
在一些实施方式中，编码小鼠IL6的全长氨基酸序列的序列(SEQ ID NO：2或4)被替换。在一些实施方式中，该序列被编码人IL6的相应区域的序列(例如，人IL6的全长氨基酸序列(SEQ ID NO：6或8))替换。
在一些实施方式中，本文所述的核酸可操控的连接至启动子或调控元件，例如，内源性小鼠IL6启动子、人IL6启动子、诱导型启动子、人增强子、小鼠增强子和/或小鼠或人调控元件。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50或60个核苷酸，例如，连续或不连续的核苷酸)，其与部分或全部小鼠IL6核苷酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或SEQID NO：1或3)不同。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50或60个核苷酸，例如，连续或不连续的核苷酸)，其与部分或全部小鼠IL6核苷酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或SEQID NO：1或3)相同。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或不连续的核苷酸)，其与部分或全部人IL6核苷酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或SEQ ID NO：5或7)不同。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或不连续的核苷酸)，其与部分或全部人IL6核苷酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或SEQ ID NO：5或7)相同。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或不连续的氨基酸残基)，其与部分或全部小鼠IL6氨基酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或SEQ ID NO：2或4)不同。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或不连续的氨基酸残基)，其与部分或全部小鼠IL6氨基酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或SEQ ID NO：2或4)相同。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或不连续的氨基酸残基)，其与部分或全部人IL6氨基酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或SEQ ID NO：6或8)不同。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或不连续的氨基酸残基)，其与部分或全部人IL6氨基酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5或SEQ ID NO：6或8)相同。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO：2、4、6或8所示序列的同一性百分比为至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在一些实施方式中，前述同一性百分比为至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％或85％。
还提供了包含本文所述的核苷酸序列的细胞、组织和动物(例如，小鼠)，以及从内源性非人IL6基因座表达人或嵌合(例如，人源化)IL6的细胞、组织和动物(例如，小鼠)。
一方面，本公开提供了一种基因修饰的非人动物，其基因组包含至少一条染色体，所述染色体包含编码人或嵌合IL6的序列。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6基因座的内源性调控元件。
在一些实施方式中，所述编码人或嵌合IL6的序列包含编码与人IL6(SEQ ID NO：6或8)的同一性至少为50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列的序列。
在一些实施方式中，所述动物是哺乳动物，例如，猴、啮齿动物或小鼠。在一些实施方式中，所述动物是BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠。
在一些实施方式中，所述动物不表达内源性IL6。在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6的细胞。
在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6的细胞，并且表达的人或嵌合IL6与内源性IL6R结合。在一些实施方式中，所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6的细胞，并且表达的人或嵌合IL6不能结合至内源性IL6R。
另一方面，本公开涉及一种基因修饰的非人动物，其中，所述动物的基因组包含在内源性IL6基因座，编码内源性IL6区域的序列被编码人IL6相应区域的序列替换。
在一些实施方式中，所述编码人IL6相应区域的序列可操控的连接到内源性IL6基因座的内源性调控元件或人调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达嵌合IL6。
在一些实施方式中，所述动物是小鼠，并且替换的内源性IL6基因座是内源性小鼠IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
在一些实施方式中，对于在内源性IL6基因座的替换，所述动物是杂合子的。在一些实施方式中，对于在内源性IL6基因座的替换，所述动物是纯合子的。
另一方面，本公开涉及制备基因修饰的非人动物的方法。所述方法包括在所述动物的至少一个细胞的内源性IL6基因座上编码内源性IL6区域的序列被替换为编码人IL6相应区域的序列。
在一些实施方式中，所述编码人IL6相应区域的序列包含人IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
在一些实施方式中，所述编码IL6相应区域的序列包含人IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5的至少50、75、100、125、150、175或200个核苷酸。
在一些实施方式中，所述编码人IL6相应区域的序列编码的序列与SEQ ID NO：6或8的全长氨基酸序列的同一性至少为90％。
在一些实施方式中，所述动物可以是小鼠，并且所述基因座可以是小鼠IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
另一方面，本公开还涉及一种非人动物，所述的非人动物包含至少一个细胞，所述细胞包含编码嵌合IL6多肽的核苷酸序列，其中，所述嵌合IL6多肽包含至少50个连续的氨基酸残基，所述氨基酸残基与人IL6的相应连续的氨基酸序列具有同一性，其中，所述动物表达嵌合IL6。
在一些实施方式中，所述嵌合IL6多肽包含与SEQ ID NO：6或8的全长氨基酸序列的同一性至少为90％、95％或99％的序列。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列可操控的连接至所述动物的内源性IL6调控元件、人IL6调控元件、小鼠5’-UTR、小鼠3’-UTR、人5’-UTR或人3’-UTR。
在一些实施方式中，所述核苷酸序列整合到所述动物的内源性IL6基因座。
在一些实施方式中，所述嵌合IL6具有至少一种小鼠IL6活性和/或至少一种人IL6活性。
另一方面，本公开还涉及制备基因修饰的表达嵌合IL6的小鼠细胞的方法。所述方法包括：在内源性小鼠IL6基因座，编码小鼠IL6区域的核苷酸序列被替换为编码人IL6相应区域的核苷酸序列，从而产生基因修饰的小鼠细胞，其包括编码嵌合IL6的核苷酸序列，其中所述小鼠细胞表达嵌合IL6。
在一些实施方式中，所述编码嵌合IL6的核苷酸序列可操控的连接到内源性调控区域或人IL6调控区域，例如，启动子。
在一些实施方式中，所述动物进一步包含编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6R、白介素33(IL33)、白介素13(IL13)、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、具有Ig和ITIM结构域蛋白的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域分子-3(TIM-3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD137、TNF受体超家族成员4(OX40)、CD47或信号调节蛋白α(SIRPa))的序列。
在一些实施方式中，所述另外的人或嵌合蛋白是IL6R。
一方面，本公开还提供了确定IL6拮抗剂(例如，抗IL6抗体)减轻炎症的有效性的方法。所述方法包括将所述IL6拮抗剂给药至本文所述的动物，其中，所述动物患有炎症；以及确定所述IL6拮抗剂减轻炎症的抑制作用。
一方面，本公开还提供了确定IL6拮抗剂(例如，抗IL6抗体)治疗自身免疫疾病或过敏的有效性的方法。所述方法包括将所述IL6拮抗剂给药至本文所述的动物，其中，所述动物患有自身免疫疾病或过敏；以及确定所述IL6拮抗剂治疗自身免疫疾病或过敏的抑制作用。
一方面，本公开还提供了确定IL6拮抗剂(例如，抗IL6抗体)治疗癌症的有效性的方法。所述方法包括将所述IL6拮抗剂给药至本文所述的动物，其中，所述动物具有肿瘤；以及确定所述IL6拮抗剂对肿瘤的抑制作用。
在一些实施方式中，所述动物进一步包含编码人或嵌合IL6R的序列。在一些实施方式中，另外的治疗剂是抗IL6R抗体。
在一些实施方式中，另外的治疗剂是抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA4抗体、抗CD20抗体、抗EGFR抗体或抗CD319抗体。
另一方面，本公开进一步提供了确定药剂(例如，IL6拮抗剂)的毒性的方法。所述方法包括：将所述药剂给药至本文所述的动物；以及确定所述动物的体重变化。在一些实施方式中，所述方法进一步包括进行血液检查(例如，确定红细胞计数)。
一方面，本公开涉及包含氨基酸序列的蛋白，其中，所述氨基酸序列是以下一种：
(a)SEQ ID NO：2、4、6、8所示的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：2、4、6、8的同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列；
(c)与SEQ ID NO：2、4、6、8所示的氨基酸序列的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸的氨基酸序列；和
(d)一种氨基酸序列，其包含替换、缺失和/或插入一个、二个、三个、四个、五个或更多个氨基酸至SEQ ID NO：2、4、6、8所示的氨基酸序列。
在一些实施方式中，本文提供了包含本文所述的蛋白的细胞。在一些实施方式中，本文提供了具有本文所述的蛋白的动物。
另一方面，本公开涉及包含核苷酸序列的核酸，其中，所述核苷酸序列是以下一种：
(a)编码本文所述蛋白的序列；
(b)SEQ ID NO：1、3、5、7、49、50；
(c)与SEQ ID NO：1、3、5、7、49、50的同一性为至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列；
在一些实施方式中，本文提供了包含本文所述核酸的细胞。在一些实施方式中，本文提供了具有本文所述核酸的动物。
另一方面，本公开还提供了一种基因修饰的非人动物，其基因组包括动物内源性IL6基因的断裂，其中，内源性IL6基因的断裂包括内源性IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5或其部分的缺失。
在一些实施方式中，内源性IL6基因的断裂还包括缺失一个或多个外显子或部分外显子，所述外显子选自内源性IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
在一些实施方式中，内源性IL6基因的断裂进一步包括缺失一个或多个内含子或部分内含子，所述内含子选自内源性IL6基因的内含子1、内含子2、内含子3和/或内含子4。
在一些实施方式中，其中，所述缺失可以包括缺失至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500或更多个核苷酸。
在一些实施方式中，所述内源性IL6基因的断裂包含缺失外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个核苷酸(例如，缺失全部外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5)。
白介素6受体(IL6R)
IL-6R(或IL6)信号传导盒包括2条IL-6R链和下游信号传导分子。IL-6R结合链以2种形式存在，首先是80-kDa跨膜系统和由55-kDa可溶性IL-6R(sIL-6R)介导的与IL-6相互作用的独特的反式信号传导系统，其次是膜结合的gp130(CD130)。膜结合的IL-6R与IL-6的结合激活gp130，并构成膜结合和sIL-6R系统的信号传导通路。一旦gp130被激活，它将导致Janus激酶(JAK)-STAT3通路和JAK-SHP-2-促分裂原活化蛋白(MAP)激酶通路的下游活化。然后发生涉及炎症和免疫力的许多基因的激活。IL-6激活的终止受细胞因子合成1和-3(SOCS1和SOCS3)抑制剂的严格调控。
IL-6/IL-6R相互作用代表了经典的膜结合受体系统，该系统仅限于表达IL-6R的细胞(主要是肝细胞和免疫细胞)。但是，通过sIL-6R进行的信号传导与经典的IL-6R信号传导形成鲜明对比，被称为“反式信号传导”。在此，sIL-6R与循环的IL-6形成(IL-6/sIL-6R)结合，具有稳定循环的IL-6的趋势，从而提高表达gp130的细胞的利用率。这包括体内大多数细胞，极大地增强了IL-6的生物学作用并扩展其病理远景。血清sIL-6R水平也随着炎症而升高，通常被认为是急性和慢性组织炎症的重要标志。人体中的sIL-6R可以通过2种机制产生。首先，IL-6R的剪接突变可导致sIL-6R。其次，可能是在多形核白细胞的炎症刺激后，人IL-6R被去整合素蛋白酶(ADAM17和ADAM10)切割。切割在质膜的近端。另外，还可发生可溶性糖蛋白130(sgp130)的切割并导致IL-6/sIL-6R复合物的阻断。这将导致IL-6/sIL-6R无法激活表达gp130的细胞。本质上，sgp130可以被认为是IL-6/sIL-6R反信号传导通路的选择性抑制剂。
IL6R及其功能的详细描述可参见，例如，Jordan等人，"白介素-6，一种对炎症、自身免疫和移植物排斥反应起重要作用的细胞因子：IL-6受体阻滞剂的治疗意义"移植杂志101.1(2017):32-44；Baran,Paul,等人，"白介素(IL)-6，IL-6可溶性IL-6受体(sIL-6R)和IL-6sIL-6R sgp130复合物的平衡允许同时进行经典和反式信号传导"生物化学杂志293.18(2018):6762-6775；其各自通过引用整体并入本文。
在人基因组中，IL6R基因(基因ID：3570)座有10个外显子，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和外显子10。IL6R蛋白具有细胞外区域、跨膜区域和细胞质区域。人IL6R mRNA的核苷酸序列是NM_000565.3(SEQ ID NO：61)，人IL6R的氨基酸序列是NP_000556.1(SEQ ID NO：62)。下面列出了人IL6R核苷酸序列和氨基酸序列中每个外显子和每个区域的位置：
表5
Figure BDA0002644849280000311
Figure BDA0002644849280000321
在小鼠中，IL6R基因座具有10个外显子，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和外显子10(图13)。小鼠IL6R蛋白还具有细胞外区域、跨膜区域和细胞质区域。小鼠IL6R mRNA的核苷酸序列是NM_010559.3(SEQ ID NO：59)，小鼠IL6R的氨基酸序列是NP_034689.2(SEQ ID NO：60)。下面列出了小鼠IL6R核苷酸序列和氨基酸序列中每个外显子和每个区域的位置：
表6
Figure BDA0002644849280000322
Figure BDA0002644849280000331
小鼠IL6R基因(基因ID：16194)位于小鼠基因组的3号染色体上，其位于NC_000069.6(GRCm38.p4(GCF_000001635.24))的89869324至89913196之间。
5'-UTR是从89,913,162至89,913,040，外显子1是从89,913,162至89,912,955，第一内含子是从89,912,954至89,890,474，外显子2是从89,890,473至89,890,237，第二内含子是从89,890,236至89,889,311，外显子3是从89,889,310至89,889,187，第三内含子是从89,889,186至89,887,207，外显子4是从89,887,206至89,887,022，第四内含子是从89,887,021至89,886,709，外显子5是从89,886,708至89,886,542，第五内含子是从89,886,541至89,886,044，外显子6是从89,886,043至89,885,902，第六内含子是从89,885,901至89,878,896，外显子7是从89,878,895至89,878,849，第七内含子是从89,878,848至89,877,914，外显子8是从89,877,913至89,877,844，第八内含子是从89,877,843至89,876,909，外显子9是从89,876,908至89,876,809，第九内含子是从89,876,808至89,871,387，外显子是10从89,871,386至89,869,324，3'-UTR是从89,871,160至89,869,324(基于转录本NM_010559.3)。小鼠IL6R基因座的所有相关信息可在NCBI网站上找到，其基因ID为：16194，其通过引用整体并入本文。
图25显示了人IL6R氨基酸序列(NP_000556.1；SEQ ID NO：62)和小鼠IL6R氨基酸序列(NP_034689.2；SEQ ID NO：60)之间的比对。因此，人和小鼠IL6R之间的相应氨基酸残基或区域也可以见图25。
其他种属的IL6R基因、蛋白和基因座在本领域中也是已知的。例如，褐家鼠的IL6R的基因ID是24499，猕猴(Macaca mulatta)(猕猴(Rhesus monkey))的IL6R的基因ID是716690，家犬(犬)的IL6R的基因ID是612271，野猪(猪)的IL6R的基因ID是399522。这些基因的相关信息(例如，内含子序列、外显子序列、这些蛋白的氨基酸残基)可以在例如NCBI数据库中找到。
本公开提供了人或嵌合(例如，人源化)IL6R核苷酸序列和/或氨基酸序列。在一些实施方式中，小鼠外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、信号肽、细胞外区域、跨膜区域和/或细胞质区域的全部序列被相应的人序列替换。
在一些实施方式中，小鼠外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、信号肽、细胞外区域、跨膜区和/或细胞质区域的“区域”或“部分”被相应的人序列替换。
在一些实施方式中，人外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、信号肽、细胞外区域、跨膜区域、细胞质区域和/或编码序列的“区域”或“部分”被插入动物基因组中。术语“区域”或“部分”可以指至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350或400个核苷酸，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或150个氨基酸残基。
在一些实施方式中，“区域”或“部分”可以是与外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、信号肽、细胞外区域、跨膜区域和/或细胞质区域的同一性至少为50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。
在一些实施方式中，小鼠外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10的区域、部分或整个序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和外显子10)被人外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10的全部序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和外显子10)替换。
在一些实施方式中，小鼠外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、信号肽、细胞外区域、跨膜区域和/或细胞质区域的“区域”或“部分”失活或缺失。例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和外显子10的区域或部分缺失。
因此，在一些实施方式中，本公开还提供了嵌合(例如，人源化)IL6R核苷酸序列和/或氨基酸序列，其中在一些实施方式中，该序列的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％与小鼠IL6RmRNA序列(例如，SEQ ID NO：59)、小鼠IL6R氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：60)或其部分(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10)具有同一性或从其来源。在一些实施方式中，该序列的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％与人IL6R mRNA序列(例如，SEQ ID NO：61)、人IL6R氨基酸序列(例如，SEQ ID NO：62)或其部分(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10)具有同一性或从其来源。
在一些实施方式中，编码小鼠IL6R的全长氨基酸的序列(SEQ ID NO：60)被替换或失活。在一些实施方式中，该序列被编码人IL6R的相应区域的序列(例如，人IL6R的全长氨基酸(SEQ ID NO：62))替换。
在一些实施方式中，本文所述的核酸可操控的连接至启动子或调控元件，例如，内源小鼠IL6R启动子、诱导型启动子、增强子和/或小鼠或人调控元件。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或不连续的核苷酸)，其与部分或全部小鼠IL6R核苷酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10或SEQ ID NO：59)不同。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或不连续的核苷酸)，其与部分或全部小鼠IL6R核苷酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10或SEQ ID NO：59)相同。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或不连续的核苷酸)，其与部分或全部人IL6R核苷酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10或SEQ ID NO：61)不同。
在一些实施方式中，所述核酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个核苷酸，例如，连续或不连续的核苷酸)，其与部分或全部人IL6R核苷酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10或SEQ ID NO：61)相同。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或不连续的氨基酸残基)，其与部分或全部小鼠IL6R氨基酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10或SEQ ID NO：60)不同。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或不连续的氨基酸残基)，其与部分或全部小鼠IL6R氨基酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10或SEQ ID NO：60)相同。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或不连续的氨基酸残基)，其与部分或全部人IL6R氨基酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10或SEQ ID NO：62)不同。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列具有至少一部分(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸残基，例如，连续或不连续的氨基酸残基)，其与部分或全部人IL6R氨基酸序列(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10或SEQ ID NO：62)相同。
本公开还提供了一种人源化IL6R小鼠氨基酸序列，其中所述氨基酸序列选自：
a)SEQ ID NO：60或62所示的氨基酸序列；
b)与SEQ ID NO：60或62所示的氨基酸序列具有至少90％同源性或至少90％同一性的氨基酸序列；
c)由核酸序列编码的氨基酸序列，其中该核酸序列能够在低严格条件或严格条件下与编码SEQ ID NO：60或62所示的氨基酸的核苷酸序列杂交；
d)与SEQ ID NO：60或62所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列；
e)与SEQ ID NO：60或62所示的氨基酸序列的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸的氨基酸序列；或
f)一种氨基酸序列，其包含替换、缺失和/或插入一个或多个氨基酸到SEQ ID NO：60或62所示的氨基酸序列。
本公开还涉及一种核酸(例如，DNA或RNA)序列，其中所述核酸序列选自：
a)SEQ ID NO：59、61或65所示的核酸序列，或编码人源化小鼠的同源性IL6R氨基酸序列的核酸序列；
b)在低严格条件或严格条件下能够与SEQ ID NO：59、61或65所示的核苷酸序列杂交的核酸序列；
c)与SEQ ID NO：59、61或65所示的核苷酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列；
d)编码氨基酸序列的核酸序列，其中，该氨基酸序列与SEQ ID NO：59、61或65所示的氨基酸序列具有至少90％同源性或至少90％同一性；
e)编码氨基酸序列的核酸序列，其中，该氨基酸序列与SEQ ID NO：59、61或65中所示的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同源性或者至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性；
f)编码氨基酸序列的核酸序列，其中，该氨基酸序列与SEQ ID NO：59、61或65所示的氨基酸序列的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；和/或
g)编码氨基酸序列的核酸序列，其中，该氨基酸序列包含替换、缺失和/或插入一个或多个氨基酸到SEQ ID NO：59、61或65所示的氨基酸序列。
本公开进一步涉及一种人源化小鼠的IL6R基因组DNA序列。通过逆转录mRNA(通过其转录获得)获得的DNA序列与SEQ ID NO：59、61或65所示的序列同源的DNA序列一致或互补。
本公开还提供了一种氨基酸序列，其与SEQ ID NO：60或62所示的序列具有至少90％同源性或至少90％同一性，并且具有蛋白活性。在一些实施方式中，与SEQ ID NO：60或62所示的序列的同源性为至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在一些实施方式中，前述同源性为至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％或85％。
在一些实施方式中，与SEQ ID NO：60或62所示的序列的同一性百分比为至少或约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在一些实施方式中，前述同一性百分比为至少约60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％或85％。
本公开还提供了一种核苷酸序列，其与SEQ ID NO：59、61或65所示的序列具有至少90％同源性或至少90％同一性，并且编码具有蛋白活性的多肽。在一些实施方式中，与SEQ ID NO：59、61或65所示的序列的同源性为至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％。在一些实施方式中，前述同源性为至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％或85％。
还提供了包含本文所述核苷酸序列的细胞、组织和动物(例如，小鼠)，以及从内源性非人IL6R基因座表达人或嵌合(例如，人源化)IL6R的细胞、组织和动物(例如，小鼠)。
一方面，本公开还提供了确定IL6R拮抗剂(例如，抗IL6R抗体)减轻炎症的有效性的方法。所述方法包括将所述IL6R拮抗剂给药至本文所述的动物，其中所述动物患有炎症；以及确定所述IL6R拮抗剂对炎症减轻的抑制作用。
一方面，本公开还提供了确定IL6R拮抗剂(例如，抗IL6R抗体)治疗自身免疫疾病或过敏的有效性的方法。所述方法包括将所述IL6R拮抗剂给药至本文所述的动物，其中所述动物患有自身免疫疾病或过敏；以及确定所述IL6R拮抗剂治疗自身免疫疾病或过敏的抑制作用。
一方面，本公开还提供了确定IL6R拮抗剂(例如，抗IL6R抗体)治疗癌症的有效性的方法。所述方法包括将所述IL6R拮抗剂给药至本文所述的动物，其中所述动物具有肿瘤；以及确定所述IL6R拮抗剂对肿瘤的抑制作用。在一些实施方式中，肿瘤包括一个或多个注入动物中的癌细胞。在一些实施方式中，确定所述IL6R拮抗剂(例如，抗IL6R抗体)对肿瘤的抑制作用涉及测量动物中的肿瘤体积。
另一方面，本公开还提供了一种基因修饰的非人动物，其基因组包含动物内源性IL6R基因的断裂，其中，内源性IL6R基因的断裂包括内源性IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10)的缺失或其部分的缺失。
在一些实施方式中，内源性IL6基因的断裂包含缺失一个或多个外显子或部分外显子，所述外显子选自内源性IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10。
在一些实施方式中，内源性IL6R基因的断裂进一步包含缺失一个或多个内含子或部分内含子，所述内含子选自内源性IL6R基因的内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6、内含子7、内含子8和/或内含子9。
在一些实施方式中，其中，所述缺失可以包含缺失至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500或更多个核苷酸。
在一些实施方式中，内源性IL6R基因的断裂包含缺失外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10(例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200个核苷酸。
基因修饰的动物
如本文所用，术语“基因修饰的非人动物”是指在动物基因组的至少一条染色体中具有基因修饰(例如，外源DNA)的非人动物。在一些实施方式中，至少一个或多个细胞，例如，至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％的基因修饰的非人动物的细胞在其基因组中进行基因修饰。具有外源DNA的细胞可以是各种细胞，例如，内源性细胞、体细胞、免疫细胞、T细胞、B细胞、生殖细胞、胚泡或内源性肿瘤细胞。在一些实施方式中，提供了基因修饰的非人动物，其包含修饰的内源性IL6R或IL6基因座，所述IL6R或IL6基因座包含外源序列(例如，人序列)，例如，一个或多个非人序列被替换为一个或多个人序列。这些动物通常能够将修饰传给子代，即通过种系传递。
如本文所用，术语“嵌合基因”或“嵌合核酸”是指基因或核酸，其中该基因或核酸的两个或更多个部分来自不同种属，或该基因或核酸的至少一个序列与动物中的野生型核酸不对应。在一些实施方式中，嵌合基因或嵌合核酸具有来源于两个或更多个不同来源的序列的至少一部分，例如，编码不同蛋白的序列或编码两个或更多个不同种属的相同(或同源)蛋白的序列。在一些实施方式中，嵌合基因或嵌合核酸是人源化基因或人源化核酸。
如本文所用，术语“嵌合蛋白”或“嵌合多肽”是指蛋白或多肽，其中该蛋白或多肽的两个或更多个部分来自不同种属，或者该蛋白或多肽序列的至少一部分与动物中的野生型氨基酸序列不对应。在一些实施方式中，嵌合蛋白或嵌合多肽具有来源自两个或更多个不同来源(例如，不同种属的相同(或同源)蛋白)的序列的至少一部分。在一些实施方式中，嵌合蛋白或嵌合多肽是人源化蛋白或人源化多肽。
在一些实施方式中，嵌合基因或嵌合核酸是人源化IL6R基因或人源化IL6R核酸。在一些实施方式中，该基因或核酸的至少一个或多个部分来自人IL6R基因，该基因或核酸的至少一个或多个部分来自非人IL6R基因。在一些实施方式中，该基因或核酸包含编码IL6R蛋白的序列。编码的IL6R蛋白是功能性的或具有人IL6R蛋白或非人IL6R蛋白的至少一种活性，例如，与人或非人IL6结合和/或上调免疫应答。
在一些实施方式中，嵌合蛋白或嵌合多肽是人源化IL6R蛋白或人源化IL6R多肽。在一些实施方式中，该蛋白或多肽的氨基酸序列的至少一个或多个部分来自人IL6R蛋白，该蛋白或多肽的氨基酸序列的至少一个或多个部分来自非人IL6R蛋白。人源化IL6R蛋白或人源化IL6R多肽是功能性的或具有人IL6R蛋白或非人IL6R蛋白的至少一种活性。
在一些实施方式中，人源化IL6R蛋白或人源化IL6R多肽可以结合小鼠IL6，和/或上调免疫应答。在一些实施方式中，人源化IL6R蛋白或人源化IL6R多肽不能结合小鼠IL6，因此不能上调免疫应答。
在一些实施方式中，嵌合基因或嵌合核酸是人源化IL6基因或人源化IL6核酸。在一些实施方式中，该基因或核酸的至少一个或多个部分来自人IL6基因，该基因或核酸的至少一个或多个部分来自非人IL6基因。在一些实施方式中，该基因或核酸包含编码IL6蛋白的序列。编码的IL6蛋白是功能性的或具有人IL6蛋白或非人IL6蛋白的至少一种活性，例如，与人或非人IL6R结合和/或上调免疫应答。
