KR20240060648A - 인간화된 sirpa-il15 녹인 마우스 및 이의 이용 방법 - Google Patents
인간화된 sirpa-il15 녹인 마우스 및 이의 이용 방법 Download PDFInfo
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Abstract
비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 비-인간 동물의 제조 방법, 및 비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 비-인간 동물의 이용 방법이 또한 제공된다. 이들 동물 및 방법은, 예를 들어, 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포 발생 및 기능의 모델링, 인간 T 세포 및/또는 NK 세포의 인간 병원체 감염 모델링, 및 다양한 생체내 스크린을 포함한, 당해 기술에서 많은 용도를 찾아낸다.
Description
교차-참조
본 출원은 2015년 4월 13일 출원된, 미국 가출원 번호 62/146,938; 2015년 4월 16일 출원된, 62/148,667; 및 2016년 1월 27일 출원된, 62/287,842의 권리를 주장하고, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 참고로 본원에서 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 유전자 변형된 비-인간 동물의 분야에 관한 것이다.
유전자 변형된 비-인간 동물, 예컨대 인간화된 마우스는, 이들이 생체내 인간 질환의 모델링 및 연구를 허용함에 따라, 번역 연구에 대단한 전망을 갖는다. 지난 10년간, 마우스에서 인간 면역 세포의 적절한 발생 및 기능에 필수적인 인간 유전자의 유전자 상으로 삽입에 의해 인간화된 마우스의 개발에서 상당한 진전이 있어왔다. 그러나, 일부 제한은 여전히 번역 연구에서 인간화된 마우스의 유용성을 제한한다. 특히, 인간 T 세포의 발생 및 생존은 차선이다.
골수-간-가슴샘 (BLT) 모델이 NS/NSG-BLT 마우스에서 장 T 세포 재구성을 개선하는 것으로 나타났어도 (Denton PW, Nochi T, Lim A 등 Mucosal Immunol 2012; 5:555-566, Nochi T, Denton PW, Wahl A 등 Cell Rep 2013; 3 : 1874-1884), 그들 마우스는 다중 조직에서 엄청난 면역 세포 침윤을 초래하는, 이식편 대 숙주 질환을 발생시키는 것으로 나타났다 (Greenblatt MB, Vrbanac V, Tivey T 등 PLoS One 2012; 7:e44664). 따라서, 현행 인간화된 마우스 모델은 여전히 인간 T 세포의 적절한 발생 및 기능이 여전히 부족하다. 특히, 인간 조직-상주 기억 T 세포의 부재는 병원체 예컨대 HIV에 대한 오래 지속되는 점막 면역력을 유도하는 것을 목표로 하는 더욱 효율적인 면역화 전략을 개발 및 시험하기 위해 전임상 도구로서 인간화된 마우스의 이용을 예방한다.
인간 조직-상주 T 세포의 발생 및 생존을 더욱 양호하게 이해하기 위해 및 오래 지속되는 T 세포-의존성 점막 면역력을 유도하는 신규한 면역화 전략을 시험하는 모델을 제공하기 위해, 인간 조직-상주 T 세포를 발생하는 유전자 변형된 비-인간 동물을 갖는 것이 유용할 것이다. 그와 같은 마우스 모델은 장내 미생물총과 인간 조직-상주 면역 세포의 상호작용을 연구하는데, 예를 들어, 미생물총이 소장 및 결장에서 인간 면역 세포의 발생 및 생존을 형상화할 수 있는 방법의 연구하는데 또한 사용될 수 있다.
또한, 당해 기술에서 인간 자연 살해 (NK) 세포 발생 및 기능의 비-인간 동물 모델이 필요하다.
요약
비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 비-인간 동물의 제조 방법, 및 비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 비-인간 동물의 이용 방법이 또한 제공된다. 이들 동물 및 방법은, 예를 들어, 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포 발생 및 기능의 모델링; 인간 T 세포 및/또는 NK 세포의 인간 병원체 감염의 모델링; T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 병원체에 의한 감염을 저해하는 제제용 생체내 스크린; 예를 들면 건강한 또는 이환 상태에서, 인간 T 세포 및/또는 NK 세포의 발생 및/또는 기능을 조절하는 제제용 생체내 스크린; 인간 T 세포 및/또는 NK 세포에 독성인 제제용 생체내 스크린; 인간 T 세포 및/또는 NK 세포에 관한 독성 제제의 독성 효과를 예방, 완화, 또는 반전시키는 제제용 생체내 스크린; 후보 T 세포-유도 백신의 생체내 스크린; 및 활성화 NK 세포-매개된 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 공정에 의해 종양 성장 및/또는 감염을 저해하는 제제용 생체내 및 시험관내 스크린을 포함한, 당해 기술에서 많은 용도를 찾아낸다.
제1 측면에서, 본 개시내용은, 하기를 포함한, 유전자 변형된 비-인간 동물을 제공한다: 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현한다.
SIRPα 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터일 수 있다. 예를 들어, SIRPα 유전자 프로모터는 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터일 수 있다. SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함할 수 있다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제1 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제1 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질은 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편이다. 하나의 상기 구현예에서, 기능성 단편은 인간 SIRPα의 세포외 도메인, 예를 들면, 적어도 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
제1 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제1 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제1 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질은 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편이다.
제1 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 면역결핍된다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 유전자 변형된 비-인간 동물은 Rag2 유전자 녹-아웃(knock-out)을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 IL2rg 유전자 녹-아웃 또는 Rag2 유전자 녹-아웃 및 IL2rg 유전자 녹-아웃 둘 모두를 포함한다.
제1 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 하나의 상기 구현예에서, 포유동물은 설치류, 예를 들면, 마우스이다.
제1 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 조혈 세포의 생착을 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 병원체로 감염을 포함한다. 하나의 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는 경우, 인간 병원체는 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는 경우, 인간 병원체는 인간 장에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 주는 병원체이다. 하나의 상기 구현예에서, 인간 병원체는 인간 로타바이러스이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는 경우, 병원체는 인간 폐에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 준다. 하나의 상기 구현예에서, 인간 병원체는 인플루엔자 바이러스이다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는 경우, 병원체는 인간 간에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 준다. 더욱 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 조혈 세포 및 종양, 예를 들면, 인간 종양, 예를 들면, 이식된 인간 종양의 생착을 포함한다.
제2 측면에서, 본 개시내용은, 하기를 포함한, 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, 생체내 모델을 제공한다: 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물은 (i) 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 유전자 변형된 비-인간 동물의 소장에서 인간 상피내 림프구 (IEL) 및 페이에르 판을 포함한다.
제2 측면의 하나의 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 병원체, 예를 들면, 장 병원체로 감염을 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 장 병원체는 하기로부터 선택된다: 캄필로박터 제주니, 클로스트리듐 디피실레, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 엔테로코쿠스 패슘, 에스케리치아 콜라이, 인간 로타바이러스, 리스테리아 모노사이토게네스, 노워크 바이러스, 살모넬라 엔테리카, 시겔라 플렉스네리, 시겔라 손네이, 시겔라 다이센테리애, 예르시니아 페스티스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 및 헬리코박터 파일로리.
제2 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 하나의 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제2 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제2 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질은 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편이다. 하나의 상기 구현예에서, 기능성 단편은 인간 SIRPα의 세포외 도메인, 예를 들면, 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
제2 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실이다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제2 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제2 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질은 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편이다.
제2 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 면역결핍된다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 유전자 변형된 비-인간 동물은 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 IL2rg 유전자 녹-아웃 또는 Rag2 유전자 녹-아웃 및 IL2rg 유전자 녹-아웃 둘 모두를 포함한다.
제2 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 하나의 상기 구현예에서, 포유동물은 설치류, 예를 들면, 마우스이다.
제3 측면에서, 본 개시내용은, 하기를 포함한 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, 생체내 모델을 제공한다: 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물은 (i) 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 유전자 변형된 비-인간 동물의 폐에서 인간 상피내 림프구 (IEL)를 포함한다.
제3 측면의 하나의 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 병원체, 예를 들면, 폐 병원체로 감염을 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 폐 병원체는 하기로부터 선택된다: 연쇄상구균 파이오제네스, 헤모필루스 인플루엔자, 코리네박테리움 디프테리아, SARS 코로나바이러스, 보데텔라 페르투스시스, 모락셀라 카타르할리스, 인플루엔자 바이러스 (A, B, C), 코로나바이러스, 아데노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 연쇄상구균 뉴모니애, 스타필로코쿠스 아우레스, 레지오넬라 뉴모필라, 클렙시엘라 뉴모니애, 슈도모나스 에어루기노사, 마이코플라스마 뉴모니아, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 클라미디아 뉴모니애, 블라스토마이세스 더마티티디스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 및 아스페르길루스 푸미가투스.
제3 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 하나의 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제3 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열은 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제3 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질은 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편이다. 하나의 상기 구현예에서, 기능성 단편은 인간 SIRPα의 세포외 도메인, 예를 들면, 적어도 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함한 세포외 도메인을 포함한다.
제3 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다.
하나의 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제3 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제3 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질은 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편이다.
제3 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 면역결핍된다. 예를 들어, 하나의 구현예에서 유전자 변형된 비-인간 동물은 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 IL2rg 유전자 녹-아웃 또는 Rag2 유전자 녹-아웃 및 IL2rg 유전자 녹-아웃 둘 모두를 포함한다.
제3 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 하나의 상기 구현예에서, 포유동물은 설치류, 예를 들면, 마우스이다.
제4 측면에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함하는, 후보 T-세포 유도 백신의 효능의 결정 방법을 제공한다: 유전자 변형된 비-인간 동물에 후보 T-세포 유도 백신을 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계: (i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, (ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및 (iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 인간 병원체로 유전자 변형된 비-인간 동물의 공격 단계; 및 후보 T-세포 유도 백신이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는지 여부를 결정하는 단계.
제4 측면의 하나의 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 하나의 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제4 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제4 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질은 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편이다. 하나의 상기 구현예에서, 기능성 단편은 인간 SIRPα의 세포외 도메인, 예를 들면, 적어도 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함한 세포외 도메인을 포함한다.
제4 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제4 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제4 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질은 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편이다.
제4 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함한다.
제4 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 IL2rg 유전자 녹-아웃을 포함한다.
제4 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 포유동물, 예컨대 설치류, 예를 들면, 마우스이다.
제5 측면에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함하는, 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 병원체에 의한 감염을 저해하는 제제의 확인 방법을 제공한다: 유전자 변형된 비-인간 동물에 제제를 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계: (i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, (ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, (iii) 인간 조혈 세포의 생착, 및 (iv) 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 병원체에 의한 감염, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및 제제가 병원체-감염된 비-인간 동물에서 병원체의 양을 감소시키는지 여부를 결정하는 단계.
제5 측면의 하나의 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 하나의 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제5 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제5 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 SIRPα 단백질은 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편이다. 하나의 상기 구현예에서, 기능성 단편은 인간 SIRPα의 세포외 도메인, 예를 들면, 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362을 포함하는 세포외 도메인을 포함한다.
제5 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 상기 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 하나의 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인 경우, 유전자 변형된 비-인간 동물은 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한다. 하나의 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스이고 삭제 돌연변이는 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성이다. 또 다른 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성이다.
제5 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제5 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질은 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편이다.
제5 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함한다.
제5 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 IL2rg 유전자 녹-아웃을 포함한다.
제5 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 포유동물, 예컨대 설치류, 예를 들면, 마우스이다.
제6 측면에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함한, 인간 IL-15 단백질 및 인간 SIRPα 단백질을 발현한 비-인간 동물의 제조 방법을 제공한다: 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 제1 비-인간 동물의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 상기 서열이 IL-15 유전자 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는, 단계; 인간 SIPRα 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 제2 비-인간 동물의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 상기 서열이 SIRPα 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는, 단계; 및 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열 및 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 포함하는 제3 비-인간 동물을 제조하는 단계로서, 상기 제3 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질 및 인간 SIPRα 단백질을 발현하는, 단계.
제6 측면의 하나의 구현예에서, 도입 단계는 인간 IL-15 또는 인간 SIRPα를 인코딩한 핵산을 포함한 만능 줄기 세포로부터 비-인간 동물의 생성을 포함한다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 제1 동물은 제2 동물과 상이한 동물이고, 제3 동물의 제조 단계는 제1 및 제2 동물의 교배를 포함한다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 제1 동물 및 제2 동물은 동일하고, 제1 동물의 게놈 속에 도입의 단계는 제2 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열과 제1 만능 줄기 세포의 접촉을 포함하고, 제2 동물의 게놈 속에 도입의 단계는 제3 만능 단계 세포를 수득하기 위해 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열과 제2 만능 줄기 세포의 접촉을 포함하고, 제3 비-인간 동물은 제3 만능 줄기 세포로부터 제조된다.
제6 측면의 대안적인 버전에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함한, 인간 IL-15 단백질 및 인간 SIRPα 단백질을 발현한 비-인간 동물의 제조 방법을 제공한다: 인간 SIPRα 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 제1 비-인간 동물의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 인간 SIPRα 단백질을 인코딩한 상기 서열이 SIPRα 유전자 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는, 단계; 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 제2 비-인간 동물의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 상기 서열이 IL-15 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는, 단계; 및 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열 및 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 포함하는 제3 비-인간 동물을 제조하는 단계로서, 상기 제3 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질 및 인간 SIPRα 단백질을 발현하는, 단계.
제6 측면의 더욱 또 다른 구현예에서, 제1 동물 및 제2 동물은 동일하고, 제1 동물의 게놈 속에 도입의 단계는 제2 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열과 제1 만능 줄기 세포의 접촉을 포함하고, 제2 동물의 게놈 속에 도입의 단계는 제3 만능 단계 세포를 수득하기 위해 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열과 제2 만능 줄기 세포의 접촉을 포함하고, 제3 비-인간 동물은 제3 만능 줄기 세포로부터 제조된다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 만능 줄기 세포는 ES 세포 또는 iPS 세포이다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 만능 줄기 세포는 Rag2에 대하여 결핍된다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 만능 줄기 세포는 IL2rg에 대하여 결핍된다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 제3 비-인간 동물은 Rag2 및 IL2rg의 한쪽 또는 양쪽에서 결핍된다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, IL-15 프로모터 서열은 인간 IL-15 프로모터용 서열이다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, IL-15 프로모터 서열은 내인성 비-인간 동물 IL-15 프로모터용 서열이다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 통합은 비-인간 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자의 대체를 초래한다.
제6 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함한다.
제7 측면에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함한, 인간 IL-15 단백질을 발현한 유전자 변형된 비-인간 동물의 생착 방법을 제공한다: 제6 측면에 따른 방법 또는 이의 임의의 구현예에 의해 제조된 유전자 변형된 비-인간 동물 속에 인간 조혈 세포를 포함한 세포의 집단의 이식 단계. 하나의 상기 구현예에서, 이식은 꼬리-정맥 주사, 태아 간 주사, 또는 안와후 주사를 포함한다.
제7 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 이식에 앞서 치사량에 가깝게 조사된다.
제7 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 조혈 세포는 CD34+ 세포이다.
제7 측면의 또 다른 구현예에서, 또는 이의 임의의 상기 구현예들의 추가 구현예에서, 인간 조혈 세포는 태아 간, 성인 골수, 또는 탯줄 혈액 출신이다.
제8 측면에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함한, 표적 세포 살해에서 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 효능 결정 방법을 제공한다: 유전자 변형된 비-인간 동물에 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 투여 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계: (i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, (ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및 (iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 표적 세포에 대해 NK 세포 매개된 항체-의존성 세포 독성을 조절하는지 여부의 결정 단계.
제9 측면에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함한, 표적 세포 살해에서, 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 효능의 결정 방법을 제공한다: 유전자 변형된 비-인간 동물로부터 NK 세포의 단리 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계: (i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, (ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및 (iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질 및 표적 세포와 단리된 NK 세포의 접촉 단계; 및 표적 세포에 대해 단리된 NK 세포의 항체- 또는 항원-결합 단백질-의존성 세포용해 활성의 결정 단계.
제10 측면에서, 본 개시내용은, 하기 단계를 포함한, 표적 세포 살해에서 개선된 효능을 위하여 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 선별 방법을 제공한다: 유전자 변형된 비-인간 동물에 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 투여 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계: (i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, (ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및 (iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 표적 세포의 살해의 개선된 효능을 표시하는지 여부의 결정 단계.
제8, 제9 및 제10 측면 중 어느 하나의 구현예에서, 표적 세포는 하나 이상의 종양 세포, 바이러스성으로-감염된 세포, 박테리아성으로-감염된 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 및 기생충 세포이다.
본 특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면(들)이 있는 본 특허 또는 특허 출원 공개의 사본은 요청시 및 필요한 요금의 지불시 청에 의해 제공될 것이다.
도 1은 인간 SIRPα 서열로 마우스 SIRPα 유전자의 대체의 도식적 묘사를 제공한다. 도 1 (상단부)는 엑손 1-8의 상대 위치를 나타낸 마우스 SIRPα 유전자좌를 보여준다. 도 1 (하단부)는 인간 엑손 2-4를 가진 최종 표적된 대립유전자를 보여준 도식적 묘사를 제공한다. 인코딩된 키메라성 단백질은 마우스 SIRPα 단백질의 세포내 부분에 융합된 야생형 인간 SIRPα 단백질의 아미노산 28-362에 대응하는 세포외 영역을 소유한다. 대각선으로 줄무늬 형상은 삽입된 인간 서열을 나타낸다.
도 2는 마우스 2로 달성된 바와 같이 마우스 IL-15 유전자의 표적화된 게놈성 대체를 예증하는 도식적 묘사를 제공한다. 비어있는 형상은 삽입된 인간 서열을 나타낸다.
도 3A는 비-생착된 SRG (인간 SIRPα, Rag KO, IL-2rg KO) 및 SRG-15 (인간 SIRPα, Rag KO, IL-2rg KO, 인간 IL-15 (마우스 1) 마우스의 다양한 조직내 hIL-15 유전자 발현을 보여주는 그래프를 제공한다. Y-축은 하우스키핑 유전자 Hprt에 비하여 hIL-15 mRNA의 수준을 보여준다.
도 3B는 비-생착된 RG (Rag KO, IL-2rg KO) 및 비-생착된 SRG-15 (인간 SIRPα, Rag KO, IL-2rg KO, 인간 IL-15) 마우스 (표시된 바와 같이 마우스 #1 및 마우스 #2)의 다양한 조직내 인간 hIL-15 유전자 발현을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 4는 폴리 (I:C)로 공격 이후 SRG, SRG IL-15h/m (마우스 2) 및 SRG 1L-15h/h (마우스 2) 마우스내 인간 IL-15 단백질의 혈청 수준을 제공한다.
도 5A는 생착 12-14 주 후 NSG, SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액내 인간 조혈 세포의 효율적인 생착을 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니(Mann-Whitney) U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** p < 0.0001).
도 5B는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2)의 BM, 비장, LN, 간 및 폐에서 인간 CD45+ 세포 수를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 6A는 골수 (BM), 간, 및 폐에서 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 인간 T 및 NK 세포 빈도를 보여주는 플롯을 제공한다.
도 6B는 다양한 조직에서 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 인간 NK 세포 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 6C는 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 간에서 인간 NK 세포 성숙을 예증하는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 6D는 인간 CD56어두운 CD16+ NK 세포가 SRG-15 마우스의 비장에서 인간 살해 저해 수용체의 높은 수준을 발현하는 것을 보여주는 플롯을 제공한다.
도 7A는 생착 10-12 주 후 NSG, SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액에서 인간 NK 세포의 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 7B는 SRG, SRG-15h/m, 및 SRG-15h/h에 대하여 생착 14 주 후 비장에서 인간 NKp46+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 7C는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액, 비장 (SP), 간 및 폐에서 인간 NK 세포의 빈도를 보여주는 플롯을 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 7D는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 비장 (SP), 간 및 폐에서 인간 NK 세포의 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 8은 (인간 CD45+ 세포 (조혈 세포) 및 NKp46+ 세포 (NK 세포)상에 게이팅된) 혈액내 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 인간 T 및 NK 세포 분포를 보여주는 플롯 (좌측); 및 생착된 SRG-15 마우스의 혈액에서 NKp46+ 세포인 hCD45+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프 (우측)을 제공한다.
도 9A는 비장에서 NK 세포 및 T 세포의 분포를 보여주는 플롯 및 CD34+ huHSCs로 생착된 SRG 마우스에 비하여 CD34+ huHSCs로 생착된 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 비장에서 NKp46+ 세포의 백분율 및 수를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 9B는 생착 10-12 주 후 NSG (n=5), SRG (n=19) 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스 (n=39)의 혈액에서 인간 면역 세포 조성물의 그래프를 제공한다.
도 9C는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 가슴샘에서 인간 CD45+ 세포 수를 제공한다.
도 9D는 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 가슴샘에서 hCD45+ 세포의 대표적인 유세포측정 플롯을 제공한다.
도 9E는 생착 14 주 후 SRG (n=8) 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스 (n=4)의 가슴샘에서 hCD45+ 세포의 조성물을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 10A는 생착 7 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액 및 비장에서 CD56밝은 CD16- 및 CD56어두운 CD16+ NK 세포 서브셋의 빈도를 보여주는 플롯을 제공한다.
도 10B는 생착 7 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액 및 비장에서 CD56밝은 CD16- 및 CD56어두운 CD16+ NK 세포 서브셋의 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 10C는 인간 및 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 NK 세포 서브셋에 관한 살해 저해 수용체 (KIRs)의 발현을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 11은 PBMC 샘플에 비하여 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 혈액에서 CD16+ 대 CD16- NK 세포의 분포를 보여주는 2개의 플롯 (상단부 좌측 및 상단부 우측)을 제공한다. 도 11은 또한 SRG-15 마우스 (마우스 2)로부터 수득된 혈액 또는 PBMC-유래된 샘플에서 CD16+ 대 CD16- 인 NKp46+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프 (하단부)를 제공한다.
도 12는 생착 7 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 골수에서 인간 NK 세포 발생을 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 13A는 다양한 조직에서 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)내 인간 T 세포 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다 (K/μl = 수 천의 세포 / μl).
도 13B는 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)에 대하여 혈액 및 간내 인간 CD8+ T 세포 표현형을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 14A는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 폐 CD8+ T 세포내 조직-상주 마커 CD69의 발현을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 14B는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 간 CD8+ T 세포내 조직-상주 마커 CD69의 발현을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 15A는 생착 16 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 비장, 폐 및 간에서 hCD3+ T 세포의 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 15B는 생착 16 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 비장, 폐 및 간에서 CD4/CD8 비를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 16A는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 결장에서 인간 고유판 림프구 (LPLs)의 빈도를 예증하는 플롯을 제공한다.
도 16B는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 결장에서 인간 고유판 림프구 (LPLs)의 빈도를 예증하는 그래프를 제공한다.
도 17A는 도 17B-17C와 함께, 16 주령 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 소장에서 인간 상피내 림프구 (IEL)의 효율적인 생착을 예증한다. 도 17A는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 IEL 분획 내에 인간 CD45+ 세포 및 CD8+ T 세포를 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 17B는 16 주령 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 소장에서 hCD45의 면역조직화학 염색의 이미지를 제공한다.
도 17C는 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 비장 및 소장에서 인간 CD8+ T 세포의 표현형 특징을 보여주는 플롯을 제공한다.
도 18A는 생착 16 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 IEL 분획 내에 인간 CD45+ 세포 및 마우스를 보여주는 대표적인 FACS 플롯을 제공한다.
도 18B는 SRG-15 (마우스 2) 마우스에 비하여 SRG의 소장에서 인간 IEL의 수 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스에 비하여 대장 SRG에서 인간 LPLs의 수를 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (*** P < 0.001).
도 18C는 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 소장에서 hCD3+ 세포의 조성물을 보여주는 플롯을 제공한다. 하나는 8 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 FACS 플롯을 대표한다.
도 18D는 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 비장 및 소장에서 hCD3+ hCD8+ T 세포의 표현형 특징을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 18E는 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 소장에서 hCD8의 면역조직화학 염색의 이미지를 제공한다. 화살표는 hCD8+ IEL를 나타낸다. 사진은 3 마우스 / 그룹을 대표한다.
도 19A는 SRG 및 SRG-15 마우스의 상피내 림프구 집단에서 hCD45+ 세포의 분포 및 수 그리고 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 상피내 림프구 집단에서 hCD45+ 세포의 집단내 NK 세포 및 T 세포의 상대 백분율을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 19B는 혈액 및 비장과 비교된 경우 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 상피내 림프구내 CD16+ 및 CD16- NK 세포의 분포 및 백분율을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 19C는 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스내 인간 IEL 및 인간 고유판 림프구 (LPLs)의 분포 및 수를 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 20A 및 20B는 SRG-15 마우스 (마우스 2)내 hCD45+ 세포를 우세하게 함유한 식별할 수 있는 페이에르 판의 존재를 증명하는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 21A는 장내 미생물총 서열분석용 배설물 샘플 수집 및 코하우징용 시간표를 제공한다.
도 21B는 비-생착된 및 생착된 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 소화관에서 마우스 박테리아의 상대 존재비를 보여주는 다이어그램을 제공한다.
도 22는 SRG-15 마우스내 인간 조직-상주 T 세포의 기능성 관련성을 예증한다. 더 구체적으로, 도 22는 급성 로타바이러스 감염의 클리어링내 인간 IEL의 기능성 관련성을 증명하는 그래프를 제공한다.
도 23A는 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (마우스 2) (n=9)내 CD56밝은 CD16- 및 CD56어두운 CD16+ NK 세포 서브셋의 42 파라미터의 CyTOF-기반 분석을 보여주는 ViSNE 플롯을 제공한다. 각각의 점은 단일 세포를 나타낸다.
도 23B는 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (마우스 2) (n=9)내 CD56밝은 CD16- NK 세포에 관한 8 선택된 마커의 발현 강도를 보여주는 ViSNE 플롯을 제공한다.
도 23C 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (n=9)내 CD56어두운 CD16+ NK 세포에 관한 8 선택된 마커의 발현 강도를 보여주는 ViSNE 플롯.
도 24A는 폴리-IC 주사 이전 및 이후 CD69+인 SRG 대 SRG-15 (마우스 2) 마우스내 혈액 NK 세포의 백분율을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 24B는 폴리 I:C 또는 인간 IL-12p70으로 시험관내 자극 이후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 유래된 NK 세포로부터 IFNγ 생산을 보여주는 그래프를 제공한다. 마우스로부터 NK 세포는 건강한 인간 PBMCs로부터 유래된 NK 세포에 대해 비교된다. 모든 샘플은 NK 수로 정규화된다.
도 24C는 항-CD20 항체의 부재 (상단부 우측) 또는 존재 (하단부 우측)하에 Raji 세포에 대해 또는 HLA 부류 I 결핍된 K562 세포 (좌측)에 대해 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스로부터 스페닉(spenic) NK 세포의 세포용해 수용력을 보여주는 그래프를 제공한다. SRG-15 #1 및 SRG-15 #2는 SRG-15 (마우스 2) 한배새끼로부터 2개의 상이한 NK 세포 제조물을 나타낸다.
도 25A는 SRG-15 마우스 (마우스 2)내 인간 NK 세포가 리툭시맙 (RTX)으로 치료 이후 종양 성장을 저해하는 것을 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (*** P < 0.001).
도 25B는 미치료된 (n=5) 및 RTX-치료된 SRG-15 마우스 (n=1)의 인간 종양 이종이식물내 인간 NK 세포 및 T 세포의 빈도를 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (*** P < 0.001).
도 25C는 미치료된 (n=2) 및 RTX-치료된 SRG-15 마우스 (n=1)의 혈액 및 종양에서 인간 NK 세포 서브셋을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (*** P < 0.001).
도 1은 인간 SIRPα 서열로 마우스 SIRPα 유전자의 대체의 도식적 묘사를 제공한다. 도 1 (상단부)는 엑손 1-8의 상대 위치를 나타낸 마우스 SIRPα 유전자좌를 보여준다. 도 1 (하단부)는 인간 엑손 2-4를 가진 최종 표적된 대립유전자를 보여준 도식적 묘사를 제공한다. 인코딩된 키메라성 단백질은 마우스 SIRPα 단백질의 세포내 부분에 융합된 야생형 인간 SIRPα 단백질의 아미노산 28-362에 대응하는 세포외 영역을 소유한다. 대각선으로 줄무늬 형상은 삽입된 인간 서열을 나타낸다.
도 2는 마우스 2로 달성된 바와 같이 마우스 IL-15 유전자의 표적화된 게놈성 대체를 예증하는 도식적 묘사를 제공한다. 비어있는 형상은 삽입된 인간 서열을 나타낸다.
도 3A는 비-생착된 SRG (인간 SIRPα, Rag KO, IL-2rg KO) 및 SRG-15 (인간 SIRPα, Rag KO, IL-2rg KO, 인간 IL-15 (마우스 1) 마우스의 다양한 조직내 hIL-15 유전자 발현을 보여주는 그래프를 제공한다. Y-축은 하우스키핑 유전자 Hprt에 비하여 hIL-15 mRNA의 수준을 보여준다.
도 3B는 비-생착된 RG (Rag KO, IL-2rg KO) 및 비-생착된 SRG-15 (인간 SIRPα, Rag KO, IL-2rg KO, 인간 IL-15) 마우스 (표시된 바와 같이 마우스 #1 및 마우스 #2)의 다양한 조직내 인간 hIL-15 유전자 발현을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 4는 폴리 (I:C)로 공격 이후 SRG, SRG IL-15h/m (마우스 2) 및 SRG 1L-15h/h (마우스 2) 마우스내 인간 IL-15 단백질의 혈청 수준을 제공한다.
도 5A는 생착 12-14 주 후 NSG, SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액내 인간 조혈 세포의 효율적인 생착을 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니(Mann-Whitney) U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** p < 0.0001).
도 5B는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2)의 BM, 비장, LN, 간 및 폐에서 인간 CD45+ 세포 수를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 6A는 골수 (BM), 간, 및 폐에서 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 인간 T 및 NK 세포 빈도를 보여주는 플롯을 제공한다.
도 6B는 다양한 조직에서 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 인간 NK 세포 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 6C는 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 간에서 인간 NK 세포 성숙을 예증하는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 6D는 인간 CD56어두운 CD16+ NK 세포가 SRG-15 마우스의 비장에서 인간 살해 저해 수용체의 높은 수준을 발현하는 것을 보여주는 플롯을 제공한다.
도 7A는 생착 10-12 주 후 NSG, SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액에서 인간 NK 세포의 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 7B는 SRG, SRG-15h/m, 및 SRG-15h/h에 대하여 생착 14 주 후 비장에서 인간 NKp46+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 7C는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액, 비장 (SP), 간 및 폐에서 인간 NK 세포의 빈도를 보여주는 플롯을 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 7D는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 비장 (SP), 간 및 폐에서 인간 NK 세포의 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 8은 (인간 CD45+ 세포 (조혈 세포) 및 NKp46+ 세포 (NK 세포)상에 게이팅된) 혈액내 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 인간 T 및 NK 세포 분포를 보여주는 플롯 (좌측); 및 생착된 SRG-15 마우스의 혈액에서 NKp46+ 세포인 hCD45+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프 (우측)을 제공한다.
도 9A는 비장에서 NK 세포 및 T 세포의 분포를 보여주는 플롯 및 CD34+ huHSCs로 생착된 SRG 마우스에 비하여 CD34+ huHSCs로 생착된 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 비장에서 NKp46+ 세포의 백분율 및 수를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 9B는 생착 10-12 주 후 NSG (n=5), SRG (n=19) 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스 (n=39)의 혈액에서 인간 면역 세포 조성물의 그래프를 제공한다.
도 9C는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 가슴샘에서 인간 CD45+ 세포 수를 제공한다.
도 9D는 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 가슴샘에서 hCD45+ 세포의 대표적인 유세포측정 플롯을 제공한다.
도 9E는 생착 14 주 후 SRG (n=8) 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스 (n=4)의 가슴샘에서 hCD45+ 세포의 조성물을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 10A는 생착 7 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액 및 비장에서 CD56밝은 CD16- 및 CD56어두운 CD16+ NK 세포 서브셋의 빈도를 보여주는 플롯을 제공한다.
도 10B는 생착 7 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액 및 비장에서 CD56밝은 CD16- 및 CD56어두운 CD16+ NK 세포 서브셋의 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 10C는 인간 및 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 NK 세포 서브셋에 관한 살해 저해 수용체 (KIRs)의 발현을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 11은 PBMC 샘플에 비하여 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 혈액에서 CD16+ 대 CD16- NK 세포의 분포를 보여주는 2개의 플롯 (상단부 좌측 및 상단부 우측)을 제공한다. 도 11은 또한 SRG-15 마우스 (마우스 2)로부터 수득된 혈액 또는 PBMC-유래된 샘플에서 CD16+ 대 CD16- 인 NKp46+ 세포의 백분율을 보여주는 그래프 (하단부)를 제공한다.
도 12는 생착 7 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 골수에서 인간 NK 세포 발생을 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (* P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001).
도 13A는 다양한 조직에서 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)내 인간 T 세포 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다 (K/μl = 수 천의 세포 / μl).
도 13B는 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)에 대하여 혈액 및 간내 인간 CD8+ T 세포 표현형을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 14A는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 폐 CD8+ T 세포내 조직-상주 마커 CD69의 발현을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 14B는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 간 CD8+ T 세포내 조직-상주 마커 CD69의 발현을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 15A는 생착 16 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 비장, 폐 및 간에서 hCD3+ T 세포의 빈도를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 15B는 생착 16 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 비장, 폐 및 간에서 CD4/CD8 비를 보여주는 그래프를 제공한다.
도 16A는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 결장에서 인간 고유판 림프구 (LPLs)의 빈도를 예증하는 플롯을 제공한다.
도 16B는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 결장에서 인간 고유판 림프구 (LPLs)의 빈도를 예증하는 그래프를 제공한다.
도 17A는 도 17B-17C와 함께, 16 주령 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 소장에서 인간 상피내 림프구 (IEL)의 효율적인 생착을 예증한다. 도 17A는 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 IEL 분획 내에 인간 CD45+ 세포 및 CD8+ T 세포를 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 17B는 16 주령 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 소장에서 hCD45의 면역조직화학 염색의 이미지를 제공한다.
도 17C는 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 비장 및 소장에서 인간 CD8+ T 세포의 표현형 특징을 보여주는 플롯을 제공한다.
도 18A는 생착 16 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 IEL 분획 내에 인간 CD45+ 세포 및 마우스를 보여주는 대표적인 FACS 플롯을 제공한다.
도 18B는 SRG-15 (마우스 2) 마우스에 비하여 SRG의 소장에서 인간 IEL의 수 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스에 비하여 대장 SRG에서 인간 LPLs의 수를 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (*** P < 0.001).
도 18C는 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 소장에서 hCD3+ 세포의 조성물을 보여주는 플롯을 제공한다. 하나는 8 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 FACS 플롯을 대표한다.
도 18D는 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 비장 및 소장에서 hCD3+ hCD8+ T 세포의 표현형 특징을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 18E는 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 소장에서 hCD8의 면역조직화학 염색의 이미지를 제공한다. 화살표는 hCD8+ IEL를 나타낸다. 사진은 3 마우스 / 그룹을 대표한다.
도 19A는 SRG 및 SRG-15 마우스의 상피내 림프구 집단에서 hCD45+ 세포의 분포 및 수 그리고 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 상피내 림프구 집단에서 hCD45+ 세포의 집단내 NK 세포 및 T 세포의 상대 백분율을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 19B는 혈액 및 비장과 비교된 경우 SRG-15 마우스 (마우스 2)의 상피내 림프구내 CD16+ 및 CD16- NK 세포의 분포 및 백분율을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 19C는 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스내 인간 IEL 및 인간 고유판 림프구 (LPLs)의 분포 및 수를 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 20A 및 20B는 SRG-15 마우스 (마우스 2)내 hCD45+ 세포를 우세하게 함유한 식별할 수 있는 페이에르 판의 존재를 증명하는 플롯 및 그래프를 제공한다.
도 21A는 장내 미생물총 서열분석용 배설물 샘플 수집 및 코하우징용 시간표를 제공한다.
도 21B는 비-생착된 및 생착된 SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 소화관에서 마우스 박테리아의 상대 존재비를 보여주는 다이어그램을 제공한다.
도 22는 SRG-15 마우스내 인간 조직-상주 T 세포의 기능성 관련성을 예증한다. 더 구체적으로, 도 22는 급성 로타바이러스 감염의 클리어링내 인간 IEL의 기능성 관련성을 증명하는 그래프를 제공한다.
도 23A는 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (마우스 2) (n=9)내 CD56밝은 CD16- 및 CD56어두운 CD16+ NK 세포 서브셋의 42 파라미터의 CyTOF-기반 분석을 보여주는 ViSNE 플롯을 제공한다. 각각의 점은 단일 세포를 나타낸다.
도 23B는 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (마우스 2) (n=9)내 CD56밝은 CD16- NK 세포에 관한 8 선택된 마커의 발현 강도를 보여주는 ViSNE 플롯을 제공한다.
도 23C 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (n=9)내 CD56어두운 CD16+ NK 세포에 관한 8 선택된 마커의 발현 강도를 보여주는 ViSNE 플롯.
도 24A는 폴리-IC 주사 이전 및 이후 CD69+인 SRG 대 SRG-15 (마우스 2) 마우스내 혈액 NK 세포의 백분율을 보여주는 그래프를 제공한다.
도 24B는 폴리 I:C 또는 인간 IL-12p70으로 시험관내 자극 이후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 유래된 NK 세포로부터 IFNγ 생산을 보여주는 그래프를 제공한다. 마우스로부터 NK 세포는 건강한 인간 PBMCs로부터 유래된 NK 세포에 대해 비교된다. 모든 샘플은 NK 수로 정규화된다.
도 24C는 항-CD20 항체의 부재 (상단부 우측) 또는 존재 (하단부 우측)하에 Raji 세포에 대해 또는 HLA 부류 I 결핍된 K562 세포 (좌측)에 대해 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스로부터 스페닉(spenic) NK 세포의 세포용해 수용력을 보여주는 그래프를 제공한다. SRG-15 #1 및 SRG-15 #2는 SRG-15 (마우스 2) 한배새끼로부터 2개의 상이한 NK 세포 제조물을 나타낸다.
도 25A는 SRG-15 마우스 (마우스 2)내 인간 NK 세포가 리툭시맙 (RTX)으로 치료 이후 종양 성장을 저해하는 것을 보여주는 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (*** P < 0.001).
도 25B는 미치료된 (n=5) 및 RTX-치료된 SRG-15 마우스 (n=1)의 인간 종양 이종이식물내 인간 NK 세포 및 T 세포의 빈도를 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (*** P < 0.001).
도 25C는 미치료된 (n=2) 및 RTX-치료된 SRG-15 마우스 (n=1)의 혈액 및 종양에서 인간 NK 세포 서브셋을 보여주는 플롯 및 그래프를 제공한다. 모든 데이터는 평균 ± 표준오차로서 보여진다. 통계 분석은 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다 (*** P < 0.001).
본 방법 및 조성물이 기재되기 전에, 본 발명이 그 자체로 다양할 수 있는, 기재된 특정한 방법 또는 조성물에 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다. 본 발명의 범위가 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 본원에서 사용된 용어가 특정한 구현예만의 기재 목적이고, 제한되도록 의도되지 않는 것이 또한 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에서 기재된 것과 유사한 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있어도, 특정한 방법 및 물질은 현재 기재된다. 본원에서 언급된 모든 공보는 공보가 인용되는 것에 관련하여 방법 및/또는 물질을 개시 및 기재하기 위해 본원에서 참고로 편입된다. 본 개시내용이 모순이 있는 정도로 편입된 공보의 임의의 개시내용을 대체한다는 것이 이해된다.
본 개시내용의 판독시 당해 분야의 숙련가에 분명한 바와 같이, 본원에서 기재된 및 예증된 각각의 개별 구현예는 본 발명의 범위 또는 정신으로부터 이탈 없이 임의의 다른 몇 개의 구현예의 특징에서 쉽게 분리될 수 있거나 특징과 조합될 수 있는 별개의 성분 및 특징을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 수행될 수 있다.
본원에서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 ("a", "an", 및 "the")가 맥락이 명확히 달리 지시하지 않는 한 복수의 지시대상을 포함하는 것이 유의되어야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 참조는 복수의 그런 세포를 포함하고 "단백질"에 대한 참조는 당해 분야의 숙련가에 공지된 하나 이상의 단백질 및 이의 등가물에 대한 참조, 기타 등등을 포함한다.
본원에서 논의된 공보는 본 출원의 출원일에 앞서 그들의 개시내용에 대하여 단독으로 제공된다. 본 발명이 상기 공보를 앞설 권리가 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되는 것은 본원에서 없다.
비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 유전자 변형된 비-인간 동물이 제공된다. 비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 비-인간 동물의 제조 방법, 및 비-인간 동물 게놈으로부터 인간 SIRPα 및 인간 IL-15를 발현한 비-인간 동물의 이용 방법이 또한 제공된다. 이들 동물 및 방법은, 예를 들어, 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포 발생 및 기능의 모델링; 인간 병원체 감염, 예를 들면, 특정 조직의 인간 병원체 감염, 예를 들면, 인간 소화관, 폐 또는 간 병원체 감염의 모델링; 인간 T 세포 및/또는 NK 세포의 인간 병원체 감염의 모델링; T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 병원체에 의한 감염을 저해하는 제제용 생체내 스크린; 예를 들면 건강한 또는 이환 상태에서, 인간 T 세포 및/또는 NK 세포의 발생 및/또는 기능을 조절하는 제제용 생체내 스크린; 인간 T 세포 및/또는 NK 세포에 독성인 제제용 생체내 스크린; 인간 T 세포 및/또는 NK 세포에 관한 독성 제제의 독성 효과를 예방, 완화, 또는 반전시키는 제제용 생체내 스크린; 후보 T 세포-유도 백신의 생체내 스크린; 및 활성화 NK 세포-매개된 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 공정에 의해 종양 성장 및/또는 감염을 저해하는 제제용 생체내 및 시험관내 스크린을 포함한, 당해 기술에서 많은 용도를 찾아낸다.
인간화된 SIRPα 비-인간 동물
본 개시내용의 일부 측면에서 인간화된 SIRPα 비-인간 동물이 제공된다. 인간화된 SIRPα 비-인간 동물, 또는 "SIRPα 비-인간 동물"은 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 비-인간 동물을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "인간 SIRPα 단백질"은 야생형 (또는 원상태) 인간 SIRPα 단백질 또는, 야생형 인간 SIRPα 단백질의 하나 이상의 신호전달 및/또는 수용체 기능을 보유하는, 야생형 (또는 원상태) 인간 SIRPα 단백질의 변이체인 단백질을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "변이체"는 인간 폴리펩타이드 또는 핵산 서열의 단리된 천연 발생 유전적 돌연변이체 또는 인간 폴리펩타이드 또는 핵산 서열의 재조합으로 제조된 변동물을 정의하고, 각각의 이들은 대응하는 야생형 인간 핵산 또는 폴리펩타이드 서열과 비교된 하나 이상의 돌연변이를 함유한다. 예를 들어, 상기 돌연변이는 하나 이상의 아미노산 치환, 첨가, 및/또는 결실을 함유한다. 용어 "변이체"는 또한 인간 동족체 및 상동체를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 변이체 폴리펩타이드는 야생형 인간 폴리펩타이드에 70% 이상 동일성, 예를 들면 75%, 80%, 또는 85% 이상 동일성, 예를 들면 야생형 인간 폴리펩타이드에 대해 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는다.
2개 서열 사이 동일성 퍼센트는 당해 기술내 임의의 편리한 기술, 예를 들어, 예를 들면, 공공연하게 이용가능한 소프트웨어를 이용하는, 서열 배열을 이용하여 결정될 수 있다. 돌연변이는 표준 분자 생물학 기술, 예컨대 부위 유도적 돌연변이유발, PCR-매개된 돌연변이유발, 유도된 발생, 기타 등등을 이용하여 도입될 수 있다. 당해 분야의 숙련가는 하나 이상의 핵산 치환이 아미노산 서열의 변경 없이 도입될 수 있다는 것, 및 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 인간 단백질의 기능성 특성의 변경 없이 도입될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
보존적 아미노산 치환은 인간 단백질 변이체를 생산하기 위해 인간 단백질에서 제조될 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 유사한 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로 하나의 아미노산의 기술적으로 인식된 치환을 의미한다. 예를 들어, 각각의 아미노산은 하나 이상의 하기 특징: 양전기, 음전기, 지방족, 방향족, 극성, 소수성 및 친수성을 갖는 것으로서 기재될 수 있다. 보존적 치환은 동일한 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로 지정된 구조적 또는 기능성 특징을 갖는 하나의 아미노산의 치환이다. 산성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트를 포함하고; 염기성 아미노산은 히스티딘, 라이신, 아르기닌을 포함하고; 지방족 아미노산은 이소류신, 류신 및 발린을 포함하고; 방향족 아미노산은 페닐알라닌, 글리신, 티로신 및 트립토판을 포함하고; 극성 아미노산은 아스파르테이트, 글루타메이트, 히스티딘, 라이신, 아스파라긴, 글루타민, 아르기닌, 세린, 트레오닌 및 티로신을 포함하고; 소수성 아미노산은 알라닌, 시스테인, 페닐알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 메티오닌, 프롤린, 발린 및 트립토판을 포함하고; 그리고 보존적 치환은 각각의 그룹 내에 아미노산 중 치환을 포함한다. 모두 전형적으로 소형으로 간주되는, 상대 크기에 관하여, 알라닌, 시스테인, 아스파르테이트, 글리신, 아스파라긴, 프롤린, 트레오닌, 세린, 발린인, 아미노산이 또한 기재될 수 있다.
인간 변이체는, 예시적으로, 제한 없이, 알파-아미노부티르산, 시트룰린, 카나바닌, 시아노알라닌, 디아미노부티르산, 디아미노피멜산, 디하이드록시-페닐알라닌, 드젠콜산, 호모아르기닌, 하이드록시프롤린, 노르류신, 노르발린, 3-포스포세린, 호모세린, 5-하이드록시트립토판, 1-메틸히스티딘, 메틸히스티딘, 및 오르니틴을 포함한, 합성 아미노산 유사체, 아미노산 유도체 및/또는 비-표준 아미노산을 포함할 수 있다.
인간 변이체는 야생형 인간 단백질을 인코딩한 핵산과 고도의 동일성을 갖는 핵산에 의해 전형적으로 인코딩될 것이다. 인간 변이체를 인코딩한 핵산의 보체는 구체적으로 높은 엄격성 조건하에 야생형 인간을 인코딩한 핵산으로 하이브리드화한다. 인간 변이체를 인코딩한 핵산은 공지된 방법론을 이용하여 재조합으로 또는 합성으로 단리 또는 생성될 수 있다. 또한 용어 "인간 SIRPα 단백질"에 의해 포함되는 것은, 야생형 인간 SIRPα 단백질의 하나 이상의 신호전달 및/또는 수용체 기능, 예를 들면, 인간 SIRPα 단백질의 세포외 도메인을 보유하는, 야생형 인간 SIRPα 단백질의 단편 (또는 이들의 변이체)이다.
용어 "인간 SIRPα 단백질"은 또한, 야생형 인간 SIRPα 단백질의 하나 이상의 단편 (또는 이들의 변이체)를 포함하는 및 야생형 인간 SIRPα 단백질의 하나 이상의 신호전달 및/또는 수용체 기능을 보유하는, 융합 단백질, 즉, 키메라성 단백질을 포함한다. 예를 들면, 하나 이상의 비-인간 펩타이드 또는 폴리펩타이드와 조합으로, 야생형 인간 SIRPα 단백질의 하나 이상의 단편 (또는 이들의 변이체)를 포함하는 융합 단백질은 또한 본원에서 인간화된 SIRPα 단백질로서 참조될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 야생형 마우스 SIRPα 단백질의 신호전달 도메인과 융합된 야생형 인간 SIRPα 단백질의 세포외 도메인의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 용어 "인간 SIRPα 단백질"에 의해 포함된다.
일부 사례에서, 본 개시내용에 따라서 인간 SIRPα 단백질은 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%, 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은, 따라서, 인간 SIRPα 단백질, 예를 들면, 야생형 인간 SIRPα 단백질, 야생형 인간 SIRPα 단백질의 변이체, 야생형 인간 SIRPα 단백질의 하나 이상의 신호전달 및/또는 수용체 기능을 보유하는 야생형 인간 SIRPα 단백질의 단편 (또는 이의 변이체), 또는 융합 단백질, 즉, 야생형 인간 SIRPα 단백질의 하나 이상의 단편 (또는 이들의 변이체)를 포함하는 및 야생형 인간 SIRPα 단백질의 하나 이상의 신호전달 및/또는 수용체 기능을 보유하는, 키메라성 단백질용 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
(인간내 "신호 조절 단백질 α" 및 "CD172A"로서 또한 공지된) SIRPα는 신호-조절-단백질 (SIRP) 계열의 구성원이고, 또한 면역글로불린 상과에 속한다. SIRPα는 면역결핍된 마우스내 세포 생착을 개선하는 것으로 나타났다 (Strowig 등 Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 13218-13223). 야생형 인간 SIRPα용 폴리펩타이드 서열 및 야생형 인간 SIRPα를 인코딩하는 핵산 서열은 유전자은행 수탁 번호 NM_001040022.1 (변이체 1), NM_001040023.1 (변이체 2), 및 NM_080792.2 (변이체 3)에서 찾아질 수 있다. SIRPα 유전자는 적어도 침팬지, 붉은털원숭이, 개, 소, 마우스, 랫트, 및 닭에서 보존된다. 야생형 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 게놈성 유전자좌는 염색체 20; NC_000020.11 (1894117-1939896)에서 인간 게놈에 찾아질 수 있다. 단백질 서열은 상기 유전자좌에서 엑손 1 내지 8에 의해 인코딩된다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 인간 SIRPα 용 코딩 서열을 포함한 핵산 서열은 인간 SIRPα 유전자의 하나 이상의 엑손 1-8을 포함한다. 일부 사례에서, 핵산 서열은 또한 인간 SIRPα의 게놈성 유전자좌의 측면, 예를 들면, 인트론, 3' 및/또는 5' 미번역된 서열 (UTRs)을 포함한다. 일부 사례에서, 핵산 서열은 인간 SIRPα 게놈성 유전자좌의 전체의 영역을 포함한다. 일부 사례에서, 핵산 서열은 인간 SIRPα 게놈성 유전자좌의 엑손 2-4를 포함한다.
대상 적용의 인간화된 SIRPα 비-인간 동물에서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 SIRPα 유전자의 하나 이상의 조절 서열, 예를 들면, 비-인간 동물의 SIRPα 유전자의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, SIRPα 조절 서열은 비-인간 동물 SIRPα 발현을 조절하는 비-인간 동물 SIRPα 게놈성 유전자좌의 그 서열, 예를 들어, 5' 조절 서열, 예를 들면, SIRPα 프로모터, SIRPα 5' 미번역된 영역 (UTR), 등; 3' 조절 서열, 예를 들면, 3 'UTR; 및 인핸서, 등이다.