在一些实施方式中，嵌合蛋白或嵌合多肽是人源化IL6蛋白或人源化IL6多肽。在一些实施方式中，该蛋白或多肽的氨基酸序列的至少一个或多个部分来自人IL6蛋白，并且蛋白或多肽的氨基酸序列的至少一个或多个部分来自非人IL6蛋白。人源化IL6蛋白或人源化IL6多肽是功能性的或具有人IL6蛋白或非人IL6蛋白的至少一种活性。
在一些实施方式中，人源化IL6蛋白或人源化IL6多肽可以结合小鼠IL6R，和/或上调免疫应答。在一些实施方式中，人源化IL6蛋白或人源化IL6多肽不能与小鼠IL6R结合，因此不能上调免疫应答。
所述基因修饰的非人动物可以是各种动物，例如，小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如，奶牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、犬、雪貂、灵长类动物(例如，狨猴、恒河猴)。对于不容易获得合适的基因修饰的胚胎干(ES)细胞的非人动物，采用其他方法来制备包含基因修饰的非人动物。这样的方法包括，例如，修饰非ES细胞基因组(例如，成纤维细胞或诱导的多能细胞)，并采用核转移将修饰的基因组转移至合适的细胞(例如，卵母细胞)，并在合适条件下的非人动物中孕育修饰的细胞(例如，经修饰的卵母细胞)形成胚胎。这些方法是本领域已知的，如A.Nagy,等人,“操作小鼠胚胎：实验室手册(第三版),”冷泉港实验室出版社,2003所述，其通过引用整体并入本文。
一方面，所述动物是哺乳动物，例如，属于超家族跳鼠科或鼠总科。在一些实施方式中，基因修饰的动物是啮齿动物。啮齿动物可以选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一些实施方式中，基因修饰的动物可以选自鼠科家族：丽仓鼠科(例如，丽仓鼠)、仓鼠科(例如，仓鼠、新世界鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺小鼠、冠鼠)、马岛鼠科(攀鼠、岩鼠、有尾巴的大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(例如，例如，多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如，鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在一些实施方式中，基因修饰的啮齿目动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、多刺小鼠和冠鼠。在一些实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一些实施方式中，所述动物是C57BL品系的小鼠，其选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10，C57BL/10ScSn，C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在一些实施方式中，小鼠是129品系，其选自：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2。这些小鼠被描述，如费斯汀等人，129品系小鼠的修订命名法，哺乳动物基因组10:836(1999)；如奥尔巴赫等人，129/SvEv和C57BL/6衍生的小鼠胚胎干细胞系的建立和嵌合体分析(2000)所述，二者均通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，基因修饰的小鼠是129品系和C57BL/6品系的杂交。在一些实施方式中，所述小鼠是129品系的杂交或BL/6品系的杂交。在一些实施方式中，小鼠是BALB品系，例如，BALB/c品系。在一些实施方式中，小鼠是BALB品系和另一品系的杂交。在一些实施方式中，小鼠来自杂种系(例如，50％BALB/c-50％12954/Sv；或50％C57BL/6-50％129)。
在一些实施方式中，所述动物是大鼠。所述大鼠可以选自Wistar大鼠、LEA品系、SD品系、Fischer品系、F344、F6和DA。在一些实施方式中，大鼠品系是选自Wistar、LEA、SD、Fischer、F344、F6和DA的两种或更多种品系的杂交。
所述动物可以具有一个或多个其他基因修饰和/或其他修饰，其适合于制备人源化IL6R或IL6动物的特定目的。例如，用于维持异种移植物的合适的小鼠可以具有一个或多个修饰、其全部或部分损害、失活或破坏非人动物的免疫系统。损害、失活或破坏非人动物的免疫系统可以包括，例如，通过化学手段(例如，施用毒素)、物理手段(例如，辐照动物)破坏造血细胞和/或免疫细胞和/或基因修饰(例如，敲除一个或多个基因)。这样的小鼠的非限制性实例包括，例如，NOD小鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、IL2Rγ基因敲除小鼠、NOD/SCID/γcnull小鼠(Ito,M.等人,NOD/SCID/γcnull小鼠:一种优良的人细胞移植的受体小鼠模型,血液100(9):3175-3182,2002)、B-NDG小鼠(Zhang,Meiling,等人，"B-NDG小鼠是免疫系统人源化和患者来源的异种移植的理想工具"AACR；癌症研究2018；78(13增刊):摘要编号1157或US20190320631，二者均通过引用整体并入本文)、裸鼠和Rag1和/或Rag2敲除小鼠。可以任选地对这些小鼠进行辐照，或以其他方式处理以破坏一个或多个免疫细胞类型。因此，在各种实施方式中，提供了基因修饰的小鼠，其可以包括内源性非人IL6R或IL6基因座的至少一部分的人源化，并且进一步包括修饰，其完全或部分损害、失活或破坏非人动物的免疫系统(或免疫系统的一个或多个细胞类型)。在一些实施方式中，修饰选自，例如，获得NOD小鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、IL-2Rγ敲除小鼠、NOD/SCID/γcnull小鼠、B-NDG小鼠、裸鼠、Rag1和/或Rag2敲除小鼠及其组合。这些基因修饰的动物如US20150106961所述，其通过引用整体并入本文。在一些实施方式中，所述小鼠可以包括用人成熟IL6R或IL6编码序列替换全部或部分成熟IL6R或IL6编码序列。
在一些实施方式中，基因修饰的非人动物包含在动物的内源性CD132基因中的断裂，其中内源性CD132基因的断裂包含内源性CD132基因的外显子2的缺失。
在一些实施方式中，内源性CD132基因的断裂进一步包括内源性CD132基因的外显子1的缺失。在一些实施方式中，内源性CD132基因的断裂包括内源性CD132基因的外显子1的部分缺失。在一些实施方式中，内源性CD132基因的断裂进一步包括缺失一个或多个外显子或部分外显子，所述外显子选自内源性CD132基因的外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8。在一些实施方式中，内源性CD132基因的断裂包括内源性CD132基因的外显子1-8的缺失。在一些实施方式中，内源性CD132基因的断裂进一步包括缺失一个或多个内含子或部分内含子，所述内含子选自内源性CD132基因的内含子1、内含子2、内含子3、内含子4、内含子5、内含子6和内含子7。在一些实施方式中，所述断裂可以由以下缺失组成，包括外显子1中的超过150个核苷酸的缺失；内含子1、外显子2、内含子2、外显子3、内含子3、外显子4、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6、内含子6、外显子7、内含子7的整体的缺失；和外显子8中的超过250个核苷酸的缺失。
在一些实施方式中，对于内源性CD132基因的断裂，所述动物是纯合子的。在一些实施方式中，对于内源性CD132基因的断裂，所述动物是杂合子的。
在一些实施方式中，所述断裂阻止了功能性CD132蛋白的表达。
在一些实施方式中，在内源性CD132基因座的其余外显子序列的长度小于内源性CD132基因的所有外显子序列的总长度的30％。在一些实施方式中，在内源性CD132基因座的其余序列的长度小于内源性CD132基因的全长序列的15％。
在一些实施方式中，所述动物是CD132敲除的非人动物，其中所述动物的基因组包含在内源性CD132基因座的5'至3'，(a)第一DNA序列；可选地，(b)包含外源序列的第二DNA序列；(c)第三DNA序列，其中第一DNA序列、可选的第二DNA序列和第三DNA序列是连接的，其中，第一DNA序列包含位于内含子1上游的内源性CD132基因序列，第二DNA序列可以具有0个核苷酸至300个核苷酸的长度，且第三DNA序列包括位于内含子7下游的内源性CD132基因序列。
在一些实施方式中，第一DNA序列包含具有10至100个核苷酸(例如，约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100个核苷酸)的长度(5'至3')的序列，其中，序列的长度是指从CD132基因的外显子1中的第一个核苷酸至第一DNA序列的最后一个核苷酸的长度。
在一些实施方式中，第一DNA序列包含来自内源性CD132基因的外显子1的至少10个核苷酸。在一些实施方式中，第一DNA序列具有来自内源性CD132基因的外显子1的至多100个核苷酸。
在一些实施方式中，第三DNA序列包含具有200至600个核苷酸(例如，约200、250、300、350、400、450、500、550、600个核苷酸)的长度(5'至3')的序列，其中，序列的长度是指从第三DNA序列中的第一个核苷酸至内源性CD132基因的外显子8中的最后一个核苷酸的长度。
在一些实施方式中，第三DNA序列包含来自内源性CD132基因的外显子8的至少300个核苷酸。在一些实施方式中，第三DNA序列具有来自内源性CD132基因的外显子8的最多400个核苷酸。
在一些实施方式中，所述动物是通过以下方法产生的基因修饰的非人动物，所述方法包括通过使用以下核酸酶敲除内源性CD132基因的一个或多个外显子：(1)第一核酸酶，其包含锌指蛋白、TAL效应子结构域或与内源性CD132基因的外显子1中或内源性CD132基因的外显子1上游的靶序列结合的单个指导RNA(sgRNA)DNA结合结构域，和(2)第二核酸酶，其包含锌指蛋白、TAL效应子结构域或与内源性CD132基因的外显子8中的序列结合的单个指导RNA(sgRNA)DNA结合结构域。
在US20190320631中描述了具有CD132基因断裂的动物，其通过引用整体并入本文。
在一些实施方式中，所述动物是哺乳动物，例如，猴、啮齿动物、大鼠或小鼠。在一些实施方式中，所述动物是NOD小鼠、NOD/scid小鼠或NOD/scid裸鼠。在一些实施方式中，所述动物进一步包括动物内源性β-2-微球蛋白(B2m)基因断裂和/或动物内源性ForkheadBox N1(Foxn1)基因断裂。
基因修饰的非人动物可以包含内源性非人IL6或IL6R基因座的修饰。在一些实施方式中，所述修饰可以包含编码成熟IL6或IL6R蛋白的至少一部分的人核酸序列(例如，与成熟的IL6或IL6R蛋白序列的同一性至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)。尽管还提供了可以包含本文所述修饰的基因修饰细胞(例如，ES细胞、体细胞)，但在许多实施方式中，该基因修饰的非人动物包含在该动物种系中内源性IL6或IL6R基因座的修饰。
基因修饰的动物可以从内源性小鼠基因座表达人IL6或IL6R(或嵌合IL6或IL6R)，其中内源性小鼠基因已被人基因和/或核苷酸序列替换，所述核苷酸序列编码人IL6或IL6R序列的区域或者与人IL6或IL6R序列的同一性至少为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的氨基酸序列。在多种实施方式中，内源性非人基因座被全部或部分修饰以包含编码成熟蛋白的至少一种蛋白编码序列的人核酸序列。
在一些实施方式中，基因修饰的小鼠从内源基因座表达人IL6或IL6R(或嵌合IL6或IL6R)，其受小鼠启动子、小鼠调控元件、人启动子和/或人调控元件的控制。内源性小鼠基因座的替换提供非人动物，其在合适的细胞类型以不会导致在本领域已知的某些其他转基因小鼠中观察到潜在病理的方式表达人蛋白或嵌合蛋白。在动物中表达的人蛋白或嵌合蛋白可以在动物中维持野生型小鼠或人蛋白的一种或多种功能。
例如，IL6R可以与人或非人IL6结合，并上调免疫应答，例如，上调免疫应答至少10％、20％、30％、40％或50％。如本文所用，术语“内源性IL6R”是指在任何基因修饰之前从非人动物(例如，小鼠)的内源性IL6R核苷酸序列表达的IL6R蛋白。相似地，术语“内源性IL6”是指在任何基因修饰之前从非人动物(例如，小鼠)的内源性IL6核苷酸序列表达的IL6蛋白。
所述动物的基因组可以包含编码与SEQ ID NO：2、4、6或8的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列的序列，和/或编码与SEQ ID NO：60或62的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列的序列。
所述基因修饰的动物的基因组可以包含在内源性IL6R基因座上插入编码人IL6R区域的序列。在一些实施方式中，插入的序列包含一个或多个序列，选自，例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9、外显子10、5'-UTR、3'UTR、第一内含子、第二内含子和第三内含子、第四内含子、第五内含子、第六内含子、第七内含子、第八内含子、第九内含子或第十内含子等。在一些实施方式中，插入的序列在内源性IL6R基因的调控区域内。在一些实施方式中，插入的序列是人IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10或其部分。
所述基因修饰的动物可以具有一个或多个表达具有细胞外区域和细胞质区域的人或嵌合IL6R(例如，人源化IL6R)的细胞，其中细胞外区域包含与人IL6R的细胞外区域具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％的同一性。在一些实施方式中，人源化IL6R的细胞外区域具有一种序列，其具有至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170或180个氨基酸(例如，连续或非连续)，所述氨基酸与人IL6R具有同一性。
所述基因修饰的动物的基因组可以包含在内源性IL6基因座编码内源性IL6区域的序列被编码人IL6相应区域的序列替换。在一些实施方式中，被替换的序列是内源性IL6基因座内的任何序列，例如，外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、5'-UTR、3'-UTR、第一内含子、第二内含子、第三内含子或第四内含子等。在一些实施方式中，被替换的序列在内源性IL6基因的调控区域内。在一些实施方式中，被替换的序列在人IL6基因的调控区域内。
由于人蛋白和非人蛋白的序列在许多情况下是不同的，因此与人蛋白结合的抗体不一定与非人蛋白具有相同的结合亲和力或对非人蛋白具有相同的作用。因此，表达人IL6的基因修饰的动物和具有人或人源化的IL6R细胞外区域的基因修饰的动物可用于更好地评估抗IL6或IL6R抗体在动物模型中的作用。
在一些实施方式中，所述非人动物可以在内源性IL6R基因座具有编码嵌合人/非人IL6R多肽的核苷酸序列，其中嵌合人/非人IL6R多肽的人部分包含人IL6R细胞外区域的一部分，并且其中所述动物在动物细胞表面上表达功能性IL6R。嵌合的人/非人IL6R多肽的人的部分可以包含人IL6R的部分外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10。在一些实施方式中，嵌合人/非人IL6R多肽的人的部分可以包含与SEQ ID NO：62的同一性至少为80％、85％、90％、95％或99％的序列。
在一些实施方式中，人源化IL6R基因座缺乏人IL6R 5’-UTR。在一些实施方式中，人源化IL6R基因座包含啮齿动物(例如，小鼠)5’-UTR。在一些实施方式中，所述人源化包括人3’-UTR。在适当的情况下，基于其5'-侧翼序列的相似性，可以合理地假设小鼠和人IL6R基因似乎受到类似的调控。如本发明所示，包含在内源性小鼠IL6R基因座的插入的人源化IL6R小鼠没有表现出明显的病理，所述内源性小鼠IL6R基因座保留了小鼠调控元件，但是包含人源化的IL6R编码序列。对于人源化IL6R，杂合子和纯合子的基因修饰的小鼠都是非常正常的。
在一些实施方式中，人源化IL6基因座具有人IL6 5'-UTR或内源性IL65'-UTR。在一些实施方式中，人源化IL6基因座包含啮齿动物(例如，小鼠)5'-UTR。在一些实施方式中，人源化包括人3'-UTR或内源性3'-URT。在适当的情况下，基于其5'-侧翼序列的相似性，可以合理地假设小鼠和人IL6基因似乎受到类似的调控。如本发明所示，在具有小鼠或人调控元件的内源性小鼠IL6基因座包含替换的人源化IL6小鼠没有表现出明显的病理。对于人源化IL6，杂合子和纯合子的基因修饰的小鼠都是非常正常的。
本公开进一步涉及通过上述方法产生的非人哺乳动物。在一些实施方式中，其基因组包含人类基因。在一些实施方式中，非人哺乳动物是啮齿动物，并且优选地，非人哺乳动物是小鼠。
在一些实施方式中，非人哺乳动物表达的蛋白是由人源化IL6R或IL6基因编码的。
另外，本公开还涉及荷瘤非人哺乳动物模型，其特征在于，所述非人哺乳动物模型通过本文所述的方法获得。在一些实施方式中，非人哺乳动物是啮齿动物(例如，小鼠)。
本公开进一步涉及来源于非人哺乳动物或其后代或荷瘤非人哺乳动物的细胞或细胞系，或其原代细胞培养物；来源于非人哺乳动物或其后代或荷瘤非人哺乳动物的组织、器官或其培养物；来源于非人哺乳动物或其后代(荷瘤时)或荷瘤非人哺乳动物的肿瘤组织。
本公开还提供了通过本文描述的任何方法产生的非人哺乳动物。在一些实施方式中，提供了非人哺乳动物；并且基因修饰的动物的基因组中含有编码人或人源化IL6R或IL6的DNA。
在一些实施方式中，非人哺乳动物包含本文所述的基因构建体。在一些实施方式中，提供了表达人或人源化IL6R或IL6的非人哺乳动物。在一些实施方式中，提供了人或人源化IL6R或IL6蛋白的组织特异性表达。
在一些实施方式中，人或人源化IL6R或IL6在基因修饰的动物中的表达是可控的，如通过添加特定的诱导物或阻遏物。
非人哺乳动物可以是本领域已知的任何非人动物，并且可以在本文所述的方法中使用。优选的非人哺乳动物是哺乳动物(例如，啮齿动物)。在一些实施方式中，非人哺乳动物是小鼠。
可以对上述非人哺乳动物进行基因、分子和行为分析。本公开还涉及由本发明提供的与相同基因型或其他基因型交配的非人哺乳动物产生的后代。
本公开还提供了来源自非人哺乳动物或其后代的细胞系或原代细胞培养物。例如，可以通过以下方法来制备基于细胞培养物的模型。细胞培养物可以通过从非人哺乳动物中分离获得，或者可以从使用相同构建体和标准细胞转染技术建立的细胞培养物中获得细胞。可以通过多种方法检测包含编码人IL6R或IL6蛋白的DNA序列的基因构建体的整合。
有许多可用于检测外源DNA的分析方法，包括核酸水平的方法(包括使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或Southern印迹的mRNA定量方法以及原位杂交)和蛋白水平的方法(包括组织化学、免疫印迹分析和体外结合研究)。另外，可以通过本领域技术人员众所周知的ELISA技术以定量目的基因的表达水平。许多标准分析方法可用于完成定量测量。例如，可以使用RT-PCR和杂交方法(包括RNase保护、Southern印迹分析、RNA点分析(RNAdot)分析)测量转录水平。免疫组织化学染色、流式细胞仪、Western印迹分析也可以用于评估人或人源化IL6R或IL6蛋白的存在。
本公开还提供了与本文所述的任何核苷酸序列的同一性至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的核酸序列，以及与本文所述的任何氨基酸序列的同一性至少为1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开涉及编码本文所述的任何肽的核苷酸序列，或由本文所述的任何核苷酸序列编码的任何氨基酸序列。在一些实施方式中，所述核酸序列是小于10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、150、200、250、300、350、400、500或600个核苷酸。在一些实施方式中，所述氨基酸序列是小于5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150 160、170、180、190或200个氨基酸残基。
在一些实施方式中，所述氨基酸序列(i)包含氨基酸序列；或(ii)由氨基酸序列组成，其中所述氨基酸序列是本文所述的任一序列。
在一些实施方式中，所述核酸序列(i)包含核酸序列；或(ii)由核酸序列组成，其中所述核酸序列是本文所述的任一序列。
为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，为了最佳比较目的，对序列进行比对(例如，可以在第一和第二氨基酸或核酸序列中的一个或两个中引入缺口，出于比较目的，可以忽略最佳比对和非同源序列)。为了比较目的而比对的参考序列的长度至少为参考序列的长度的80％，并且在一些实施方式中至少为90％、95％或100％。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置是相同的。考虑到缺口数和每个缺口的长度，两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置的数目的函数，这需要引入以实现两个序列的最佳比对。为了本发明的目的，序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用具有缺口罚分12，缺口延伸罚分4和移码缺口罚分5的Blossum 62评分矩阵完成。
具有相似理化特性(同源性百分比)的保守残基百分比，例如，亮氨酸和异亮氨酸，也可用于测量序列相似性。具有相似理化性质的氨基酸残基的家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。在许多情况下，同源性百分比高于同一性百分比。
还提供了包含本文所述核苷酸序列的细胞、组织和动物(例如，小鼠)，以及从内源性非人IL6R或IL6基因座表达人或嵌合(例如，人源化)氨基酸序列的细胞、组织和动物(例如，小鼠)。
载体
本公开涉及靶向载体，其包括：a)与待改变区域的5'末端同源的DNA片段，即5’臂，其选自长度为100至10,000个核苷酸的IL6R或IL6基因的基因组DNA；b)编码供体区域的预期/供体DNA序列；以及c)与待改变区域的3'末端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自长度为100至10,000个核苷酸的IL6R或IL6基因的基因组DNA。
在一些实施方式中，a)与待改变的转化区的5'末端同源的DNA片段，即5’臂选自与NCBI登录号NC_000071.6具有至少90％的同源性的核苷酸序列；c)与待改变的区域的3'末端同源的DNA片段，即3’臂选自与NCBI登录号NC_000071.6具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，a)与待改变的区域的5'末端同源的DNA片段，即5’臂选自NCBI登录号NC_000071.6(SEQ ID NO：9)的位置30006059至位置30011541的核苷酸；c)与待改变区域的3'末端同源的DNA片段，即3’臂选自NCBI登录号NC_000071.6(SEQ ID NO：10)的第30020010至30024779位的核苷酸。
在一些实施方式中，a)与待改变区域的5'末端同源的DNA片段，即5’臂选自NCBI登录号NC_000071.6(SEQ ID NO：46)的第30011619至30013191位的核苷酸；c)与待改变区域的3'末端同源的DNA片段，即3’臂选自NCBI登录号NC_000071.6(SEQ ID NO：47)的第30019976至30021303位的核苷酸。
在一些实施方式中，a)与待改变的转化区的5'末端同源的DNA片段，即5’臂选自与NCBI登录号NC_000069.6具有至少90％同源性的核苷酸序列；c)与待改变的区域的3'末端同源的DNA片段，即3’臂选自与NCBI登录号NC_000069.6具有至少90％同源性的核苷酸序列。
在一些实施方式中，a)与待改变区域的5'末端同源的DNA片段，即5’臂选自NCBI登录号NC_000069.6(SEQ ID NO：63)的第89917172至89913040位的核苷酸；c)与待改变区域的3'末端同源的DNA片段，即3’臂选自NCBI登录号NC_000069.6(SEQ ID NO：64)的第89913026至89908300位的核苷酸。
在一些实施方式中，靶向载体中选择的基因组核苷酸序列的长度可以是约或至少1kb、2kb、3kb、4kb、5kb、6kb、7kb、8kb、9kb或10kb(例如，4.7kb或12.7kb)。
在一些实施方式中，待改变区域是IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5(例如，小鼠IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5)。
在一些实施方式中，待改变区域是IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10(例如，小鼠IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10)。
靶向载体可以进一步包括选择的基因标志物。
在一些实施方式中，5’臂的序列如SEQ ID NO：9所示；3’臂的序列如SEQ ID NO：10所示。
在一些实施方式中，5’臂的序列如SEQ ID NO：46所示；3’臂的序列如SEQ ID NO：47所示。
在一些实施方式中，5’臂的序列如SEQ ID NO：63所示；3’臂的序列如SEQ ID NO：64所示。
在一些实施方式中，该序列来源于人(例如，NC_000007.14的22722839-22735564，或NC_000007.14的22727263-22732018)。例如，靶向载体中的靶区域是人IL6的核苷酸序列的部分或全部，优选人IL6的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。在一些实施方式中，人源化IL6的核苷酸序列编码人IL6蛋白的全部或部分(例如，SEQ ID NO：6或8)。
在一些实施方式中，该序列来源自人(例如，NM_000565.3的438-1844)。例如，靶向载体中的靶区域是人IL6R的核苷酸序列的部分或全部，优选为人IL6R的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10。在一些实施方式中，人源化IL6R的核苷酸序列编码人IL6R蛋白的全部或部分(例如，SEQ ID NO：62)。
在一些实施方式中，靶区域来源自人。在一些实施方式中，靶区域是人源化IL6R的核苷酸序列的部分或全部。在一些实施方式中，核苷酸序列显示为人IL6R的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10中的一个或多个。在一些实施方式中，靶区域是人源化IL6的核苷酸序列的部分或全部。在一些实施方式中，核苷酸序列显示为人IL6的外显子1，外显子2，外显子3，外显子4和/或外显子5中的一个或多个。
在一些实施方式中，人IL6R的核苷酸序列编码NCBI登录号NP_000556.1(SEQ IDNO：62)的人IL6R蛋白。在一些实施方式中，人IL6R的核苷酸序列选自NM_000565.3(SEQ IDNO：65的1-1407bp)的第438至1844位的核苷酸。
在一些实施方式中，人IL6的核苷酸序列编码NCBI登录号NP_000591.1(SEQ IDNO：6)或NP_001305024.1(SEQ ID NO：8)的人IL6蛋白。在一些实施方式中，人IL6的核苷酸序列选自以下核苷酸：NC_000007.14(SEQ ID NO：11)的第22722839至22735564位的核苷酸，或NC_000007.14(SEQ ID NO：48)的第22727263至位置22732018位的核苷酸。
本公开还涉及包含如本文所述的靶向载体的细胞。
另外，本公开进一步涉及非人哺乳动物细胞，其具有前述靶向载体中的任一种以及本文所述构建体的一个或多个体外转录本。在一些实施方式中，所述细胞包括Cas9mRNA或其体外转录本。
在一些实施方式中，细胞中的基因是杂合的。在一些实施方式中，细胞中的基因是纯合的。
在一些实施方式中，非人哺乳动物细胞是小鼠细胞。在一些实施方式中，细胞是受精卵细胞。
在一些实施方式中，如本文所述的核酸可操控的连接至土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)和/或polyA(多聚腺苷酸化)信号序列。WPRE元件是一个DNA序列，其在转录时产生一个增强表达的三级结构。该序列可用于增加病毒载体递送的基因的表达。WPRE是具有γ、α和β成分的三方调控元件。在一些实施方式中，WPRE与SEQ ID NO：87具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。
本公开还提供了用于构建人源化动物模型或敲除模型的载体。在一些实施方式中，所述载体包含sgRNA序列，其中sgRNA序列靶向IL6或IL6R基因，并且sgRNA在待改变的基因的靶序列上是唯一的，并且符合5'-NNN(20)-NGG3'或5'-CCN-N(20)-3'的序列排列规则；且在一些实施方式中，小鼠IL6基因中sgRNA的靶位点位于小鼠IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、内含子1、内含子2、内含子3、内含子4上、外显子1的上游或外显子5的下游。
在一些实施方式中，该序列的5'末端靶向序列如SEQ ID NO：22-28所示，并且sgRNA序列识别5'靶位点。在一些实施方式中，敲除序列的3'末端靶向序列如SEQ ID NO：29-36所示，并且sgRNA序列识别3'靶位点。因此，本公开提供了用于构建基因修饰的动物模型的sgRNA序列。在一些实施方式中，寡核苷酸sgRNA序列在SEQ ID NO：38-45中列出。
在一些实施方式中，本公开涉及包括sgRNA序列的质粒构建体(例如，pT7-sgRNA)，和/或包括该构建体的细胞。
制备基因修饰的动物的方法
可以通过本领域已知的几种技术制备基因修饰的动物，包括例如非同源末端连接(NHEJ)、同源重组(HR)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活子样效应子基核酸酶(TALEN)以及成簇的规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas系统。在一些实施方式中，使用同源重组。在一些实施方式中，CRISPR-Cas9基因组编辑用于产生基因修饰的动物。这些基因组编辑技术中有许多是本领域已知的，以及如Yin等人,"基因组编辑的传递技术"自然·评论·药物发现16.6(2017):387-399所述，其通过引用整体并入本文。还提供了许多其他方法，并且可以用于基因组编辑，例如，将基因修饰的核微注射至去核的卵母细胞中，以及将去核的卵母细胞与另一种基因修饰的细胞融合。
因此，在一些实施方式中，本公开提供了在动物的至少一个细胞中，编码内源IL6R或IL6区域的序列在内源IL6R或IL6基因座上被替换为编码人或嵌合IL6R或IL6相应区域的序列。在一些实施方式中，替换发生在生殖细胞、体细胞、胚泡或成纤维细胞等细胞中。体细胞或成纤维细胞的核可以插入去核的卵母细胞中。
图15显示了小鼠IL6R基因座的人源化策略。在图15中，打靶策略涉及一种包含5'末端同源臂、人IL6R基因片段、WPRE、polyA、Neo盒和3'同源臂的载体。该过程可以包括通过同源重组使用人序列替换内源性IL6R序列。图4和图6显示了小鼠IL6基因座的人源化策略。在图4和图6中，打靶策略涉及一种包含5'末端同源臂、人IL6基因片段、可选的Neo盒、3'同源臂的载体。该过程可以包括通过同源重组使用人序列替换内源性IL6序列。在一些实施方式中，在靶位点的上游和下游的切割(例如，通过锌指核酸酶、TALEN或CRISPR)可导致DNA双链断裂，通过同源重组使人IL6R或IL6序列替换内源性IL6R或IL6序列。
因此，在一些实施方式中，用于制备基因修饰的人源化动物的方法可包括在内源IL6R基因座(或位点)插入编码人IL6R区域的核酸序列的步骤。该序列可以包括人IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10的区域(例如，部分或全部区域)。在一些实施方式中，该序列包括人IL6R基因(例如，SEQ ID NO：62)的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6，、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10的区域。在一些实施方式中，插入的位点位于外显子1内。在一些实施方式中，序列在起始密码子之后立即插入。
在一些实施方式中，用于制备基因修饰的人源化动物的方法可以包括以下步骤：在内源性IL6基因座(或位点)，编码内源性IL6区域的核酸序列被替换为编码人IL6相应区域的序列。该序列可以包括人IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5的区域(例如，部分或全部区域)。在一些实施方式中，该序列包括人IL6基因(例如，SEQ IDNO：6或8)的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5的区域。在一些实施方式中，内源性IL6基因座是小鼠IL6的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
在一些实施方式中，修饰小鼠的IL6R或IL6基因座以表达嵌合人/小鼠IL6R或IL6肽的方法可以包括以下步骤：在内源性小鼠IL6R或IL6基因座，编码小鼠IL6R或IL6的核苷酸序列被替换为编码人IL6R或IL6的核苷酸序列，从而产生编码嵌合人/小鼠IL6R或IL6的序列。
在一些实施方式中，编码嵌合人/小鼠IL6R的核苷酸序列可以包括：包含小鼠5'-UTR的第一核苷酸序列；编码人IL6R的第二核苷酸序列；编码小鼠IL6R的第三核苷酸序列。
在一些实施方式中，本文所述的核苷酸序列彼此不重叠(例如，第一核苷酸序列、第二核苷酸序列和/或第三核苷酸序列不重叠)。在一些实施方式中，本文所述的氨基酸序列彼此不重叠。
本公开还提供了一种建立IL6R或IL6基因人源化动物模型的方法，包括以下步骤：
(a)根据本文所述的方法提供细胞(例如，受精卵细胞)；
(b)在液体培养基中培养细胞；
(c)将培养的细胞移植到雌性非人哺乳动物的输卵管或子宫中，使细胞在雌性非人哺乳动物的子宫中发育；
(d)鉴定步骤(c)妊娠雌性的后代中基因修饰的人源化非人哺乳动物中的种系传递。
在一些实施方式中，前述方法中的非人哺乳动物是小鼠(例如，C57BL/6或BALB/c小鼠)。
在一些实施方式中，步骤(c)中的非人哺乳动物是假孕(或伪孕)的雌性。
在一些实施方式中，用于上述方法的受精卵是C57BL/6或BALB/c受精卵。也可以在本文所述的方法中使用的其他受精卵包括但不限于FVB/N受精卵、DBA/1受精卵和DBA/2受精卵。
受精卵可以来自任何非人动物，例如，本文所述的任何非人动物。在一些实施方式中，受精卵细胞来源自啮齿动物。可以通过显微注射DNA将基因构建体引入受精卵中。例如，通过在显微注射后培养受精卵，可以将培养的受精卵转移到假孕的非人动物中，然后生下非人哺乳动物，从而产生在上述方法中所述的非人哺乳动物。
使用基因修饰的动物的方法
在内源性非人基因座并在内源性启动子和/或调控元件的控制下，使用同源或直系同源的人基因或人序列替换非人动物中的非人基因，可以获得具有可能与典型的基因敲除加转基因动物大不相同的品质和特征的非人动物。在典型的基因敲除加转基因动物中，内源性基因座被去除或破坏，将完全的人转基因插入动物的基因组，并可能随机整合到基因组中。通常，整合转基因的位置未知。人蛋白的表达通过人基因的转录和/或蛋白测定和/或功能测定进行测量。在人转基因中包含上游和/或下游人序列显然被认为足以为转基因的表达和/或调控提供适当的支持。