"프로모터" 또는 "프로모터 서열"은 세포에서 RNA 폴리머라제를 결합할 수 있는 및 다운스트림 (3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 영역을 지칭한다. 프로모터 서열은 전사 시작 부위에 의해 그의 3' 말단에서 한정되고 배경 초과 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 요소 또는 염기의 최소 수를 포함하도록 업스트림 (5' 방향) 확장한다. 프로모터 서열 내에 전사 시작 부위, 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 책임지는 단백질 결합 도메인이 발견될 것이다. 진핵 프로모터는 종종, 그러나 항상은 아니고, "TATA" 박스 및 "CAT" 박스를 함유한다. 대응하는 내인성 단백질에 대하여 관측된 바와 같이, 동시에 그리고 동일한 공간적 및 일시적 발현 패턴에서, 즉, 동일한 세포 및 조직에서 인간 단백질의 전사를 촉진하는, DNA 조절 요소, 예를 들면 프로모터가 본 개시내용에 특히 관심이다.
마우스 SIRPα는 염색체 2; NC 000068.7 (129592606-129632228)상에 위치하고, 마우스 SIRPα 코딩 서열은 유전자은행 수탁 번호 NM_007547.4 (동형체 1), NM_001177647.2 (동형체 2), NM_001291019.1 (동형체 3), NM_001291020.1 (동형체 3), NM 001291021.1 (동형체 4), NM_001291022.1 (동형체 5)에서 찾아질 수 있다. 마우스 SIRPα의 조절 서열은 당해 기술에서 양호하게 정의되고, 인실리코 방법을 이용하여, 예를 들면, 월드 와이드 웹에서 UCSC 게놈 브라우저상에 상기 유전자은행 수탁 번호 참조에 의해, 또는 당해 기술에서 기재된 바와 같이 실험적 방법에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 일부 사례에서, 예를 들면, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 마우스 SIRPα 게놈성 유전자좌에 위치한 경우, 인간 SIRPα 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 마우스 게놈에 대해 내인성, 또는 원상태이다, 즉, 이들은 인간 핵산 서열의 통합에 앞서 마우스 게놈에서 존재하였다.
일부 사례에서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 게놈 속에 (상기에 기재된 바와 같이 단편을 포함한) 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 인간 핵산 서열, 즉, "인간 SIRPα 핵산 서열", 또는 "인간 SIRPα 서열"의 랜덤 통합, 또는 삽입에 의해 생성된다. 전형적으로, 상기 구현예에서, 게놈에서 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열의 위치는 미공지된다. 다른 사례에서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 게놈 속에 인간 SIRPα 핵산 서열의 표적화된 통합, 또는 삽입, 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 생성된다. 상동성 재조합에서, 폴리뉴클레오타이드는 표적 유전자좌에서 숙주 게놈 속에 삽입되면서 동시에 표적 유전자좌로부터 숙주 게놈성 물질, 예를 들면, 50 염기쌍 (bp) 이상, 100 bp 이상, 200 bp 이상, 500 bp 이상, 1 kB 이상, 2 kB 이상, 5 kB 이상, 10 kB 이상, 15 kB 이상, 20 kB 이상, 또는 50 kB 이상의 게놈성 물질을 제거한다. 그래서, 예를 들어, 마우스 SIRPα 유전자좌에 인간 SIRPα 핵산 서열의 표적화에 의해 창출된 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 인간화된 SIRPα 마우스에서, 인간 SIRPα 핵산 서열은 SIRPα 유전자좌에서 일부 또는 모든 마우스 서열, 예를 들면 엑손 및/또는 인트론을 대체할 수 있다. 일부 상기 사례에서, 인간 SIRPα 핵산 서열은 인간 SIRPα 서열의 발현이 마우스 SIRPα 유전자좌에서 원상태, 또는 내인성, 조절 서열에 의해 조절되도록 마우스 SIRPα 유전자좌 속에 통합된다. 환언하면, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열이 작동가능하게 연결되는 조절 서열(들)은 마우스 SIRPα 유전자좌에서 원상태 SIRPα 조절 서열이다.
일부 사례에서, 인간 SIRPα 서열의 통합은 인간 SIRPα 서열이 통합한 유전자 속에 전사에 영향을 주지 않는다. 예를 들어, 인간 SIRPα 서열이 인테인으로서 코딩 서열 속에 통합하면, 또는 인간 SIRPα 서열이 2A 펩타이드를 포함하면, 인간 SIRPα 서열은 인간 SIRPα 서열이 통합한 유전자와 동시에 번역 및 전사될 것이다. 다른 사례에서, 인간 SIRPα 서열의 통합은 인간 SIRPα 서열이 통합한 유전자의 전사를 방해한다. 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 인간 SIRPα 서열의 통합시, 통합 유전자좌에서 일부 또는 모든 코딩 서열은 제거될 수 있어서, 인간 SIRPα 서열은 대신 전사된다. 일부 상기 사례에서, 인간 SIRPα 서열의 통합은 삭제 돌연변이, 및 그러므로, 무반응 대립유전자를 창출한다. 무반응 대립유전자는 그 유전자의 정상 기능이 완전히 부족한 유전자의 돌연변이체 카피이다. 이는 분자 수준에서 유전자 생성물 (단백질, RNA)의 완전한 부재, 또는 비-기능성 유전자 생성물의 발현의 결과일 수 있다. 표현형 수준에서, 무반응 대립유전자는 전체 유전자좌의 결실로부터 구별할 수 없다.
일부 사례에서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열의 하나의 카피를 포함한다. 예를 들어, 비-인간 동물은 핵산 서열에 대하여 이종접합성일 수 있다. 환언하면, 한 유전자좌에서 하나의 대립유전자는 핵산 서열을 포함할 것이고, 반면에 다른 것은 내인성 대립유전자일 것이다. 예를 들어, 상기 논의된 바와 같이, 일부 사례에서, 인간 SIRPα 핵산 서열은 비-인간 동물 SIRPα용 무반응 대립유전자를 창출하도록 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, SIRPα 유전자좌 속에 통합된다. 일부 상기 구현예에서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 인간 SIRPα를 인코딩한 핵산 서열에 대하여 이종접합성일 수 있다, 즉, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 비-인간 동물 SIRPα용 하나의 무반응 대립유전자 (핵산 서열을 포함한 대립유전자) 및 하나의 내인성 SIRPα 대립유전자 (야생형 또는 그 반대)를 포함한다. 환언하면, 비-인간 동물은 SIRPαh/m 비-인간 동물이고, 여기서 "h"는 인간 서열을 포함한 대립유전자를 나타내고 "m"은 내인성 대립유전자를 나타낸다. 다른 사례에서, 인간화된 SIRPα는 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열의 2 카피를 포함한다. 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 핵산 서열에 대하여 동종접합성일 수 있다, 즉, 2배체 게놈에서 유전자좌에 대하여 양쪽 대립유전자는 핵산 서열을 포함할 것이다, 즉, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 비-인간 동물 SIRPα용 2개의 무반응 대립유전자 (핵산 서열을 포함한 대립유전자)를 포함한다. 환언하면, 비-인간 동물은 SIRPαh/h 비-인간 동물이다.
일부 구현예에서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 다른 유전자 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 면역저하된 동물이다. 예를 들어, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 Rag2 유전자 (마우스 유전자용 상기 코딩 서열은 유전자은행 수탁 번호 NM_009020.3에서 찾아질 수 있는, "재조합 활성화 유전자 2")용 적어도 하나의 무반응 대립유전자를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 Rag2용 2개의 무반응 대립유전자를 포함한다. 환언하면, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 Rag2용 동종접합성 무반응이다. 또 다른 예로서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 IL2rg 유전자 (마우스 유전자용 상기 코딩 서열은 유전자은행 수탁 번호 NM 013563.3에서 찾아질 수 있는, 통상 감마 사슬, 또는 γC로서 또한 공지된, "인터류킨 2 수용체, 감마")용 적어도 하나의 무반응 대립유전자를 포함한다. 일부 구현예에서, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 IL2rg용 2개의 무반응 대립유전자를 포함한다. 환언하면, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 IL2rg에 대하여 동종접합성 무반응이다, 즉, IL2rg-/- (또는 IL2rg 유전자가 마우스에서와 같이 X 염색체상에 위치한 IL2rgY/-)이다. 일부 구현예에서, SIRPα 비-인간 동물은 Rag2 및 IL2rg 둘 모두에 대하여 무반응 대립유전자를 포함한다, 즉, Rag2-/- IL2rg-/- (또는 IL2rg 유전자가 마우스에서와 같이 X 염색체상에 위치한 Rag2-/- IL2rgY/-)이다. 다른 유전자 변형이 또한 고려된다. 예를 들어, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 조혈 세포 및 면역 시스템의 발생 및/또는 기능과 관련된 다른 유전자내 변형, 예를 들면 인간 상동체를 인코딩한 핵산 서열로 하나 이상의 다른 비-인간 동물 유전자의 대체를 포함할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 다른 세포 및 조직의 발생 및/또는 기능과 관련된 유전자, 예를 들면, 인간 장애 또는 질환과 관련된 유전자, 또는 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에서 변형된 경우, 인간 장애 및 질환의 모델을 제공하는 유전자내 변형을 포함할 수 있다.
인간화된 IL-15 비-인간 동물
본 개시내용의 일부 측면에서, 인간화된 IL-15 비-인간 동물이 제공된다. 인간화된 IL-15 비-인간 동물, 또는 "IL-15 비-인간 동물"은 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 비-인간 동물을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, "인간 IL-15 단백질"은, 야생형 (또는 원상태) 인간 IL-15 단백질의 하나 이상의 신호전달 기능을 보유하는, 예를 들면, 인간 IL-15 수용체의 자극 (또는 상기를 통한 신호전달)을 허용하는, 및/또는 인간 IL-15 수용체의 인간 IL-15 수용체 알파 소단위에 결합할 수 있는, 및/또는 IL-2R 베타/IL-15R 베타 및 통상 γ-사슬 (γc)에 결합할 수 있는, 야생형 (또는 원상태) 인간 IL-15 단백질 또는 야생형 (또는 원상태) 인간 IL-15 단백질의 변이체인 단백질을 의미한다. 또한 야생형 인간 IL-15 단백질의 하나 이상의 신호전달 기능을 보유하는, 야생형 인간 IL-15 단백질의 단편 (또는 이들의 변이체), 예를 들면, 인간 IL-15 수용체의 자극 (또는 상기를 통한 신호전달)을 허용하는, 및/또는 인간 IL-15 수용체의 인간 IL-15 수용체 알파 소단위에 결합할 수 있는, 및/또는 IL-2R 베타/IL-15R 베타 및 통상 γ-사슬 (γc)에 결합할 수 있는, 인간 IL-15 단백질의 단편이 용어 "인간 IL-15 단백질"에 의해 포함된다.
용어 "인간 IL-15 단백질"은 또한, 예를 들면, 상기에 기재된 바와 같이, 야생형 인간 IL-15 단백질의 하나 이상의 단편 (또는 이들의 변이체)를 포함하는 및 야생형 인간 IL-15 단백질의 하나 이상의 신호전달 기능을 보유하는, 융합 단백질, 즉, 키메라성 단백질을 포함한다. 야생형 인간 IL-15 단백질의 하나 이상의 단편 (또는 이들의 변이체)를 포함하는 융합 단백질은 또한 본원에서 인간화된 IL-15 단백질로서 참조될 수 있다.
인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은, 따라서, 예를 들면, 상기에 기재된 바와 같이, 인간 IL-15 단백질, 즉, 야생형 인간 IL-15 단백질, 야생형 인간 IL-15 단백질의 변이체, 야생형 인간 IL-15 단백질의 하나 이상의 신호전달 기능을 보유하는 야생형 인간 IL-15 단백질의 단편 (또는 이의 변이체), 또는 융합 단백질, 즉, 야생형 인간 IL-15 단백질의 하나 이상의 단편 (또는 이의 변이체)를 포함하는 및 야생형 인간 IL-15 단백질의 하나 이상의 신호전달 기능을 보유하는, 키메라성 단백질용 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드이다.
("인터류킨 15"로서 또한 공지된) IL-15는 T 림프구의 증식을 자극하는 사이토카인이다. 야생형 인간 IL-15용 폴리펩타이드 서열 및 야생형 인간 IL-15를 인코딩하는 핵산 서열은 유전자은행 수탁 번호 M_000585.4; P_000576.1 (동형체 1), M_172175.2; P 751915.1 (동형체 2)에서 찾아질 수 있다. 야생형 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 게놈성 유전자좌는 염색체 4; NC 000004.12 (141636596-141733987)에서 인간 게놈에 찾아질 수 있다. 인간 IL-15 유전자좌는 8 엑손을 포함하고, 엑손 3-8은 코딩 엑손이다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 인간 IL-15용 코딩 서열을 포함한 핵산 서열은 인간 IL-15 유전자의 하나 이상의 엑손 3-8 (즉, 코딩 엑손 1-6, 참조 도 2)를 포함한다. 예를 들어, 하기 엑손 용법 조합 엑손 1-2-3-4-5-6-7-8; 엑손 1-3-4-5-6-7-8 또는 엑손 1-3-4-(대안적인 엑손 5)-5-6-7-8)을 통해 생산되는 다양한 IL-15 mRNA 동형체가 확인되었다. 일부 사례에서, 핵산 서열은 또한 인간 IL-15의 게놈성 유전자좌의 측면, 예를 들면, 인트론, 3' 및/또는 5' 미번역된 서열 (UTRs)을 포함한다. 일부 사례에서, 핵산 서열은 인간 IL-15 게놈성 유전자좌의 전체의 영역을 포함한다. 일부 사례에서, 핵산 서열은 인간 IL-15 게놈성 유전자좌의 엑손 5-8 (즉, 코딩 엑손 3-6)을 포함한다.
일부 사례에서, 본 개시내용에 따라서 인간 IL-15 단백질은 서열 식별 번호:31에 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 100%, 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
대상 적용의 인간화된 IL-15 비-인간 동물에서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열은 IL-15 유전자의 하나 이상의 조절 서열, 예를 들면, 비-인간 동물의 IL-15 유전자의 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, IL-15 조절 서열은 비-인간 동물 IL-15 발현을 조절하는 비-인간 동물 IL-15 게놈성 유전자좌의 그들 서열, 예를 들어, 5' 조절 서열, 예를 들면, IL-15 프로모터, IL-15 5' 미번역된 영역 (UTR), 등; 3' 조절 서열, 예를 들면, 3 'UTR; 및 인핸서, 등이다. 마우스 IL-15는 염색체 8, NC_000074.6 (82331624-82403227, 보체)상에 위치하고, 마우스 IL-15 코딩 서열은 유전자은행 수탁 번호 NM_008357.2 (변이체 1); NM_001254747.1 (변이체 2)에서 찾아질 수 있다. 마우스 IL-15의 조절 서열은 당해 기술에서 양호하게 정의되고, 인실리코 방법을 이용하여, 예를 들면, UCSC 게놈 브라우저, 월드 와이드 웹으로, 게놈.ucsc.edu에서 상기 유전자은행 수탁 번호의 참조에 의해, 또는 당해 기술에서 기재된 바와 같이 실험적 방법에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 일부 사례에서, 예를 들면, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 마우스 IL-15 게놈성 유전자좌에 위치한 경우, 인간 IL-15 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열은 마우스 게놈에 내인성, 또는 원상태이다, 즉, 이들은 인간 핵산 서열의 통합에 앞서 마우스 게놈에서 존재하였다.
일부 사례에서, 인간화된 IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 게놈 속에 (상기에 기재된 바와 같이 단편을 포함한) 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 인간 핵산 서열, 즉, "인간 IL-15 핵산 서열", 또는 "인간 IL-15 서열"의 랜덤 통합, 또는 삽입에 의해 생성된다. 전형적으로, 상기 구현예에서, 게놈에서 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열의 위치는 미공지된다. 다른 사례에서, 인간화된 IL-15 비-인간 동물은 게놈 속에 인간 IL-15 핵산 서열의 표적화된 통합, 또는 삽입에 의해, 예를 들어, 상동성 재조합에 의해 생성된다. 상동성 재조합에서, 폴리뉴클레오타이드는 표적 유전자좌에서 숙주 게놈 속에 삽입되면서 동시에 표적 유전자좌로부터 숙주 게놈성 물질, 예를 들면, 50 염기쌍 (bp) 이상, 100 bp 이상, 200 bp 이상, 500 bp 이상, 1 kB 이상, 2 kB 이상, 5 kB 이상, 10 kB 이상, 15 kB 이상, 20 kB 이상, 또는 50 kB 이상의 게놈성 물질을 제거한다. 그래서, 예를 들어, 마우스 IL-15 유전자좌에 인간 IL-15 핵산 서열의 표적화에 의해 창출된 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 인간화된 IL-15 마우스에서, 인간 IL-15 핵산 서열은 IL-15 유전자좌에서 일부 또는 모든 마우스 서열, 예를 들면 엑손 및/또는 인트론을 대체할 수 있다. 일부 상기 사례에서, 인간 IL-15 핵산 서열은 인간 IL-15 서열의 발현이 마우스 IL-15 유전자좌에서 원상태, 또는 내인성, 조절 서열에 의해 조절되도록 마우스 IL-15 유전자좌 속에 통합된다. 환언하면, 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열이 작동가능하게 연결되는 조절 서열(들)은 마우스 IL-15 유전자좌에서 원상태 IL-15 조절 서열이다.
일부 사례에서, 인간 IL-15 서열의 통합은 인간 IL-15 서열이 통합한 유전자의 전사에 영향을 주지 않는다. 예를 들어, 인간 IL-15 서열이 인테인으로서 코딩 서열 속에 통합하면, 또는 인간 IL-15 서열이 2A 펩타이드를 포함하면, 인간 IL-15 서열은 인간 IL-15 서열이 통합한 유전자와 동시에 번역 및 전사될 것이다. 다른 사례에서, 인간 IL-15 서열의 통합은 인간 IL-15 서열이 통합한 유전자의 전사를 방해한다. 예를 들어, 상동성 재조합에 의한 인간 IL-15 서열의 통합시, 통합 유전자좌에서 일부 또는 모든 코딩 서열은 제거될 수 있어서, 인간 IL-15 서열은 대신 전사된다. 일부 상기 사례에서, 인간 IL-15 서열의 통합은 삭제 돌연변이, 및 그러므로, 무반응 대립유전자를 창출한다. 무반응 대립유전자는 그 유전자의 정상 기능이 완전히 부족한 유전자의 돌연변이체 카피이다. 이는 분자 수준에서 유전자 생성물 (단백질, RNA)의 완전한 부재, 또는 비-기능성 유전자 생성물의 발현의 결과일 수 있다. 표현형 수준에서, 무반응 대립유전자는 전체 유전자좌의 결실로부터 구별할 수 없다.
일부 사례에서, 인간화된 IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열의 하나의 카피를 포함한다. 예를 들어, 비-인간 동물은 핵산 서열에 대하여 이종접합성일 수 있다. 환언하면, 유전자좌에서 하나의 대립유전자는 핵산 서열을 포함할 것이고, 반면에 다른 것은 내인성 대립유전자에 있을 것이다. 예를 들어, 상기 논의된 바와 같이, 일부 사례에서, 인간 IL-15 핵산 서열은 비-인간 동물 IL-15용 무반응 대립유전자를 창출하도록 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, IL-15 유전자좌 속에 통합된다. 일부 상기 구현예에서, 인간화된 IL-15 비-인간 동물은 인간 IL-15를 인코딩한 핵산 서열에 대하여 이종접합성일 수 있다, 즉, 인간화된 IL-15 비-인간 동물은 비-인간 동물 IL-15용 하나의 무반응 대립유전자 (핵산 서열을 포함한 대립유전자) 및 하나의 내인성 IL-15 대립유전자 (야생형 또는 그 반대)를 포함한다. 환언하면, 비-인간 동물은 IL-15h/m 비-인간 동물이고, 여기서 "h"는 인간 서열을 포함한 대립유전자를 나타내고 "m"은 내인성 대립유전자를 나타낸다. 다른 사례에서, 인간화된 IL-15는 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열의 2개의 카피를 포함한다. 예를 들어, 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 핵산 서열에 대하여 동종접합성일 수 있다, 즉, 2배체 게놈에서 유전자좌에 대하여 양쪽 대립유전자는 핵산 서열을 포함할 것이다, 즉, 인간화된 IL-15 비-인간 동물은 비-인간 동물 IL-15용 2개의 무반응 대립유전자 (핵산 서열을 포함한 대립유전자). 환언하면, 비-인간 동물은 IL-15h/h 비-인간 동물이다.
인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물
상기에 기재된 바와 같이 동일한 종의 인간화된 SIRPα 비-인간 동물과 상기에 기재된 바와 같이 인간화된 IL-15 비-인간 동물의 교차에 의해, 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한 유전자 변형된 비-인간 동물이 생산될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물은, 예를 들면, Rag2 및 IL2rg의 한쪽 또는 양쪽에 대하여 무반응 대립유전자의 결과로서, 내인성 면역 시스템 예를 들면, 면역저하된 동물에 대하여 결핍된다. 예를 들어, 일부 구현예에서 본 개시내용에 따른 비-인간 동물은 Rag2-/- 및/또는 IL2rg-/- (또는 IL2rg 유전자가 마우스에서와 같이 X 염색체상에 위치한 Rag2-/- 및/또는 IL2rgY/-)이다. 일부 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스가 SIRPαh/m IL-15h/m Rag2-/- IL2rgY/-, SIRPαh/h IL-15h/m Rag2-/- IL2rgY/-, 또는 SIRPαh/m IL-15h/h Rag2-/- IL2rgY/-인, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스가 제공된다.
일부 구현예에서, 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스가 제공되고, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현한다.
일부 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 일부 상기 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, SIRPα 유전자 프로모터는 인간 SIRPα 프로모터이다.
일부 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 일부 상기 구현예에서, IL-15 유전자 프로모터는 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, IL-15 프로모터는 인간 IL-15 프로모터이다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 유전자 변형된 비-인간 동물은 간, 폐, 골수 (BM), 소장 (SI) 및 결장에서 인간 IL-15 mRNA를 발현한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현하는, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 인간 조혈 세포, 예를 들면, CD45+ 세포로 생착 이후, 인간 SIRPα만을 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스보다 인간 T 세포 및 NK 세포의 더 높은 백분율 및 수를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 혈액 및 비장에서 NK 세포의 더 높은 백분율 및 수를 나타낸다. 일부 구현예에서 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 인간 조혈 세포, 예를 들면, CD45+ 세포로 생착 이후, 혈액, 비장 및 간에서, 양쪽 인간 NK 세포 서브셋, CD56밝은CD16- 및 CD56어두운CD16+를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 인간 대상체로부터 수득된 PBMCs내 CD16+ 대 CD16- NK 세포의 분포와 혈액내 CD16+ 대 CD16- NK 세포의 유사한 분포를 나타낸다.
일부 구현예에서 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 인간 조혈 세포, 예를 들면, CD45+ 세포로 생착 이후, 인간 SIRPα만을 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 비하여, 증가된 NK 세포 성숙을 나타내는, CD16 및 CD56의 더 높은 발현 수준을 나타내는 유전자 변형된 비-인간 동물의 간에서 NK 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 및 인간 조혈 세포, 예를 들면, CD45+ 세포로 생착된, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 인간의 혈액에서 NK 세포 서브셋에 대하여 찾아진 것과 유사한, CD158-발현 세포의 더 높은 백분율을 나타내는 CD56어두운CD16+ NK 세포 집단으로, 살해 저해 수용체의 상이한 발현 수준을 나타내는 비장에서 NK 세포를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 및 인간 조혈 세포, 예를 들면, CD45+ 세포로 생착된, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 인간 SIRPα만을 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 비하여 상피내 림프구 집단에서 인간 CD45+ 및 CD8+ T 세포의 더 높은 빈도를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 및 인간 조혈 세포로 생착된, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 정상 인간 생리학을 반영하는, 혈액 및 비장내 CD16- NK 세포 보다 더 많은 CD16+, 및 IEL내 비교할만한 CD16+ 대 CD16- NK 세포 분포를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 및 인간 조혈 세포, 예를 들면, CD45+ 세포로 생착된, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 인간 SIRPα만을 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 비하여 폐에서 인간 T 세포의 증가된 수를 나타낸다. 일부 상기 구현예에서, 그와 같은 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 인간 SIRPα만을 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 비하여 폐에서 인간 CD8+ T 세포에 관한 CD69의 발현의 더 높은 수준을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 및 인간 조혈 세포, 예를 들면, CD45+ 세포로 생착된, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 인간 SIRPα만을 발현한, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 비하여 간에서 인간 CD8+ T 세포에 관한 CD69 발현의 증가된 수준을 나타낸다.
일부 구현예에서, 본원에서 기재된 바와 같이 인간 SIRPα 및 인간 IL-15 둘 모두를 발현한, 및 인간 조혈 세포로 생착된, 유전자 변형된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 우세하게 인간 CD45+인 식별할 수 있는 페이에르 판을 나타낸다.
임의의 비-인간 포유동물은 대상체 개시내용에 따라 변형된 유전자일 수 있다. 비제한 예는, 당해 기술에서 공지된 바와 같이, 실험실 동물, 가정용 동물, 가축, 등, 예를 들면, 종 예컨대 쥣과, 설치류, 갯과, 고양이, 돼지, 말, 소, 양, 비-인간 영장류, 등; 예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 소, 돼지, 양, 염소 및 다른 트랜스제닉 동물 종, 특히-포유류 종을 포함한다. 다른 구현예에서, 비-인간 동물은, 예를 들면, 닭목, 예컨대 닭, 칠면조, 메추라기, 꿩, 또는 자고새; 예를 들면, 기러기목, 예컨대 오리, 거위, 또는 백조, 예를 들면, 비둘기목, 예컨대 피죤 또는 도브의 새일 수 있다. 다양한 구현예에서, 상기 대상체 유전자 변형된 동물은 마우스, 랫트 또는 토끼이다.