在某些情况下，具有人调控元件的转基因以非生理的或其他不令人满意的方式表达，并且实际上可能对动物有害。本公开证明在内源性调控元件的控制下，在内源性基因座使用人序列替换提供了生理学上合适的表达模式和水平，其产生有用的人源化动物，其关于被替换的基因的生理学在人源化动物的生理学背景上是有意义且适当的。
表达人或人源化IL6R和/或IL6蛋白的基因修饰的动物，例如，以生理学上合适的方式，提供了多种用途，包括但不限于开发针对人类疾病和病症的疗法，以及评估毒性和/或这些人类疗法在动物模型中的疗效。
在多方面，提供了表达人或人源化IL6R和/或IL6的基因修饰的动物，其可用于检测可降低或阻断IL6R和IL6之间的相互作用或IL6R和其他IL6R配体之间的相互作用的试剂，检测试剂是否可以增加或减少免疫应答，和/或确定试剂是否是IL6R或IL6激动剂或拮抗剂。基因修饰的动物可以是例如人类疾病的动物模型，例如，该疾病是通过基因诱导的(敲入或敲除)。在多个实施方式中，基因修饰的非人动物还包括受损的免疫系统，例如，基因修饰的非人动物以维持或保持人异种移植物，例如，人实体瘤或血细胞瘤(例如，淋巴细胞肿瘤，例如，B或T细胞肿瘤)的非人动物。
一方面，本公开涉及一种确定IL6-IL6R通路调控剂用于治疗疾病(例如，减轻炎症、治疗免疫疾病、治疗癌症)的有效性的方法。该方法包括将所述IL6-IL6R通路调控剂给药至本文所述的动物，以及确定所述IL6-IL6R通路调控剂对IL6-IL6R通路活性的作用。
一方面，本公开还提供了确定IL6R或IL6拮抗剂(例如，抗IL6R或抗IL6抗体)减轻炎症的有效性的方法。该方法包括将所述IL6R或IL6拮抗剂给药至本文所述的动物，其中所述动物患有炎症；以及确定所述IL6R或IL6拮抗剂对炎症减轻的抑制作用。
一方面，本公开还提供了确定IL6R或IL6拮抗剂(例如，抗IL6R或抗IL6抗体)治疗免疫疾病(例如，自身免疫疾病或过敏)的有效性的方法。所述方法包括将所述IL6R或IL6拮抗剂给药至本文所述的动物，其中所述动物患有免疫疾病；以及确定所述IL6R或IL6拮抗剂的抑制作用。
一方面，本公开还提供了确定IL6R或IL6拮抗剂(例如，抗IL6R或抗IL6抗体)治疗癌症的有效性的方法。该方法包括将所述IL6R或IL6拮抗剂给药至本文所述的动物，其中所述动物患有肿瘤；以及确定所述IL6R或IL6拮抗剂对肿瘤的抑制作用。在一些实施方式中，肿瘤包括一种或多种注入动物中的癌细胞。可以确定的抑制作用包括，例如，肿瘤尺寸或肿瘤体积的减少、肿瘤生长的减少、受试者中肿瘤体积的增加速率的减慢(例如，与治疗前同一受试者或未经治疗的另一受试者的肿瘤体积增加率相比)、发生转移的风险降低或发生一种或多种其他转移的风险降低、存活率增加和预期寿命增加等。受试者中的肿瘤体积可以通过各种方法确定，例如，通过直接测量、MRI或CT确定。
在一些实施方式中，抗IL6R抗体或抗IL6抗体阻止IL6与IL6R结合。在一些实施方式中，抗IL6R抗体或抗IL6抗体不能阻止IL6与IL6R结合(例如，内源性IL6R)。
在一些实施方式中，基因修饰的动物可以用于确定抗IL6R抗体是IL6R激动剂还是拮抗剂。在一些实施方式中，基因修饰的动物可以用于确定抗IL6抗体是IL6激动剂还是拮抗剂。在一些实施方式中，本文所述的方法还被设计为确定试剂(例如，抗IL6R或抗IL6抗体)对IL6R和/或IL6的作用，例如，试剂是否可以刺激巨噬细胞，和/或试剂是否可以上调免疫应答或下调免疫应答。在一些实施方式中，基因修饰的动物可以用于确定治疗剂的有效剂量，所述治疗剂用于治疗受试者的疾病，例如，免疫疾病、过敏或自身免疫疾病。
在一些实施方式中，通过爪厚、关节炎评分、行为评分、脑/脊髓IHC病理学、血清/脑匀浆Th17型多细胞因子检测和/或CNS和脾流式细胞术来评估抑制作用。部分这些评分如Anderson等人，"类风湿关节炎疾病活动度测量：美国风湿病学会在临床实践中的建议"关节炎护理与研究64.5(2012):640-647所述，其通过引用整体并入本文。
IL-6也是肿瘤微环境中的主要细胞因子之一。已知它在癌症中被下调。在几乎所有类型的肿瘤中均已报道其过度表达。炎症与癌症之间的强关联体现在肿瘤微环境中高水平的IL-6上，其中其通过调控癌症的所有标志和多种信号通路(包括细胞凋亡、存活、增殖、血管生成、侵袭性和转移，以及最重要的是新陈代谢)促进肿瘤发生。此外，IL-6通过促进修复和诱导抗信号传导(抗氧化剂和抗凋亡/促存活)通路来保护癌细胞免受治疗诱导的DNA损伤、氧化应激和细胞凋亡。因此，单用或与常规抗癌疗法联合阻断IL-6或抑制其相关信号传导可能是治疗以IL-6为主的信号传导的潜在治疗策略(Kumari等人，"白介素-6在肿瘤进展和治疗性抗拒中的作用"肿瘤生物学37.9(2016):11553-11572)。在一些实施方式中，抗IL6R或抗IL6抗体被设计用于治疗各种癌症。如本文所用，术语“癌症”是指具有自主生长能力的细胞，即以迅速增殖的细胞生长为特征的异常状态或状况。该术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而与组织病理学类型或侵入性阶段无关。如本文所用，术语“肿瘤”是指癌细胞，例如，大量癌细胞。可以使用本文描述的方法治疗或诊断的癌症包括各种器官系统的恶性肿瘤，如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴样、胃肠道和生殖泌尿道，以及恶性腺瘤，其包括恶性肿瘤，如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、肺部非小细胞癌、小肠癌和食道癌。还可以通过本领域已知的方法确定对肿瘤的抑制作用，例如，测量动物中的肿瘤体积，和/或确定肿瘤(体积)抑制率(TGITV)。可以使用公式TGITV(％)＝(1–TVt/TVc)x 100计算肿瘤生长抑制率，其中，TVt和TVc是治疗组和对照组的平均肿瘤体积(或重量)。
在一些实施方式中，抗体被设计用于治疗各种自身免疫性疾病或过敏(例如，过敏性鼻炎、鼻窦炎、哮喘、多发性硬化或湿疹)。因此，本文所述的方法可用于确定抗体抑制免疫应答的有效性。
本公开还提供了确定抗体(例如，抗IL6R抗体或抗IL6抗体)的毒性的方法。所述方法包括将抗体给药至本文所述的动物。然后，评估所述动物的体重变化、红细胞计数、血细胞比容和/或血红蛋白。在一些实施方式中，抗体可使红细胞(RBC)、血细胞比容或血红蛋白减少超过20％、30％、40％或50％。
本公开还涉及通过本文所述的方法产生的动物模型在开发与人细胞的免疫过程有关的产品、人抗体的生产或研究药理学、免疫学、微生物学和医学模型系统中的用途。
在一些实施方式中，本公开提供了通过本文所述方法产生的动物模型在涉及人细胞的免疫过程的动物实验疾病模型的生产和利用、病原体研究或新诊断策略和/或治疗策略的开发中的用途。
本公开还涉及通过本文所述方法产生的动物模型在筛选、验证、评价或研究IL6R或IL6基因功能、人IL6R或IL6抗体、用于人IL6R或IL6靶位点的药物、用于人IL6R或IL6靶位点的药物或疗效、用于免疫相关疾病的药物和抗肿瘤药物中的用途。
具有多个人或嵌合基因的基因修饰的动物模型
本公开进一步涉及用于产生具有多个人或嵌合基因的基因修饰的动物模型的方法。该动物可以包含人或嵌合IL6R基因和编码一个或多个另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6)的序列。或者，该动物可以包含人或嵌合IL6基因和编码一个或多个另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6R)的序列。
在一些实施方式中，另外的人或嵌合蛋白可以进一步包括，例如，白介素33(IL33)、IL3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL13、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、具有Ig和ITIM结构域蛋白的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域分子-3(TIM-3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD137、TNF受体超家族成员4(TNFRSF4或OX40)、CD47或SIRPa。
具有两个或多个人或嵌合基因(例如，人源化基因)的基因修饰的动物模型的产生方法可以包括以下步骤：
(a)使用如本文所述的引入人IL6R基因或嵌合IL6R基因的方法以获得基因修饰的非人动物；
(b)使基因修饰的非人动物与另一基因修饰的非人动物交配，然后筛选后代以获得具有两个或多个人或嵌合基因的基因修饰的非人动物。
在一些实施方式中，在该方法的步骤(b)中，可以将该基因修饰的动物与具有人或嵌合IL6、IL33、IL13、PD-1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、OX40、CD137、CD47或SIRPa基因修饰的非人动物交配。部分这些基因修饰的非人动物如下所述：PCT/CN2017/090320、PCT/CN2017/099577、PCT/CN2017/110435、PCT/CN2017/099576、PCT/CN2017/099574、PCT/CN2017/106024、PCT/CN2017/110494、PCT/CN2017/110435、PCT/CN2017/117984、PCT/CN2018/081628、PCT/CN2017/120388、PCT/CN2017/099575和PCT/CN2018/081629；它们各自通过引用以其整体并入本文。
同样，产生基因修饰的动物模型的方法可以包括以下步骤：
(a)使用如本文所述的引入人IL6基因或嵌合IL6基因的方法以获得基因修饰的非人动物；
(b)使基因修饰的非人动物与另外的基因修饰的非人动物交配，然后筛选后代以获得具有两个或多个人或嵌合基因的基因修饰的非人动物。
在一些实施方式中，直接对具有人或嵌合IL6、IL6R、IL33、IL13、PD-1、CTLA-4、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137、OX40、CD47或SIRPa基因的基因修饰的动物进行人源化。
在一些实施方式中，直接对具有人或嵌合IL6的基因修饰动物进行IL6R人源化。在一些实施方式中，直接对具有人或嵌合IL6R的基因修饰动物进行IL6人源化。
由于这些蛋白可能涉及不同的机制，因此靶向其中两个或多个这些蛋白的联合疗法可能是更有效的治疗方法。实际上，许多相关的临床试验正在进行中并显示出良好的效果。具有两个或多个人或人源化基因的基因修饰的动物模型可用于确定靶向这些蛋白中的两个或更多个的联合疗法的有效性，例如，用于治疗的抗IL6R抗体和另外的治疗剂。该方法包括将抗IL6R抗体和/或抗IL6抗体以及另外的治疗剂给药至动物，其中动物患有肿瘤；以及确定联合治疗对肿瘤的抑制作用。在一些实施方式中，所述另外的治疗剂是与IL6、IL6R、IL33、IL13、PD-1、CTLA-4、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR，CD137、OX40、CD47或SIRPa特异性结合的抗体。在一些实施方式中，另外的治疗剂是抗CTLA4抗体(例如，伊匹单抗)、抗CD20抗体(例如，利妥昔单抗)、抗EGFR抗体(例如，西妥昔单抗)和抗CD319抗体(例如，埃罗妥珠单抗)或抗PD-1抗体(例如，纳武单抗)。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。
材料和方法
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
ScaI，HindIII，SpeI，BglII，EcoRI，BamHI，SspI和EcoRV酶购自NEB，货号分别为：R3122M，R3104M，R0133M，R0144M，R3101M，R3136M，R3132M和R3195M；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
NOD-Prkdcscid IL-2rgnull(B-NDG)小鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号B-CM-001；
Cre工具鼠来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号B-EM-045；
NOD/scid小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司；
UCA试剂盒来源百奥赛图公司，货号为BCG-DX-001；
小鼠结肠癌细胞MC38购自上海酶研生物技术有限公司；
MEGAshortscriptTMKit(Ambion体外转录试剂盒)购自Thermo Fisher，货号为AM1354；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
LEGEND MAXTM Mouse IL-6 ELISA Kit with Pre-coated Plates(小鼠IL6试剂盒)购自BioLegend，货号431307；
LEGEND MAXTMHuman IL-6 ELISA Kit with Pre-coated Plates(人IL6试剂盒)购自BioLegend，货号430507；
PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit购自TAKARA Bio USA，货号6110A；
RNAprep pure Cell/Bacteria Kit(培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒)购自北京天根生化，货号DP430；
APC/Cy7 anti-mouse TCRβchain Antibody(mTcRβ-APC/Cy7)购自BioLegend，货号为：109220；
PE anti-mouse CD126(IL-6Rαchain)Antibody(mIL-6R PE)购自BioLegend，货号为：115805；
PE anti-human CD126(IL-6Rα)Antibody(hIL-6R PE)购自BioLegend，货号为：352803。
实施例1 IL6基因人源化小鼠
小鼠IL6基因(NCBI Gene ID：16193，Primary source：MGI：96559，UniProt ID：P08505，位于5号染色体NC_000071.6的第30013114至30019975位)和人IL6基因(NCBI GeneID：3569，Primary source：HGNC:6018，UniProt ID：P05231，位于7号染色体NC_000007.14的第22725889至22732002位)，鉴于人IL6和小鼠IL6具有多种亚型或多个转录本，如图1A-1D所示的基因示意图。图1A：鼠转录本NM_031168.2(SEQ ID NO：1)及其编码蛋白NP_112445.1(SEQ ID NO：2)；图1B：鼠转录本NM_001314054.1(SEQ ID NO：3)及其编码蛋白NP_001300983.1(SEQ ID NO：4)；图1C：人转录本NM_000600.4(SEQ ID NO：5)及其编码蛋白NP_000591.1(SEQ ID NO：6)图1D：人转录本NM_001318095.1(SEQ ID NO：7)及其编码蛋白NP_001305024.1(SEQ ID NO：8)。
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠IL6基因座引入编码人IL6蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人IL6蛋白。用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，如在内源小鼠IL6基因座上用人IL6基因序列替换特定小鼠IL6基因序列。在小鼠或人IL6调节元件的控制下，将至少包含小鼠ATG(起始密码子)至TGA(终止密码子)的约6.2kb序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL6基因序列，实现对小鼠IL6基因不同程度的人源化改造。其中一种较大范围的人源化序列替换策略得到的该人源化IL6基因序列示意图如图2所示。人IL6编码序列受人5’–UTR调控。
另一种IL6小鼠人源化策略是在IL6基因座附近进行较小范围的序列替换，得到的小鼠人源化IL6基因序列如示意图图3所示。人IL6编码序列受鼠5’–UTR调控。(后续实施例中将以鼠转录本NM_031168.2→NP_112445.1和人转录本NM_000600.4→NP_000591.1为例)。
如图4所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠IL6上游和下游的同源臂序列(内源IL6基因上游约5.5kb和下游约4.8kb的小鼠DNA)，以及约1.2kb人IL6序列。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：9)与NCBI登录号为NC_000071.6的第30006059-30011541位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：10)与NCBI登录号为NC_000071.6的第30020010-30024779位核苷酸序列相同。人IL6的DNA片段序列(SEQ ID NO：11)与NCBI登录号为NC_000007.14的第22722839-22735564位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统LoxP重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒的5’末端与人IL6序列相连，连接设计为5’-AGGCCCGTATTCCAGACCCAAGCTC
Figure BDA0002644849280000662
CCTGCAGCCAAGCTATCGAATTCCTGCAGCCCAATTCCGATCATATTCAATAACCCTTAATATAACTTCGTATAATGT-3’(SEQ ID NO：12)内，其中序列“AGCTC”的最后一个“C”是人的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0002644849280000663
的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒的3’末端与小鼠IL6基因座直接连接，其接合设计为5’-CTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAGGGGATCCACTAGT
Figure BDA0002644849280000664
CC AACATGAGCAAGGTCCTAAGTTACATCCAAACA-3’(SEQ ID NO：13)内，其中序列“CTAGT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0002644849280000661
的第一个“C”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接和/或直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将构建正确的靶向载体利用电穿孔并转染到C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用HindIII或SpeI消化细胞DNA并使用2个探针进行杂交，见表7)检测筛选出正确的阳性克隆细胞进行后续试验。
PCR测定包括下述引物：
F1：5’-TGCATCGCATTGTCTGAGTAGG-3’(SEQ ID NO：14)，
R1：5’-ACTTAGGACCTTGCTCATGTTGG-3’(SEQ ID NO：15)；
F2：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’(SEQ ID NO：16)，
R2：5’-CAGAAGCCTGATATCTTAGTGTC-3’(SEQ ID NO：17)；
Southern Blot检测包括如下探针引物：
探针1(Probe1)：
F：5’-CCATGGAAGGAGTTACAGAGA-3’(SEQ ID NO：18)，
R：5’-GTACTGAGGCATATAAAGTTTGC-3’(SEQ ID NO：19)；
探针2(Probe2)：
F：5’-GGGACCACTATGGTTGAAT-3’(SEQ ID NO：20)，
R：5’-CAGAAGCCTGATATCTTAGTGTC-3’(SEQ ID NO：21)；
表7具体探针及目的片段的长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
HindIII 探针1 10.1kb 13.1kb
SpeI 探针2 14.2kb 6.1kb
将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配，获得F2代纯合子鼠。将阳性鼠与Cre工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配，得到去Neo的表达人IL6蛋白的人源化IL6纯合子小鼠。通过PCR等常规方法鉴定子代小鼠鼠尾的基因组DNA。
此外，引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，以图3所示的IL6基因人源化小鼠为例，设计打靶策略如图6所示。由于靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率，因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别5’末端靶位点(sgRNA1-sgRNA7)、3’末端靶位点(sgRNA8-sgRNA15)的sgRNA序列。5’末端靶位点和3’末端靶位点分别位于小鼠IL6基因第1号外显子和第5号外显子上，在各sgRNA上的靶位点序列如下：
sgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO：22)：5’-AGTCTCAATAGCTCCGCCAGAGG-3’
sgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO：23)：5’-GTCTATACCACTTCACAAGTCGG-3’
sgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO：24)：5’-GGGCGCCTGCTGCTAGCTGATGG-3’
sgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO：25)：5’-TGCTGGCCAACCCACAATGCTGG-3’
sgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO：26)：5’-AGTCTCCTGCGTGGAGAAAAGGG-3’
sgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO：27)：5’-TGTGCTATCTGCTCACTTGCCGG-3’
sgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO：28)：5’-GCCTTCACTTACTTGCAGAGAGG-3’
sgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO：29)：5’-ATGCTTAGGCATAACGCACTAGG-3’
sgRNA9靶位点序列(SEQ ID NO：30)：5’-GTCCACAAACTGATATGCTTAGG-3’
sgRNA10靶位点序列(SEQ ID NO：31)：5’-TGCCTAAGCATATCAGTTTGTGG-3’
sgRNA11靶位点序列(SEQ ID NO：32)：5’-AAGTCACTTTGAGATCTACTCGG-3’
sgRNA12靶位点序列(SEQ ID NO：33)：5’-TAAGTCAGATACCTGACAACAGG-3’
sgRNA13靶位点序列(SEQ ID NO：34)：5’-TATTCTGTTACCTAGCCAGATGG-3’
sgRNA14靶位点序列(SEQ ID NO：35)：5’-TTCCAAGAAACCATCTGGCTAGG-3’
sgRNA15靶位点序列(SEQ ID NO：36)：5’-GAACTGACAATATGAATGTTGGG-3’
利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，其中，检测结果参见图7A-7B和表8。基于此，从中优先选择2个(分别是sgRNA5和sgRNA13)进行后续实验，在其5’末端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸(序列见表9)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-sgRNA5和pT7-sgRNA13。
pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的DNA片段(SEQ ID NO：37)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。
表8sgRNA的活性检测结果
Figure BDA0002644849280000691
Figure BDA0002644849280000701
表9sgRNA序列
Figure BDA0002644849280000702
图6显示的靶向载体上含有小鼠IL6基因的上游和下游的同源臂序列以及人IL6序列。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：46)与NCBI登录号为NC_000071.6的第30011619-30013191位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：47)与NCBI登录号为NC_000071.6的第30019976-30021303位核苷酸序列相同；人IL6的DNA片段序列(SEQ ID NO：48)与NCBI登录号为NC_000007.14的第22727263-22732018位核苷酸序列相同。改造后的人源化小鼠IL-6的mRNA序列如SEQ ID NO：49(基于转录本NM_000600.4-NP_000591.1)和SEQ ID NO：50(基于转录本NM_001318095.1-NP_001305024.1)所示，其对应编码的蛋白为人IL6蛋白，序列分别如SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：8所示。靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的载体质粒用于后续实验。
利用显微注射仪将预混好的pT7-sgRNA5、pT7-sgRNA13的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)和Cas9mRNA注射至B-NDG小鼠受精卵细胞质或细胞核中，按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(A.Nagy等编著，冷泉港实验室出版社2003年出版)中的方法进行胚胎的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管，生产基因改造人源化小鼠，得到首建鼠(即founder鼠，为F0代)。
可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠鼠尾的基因组DNA，部分F0代小鼠的鉴定结果见图8A-8B，其中，编号F0-005、F0-009、F0-021、F0-029、F0-032的5只小鼠均为阳性小鼠。PCR引物见表10。
表10 PCR引物及片段大小
Figure BDA0002644849280000711
将获得的F0代阳性小鼠与B-NDG小鼠交配可得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行鼠尾基因组DNA鉴定，部分F1代小鼠实验结果见图9A-9B，结果显示图中15只F1代小鼠均为阳性小鼠。进一步的使用Southern Blot技术进行检测，检测结果见图10A-10B，检测结果表明经PCR验证为阳性的15只小鼠均为阳性杂合子且无随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的基因工程小鼠。
Southern Blot检测时用BglII或ScaI消化DNA并使用2个探针进行杂交(见表11)，探针引物如下：
IL6-5’探针(IL6-5’Probe)：
F：5’-AACAGCTAGCAATGGAGTTGGGCTT-3’(SEQ ID NO：55)，
R：5’-AAAGGTGCTTTTTAAGTCGGGAGCA-3’(SEQ ID NO：56)；
IL6-A探针(IL6-AProbe)：
F：5’-AGGTGAGCTTGGAACTGAACCCAAG-3’(SEQ ID NO：57)，
R：5’-TACCCACTTTTTGTTGCTGCCTGGA-3’(SEQ ID NO：58)；
表11具体探针及目的片段的长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
BglII IL6-5’探针 3.3kb 10.3kb
ScaI IL6-A探针 -- 6.5kb
可通过常规检测方法确认上述阳性小鼠体内人或人源化IL6蛋白的表达情况，例如使用ELISA方法，选取B-NDG小鼠(+/+)和B-NDG背景人源化IL6小鼠杂合子(h/+)各1只，先给小鼠腹腔注射20μgLPS，2h后取血清，分别稀释1600或300倍后检测鼠或人IL6蛋白水平，检测结果(见图11A-11B)显示，在刺激后的B-NDG小鼠(+/+)体内只能检测到鼠IL6蛋白的表达，未检测人或人源化IL6蛋白的表达，在刺激后的B-NDG背景人源化IL6小鼠杂合子体内可检测到鼠和人IL6蛋白的表达。
另一个实验中，选取C57/BL6小鼠(+/+)和B-NDG背景的人源化IL6纯合子小鼠(H/H，此实施例制备)各1只，按照同样方法检测鼠或人IL6蛋白水平，检测结果(见图16A-16B)显示，在经LPS刺激后的C57/BL6小鼠(+/+)体内只能检测到鼠IL6蛋白的表达，未检测人或人源化IL6蛋白的表达，在刺激后的人源化IL6纯合子小鼠(H/H)体内只能检测到人IL6蛋白的表达，不能检测到鼠IL6蛋白的表达。
此外，由于Cas9的切割造成基因组DNA的双链断裂，通过染色体同源重组的修复方式会随机产生插入/缺失突变，本方法还可同时得到IL6蛋白功能丧失的基因敲除小鼠，可通过常规PCR的方法检测基因缺失情况，鉴定结果参见图12，显示编号为KO-001、KO-003、KO-005、KO-012、KO-013、KO-014、KO-018、KO-021、KO-025、KO-029的小鼠为IL6基因敲除小鼠。PCR分析包括下述引物，其中基因敲除小鼠得到的条带约为571bp。
5’MSD-F：5’-ATAAGGTTTCCAATCAGCCCCACCC-3’(SEQ ID NO：68)
5’MSD-R：5’-ACTTAGGACCTTGCTCATGTTGGGT-3’(SEQ ID NO：69)
实施例2 IL6R基因人源化小鼠
小鼠IL6R基因(NCBI Gene ID：16194，Primary source：MGI：105304，UniProt ID：P08505，位于3号染色体NC_000069.6的第89869324至89913196位)和人IL6R基因(NCBIGene ID：3570，Primary source：HGNC:6019，UniProt ID：P08887，位于1号染色体NC_000001.11的第154405193至154469450位)，鉴于人IL6R和小鼠IL6R具有多种亚型或多个转录本，如图13所示的基因示意图以鼠转录本NM_010559.3(SEQ ID NO：59)及其编码蛋白NP_034689.2(SEQ ID NO：60)、人转录本NM_000565.3(SEQ ID NO：61)及其编码蛋白NP_000556.1(SEQ ID NO：62)为例。
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠IL6R基因座引入编码人IL6R蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人IL6R蛋白。例如，可用基因编辑技术对小鼠胚胎干细胞进行修饰，在内源小鼠IL6R起始密码子(ATG)后插入可编码人或人源化IL6R蛋白的核苷酸序列，为了让人IL6R蛋白在小鼠体内可以更稳定、更好的表达，在人IL6R编码序列后插入辅助序列WPRE(土拨鼠乙肝病毒转录后调控元件)和/或polyA(多聚腺苷酸)。
最终得到的改造后的人源化小鼠IL6R基因部分示意图见图14所示，该小鼠通过内源性启动子调控人源IL6R序列的表达，体内表达的IL6R蛋白为人IL6R蛋白；并进一步的设计了如图15所示的打靶策略。由于所插入的重组序列后存在终止密码子和polyA信号，使图15所示人源化鼠IL6R基因的鼠源编码区不能正常转录和翻译。
鉴于人IL6R或小鼠IL6R具有多种亚型或多个转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。
如图15所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体＝上含有小鼠IL-6R上游和下游的同源臂序列(起始密码子上游约4.2kb(4133bp)，起始密码子下游约4.8kb(包括起始密码子；4727bp))，以及包含编码人IL6R蛋白和辅助序列WPRE、polyA(简称WPRE-PA片段)的IL-6R-A片段。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：63)与NCBI登录号为NC_000069.6的第89917172-89913040位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ IDNO：64)与NCBI登录号为NC_000069.6的第89913026-89908300位核苷酸序列相同；IL-6R-A片段序列(SEQ ID NO：65)中，第1-1407bp为编码人IL6R蛋白的序列，该序列与NCBI登录号为NM_000565.3的第438-1844位核苷酸序列相同。
靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统FRT重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒位于IL-6R-A片段上，其5’末端与WPRE-PA片段序列相连，连接设计为5’-GGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGGAACTTC-3’(SEQ ID NO：66)内，其中序列“GCTGGGGA”的“A”是WPRE-PA片段的最后一个核苷酸，序列“GAATT”的“G”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒3’末端与小鼠IL-6R基因座的接合设计为5’-TCTCTAGAAAGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCAGTACTGCTGCACGCTGTTGGTCGCCCTGC-3’(SEQ ID NO：67)内，其中序列“AGTACT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“GCTGC”的第一个“G”是鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建(插入)了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基(DTA)的编码序列)。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将构建正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。
经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot检测，筛选出正确的阳性克隆细胞。其中，Southern Blot检测分别用SspI、SpeI或EcoRV酶消化细胞DNA并使用3个探针(见表12)进行杂交，图17中检测结果表明2个克隆(1-G01、1-H01)目的条带大小正确，均为阳性杂合克隆且无随机插入。
表12具体探针及目的片段的长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
SspI IL6R-5’探针 14.1kb 7.2kb
SpeI IL6R-3’探针 19.3kb 12.6kb
EcoRV IL6R-Neo探针 -- 10.0kb
其中，PCR测定包括下述引物：
IL6R-F1：5’-AGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTC-3’(SEQ ID NO：70)，
IL6R-R1：5’-TGCCTGTAGGTGACTCTCAAGTCCA-3’(SEQ ID NO：71)；
IL6R-F2：5’-CTGGGATTCCACATCTGTTGTCCAC-3’(SEQ ID NO：72)，
IL6R-R2：5’-ACAGTGGCATTGTCTTCCGGCTCTA-3’(SEQ ID NO：73)。
Southern Blot检测包括如下探针引物：
IL6R-5’探针(IL6R-5’Probe)：
F：5’-CTGGGATTCCACATCTGTTGTCCAC-3’(SEQ ID NO：74)，
R：5’-TGCAGCTACCGTTCATGTCCCC-3’(SEQ ID NO：75)；
IL6R-3’探针(IL6R-3’Probe)：
F：5’-GTCAACAAGCACAACTCTTCCAGGG-3’(SEQ ID NO：76)，
R：5’-CCAGAGGCTTCTAAACCCTAAAGC-3’(SEQ ID NO：77)；
IL6R-Neo探针(IL6R-Neo Probe)：
F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：78)，
R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：79)。
将筛选出的阳性克隆根据本领域技术人员已知的任意方法将阳性克隆细胞(黑色小鼠)导入分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配，获得F2代纯合子鼠。
将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后(如图18所示)，再通过互相交配，得到IL6R基因人源化F2纯合子小鼠。通过PCR鉴定F1代小鼠鼠尾的基因组DNA，引物如表13所示。结果如图19A-19D所示，编号为IL6R-F1-1和IL6R-F1-2的2只小鼠检测结果与预期相符，均为阳性小鼠(其中编号为PC为阳性对照，WT为野生型)。这表明本方法可以构建出稳定传代且无随机插入的IL6R基因人源化工程小鼠。
表13PCR引物及片段大小
Figure BDA0002644849280000761
通过常规检测方法可确认小鼠体内人IL6R蛋白的表达情况，例如可用抗鼠IL6R抗体mIL6R PE和鼠源T细胞表面抗体mTcRβ-APC/Cy7或抗人IL6R抗体hIL6R PE和mTcRβ-APC/Cy7对小鼠的脾脏细胞识别染色后进行流式检测IL6R蛋白表达。流式分析结果(见图20A-20D)显示，在IL6R基因人源化纯合子小鼠脾脏内，可检测到表达人IL6R蛋白(图20D)，但不能检测表达鼠IL6R蛋白(图20B)的细胞；而在野生型C57BL/6小鼠的细胞内只能检测到表达鼠IL6R蛋白(图20A)，未检测到表达人或人源化IL6R蛋白的细胞(图20C)。
实施例3在IL6人源化小鼠体内进行人免疫系统重建
利用实施例1制得的IL6人源化小鼠(B-NDG背景)作为工具能够移植人CD34+细胞并实现人免疫系统重建。先通过辐照清髓，然后给小鼠尾静脉注射脐带血干细胞。移植后在不同时间收集血浆样品并进行检测。结果显示，IL6人源化小鼠(B-NDG背景)体内比野生型对照组有更高的人外周血植入，且且分化百分比更接近，含有部分成熟B细胞。
实施例4利用人源化小鼠进行疾病模型制备
利用本方法制得小鼠可以诱导或制备多重人类疾病模型，包括多发性硬化、哮喘、过敏、关节炎等模型，可以用于测试人特异性抗体的体内药效。例如，IL6基因人源化小鼠可用于评估人特异性IL6信号通路的拮抗剂的药效、药代动力学及在本领域已知的各种疾病模型中的体内治疗功效。
以实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)模型的制备为例，可以选取实施例1制备的人源化IL6小鼠(C57BL/6背景，约10周龄)，采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein，MOG)免疫1次(day0，皮下注射200μg/只)，并给予腹腔注射百日咳毒素(Pertussis Toxin，PTX)两次(day0和day2，剂量为400μg/只)，获得EAE小鼠模型。
将发病的EAE小鼠模型分组，通过灌胃或鼠尾静脉注射给药，可通过行为学评分、脑/脊髓IHC病理、血清/脑匀浆Th17型多细胞因子检测和CNS及脾的流式细胞术等多重检测指标评定不同人用药物的体内药效情况。
实施例5在人源化小鼠体内进行药效评估
利用本方法制得的人源化小鼠评估靶向人IL6或IL6R的调节剂药效。例如，以实施例2制备的IL6R人源化小鼠为例，先给纯合子小鼠接种肿瘤细胞系MC38，待肿瘤组织约100mm3时进行分组，基于肿瘤的大小，小鼠可分为对照组和治疗组。治疗组选择不同的抗人IL6抗体，对照组注射等体积的空白制剂。定期测量肿瘤体积并称量小鼠的体重。结果可通过比较小鼠体重变化和肿瘤大小，来有效评估化合物的体内安全性和体内药效。
实施例6双人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
利用本方法或制得的人源化IL6和/或IL6R小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。以IL6基因人源化小鼠为例，如，前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有其它基因修饰的小鼠，或者，也可选择对IL6人源化小鼠的受精卵细胞进行基因编辑，可以进一步得到IL6与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的人源化IL6和/或IL6R动物(小鼠)模型的纯合子或杂合子与其它对应基因修饰的纯合或杂合动物(小鼠)交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到IL6和/或IL6R与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子。利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人IL6和/或IL6R和其他基因调节剂的体内药效验证等。
以双人源化IL6/IL6R小鼠为例，由于鼠IL6与IL6R基因分别位于5号和3号染色体上，IL6人源化小鼠能够与IL6R人源化小鼠交配，再通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到双人源化IL6/IL6R小鼠。
进一步的对双人源化IL6/IL6R小鼠的表达情况进行检测。选取1只双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠(6-7周龄，其中IL6的人源化改造如图2所示)，另选1只野生型C57BL/6小鼠作为对照，按照前述IL6单基因人源化小鼠的检测方法检测小鼠和人的IL6蛋白表达情况。先给小鼠腹腔注射20μgLPS，2h后取血清，稀释后检测鼠和人IL6蛋白水平。检测结果(见图21A-21B)所示，在LPS刺激后的C57BL/6小鼠(WT)体内只能检测到鼠IL6蛋白的表达，未检测人或人源化IL6蛋白的表达。相对的，在刺激后的双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠(IL6H/H/IL6RH/H)体内可检测到人IL6蛋白的表达，未能检测到鼠IL6蛋白的表达。
另一个实验中，选取同样的双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠1只，另选1只野生型C57BL/6小鼠作为对照，按照前述IL6R单基因人源化小鼠的检测方法，流式检测小鼠体内IL6R蛋白的表达水平。结果显示，流式分析结果(见如图22A-22D所显示，在双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠脾脏内，可检测到表达人源化IL6R蛋白(图22D)，但未检测到表达鼠IL6R蛋白(图22B)的细胞；而在野生型C57BL/6小鼠的脾脏内只能检测到表达鼠IL-6R蛋白(图22A)，未检测到表达人或人源化IL6R蛋白的细胞(图22C)。
实施例7利用双基因人源化小鼠体内进行药效评估
利用实施例6制得的双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠构建了实验性胶原诱导的关节炎(collagen-induced arthritis model，CIA)模型，并进行了抗人IL6R抗体的药效评估。具体实验过程为，用4mg/mL的鸡二型胶原(美国Sigma公司)与4mg/mL弗氏完全佐剂(美国Sigma公司)等体积混合，冰上研磨至油包水状态的混合液供后续使用；对每只双人源化IL6/IL6R纯合子小鼠的尾根部、背部多点(2-3点)皮内注射0.1mL的上述混合液，在第一次免疫后的第21天对每只人源化鼠再次多点(2-3点)皮下注射0.1mL的上述混合液；对照组注射等体积PBS。
在第二次免疫后每周两次对各组小鼠的体重、足趾和关节炎指数情况进行监测，测量爪厚并记录每只小鼠的关节炎评分，共记录12次。其中，关节炎评分采用4级评分法，0、正常；1、一种关节类型(A、B、C)发红和肿胀；2、二种关节类型(A、B、C)发红和肿胀；3、三种关节类型(A、B、C)发红和肿胀；4、整个爪子最大的发红和肿胀；其中关节类型：A:趾间关节B:掌指关节C:腕和跗骨关节。免疫后第28天时，将评分不低于1分的小鼠进行分组入组，每组5只，具体分组和给药方案如表14所示。初步检测结果表明实验过程中，从30天起，CIA造模组G2、G3体重开始下降且与对照组G1相比有显著性；而与平均爪厚度和评分结果，都表明抗人IL-6R抗体具有抑制CIA模型小鼠发病的作用，而使用hIgG1/kappa则没有明显抑制CIA模型小鼠发病的作用。
表14分组和给药方案
分组 造模试剂 药物 剂量/给药方式/频率
G1 PBS / /
G2 CII hIgG1/kappa 8mg/kg；腹腔注射；每周给药2次，共给药6次
G3 CII 人IL-6R抗体 8mg/kg；腹腔注射；每周给药2次，共给药6次
以上研究表明本方法可用于评估人特异性IL6/IL6R信号通路的调节剂与IL6/IL6R信号通路调节剂联用的药效、药代动力学及在类风湿关节炎自身免疫病模型和本领域已知的各种疾病模型中的体内治疗功效。
其他实施方式
应当理解，尽管已经结合本发明的具体实施方式描述了本发明，但是前述描述旨在说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。
序列表
<110> 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司
北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 具有人或嵌合基因的基因修饰的非人动物
<130> 1
<160> 87
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1141
<212> DNA/RNA
<213> Mouse
<400> 1
aaatatgaga ctggggatgt ctgtagctca ttctgctctg gagcccacca agaacgatag 60
tcaattccag aaaccgctat gaagttcctc tctgcaagag acttccatcc agttgccttc 120
ttgggactga tgctggtgac aaccacggcc ttccctactt cacaagtccg gagaggagac 180
ttcacagagg ataccactcc caacagacct gtctatacca cttcacaagt cggaggctta 240
attacacatg ttctctggga aatcgtggaa atgagaaaag agttgtgcaa tggcaattct 300
gattgtatga acaacgatga tgcacttgca gaaaacaatc tgaaacttcc agagatacaa 360
agaaatgatg gatgctacca aactggatat aatcaggaaa tttgcctatt gaaaatttcc 420
tctggtcttc tggagtacca tagctacctg gagtacatga agaacaactt aaaagataac 480
aagaaagaca aagccagagt ccttcagaga gatacagaaa ctctaattca tatcttcaac 540
caagaggtaa aagatttaca taaaatagtc cttcctaccc caatttccaa tgctctccta 600
acagataagc tggagtcaca gaaggagtgg ctaaggacca agaccatcca attcatcttg 660
aaatcacttg aagaatttct aaaagtcact ttgagatcta ctcggcaaac ctagtgcgtt 720
atgcctaagc atatcagttt gtggacattc ctcactgtgg tcagaaaata tatcctgttg 780
tcaggtatct gacttatgtt gttctctacg aagaactgac aatatgaatg ttgggacact 840
attttaatta tttttaattt attgataatt taaataagta aactttaagt taatttatga 900
ttgatattta ttatttttat gaagtgtcac ttgaaatgtt atatgttata gttttgaaat 960
gataacctaa aaatctattt gatataaata ttctgttacc tagccagatg gtttcttgga 1020
atgtataagt ttacctcaat gaattgctaa tttaaatatg tttttaaaga aatctttgtg 1080
atgtattttt ataatgttta gactgtcttc aaacaaataa attatattat atttaaaaac 1140
c 1141
<210> 2
<211> 211
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 2
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Leu Met Leu Val Thr Thr Thr Ala Phe Pro Thr Ser Gln Val Arg Arg
20 25 30
Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr Pro Asn Arg Pro Val Tyr Thr Thr
35 40 45
Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr His Val Leu Trp Glu Ile Val Glu
50 55 60
Met Arg Lys Glu Leu Cys Asn Gly Asn Ser Asp Cys Met Asn Asn Asp
65 70 75 80
Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro Glu Ile Gln Arg Asn
85 90 95
Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys Leu Leu Lys
100 105 110
Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu Tyr His Ser Tyr Leu Glu Tyr Met Lys
115 120 125
Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala Arg Val Leu Gln Arg
130 135 140
Asp Thr Glu Thr Leu Ile His Ile Phe Asn Gln Glu Val Lys Asp Leu
145 150 155 160
His Lys Ile Val Leu Pro Thr Pro Ile Ser Asn Ala Leu Leu Thr Asp
165 170 175
Lys Leu Glu Ser Gln Lys Glu Trp Leu Arg Thr Lys Thr Ile Gln Phe
180 185 190
Ile Leu Lys Ser Leu Glu Glu Phe Leu Lys Val Thr Leu Arg Ser Thr
195 200 205
Arg Gln Thr
210
<210> 3
<211> 1083
<212> DNA/RNA
<213> Mouse
<400> 3
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tcaattccag aaaccgctat gaagttcctc tctgcaagag acttccatcc agttgccttc 120
ttgggactga tgctggtgac aaccacggcc ttccctactt cacaagtccg gagaggagac 180
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agaaatgatg gatgctacca aactggatat aatcaggaaa tttgcctatt gaaaatttcc 420
tctggtcttc tggagtacca tagctacctg gagtacatga agaacaactt aaaagataac 480
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caagagataa gctggagtca cagaaggagt ggctaaggac caagaccatc caattcatct 600
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tgtcaggtat ctgacttatg ttgttctcta cgaagaactg acaatatgaa tgttgggaca 780
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gattgatatt tattattttt atgaagtgtc acttgaaatg ttatatgtta tagttttgaa 900
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tgatgtattt ttataatgtt tagactgtct tcaaacaaat aaattatatt atatttaaaa 1080
acc 1083
<210> 4
<211> 165
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 4
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1 5 10 15
Leu Met Leu Val Thr Thr Thr Ala Phe Pro Thr Ser Gln Val Arg Arg
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Gly Asp Phe Thr Glu Asp Thr Thr Pro Asn Arg Pro Val Tyr Thr Thr
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Ser Gln Val Gly Gly Leu Ile Thr His Val Leu Trp Glu Ile Val Glu
50 55 60
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65 70 75 80
Asp Ala Leu Ala Glu Asn Asn Leu Lys Leu Pro Glu Ile Gln Arg Asn
85 90 95
Asp Gly Cys Tyr Gln Thr Gly Tyr Asn Gln Glu Ile Cys Leu Leu Lys
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Ile Ser Ser Gly Leu Leu Glu Tyr His Ser Tyr Leu Glu Tyr Met Lys
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Asn Asn Leu Lys Asp Asn Lys Lys Asp Lys Ala Arg Val Leu Gln Arg
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Asp Thr Glu Thr Leu Ile His Ile Phe Asn Gln Glu Ile Ser Trp Ser
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<210> 5
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cagagctgtg cagatgagta caaaagtcct gatccagttc ctgcagaaaa aggcaaagaa 600
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ttattaatat ttaaatatgt gaagctgagt taatttatgt aagtcatatt tatattttta 960
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gcagtttgaa tatcctttgt ttcagagcca gatcatttct tggaaagtgt aggcttacct 1080
caaataaatg gctaacttat acatattttt aaagaaatat ttatattgta tttatataat 1140
gtataaatgg tttttatacc aataaatggc attttaaaaa attcagcaaa aaaaaaa 1197
<210> 6
<211> 212
<212> PRT
<213> human
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50 55 60
Ser Ala Leu Arg Lys Glu Thr Cys Asn Lys Ser Asn Met Cys Glu Ser
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<210> 7
<211> 1006
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tatgaactcc ttctccacaa acatgtaaca agagtaacat gtgtgaaagc agcaaagagg 180
cactggcaga aaacaacctg aaccttccaa agatggctga aaaagatgga tgcttccaat 240
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tatacctaga gtacctccag aacagatttg agagtagtga ggaacaagcc agagctgtgc 360
agatgagtac aaaagtcctg atccagttcc tgcagaaaaa ggcaaagaat ctagatgcaa 420
taaccacccc tgacccaacc acaaatgcca gcctgctgac gaagctgcag gcacagaacc 480
agtggctgca ggacatgaca actcatctca ttctgcgcag ctttaaggag ttcctgcagt 540
ccagcctgag ggctcttcgg caaatgtagc atgggcacct cagattgttg ttgttaatgg 600
gcattccttc ttctggtcag aaacctgtcc actgggcaca gaacttatgt tgttctctat 660
ggagaactaa aagtatgagc gttaggacac tattttaatt atttttaatt tattaatatt 720
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ctaacttata catattttta aagaaatatt tatattgtat ttatataatg tataaatggt 960
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<212> PRT
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1 5 10 15
Pro Lys Met Ala Glu Lys Asp Gly Cys Phe Gln Ser Gly Phe Asn Glu
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35 40 45
Tyr Leu Glu Tyr Leu Gln Asn Arg Phe Glu Ser Ser Glu Glu Gln Ala
50 55 60
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85 90 95
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130 135
<210> 9
<211> 5483
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
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cccacggtca gctccttgct gcctgcttgt gatagttctt actatcaaga tacgcagttt 240
ctcttgcaca agcaagacta tcatactagg taacttagtc ccctgggaag atacaaccag 300
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accagctgaa aagcaaatat caagtcaagc tgcaaaatgt gcatggtgtc aaacaaccag 600
cataacttaa taatttagag atgccattac tgcatgaaca aacaataagt taacctttgg 660
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gctttgtgaa cagtgagcat ctatatactt cacttgatgc ttcccttctg aactccaact 780
agtttatatt cagagagtta ctctgtgttg tatatgcaga gaaatacaag aaagaaagaa 840
aagccaagcc aggtctggtg gcatgaattt gtaattctaa cttttcagaa agctgagaat 900
cactactaac aatctgaaag aacaagaacc accaacaata attactaaga aatgtgctat 960
tttattgcac tggcatgttt tcacacagac tctaacttct tgaatttgtt tattttgcct 1020
gaggccacca agatcctgga catgtaaaaa tggaaagcat cctaaacagc tgaaattagt 1080
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taaagcatct ccccactttc aatgcaaggt attttggtcc tgtttggtag aaagaaaaga 5340
acacaggagg ggagattggg agcccacact cgaattctgg ttctgccaaa ccagccttgt 5400
gatcttgggt aaattcccta ccacctctgg actccatcag taaaattggg cgtggactag 5460
gtgatctcat agatccttcc tgctggaaca ttctatggct tgaattatat tctcctaatt 5520
attgtcaaaa ttgctgttat taagtatcta ctgtgtgcca ggcactttaa ataaatattg 5580
tgtctaatct tcaaaacaaa tttgcaagga aggtttttgg agataaggaa actgagactc 5640
aggattaagt aacacaccta aagtcacagg tgagcttgga actgaaccca agtgtgcccc 5700
cactccactg gaatttgctt gccaggatgc caatgagttg tagcttcatt tttcttagag 5760
actttcctgg ctgtggttga acaatgaaaa ggccctctag tggtgtttgt tttagggaca 5820
cttaggtgat aacaattctg gtattctttc ccagacatgt aacaagagta acatgtgtga 5880
aagcagcaaa gaggcactgg cagaaaacaa cctgaacctt ccaaagatgg ctgaaaaaga 5940
tggatgcttc caatctggat tcaatgaggt accaacttgt cgcactcact tttcactatt 6000
ccttaggcaa aacttctccc tcttgcatgc agtgcctgta tacatataga tccaggcagc 6060
aacaaaaagt gggtaaatgt aaagaatgtt atgtaaattt catgaggagg ccaacttcaa 6120
gcttttttaa aggcagttta ttcttggaca ggtatggcca gagatggtgc cactgtggtg 6180
agattttaac aactgtcaaa tgtttaaaac tcccacaggt ttaattagtt catcctggga 6240
aaggtactct cagggccttt tccctctctg gctgcccctg gcagggtcca ggtctgccct 6300
ccctccctgc ccagctcatt ctccacagtg agataacctg cactgtcttc tgattatttt 6360
ataaaaggag gttccagccc agcattaaca agggcaagag tgcaggaaga acatcaaggg 6420
ggacaatcag agaaggatcc ccattgccac attctagcat ctgttgggct ttggataaaa 6480
ctaattacat ggggcctctg attgtccagt tatttaaaat ggtgctgtcc aatgtcccaa 6540
aacatgctgc ctaagaggta cttgaagttc tctagaggag cagagggaaa agatgtcgaa 6600
ctgtggcaat tttaactttt caaattgatt ctatctcctg gcgataacca attttcccac 6660
catctttcct cttaggagac ttgcctggtg aaaatcatca ctggtctttt ggagtttgag 6720
gtatacctag agtacctcca gaacagattt gagagtagtg aggaacaagc cagagctgtg 6780
cagatgagta caaaagtcct gatccagttc ctgcagaaaa aggtgggtgt gtcctcattc 6840
cctcaacttg gtgtggggga agacaggctc aaagacagtg tcctggacaa ctcagggatg 6900
caatgccact tccaaaagag aaggctacac gtaaacaaaa gagtctgaga aatagtttct 6960
gattgttatt gttaaatctt tttttgtttg tttggttggt tggctctctt ctgcaaagga 7020
catcaataac tgtattttaa actatatatt aactgaggtg gattttaaca tcaattttta 7080
atagtgcaag agatttaaaa ccaaaggcgg gggggcgggc agaaaaaagt gcatccaact 7140
ccagccagtg atccacagaa acaaagacca aggagcacaa aatgatttta agattttagt 7200
cattgccaag tgacattctt ctcactgtgg ttgtttcaat tctttttcct accttttacc 7260
agagagttag ttcagagaaa tggtcagaga ctcaagggtg gaaagaggta ccaaaggctt 7320
tggccaccag tagctggcta ttcagacagc agggagtaga cttgctggct agcatgtgga 7380
ggagccaaag ctcaataaga aggggcctag aatgaaaccc ttggtgctga tcctgcctct 7440
gccatttcta cttaagccag ggtttctcat atgttaacat gcatgggaat tccctgggca 7500
tcttcttgtg gtgtggagtc tgacttagca agcctcgggt gggtttgagg gtcaaatttc 7560
taccaggctt atatccctgg tgatgctgca gaattccagg accacacttg gaggtttaag 7620
gccttccaca agttacttat cccatatggt gggtctatgg aaaggtgttt cccagtcctc 7680