일부 구현예에서, 비-인간 동물은 포유동물이다. 일부 상기 구현예에서, 비-인간 동물은, 예를 들면, 뛰는쥐상과 또는 쥐상과의 작은 포유동물이다. 하나의 구현예에서, 유전자 변형된 동물은 설치류이다. 하나의 구현예에서, 설치류는 마우스, 랫트, 및 햄스터로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 설치류는 쥐상과로부터 선택된다. 하나의 구현예에서, 유전자 변형된 동물은 칼로미스쿠스류 (예를 들면, 마우스-유사 햄스터), 비단털쥐과 (예를 들면, 햄스터, 뉴 월드 랫트 및 마우스, 들쥐), 쥐과 (트루 마우스 및 랫트, 게르빌루스쥐, 가시 마우스, 깃장식 랫트), 붉은숲쥐과 (클라이밍 마우스, 록 마우스, 백색-테일드 랫트, 말라가시 랫트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과 (예를 들면, 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐과 (예를 들면, 뒤쥐, 대나무쥐, 조코르(zokor))로부터 선택된 계열 출신이다. 특정 구현예에서, 유전자 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 랫트 (쥣과 계열), 게르빌루스쥐, 가시 마우스, 및 깃장식 랫트로부터 선택된다.
하나의 구현예에서, 대상 유전자 변형된 비-인간 동물은 랫트이다. 하나의 상기 구현예에서, 랫트는 위스타 랫트, LEA 계통, 스프래그 다우리 계통, 피셔 계통, F344, F6, 및 다크 아구티로부터 선택된다. 또 다른 구현예에서, 랫트 계통은 위스타, LEA, 스프래그 다우리, 피셔, F344, F6, 및 다크 아구티로 구성된 군으로부터 선택된 2 이상 계통의 혼합물이다.
또 다른 구현예에서, 상기 대상체 유전자 변형된 비-인간 동물은 마우스, 예를 들면 C57BL 계통 (예를 들면 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/Ola, 등)의 마우스; 129 계통 (예를 들면 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들면, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2)의 마우스; BALB 계통의 마우스; 예를 들면, BALB/c; 기타 등등이다. 참조, 예를 들면, Festing 등 (1999) Mammalian Genome 10:836, 참조 또한, Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- 및 C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). 또 다른 구현예에서, 마우스는 상기 언급된 계통의 혼합물이다.
일부 구현예에서, 대상 유전자 변형된 비-인간 동물은 또한 면역결핍된다. "면역결핍된"은 동물의 원상태, 또는 내인성, 면역 시스템의 하나 이상의 측면내 결핍을 포함하고, 예를 들면 동물은 숙주 면역 세포 기능화의 하나 이상의 유형에 대하여 결핍된, 예를 들면 비-인간 B 세포 수 및/또는 기능, 비-인간 T 세포 수 및/또는 기능, 비-인간 NK 세포 수 및/또는 기능, 등에 대하여 결핍된다.
대상 동물내 면역결핍을 달성하는 하나의 방법은 치사량에 가까운 조사이다. 예를 들어, 신생 유전자 변형된 마우스 새끼는 치사량에 가깝게, 예를 들면, 2 x 200 cGy를 4 시간 간격으로 조사될 수 있다. 대안적으로, 면역결핍은 당해 기술에 공지된 수많은 유전자 돌연변이 중 임의의 하나에 의해 달성될 수 있고, 이들 중 어떤 것은 본 개시내용의 대상체 유전자 변형된 비-인간 동물 속에 조합으로 또는 단독으로 교배될 수 있거나 대상체 개시내용의 유전자 변형이 도입될 수 있는 줄기 세포의 공급원으로서 사용될 수 있다. 비제한 예는 IL2rg 유전자 돌연변이와 관련된 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(-)에 의해 특성규명된, X-연결된 SCID; Jak3 유전자 돌연변이와 관련된 및 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(-)에 의해 특성규명된 상염색체 열성 SCID; 림프구 표현형 T(-) B(-) NK(-)에 의해 특성규명된 ADA 유전자 돌연변이; 림프구 표현형 T(-) B(+) NK(+)에 의해 특성규명된 IL-7R 알파-사슬 돌연변이; 림프구 표현형 T(-) B(+) K(+)에 의해 특성규명된 CD3 델타 또는 엡실론 돌연변이; 림프구 표현형 T(-) B(-) K(+)에 의해 특성규명된 RAGl 및 RAG2 돌연변이; 림프구 표현형 T(-) B(-) K(+)에 의해 특성규명된 Artemis 유전자 돌연변이, 림프구 표현형 T(-) B(+) K(+)에 의해 특성규명된 CD45 유전자 돌연변이; 및 림프구 표현형 T(-), B(-)에 의해 특성규명된 Prkdcscid 돌연변이를 포함한다. 이와 같이, 일부 구현예에서, 유전자 변형된 면역결핍된 비-인간 동물은 IL2 수용체 감마 사슬 (Il2rgy/-) 결핍, Jak3 결핍, ADA 결핍, IL7R 결핍, CD3 결핍, RAG1 및/또는 RAG2 결핍, Artemis 결핍, CD45 결핍, 및 Prkdc 결핍으로부터 선택된 하나 이상의 결핍을 갖는다. 면역결핍의 이들 및 다른 동물 모델은 당업자에 공지될 것이고, 이들 중 어떤 것은 본 개시내용의 면역결핍된 동물을 생성하는데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명에 따른 유전자 변형된 비-인간 동물은 생착된 인간 조혈 세포로부터 인간 면역 세포를 발생할 수 있는 인간 조혈 세포의 수령체로서 용도를 찾는다. 이와 같이, 본 발명의 일부 측면에서, 대상 유전자 변형된 동물은 유전자 변형된, 면역결핍된, 인간 조혈 세포와 생착되는 비-인간 동물이다.
인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물의 생착
상기 논의된 바와 같이, 본 발명의 일부 측면에서, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, 예를 들면, Rag2-/-IL2rgY/- hSIRPα hIL-15 마우스, 또는 치사량에 가깝게 조사된 hSIRPα hIL-15 마우스는 세포로 생착되거나, 이식된다. 세포는 유사분열 세포 또는 후-유사분열 세포일 수 있고, 만능 줄기 세포, 예를 들면, ES 세포, iPS 세포, 및 배아 생식 세포; 및 체세포, 예를 들면, 섬유아세포, 조혈 세포, 뉴런, 근육 세포, 골 세포, 혈관 내피 세포, 소화관 세포, 기타 등등, 및 그들의 혈통-제한된 조상세포 및 전구체로서 관심의 상기 세포를 포함한다. 특정한 관심의 세포 집단은, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물의 조혈 시스템, 예를 들어, 말초 혈액 백혈구, 태아 간 세포, 태아 골, 태아 가슴샘, 태아 림프절, 혈관발달된 피부, 동맥 세그먼트, 및 정제된 조혈 줄기 세포, 예를 들면, 이동성 HSCs 또는 제대혈 HSCs에 기여할 또는 상기를 재구성할, 조혈 줄기 또는 조상 세포를 포함하는 것들을 포함한다.
당해 기술에서 공지된 또는 본원에서 기재된 바와 같이 인간 조혈 세포, 인간 조혈 줄기 세포 (HSCs) 및/또는 조혈 줄기 조상 세포 (HSPC)의 임의의 공급원은 본 개시내용의 유전자 변형된 면역결핍된 비-인간 동물 속에 이식될 수 있다. 당해 기술에서 공지된 인간 조혈 세포의 하나의 적합한 공급원은 인간 탯줄 혈액 세포, 특히 CD34-양성 (CD34+) 세포이다. 인간 조혈 세포의 또 다른 공급원은 인간 태아 간이다. 또 다른 공급원은 인간 골수이다. 체세포의 탈분화에 의해, 예를 들면, 당해 기술에서 공지된 방법에 의해 생산된 유도된 만능 줄기 세포 (iPSC) 및 유도된 조혈 줄기 세포 (iHSC)가 또한 포함된다.
세포는 임의의 포유류 종, 예를 들면, 쥣과, 설치류, 갯과, 고양이, 말, 소, 양, 영장류, 인간, 등 출신일 수 있다. 세포는 확립된 세포주 출신일 수 있거나 1차 세포일 수 있고, 여기서 "1차 세포", "1차 세포주", 및 "1차 배양물"은 대상체로부터 유래된 및 배양물의, 제한된 수의 통과, 즉, 스플리팅으로 시험관내 성장하도록 허용된 세포 및 세포 배양물을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 예를 들어, 초대 배양물은 0 회, 1 회, 2 회, 4 회, 5 회, 10 회, 또는 15 회 통과될 수 있지만, 충분한 회만큼 위기 시기를 겪지 않는 배양물이다. 전형적으로, 본 발명의 1차 세포주는 시험관내 10 통과 미만으로 유지된다.
세포가 1차 세포이면, 이들은 임의의 편리한 방법으로 개체로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 세포, 예를 들면, 혈액 세포, 예를 들면, 백혈구는 분리반출법, 백혈구분리반출법, 밀도 구배 분리, 등으로 수확될 수 있다. 또 다른 예로서, 세포, 예를 들면, 피부, 근육, 골수, 비장, 간, 췌장, 폐, 장, 위 조직, 등은 생검으로 수확될 수 있다. 적절한 용액은 수확된 세포의 분산 또는 현탁에 사용될 수 있다. 그와 같은 용액은 일반적으로, 저농도, 일반적으로 5-25 mM에서 허용가능한 완충액과 함께, 소태아 혈청 또는 다른 천연 발생 인자로 편리하게 보강된, 평형 염류액, 예를 들면, 정상 식염수, PBS, 항크스(Hank's) 평형 염류액, 등일 수 있다. 편리한 완충액은 HEPES, 인산염 완충액, 락테이트 완충액, 등을 포함한다.
일부 사례에서, 세포의 이종 집단은 인간화된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 이식될 것이다. 다른 사례에서, 특정한 유형의 세포, 예를 들면, 조상 세포, 예를 들면, 조혈 조상 세포가 풍부한 세포의 집단은 인간화된 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스 속에 생착될 것이다. 관심 세포 집단의 농축은 임의의 편리한 분리 기술일 수 있다. 예를 들어, 관심 세포는 배양 방법에 의해 농축될 수 있다. 상기 배양 방법에서, 특정한 성장 인자 및 영양소는 다른 세포 집단보다 한 세포 집단의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 배양물에 전형적으로 첨가된다. 생존 및/또는 증식에 영향을 주는 다른 배양 조건은 부착 또는 비-부착 기질 상에서 성장, 특정한 시간의 길이 동안 배양, 등을 포함한다. 그와 같은 배양 조건은 당해 기술에 공지되어 있다. 또 다른 예로서, 관심 세포는 친화도 분리 기술에 의해 초기 집단으로부터 관심 세포 분리에 의해 농축될 수 있다. 친화도 분리용 기술은 친화도 시약으로 코팅된 자기 비드를 이용한 자기 분리, 친화성 크로마토그래피, 고형 매트릭스, 예를 들면, 플레이트에 부착된 친화도 시약, 친화도 시약에 연결된 또는 친화도 시약, 예를 들면, 보체 및 세포독소와 함께 사용된 세포독성제로 "패닝(panning)", 또는 다른 편리한 기술을 포함할 수 있다. 정확한 분리를 제공한 기술은, 다양한 정도의 정교화, 예컨대 다중 색상 채널, 저각도 및 둔한 광 산란 검출 채널, 임피던스 채널, 등을 가질 수 있는, 형광 활성화된 세포 분류기를 포함한다. 세포는 죽은 세포와 관련된 염료 (예를 들면 요오드화프로피듐)을 사용함으로써 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 관심 세포의 생존력에 지나치게 해롭지 않은 임의의 기술이 이용될 수 있다.
예를 들어, 친화도 분리 기술을 이용하여, 이식에 대하여 관심 세포가 아닌 세포는 관심 세포에서 발현되지 않는 마커를 구체적으로 인식하고 선택적으로 결합하는 친화도 시약과 집단을 접촉시킴으로써 집단으로부터 감손될 수 있다. 예를 들어, 조혈 조상 세포의 집단을 농축시키기 위해, 성숙한 조혈 세포 마커를 발현한 세포를 감손시킬 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 양성 선택 및 분리는 조혈 조상 세포, 예를 들면 CD34, CD133, 등과 관련된 마커를 구체적으로 인식하고 선택적으로 결합하는 친화도 시약과 집단의 접촉을 이용하여 수행될 수 있다. "선택적으로 결합하다"는 분자가 관심 표적에 우선적으로 결합하거나 다른 분자보다 더 큰 친화도로 표적에 결합하는 것을 의미한다. 예를 들어, 항체는 특이적인 에피토프를 포함한 분자에 결합할 것이고 관련없는 에피토프에는 아니다. 일부 구현예에서, 친화도 시약은 항체, 즉 CD34, CD133, 등에 특이적인 항체일 수 있다. 일부 구현예에서, 친화도 시약은 CD34, CD133, 등에 특이적 수용체 또는 리간드, 예를 들면, 펩타이드 리간드 및 수용체; 효과기 및 수용체 분자, CD34, CD133, 등에 특이적인 T-세포 수용체, 기타 등등일 수 있다. 일부 구현예에서, 관심 마커에 특이적인 다중 친화도 시약이 사용될 수 있다.
친화도 시약으로서 용도를 찾는 항체 및 T 세포 수용체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있고, 트랜스제닉 동물, 면역화된 동물, 불멸화된 인간 또는 동물 B-세포, 항체 또는 T 세포 수용체를 인코딩한 DNA 벡터로 형질감염된 세포, 등으로 생산될 수 있다. 항체의 제조 및 특이적 결합 구성원으로서 사용을 위한 그들의 적합성의 세부사항은 당해 분야의 숙련가에 공지된다. 친화도 시약으로서 표지된 항체의 용도가 특히 관심이다. 편리하게, 이들 항체는 분리에서 사용을 위한 표지와 접합된다. 표지는, 특정한 세포 유형의 분리 용이성을 허용하기 위해, 직접적인 분리를 허용하는, 자기 비드; 지지체에 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 제거될 수 있는, 바이오틴; 형광 활성화된 세포 분류기와 사용될 수 있는, 형광색소; 기타 등등을 포함한다. 용도를 찾는 형광색소는 파이코빌리단백질, 예를 들면, 파이코에리트린 및 알로피코시아닌, 플루오레신 및 텍사스 레드를 포함한다. 빈번하게 각각의 항체는 각각의 마커에 대하여 독립적인 분류를 허용하기 위해 상이한 형광색소로 표지된다.
세포의 초기 집단은 친화도 시약(들)과 접촉되고 이용가능한 세포 표면 항원을 결합하기에 충분한 기간 동안 인큐베이션된다. 인큐베이션은 일반적으로 적어도 약 5 분 및 일반적으로 약 60 분 미만일 것이다. 분리의 효율이 항체의 부족에 의해 제한되지 않도록, 반응 혼합물에서 항체의 충분한 농도를 갖는 것이 바람직하다. 적절한 농도는 적정에 의해 결정되지만, 전형적으로 약 1:50 (즉, 1 부 항체 대 50 부 반응 용적), 약 1:100, 약 1:150, 약 1:200, 약 1:250, 약 1:500, 약 1:1000, 약 1:2000, 또는 약 1:5000인 세포 현탁액의 용적 속에 항체의 희석액일 것이다. 세포가 현탁되는 배지는 세포의 생존력을 유지하는 임의의 배지일 것이다. 바람직한 배지는 0.1 내지 0.5% BSA 또는 1-4% 염소 혈청을 함유한 포스페이트 완충된 염수이다. 소태아 혈청, BSA, HSA, 염소 혈청 등으로 빈번하게 보강된, 둘베코 변형된 이글 배지 (dMEM), 항크스 염기성 염 용액 (HBSS), 둘베코 포스페이트 완충된 염수 (dPBS), RPMI, 이스코브 배지, 5 mM EDTA를 가진 PBS, 등을 포함한, 다양한 배지는 상업적으로 입수가능하고 세포의 성질에 따라 사용될 수 있다.
친화도 시약에 의해 표지된 접촉된 집단에서 세포는, 예를 들면, 상기에 기재된 바와 같이 또는 당해 기술에서 공지된 바와 같이 임의의 편리한 친화도 분리 기술에 의해 선택된다. 분리 이후, 분리된 세포는, 일반적으로 수집관의 하단부에서 혈청의 쿠션을 갖는, 세포의 생존력을 유지하는 임의의 적절한 배지에서 수집될 수 있다. 소태아 혈청으로 빈번하게 보강된, dMEM, HBSS, dPBS, RPMI, 이스코브 배지, 등을 포함한, 다양한 배지는 상업적으로 입수가능하고 세포의 성질에 따라 사용될 수 있다.
관심 세포 유형, 예를 들면, 조혈 세포가 고도로 농축된 조성물은 이런 식으로 달성된다. 세포는 세포 조성물의 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85% 약 90% 이상, 농축된 세포 조성물의 약 95% 이상일 것이고, 바람직하게는 농축된 세포 조성물의 약 95% 이상일 것이다. 환언하면, 조성물은 관심 세포의 실질적으로 순수한 조성물일 것이다.
인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스 속에 이식된 세포는, 이들이 세포의 이종 집단 또는 세포의 농축된 집단이면, 즉시 이식될 수 있다. 대안적으로, 세포는 액체 질소 온도에서 냉동될 수 있고 장기간 동안 저장되어, 해동되고 재사용될 수 있다. 그와 같은 경우에, 세포는 일반적으로 그와 같은 냉동 온도에서 세포를 보존하기 위해 당해 기술에서 통상적으로 사용되는 바와 같이 10% DMSO, 50% 혈청, 40% 완충된 배지, 또는 일부 다른 그와 같은 용액에서 냉동될 것이고, 냉동된 배양된 세포의 해동을 위하여 당해 기술에서 통상적으로 공지된 바와 같은 방식으로 해동될 것이다. 추가로 또는 대안적으로, 세포는 다양한 배양 조건하에 시험관내 배양될 수 있다. 배양 배지는, 예를 들면 한천, 메틸셀룰로오스, 등을 함유한 액체 또는 반-고체일 수 있다. 세포 집단은 편리하게, 소태아 혈청 (약 5-10%), L-글루타민, 티올, 특히 2-머캅토에탄올, 및 항생제, 예를 들면 페니실린 및 스트렙토마이신으로 정상적으로 보강된, 적절한 배양기, 예컨대 이스코브 변형된 DMEM 또는 RPMI-1640에서 현탁될 수 있다. 배양액은 세포가 반응성인 성장 인자를 함유할 수 있다. 본원에서 정의된 바와 같이, 성장 인자는, 막관통 수용체상에서 특정 효과를 통해, 배양액에서 또는 온전한 조직에서, 세포의 생존, 성장 및/또는 분화를 촉진시킬 수 있는 분자이다. 성장 인자는 폴리펩타이드 및 비-폴리펩타이드 인자를 포함한다.
세포는, 예를 들면, 선택가능한 또는 추적가능한 마커를 제공하기 위해, (예를 들면, 질환 모델링을 위한) 세포에서 유전 결손을 유도하기 위해, 유전 결손을 치유하기 위해 또는 세포에서 유전자를 이소성으로 발현하기 위해 (예를 들면, 그와 같은 변형이 질환의 경과에 영향을 줄지를 결정하기 위해) 등 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 이식에 앞서 유전자 변형될 수 있다. 세포는, 이들이 관심 유전자를 발현하도록, 적합한 벡터로, 또는 요망되지 않는 유전자의 발현을 차단하기 위해 안티센스 mRNA, siRNA 또는 리보자임으로 형질감염 또는 형질도입, 상동성 재조합, 또는 다른 적절한 기술에 의해 유전자 변형될 수 있다. 다양한 기술은 표적 세포 속에 핵산의 도입에 대하여 당해 기술에 공지되어 있다. 세포를 유전자 변형한 것을 입증하기 위해, 다양한 기술이 이용될 수 있다. 세포의 게놈은 증폭과 무관하게 제한 및 사용될 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응; 겔 전기영동; 제약 분석; 서던, 노던, 및 웨스턴 블랏; 서열분석; 기타 등등이 모두 이용될 수 있다. 본 출원에서 개시된 이들 및 다른 목적을 위한 분자 및 세포 생화학내 일반적인 방법은 하기와 같은 표준 교재에서 발견될 수 있다: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel 등 eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag 등, John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner 등 eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998) (이들의 개시내용은 본원에서 참고로 편입된다). 본 개시내용에서 참조된 유전자 조작용 시약, 클로닝 벡터, 및 키트는 상업적 판매인 예컨대 BioRad, Stratagene, Invitrogen, Sigma-Aldrich, 및 ClonTech으로부터 이용가능하다.
세포는, 예를 들어, 간내 주사, 꼬리-정맥 주사, 안와후 주사, 기타 등등을 포함한, 임의의 편리한 방법에 의해, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에서 이식될 수 있다. 전형적으로, 약 0.5 x 105 - 2 x 106 만능 또는 조상 세포, 예를 들면 약 1 x 105 - 1 x 106 세포, 또는 약 2 x 105 - 5 x 105 세포가 이식된다. 일부 사례에서, 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 인간 세포 이식에 앞서 치사량 가깝게 조사된다. 환언하면, 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 예를 들면, 당해 기술에서 공지된 바와 같이, 방사선의 치사량 가까운 용량으로 노출된다. 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 그 다음, 생착된 세포로 면역 시스템의 충분한 재구성을 허용하기 위해, 적어도 1 주, 예를 들면, 1 주 이상, 또는 2 주 이상, 때때로 4 주 이상, 및 일부 사례에서 6 주 이상, 예컨대 10 주 이상 또는 15 주 이상 동안 실험실 동물 축산 조건하에 유지된다.
인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, 및 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 인간 조혈 세포로 생착된, 마우스, 예를 들면, 생착된 Rag2-/-IL2rgY/- hSIRPα hIL-15 마우스, 및 선택적으로 다른 유전자 변형은 많은 적용에서 유용하다. 예를 들어, 이들 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 인간 면역 질환 및 인간 병원체의 모델링에 유용한 시스템을 제공한다. 예를 들어, 대상 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 예를 들어, 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포 발생 및 기능의 모델링; 특정 조직 및/또는 세포의 인간 병원체 감염, 예를 들면, 소화관 또는 폐의 인간 병원체 감염, 및/또는 인간 T 세포 및/또는 NK 세포의 인간 병원체 감염 또는 상기에 대한 반응에 유용하다. 그와 같은 비-인간 동물은 또한 병원체, 예를 들면, 특정 조직 또는 세포 유형에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 주는 병원체, 예를 들면, 소화관 또는 폐의 인간 병원체, 예를 들면, T 세포 및/또는 NK 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 인간 병원체에 의한 감염을 저해하는 제제용 생체내 스크린에서; 예를 들면 건강한 또는 이환 상태에서, 인간 T 세포 및/또는 NK 세포의 발생 및/또는 기능을 조절하는 제제용 생체내 스크린에서; 인간 T 세포 및/또는 NK 세포에 독성인 제제용 생체내 스크린에서; 인간 T 세포 및/또는 NK 세포에 관한 독성 제제의 독성 효과를 예방, 완화, 또는 반전시키는 제제용 생체내 스크린에서; 후보 T 세포-유도 백신의 생체내 스크린에서; 및 활성화 NK 세포-매개된 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 공정에 의해 종양 성장 및/또는 감염을 저해하는 제제용 생체내 및 시험관내 스크린에서 용도를 찾는다.
본 개시내용은 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 인간 조혈 세포로 생착된, 마우스, 예를 들면, 생착된 Rag2-/-IL2rgY/- hSIRPα hIL-15 마우스가 소화관 및 폐에서 조직-상주 림프구, 예를 들면, 상피내 림프구를 발생한다는 것을 증명하는 예기치 못한 결과를 제공한다. 따라서, 본 개시내용은 그와 같은 조직-상주 림프구의 모니터링 및 시험을 가능하게 하는 이전에 이용할 수 없는 동물 모델을 제공한다. 그와 같은 동물 모델은 소화관 및/또는 폐에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 주는 인간 병원체에 대한, 조직-상주 림프구, 예를 들면, T 세포 및 NK 세포의 면역 반응의 모델링에서 그리고 그와 같은 병원체를 표적화하고/하거나 조직-상주 림프구 반응을 유도 또는 개선하는 치료제 및 백신 선별에 특히 유용하다. 또한, 이들 조직-상주 림프구의 존재는 또한 위장관에 영향을 주는 인간 면역 세포 유도된 자가면역 질환 예컨대 소아지방변증 및 IBD의 모델링을 허용한다.
따라서, 일부 구현예에서, 본 개시내용은, 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열을 포함한 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, 생체내 모델을 제공한다. 유전자 변형된 비-인간 동물은 또한, 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열을 포함한다. 마지막으로, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 조혈 세포의 생착을 포함하고, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물은 (i) 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 유전자 변형된 비-인간의 소화관에서, 인간 조직-상주 림프구, 예를 들면, 상피내 림프구 (IEL)를 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 병원체, 예를 들면, 소화관에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 주는 인간 병원체로 감염된다.
소화관에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 줄 수 있는 인간 병원체는, 비제한적으로, 캄필로박터 제주니, 클로스트리듐 디피실레, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 엔테로코쿠스 패슘, 에스케리치아 콜라이, 인간 로타바이러스, 리스테리아 모노사이토게네스, 노워크 바이러스, 살모넬라 엔테리카, 시겔라 플렉스네리, 시겔라 손네이, 시겔라 다이센테리애, 예르시니아 페스티스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 및 헬리코박터 파일로리를 포함한다.
다른 구현예에서, 본 개시내용은, 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열을 포함한 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, 생체내 모델을 제공한다. 유전자 변형된 비-인간 동물은 또한, 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열을 포함한다. 마지막으로, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 조혈 세포의 생착을 포함하고, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물은 (i) 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 유전자 변형된 비-인간의 폐에서, 인간 조직-상주 림프구, 예를 들면, 상피내 림프구 (IEL)를 포함한다. 일부 상기 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 인간 병원체, 예를 들면, 폐에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 주는 인간 병원체로 감염된다.