tttacaccac cggatcagtg gtctttcaac agatcctaaa gggatggtga gagggaaact 7740
ggagaaaagt atcagattta gaggccactg aagaacccat attaaaatgc ctttaagtat 7800
gggctcttca ttcatatact aaatatgaac tatgtgccag gcattatttc atatgacaga 7860
atacaaacaa ataagatagt gatgctggtc aggcttggtg gctcatgcct gtattcccta 7920
aactttggga gcctaaggtg agaactcctt gaactcctaa ggccaggagt tcaagaccag 7980
cctggataac atagcaagac cccatctcta caaaaaacca aaaccaaaca aacaaaaatg 8040
atagtggtgc ttccctcagg atgcttgtgg tctaatggga gacagaacag caaagggatg 8100
attagaagtt ggttgctgtg agccaggcac agtgctgata taatcccagc gctatgggag 8160
gctgaggtgg gtggatcatt tgaggccagg agtttaagac cagcctggtc aacatggtaa 8220
aaccccatct ctacttaaaa atacaaaaaa gttagccagg catggtggca tacacctgta 8280
acccagctac tcaggaggct gaggcacatg aatcacttga acccaggagg cagaggttgc 8340
tgtgcaccac tgcactccag cctgggtgac agaacgagac cttgactcaa aaaaaaaaaa 8400
aagaagtttg ttgctatgga agggtcctac tcagagcagg caccccagtt aatctcattc 8460
accccacatt tcacatttga acatcatccc atagcccaga gcatccctcc actgcaaagg 8520
atttattcaa catttaaaca atccttttta ctttcatttt ccttcaggca aagaatctag 8580
atgcaataac cacccctgac ccaaccacaa atgccagcct gctgacgaag ctgcaggcac 8640
agaaccagtg gctgcaggac atgacaactc atctcattct gcgcagcttt aaggagttcc 8700
tgcagtccag cctgagggct cttcggcaaa tgtagcatgg gcacctcaga ttgttgttgt 8760
taatgggcat tccttcttct ggtcagaaac ctgtccactg ggcacagaac ttatgttgtt 8820
ctctatggag aactaaaagt atgagcgtta ggacactatt ttaattattt ttaatttatt 8880
aatatttaaa tatgtgaagc tgagttaatt tatgtaagtc atatttatat ttttaagaag 8940
taccacttga aacattttat gtattagttt tgaaataata atggaaagtg gctatgcagt 9000
ttgaatatcc tttgtttcag agccagatca tttcttggaa agtgtaggct tacctcaaat 9060
aaatggctaa cttatacata tttttaaaga aatatttata ttgtatttat ataatgtata 9120
aatggttttt ataccaataa atggcatttt aaaaaattca gcaactttga gtgtgtcacg 9180
tgaagcttaa tataaacaag tttcttgtca ctgccaccac cacgaccaaa aaaagctaat 9240
caatcactat atataataca tatatatact atatataata aatatatata ctatatataa 9300
tacatatata cactatatat aatacatata tactatatat acacatatat actatatata 9360
cacatatata ttatgaatgt atatatatag tatatatagt atatatacta tgtatgtata 9420
tatatagtat atatagtata tatactatgt atgtgtatat atagtatata tagtatatat 9480
agtatatata ctatgtatgt atatatatag tatatatagt atatatactg tgtatgtata 9540
tatatagtat atatatacta tatatgcata catagtatat atgcatatat actatatata 9600
ctatatattt atatatacta tatactatat atactatata ctgtatatat actatatatg 9660
tatgtatacg atatatatat atactatata tgtacacaca cacatatata tatacatata 9720
agcacctact acatgccagg catcattaaa tgtgttgcat ccatcacgtc atttaacccc 9780
agcacttgca cactcctttc tggttgtgga agactaagta atttatctaa gtcacccagc 9840
tggaaggtca ggcagggacc cagatttgaa atccaagtct acctacctac aggtccccta 9900
ctcttaacct gtaggtccca ctgcctaccc aggaactgag ggatgatgta gaaaatccca 9960
aaacatgtta atatagggaa tacctataaa catgcaatca aagtctttgg gactatacaa 10020
ccactgtata aagcataaca atgtacaagc ttccaaacaa taactagaag ttctgcctcc 10080
ctcttctggg ttcctaaagc actgcaccta tctacctgtc aaagcatcta ccacattgta 10140
ccacacctta aaatcaatgg tttttttctt ctcagccagc atgtggatgc ctcaataaag 10200
cagactcctt tcatgaccta aaactaattt caggggggaa aaaaagacga gctgggcgca 10260
gtggctcacg cctataatcc cagcactttg ggaggctgag gcgggaggat cacttgaggt 10320
cagaagacca gcctggccaa catggcaaaa ccccgtctct actaaaaata caaaaattag 10380
ctgggcgtgg tggcgcacct ataatcccag ctactcagga agctgagaca tgataatcgc 10440
ttgagcctgg gaggtagagc ctggggctgc actccatcct gggcaacaga gggagattct 10500
gtctcaaaaa ataataataa taatataaat aaataaataa tttttttaaa aaaagactct 10560
ttcctatatt aatctttgca tcctgtgccc atggccccaa acctgaccaa tgaaggcccc 10620
agtaaatatt ttttgaacaa aagaaaatat agatgatcaa agataagaaa gataagaaga 10680
cacctcaatt cttgtaggca tatagtggta ggggaaatca ctaattctgt gtgtttatgt 10740
atcttcatct tcaggaaaaa tagcaagaat tagaaagaaa cactcaaagg acttccagag 10800
aaggcaatga atagccagtg catgtacacc tacctccatt tcctttgcca ctggcaataa 10860
tcttcatctg ccctctcccc tccccgacct aaagtggtag tgagagaggc aatctggaca 10920
acttaacatg gcctcgttta tccatctcaa cacgacactg ggaatttggt gcagatttcc 10980
cctttctaac ccctgcaata taaaagttct gtctccttat aaagcttttc cccattctac 11040
ccgctacaga cttcttcctc caggggagga gttcttctgg gtaagggaaa gtccacagag 11100
gtcaaaaacc gagaggagct gagccagaaa agagccacat actctgattt ctagaaacca 11160
cgcatcacaa gtgggcttcc caaaactagg gtcaagtcaa agaacaaaga gaaattgcga 11220
tcaactgatg ctttcattct tcaaacaaaa atgggttgag tttcatagat aagtcaggga 11280
aagctcctga gaaagaggtg aaagggtaga catgatccct gccctcttgt gtagcacact 11340
atggaaggga aaatagacat taaataaaga ctataaatgt gataaggttt ccaaaaagaa 11400
atgtgggctg tgctgagaac ccatactaga ggcacggata atctaagtga accctggttt 11460
ggctgctcac cactcgaaag ccagacatga gagacaaggt tggtgggagg aaaagccagt 11520
tcatcagaaa gccagtaaac caagaagatg gtgagctagt attttaaagt accatcttga 11580
attttaaaat ttatcacagt agtttttaaa gagaaacttg gtatgggaga tacgtgggag 11640
tggtgcgtgg tgtagggtct gtgtgtcttg ttctgatggc tatctcaggt aaccgcctgt 11700
ccggaggtct gtttgggatc atcttaactt cagctagatg atggattcat tgttcatgat 11760
tccttctaac caggaggatt ctgcaatggg ggctccttgc ctcgtttgtt taaagatcag 11820
cctctgggat ttttaaagca agagtataat tagataagca tacattgcca gaggggagtg 11880
tctagagagg gaaggaatga agaggtgaga ggaaagaaaa ggaagaaaaa gaaagtgggt 11940
aagaggcaga gcaagatggc agaatagaaa gctccaccaa tggaccccct ggcaaggata 12000
caaagttaac aactatctgc acagaaaaac aaacaaacaa aaaacacctt cataagaatc 12060
agaactcagg tgagcacaca tagtacctgg ttttaacttc atatcactga aacaggcact 12120
gaagaaatta aaaaacagtc ctgaatcaca atgctacccc tcccctatcc acagcagcag 12180
tggtgtggtg cggagaatgt ctctgggtgc tgggagaagg agaacacatc aattgtgggg 12240
cactgaactc agtactgtcc tgttagagga gaaaggaaaa ccagactaaa cttagctgat 12300
gtccactcac agagggagca tttaaaccat ccctagccca agaggaattg tcaatcccca 12360
gcagtccaaa cttgagtagc cgcaaaactc tccactgagg gccaaacttg aaaggcagtc 12420
taggccataa ggactgcaac tcttaggcaa gtactagggc tcaacaaggc ccggagacct 12480
agtggactga ggggacatgt gacataccga gataccagct gaggcagcca agggagtatt 12540
ggcttcaccc ctctcctaat cctaggctgc acaagtcata gcttcaaaag agactttttc 12600
tttctgcttg aggagagaag acagaagagt ggggaggact tggccttacc tcttggatac 12660
cagctcagct acagcaggat agggcactag tcagagtcat aaggcccgta ttccagaccc 12720
aagctc 12726
<210> 12
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
aggcccgtat tccagaccca agctcgtcga cctgcagcca agctatcgaa ttcctgcagc 60
ccaattccga tcatattcaa taacccttaa tataacttcg tataatgt 108
<210> 13
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 13
ctatacgaag ttattaggtc cctcgagggg atccactagt cttacccaac atgagcaagg 60
tcctaagtta catccaaaca 80
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 14
tgcatcgcat tgtctgagta gg 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 15
acttaggacc ttgctcatgt tgg 23
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 16
gctcgactag agcttgcgga 20
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 17
cagaagcctg atatcttagt gtc 23
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 18
ccatggaagg agttacagag a 21
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 19
gtactgaggc atataaagtt tgc 23
<210> 20
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 20
gggaccacta tggttgaat 19
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 21
cagaagcctg atatcttagt gtc 23
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 22
agtctcaata gctccgccag agg 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 23
gtctatacca cttcacaagt cgg 23
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 24
gggcgcctgc tgctagctga tgg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 25
tgctggccaa cccacaatgc tgg 23
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 26
agtctcctgc gtggagaaaa ggg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 27
tgtgctatct gctcacttgc cgg 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 28
gccttcactt acttgcagag agg 23
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 29
atgcttaggc ataacgcact agg 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 30
gtccacaaac tgatatgctt agg 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 31
tgcctaagca tatcagtttg tgg 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 32
aagtcacttt gagatctact cgg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 33
taagtcagat acctgacaac agg 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 34
tattctgtta cctagccaga tgg 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 35
ttccaagaaa ccatctggct agg 23
<210> 36
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 36
gaactgacaa tatgaatgtt ggg 23
<210> 37
<211> 132
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 37
gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60
agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120
tttaaaggat cc 132
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 38
agtctcctgc gtggagaaaa 20
<210> 39
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 39
taggagtctc ctgcgtggag aaaa 24
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 40
ttttctccac gcaggagact 20
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 41
aaacttttct ccacgcagga gact 24
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 42
tattctgtta cctagccaga 20
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 43
taggtattct gttacctagc caga 24
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 44
tctggctagg taacagaata 20
<210> 45
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 45
aaactctggc taggtaacag aata 24
<210> 46
<211> 1573
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 46
aatctactct aatcgcctgt gtgtttacac tgggttacat tctttagagt gtacttatat 60
tctccttttg cattctcaat ataaattaat ctgctagata taaagctgtt ctctttattt 120
tagtgtaatt tttttcttca cattgaattc taggagaaac tatgctagtg atatataatt 180
cttgaactat taaacatggg agcataagaa aacaagaatc ttaaggcaat ctgcagagtg 240
aagaagctga ttgtgatcct gagagtgtgt tttgtaaatg gttttggatt ttatgtacag 300
agcctacttt cagcctggaa tcattctgaa tgctagctag atatctggag acaggtggac 360
agaaaaccag gaactagtct gaaaaagaaa ctaaccaaag ggaagaagtc tgtttaagtt 420
tgacccagcc tagaagactt gagcattgga ggggttattc agagtgagac gtaccacctt 480
cagattcaaa tcctgtcatc cagtagaagg gagcttcaaa cacaagctag ctaagataca 540
atgaggtcct tcttcgatat ctttatcttc catataccat gaatcaaaga aacttcaaca 600
acatgaggac tgcaacagac cttcaagcct ccttgcatga cctggaaatg ttttggggtg 660
tcctggcagc agtgggatca gcactaacag ataagggcaa ctctcacaga gactaaaggt 720
cttaactaag aagatagcca agagaccact ggggagaatg cagagaatag gcttggactt 780
ggaagccaag attgcttgac aacagacaga agatatttct gtacttcacc cactttaccc 840
acctggcaac tcctggaaac aactgcacaa aatttggagg tgaacaaacc attagaaaca 900
actggtcctg acaagacaca ggaaaaacaa gcaatatgca acattactgt ctgttgtcca 960
ggttgggtgc tgggggtggg agagggagtg tgtgtctttg tatgatctga aaaaactcag 1020
gtcagaacat ctgtagatcc ttacagacat acaaaagaat cctagcctct tattcatgtg 1080
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtatgtgtg tgtcgtctgt 1140
catgcgcgcg tgcctgcgtt taaataacat cagctttagc ttctctttct ccttataaaa 1200
cattgtgaat ttcagttttc tttcccatca agacatgctc aagtgctgag tcacttttaa 1260
agaaaaaaaa gaagagtgct catgcttctt agggctagcc tcaaggatga cttaagcaca 1320
ctttcccctt cctagttgtg attctttcga tgctaaacga cgtcacattg tgcaatctta 1380
ataaggtttc caatcagccc cacccactct ggccccaccc ccaccctcca acaaagattt 1440
ttatcaaatg tgggattttc ccatgagtct caaaattaga gagttgactc ctaataaata 1500
tgagactggg gatgtctgta gctcattctg ctctggagcc caccaagaac gatagtcaat 1560
tccagaaacc gct 1573
<210> 47
<211> 1328
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 47
agtgactgaa agacgcatct cagctggtaa agttcttacc caacatgagc aaggtcctaa 60
gttacatcca aacatcctcc cccaaatcaa taattaagca ctttttatga catgtaaagt 120
taaataagaa gtgaaagctg cagatggtga gtgagagatg ccatgagaaa gcattgcata 180
taccacatta gttaatttca ggtcttgtac attcttttct ggacatgaga gagtaaggga 240
tctaactaag ccaccttttg gaaacataaa acataatctc tgatttgaat tcaagtctac 300
ctccctctag gtccattttt aacttttagt tgtaatttga agacagatat agaaaaatct 360
caaaacattt taatatgaat tatacactta gagttgatgt cacagattct gagaccatgg 420
gactacttag ataagatata gctccaaaag ataaaagcgc caaaataata tccagaagtt 480
ctgcctccct cgtctggagt ctccatgcac tgcatacctc ctattagtgt ctgccattat 540
atatcatacc ttaaaactga aggagctttc tatccaacta gcatatgggt ccctcaagaa 600
agcagactct agtgttttaa ccttttcgtg ctatatatag gtaaggagcc tgaacaaagg 660
agacccctat aagtatttgc tgaatgaaaa gagaatagtt aatcacagta taacaaaagt 720
cagttcttgg taaatacaga gcatttgggt gacattacag tgatgtgtta ttgtctttta 780
aaaaaagtag aaaagaatgg aaatgaaaca ttttaaggat ttctaaataa ggggcagata 840
caagagtatt ttgggtttta gcccagacta tactgtaggg ggaaagcctg tctcaacttt 900
atcccaattt catatatgta tgtccatata tgtgcatgta tgtgcacatg cacacatggg 960
tgtgtatgtg tgtgtgtatg gtgattatga tgatgatgaa gagatgatgt ctataactta 1020
atgtggttct tcctatttct gtacaaaact gagaatttgg tgccaattct ctctctctct 1080
ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctttttct 1140
tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct 1200
tcttcttctt cttcttcttc ttcttcttct tcttcttttt attattattt tatgtacatt 1260
ccagccattg cccccaggat cccctcccac agttcctcat cccattcctc tttccccttg 1320
cctccgag 1328
<210> 48
<211> 4756
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 48
atgaactcct tctccacaag taagtgcagg aaatccttag ccctggaact gccagcggcg 60
gtcgagccct gtgtgaggga ggggtgtgtg gcccagggag ggctggcggg cggccagcag 120
cagaggcagg ctcccagctg tgctgtcagc tcacccctgc gctcgctccc ctccggcaca 180
ggcgccttcg gtccagttgc cttctccctg gggctgctcc tggtgttgcc tgctgccttc 240
cctgccccag tacccccagg agaagattcc aaagatgtag ccgccccaca cagacagcca 300
ctcacctctt cagaacgaat tgacaaacaa attcggtaca tcctcgacgg catctcagcc 360
ctgagaaagg aggtgggtag gcttggcgat ggggttgaag ggcccggtgc gcatgcgttc 420
cccttgcccc tgcgtgtggc cgggggctgc ctgcattagg aggtctttgc tgggttctag 480
agcactgtag atttgaggcc aacggggccg actagactga cttctgtatt tatcctttgc 540
tggtgtcagg aagttccttt cctttctgga aaatgcagaa tgggtctgaa atccatgccc 600
acctttggca tgagctgagg gttattgctt ctcagggctt ccttttccct ttccaaaaaa 660
ttaggtctgt gaagctcctt tttgtccccc gggctttgga aggactagaa aagtgccacc 720
tgaaaggcat gttcagcttc tcagagcagt tgcagtactt tttggttatg taaactcaat 780
ggctaggatt cctcaaagcc attccagcta agattcatac ctcagagccc accaaagtgg 840
caaatcataa ataggttaaa gcatctcccc actttcaatg caaggtattt tggtcctgtt 900
tggtagaaag aaaagaacac aggaggggag attgggagcc cacactcgaa ttctggttct 960
gccaaaccag ccttgtgatc ttgggtaaat tccctaccac ctctggactc catcagtaaa 1020
attgggcgtg gactaggtga tctcatagat ccttcctgct ggaacattct atggcttgaa 1080
ttatattctc ctaattattg tcaaaattgc tgttattaag tatctactgt gtgccaggca 1140
ctttaaataa atattgtgtc taatcttcaa aacaaatttg caaggaaggt ttttggagat 1200
aaggaaactg agactcagga ttaagtaaca cacctaaagt cacaggtgag cttggaactg 1260
aacccaagtg tgcccccact ccactggaat ttgcttgcca ggatgccaat gagttgtagc 1320
ttcatttttc ttagagactt tcctggctgt ggttgaacaa tgaaaaggcc ctctagtggt 1380
gtttgtttta gggacactta ggtgataaca attctggtat tctttcccag acatgtaaca 1440
agagtaacat gtgtgaaagc agcaaagagg cactggcaga aaacaacctg aaccttccaa 1500
agatggctga aaaagatgga tgcttccaat ctggattcaa tgaggtacca acttgtcgca 1560
ctcacttttc actattcctt aggcaaaact tctccctctt gcatgcagtg cctgtataca 1620
tatagatcca ggcagcaaca aaaagtgggt aaatgtaaag aatgttatgt aaatttcatg 1680
aggaggccaa cttcaagctt ttttaaaggc agtttattct tggacaggta tggccagaga 1740
tggtgccact gtggtgagat tttaacaact gtcaaatgtt taaaactccc acaggtttaa 1800
ttagttcatc ctgggaaagg tactctcagg gccttttccc tctctggctg cccctggcag 1860
ggtccaggtc tgccctccct ccctgcccag ctcattctcc acagtgagat aacctgcact 1920
gtcttctgat tattttataa aaggaggttc cagcccagca ttaacaaggg caagagtgca 1980
ggaagaacat caagggggac aatcagagaa ggatccccat tgccacattc tagcatctgt 2040
tgggctttgg ataaaactaa ttacatgggg cctctgattg tccagttatt taaaatggtg 2100
ctgtccaatg tcccaaaaca tgctgcctaa gaggtacttg aagttctcta gaggagcaga 2160
gggaaaagat gtcgaactgt ggcaatttta acttttcaaa ttgattctat ctcctggcga 2220
taaccaattt tcccaccatc tttcctctta ggagacttgc ctggtgaaaa tcatcactgg 2280
tcttttggag tttgaggtat acctagagta cctccagaac agatttgaga gtagtgagga 2340
acaagccaga gctgtgcaga tgagtacaaa agtcctgatc cagttcctgc agaaaaaggt 2400
gggtgtgtcc tcattccctc aacttggtgt gggggaagac aggctcaaag acagtgtcct 2460
ggacaactca gggatgcaat gccacttcca aaagagaagg ctacacgtaa acaaaagagt 2520
ctgagaaata gtttctgatt gttattgtta aatctttttt tgtttgtttg gttggttggc 2580
tctcttctgc aaaggacatc aataactgta ttttaaacta tatattaact gaggtggatt 2640