폐에 (예를 들면, 감염에 의해) 영향을 줄 수 있는 인간 병원체는, 비제한적으로, 연쇄상구균 파이오제네스, 헤모필루스 인플루엔자, 코라이네박테리움 디프테리아, SARS 코로나바이러스, 보데텔라 페르투스시스, 모락셀라 카타르할리스, 인플루엔자 바이러스 (A, B, C), 코로나바이러스, 아데노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 연쇄상구균 뉴모니애, 스타필로코쿠스 아우레스, 레지오넬라 뉴모필라, 클렙시엘라 뉴모니애, 슈도모나스 에어루기노사, 마이코플라스마 뉴모니아, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 클라미디아 뉴모니애, 블라스토마이세스 더마티티디스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 및 아스페르길루스 푸미가투스를 포함한다.
신규한 치료제, 신규한 백신, 및 치료제 및 백신의 효능의 신규한 시험 방식이 필요하다. 효율적인 인간 T 및 NK 세포 생착을 지지하는, 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는, 예를 들어, 특히 인간 T 세포 및/또는 NK 세포를 감염시키는 인간 병원체에 대하여, 신규한 치료제 및 신규한 백신을 확인하는데 유용할 것이다. 신규한 치료제 및 신규한 백신은, 그와 같은 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에서, 예를 들면, 추정 항-바이러스제로 치료에 반응하여 비-인간 동물에서 (혈액 또는 소정의 조직내), 인간 병원체, 예를 들면, 바이러스의 양의 결정, 또는 추정 백신으로 마우스의 접종 그 다음 인간 병원체, 예를 들면, HIV의 감염성 투여에 노출, 및 백신으로 접종되지 않은 그러나 HIV로 감염된 대조군과 비교된 경우 추정 백신에 의한 접종으로 인해 감염성에서 임의의 변화 관찰에 의해 시험될 수 있다.
병원체 감염의 그와 같은 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, 모델은, 예를 들면, 인간 감염의 진행을 더욱 양호하게 이해하기 위해, 조사에서 유용하다. 감염의 그와 같은 마우스 모델은, 예를 들면 감염으로부터 보호하거나 치료하는 후보 제제를 확인하기 위해 약물 발견에서 또한 유용하다.
본 개시내용의 생착된 유전자 변형된 동물은 인간 병원체, 예를 들면, 인간 T 및/또는 NK 세포를 표적하는 인간 병원체에 의한 감염을 치료할 것을 확인하기 위한 후보 제제 선별에서 용도를 찾는다. 용어들 "치료하다", "치료", "치료하는" 기타 등등은 일반적으로 목적하는 약리학적 및/또는 생리적 효과 수득을 포함하기 위해 본원에서 사용된다. 효과는 질환 또는 이의 증상의 완전히 또는 부분적으로 예방에 관하여 예방적일 수 있고/있거나 질환에 대하여 부분적인 또는 완전한 치유 및/또는 질환에 기인하는 역효과에 관하여 치료적일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "치료"는 포유동물내 질환의 임의의 치료를 포함하고, 하기를 포함한다: (a) 질환에 취약할 수 있지만 그것을 갖는 것으로 아직 진단되지 않은 대상체에서 발생으로부터 질환의 예방; (b) 질환의 억제, 즉, 그의 발생 억제; 또는 (c) 질환의 완화, 즉, 질환의 퇴행 유발.
용어들 "개체", "대상체", "숙주", 및 "환자"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고 진단, 치료, 또는 요법이 목적하는 임의의 포유동물 대상체, 특히 인간을 포함한다.
인간 조혈 세포로 생착된, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스는 다른 목적하는 생체내 활성을 위한 후보 제제 선별에 또한, 예를 들어, 예를 들면, 건강한 또는 이환 상태에서 인간 T 세포 및 NK 세포의 발생 및/또는 활성을 조절 (즉, 촉진 또는 억압)할 수 있는, 예를 들면, 신규한 치료제를 확인할 수 있고/있거나 면역 시스템의 발생 및 기능의 분자 기준의 더 나은 이해를 만들 수 있는 제제에; T 세포 및/또는 NK 세포 및 이들의 조상세포에 독성인 제제에; 및 T 세포, NK 세포, 및 이들의 조상세포에 관한 독성 제제의 독성 효과를 예방, 완화, 또는 반전시키는 제제에; NK 세포 의존성 ADCC 공정, 등을 매개하는 항체 또는 항원-결합 단백질에 유용한 시스템을 제공한다. 또 다른 예로서, 본원에서 기재된 유전자 변형된 마우스는, 예를 들면, 그 제제에 대한 개체의 반응성을 예측하기 위해, 제제, 예를 들면, 치료제에 개체의 면역 시스템의 반응성 선별용 생체내 플랫폼의 제공에 의해 질환 요법에 개체의 반응성 예측에 유용한 시스템을 제공한다.
생물학적 활성 제제용 선별 검정에서, 인간 조혈 세포로 생착된 및 일부 사례에서, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스 속에 생착된 세포, 또는 인간 병원체로 감염된, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, 예를 들면, 생착된 Rag2-/-IL2rgY/- hSIRPα hIL-15 마우스는 관심 후보 제제와 접촉되고 후보 제제의 효과는 하나 이상의 출력 파라미터 모니터링에 의해 평가된다. 이들 출력 파라미터는 세포의 생존력, 예를 들면 조혈 세포의 총 수 또는 특정한 조혈 세포 유형의 세포의 수, 또는 세포의 세포자멸적 상태의 수, 예를 들면 DNA 단편화의 양, 세포 수포형성의 양, 세포 표면상에서 포스파티딜세린의 양, 및 당해 기술에 공지되어 있는 방법에 의한 기타 등등을 반영할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 출력 파라미터는 세포의 분화 수용력, 예를 들면 분화된 세포 및 분화된 세포 유형, 예를 들면, T 세포 및/또는 NK 세포의 비율을 반영할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 출력 파라미터는 세포의 기능, 예를 들면 세포에 의해 생산된 사이토카인 및 케모카인, 공격의 부위에 대해 삼출 및 유도하는 세포의 능력, 시험관내 또는 생체내 다른 세포의 활성을 조절하는, 즉 촉진 또는 억압하는 세포의 능력 등을 반영할 수 있다. 다른 출력 파라미터는 동물에서 병원체 감염의 정도, 예를 들면, 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에서 병원체의 역가, 등을 반영할 수 있다.
파라미터는 세포의 정량화가능 성분, 특히, 바람직하게는 고 처리 시스템으로, 정확하게 측정될 수 있는 성분이다. 파라미터는 세포 표면 결정인자, 수용체, 단백질 또는 이의 형태적 또는 후번역 변형, 지질, 탄수화물, 유기 또는 무기 분자, 핵산, 예를 들면 mRNA, DNA, 등 또는 그와 같은 세포 성분으로부터 유래된 부분 또는 이들의 조합을 포함한 임의의 세포 성분 또는 세포 생성물일 수 있다. 대부분의 파라미터가 정량적 판독을 제공할 것인 반면, 일부 사례에서 반정량적 또는 정성적 결과는 허용가능할 것이다. 판독은 단일 결정된 값을 포함할 수 있거나, 평균, 중앙 값 또는 변동, 등을 포함할 수 있다. 특징적으로 파라미터 판독 값의 범위는 다수의 동일한 검정으로부터 각각의 파라미터에 대하여 수득될 것이다. 가변성이 예상되고 시험 파라미터의 각각의 세트에 대한 값의 범위는 단일 값을 제공하는데 사용된 흔한 통계 방법으로 표준 통계 방법을 이용하여 수득될 것이다.
선별을 위한 관심 후보 제제는, 유기금속 분자, 무기 분자, 유전적 서열, 백신, 항생제 또는 항생제 특성을 갖는 것으로 의심되는 다른 제제, 펩타이드, 폴리펩타이드, 항체, 항원-결합 단백질, 인간에서 사용을 위하여 약제학적으로 승인된 제제, 등을 포함할 수 있는, 수많은 화학 부류, 주로 유기 분자를 포함하는 공지된 및 미공지된 화합물을 포함한다. 본 발명의 중요한 측면은 독성 시험을 포함한 후보 약물의 평가; 기타 등등이다.
후보 제제는 구조적 상호작용, 특히 수소 결합에 필요한 작용기를 포함한 유기 분자를 포함하고, 전형적으로 적어도 아민, 카보닐, 하이드록실 또는 카복실 기, 빈번하게 작용성 화학기의 적어도 2개를 포함한다. 후보 제제는 종종 하나 이상의 상기 작용기로 치환된 환식 탄소 또는 복소환식 구조 및/또는 방향족 또는 다환방향족 구조를 포함한다. 후보 제제는 또한, 펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 사카라이드, 지방산, 스테로이드, 퓨린, 피리미딘, 유도체, 구조적 유사체 또는 이들의 조합을 포함한, 생체분자 중에서 발견된다. 약리적으로 활성 약물, 유전자 상으로 활성 분자, 등이 포함된다. 관심 화합물은 화학치료제, 호르몬 또는 호르몬 길항제, 등을 포함한다. 본 발명에 적합한 예시적인 약제는 "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Goodman and Gilman, McGraw-Hill, New York, N.Y., (1996), Ninth edition에 기재된 것이다. 독소, 및 생물학 및 화학 작용제가 또한 포함된다, 예를 들어 참조 Somani, S. M. (Ed.), "Chemical Warfare Agents," Academic Press, New York, 1992).
선별을 위한 관심 후보 제제는 또한 핵산, 예를 들어, siRNA, shRNA, 안티센스 분자, 또는 miRNA를 인코딩하는 핵산, 또는 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산을 포함한다. 표적 세포 속에 핵산 이동에 유용한 많은 벡터가 이용가능하다. 벡터는 에피솜 상태로, 예를 들면, 플라스미드, 미니서클 DNAs, 바이러스-유래된 벡터 상기 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스, 등으로서 유지될 수 있거나, 이들은 상동성 재조합 또는 랜덤 통합을 통해 표적 세포 게놈, 예를 들면, 레트로바이러스 유래된 벡터 예컨대 MMLV, HIV-1, ALV, 등에 통합될 수 있다. 벡터는 대상 세포에 직접적으로 제공될 수 있다. 환언하면, 만능 세포는 벡터가 세포에 의해 차지되도록 관심 핵산을 포함한 벡터와 접촉된다.
핵산 벡터와, 세포, 예를 들면, 배양액내 세포 또는 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스내 세포의 접촉 방법, 예컨대 전기천공, 염화칼슘 형질감염, 및 리포펙션은 당해 기술에 공지되어 있다. 대안적으로, 관심 핵산은 바이러스를 통해 세포에 제공될 수 있다. 환언하면, 세포는 관심 핵산을 포함한 바이러스성 입자와 접촉된다. 레트로바이러스, 예를 들어, 렌티바이러스는 본 발명의 방법에 특히 적합하다. 통상적으로 사용된 레트로바이러스 벡터는 "불량성"인, 즉, 생산적인 감염에 요구된 바이러스성 단백질을 생산할 수 없다. 오히려, 벡터의 복제는 패키징 세포주에서 성장을 요구한다. 관심 핵산을 포함한 바이러스성 입자를 생성하기 위해, 핵산을 포함한 레트로바이러스 핵산은 패키징 세포주에 의해 바이러스성 캡시드 속에 패키징된다. 상이한 패키징 세포주는 캡시드 속에 편입된 상이한 엔빌로프 단백질을 제공하고, 상기 엔빌로프 단백질은 세포에 대하여 바이러스 입자의 특이성을 결정한다. 엔빌로프 단백질은 적어도 세 유형, 동종지향성, 암포트로픽 및 친이종성이다. 동종지향성 엔빌로프 단백질로 패키징된 레트로바이러스, 예를 들면, MMLV는 대부분의 쥣과 및 랫트 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 동종지향성 패키징 세포주 예컨대 BOSC23 이용에 의해 생성된다 (Pear 등 (1993) P.N.A.S. 90:8392-8396). 암포트로픽 엔빌로프 단백질을 보유한 레트로바이러스, 예를 들면 4070A (Danos 등, 상기)는, 인간, 개 및 마우스를 포함한, 대부분의 포유동물 세포 유형을 감염시킬 수 있고, 암포트로픽 패키징 세포주 예컨대 PA12 이용에 의해 생성된다 (Miller 등 (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller 등 (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); GRIP (Danos 등 (1988) PNAS 85:6460-6464). 친이종성 엔빌로프 단백질로 패키징된 레트로바이러스, 예를 들면, AKR env는, 쥣과 세포를 제외하고, 대부분의 포유동물 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 적절한 패키징 세포주는 관심 세포가 - 일부 사례에서, 생착된 세포, 일부 사례에서, 숙주, 즉, 인간화된 SIRPα-IL-15의 세포 - 포장된 바이러스성 입자에 의해 표적화되는 것을 확보하는데 사용될 수 있다.
대상체 세포에 관심 핵산의 제공에 사용된 벡터는 전형적으로 관심 핵산의 발현, 즉, 전사 활성화 구동에 적합한 프로모터를 포함할 것이다. 이는 도처에 작용하는 프로모터, 예를 들어, CMV-b-액틴 프로모터, 또는 유도성 프로모터, 예컨대 약물 예컨대 테트라사이클린의 존재에 반응하는 또는 특정 세포 집단에 활성인 프로모터를 포함할 수 있다. 전사 활성화로, 전사가 적어도 약 10 배만큼, 적어도 약 100 배만큼, 더 일반적으로 적어도 약 1000 배만큼 표적 세포에서 기저 수준 초과 증가될 것이 의도된다. 또한, 대상 세포에 재프로그래밍 인자 제공에 사용된 벡터는, 예를 들면, 재조합효소 시스템 예컨대 Cre/Lox를 이용하여 나중에 제거되어야 하는 유전자, 또는, 예를 들면, 선택적 독성을 허용하는 유전자 예컨대 헤르페스바이러스 TK, bcl-xs, 등을 포함함으로써 파괴된 이들을 발현하는 세포를 포함할 수 있다.
선별을 위한 관심 후보 제제는 또한 폴리펩타이드를 포함한다. 그와 같은 폴리펩타이드는 생성물의 용해도를 증가시키는 폴리펩타이드 도메인에 선택적으로 융합될 수 있다. 도메인은 정의된 프로테아제 절단 부위, 예를 들면, TEV 프로테아제에 의해 절단되는, TEV 서열을 통해 폴리펩타이드에 연결될 수 있다. 링커는 또한 하나 이상의 가요성 서열, 예를 들면, 1 내지 10 글리신 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 융합 단백질의 절단은, 예를 들면, 0.5 내지 2 M 우레아의 존재하에, 용해도 등을 증가시키는 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드의 존재하에 생성물의 용해도를 유지하는 완충액에서 수행된다. 관심 도메인은 엔도솜분해적 도메인, 예를 들면, 인플루엔자 HA 도메인; 및, 예를 들면, IF2 도메인, GST 도메인, GRPE 도메인, 기타 등등의 생산을 돕는 다른 폴리펩타이드를 포함한다. 추가로 또는 대안적으로, 그와 같은 폴리펩타이드는 개선된 안정성으로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 펩타이드는 페길화될 수 있고, 여기서 폴리에틸렌옥시 기는 혈류에서 향상된 수명을 제공한다. 폴리펩타이드는 첨가된 작용기를 제공하기 위해, 예를 들면, 생체내 안정성을 증가시키기 위해 또 다른 폴리펩타이드에 융합될 수 있다. 일반적으로 그와 같은 융합 파트너는, 예를 들어, 융합으로서 존재한 경우 폴리펩타이드의 생체내 혈장 반감기를 확장시킬 수 있는, 안정적인 혈장 단백질이고, 특히 여기서 그와 같은 안정적인 혈장 단백질은 면역글로불린 불변 도메인이다. 안정적인 혈장 단백질이, 동일한 또는 상이한 폴리펩타이드 사슬이 정상적으로 디설파이드이고/이거나 조립된 다중쇄 폴리펩타이드를 형성하기 위해 비공유결합되는, 다량체 형태, 예를 들면, 면역글로불린 또는 지질단백질에서 정상적으로 발견되는 대개의 경우, 폴리펩타이드를 함유한 본원에서 융합은 또한 안정적인 혈장 단백질 전구체와 실질적으로 동일한 구조를 갖는 다량체로서 생산 및 이용될 것이다. 이들 다량체는 이들이 포함하는, 또는 이들이 1 초과 폴리펩타이드 제제를 함유할 수 있는 폴리펩타이드 제제에 대하여 균질할 것이다.
후보 폴리펩타이드 제제는 진핵 세포로부터 생산될 수 있거나, 원핵 세포에 의해 생산될 수 있다. 언폴딩, 예를 들면, 열 변성, DTT 감축, 등에 의해 추가로 가공될 수 있고, 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여, 추가로 리폴딩될 수 있다. 1차 서열을 변경하지 않는 관심 변형은 폴리펩타이드의 화학 유도체화, 예를 들면, 아실화, 아세틸화, 카복실화, 아미드화, 등을 포함한다. 당화의 변형, 예를 들면, 그의 합성 및 가공 동안 또는 추가 처리 단계에서 폴리펩타이드의 당화 패턴 변경에 의해; 예를 들면, 당화에 영향을 주는 효소, 예컨대 포유동물 글리코실화 또는 탈글리코실화 효소에 폴리펩타이드 노출에 의해 제조된 것이 또한 포함된다. 인산화된 아미노산 잔기, 예를 들면, 포스포티로신, 포스포세린, 또는 포스포트레오닌을 갖는 서열이 또한 포괄된다. 폴리펩타이드는 단백분해적 분해에 대한 그들의 저항을 개선하기 위해 또는 용해도 특성을 최적화하기 위해 또는 치료제로서 이들을 더욱 적합하게 만들기 위해 통상적인 분자 생물학적 기술 및 합성 화학을 이용하여 변형될 수 있다. 그와 같은 폴리펩타이드의 유사체는 천연 발생 L-아미노산, 예를 들면, D-아미노산 또는 비-천연 발생 합성 아미노산 이외의 잔기를 함유한 것을 포함한다. D-아미노산은 일부 또는 모든 아미노산 잔기로 치환될 수 있다.
후보 폴리펩타이드 제제는, 당해 기술에서 공지된 바와 같이 종래의 방법을 이용하여, 시험관내 합성에 의해 제조될 수 있다. 다양한 상업적 합성 장치, 예를 들어, Applied Biosystems, Inc., Beckman, 등에 의한 자동화 합성기는 이용가능하다. 합성기를 이용하여, 천연 발생 아미노산은 비천연 아미노산으로 치환될 수 있다. 특정한 서열 및 제조의 방식은 편리성, 경제성, 요구된 순도 기타 등등에 의해 결정될 것이다. 대안적으로, 후보 폴리펩타이드 제제는 재조합 합성의 종래의 방법에 따라 단리 및 정제될 수 있다. 용해물은 HPLC, 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화성 크로마토그래피, 또는 다른 정제 기술을 이용하여 정제된 용해물 및 발현 숙주로 제조될 수 있다. 대개, 사용되는 조성물은, 생성물의 제조 방법 및 그의 정제에 관련된 오염물질과 관련하여, 목적하는 생성물의 적어도 20중량 %, 더 일반적으로 적어도 약 75 중량 %, 바람직하게는 적어도 약 95중량 %, 및 치료 목적을 위하여, 일반적으로 적어도 약 99.5중량 %를 포함할 것이다. 일반적으로, 백분율은 총 단백질에 기반될 것이다.
일부 경우에, 선별된 후보 폴리펩타이드 제제는 항체 또는 항원-결합 단백질이다. 용어 "항체" 또는 "항체 모이어티"는 에피토프에 맞추는 및 상기를 인식하는 특정 형상을 가진 임의의 폴리펩타이드 사슬-함유 분자 구조를 포함하도록 의도되고, 여기서 하나 이상의 비-공유 결합 상호작용은 분자 구조와 에피토프 사이 복합체를 안정화시킨다. 소정의 구조 및 그의 특정 에피토프의 특이적 또는 선택적 맞춤은 때때로 "자물쇠와 열쇠"로 지칭된다. 전형적인 항체 분자는 면역글로불린이고, 모든 공급원, 예를 들면 인간, 설치류, 토끼, 소, 양, 돼지, 개, 다른 포유동물, 닭, 다른 조류, 등으로부터 모든 유형의 면역글로불린, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 등은 "항체"인 것으로 간주된다. 본 발명에서 이용된 항체는 다클론성 항체 또는 단클론성 항체일 수 있다. 항체는 세포가 배양되는 배지에서 전형적으로 제공된다. 항체 이외에, 항원-결합 단백질은 또한 관심 항원을 결합하기 위해 및 반응, 예를 들면, 면역학적 반응을 유도하기 위해 설계되는 폴리펩타이드를 포함한다. (예를 들면, Fab, Fab' F(ab')2, Fabc, 및 scFv를 포함한) 당해 기술에서 공지된 항원-결합 단편은 또한 용어 "항원-결합 단백질"에 의해 포함된다. 용어들 "항체" 및 "항원-결합 단백질"은 또한 다른 단백질과 융합 단백질에 화학적으로 접합될 수 있거나 상기로서 표현될 수 있는 하나 이상의 면역글로불린 사슬 또는 단편, 단일 사슬 항체, 및 이중특이적 항체를 포함한다.
후보 제제는 합성 또는 천연 화합물의 라이브러리를 포함한 다양한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들어, 수많은 수단은, 무작위화된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고펩타이드의 발현을 포함한, 생체분자를 포함한, 다양한 유기 화합물의 랜덤 및 유도된 합성에 이용가능하다. 대안적으로, 박테리아, 진균, 식물 및 동물 추출물의 형태로 천연 화합물의 라이브러리는 이용가능하거나 쉽게 생산된다. 추가로, 천연 또는 합성으로 생산된 라이브러리 및 화합물은 종래의 화학, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형되고, 조합 라이브러리를 생산하는데 사용될 수 있다. 공지된 약리적 제제는 구조적 유사체를 생산하기 위해 유도된 또는 랜덤 화학 변형, 예컨대 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화, 등에 적용될 수 있다.
후보 제제는, 때때로 제제가 부족한 샘플과 함께, 적어도 하나 및 일반적으로 복수의 샘플에 제제의 투여에 의해 생물학적 활성으로 선별된다. 제제에 반응하여 파라미터의 변화는 측정되고, 결과는, 예를 들면 다른 제제 등으로 수득된, 제제의 존재 및 부재 하에, 참조 배양액과 비교로 평가된다. 독성 제제의 효과를 예방, 완화 또는 반전시킬 후보 제제를 확인하기 위해 선별이 수행되는 사례에서, 선별은 전형적으로 독성 제제의 존재 하에 수행되고, 여기서 독성 제제는 결정된 결과에 가장 적절한 시간에 첨가된다. 예를 들어, 후보 제제의 보호성/예방성 능력이 시험되는 사례에서, 후보 제제는 독성 제제 이전에, 후보 제제와 동시에, 또는 후보 제제로 치료 이후에 첨가될 수 있다. 또 다른 예로서, 독성 제제의 효과를 반전시키기 위한 후보 제제의 능력이 시험되는 사례에서, 후보 제제는 후보 제제로 치료 이후에 첨가될 수 있다. 상기에서 언급된 바와 같이, 일부 사례에서, 샘플은 세포로 생착된, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스이다, 즉, 후보 제제는, 세포로 생착된, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 제공된다. 일부 사례에서, 샘플은 생착된 세포이다, 즉, 후보 제제는 이식에 앞서 세포에 제공된다.
후보 제제가 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에 직접적으로 투여되면, 제제는 펩타이드, 소분자 및 핵산의 투여를 위하여 당해 기술에서 임의의 수의 공지된 방법에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 제제는 경구로, 점막으로, 국소로, 진피내로, 또는 주사로, 예를 들면 복강내, 피하, 근육내, 정맥내, 또는 두개내 주사, 기타 등등으로 투여될 수 있다. 제제는 완충액으로 투여될 수 있거나, 예를 들면 적절한 약제학적으로 허용가능한 비히클과 조합에 의해, 임의의 다양한 제형 속에 편입될 수 있다. "약제학적으로 허용가능한 비히클"은 연방 또는 주 정부의 감독 기관에 의해 승인된 또는 미국 약전 또는 포유동물, 예컨대 인간에서 사용을 위한 다른 일반적으로 인식된 약전에서 열거된 비히클일 수 있다. 용어 "비히클"은 본 발명의 화합물이 포유동물에 투여를 위하여 제형화되는 희석제, 아쥬반트, 부형제, 또는 캐리어를 지칭한다. 그와 같은 약제학적 비히클은 지질, 예를 들면 리포좀, 예를 들면 리포좀 덴드리머; 액체, 예컨대 석유, 동물, 야채 또는 합성 기원의 것, 예컨대 땅콩 오일, 대두 오일, 광유, 참께 오일 및 등, 염수를 포함한, 물 및 오일; 아카시아검, 젤라틴, 전분 페이스트, 탈크, 케라틴, 콜로이드 실리카, 우레아, 기타 등등일 수 있다. 또한, 보조제, 안정제, 증점제, 윤활제 및 착색제가 사용될 수 있다. 약제학적 조성물은 제제 속에 고체, 반-고체, 액체 또는 기체성 형태, 예컨대 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 주사, 흡입제, 겔, 마이크로구형체, 및 에어로졸로 제형화될 수 있다. 제제는 투여 이후 전신성일 수 있거나 영역 투여, 점막내 투여, 또는 이식의 부위에서 활성 용량을 보유하도록 작용하는 임플란트의 이용에 의해 국재화될 수 있다. 활성제는 즉각적인 활성용으로 제형화될 수 있거나 지속 방출용으로 제형화될 수 있다. 일부 상태, 특히 중추신경계 상태를 위하여, 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 교차하도록 제제를 제형화하는 것이 필요할 수 있다. 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 통해 약물 전달을 위한 하나의 전략은, 삼투 수단 예컨대 만니톨 또는 류코트리엔에 의해, 또는 생화학적으로 혈관활성 서브스턴스 예컨대 브라디키닌의 사용에 의해, BBB의 파괴를 수반한다. 조성물이 혈관내 주사에 의해 투여된 경우 BBB 파괴 약물은 제제와 공동-투여될 수 있다. BBB을 경험하는 다른 전략은 카베올린-1 매개된 통과세포외배출, 캐리어-매개된 수송체 예컨대 글루코오스 및 아미노산 캐리어, 인슐린 또는 트랜스페린용 수용체-매개된 통과세포외배출, 및 활성 유출 수송체 예컨대 p-당단백질을 포함한, 내인성 운반계의 용도를 수반할 수 있다. 활성 수송 모이어티는 또한 혈관의 내피 벽을 거쳐 수송을 용이하게 하는 본 발명에서 사용을 위하여 치료 화합물에 접합될 수 있다. 대안적으로, BBB 뒤에 제제의 약물 전달은 국부 전달, 예를 들어 척추강내 전달, 예를 들면 옴마야(Ommaya) 저장기를 통해 (참조 예를 들면 미국 특허 번호 5,222,982 및 5,385,582, 본원에서 참고로 편입됨); 볼러스 주사로, 예를 들면 주사기로, 예를 들면 초자체내로 또는 두개내로; 연속 주입으로, 예를 들면 캐뉼라삽입으로, 예를 들면 대류로 (참조 예를 들면 미국 출원 번호 20070254842, 여기서 참고로 편입됨); 또는 제제가 가역적으로 부착된 디바이스의 임플란팅 (참조 예를 들면 미국 출원 번호 20080081064 및 20090196903, 본원에서 참고로 편입됨)일 수 있다.