ttaacatcaa tttttaatag tgcaagagat ttaaaaccaa aggcgggggg gcgggcagaa 2700
aaaagtgcat ccaactccag ccagtgatcc acagaaacaa agaccaagga gcacaaaatg 2760
attttaagat tttagtcatt gccaagtgac attcttctca ctgtggttgt ttcaattctt 2820
tttcctacct tttaccagag agttagttca gagaaatggt cagagactca agggtggaaa 2880
gaggtaccaa aggctttggc caccagtagc tggctattca gacagcaggg agtagacttg 2940
ctggctagca tgtggaggag ccaaagctca ataagaaggg gcctagaatg aaacccttgg 3000
tgctgatcct gcctctgcca tttctactta agccagggtt tctcatatgt taacatgcat 3060
gggaattccc tgggcatctt cttgtggtgt ggagtctgac ttagcaagcc tcgggtgggt 3120
ttgagggtca aatttctacc aggcttatat ccctggtgat gctgcagaat tccaggacca 3180
cacttggagg tttaaggcct tccacaagtt acttatccca tatggtgggt ctatggaaag 3240
gtgtttccca gtcctcttta caccaccgga tcagtggtct ttcaacagat cctaaaggga 3300
tggtgagagg gaaactggag aaaagtatca gatttagagg ccactgaaga acccatatta 3360
aaatgccttt aagtatgggc tcttcattca tatactaaat atgaactatg tgccaggcat 3420
tatttcatat gacagaatac aaacaaataa gatagtgatg ctggtcaggc ttggtggctc 3480
atgcctgtat tccctaaact ttgggagcct aaggtgagaa ctccttgaac tcctaaggcc 3540
aggagttcaa gaccagcctg gataacatag caagacccca tctctacaaa aaaccaaaac 3600
caaacaaaca aaaatgatag tggtgcttcc ctcaggatgc ttgtggtcta atgggagaca 3660
gaacagcaaa gggatgatta gaagttggtt gctgtgagcc aggcacagtg ctgatataat 3720
cccagcgcta tgggaggctg aggtgggtgg atcatttgag gccaggagtt taagaccagc 3780
ctggtcaaca tggtaaaacc ccatctctac ttaaaaatac aaaaaagtta gccaggcatg 3840
gtggcataca cctgtaaccc agctactcag gaggctgagg cacatgaatc acttgaaccc 3900
aggaggcaga ggttgctgtg caccactgca ctccagcctg ggtgacagaa cgagaccttg 3960
actcaaaaaa aaaaaaaaga agtttgttgc tatggaaggg tcctactcag agcaggcacc 4020
ccagttaatc tcattcaccc cacatttcac atttgaacat catcccatag cccagagcat 4080
ccctccactg caaaggattt attcaacatt taaacaatcc tttttacttt cattttcctt 4140
caggcaaaga atctagatgc aataaccacc cctgacccaa ccacaaatgc cagcctgctg 4200
acgaagctgc aggcacagaa ccagtggctg caggacatga caactcatct cattctgcgc 4260
agctttaagg agttcctgca gtccagcctg agggctcttc ggcaaatgta gcatgggcac 4320
ctcagattgt tgttgttaat gggcattcct tcttctggtc agaaacctgt ccactgggca 4380
cagaacttat gttgttctct atggagaact aaaagtatga gcgttaggac actattttaa 4440
ttatttttaa tttattaata tttaaatatg tgaagctgag ttaatttatg taagtcatat 4500
ttatattttt aagaagtacc acttgaaaca ttttatgtat tagttttgaa ataataatgg 4560
aaagtggcta tgcagtttga atatcctttg tttcagagcc agatcatttc ttggaaagtg 4620
taggcttacc tcaaataaat ggctaactta tacatatttt taaagaaata tttatattgt 4680
atttatataa tgtataaatg gtttttatac caataaatgg cattttaaaa aattcagcaa 4740
ctttgagtgt gtcacg 4756
<210> 49
<211> 1154
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 49
aaatatgaga ctggggatgt ctgtagctca ttctgctctg gagcccacca agaacgatag 60
tcaattccag aaaccgctat gaactccttc tccacaagcg ccttcggtcc agttgccttc 120
tccctggggc tgctcctggt gttgcctgct gccttccctg ccccagtacc cccaggagaa 180
gattccaaag atgtagccgc cccacacaga cagccactca cctcttcaga acgaattgac 240
aaacaaattc ggtacatcct cgacggcatc tcagccctga gaaaggagac atgtaacaag 300
agtaacatgt gtgaaagcag caaagaggca ctggcagaaa acaacctgaa ccttccaaag 360
atggctgaaa aagatggatg cttccaatct ggattcaatg aggagacttg cctggtgaaa 420
atcatcactg gtcttttgga gtttgaggta tacctagagt acctccagaa cagatttgag 480
agtagtgagg aacaagccag agctgtgcag atgagtacaa aagtcctgat ccagttcctg 540
cagaaaaagg caaagaatct agatgcaata accacccctg acccaaccac aaatgccagc 600
ctgctgacga agctgcaggc acagaaccag tggctgcagg acatgacaac tcatctcatt 660
ctgcgcagct ttaaggagtt cctgcagtcc agcctgaggg ctcttcggca aatgtagcat 720
gggcacctca gattgttgtt gttaatgggc attccttctt ctggtcagaa acctgtccac 780
tgggcacaga acttatgttg ttctctatgg agaactaaaa gtatgagcgt taggacacta 840
ttttaattat ttttaattta ttaatattta aatatgtgaa gctgagttaa tttatgtaag 900
tcatatttat atttttaaga agtaccactt gaaacatttt atgtattagt tttgaaataa 960
taatggaaag tggctatgca gtttgaatat cctttgtttc agagccagat catttcttgg 1020
aaagtgtagg cttacctcaa ataaatggct aacttataca tatttttaaa gaaatattta 1080
tattgtattt atataatgta taaatggttt ttataccaat aaatggcatt ttaaaaaatt 1140
cagcaaaaaa aaaa 1154
<210> 50
<211> 926
<212> DNA/RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 50
aaatatgaga ctggggatgt ctgtagctca ttctgctctg gagcccacca agaacgatag 60
tcaattccag aaaccgctat gtgtgaaagc agcaaagagg cactggcaga aaacaacctg 120
aaccttccaa agatggctga aaaagatgga tgcttccaat ctggattcaa tgaggagact 180
tgcctggtga aaatcatcac tggtcttttg gagtttgagg tatacctaga gtacctccag 240
aacagatttg agagtagtga ggaacaagcc agagctgtgc agatgagtac aaaagtcctg 300
atccagttcc tgcagaaaaa ggcaaagaat ctagatgcaa taaccacccc tgacccaacc 360
acaaatgcca gcctgctgac gaagctgcag gcacagaacc agtggctgca ggacatgaca 420
actcatctca ttctgcgcag ctttaaggag ttcctgcagt ccagcctgag ggctcttcgg 480
caaatgtagc atgggcacct cagattgttg ttgttaatgg gcattccttc ttctggtcag 540
aaacctgtcc actgggcaca gaacttatgt tgttctctat ggagaactaa aagtatgagc 600
gttaggacac tattttaatt atttttaatt tattaatatt taaatatgtg aagctgagtt 660
aatttatgta agtcatattt atatttttaa gaagtaccac ttgaaacatt ttatgtatta 720
gttttgaaat aataatggaa agtggctatg cagtttgaat atcctttgtt tcagagccag 780
atcatttctt ggaaagtgta ggcttacctc aaataaatgg ctaacttata catattttta 840
aagaaatatt tatattgtat ttatataatg tataaatggt ttttatacca ataaatggca 900
ttttaaaaaa ttcagcaaaa aaaaaa 926
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 51
cggtgaaaga atggtggact cacttc 26
<210> 52
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 52
tgcagaagag agccaaccaa ccaaa 25
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 53
ccctgcccag ctcattctcc acag 24
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 54
ccagagactg agccaccaat gagg 24
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 55
aacagctagc aatggagttg ggctt 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 56
aaaggtgctt tttaagtcgg gagca 25
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 57
aggtgagctt ggaactgaac ccaag 25
<210> 58
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 58
tacccacttt ttgttgctgc ctgga 25
<210> 59
<211> 3377
<212> DNA/RNA
<213> Mouse
<400> 59
cacaccgatc tgagccacgc cggggcgagc gctcgcagtg cgagctgagt gtggagcccg 60
aggccgaggg cgactgctct cgctgcccca gtctgccggc cgcccggccc cggctgcgga 120
gccgctctgc cgcccgccgt cccgcgtaga aggaagcatg ctgaccgtcg gctgcacgct 180
gttggtcgcc ctgctggccg cgcccgcggt cgcgctggtc ctcgggagct gccgcgcgct 240
ggaggtggca aatggcacag tgacaagcct gccaggggcc accgttaccc tgatttgccc 300
cgggaaggaa gcagcaggca atgttaccat tcactgggtg tactctggct cacaaaacag 360
agaatggact accacaggaa acacactggt tctgagggac gtgcagctca gcgacactgg 420
ggactattta tgctccctga atgatcacct ggtggggact gtgcccttgc tggtggatgt 480
tcccccagag gagcccaagc tctcctgctt ccggaagaac ccccttgtca acgccatctg 540
tgagtggcgt ccgagcagca ccccctctcc aaccacgaag gctgtgctgt ttgcaaagaa 600
aatcaacacc accaacggga agagtgactt ccaggtgccc tgtcagtatt ctcagcagct 660
gaaaagcttc tcctgccagg tggagatcct ggagggtgac aaagtatacc acatagtgtc 720
actgtgcgtt gcaaacagtg tgggaagcaa gtccagccac aacgaagcgt ttcacagctt 780
aaaaatggtg cagccggatc cacctgccaa ccttgtggta tcagccatac ctggaaggcc 840
gcgctggctc aaagtcagct ggcagcaccc tgagacctgg gacccgagtt actacttgct 900
gcagttccag cttcgatacc gacctgtatg gtcaaaggag ttcacggtgt tgctgctccc 960
ggtggcccag taccaatgcg tcatccatga tgccttgcga ggagtgaagc acgtggtcca 1020
ggtccgtggg aaggaggagc ttgaccttgg ccagtggagc gaatggtccc cagaggtcac 1080
gggcactcct tggatagcag agcccaggac caccccggca ggaatcctct ggaaccccac 1140
acaggtctct gttgaagact ctgccaacca cgaggatcag tacgaaagtt ctacagaagc 1200
aacgagtgtc ctcgccccag tgcaagaatc ctcgtccatg tccctgccca cattcctggt 1260
agctggagga agcttggcgt ttgggttgct tctctgtgtc ttcatcatcc tgagactcaa 1320
gcagaaatgg aagtcagagg ctgagaagga aagcaagacg acctctcctc cacccccacc 1380
gtattccttg ggcccactga agccgacctt ccttctggtt cctctcctca ccccacacag 1440
ctctgggtct gacaataccg taaaccacag ctgcctgggt gtcagggacg cacagagccc 1500
ttatgacaac agcaacagag actacttatt ccccagataa tcatctggat ggtacctggc 1560
agctggcagg gcaccacgag atcagcacac aagtttctca tgcgggtccc atccacctgg 1620
ggtggggtgg ggcgggcggg gctgcagctt cactaaccca caagagctct gcacaggttc 1680
tgagtaggtg cagctggtgc tgcataggct ctgaaggaag gaaggggctg tgaggaacac 1740
aggccattgt gaagacagct tgtgatgact gaatagagat gcccgtcagc tccacatctg 1800
atagtggctc acaagctgca ccctcaggag gcctcagaaa ggggctccaa aggctgcccc 1860
agctgcctcg ctctgcctca ctgccccaag ccacctttta gctctcgaac tcctaaagtc 1920
caagcacttt gccattctct ttccgaggcc actgaggccg ggtggaagct tggttccgat 1980
ttccttctca acatctggaa agcagctggg cccggtggtg gtgactaata tctcagggcc 2040
tgatggttta cgcgagtgac aatttctcac aagcagtttt taaatgtgaa tgatgacccc 2100
aggcactgct ggctgcggag gcttcatttt cctcttcgat ctcaggactt caggcgaaaa 2160
gcggagtgga agtagagagc ggatgggtgt ccaccgtcct catggtactt gcgggaggta 2220
cagcctggaa aacacgtttc ctgtccccct actctcccag gagagggatg atggtagggg 2280
gtgcctcttc cagggcggag agaactactt taccccagcc ttgcccattc tgatttcaac 2340
tggactggag ctactaggaa agtcgacatt catgcaaaaa gaaaaaacgt taactagcaa 2400
gaatgcactt tcattttggt ttttagagaa ctgttgcctg tttctctcaa gagtctggaa 2460
gaggccgctc actgcacact actgtatgaa ccctcactgc ccaccctgga ggaccaagtg 2520
cagtaacggt agcccaaaca ccaagtcaag tgaaaatcga gggaaaaaaa aaacaaacaa 2580
gcaacaaaaa aaaaaaacca aaactaaact aaaaaacaaa tcaccccccc aaaaaaaaac 2640
aaaaccaaaa accaaaaaaa acaaaaaaac aaaacaacaa caacaaaaaa aacccaaacc 2700
aacccgctgt ttcctataac agaaaagcct ttggtttcat tttttatttt gatttttttg 2760
tcttaaaaag tataaaaata gcctgtccat gctctgcttc agggaatgag cctgtgaaca 2820
ctcccaggcg caggcaggaa gggtgtctgc ttcctgctac acctcactgc caccttggcc 2880
ttccttgctt tacgtttgac tgagtggcct cagatgcttt cccctggggc tttgaggaat 2940
ccagtgatgt tagtggtcac cgaggagacc acagagccac agtgtggtgc ttagattaaa 3000
gtgacttctg caaccacagc accccacacc tgccgtctta ctgaactatg ccagtaactt 3060
gccttttctg ccaccaccac gagacgagac gggcagagct cggaagctgt caccccatgc 3120
cctctgcttg tccgctctag gggccactga cctaagcatt agttatttta ttttatttta 3180
tttttttgtg ggttttgtac attttaggtc ctgttgctgt cttagaaaag gctctgtagg 3240
ttgacagaaa atcaggccaa gtattcatgt tttgtttttt ttttttttcc ttctttcctc 3300
ctttgctaag tttttgggac tcaagggtag caaaactgct gtgaaaggga aatttattaa 3360
aaatgttaca gatcgtg 3377
<210> 60
<211> 460
<212> PRT
<213> Mouse
<400> 60
Met Leu Thr Val Gly Cys Thr Leu Leu Val Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Ala Val Ala Leu Val Leu Gly Ser Cys Arg Ala Leu Glu Val Ala Asn
20 25 30
Gly Thr Val Thr Ser Leu Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Ile Cys Pro
35 40 45
Gly Lys Glu Ala Ala Gly Asn Val Thr Ile His Trp Val Tyr Ser Gly
50 55 60
Ser Gln Asn Arg Glu Trp Thr Thr Thr Gly Asn Thr Leu Val Leu Arg
65 70 75 80
Asp Val Gln Leu Ser Asp Thr Gly Asp Tyr Leu Cys Ser Leu Asn Asp
85 90 95
His Leu Val Gly Thr Val Pro Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu Glu
100 105 110
Pro Lys Leu Ser Cys Phe Arg Lys Asn Pro Leu Val Asn Ala Ile Cys
115 120 125
Glu Trp Arg Pro Ser Ser Thr Pro Ser Pro Thr Thr Lys Ala Val Leu
130 135 140
Phe Ala Lys Lys Ile Asn Thr Thr Asn Gly Lys Ser Asp Phe Gln Val
145 150 155 160
Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Gln Leu Lys Ser Phe Ser Cys Gln Val Glu
165 170 175
Ile Leu Glu Gly Asp Lys Val Tyr His Ile Val Ser Leu Cys Val Ala
180 185 190
Asn Ser Val Gly Ser Lys Ser Ser His Asn Glu Ala Phe His Ser Leu
195 200 205
Lys Met Val Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Leu Val Val Ser Ala Ile
210 215 220
Pro Gly Arg Pro Arg Trp Leu Lys Val Ser Trp Gln His Pro Glu Thr
225 230 235 240
Trp Asp Pro Ser Tyr Tyr Leu Leu Gln Phe Gln Leu Arg Tyr Arg Pro
245 250 255
Val Trp Ser Lys Glu Phe Thr Val Leu Leu Leu Pro Val Ala Gln Tyr
260 265 270
Gln Cys Val Ile His Asp Ala Leu Arg Gly Val Lys His Val Val Gln
275 280 285
Val Arg Gly Lys Glu Glu Leu Asp Leu Gly Gln Trp Ser Glu Trp Ser
290 295 300
Pro Glu Val Thr Gly Thr Pro Trp Ile Ala Glu Pro Arg Thr Thr Pro
305 310 315 320
Ala Gly Ile Leu Trp Asn Pro Thr Gln Val Ser Val Glu Asp Ser Ala
325 330 335
Asn His Glu Asp Gln Tyr Glu Ser Ser Thr Glu Ala Thr Ser Val Leu
340 345 350
Ala Pro Val Gln Glu Ser Ser Ser Met Ser Leu Pro Thr Phe Leu Val
355 360 365
Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Leu Leu Leu Cys Val Phe Ile Ile
370 375 380
Leu Arg Leu Lys Gln Lys Trp Lys Ser Glu Ala Glu Lys Glu Ser Lys
385 390 395 400
Thr Thr Ser Pro Pro Pro Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Pro Leu Lys Pro
405 410 415
Thr Phe Leu Leu Val Pro Leu Leu Thr Pro His Ser Ser Gly Ser Asp
420 425 430
Asn Thr Val Asn His Ser Cys Leu Gly Val Arg Asp Ala Gln Ser Pro
435 440 445
Tyr Asp Asn Ser Asn Arg Asp Tyr Leu Phe Pro Arg
450 455 460
<210> 61
<211> 5928
<212> DNA/RNA
<213> human
<400> 61
ggcggtcccc tgttctcccc gctcaggtgc ggcgctgtgg caggaagcca ccccctcggt 60
cggccggtgc gcggggctgt tgcgccatcc gctccggctt tcgtaaccgc accctgggac 120
ggcccagaga cgctccagcg cgagttcctc aaatgttttc ctgcgttgcc aggaccgtcc 180
gccgctctga gtcatgtgcg agtgggaagt cgcactgaca ctgagccggg ccagagggag 240
aggagccgag cgcggcgcgg ggccgaggga ctcgcagtgt gtgtagagag ccgggctcct 300
gcggatgggg gctgcccccg gggcctgagc ccgcctgccc gcccaccgcc ccgccccgcc 360
cctgccaccc ctgccgcccg gttcccatta gcctgtccgc ctctgcggga ccatggagtg 420
gtagccgagg aggaagcatg ctggccgtcg gctgcgcgct gctggctgcc ctgctggccg 480
cgccgggagc ggcgctggcc ccaaggcgct gccctgcgca ggaggtggcg agaggcgtgc 540
tgaccagtct gccaggagac agcgtgactc tgacctgccc gggggtagag ccggaagaca 600
atgccactgt tcactgggtg ctcaggaagc cggctgcagg ctcccacccc agcagatggg 660
ctggcatggg aaggaggctg ctgctgaggt cggtgcagct ccacgactct ggaaactatt 720
catgctaccg ggccggccgc ccagctggga ctgtgcactt gctggtggat gttccccccg 780
aggagcccca gctctcctgc ttccggaaga gccccctcag caatgttgtt tgtgagtggg 840
gtcctcggag caccccatcc ctgacgacaa aggctgtgct cttggtgagg aagtttcaga 900
acagtccggc cgaagacttc caggagccgt gccagtattc ccaggagtcc cagaagttct 960
cctgccagtt agcagtcccg gagggagaca gctctttcta catagtgtcc atgtgcgtcg 1020
ccagtagtgt cgggagcaag ttcagcaaaa ctcaaacctt tcagggttgt ggaatcttgc 1080
agcctgatcc gcctgccaac atcacagtca ctgccgtggc cagaaacccc cgctggctca 1140
gtgtcacctg gcaagacccc cactcctgga actcatcttt ctacagacta cggtttgagc 1200
tcagatatcg ggctgaacgg tcaaagacat tcacaacatg gatggtcaag gacctccagc 1260
atcactgtgt catccacgac gcctggagcg gcctgaggca cgtggtgcag cttcgtgccc 1320
aggaggagtt cgggcaaggc gagtggagcg agtggagccc ggaggccatg ggcacgcctt 1380
ggacagaatc caggagtcct ccagctgaga acgaggtgtc cacccccatg caggcactta 1440
ctactaataa agacgatgat aatattctct tcagagattc tgcaaatgcg acaagcctcc 1500
cagtgcaaga ttcttcttca gtaccactgc ccacattcct ggttgctgga gggagcctgg 1560
ccttcggaac gctcctctgc attgccattg ttctgaggtt caagaagacg tggaagctgc 1620
gggctctgaa ggaaggcaag acaagcatgc atccgccgta ctctttgggg cagctggtcc 1680
cggagaggcc tcgacccacc ccagtgcttg ttcctctcat ctccccaccg gtgtccccca 1740
gcagcctggg gtctgacaat acctcgagcc acaaccgacc agatgccagg gacccacgga 1800
gcccttatga catcagcaat acagactact tcttccccag atagctggct gggtggcacc 1860
agcagcctgg accctgtgga tgataaaaca caaacgggct cagcaaaaga tgcttctcac 1920
tgccatgcca gcttatctca ggggtgtgcg gcctttggct tcacggaaga gccttgcgga 1980
aggttctacg ccaggggaaa atcagcctgc tccagctgtt cagctggttg aggtttcaaa 2040
cctccctttc caaatgccca gcttaaaggg gctagagtga acttgggcca ctgtgaagag 2100
aaccatatca agactctttg gacactcaca cggacactca aaagctgggc aggttggtgg 2160
gggcctcggt gtggagaagc ggctggcagc ccacccctca acacctctgc acaagctgca 2220
ccctcaggca ggtgggatgg atttccagcc aaagcctcct ccagccgcca tgctcctggc 2280
ccactgcatc gtttcatctt ccaactcaaa ctcttaaaac ccaagtgcct tagcaaattc 2340
tgtttttcta ggcctgggga cggcttttac ttaaaccgcc aaggctgggg gaagaagctc 2400
tctcctccct ttcttcccta cagttgaaaa acagctgagg gtgagtgggt gaataataca 2460
gtatctcagg gcctggtcgt tttcaacaga attataatta gttcctcatt agcattttgc 2520
taaatgtgaa tgatgatcct aggcatttgc tgaatacaga ggcaactgca ttggctttgg 2580
gttgcaggac ctcaggtgag aagcagagga aggagaggag aggggcacag ggtctctacc 2640
atcccctgta gagtgggagc tgagtggggg atcacagcct ctgaaaacca atgttctctc 2700
ttctccacct cccacaaagg agagctagca gcagggaggg cttctgccat ttctgagatc 2760
aaaacggttt tactgcagct ttgtttgttg tcagctgaac ctgggtaact agggaagata 2820
atattaagga agacaatgtg aaaagaaaaa tgagcctggc aagaatgtgt ttaaacttgg 2880
tttttaaaaa actgctgact gttttctctt gagagggtgg aatatccaat attcgctgtg 2940
tcagcataga agtaacttac ttaggtgtgg gggaagcacc ataactttgt ttagcccaaa 3000
accaagtcaa gtgaaaaagg aggaagagaa aaaatatttt cctgccaggc atggtggccc 3060