제제(들)이 이식에 앞서 세포에 제공되면, 제제는 배양액내 세포의 배지에 용액으로, 또는 쉽게 가용성 형태로 편리하게 첨가된다. 제제는 통과액 시스템에서, 스트림으로서, 간헐적 또는 연속적으로 첨가될 수 있거나, 대안적으로, 달리 고정 용액에, 단독으로 또는 증분적으로, 화합물의 볼러스 첨가될 수 있다. 통과액 시스템에서, 2개의 유체가 사용되고, 여기서 하나는 생리적으로 중성 용액이고, 다른 것은 첨가된 시험 화합물과 동일한 용액이다. 제1 유체가 세포를 넘어 통과되고, 그 다음 제2 유체이다. 단일 용액 방법에서, 시험 화합물의 볼러스는 세포를 둘러싸는 배지의 용적에 첨가된다. 배양 배지의 성분의 전체 농도는 볼러스의 첨가로, 또는 통과액 방법에서 2개 용액 사이 상당히 변화하지 않아야 한다.
복수의 검정은 다양한 농도로 차별적인 반응을 수득하기 위해 상이한 제제 농도로 병렬적으로 실시될 수 있다. 당해 기술에서 공지된 바와 같이, 제제의 효과적인 농도의 결정은 전형적으로 1:10에서 비롯한 농도의 범위, 또는 다른 로그 눈금, 희석액을 이용한다. 농도는, 필요하면, 제2 시리즈의 희석액으로 추가로 정제될 수 있다. 전형적으로, 이들 농도 중 하나는 음성 대조군으로서, 즉, 제로 농도에서 또는 제제의 검출 수준 미만에서 또는 표현형에서 검출가능한 변화를 제공하지 않는 제제의 농도에서 또는 그 미만에서 작용한다.
후보 제제에 대한, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에서 세포의 반응의 분석은 제제로 치료 이후 임의의 시간에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포는 후보 제제와 접촉 이후 1, 2, 또는 3 일, 때때로 4, 5, 또는 6 일, 때때로 8, 9, 또는 10 일, 때때로 14 일, 때때로 21 일, 때때로 28 일, 때때로 1 개월 이상, 예를 들면, 2 개월, 4 개월, 6 개월 이상 분석될 수 있다. 일부 구현예에서, 분석은 다중 시점에서 분석을 포함한다. 분석용 시점(들)의 선택은, 당업자에 의해 쉽게 이해될 바와 같이, 수행된 분석의 유형에 기반될 것이다.
분석은 세포 생존력, 세포 증식, 세포 동일성, 세포 형태학, 및 세포 기능 측정을 위하여, 특히 이들이 면역 시스템의 세포, 예를 들면, T 세포 및/또는 NK 세포에 부속할 수 있음에 따라, 당해 기술에서 공지된 또는 본원에서 기재된 임의의 파라미터 측정을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유세포측정은 조혈 세포의 총 수 또는 특정한 조혈 세포 유형의 세포의 수를 결정하는데 사용될 수 있다. 조직화학 또는 면역조직화학은 세포의 세포자멸적 상태를 결정하기 위해 수행될 수 있고, 예를 들면 말단 데옥시뉴클레오티딜 전달효소 dUTP 닉 말단 라벨링 (TUNEL)은 DNA 단편화를 측정하기 위해, 또는 면역조직화학은 세포 표면에서 포스파티딜세린에 아넥신 V 결합을 검출하기 위해 수행될 수 있다. 유세포측정은 또한 분화된 세포 및 분화된 세포 유형의 비율을 평가하는데, 예를 들면, 제제의 존재하에 분화하기 위한 조혈 세포의 능력을 결정하는데 이용될 수 있다. ELISAs, 웨스턴, 및 노던 블랏은, 예를 들면 생착된 세포의 기능을 평가하기 위해, 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에서 발현된, 사이토카인, 케모카인, 면역글로불린, 등의 수준을 결정하기 위해 수행될 수 있다. 면역 세포의 기능을 시험하기 위한 생체내 검정, 뿐만 아니라 특정한 관심 질환 또는 장애 예컨대 당뇨병, 자가면역 질환, 이식편 대 숙주 질환, AMD, 등에 관련된 검정은 또한 수행될 수 있다. 참조, 예를 들면 Current Protocols in Immunology (Richard Coico, ed. John Wiley & Sons, Inc. 2012) 및 Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997) (이들의 개시내용은 본원에서 참고로 편입됨).
그래서, 예를 들어, 유효량의 인간 병원체에 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, 예를 들면, 생착된 Rag2 -/- IL2rg Y/- hSIRPα hIL-15 마우스를 노출시키는 단계로서, 유효량의 병원체가 마우스에서 감염을 생산하도록 요구된 병원체의 양인, 단계; 병원체를 마우스에 감염시키는 단계; 제제의 존재하에 경시적으로 감염의 파라미터를 측정하는 단계; 및 제제에 노출되지 않은, 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스로부터 측정에 그 측정을 비교하는 단계를 포함한, 인간 병원체에 관한 제제의 효과 결정 방법이 제공된다. 선택된 기간에 걸쳐 제제의 단일 투여 또는 2 이상 투여 이후 적어도 절반만큼 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스의 혈액 또는 조직내 제제의 양을 감소시키면 제제는 항병원성 제제인 것으로 결정된다.
또 다른 예로서, 병원체 단리체 또는 관심 균주가 약물 내성, 예를 들면 다중약물 내성인지의 결정 방법이 제공된다. 이들 방법에서, 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, 예를 들면, 생착된 Rag2 -/- IL2rg Y/- hSIRPα hIL-15 마우스는 유효량의 인간 병원체 단리체 또는 관심 균주에 노출되고, 유효량의 병원체는 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스에서 감염을 생산하도록 요구된 병원체의 양이고; 병원체는 비-인간 동물을 감염시킬 수 있게 되고; 감염의 파라미터, 예를 들면, 비-인간 동물의 혈액 또는 조직에서 단리체 또는 관심 균주의 역가, 비-인간 동물에서 감염을 유지하기 위한 단리체 또는 관심 균주의 능력, 또는 약물의 투여 이후 시점에서 비-인간 동물에서 재생산하기 위한 단리체 또는 관심 균주의 능력은 약물의 존재하에 측정되고; 그 측정은 제제에 노출되지 않은 병원체로 감염된 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스로부터 측정에 비교된다. 관심 약물의 예는 아목시실린, 암피실린, 세포탁심, 세프트리악손, 세프타지딤, 클로르암페니콜, 시프로플록사신, 코-트리목사졸, 에르타페넴, 이미페넴, 플루오로퀴놀론 (예를 들면, 시프로플록사신, 가티플록사신, 오플록사신), 스트렙토마이신, 설파디아진, 설파메톡사졸, 테트라사이클린, 및 이들의 조합을 포함한다. 특정 구현예에서, 약물 또는 약물의 조합의 투여는 단리체 또는 관심 균주에 감염-생산 노출 이후 적어도 1 주, 10 일, 2 주, 3 주, 또는 4 주이다.
또한, 인간 조혈 세포로 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물 (예를 들면, 마우스) 및 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물 (예를 들면, 마우스), 예를 들면, 생착된 Rag2-/-IL2rgY/- hSIRPα hIL-15 마우스, 및 선택적으로 다른 유전자 변형을 갖는 것은 NK 세포 (예를 들면, 인간 NK 세포)에 의해 매개된 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 연구에서 유용하다. 그와 같은 동물은 또한, 그와 같은 세포 또는 감염원 사멸에 관여된 NK 세포 경로를 활성화하기 위해, 다양한 세포 (예를 들면, 종양 또는 감염된 세포) 또는 감염원을 표적화하도록 설계된, 치료 약물 후보, 예를 들면, 항원-결합 단백질 또는 항체의 능력 시험에 유용한 모델이다.
단클론성 항체 요법의 기저를 이루는 기전 중 하나가 NK 세포 Fc 수용체 CD16 (Fc 감마 수용체 IIIA) 결합을 통한 NK 세포의 이의 활성화인 것이 널리 공지된다. ADCC를 개선하기 위해 Fc감마 RIIIA에 대하여 다양한 공지된 단클론성 후보 (예를 들면, 리툭시맙)의 친화도를 증가하기 위해 시도되어 왔다 (예를 들면, Bowles 등 Blood 2006; 108:2648-2654; Garff-Tavernier 등 Leukemia 2011; 25:202-209). 본원에서 증명된 바와 같이, 인간화된 SIRPα-IL-15 생착된 비-인간 동물은 ADCC를 매개할 수 있는 인간 NK 세포를 생산하고; 따라서, 이들 동물은 ADCC 기전의 연구 및 다양한 치료적 후보의 선별에 유용한 생체내 모델을 나타낸다.
따라서, 그로부터 단리된, 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물 및 세포, 예를 들면, 인간 NK 세포는 인간화된 비-인간 동물 또는 세포, 예를 들면, 인간 NK 세포에서 생착된 세포 유형의 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 활성을 개선하는 제제를 확인하기 위해 설계된 선별 방법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 적합한 방법은 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물에 제제의 투여 및 인간화된 비-인간 동물에서 생체내 생착된 세포 유형의 항체 의존성 세포 독성 (ADCC) 활성에 관한 제제의 효과의 결정을 포함할 수 있다. 하나의 구현예에서, 상기 효과는, 예를 들면, 이식된 종양, 예를 들면, 인간 종양의 개선된 종양 사멸을 초래한다. 또 다른 구현예에서, 상기 효과는 감염된 세포, 예를 들면, 바이러스성으로-감염된 세포 또는 박테리아성으로-감염된 세포의 개선된 사멸을 초래한다. 더욱 또 다른 구현예에서, 상기 효과는 박테리아, 진균 또는 기생충의 개선된 사멸을 초래한다. 다양한 구현예에서 제제는 항체 또는 항원-결합 단백질이다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단백질은 인간 종양 세포상에서 발현된 항원을 표적하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단백질은 바이러스성으로-감염된 세포 또는 박테리아성으로-감염된 세포상에서 발현된 항원을 표적하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단백질은 박테리아, 진균, 또는 기생충 항원을 표적화하도록 설계된다. 일부 구현예에서, 인간 세포, 예를 들면, 인간 NK 세포가 표적 세포의 사멸 매개에서 제제의 효능을 결정하기 위해 제제 예컨대 항체 또는 항원-결합 단백질, 및 표적 세포 (예를 들면, 종양 세포)와 시험관내 접촉되고 생착된 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물로부터 단리되는 시험관내 방법이 제공된다. 인간 세포, 예를 들면, 인간 NK 세포의 세포용해 활성에 관한 제제의 효과는 그 다음 결정될 수 있다.
대상 마우스에 대한 다른 사용 예는 본원에서 다른 곳에 제공된다. 본 개시내용에 기재된 유전자 변형된 및 생착된 마우스의 추가 적용은 본 개시내용의 판독시 당해 분야의 숙련가에 분명할 것이다.
대상 유전자 변형된 비-인간 동물의 제조 방법
본 발명의 일부 측면에서, 본 개시내용의 대상 비-인간 동물의 제조 방법이 제공된다. 대상 방법의 실시에서, 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터, 예를 들면, 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터, 예를 들면, 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열을 포함하는 비-인간 동물이 생성된다.
인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결되는 핵산 서열, 및/또는 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는 핵산 서열을 포함한 비-인간 동물의 생성은, 예를 들면 당해 기술에서 공지된 바와 같이 또는 본원에서 기재된 바와 같이 유전자 변형된 동물의 임의의 편리한 제조 방법을 이용하여 달성될 수 있다.
예를 들어, 인간 SIRPα 단백질 또는 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산은 숙주 세포의 게놈 속에 삽입 및 비-인간 숙주 세포내 인간 단백질의 발현에 적합한 형태로 재조합 벡터 속에 편입될 수 있다. 다양한 구현예에서, 재조합 벡터는, 상기에 기재된 바와 같이, 인간 단백질 속에 mRNA의 번역 및 mRNA 속에 핵산의 전사를 허용하는 방식으로 인간 단백질을 인코딩한 핵산에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 벡터의 설계는 형질감염된 숙주 세포의 선택 및/또는 발현된 인간 단백질의 양과 같은 그러한 인자에 의존할 수 있다는 것이 이해될 것이다.
임의의 다양한 방법은 그 다음 인간 유전자를 발현하는 유전자 변형된 동물을 생산하기 위해 동물 세포 속에 인간 핵산 서열을 도입하는데 사용될 수 있다. 그와 같은 기술은 당해 기술에서 공지되고, 비제한적으로, 전핵 미세주입, 배아 줄기 세포의 전환, 상동성 재조합 및 녹-인 기술을 포함한다. 사용될 수 있는 유전자 변형된 동물의 생성 방법은, 비제한적으로, 하기에 기재된 것을 포함한다: Sundberg and Ichiki (2006, Genetically Engineered Mice Handbook, CRC Press), Hofker and van Deursen (2002, Genetically modified Mouse Methods and Protocols, Humana Press), Joyner (2000, Gene Targeting: A Practical Approach, Oxford University Press), Turksen (2002, Embryonic stem cells: Methods and Protocols in Methods Mol Biol., Humana Press), Meyer 등 (2010, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 107: 15022-15026), 및 Gibson (2004, A Primer of Genome Science 2nd ed. Sunderland, Massachusetts: Sinauer), 미국 특허 번호 6,586,251, Rathinam 등 (2011, Blood 118:3119-28), Willinger 등, (2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108:2390-2395), Rongvaux 등, (2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108:2378-83) 및 Valenzuela 등 (2003, Nat Biot 21 :652-659).
예를 들어, 대상 유전자 변형된 동물은, 예를 들면, 미세주입에 의해 난모세포 속에 인간 단백질을 인코딩한 핵산의 도입, 및 암컷 포스터 동물을 발생할 수 있게 난모세포의 허용에 의해 창출될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 핵산은 수정된 난모세포 속에 주사된다. 수정된 난모세포는 교배 다음 날 과잉배란된 암컷으로부터 수집될 수 있고 발현 작제물로 주사될 수 있다. 주사된 난모세포는 밤새 배양되거나 0.5-일 p.c. 상상임신한 암컷의 난관 속에 직접적으로 이동된다. 과배란, 난모세포의 수확, 발현 작제물 주사 및 배아 이동 방법은 당해 기술에 공지되어 있고 하기에 기재된다: Manipulating the Mouse Embryo (2002, A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press). 새끼는 DNA 분석 (예를 들면, PCR, 서던 블랏, DNA 서열분석, 등)에 의해 또는 단백질 분석 (예를 들면, ELISA, 웨스턴 블랏, 등)에 의해 도입된 핵산의 존재로 평가될 수 있다.
또 다른 예로서, 인간 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 포함한 작제물은 공지된 방법, 예컨대 전기천공, 칼슘-포스페이트 침전, 리포펙션, 등을 이용하여 줄기 세포 (예를 들면, ES 세포 또는 iPS 세포) 속에 형질감염될 수 있다. 세포는 DNA 분석 (예를 들면, PCR, 서던 블랏, DNA 서열분석, 등)에 의해 또는 단백질 분석 (예를 들면, ELISA, 웨스턴 블랏, 등)에 의해 도입된 핵산의 존재로 평가될 수 있다. 발현 작제물을 편입하도록 결정된 세포는 그 다음 착상 전 배아 속에 도입될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 당해 기술에서 공지된 방법의 상세한 설명을 위하여, 하기 참조: Nagy 등, (2002, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press), Nagy 등 (1990, Development 110:815-821), 미국 특허 번호 7,576,259, 미국 특허 번호 7,659,442, 미국 특허 번호 7,294,754, 및 Kraus 등 (2010, Genesis 48:394-399).
바람직한 구현예에서, 본원에서 기재된 유전자 변형된 동물의 생성 방법은 VELOCIGENE® 기술을 이용하여 제조된 표적화 작제물, ES 세포 속에 작제물 도입, 및, 실시예에서 기재된 바와 같이, VELOCIMOUSE® 기술을 이용한 마우스 배아 속에 표적화된 ES 세포 클론 도입을 이용한다.
유전자 변형된 초대 동물은 유전자 변형을 옮기는 추가 동물로 번식될 수 있다. 예를 들어, 인간화된 SIRPα 비-인간 동물은 본원에서 기재된 hSIRPα-hIL-15 비-인간 동물을 생산하기 위해 동일한 종의 인간화된 IL-15 비-인간 동물로 번식될 수 있다. 본 개시내용의 인간 단백질(들)을 인코딩한 핵산을 옮기는 유전자 변형된 동물은 녹아웃 동물, 예를 들면, 하나 이상의 단백질에 대하여 결핍되는, 예를 들면 하나 이상의 이의 유전자를 발현하지 않는 비-인간 동물, 예를 들면 Rag2-결핍된 동물 및/또는 I12rg-결핍된 동물에 추가로 번식될 수 있다.
상기 논의된 바와 같이, 일부 구현예에서, 대상 유전자 변형된 비-인간 동물은 면역결핍된 동물이다. 면역결핍되고 하나 이상의 인간 단백질, 예를 들면 hSIRPα 및/또는 hIL-15를 포함하는 유전자 변형된 비-인간 동물은, 예를 들면 당해 기술에서 공지된 바와 같이 또는 본원에서 기재된 바와 같이, 유전자 변형된 동물의 생성을 위하여 임의의 편리한 방법을 이용하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 유전자 변형된 면역결핍된 동물의 생성은, 동종접합성인 경우, 본원에서 상기 및 실시예에서 더 상세히 기재된 바와 같이 면역결핍을 초래할, 돌연변이체 SCID 유전자 대립유전자를 포함한 난모세포 또는 줄기 세포 속에 인간 단백질을 인코딩한 핵산의 도입에 의해 달성될 수 있다. 마우스는 그 다음, 예를 들면 본원에서 기재된 및 당해 기술에서 공지된 방법을 이용하여 변형된 난모세포 또는 ES 세포로 생성되고, 교배되어 목적하는 유전자 변형을 포함한 면역결핍된 마우스를 생산한다. 또 다른 예로서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 면역적격 배경에서 생성될 수 있고, 반접합성 또는 동종접합성인 경우, 면역결핍을 초래할 돌연변이체 유전자 대립유전자를 포함한 동물, 및 적어도 하나의 관심 인간 단백질을 발현한 면역결핍된 동물을 창출하기 위해 교배된 자손에 잡종이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 유전자 변형된 비-인간 동물은 유전자 변형된 비-인간 동물에서 실재할 수 있는 내인성 조혈 세포를 제거하기 위해 치료받는다. 하나의 구현예에서, 치료는 유전자 변형된 비-인간 동물의 조사를 포함한다. 구체적 구현예에서, 신생 유전자 변형된 마우스 새끼는 치사량 가깝게 조사된다. 구체적 구현예에서, 신생 새끼는 4 시간 간격으로 2 x 200 cGy 조사된다.
본 발명의 다양한 구현예는 실질적으로 그들의 세포의 모두에서 인간 핵산을 포함하는 유전자 변형된 동물, 뿐만 아니라 모든 그들의 세포가 아닌, 일부에서 인간 핵산을 포함하는 유전자 변형된 동물을 제공한다. 일부 사례, 예를 들면 표적화된 재조합에서, 인간 핵산의 하나의 카피는 유전자 변형된 동물의 게놈 속에 통합될 것이다. 다른 사례, 예를 들면 랜덤 통합에서, 인간 핵산의, 서로 인접한 또는 떨어진, 다중 카피는 유전자 변형된 동물의 게놈 속에 통합될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 상기 대상체 유전자 변형된 비-인간 동물은 대응하는 비-인간 동물 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 폴리펩타이드를 인코딩한 핵산을 포함하는 게놈을 포함한 면역결핍된 동물일 수 있고, 여기서 상기 동물은 인코딩된 인간 폴리펩타이드를 발현한다. 환언하면, 대상 유전자 변형된 면역결핍된 비-인간 동물은 적어도 하나의 인간 폴리펩타이드를 인코딩한 핵산을 포함하는 게놈을 포함하고, 여기서 상기 핵산은 대응하는 비-인간 프로모터 및 폴리아데닐화 신호에 작동가능하게 연결되고, 상기 동물은 인코딩된 인간 폴리펩타이드를 발현한다.
시약, 디바이스 및 키트
하나 이상의 상기-기재된 방법의 실시용 이의 시약, 디바이스 및 키트가 또한 제공된다. 이의 대상 시약, 디바이스 및 키트는 매우 다양할 수 있다.
일부 구현예에서, 시약 또는 키트는 본원에서 기재된 방법에서 사용을 위해 하나 이상의 제제를 포함할 것이다. 예를 들어, 본 키트는 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, 예를 들면, Rag2 -/- IL2rg Y/- hSIRPα hIL-15 마우스를 포함한다. 본 키트는 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스, 예를 들면, 프라이머 교배용 시약 및, 일부 사례에서, 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스 유전형분석용 시약을 포함할 수 있다. 본 키트는 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스 속에 이식을 위하여 인간 조혈 세포 또는 인간 조혈 조상 세포의 농축된 집단, 또는 인간화된 SIRPα-IL-15 비-인간 동물, 예를 들면, 마우스 속에 이식을 위하여 인간으로부터 조혈 세포의 농축된 집단 또는 조혈 세포의 집단 제조용 시약을 포함할 수 있다. 다른 시약은, 예를 들면 후보 제제, 예를 들면, 상이한 유형의 조혈 세포 또는 분화된 면역 세포 (예를 들면, T 세포 및/또는 NK 세포)에 의해 발현된 마커에 특이적인 하나 이상의 항체의 존재/부재 하에 조혈 세포 또는 분화된 면역 세포 (예를 들면, T 세포 및/또는 NK 세포)의 생존력 및/또는 기능 결정용 시약, 또는 특정한 사이토카인, 케모카인, 등 검출용 시약을 포함할 수 있다. 다른 시약은 배양 배지, 배양 보충물, 매트릭스 조성물, 기타 등등을 포함할 수 있다.
상기 성분에 더하여, 대상 키트는 대상 방법 실시용 지침을 추가로 포함할 것이다. 이들 지침은 다양한 형태로 대상 키트에서 존재할 수 있고, 이들 중 하나 이상은 키트에서 존재할 수 있다. 이들 지침이 존재할 수 있는 하나의 형태는 적합한 배지 또는 기질상에 인쇄된 정보, 예를 들면, 키트의 패키징에서, 포장 삽입물, 등에서, 정보가 인쇄되는 피스 또는 종이 조각이다. 더욱 또 다른 수단은, 정보가 기록된, 컴퓨터 판독가능 매체, 예를 들면, 디스켓, CD, 등일 것이다. 존재할 수 있는 더욱 또 다른 수단은 원격 현장에서 정보에 접근하기 위해 인터넷을 통해 사용될 수 있는 웹사이트 주소이다. 임의의 편리한 수단은 키트에서 존재할 수 있다.
본 개시내용의 예시적인 비제한 측면
상기 기재된 본 요지의, 구현예를 포함한, 측면은 하나 이상의 다른 측면 또는 구현예와 조합으로 또는 단독으로 유익할 수 있다. 전술한 설명의 제한 없이, 1-167 넘버링된 본 개시내용의 특정 비제한 측면은 아래 제공된다. 본 개시내용 판독시 당해 분야의 숙련가에 분명할 바와 같이, 각각의 개별적으로 넘버링된 측면은 사용될 수 있거나 임의의 이전의 또는 이후의 개별적으로 넘버링된 측면과 조합될 수 있다. 이는 측면의 모든 상기 조합에 지지를 제공하도록 의도되고 아래 명백하게 제공된 측면의 조합에 제한되지 않는다:
1. 하기를 포함한, 유전자 변형된 비-인간 동물:
서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및
서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 동물.
2. 1에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
3. 2에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
4. 3에 있어서, 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한, 유전자 변형된 비-인간 동물.
5. 4에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
6. 4에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
7. 4에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
8. 1-7 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
9. 1-8 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질이 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
10. 9에 있어서, 기능성 단편이 인간 SIRPα의 세포외 도메인을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
11. 10에 있어서, 세포외 도메인이 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
12. 1-11 중 어느 하나에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
13. 12에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
14. 13에 있어서, 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함한, 유전자 변형된 비-인간 동물.