acgcacttcg ggaggtcgag gcaggaggat cacttgagtc cagaagtttg agatcagcct 3120
gggcaatgtg ataaaacccc atctctacaa aaagcataaa aattagccaa gtgtggtaga 3180
gtgtgcctga agtcccagat acttgggggg ctgaggtggg aggatctctt gagcctggga 3240
ggtcaaggct gcagtgagcc gagattgcac cactgcactc cagcctgggt gacagagcaa 3300
gtgagaccct gtctcaaaaa aagaaaaaga aaaagaaaaa atattttccc tattagagaa 3360
gagattgtgg tttcattctg tattttgttt ttgtcttaaa aagtggaaaa atagcctgcc 3420
tcttctctac tctagggaaa aaccagcgtg tgactactcc cccaggtggt tatggagagg 3480
gtgtccggtc cctgtcccag tgccgagaag gaagcctccc acgactgccc ggcagggtcc 3540
tagaaattcc ccaccctgaa agccctgagc tttctgctat caaagaggtt ttaaaaaaat 3600
cccatttaaa aaaaatccct tacctcggtg ccttcctctt tttatttagt tccttgagtt 3660
gattcagctc tgcaagaatt gaagcaggac taaatgtcta gttgtaacac catgattaac 3720
cacttcagct gacttttctg tccgagcttt gaaaattcag tggtgttagt ggttacccag 3780
ttagctctca agttatcagg gtattccaga gtggggatat gatttaaatc agccgtgtaa 3840
ccatggaccc aatatttacc agaccacaaa acttttctaa tactctaccc tcttagaaaa 3900
accaccacca tcaccagaca ggtgcgaaag gatgaaagtg accatgtttt gtttacggtt 3960
ttccaggttt aagctgttac tgtcttcagt aagccgtgat tttcattgct gggcttgtct 4020
gtagatttta gaccctattg ctgcttgagg caactcatct taggttggca aaaaggcagg 4080
atggccgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcctagcact ttgggaggcc aaggtgggag 4140
gattgcttga gctcaggagt ttgagaccaa cctgggtaac atagtgagac accatctcta 4200
ttatgaacaa taacagttaa gaaaaaaaaa ggcaggcagg cggttatggt ggttccctcc 4260
catcccacca cataaagttt ctgagacttg agaacagcaa aatgctgtta aagggaaata 4320
ttaagaatga gaatctgcag taagggtgat tctgtgccca cagttcttca attctttata 4380
ccgttttacc cacatgtggt gttaccaaag ccgggcagaa ccatgctagc ggaagatgtg 4440
aaatccagat agctcattat tgccaagagc taggcagctt tgatctccaa attgttattg 4500
ctttcatttt tattgtaatg gaattgcttt gttttgtttt tttgtttttg tattgaagag 4560
ggttgttttc cctttatttt tcataagcta atgtaaatga agaaaaaatg tcttctctgg 4620
gctgtaggcc tggctcagcg tacacaggta tacatcctaa gctctctatg ttctctaatc 4680
tgtggtgact gaacatgtgt ctcaatgcac ggggcatttc tacctgtgtt tctgcagcac 4740
ccccactgcc ttgagtcccc agcagtgctg ttatttgcct aacacctgta gccatctgcc 4800
acgcagccag acgtgaaacg ctgagacaga gaccatttag gttaaatacg acagcttatc 4860
ctgctgggtg gggaaagtaa aaaatatgct ggttcaaggc ctaaagtaaa atgatcaata 4920
atgtttgtag cattaatgaa atattttcaa gaaatgtgtc caggggtagc actggctatg 4980
ttgacgaggc ctttggtaac tcagagagct cttggccctg atggggactt gcccttacgc 5040
tttctttatc aggctctgag ttcacacgga gcctctggca cttccctgct gtcttgggag 5100
aaaggaaact ggttgccgcg gcaggttgtg gaatctgttg ctggaaccag gctggaagcc 5160
cacctggtag tgaacagggc ccagtggggc aggctgggca tgttgtggtc tatgggtttg 5220
tttcctggag aatgttcagg aatgtcttcc cagctgcttt ggtgctgagc tctattatct 5280
cacagcacgt ccagaaggct aacccaggtg gggaggatgc tgacaccagc tccaggtgga 5340
gttggtggtc ttaatttgga gatgcagggg caacctgtga ccctttgagg caagagccct 5400
gcacccagct gtcccgtgca gccgtgggca ggggctgcac acggaggggc aggcgggcca 5460
gttcagggtc cgtgccaggc cctcctcagt gccctgtgaa ggcctcctgt cctccgtgcg 5520
gctgggcacc agcaccaggg agtttctatg gcaaccttag tgattattaa ggaacactgt 5580
cagttttatg aacatatgct caaatgaaat tctactttag gaggaaagga ttggaacagc 5640
atgtcacaag gctgttaatt aacagagaga ccttattgga tggagatcac atctgttaaa 5700
tagaatacct caactctacg ttgttttctt ggagataaat aatagtttca agtttttgtt 5760
tgtttgtttt acctaattac ctgaaagcaa ataccaaagg ctgatgtctg tatatggggc 5820
aaagggtcag tatatttttc agtgtttttt tttctaccag ctattttgca tttaaagtga 5880
acattgtgtt tggaataaat actcttaaaa aataaaaaaa aaaaaaaa 5928
<210> 62
<211> 468
<212> PRT
<213> human
<400> 62
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg
20 25 30
Gly Val Leu Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro
35 40 45
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys
50 55 60
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg
65 70 75 80
Leu Leu Leu Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys
85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val
100 105 110
Pro Pro Glu Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser
115 120 125
Asn Val Val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr
130 135 140
Lys Ala Val Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp
145 150 155 160
Phe Gln Glu Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys
165 170 175
Gln Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met
180 185 190
Cys Val Ala Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe
195 200 205
Gln Gly Cys Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val
210 215 220
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp
225 230 235 240
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg
245 250 255
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp
260 265 270
Leu Gln His His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His
275 280 285
Val Val Gln Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser
290 295 300
Glu Trp Ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser
305 310 315 320
Pro Pro Ala Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr
325 330 335
Asn Lys Asp Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr
340 345 350
Ser Leu Pro Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu
355 360 365
Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys Ile Ala Ile
370 375 380
Val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly
385 390 395 400
Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gln Leu Val Pro Glu
405 410 415
Arg Pro Arg Pro Thr Pro Val Leu Val Pro Leu Ile Ser Pro Pro Val
420 425 430
Ser Pro Ser Ser Leu Gly Ser Asp Asn Thr Ser Ser His Asn Arg Pro
435 440 445
Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro Tyr Asp Ile Ser Asn Thr Asp Tyr
450 455 460
Phe Phe Pro Arg
465
<210> 63
<211> 4133
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 63
gtgaagtcct gtgttccttt gctgcagtca cacgggcttg tctgaattcc ctgcacaggg 60
tactttagcc tcacctgccg ttcatttctg cttcctggag gccagatgtc tccattccca 120
agttgagatt tatctgatac actgttacac caataggagg gtcttttcct ggagttggca 180
ggcacccagg aggggctggt aactcctggg gacaggtagc aggagtctga cttggggtgg 240
gaggttcatg gggtgggggt tgtcagcaaa gctcatacac acaggtttga tttctctcct 300
ccttaacagt gttgtcgtaa caacctggaa tgttggctgg aaaactgaac ttccactaag 360
tgtagagttc agacagcctc caaggaggaa agagactgct cagagccctg aggaatgtct 420
ttccttacct tagatagaga tcttcagtat gtgttgggcc cttcagcagg agatgcagag 480
atgagttctt cagggtgaca gggaaggcag ggtggtaaac aaagtcacat ggcatttggg 540
aggaacacag gactctggca cccaagctaa ccagtggatg acagctttct tggaattgag 600
gaaagagacc attgagtttt ctgaaaaaga cagccaagtc caggtttggc tttttttttt 660
tttttttttt ttttttaact tgtggattac gttgggccca cacttggggt aattttatct 720
ttccttcctg gatactgagg atacatgtgt tcacagctat gcttggcttt tttttttttt 780
aatagggtct tgtccagcgt ggccagaacc ttgccacgtt tcccccttag cctcttcagt 840
gccagaatta caatcatcca ccaccgtgcc tgtcagagac gagtgtgagg gcagagtagg 900
gtgtaagact aaaggaaagg aaggcctggc cagaggataa gcttgaacaa ggcatgcaga 960
ttagaaacca cggacatcat tgtagaaact tacctacacg caaggctctg gtacaggaaa 1020
gagggtggga aagtgaaggt ggactctctg tgtagccctg gatgacctgg aactcactct 1080
gtggaccagg ctggccttaa actcacagag atatgcctgc ttctgcctcc caagtgctgg 1140
gattaaaggc aggagccatc ataccaggac ttgaagcaca acactaatac tttgtatatt 1200
ataaattctt accacacaaa tcagtaaaaa aggctctgag atgaagtaga aacttgagtt 1260
ctttggaaag tcagttgtgt ggcatggtat tttgctgggg caaacatgtg acatgaagga 1320
gtattttcct gaagcagaca caaggtaaaa ggatgttttg ctaaagcaga cccgtgaaag 1380
gacccatgat gtaggattct tctctaacta catgcaagga tcagttcacc ttacatttca 1440
ttgttgagct ccatttgttg tgactccata gagagaaaca tactggaaac gtttctagtg 1500
gtgttctggt ggcttcttgc tgcttccatg gactcgggca gagtgatgtc agctgataca 1560
gactcaagtg gagttttgct aagacagact cacatactga ggcgagaccc atttgagaac 1620
acgttatgtt tggagagcgg ataactaaga ctcaatggac agtgggaaag ggcttgcttg 1680
catagctagc tttgcaatgc ttcctggtct tcttcgctga tcttcacttt gttaagagaa 1740
gtaaggcaaa gaacttctcc aggcctaatc actcctgcta actcatgcag attcggccga 1800
ggcctggctg tttctgctag gttgtgccaa cactgctgtt gatttgtgtt tgttatcctg 1860
acactaccga cctggactgc tgctatattc atcaagtatt tgcaagtgga tgggatttgc 1920
tccaaagaac aatttctaga cagatccacc tcctaatatc ctaactacct aattcctgta 1980
tcctaataac tttccatttc cactgcctct aggagggagg ttaaagtgtt taaaaaccat 2040
cattaaaatt agggttgaga aatatctaaa caacacagag aaattaacta taacttgccc 2100
aaatcctaca gctatcaagc agtagacctg ggatgggaac taaactcatc tgactatgga 2160
acaccccccc ccccacactc caggatcaaa acggggtgga tggggggaag ccacttggcc 2220
agggttgccg ggtcgtgtct gagatgtctg ctcttgcctt caacattcct tctatctgag 2280
ctggcagcct tctgtagcct tcctgtttca ggccagcaac ttgtctctct gcaattattt 2340
tcaggtctct gtttaccaca gaaaggaagg aggcagcaca atgagagtct gttggaaatt 2400
aattatattt ttaagatagg gcaagttcca ctatgcttgc ctcgaactct ggatcttcct 2460
gcctcagcct ccagagtttt gggattacag gtgtgtacta ccacatcctc ttgctattta 2520
atcccatttt aaatagcagg agaaaaaaat atgtattttt tttagacagg gccttagact 2580
cacagctatt cacctgcttc tgcttcccaa atgcctgccc caccacaggg agagagaaca 2640
accatgcctt tctctccgac ttatagcgtg gctgaggaag tgccatcaaa accaatccca 2700
ttgtcctggg tacaggtttg gttctgacat ccacagagag cggtggatgc ctaggtctga 2760
ggccagcatg ttgcttaaat aaggtcatgt cttatttagg ggttcagcca gcacacacac 2820
attccagttg ccccatggac tctaatcagc tgaaccctga aatggaagaa tacattaaaa 2880
catactggtg taggtccagg gctccccatc tacattttct tttctttctt ttttttttct 2940
tatcccttcc cttctccctc ttgctccggc ccggctcgct caggcccata ggttttattt 3000
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cttggaaggg aaccttggtg gagtctggta aatagcaaac gccggttcct ttgtgtccag 3240
tcaagtcatg atgggtaatc aaagccctac tccttgttga gcagttaggc tccaggtaca 3300
tcgacagtgt ttccaggaat ctttatcatg ggcttaaaaa tacatctcta ataggtgaga 3360
aaactgagac ttccggatcg ggatagcaat cttgaggagg gtaacacatg tgtctctggg 3420
ccagactcaa aagcgcacac tggtttcgtt gcctctgcag tagccttcaa agagctgctc 3480
ctccactgga agatgagagg aaatcttttt ctcaggttat ggacgcctaa gttttccttc 3540
agaccaatta aatcacaatc tctgggctcg aagcagacat cggtgtcttt tcggattccc 3600
tgtttgattc ccgtaagcac ccaggacact gacctgcctt ctactttaac agccagagcc 3660
actggctggc gctcatgaaa gcaaaactca agcggaggcg cggatggaag gaaggagggg 3720
gatatttctc cttatctcag cgtcaaaacc tggggagggg ccctggtggg ggtccctggg 3780
ggctcaggtg tggcgcggct gcaggaagta accccctccg gtggcccgga gcgctggccg 3840
attgcgccat cctactgggc tttcgtaacc gcgagccggg gctgccaaga ggagcttcag 3900
caccggttcc tcaaatgttt cactgttgcc aggacggccg gctgctgtgt gtcacgtgca 3960
tgtgggaagt cgcgcccaca ccgatctgag ccacgccggg gcgagcgctc gcagtgcgag 4020
ctgagtgtgg agcccgaggc cgagggcgac tgctctcgct gccccagtct gccggccgcc 4080
cggccccggc tgcggagccg ctctgccgcc cgccgtcccg cgtagaagga agc 4133
<210> 64
<211> 4727
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 64
gctgcacgct gttggtcgcc ctgctggccg cgcccgcggt cgcgctggtc ctcgggagct 60
gccgcgcgct gggtaagagg aacccggagc gggcgtgggg aatgtgacac tgtctggttc 120
cgttcgcaga gtgagccccg ccggtaccgg ctgctagcct gggctgactc acctgtgctg 180
acgcggtgga ggttcgcgcg ccccctgttg cgtctagcgc ctataactgc gtgctcctgt 240
ctgtgtctgg ccagttacct caagtctgag tacaggacag tgtgttttcc tgaaacctga 300
ctctggtgtc tggttcccag tgttcccagt cttactcaac tgcatcccgg gtcgctccaa 360
aaagagatac ccagagggcg cgccctagtg gaacagtagt agtcccttct ggagagtcct 420
ttatgccact ggctctctct gctttagttg tggcacctcg cgtggctttc cttagttcta 480
ctacattcca tgtcgtgtgt aatgacagtg acccgacggt gaagggtctg acatcatggg 540
ctctgagtca tgggtgttcc cgcctcacaa acttactcct ttagccaact agccctagca 600
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aggcggaggg tagggtaggg gcactgtgtt taccttcctt gcactctgcc ttgtaggtct 780
aggcctctct gtgggctctg gcttcaggcc cagcagcctg cctggtctct tctggaggaa 840
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aagagccaaa ggacatgggg gagatttatc ctgtgctggt cgtggggaca gtggcttcca 960
ggctttcttt ctgcctggaa ggtagaattc ctcaagcttg gtttgttacc cctacctata 1020
ttttctttat atatatatat ataaagaaaa tatatatata tattagacag gctctcccat 1080
aacccaggct ggcctcaaac ttgtgcctct tctgcctcta tctcttgagt gctgggattt 1140
caggtattaa cccaccctgt attttacacg tttttaatcc tctacaggat tgacataaag 1200
ctttgggagg agcctgaggt tcagagagat gcaatgggaa gcatcaggcc cctccgtgtc 1260
tcagtgttct cctgtgggta cagctgaggg cgtctggggt aggctgagca ccactatcat 1320
ctggtgggat tctgggggag aagacactga tgaaagagaa gatccccgct tagctgttca 1380
tggtgccagg caggactgag gtcctctctt ccatcttggg agagcaggac tgggcctctc 1440
tgcctgtctc agttactact caacataccc cagcgccccc accaccactt ccctttgttc 1500
ctaaggagct gcaaggcact tcggagacag cgagttctgt tttcctgtgg ttcagaaagg 1560
acacccaagg gtgggggtgt cttctgaccc aaacagcctt tagaaggcag aactgggagt 1620
ctggggagga agtgaaagcc ctgccagttt agaaggaaga ggcagagaag tccccagccc 1680
atctcccaca cccacacttg cacagctaca aactggagag tgacaatcaa gaaacaagca 1740
ccaaacagga agtgtggagc aaatgactga gatgtttggc tttagagaag tgaggccaga 1800
tggagatggc tctctggggg ggaacccatg ggtggaagat atacataaac atatatatat 1860
gggcaggcga gatagctcag cacacgcaca cacacacaca cacacacaca cacacacact 1920
ctcctccatc catcatcctt agtgggtttt tgccttcatg tattcatgtc tgtgtgaggg 1980
ttccaaatcc tatggaactg gagttacagt tgtgagctgc catgtggtgc agggattgaa 2040
cctgggtcct ctggaagaac agccagtgtt cttaactgct gagccatcac tccagcacca 2100
acaggtggga ttttcatagt ctgcccctcc agggcctgct aggactcctg tgtcttcttc 2160
cacctggggc ccaggaccag ctgggactga ggcttctgcc aggtcaaact ttctaggcgc 2220
tgctgactga ggacaggctg ggcatgggtg gcttcagtcc ccctttcctt ctgtaaggca 2280
agaaaacacg cagcagcacc gatgcctatg tatctaaatc tcctcctgac ttctgaattc 2340
cctctgggac aacctctttc ggtctacaaa acctacctgt attcctagcc tcaccctgaa 2400
tcagtatttt tctgaaggat atatttttta tctagcatca aatttcggct aggaaggata 2460
gatctttgta aaaaaaaaat cacaattttt aaaacattag ggtttgtggg ttttttgttt 2520
gtttgttttt tttttttttt tgatattttg agacaggtgt ttctttgtgt agccctggct 2580
gccctggaac tcactctgta gaccaggttg gccttgaact tagaggtctt tgcctcctga 2640
gtgctgggat caaaggccac ggtacccaac caaaaatgac aattcttgac ccctggccac 2700
tcattaaaca tgtatcagaa gagcagagag tgaggtctac actttgaaaa aaaacaaatt 2760
gttccttgtg gcccctgggc actggcttga ggacatttgc ctaatggtca ggatgagtaa 2820
aagaccttct tcccctgcca ggttccctgt gaccagaagc ctctccccgc cttggctctg 2880
cccctcccct tgtttattcg ttgcaacaca tatttatgta ttccctgtaa agcccttggg 2940
gaccaagtgg gatccgtcat gcacactcca ccctataaag gatcctgaat gtggccaaaa 3000
gcaaatcctg agacagagcc agttcagtct ctctgacctg acactgggta ccaactctcc 3060
agggacagat tgtctcagca gtcagctaga cagaggaacc cttctgactg ggaccctaaa 3120
gcaacaggag cctgcctgtt ctctacccca tctgactggc atcaaactgt gcaggcgcaa 3180
gtgtggccat agctgggtta tgtaaacaaa gtaacttcag agcttctggc ttcaaacaga 3240
tgtctccttc agcaagcttt ccatctgccc ctgcaggcct gagtgccacc actcagtcat 3300
cagcttgaat ccagggctaa agctatctca gatgagccag taagtgagtt taagctatta 3360
aaccttaaat taatagaaaa agtaaaatgg gcacatgaga tggctcagca gataaaaaaa 3420
ggcatttgct gccgacaggg ctgatgagct agggacccgg cggggggggg gggtgcgggg 3480
ggggggggag gtgttactcc caagggtttc tgtttctctg gcctctacat atgtactgtg 3540
gctagtgcat gcacataaac aaacaaacaa ataaatgtaa ttaaaacaaa agctgtgtat 3600
ggtggcacat gcccttagtg ccagaatctc tgtgagtttg tggtcagcct ggtctccaca 3660
gcaagttcaa gaaagaggaa aaaagggtga tttctagatg tgcttgatgg tgtaactcat 3720
atgggaactt gatgcagggg gattgcaagc tctaggttag cctaagctac agagacaggg 3780
ttggggtggg ggtggggagt aggggaaccc tcaaaaaaaa acacaaacaa acaaacaaaa 3840
accaggacaa atctctgtcc ttcatcacgc ctgtcacttg cagtgcgcag tggctagctg 3900
tggctggtgt ggctgtgcat gtctgctcat ggggctttcc catagcggag gggaagtgtg 3960
tcgggtgagg ggctagagag ctatgcggtg tcttccagac acctgttcca cctgtatgca 4020
tggtgctctg agggggcatt ggagcctctg gaactggagt tacagatggt tgtgagctgt 4080
cttgtgggtg ctggggatca aatcctgctt cattgaaaga actctctctt tttggagaca 4140
aagtctcacc acgtagccct ggctggcttg gaactctctg tgtagaacag gctggccccg 4200
aatgcacaga gagcctcccg cctctgtctc tcaagtgatg gaactaaagg tgtgggctca 4260
ggaggtcatc agtgacggtt tatcagtgag ctgtcatctt tctagtccca gagctgacgc 4320
tttacctgaa cctcagcagc tttcaccatt gcgcttgtct cttgccagct ctgtctgcag 4380
gtttctagca cagggtgctc ctgaggcccc aacccaggag cccgttctct gactcacttc 4440
tctccctacc tccttccaga aaatcattct ttgggcttcc ctttctgtgg tggttacagt 4500
aactgtggct ctgagtatca acttcatttg aaaaattgtg tcagaccctt ggcacaacag 4560
tgcagctttg ggtgagtggg gtgccagccc gctcttggct ggacagggta gctacaggac 4620
agcaggtggg gttggatgag tgatcagagg ccattctggg gcatgtggga actgagacat 4680
ctatagcaca accaagaaag gatgctaaat caggtctggt ggactgc 4727