15. 14에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
16. 14에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
17. 14에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
18. 1-17 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
19. 1-18 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질이 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
20. 1-19 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 면역결핍되는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
21. 20에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
22. 20 또는 21에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 IL2rg 유전자 녹-아웃을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
23. 1-22 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 포유동물인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
24. 23에 있어서, 포유동물이 설치류인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
25. 24에 있어서, 설치류가 마우스인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
26. 1-25 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 조혈 세포의 생착을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
27. 26에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
28. 27에 있어서, 인간 병원체가 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
29. 27에 있어서, 인간 병원체가 인간 장을 감염시키는 병원체인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
30. 29에 있어서, 인간 병원체가 인간 로타바이러스인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
31. 27에 있어서, 병원체가 인간 폐를 감염시키는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
32. 31에 있어서, 인간 병원체가 인플루엔자 바이러스인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
33. 하기를 포함한 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, 동물 생착 모델:
서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열;
서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및
인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 (i) 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 유전자 변형된 비-인간 동물의 소장 및 페이에르 판에서 인간 상피내 림프구 (IEL)를 포함하는, 모델.
34. 33에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는, 모델.
35. 34에 있어서, 인간 병원체가 장 병원체인, 모델.
36. 35에 있어서, 장 병원체가 하기로부터 선택되는, 모델: 캄필로박터 제주니, 클로스트리듐 디피실레, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 엔테로코쿠스 패슘, 에스케리치아 콜라이, 인간 로타바이러스, 리스테리아 모노사이토게네스, 노워크 바이러스, 살모넬라 엔테리카, 시겔라 플렉스네리, 시겔라 손네이, 시겔라 다이센테리애, 예르시니아 페스티스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 및 헬리코박터 파일로리.
37. 33-36 중 어느 하나에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 모델.
38. 37에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 모델.
39. 38에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함하는, 모델.
40. 39에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실인, 모델.
41. 39에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 모델.
42. 39에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 모델.
43. 33-42 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 모델.
44. 33-43 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질이 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편인, 모델.
45. 44에 있어서, 기능성 단편이 인간 SIRPα의 세포외 도메인을 포함하는, 모델.
46. 45에 있어서, 세포외 도메인이 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함하는, 모델.
47. 33-46 중 어느 하나에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 모델.
48. 47에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 모델.
49. 48에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함하는, 모델.
50. 49에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실인, 모델.
51. 48에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 모델.
52. 48에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 모델.
53. 33-52 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 모델.
54. 33-53 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질이 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편인, 모델.
55. 33-54 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 면역결핍되는, 모델.
56. 55에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함하는, 모델.
57. 55 또는 56에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 IL2rg 유전자 녹-아웃을 포함하는, 모델.
58. 33-57 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 포유동물인, 모델.
59. 58에 있어서, 포유동물이 설치류인, 모델.
60. 59에 있어서, 설치류가 마우스인, 모델.
61. 하기를 포함한 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, 동물 생착 모델:
서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열;
서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및
인간 조혈 세포의 생착, 여기서 유전자 변형된 비-인간 동물이 (i) 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 유전자 변형된 비-인간 동물의 폐에서 인간 상피내 림프구 (IEL)를 포함하는, 모델.
62. 61에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는, 모델.
63. 62에 있어서, 인간 병원체가 폐 병원체인, 모델.
64. 63에 있어서, 폐 병원체가 하기로부터 선택되는, 모델: 연쇄상구균 파이오제네스, 헤모필루스 인플루엔자, 코라이네박테리움 디프테리아, SARS 코로나바이러스, 보데텔라 페르투스시스, 모락셀라 카타르할리스, 인플루엔자 바이러스 (A, B, C), 코로나바이러스, 아데노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 연쇄상구균 뉴모니애, 스타필로코쿠스 아우레스, 레지오넬라 뉴모필라, 클렙시엘라 뉴모니애, 슈도모나스 에어루기노사, 마이코플라스마 뉴모니아, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 클라미디아 뉴모니애, 블라스토마이세스 더마티티디스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 및 아스페르길루스 푸미가투스.
65. 61-64 중 어느 하나에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 모델.
66. 65에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 모델.
67. 66에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함하는, 모델.
68. 67에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4인, 모델.
69. 67에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 모델.
70. 67에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 모델.
71. 61-70 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 모델.
72. 61-71 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질이 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편인, 모델.
73. 72에 있어서, 기능성 단편이 인간 SIRPα의 세포외 도메인을 포함하는, 모델.
74. 73에 있어서, 세포외 도메인이 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함하는, 모델.
75. 61-74 중 어느 하나에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 모델.
76. 75에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 모델.
77. 76에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함하는, 모델.
78. 77에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실인, 모델.
79. 77에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 모델.
80. 77에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 모델.
81. 61-80 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 모델.
82. 61-80 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질이 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편, 모델.
83. 61-82 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 면역결핍되는, 모델.
84. 83에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함하는, 모델.
85. 83 또는 84에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 IL2rg 유전자 녹-아웃을 포함하는, 모델.
86. 61-85 중 어느 하나에 있어서, 비-인간 동물이 포유동물인, 모델.
87. 86에 있어서, 포유동물이 설치류인, 모델.
88. 87에 있어서, 설치류가 마우스인, 모델.
89. 하기 단계를 포함하는, 후보 T-세포 유도 백신의 효능 결정 방법:
유전자 변형된 비-인간 동물에 후보 T-세포 유도 백신을 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계:
(i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및
(iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 포함하는, 단계;
유전자 변형된 비-인간 동물을 인간 병원체로 공격하는 단계; 및
후보 T-세포 유도 백신이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 T 세포 매개된 면역 반응을 유도하는지 여부를 결정하는 단계.
90. 89에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 방법.
91. 90에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 방법.
92. 91에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함하는, 방법.
93. 92에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실인, 방법.
94. 92에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 방법.
95. 92에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 방법.
96. 89-95 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 방법.
97. 89-96 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질이 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편인, 방법.
98. 97에 있어서, 기능성 단편이 인간 SIRPα의 세포외 도메인인, 방법.
99. 98에 있어서, 세포외 도메인이 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함하는, 방법.
100. 89-99 중 어느 하나에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 방법.
101. 100에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 방법.
102. 101에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함하는, 방법.
103. 102에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실인, 방법.
104. 101에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 방법.
105. 101에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 방법.
106. 89-105 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 방법.
107. 89-106 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질이 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편인, 방법.
108. 89-107 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함하는, 방법.
109. 89-108 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 IL2rg 유전자 녹-아웃을 포함하는, 방법.
110. 89-109 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 포유동물인, 방법.
111. 110에 있어서, 포유동물이 설치류인, 방법.
112. 111에 있어서, 설치류가 마우스인, 방법.
113. 하기 단계를 포함한, 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 병원체에 의한 감염을 저해하는 제제의 확인 방법:
유전자 변형된 비-인간 동물에 제제를 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계:
(i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(iii) 인간 조혈 세포의 생착, 및
(iv) 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 병원체에 의한 감염, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및
제제가 병원체-감염된 비-인간 동물에서 병원체의 양을 감소시키는지 여부를 결정하는 단계.
114. 113에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 방법.
115. 114에 있어서, SIRPα 유전자 프로모터가 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 방법.
116. 115에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 비-인간 SIRPα 유전자에 삭제 돌연변이를 포함하는, 방법.
117. 116에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실인, 방법.
118. 116에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 방법.
119. 116에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 방법.
120. 113-119 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 SIRPα 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 방법.
121. 113-120 중 어느 하나에 있어서, 인간 SIRPα 단백질이 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편인, 방법.
122. 121에 있어서, 기능성 단편이 인간 SIRPα의 세포외 도메인을 포함하는, 방법.
123. 122에 있어서, 세포외 도메인이 서열 식별 번호: 12의 아미노산 28-362를 포함하는, 방법.
124. 113-123 중 어느 하나에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 방법.
125. 124에 있어서, IL-15 유전자 프로모터가 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 방법.
126. 125에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자에 삭제 돌연변이를 포함하는, 방법.
127. 126에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실인, 방법.
128. 125에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 방법.
129. 125에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 방법.
130. 113-129 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 방법.
131. 113-130 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질이 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편인, 방법.
132. 113-131 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함하는, 방법.
133. 113-132 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 IL2rg 유전자 녹-아웃을 포함하는, 방법.
134. 113-133 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 포유동물인, 방법.
135. 134에 있어서, 포유동물이 설치류인, 방법.
136. 135에 있어서, 설치류가 마우스인, 방법.
137. 하기 단계를 포함한, 인간 IL-15 단백질 및 인간 SIRPα 단백질을 발현한 비-인간 동물의 제조 방법:
인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 제1 비-인간 동물을 게놈 속에 도입하는 단계로서, 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 서열이 SIRPα 유전자 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는, 단계;
인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 제2 비-인간 동물을 게놈 속에 도입하는 단계로서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 서열이 IL-15 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는, 단계; 및
인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열 및 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 포함하는 제3 비-인간 동물을 제조하는 단계로서, 상기 제3 비-인간 동물이 인간 IL-15 단백질 및 인간 SIPRα 단백질을 발현하는, 단계.
138. 137에 있어서, 도입의 단계가 인간 IL-15 또는 인간 SIRPα를 인코딩한 핵산을 포함한 만능 줄기 세포로부터 비-인간 동물의 생성을 포함하는, 방법.
139. 137 또는 138에 있어서, 제1 동물이 제2 동물과 상이하고, 제3 동물의 제조의 단계가 제1 및 제2 동물의 교배를 포함하는, 방법.
140. 137에 있어서, 제1 동물 및 제2 동물이 동일하고, 게놈 속에 제1 동물의 도입의 단계가 제2 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열과 제1 만능 줄기 세포의 접촉을 포함하고, 게놈 속에 제2 동물의 도입의 단계가 제3 만능 단계 세포를 수득하기 위해 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열과 제2 만능 줄기 세포의 접촉을 포함하고, 제3 비-인간 동물이 제3 만능 줄기 세포로부터 제조되는, 방법.
141. 137-140 중 어느 하나에 있어서, 만능 줄기 세포가 ES 세포 또는 iPS 세포인, 방법.
142. 137-140 중 어느 하나에 있어서, 만능 줄기 세포가 Rag2에 대하여 결핍되는, 방법.
143. 137-142 중 어느 하나에 있어서, 만능 줄기 세포가 IL2rg에 대하여 결핍되는, 방법.
144. 137-143 중 어느 하나에 있어서, 제3 비-인간 동물이 Rag2 및 IL2rg의 한쪽 또는 양쪽에서 결핍되는, 방법.
145. 137-144 중 어느 하나에 있어서, IL-15 프로모터 서열이 인간 IL-15 프로모터 서열인, 방법.
146. 137-144 중 어느 하나에 있어서, IL-15 프로모터 서열이 내인성 비-인간 동물 IL-15 프로모터 서열인, 방법.
147. 137-144 중 어느 하나에 있어서, 통합이 비-인간 IL-15 유전자좌에서 비-인간 IL-15 유전자의 대체를 초래하는, 방법.
148. 137-147 중 어느 하나에 있어서, 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 핵산 서열이 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 방법.
149. 하기 단계를 포함한, 인간 IL-15 단백질을 발현한 유전자 변형된 비-인간 동물의 생착 방법:
137-148 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 유전자 변형된 비-인간 동물 속에 인간 조혈 세포를 포함한 세포의 집단의 이식 단계.
150. 149에 있어서, 이식 단계가 꼬리-정맥 주사, 태아 간 주사, 또는 안와후 주사를 포함하는, 방법.
151. 149 또는 150에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 이식에 앞서 치사량 가깝게 조사되는, 방법.
152. 149-151 중 어느 하나에 있어서, 인간 조혈 세포가 CD34+ 세포인, 방법.
153. 149-151 중 어느 하나에 있어서, 인간 조혈 세포가 태아 간, 성인 골수, 또는 탯줄 혈액 출신인, 방법.
154. 하기 단계를 포함한, 표적 세포 사멸에서 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 효능 결정 방법:
후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질을 유전자 변형된 비-인간 동물에 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계:
(i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및
(iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및
후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 표적 세포에 대해 NK 세포 매개된 항체-의존성 세포 독성을 조절하는지 여부를 결정하는 단계.
155. 하기 단계를 포함한, 표적 세포 사멸에서 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 효능 결정 방법:
유전자 변형된 비-인간 동물로부터 NK 세포를 단리하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계:
(i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및
(iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계;
후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질 및 표적 세포와 단리된 NK 세포를 접촉하는 단계; 및
표적 세포에 대해 단리된 NK 세포의 항체- 또는 항원-결합 단백질-의존성 세포용해 활성을 결정하는 단계.
156. 하기 단계를 포함한 표적 세포 사멸에서 개선된 효능을 위한 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 선별 방법:
후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질을 유전자 변형된 비-인간 동물에 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계
(i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및
(iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및
후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 표적 세포 사멸에 개선된 효능을 표시하는지 여부를 결정하는 단계.
157. 154-156 중 어느 하나에 있어서, 표적 세포가 종양 세포, 바이러스성으로-감염된 세포, 박테리아성으로-감염된 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 및 기생충 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
158. 하기 단계를 포함한, 표적 세포의 NK-세포 매개된 사멸에서 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질 효능의 결정 방법:
후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질을 유전자 변형된 비-인간 동물에 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 결핍되고 하기를 포함하는, 단계:
(i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및
(iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및
후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질이 유전자 변형된 비-인간 동물에서 표적 세포에 대해 NK 세포 항체-의존성 세포 독성을 조절 (예를 들면, 활성화)하는지 여부를 결정하는 단계.
159. 158에 있어서, 표적 세포가 종양 세포, 바이러스성으로-감염된 세포, 박테리아성으로-감염된 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 및 기생충 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
160. 청구항 159에 있어서, 표적 세포가 종양 세포인, 방법.
161. 청구항 160에 있어서, 종양 세포가 B-세포 림프종 세포인, 방법.
162. 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, NK 세포 매개된 항체-의존성 세포 독성의 모델로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 모델:
서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열;
서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 유전자 변형된 비-인간 동물의 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및
인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 (i) 인간 SIRPα 단백질 및 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 인간 림프구를 포함하고, (iii) 종양 세포, 바이러스성으로-감염된 세포, 박테리아성으로-감염된 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 및 기생충 세포로 구성된 군으로부터 선택된 표적 세포를 포함하는, 모델.
163. 청구항 162에 있어서, 표적 세포가 종양 세포인, 모델.
164. 청구항 163에 있어서, 종양 세포가 B-세포 림프종 세포인, 모델.
165. 청구항 163 또는 청구항 164에 있어서, 모델이 외인성 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질을 포함하는, 모델.
166. 청구항 162-165 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 유전자 변형된 비-인간 동물의 소장 및 페이에르 판에서 인간 상피내 림프구 (IEL)를 포함하는, 모델.
167. 청구항 162-166 중 어느 하나에 있어서, 유전자 변형된 비-인간 동물이 유전자 변형된 비-인간 동물의 폐에서 인간 상피내 림프구 (IEL)를 포함하는, 모델.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 제조 및 사용 방법의 설명 및 완전한 개시내용을 당해 분야의 숙련가에 제공하기 위해 제시되고, 발명자들이 그들의 발명으로서 간주하는 것의 범위를 제한하도록 의도되지 않고 아래 실험이 수행된 모든 또는 유일한 실험인 것을 나타내도록 의도되지 않는다. 사용된 숫자 (예를 들면 양, 온도, 등)에 관하여 정확도를 확보하기 위해 노력하였지만 일부 실험적 오차 및 편차는 설명되어야 한다. 달리 나타내지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨온도이고 압력은 대기압 또는 그 근처이다.
실시예 1: 인간화된 SIRPα (SRG) 녹-인 마우스의 생성
마우스 SIRPα 프로모터에 작동가능하게 연결된 인간 SIRPα의 세포외 도메인을 발현하는, 인간 SIRPα 녹-인 마우스가 생성되었다 (참조 도 1). 인간 SIRPα는 적어도 10 대립유전자 형태로 실재한다고 공지된다. 상기 특정한 실시예에서, 인간 SIRPα 변이체 1은 마우스의 내인성 SIRPα 유전자의 인간화에 이용된다.
물질 및 방법
인간 SIRPα를 Rag2-/- Il2rgY/- 129xBalb/c (N2) 유전적 배경 속에 인코딩한 녹-인 마우스의 생성은 아래 더 상세히 기재된 바와 같이 VELOCIGENE® 기술을 이용하여 수행되었다. 마우스는 특이적 무병원체 조건하에 및 음용수 (바이트릴(Baytril); 0.27 mg/mL)에서 엔로플록사신의 연속 치료로 유지되었다.
SIRP (예를 들면, SIRPα) 유전자의 세포외 영역의 인간화용 표적화 벡터는 VELOCIGENE® 기술을 이용하여 작제되었다 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 6,586,251 및 Valenzuela 등 (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659).
간단히, 마우스 박테리아 인공 염색체 (BAC) 클론 bMQ-261H14는 인간 BAC 클론 CTD-3035H21을 이용하여 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 삽입하도록 및 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유한 서열을 결실하도록 변형되었다. 내인성 SIRPα 유전자 (~8555 bp)의 엑손 2 내지 4에 대응하는 게놈성 DNA는 BAC 클론 CTD-3035H21로부터 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유한 ~8581 bp DNA 단편으로 BAC 클론 bMQ-261H14에서 대체되었다. BAC 클론 CTD-3035H21에 함유된 인간 SIRPα 대립유전자의 서열 분석은 인간 변이체 1에 대응하기 위해 대립유전자를 밝혀냈다. loxP 부위에 의해 측접된 네오마이신 카세트는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유한 ~8581 bp 인간 DNA 단편의 말단에 첨가되었다 (도 1 (하단부)).
업스트림 및 다운스트림 상동 아암은 엑손 2 및 4의 위치 5' 및 3', 각각에서 마우스 BAC DNA로부터 수득되었고, 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 2의 마우스 DNA 5'의 19 kb을 함유한 5' 내지 3' 5' 상동 아암을 함유하는, 내인성 SIRPα 유전자의 인간화용 최종 표적화 벡터를 창출하기 위한 ~8581 bp 인간 단편-네오마이신 카세트, 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 함유한 ~8581 bp DNA 단편, loxP 부위에 의해 측접된 네오마이신 카세트, 및 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 4의 마우스 DNA 3'의 21 kb를 함유한 3' 상동 아암에 첨가되었다. 표적화 벡터의 표적화된 삽입은 엑손 4와 5 사이 마우스 SIRPα 유전자의 제5 인트론에서 네오마이신 카세트를 배치시켰다. 표적화 벡터는 SwaI로 소화에 의해 선형화되었고 그 다음 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4로 마우스 SIRPα 유전자에서 엑손 2 내지 4의 표적화된 대체를 달성하기 위해 박테리아 세포내 상동성 재조합으로 사용되었다 (도 1 (하단부)).
(상기 기재된) 표적화된 BAC DNA는 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 포함한 게놈성 단편으로 내인성 마우스 SIRPα 유전자에서 엑손 2 내지 4의 대체를 포함한 변형된 ES 세포를 창출하기 위해 Rag2-/- IL2rgY/- 마우스 ES 세포를 전기천공하는데 사용되었다. 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4를 포함한 게놈성 단편을 함유한 양성 ES 세포는 TAQMAN™ 프로브를 이용한 정량적 PCR로 확인되었다 (Lie and Petropoulos, 1998. Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48). 업스트림 삽입 지점을 거친 뉴클레오타이드 서열은 하기를 포함하였고, 이는 삽입 지점에서 존재한 인간 SIRPα 게놈성 서열에 인접해서 연결된 (아래 괄호 내에 함유된) 삽입 지점의 내인성 마우스 서열 업스트림을 나타낸다:
(서열 식별 번호:1). 네오마이신 카세트의 5' 말단에서 다운스트림 삽입을 거친 뉴클레오타이드 서열은 하기를 포함하였고, 이는 (이탤릭체된 loxP 서열로 아래 괄호 내에 함유된) 삽입 지점의 카세트 서열 다운스트림과 인접한 인간 SIRPα 게놈성 서열을 나타낸다:
(서열 식별 번호:2). 네오마이신 카세트의 3' 말단에서 다운스트림 삽입 지점을 거친 뉴클레오타이드 서열은 하기를 포함하였고, 이는 (아래 괄호 내에 함유된) 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 4의 마우스 게놈성 서열 3'와 인접한 카세트 서열을 나타낸다:
(서열 식별 번호:3). 양성 ES 세포 클론은 그 다음 마우스의 내인성 SIRPα 유전자 속에 인간 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4의 삽입을 함유한 한 배에서 난 새끼를 생성하기 위해 VELOCIMOUSE® 방법 (참조, 예를 들면, 미국 특허 번호 7,294,754 및 Poueymirou 등 2007, 즉각적인 표현형 분석을 허용한 공여체 유전자-표적화된 ES 세포로부터 본질적으로 완전히 유래되는 F0 세대 마우스, Nature Biotech. 25(1):91-99)을 이용하여 암컷 마우스를 이식하는데 사용되었다.
상기 기재된 표적화된 ES 세포는 공여체 ES 세포로서 사용되었고 VELOCIMOUSE® 방법 (상기)에 의해 8-세포 기 마우스 배아 속에 도입되었다. 내인성 SIRPα 유전자의 엑손 2 내지 4의 인간화를 보유한 마우스는 인간 SIRPα 유전자 서열의 존재를 검출한 대립유전자 검정 (Valenzuela 등, 상기)의 변형을 이용한 유전형분석에 의해 확인되었다.
인간화된 SIRPα 유전자 작제물을 보유한 (즉, 마우스 SIRPα 유전자에서 인간 SIRPα 엑손 2 내지 4를 함유한) 마우스는, 예를 들면, ES 세포 기에서 또는 배아에서 제거되지 않는 표적화 벡터에 의해 도입된 임의의 록스드(loxed) 네오마이신 카세트를 제거하기 위해 Cre 딜리터(deletor) 마우스 균주 (참조, 예를 들면, 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2009/114400)에 교배될 수 있다. 선택적으로, 네오마이신 카세트는 마우스에서 유지된다. 동종접합성 Sirpα 마우스를 수득하기 위해 이형접합체가 교배된다.
결과
상기에 기재된 바와 같이 마우스 SIRPα 유전자의 인간화된 버전을 인코딩한 핵산을 포함한 마우스 (SRG 마우스)는 인간화된 SIRPα 단백질의 생리적 발현을 나타낸다 (데이터 도시되지 않음). 이들 마우스는 또한 NOD scid 감마 (NSG) 마우스에 비교할만한 비장, 주변 림프절 (LN) 및 가슴샘에서 인간 면역 세포 생착을 나타낸다 (데이터 도시되지 않음).
실시예 2: 인간화된 SRG IL-15
h/h
(SRG-15) 녹-인 마우스의 생성
사이토카인 IL-15는 마우스 NK 세포 발생 및 기억 CD8+ T 세포 분화 및 유지에 중요한 것으로 나타났다. 동물 모델의 맥락에서, 인간 면역 세포의 발생, 분화 및 유지에 관한 인간 IL-15의 효과를 연구하기 위해, 인간 IL-15 인간 SIRPα 녹-인 마우스는 아래 더 상세히 기재된 바와 같이 생성되었다. 도 2는 IL-15 녹-인 작제물의 도식적 묘사를 보여준다.
물질 및 방법
마우스 ES 세포는, 도 2에서 나타낸 바와 같이 인간화된 유전자좌를 생산하기 위해, VELOCIGENE® 유전공학 기술을 이용하여, 마우스 IL-15 조절 요소의 통제하에, 내인성 마우스 IL-15 유전자좌에서 인간 IL-15 유전자 서열로 마우스 IL-15 유전자 서열을 대체하도록 변형되었다. 인간 Il-15를 포함한 녹-인 마우스는 Rag2-/- Il2rgY/- 129xBalb/c 유전적 배경상에서 생성되었다. 도 2는 마우스 유전자의 5' 미번역된 엑손 (엑손 1 및 2)의 (IL-15 유전자의 전사의 방향에 관하여) 업스트림을 보여주지 않고; 도 2의 코딩 엑손 1 (엑손 3)은 코딩 엑손의 작은 미번역된 영역 (미충전된) 업스트림을 보여준다. 마우스 1에 대하여 이하에 논의된 바와 같이 제외하고, 도 2의 하단부에서 인간화에 나타낸 바와 같이, 마우스 코딩 엑손 1 및 2 (엑손 3 및 4)는 유지되었고, 반면에 마우스 코딩 엑손 3 내지 6 (엑손 5-8)은 인간 코딩 엑손 3 내지 6 (엑손 5-8)로 대체되었다. 다운스트림 말단에서, 인간 코딩 엑손 6 (엑손 8)은 정지 코돈 및 인간 3'-UTR이 뒤따르고, 추가로 인간 3'UTR의 다운스트림에서 발견된 인간 서열이 뒤따른다. 선택 목적으로, Cre에 의한 제거로 플록스드(floxed)) 선별 카세트가 포함되었다. 도 2의 인간화된 유전자좌는 완전히 인간인 성숙한 IL-15 단백질을 발현한다.
구체적으로, 박테리아 상동성 재조합 (BHR)은 표준 BHR 기술 (참조, 예를 들면, Valenzuela 등 (2003), 상기) 및 갭 치유 BHR을 이용하여 마우스 IL-15 유전자좌에 표적화를 위한 인간 IL-15 유전자의 서열을 함유한 큰 표적화 벡터 (LTVEC)를 작제하도록 수행되었다. 선형 단편은 클로닝된 카세트에 PCR-생성된 상동성 박스의 결찰 그 다음 결찰 생성물의 겔 단리 및 표적 박테리아 인공 염색체 (BAC)를 품은 BHR-능숙한 박테리아 속에 전기천공에 의해 생성되었다. 마우스 BAC PRCI23-203P7은 마우스 서열의 공급원으로서 사용되고; 인간 BAC RP11-103B12는 인간 IL-15 유전자 서열의 공급원으로서 사용된다. 선택 단계 이후, 정확하게 재조합된 클론은 신규한 접합을 거친 PCR에 의해, 및 제약 분석에 의해 확인된다. 상동 아암 및 인간 IL-15 유전자 서열을 함유한 LTVEC이 제조되었다.