<210> 65
<211> 4098
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 65
atgctggccg tcggctgcgc gctgctggct gccctgctgg ccgcgccggg agcggcgctg 60
gccccaaggc gctgccctgc gcaggaggtg gcgagaggcg tgctgaccag tctgccagga 120
gacagcgtga ctctgacctg cccgggggta gagccggaag acaatgccac tgttcactgg 180
gtgctcagga agccggctgc aggctcccac cccagcagat gggctggcat gggaaggagg 240
ctgctgctga ggtcggtgca gctccacgac tctggaaact attcatgcta ccgggccggc 300
cgcccagctg ggactgtgca cttgctggtg gatgttcccc ccgaggagcc ccagctctcc 360
tgcttccgga agagccccct cagcaatgtt gtttgtgagt ggggtcctcg gagcacccca 420
tccctgacga caaaggctgt gctcttggtg aggaagtttc agaacagtcc ggccgaagac 480
ttccaggagc cgtgccagta ttcccaggag tcccagaagt tctcctgcca gttagcagtc 540
ccggagggag acagctcttt ctacatagtg tccatgtgcg tcgccagtag tgtcgggagc 600
aagttcagca aaactcaaac ctttcagggt tgtggaatct tgcagcctga tccgcctgcc 660
aacatcacag tcactgccgt ggccagaaac ccccgctggc tcagtgtcac ctggcaagac 720
ccccactcct ggaactcatc tttctacaga ctacggtttg agctcagata tcgggctgaa 780
cggtcaaaga cattcacaac atggatggtc aaggacctcc agcatcactg tgtcatccac 840
gacgcctgga gcggcctgag gcacgtggtg cagcttcgtg cccaggagga gttcgggcaa 900
ggcgagtgga gcgagtggag cccggaggcc atgggcacgc cttggacaga atccaggagt 960
cctccagctg agaacgaggt gtccaccccc atgcaggcac ttactactaa taaagacgat 1020
gataatattc tcttcagaga ttctgcaaat gcgacaagcc tcccagtgca agattcttct 1080
tcagtaccac tgcccacatt cctggttgct ggagggagcc tggccttcgg aacgctcctc 1140
tgcattgcca ttgttctgag gttcaagaag acgtggaagc tgcgggctct gaaggaaggc 1200
aagacaagca tgcatccgcc gtactctttg gggcagctgg tcccggagag gcctcgaccc 1260
accccagtgc ttgttcctct catctcccca ccggtgtccc ccagcagcct ggggtctgac 1320
aatacctcga gccacaaccg accagatgcc agggacccac ggagccctta tgacatcagc 1380
aatacagact acttcttccc cagatagaga tctaatcaac ctctggatta caaaatttgt 1440
gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg atacgctgct 1500
ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 1560
aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca acgtggcgtg 1620
gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac cacctgtcag 1680
ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact catcgccgcc 1740
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggtgttg 1800
tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg gattctgcgc 1860
gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc ttcccgcggc 1920
ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac gagtcggatc 1980
tccctttggg ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgacctc gactgtgcct tctagttgcc 2040
agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca 2100
ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta 2160
ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc 2220
atgctgggga gaattccgaa gttcctattc tctagaaagt ataggaactt caggtctgaa 2280
gaggagttta cgtccagcca agctagcttg gctgcaggtc gtcgaaattc taccgggtag 2340
gggaggcgct tttcccaagg cagtctggag catgcgcttt agcagccccg ctgggcactt 2400
ggcgctacac aagtggcctc tggcctcgca cacattccac atccaccggt aggcgccaac 2460
cggctccgtt ctttggtggc cccttcgcgc caccttctac tcctccccta gtcaggaagt 2520
tcccccccgc cccgcagctc gcgtcgtgca ggacgtgaca aatggaagta gcacgtctca 2580
ctagtctcgt gcagatggac agcaccgctg agcaatggaa gcgggtaggc ctttggggca 2640
gcggccaata gcagctttgc tccttcgctt tctgggctca gaggctggga aggggtgggt 2700
ccgggggcgg gctcaggggc gggctcaggg gcggggcggg cgcccgaagg tcctccggag 2760
gcccggcatt ctgcacgctt caaaagcgca cgtctgccgc gctgttctcc tcttcctcat 2820
ctccgggcct ttcgacctgc agcctgttga caattaatca tcggcatagt atatcggcat 2880
agtataatac gacaaggtga ggaactaaac catgggatcg gccattgaac aagatggatt 2940
gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 3000
gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 3060
ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caggacgagg cagcgcggct 3120
atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc 3180
gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct 3240
tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga 3300
tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg 3360
gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc 3420
agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgcg catgcccgac ggcgatgatc tcgtcgtgac 3480
ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat 3540
cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg ctacccgtga 3600
tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt acggtatcgc 3660
cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct tctgagggga 3720
tcaattctct agagctcgct gatcagcctc gactgtgcct tctagttgcc agccatctgt 3780
tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt gccactccca ctgtcctttc 3840
ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg tgtcattcta ttctgggggg 3900
tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac aatagcaggc atgctgggga 3960
tgcggtgggc tctatggctt ctgaggcgga aagaaccagc tggggctcga ctagagcttg 4020
cggaaccctt cgaagttcct attctctaga aagtatagga acttcatcag tcaggtacat 4080
aatggtggat ccagtact 4098
<210> 66
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 66
gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggag aattccgaag ttcctattct 60
ctagaaagta taggaacttc 80
<210> 67
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 67
tctctagaaa gtataggaac ttcatcagtc aggtacataa tggtggatcc agtactgctg 60
cacgctgttg gtcgccctgc 80
<210> 68
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 68
ataaggtttc caatcagccc caccc 25
<210> 69
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 69
acttaggacc ttgctcatgt tgggt 25
<210> 70
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 70
agcgcacgtc tgccgcgctg ttc 23
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 71
tgcctgtagg tgactctcaa gtcca 25
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 72
ctgggattcc acatctgttg tccac 25
<210> 73
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 73
acagtggcat tgtcttccgg ctcta 25
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 74
ctgggattcc acatctgttg tccac 25
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 75
tgcagctacc gttcatgtcc cc 22
<210> 76
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 76
gtcaacaagc acaactcttc caggg 25
<210> 77
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 77
ccagaggctt ctaaacccta aagc 24
<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 78
ggatcggcca ttgaacaaga t 21
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 79
cagaagaact cgtcaagaag gc 22
<210> 80
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 80
aaatgtttca ctgttgccag gacgg 25
<210> 81
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 81
gacacagaca ggagcacgca gttat 25
<210> 82
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 82
cagtggcatt gtcttccggc tctac 25
<210> 83
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 83
gcatcgatac cgtcgacctc gac 23
<210> 84
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 84
gacacagaca ggagcacgca gttat 25
<210> 85
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 85
gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25
<210> 86
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 86
gctccaattt cccacaacat tagt 24
<210> 87
<211> 589
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 87
aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60
ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120
atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180
tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240
ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300
attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360
ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat cgtcctttcc ttggctgctc 420
gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480
aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540
cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgc 589

Claims (90)

1.一种基因修饰的非人动物，所述动物的基因组包含至少一条染色体，所述染色体包含编码人或嵌合白介素6受体(IL6R)的序列。
2.根据权利要求1所述的动物，所述编码人或嵌合IL6R的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6R基因座的内源性调控元件。
3.根据权利要求1所述的动物，所述编码人或嵌合IL6R的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6R基因座的人IL6R调控元件。
4.根据权利要求1-3中任一所述的动物，其中所述至少一条染色体包含一个或多个内源性IL6R外显子，并且所述一个或多个内源性IL6R外显子失活。
5.根据权利要求1所述的动物，其中所述编码人或嵌合IL6R的序列包含编码与人IL6R(NP_000556.1；SEQ ID NO：62)的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列的序列。
6.根据权利要求1所述的动物，其中所述动物包含与SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQID NO：67或SEQ ID NO：65的1至1407bp的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
7.根据权利要求1-6任一所述的动物，其中所述动物是哺乳动物，例如，猴、啮齿动物或小鼠。
8.根据权利要求1-6任一所述的动物，其中所述动物是小鼠。
9.根据权利要求1-8任一所述的动物，其中所述动物不表达内源性IL6R，或与野生型动物中IL6R表达水平相比，所述动物的内源性IL6R表达水平降低。
10.根据权利要求1-8任一所述的动物，其中所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6R的细胞。
11.根据权利要求1-8任一所述的动物，其中所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6R的细胞，并且表达的人或嵌合IL6R与内源性IL6结合。
12.根据权利要求1-8任一所述的动物，其中所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6R的细胞，并且表达的人或嵌合IL6R与人IL6结合。
13.一种基因修饰的非人动物，其中所述动物的基因组包含在内源性IL6R基因座上插入编码人或嵌合IL6R的序列。
14.根据权利要求13所述的动物，所述编码人或嵌合IL6R的序列可操控的连接到内源性IL6R基因座的内源性调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人或嵌合IL6R。
15.根据权利要求13所述的动物，所述编码人或嵌合IL6R的序列可操控的连接到内源性IL6R基因座的人调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人或嵌合IL6R。
16.根据权利要求13所述的动物，其中所述动物不表达内源性IL6R，或与野生型动物中IL6R表达水平相比，所述动物的内源性IL6R的表达水平降低。
17.根据权利要求13所述的动物，其中在内源性IL6R基因座上插入编码与人IL6R(SEQID NO：62)的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的氨基酸序列。
18.根据权利要求17所述的动物，其中插入的序列进一步包含土拨鼠肝炎病毒(WHP)转录后调控元件(WPRE)和/或polyA(多聚腺苷酸化)信号序列。
19.根据权利要求13所述的动物，其中对于在内源性IL6R基因座的插入，所述动物是杂合子的。
20.根据权利要求13所述的动物，其中对于在内源性IL6R基因座的插入，所述动物是纯合子的。
21.一种非人动物，所述的非人动物包含至少一个细胞，所述细胞包含编码嵌合IL6R多肽的核苷酸序列，其中所述嵌合IL6R多肽包含至少50个连续的氨基酸残基，所述氨基酸残基与人IL6R的相应连续的氨基酸序列具有同一性，其中所述动物表达嵌合IL6R。
22.根据权利要求21所述的动物，其中所述嵌合IL6R多肽包含与SEQ ID NO：62的同一性至少为90％、95％或99％的序列。
23.根据权利要求21所述的动物，其中所述核苷酸序列可操控的连接至所述动物的内源性IL6R调控元件。
24.根据权利要求21所述的动物，其中所述核苷酸序列整合到所述动物的内源性IL6R基因座。
25.根据权利要求1-24任一所述的动物，其中所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
26.根据权利要求1-25任一所述的动物，其中所述动物进一步包含编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6、IL3、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL33、IL13、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、具有Ig和ITIM结构域蛋白的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域分子-3(TIM-3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD137、TNF受体超家族成员4(OX40)、CD47或信号调节蛋白α(SIRPa))的序列。
27.根据权利要求26所述的动物，其中所述另外的人或嵌合蛋白是IL6。
28.一种制备基因修饰的非人动物的方法，其包括在所述动物的至少一个细胞的内源性IL6R基因座上插入编码人或嵌合IL6R的序列。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述编码人或嵌合IL6R的序列包含一个或多个外显子，所述外显子选自人IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和外显子10。
30.根据权利要求28所述的方法，其中所述编码人或嵌合IL6R的序列包含人IL6R基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4、外显子5、外显子6、外显子7、外显子8、外显子9和/或外显子10的至少30、50、100、200或300个核苷酸。
31.根据权利要求28所述的方法，其中所述编码人或嵌合IL6R的序列编码的序列与SEQID NO：62的同一性至少为90％。
32.根据权利要求28所述的方法，其中所述编码人或嵌合IL6R的序列受内源性IL6R调控元件的控制。
33.根据权利要求28所述的方法，其中所述动物是小鼠，并且所述基因座在小鼠IL6R基因的外显子1内。
34.根据权利要求28-33任一所述的方法，其中所述动物或小鼠进一步包含编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6、IL3、GM-CSF、IL33、PD-1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137、OX40、CD47或SIRPa)的序列。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述另外的人或嵌合蛋白是IL6。
36.根据权利要求28-35任一所述的方法，其中所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
37.一种基因修饰的非人动物，所述动物的基因组包含至少一条染色体，所述染色体包含编码人或嵌合IL6的序列。
38.根据权利要求37所述的动物，所述编码人或嵌合IL6的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6基因座的内源性调控元件。
39.根据权利要求37所述的动物，所述编码人或嵌合IL6的序列可操控的连接到至少一条染色体上的内源性IL6基因座的人调控元件。
40.根据权利要求37所述的动物，其中所述编码人或嵌合IL6的序列包含编码氨基酸序列的序列，所述氨基酸序列与人IL6(NP_000591.1(SEQ ID NO：6)或NP_001305024.1(SEQID NO：8))的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％。
41.根据权利要求37所述的动物，其中所述动物包含与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：48的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
42.根据权利要求37所述的动物，其中所述动物表达与SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：50的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
43.根据权利要求37-42任一所述的动物，其中所述动物是哺乳动物，例如，猴、啮齿动物或小鼠。
44.根据权利要求37-42任一所述的动物，其中所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull动物。
45.根据权利要求37-44任一所述的动物，其中所述动物不表达内源性IL6，或与野生型动物中IL6表达水平相比，所述动物的内源性IL6表达水平降低。
46.根据权利要求37-44任一所述的动物，其中所述动物具有一个或多个表达人IL6的细胞。
47.根据权利要求37-44任一所述的动物，其中所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6的细胞，并且表达的人或嵌合IL6与内源性IL6R结合。
48.根据权利要求37-44任一所述的动物，其中所述动物具有一个或多个表达人或嵌合IL6的细胞，并且表达的人或嵌合IL6与人IL6R结合。
49.一种基因修饰的非人动物，其中所述动物的基因组包含在内源性IL6基因座，编码内源性IL6区域的序列被编码人IL6相应区域的序列替换。
50.根据权利要求49所述的动物，所述编码人IL6相应区域的序列可操控的连接到内源性IL6基因座的内源性调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人IL6。
51.根据权利要求49所述的动物，所述编码人IL6相应区域的序列可操控的连接到内源性IL6基因座的人调控元件，并且所述动物的一个或多个细胞表达人IL6。
52.根据权利要求49所述的动物，其中所述动物不表达内源性IL6，或与野生型动物中IL6表达水平相比，所述动物表达的内源性IL6水平降低。
53.根据权利要求49所述的动物，其中替换的基因座包含与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：48的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
54.根据权利要求49所述的动物，其中所述动物是小鼠，并且替换的内源性IL6区域是内源性小鼠IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
55.根据权利要求49所述的动物，其中对于在内源性IL6基因座的替换，所述动物是杂合子的。
56.根据权利要求49所述的动物，其中对于在内源性IL6基因座的替换，所述动物是纯合子的。
57.一种包含至少一个细胞的非人动物，所述细胞包含编码人或嵌合IL6多肽的核苷酸序列，其中所述人或嵌合IL6多肽包含至少50个连续的氨基酸残基，所述氨基酸残基与人IL6的相应连续的氨基酸序列具有同一性。
58.根据权利要求57所述的动物，其中所述人或嵌合IL6多肽具有至少100个连续的氨基酸残基，所述氨基酸残基与人IL6的相应连续的氨基酸序列具有同一性。
59.根据权利要求57所述的动物，其中所述核苷酸序列可操控的连接至所述动物的内源性IL6调控元件。
60.根据权利要求57所述的动物，其中所述核苷酸序列可操控的连接至所述动物的人IL6调控元件。
61.根据权利要求57所述的动物，其中所述核苷酸序列整合到所述动物的内源性IL6基因座。
62.根据权利要求37-61任一所述的动物，其中所述动物进一步包含编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6R、IL33、IL13、程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、淋巴细胞活化基因3(LAG-3)、B和T淋巴细胞相关蛋白(BTLA)、程序性细胞死亡1配体1(PD-L1)、CD27、CD28、具有Ig和ITIM结构域蛋白的T细胞免疫受体(TIGIT)、T细胞免疫球蛋白及含粘蛋白结构域分子-3(TIM-3)、糖皮质激素诱导的TNFR相关蛋白(GITR)、CD137、TNF受体超家族成员4(OX40)、CD47或SIRPa)的序列。
63.根据权利要求37-61任一所述的动物，其中所述另外的人或嵌合蛋白是IL6R。
64.根据权利要求37-61任一所述的动物，其中所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
65.一种制备基因修饰的非人动物的方法，其包括在所述动物的至少一个细胞的内源性IL6基因座上编码内源性IL6区域的序列被替换为编码人IL6相应区域的序列。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述编码人IL6相应区域的序列包含人IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述编码IL6相应区域的序列包含人IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和/或外显子5的至少100、150或200个核苷酸。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述编码人IL6相应区域的序列编码的序列与SEQ ID NO：6或8的同一性至少为90％。
69.根据权利要求65所述的方法，其中替换的基因座包含与SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：49、SEQ ID NO：50、SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：48的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或100％的序列。
70.根据权利要求65所述的方法，其中所述动物是小鼠，并且所述基因座是小鼠IL6基因的外显子1、外显子2、外显子3、外显子4和外显子5。
71.一种制备基因修饰的表达嵌合IL6的小鼠细胞的方法，所述方法包括：
在内源性小鼠IL6基因座，编码小鼠IL6区域的核苷酸序列被替换为编码人IL6相应区域的核苷酸序列，从而产生基因修饰的小鼠细胞，其包括编码嵌合IL6的核苷酸序列，其中所述小鼠细胞表达嵌合IL6。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述编码嵌合IL6的核苷酸序列可操控的连接至内源性IL6调控区域，例如，启动子。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述编码嵌合IL6的核苷酸序列可操控的连接至人IL6调控区域，例如，启动子。
74.根据权利要求65-73任一所述的方法，其中所述动物或小鼠进一步包含编码另外的人或嵌合蛋白(例如，IL6R、IL33、IL13、PD-1、CTLA-4、LAG-3、BTLA、PD-L1、CD27、CD28、TIGIT、TIM-3、GITR、CD137、OX40、CD47或SIRPa)的序列。
75.根据权利要求74所述的方法，其中所述另外的人或嵌合蛋白是IL6R。
76.根据权利要求65-75任一所述的方法，其中所述动物是NOD-Prkdcscid IL-2rgnull小鼠。
77.一种确定IL6-IL6R通路调控剂治疗免疫疾病的有效性的方法，其包括：
将所述IL6-IL6R通路调控剂给药至权利要求1-27和37-64任一所述的动物；以及
确定所述IL6-IL6R通路调控剂的作用。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述免疫疾病是过敏。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述免疫疾病是自身免疫疾病。
80.根据权利要求77所述的方法，其中所述免疫疾病是多发性硬化症、哮喘、过敏、关节炎或自身免疫性脑脊髓炎。
81.一种确定IL6-IL6R通路调控剂减轻炎症的有效性的方法，其包括：
将所述IL6-IL6R通路调控剂给药至权利要求1-27和37-64任一所述的动物；以及
确定所述IL6-IL6R通路调控剂的作用。
82.一种确定IL6-IL6R通路调控剂治疗自身免疫疾病的有效性的方法，其包括：
将所述IL6-IL6R通路调控剂给药至权利要求1-27和37-64任一所述的动物；以及
确定所述IL6-IL6R通路调控剂的作用。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述自身免疫疾病是多发性硬化症。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述自身免疫疾病是关节炎。
85.根据权利要求82所述的方法，其中所述IL6-IL6R通路调控剂是抗人IL6抗体。
86.根据权利要求82所述的方法，其中所述IL6-IL6R通路调控剂是抗人IL6R抗体。
87.根据权利要求84所述的方法，其中所述作用通过爪厚和/或关节炎评分评价。
88.根据权利要求82所述的方法，其中所述作用通过行为评分、脑/脊髓IHC病理学、血清/脑匀浆Th17型多细胞因子检测和/或中枢神经系统(CNS)和脾脏流式细胞术评价。
89.一种确定抗IL6R抗体或抗IL6抗体的毒性的方法，所述方法包括：
将所述抗IL6R抗体或抗IL6抗体给药至权利要求1-27和37-64任一所述的动物；以及
确定所述动物的体重变化。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述方法进一步包括进行血液检查(例如，确定红细胞计数)。
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