마우스 IL-15 유전자 (마우스 GeneID: 103014; RefSeq 전사체: M 008357.2; 앙상블 eID: 16168)은 결실 GRCM38: ch 8: 82331173-82343471용 게놈성 좌표 (마이너스 가닥); 대체 GRCh37: ch4: 142642924-142655819용 게놈성 좌표 (플러스 가닥)을 이용함으로써 변형된다. 마우스 서열의 12299 뉴클레오타이드는 인간 서열의 12896 뉴클레오타이드에 의해 대체되었다. 상기에 기재된 바와 같이 마우스 IL-15 서열의 대체는 도 2에서 그래프로 나타난다.
인간화된 IL-15 유전자를 포함한 LTVEC은 MluI 부위를 가진 업스트림으로 측접된 아암을 표적하는 업스트림 마우스의 약 13 kb, 및 AscI 부위를 가진 다운스트림으로 측접된 아암을 표적하는 27 kb 다운스트림 마우스를 가졌다. LTVEC는 전기천공용 MluI 및 AscI로 선형화되었다.
LTVEC의 작제 이후, 마우스/인간 5' 접합, 및 인간/마우스 3' 접합을 거친 LTVEC의 뉴클레오타이드 서열은 아래 표 1에서 나타낸 바와 같다. 서열 식별 번호:4는 마우스 서열과 인간 서열 사이 업스트림 (IL-15 유전자의 전사의 방향에 관하여) 접합을 도시하고; 보여진 서열은 대문자로 마우스 서열, 그 다음 소문자로 AsisI 제한 부위, 그 다음 대문자로 인간 IL-15 핵산 서열로 시작한다. 서열 식별 번호:5는 대문자로 다운스트림 인간 IL-15 코딩 및 비코딩 서열 (인간 3'UTR 볼드체된 이탤릭체), 그 다음 소문자로 XhoI 부위, 그 다음 lox 부위 (대문자, 볼드체된 이탤릭체), 그 다음, 2.6 kb 다운스트림 확장하는 (도시되지 않음), 다운스트림 신 선별 카세트 (대문자)의 서열을 나타낸다. 서열 식별 번호:6은 신 선별 카세트 (대문자)의 다운스트림 부분과, lox 부위 (대문자 및 볼드체된 이탤릭체), 그 다음 Nhel 부위 (소문자) 사이 접합을 도시하고, 인간화 (대문자)의 마우스 서열 다운스트림이 뒤따르는 핵산 서열이고; 선별 카세트는 2.6 kb 추가 업스트림 확장한다.
마우스 ES 세포는 LTVEC 작제물로 전기천공되었고, 선택 배지상에서 성장되었고 공여체 ES 세포로서 사용되어 도 2에서 묘사된 바와 같이 인간 서열로 내인성 마우스 IL-15 유전자좌에서 대체를 포함한 인간화된 IL-15 마우스를 만들었다. ES 세포의 전기천공 이후, 원상태 대립유전자 검정의 손실 (참조, 예를 들면, Valenzuela 등 (2003), 상기)은 표적화로 인한 내인성 IL-15 서열의 손실을 검출하는데 수행된다.
정확하게 표적화된 ES 세포는 일시적 Cre-발현 벡터로 추가로 전기천공되어 신 약물 선별 카세트를 제거하였다.
인간화된 IL-15 유전자좌를 포함한 공여체 마우스 ES 세포는 VELOCIMOUSE® 방법 (Poueymirou 등 (2007) 즉각적인 표현형 분석을 허용하는 유전자-표적화된 배아 줄기 세포로부터 완전히 유래된 F0 세대 마우스, Nat Biotechnol 25:91-99)에 의해 초기 마우스 배아 속에 도입되었다. 이종접합성 마우스는 수득되었고, 이형접합체는 교배되어 인간화된 IL-15에 관하여 동형접합체를 수득하였다. 인간화된 IL-15 마우스의 2개 버전이 생성되었다 (본원에서 마우스 1 및 마우스 2로서 참조되었다). 추가 분석 이후, 마우스 1 버전은 이의 게놈에서 엑손 중복을 함유하는 것으로 발견되었다. 마우스 2에서 내인성 마우스 IL-15 유전자좌는 도 2에서 묘사된 바와 같이 인간 서열로 대체되었다.
인간 IL-15mRNA 수준은 아래와 같이 결정되었다. 역전사 (RT)-qPCR은 7500 Fast Real-Time PCR 시스템 (Applied Biosystems) 및 SYBR® FAST universal qPCR 키트 (KAPA Biosystems)을 이용하여 수행되었다. 서열-특이적 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 프라이머(Primer)3 소프트웨어를 이용하여 설계되었고 Sigma-Aldrich에 의해 합성되었다. 하기 프라이머가 사용되었다: 마우스 Hprt 정방향: 5'-AGGGATTTGAATCACGTTTG-3'(서열 식별 번호:7), 마우스 Hprt 역방향: 5'-TTTACTGGCAACATCAACAG-3'(서열 식별 번호:8); 인간 Il15 정방향: 5'-GCCCAGGGAAATC AAAAGAT-3'(서열 식별 번호:9), 인간 Il15 역방향: 5'-TGGCTCCAACAAATCAACAG-3'(서열 식별 번호: 10). 상대 발현 값은 비교 역치 사이클 방법을 이용하여 계산되었고 마우스 Hprt로 정규화되었다.
SRG-15 마우스는 (1) 모두 Rag2-/- Il2rgY/- 배경상에서, 인간 IL-15 대체를 포함한 마우스에 인간 SIRPα 대체를 포함한 마우스의 교배에 의해, 또는 (2) (실시예 1에 기재된) Rag2-/- Il2rgY/- 배경상에서 인간 SIRPα 대체를 품은 ES 세포 속에 인간 IL-15를 포함한 큰 표적화 벡터의 도입 및 VELOCIMOUSE® 방법을 이용하여 인간 IL-15 및 SIRPα 유전자 대체 둘 모두 뿐만 아니라 Rag2-/- Il2rgY/-를 품은 ES 세포로부터 마우스 생성에 의해 생성된다. 이종접합성 마우스는 동형접합성으로 교배된다.
결과
도 3A 및 3B에서 실증된 바와 같이, 인간 IL-15 mRNA의 발현의 높은 수준은 비-생착된 SRG-15 마우스 1의 간, 폐, 골수 (BM), 소장 (SI) 및 결장에서 발견되었다. 인간 IL-15 mRNA의 유사하게 높은 수준은 비-생착된 SRG-15 마우스 2의 간, 폐 및 소장에서 발견되었다 (도 3B). 도 4에서 나타낸 바와 같이, 폴리 (I:C)에 의한 자극시, 인간 IL-15 단백질의 높은 수준은 SRG-15 마우스 2의 혈청에서 또한 검출될 수 있고, 여기서 인간 엑손 5-8은 내인성 마우스 엑손을 대체한다.
실시예 3: SRG-15 마우스의 생착
물질 및 방법
SRG 및 SRG-15 마우스는 아래에 기재된 바와 같이 생착된다. 신생아 마우스는 160cGy로 출생 3-5 일 후 마취 없이 치사량 가깝게 조사되고 쉬는 동안 그들의 모체에 되돌린다. 조사 4-12 시간 후 이들 신생아는 30G 바늘을 이용하여 간내로 (i.h.) 25 μl PBS내 CD34+ huHSCs로 이식된다.
결과
면역 세포 발생에 관한 인간 IL-15의 영향을 평가하기 위해, NSG, SRG 및 SRG-15 마우스내 인간 CD45+ 세포 생착이 비교되었다. NSG, SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액에서 인간 조혈 세포의 효율적인 생착은 도 5A에서 나타낸 바와 같이 생착 12-14 주 후 보여졌다. 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2)의 BM, 비장, LN, 간 및 폐에서 인간 CD45+ 세포 수에 의해 입증된 바와 같이 생착을 보여주는 비교는 도 5B에서 제공된다.
마우스 1에서, 인간 CD45+ 세포 생착이 상이하지 않았어도, 인간 NK 세포의 더 높은 백분율 및 수는, 도 6A 및 6B에 의해 예증된 바와 같이, SRG 마우스에 비교된 SRG-15 마우스내 다양한 조직에서 발견되었다. IL-15는 NK 세포 발생 및 생존 뿐만 아니라 그들의 성숙에 중요하다. 도 6C에서 나타낸 바와 같이, SRG-15 마우스 (마우스 1)의 간에서 인간 NK 세포는, SRG 마우스에 비교된 SRG-15 마우스내 증가된 NK 세포 성숙을 나타내는, CD16 및 CD56의 더 높은 발현 수준을 가졌다. 양쪽 인간 NK 세포 서브셋, CD56밝은CD16- 및 CD56어두운CD16+는, 도 6D (비장) (및 데이터 도시되지 않음)에서 나타낸 바와 같이, SRG-15 마우스의 혈액, 비장 및 간에서 존재하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 도 6D에서 나타낸 바와 같이, SRG-15 마우스 (마우스 1)의 비장에서 2개 인간 NK 세포 서브셋의 분석은 이들이 CD158-발현 세포의 더 높은 백분율을 포함한 CD56어두운CD16+ NK 세포 집단으로 살해 저해 수용체의 상이한 발현 수준을 가졌다는 것을 보여주었다. 이는 인간 (데이터 도시되지 않음)의 혈액에서 NK 세포 서브셋에 대하여 밝혀진 것을 닯는다.
SRG-15 마우스 2에 대하여, 림프양 및 비-림프양 조직내 효율적인 인간 NK 세포 생착은 도 7A - 7D에서 나타낸 바와 같이 보여졌다. 도 7A 및 7B는 혈액 및 비장, 각각에서 NK 세포의 백분율을 보여준다. 도 7C 및 7D는 생착 14 주 후 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액, 비장 (SP), 간 및 폐에서 인간 NK 세포의 빈도를 보여준다. 상이한 실험으로부터 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 혈액 및 비장에서 NK 세포 분포 및 백분율을 보여주는 추가 데이터는 도 8 및 9A 각각에서 제공된다. SRG-15 마우스 (마우스 2)의 혈액에서 hCD45+ 세포의 hNKp46 단편에서의 증가는 도 9B에서 보여진다. 도 9C - 9E는 SRG 및 SRG-15 (마우스 2) 마우스의 가슴샘에서 hCD45+ 세포의 비례수, 분포 및 조성물을 보여준다.
인간 및 SRG-15 마우스 (마우스 2)내 NK 세포 서브셋은 특성규명되었다. 도 10A 및 10B에서 나타낸 바와 같이, hCD-56밝은 hCD16- 및 hCD56어두운 hCD16+ 둘 모두의 증가된 수준은 SRG 마우스에 비하여 SRG-15 마우스의 혈액 및 비장에서 보여졌다. 인간에서와 같이, 살해 저해 수용체 (KIRs)의 발현은 SRG-15 마우스 (마우스 2)내 NK 세포 서브셋상에서 보여졌다 (도 10C). 도 1OC는 CD56밝은 CD16- NK 세포 (각각의 플롯에 대하여 좌측 박스) 및 CD56어두운 CD16+ NK 세포 (각각의 플롯에 대하여 우측 박스)를 보여준다. 아래 히스토그램은 그들 서브셋내 CD158 발현을 보여준다. SRG-15 마우스내 NK 세포 서브셋에서 CD158 (KIR2D)는 인간 PBMC-유래된 NK 세포에서 관측되는 것과 유사하다.
SRG-15 마우스의 혈액에서 인간 NK 세포 분포는 2개의 건강한 인간 공여체로부터 수득된 혈액의 것과 비교되었다. 말초 혈액 단핵 세포 (PBMCs)는 Ficoll-Paque에 걸쳐 (하기로부터 수득된: BioreclamationIVT, Westbury, NY) 2개의 개별 공여체의 버피 코트로부터 단리되었고; 혈액 NK 세포의 더 큰 백분율이 인간 공여체로부터 PBMCs에서보다 생착된 SRG-15 마우스에서 관측되었어도, 세포독성 (CD16+) NK 세포 대 IFN-g 생산 (CD16-) NK 세포의 생리적으로 비교할만한 분포는 관측되었다 (도 11).
마지막으로, SRG 및 SRG-15 (마우스 2)의 골수의 분석은 SRG 마우스에 비하여 SRG-15 마우스내 증가된 인간 NK 세포 발생을 보여주었다 (도 12).
SRG-15 마우스내 인간 T 세포 발생에 관한 인간 IL-15의 영향이 또한 평가되었다. SRG 마우스에 비하여 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 비교는 T 세포의 백분율, 수 및/또는 비에 관한 인간 IL-15의 효과가 조직에 따라 다양하였음을 보여주었다 (도 13A). 생착 16 주 후에 림프절의 크기 및 수는, SRG 및 SRG-15 (마우스 1) 마우스의 림프절에서 인간 T 세포의 수가 유사하였다는 결과를 확인하는, SRG와 SRG-15 마우스 사이 상이하지 않았다 (도 13A). 도 13B는, 혈액 및 간 둘 모두에 대하여 SRG 마우스에 비해 SRG-15 마우스 (마우스 1)내 hCD62L- 세포의 증가와 함께, SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 1)에 대하여 혈액 및 간내 인간 CD8+ T 세포 표현형을 보여주었다. SRG 마우스에 비하여 SRG-15 마우스 (마우스 1)의 T 세포를 특성규명한 추가 데이터는, SRG 및 SRG-15 마우스의 폐 (14A) 및 간 (14B)의 CD8+ T 세포에서 조직-상주 마커 CD69의 발현을 보여주는, 도 14A 및 14B에서 제공된다. 상기 데이터는 SRG-15 마우스내 효과기 조직-상주 T 세포의 증가의 증거를 제공한다.
마우스 2에 대하여, SRG 마우스에 비하여 비장, 폐 및 간에서 hCD3+ T 세포의 빈도는, 도 15A 및 15B에서 나타낸 바와 같이, 생착 16 주 후 평가되었다.
실시예 4: SRG-15 마우스내 인간 조직-상주 림프구의 발생
IL-15가 소화관 및 폐에서 상피성 세포에 의해 생산되는 것으로 나타났고 인간 조직-상주 T 및 NK 세포의 발생 및 생존에 중요한 역할을 할 수 있기 때문에, 인간 조직-상주 T 및 NK 세포는 SRG 및 SRG-15 마우스에서 분석되었다.
물질 및 방법
신생아 마우스는 160cGy로 출생 3-5 일 후 마취 없이 치사량 가깝게 조사되고 쉬는 동안 그들의 모체에 되돌린다. 조사 4-12 시간 후 이들 신생아는 30G 바늘을 이용하여 간내로 (i.h.) 25 μl PBS내 CD34+ huHSCs로 이식된다.
결과
도 17A에서 나타낸 바와 같이, 마우스 1내 정상 상태 조건 동안 소장으로부터 상피내 림프구 집단의 단리는 SRG 마우스에 비교된 SRG-15 마우스내 인간 CD45+ 세포의 더 높은 빈도를 드러냈다. 면역조직화학 분석은, 도 17B에서 예증된 바와 같이, 인간 CD45+ NK 세포가 (도 17B에서 화살표로 지정된 바와 같이) SRG-15 마우스 (마우스 1)의 소장의 상피성 세포 층에서 위치하였고, 반면에 아주 적은 상피내 림프구가 SRG 마우스에서 발견되었다는 것을 실증하였다. SRG-15 마우스내 인간 CD8+ IEL는, 조직-상주 T 세포의 전형적인 마커인, CD69의 고 발현을 보여주었다. 인간 IEL (Sathaliyawala T, Kubota M, Yudanin N 등 Immunity 2013; 38: 187-197)과 대조적으로, SRG-15 마우스에서 인간 CD8+ IEL의 하위집단만이 조직-상주 마커 CD103을 발현하였다 (도 17C). 도 16A 및 16B에서 나타낸 바와 같이, SRG-15 마우스 (마우스 1)내 증가된 인간 CD8+ IEL의 표현형은 SRG와 SRG-15 마우스 사이 정상 상태 동안 결장에서 고유층 세포의 수에서 거의 차이가 없음에 따라 특이적이었다. 도 13A에서 나타낸 바와 같이 SRG-15 마우스 1의 폐에서 인간 T 세포의 증가된 수에 더하여, SRG 마우스에 비교된 SRG-15 마우스의 폐에서 인간 CD8+ T 세포상에서 CD69의 더 높은 발현은 또한 도 14A에 의해 보여진 바와 같이 밝혀졌다. 또한, 도 14B는 SRG 마우스에 비교된 SRG-15 마우스 1의 간에서 CD8+ T 세포를 발현한 hCD69의 더 높은 수준을 보여준다.
SRG-15 생착된 마우스 1과 유사한, SRG-15 생착된 마우스 2에서, FACS 분석은 SRG 마우스에 비교된 SRG-15 마우스의 IEL 분획에서 인간 CD45+ 세포의 더 높은 비율을 드러냈다 (도 18A). 또한, LPLs의 수가 SRG와 SRG-15 (마우스 2) 마우스 사이 상당히 변화되지 않았던 반면, IEL에서 유의미한 증가는 SRG 마우스에 비하여 SRG-15 (마우스 2) 마우스에서 보여졌다 (도 18B). SRG-15 마우스 (마우스 2)의 소장에서 hCD3+ 세포의 조성물은 도 18C에서 제공되고 hCD4+ 세포에 비하여 hCD8+의 더 큰 비율을 보여준다. SRG-15 마우스 (마우스 2)의 비장 및 소장에서 hCD3+ hCD8+ T 세포의 표현형 특징은 도 18D에서 제공된다. 면역조직화학 분석은, 도 18E에서 예증된 바와 같이, 인간 CD8+ IEL이 (도 18E에서 화살표로 지정된 바와 같이) SRG-15 마우스의 소장의 상피성 세포 층에서 위치하였고, 반면에 아주 적은 상피내 림프구가 SRG 마우스에서 발견되었다는 것을 증명하였다.
도 18A 및 18B에 관하여 상기 논의된 바와 같이, SRG-15 생착된 마우스 2에서, 더 큰 소화관-관련된 림프양 조직 (GALT) 상주하는 상피내 인간 림프구 재구성 (IEL)은 SRG 마우스에 비교하여 관측되었다 (도 19A 및 19C). 흥미롭게도, 관측된 인간 림프구의 다수는 인간 NK 세포이었다. 정상 인간 GALT 생리학에 대하여 예상대로, 혈액 및 비장 둘 모두내 SRG-15 마우스 2에서 NK 세포의 다수는 세포독성 NK 세포 (CD16+)이었고, 반면에 IEL에서, CD16+ 대 CD16- NK 세포의 비교할만한 분포가 있었다 (도 19B). 생착된 SRG와 SRG-15 마우스 사이 고유층 림프구의 수에서 변화가 없었다 (도 19C). 생착된 SRG-15 마우스 1과 달리, 생착된 SRG-15 마우스 2에서 인간 CD3+ CD8+ IEL의 더 큰 비율이 인간 CD103 마커를 발현시켰다. 페이에르 판은 SRG 마우스에서 완전히 부재였지만 이들은 SRG-15 마우스 2에서 존재하였고 도 20A 및 20B에서 나타낸 바와 같이 인간 림프구와 함께 거주되었다.
실시예 5: 바이러스성 감염 동안 SRG-15 마우스내 인간 조직-상주 T 세포의 기능성 역할의 결정
SRG-15 마우스내 조직-상주 T 세포가 항상성 동안 기능성 관련성을 갖는지 여부를 시험하기 위해, SRG-15 마우스내 인간 CD8+ IEL의 증가된 수가 마우스 장내 미생물총의 조성물에서 특징적인 변화를 유도하는지 여부가 결정되었다.
물질 및 방법
신생아 마우스는 160cGy로 출생 3-5 일 후 마취 없이 치사량 가깝게 조사되고 쉬는 동안 그들의 모체에 되돌린다. 조사 4-12 시간 후 이들 신생아는 30G 바늘을 이용하여 간내로 (i.h.) 25 μl PBS내 CD34+ huHSCs로 이식된다.
생착 4 주 후, SRG-15 마우스는 4 주 동안 SRG 및 공여체 Balb/c 마우스와 코하우징되어 상이한 균주 사이 장내 미생물총을 균일하게 하였다. 마우스는 그 다음 분리되었고 배설물 샘플은 수집되었고 16S rRNA 서열분석에 의해 분석되었다. 도 21 A는 코하우징용 시간표 및 장내 미생물총 서열분석용 배설물 샘플 수집을 제공한다.
결과
21B에서 예증된 바와 같이, 마우스 1에 대하여, 이 결과는, 인간 CD8+ IEL 개발이 정상 상태 조건 동안 주요 변화를 유도하지 않는다는 것을 지시하는, 코하우징 이후 생착된 SRG-15와 SRG 마우스 사이 유의미한 변화가 없었다는 것을 보여준다. 추가 실험은, 급성 로타바이러스 감염을 클리어링하는데 충분한, CD8 IEL가 생착된 SRG-15 마우스내 로타바이러스 감염을 클리어링할 수 있는지 여부를 결정하도록 수행되었다. 도 22에서 나타낸 바와 같이, 결과는 급성 로타바이러스 감염이 생착된 SRG-15 마우스에서 클리어링될 수 있지만 비-생착된 SRG 마우스에서는 아니라는 것을 나타내었다.
실시예 6: SRG-15 마우스 (마우스 2) 및 인간내 NK 세포 서브셋의 분석
SRG-15 (마우스 2) 마우스내 NK 세포 서브셋은 다양한 표현형 마커에 대하여 특성규명되었고 인간과 비교되었다.
물질 및 방법
NK 세포 서브셋은, Yao 등 J. of Immunological Methods 415 (2014) 1-5에서 일반적으로 기재된 바와 같이, 비과시간 (CyTOF)에 의한 세포측정을 통해 검출되었고, 하기를 이용하여 분석되었다: ViSNE (el-AD 등 Nat. Biotechnol. 2013 Jun; 31(6):545-52doi: 10.1038/nbt.2594. Epub 2013 May 19.
결과
도 23A는 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (마우스 2) (n=9)내 CD56밝은 CD16- 및 CO56어두운 CD16+ NK 세포 서브셋의 33 파라미터의 CyTOF-기반 분석을 보여주는 ViSNE 플룻을 제공한다. 각각의 점은 단일 세포를 나타낸다.
도 23B는 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (마우스 2) (n=9)내 CD56밝은 CD16- NK 세포상에서 8 선택된 마커의 발현 강도를 보여주는 ViSNE 플롯을 제공한다.
도 23C 인간 (n=20) 및 SRG-15 마우스 (n=9)내 CO56어두운 CD16+ NK 세포상에서 8 선택된 마커의 발현 강도를 보여주는 ViSNE 플롯. 인간 NK 세포의 33 핵심 분자의 상기 다차원 단일-세포 분석은 SRG-15 마우스에서 발생하는 인간 NK 세포가 건강한 개체내 인간 NK 세포에 고도로 비교할만하다는 것을 나타낸다.
실시예 7: SRG-15 마우스로부터 NK 세포의 세포독성 수용력
물질 및 방법
시험관내 NK 세포독성 연구를 위하여, 인간 HSC-생착된 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 2)로부터 단리된 비장 NK 세포는 밤새 인간 IL-2로 치료되었다. 다음 날, NK 세포는 다양한 효과기 대 표적 비 (E:T)에서 CFSE-표지된, NK-민감한 K562 표적 세포로 배양되었다. 5 시간 공동배양후, K562 세포의 사멸은 (K562를 구별하기 위해 CFSE+ 세포상에 게이팅된 및 그 다음 Topro3에 대하여 퍼센트 양성의 분석) K562 세포에 의한 생존력 염료 Topro3 흡수의 FACS 분석으로 측정되었다.
추가로, 시험관내 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 연구를 위하여, 인간 HSC-생착된 SRG 및 SRG-15 마우스로부터 단리된 비장 NK 세포는 밤새 인간 IL-2로 치료되었다. 다음 날, NK 세포는 다양한 효과기 대 표적 비 (E:T)에서 CFSE-표지된 Raji 표적 세포로 배양되었다. Raji 세포는 항-CD20 (리툭시맙) 또는 대조군 IgG로 사전-치료되었다. 5 시간 공동배양후, Raji 세포의 사멸은 CFSE+ 세포상에서 게이팅된 및 그 다음 Topro3에 대하여 퍼센트 양성의 분석) Raji 세포에 의한 생존력 염료 Topro3 흡수의 FACS 분석으로 측정되었다.
생체내 NK 세포 활성화 연구를 위하여, 인간 HSC-생착된 SRG 및 SRG-15 마우스 (마우스 2)는 50 μg 폴리 IC로 복막내로 주사되었다. 마우스는 (폴리 IC 주사 이전) 및 폴리 IC 주사 후 18 시간 사전-채혈되었다. 인간 CD45+ NKp46+ (NK 세포)는 FACS 전- 및 후-폴리 IC 투여에 의한 활성화 마커 CD69 발현에 대하여 분석되었다.
결과
고전적 NK 세포독성 연구에서, 고전적 NK 표적 HLA 부류 I 결핍된 K562 세포는 SRG 또는 SRG-15 마우스 (마우스 2)로부터 활성화된 NK 세포에 의한 사멸에 적용되었다. 도 24C (좌측)에서 나타낸 바와 같이 SRG 및 SRG-15 마우스로부터 비장 NK 세포는 수로 정규화된 경우 K562 세포에 관하여 비교할만한 세포용해 수용력을 보여주었다.
NK 세포는 B 세포 백혈병 및 림프종에 대해 항-CD20 항체 매개된 ADCC를 전형적으로 책임진다 (참조, 예를 들면, J. Golay 등 Haematologica 2003; 88: 1002-12). 항-CD20 매개된 ADCC를 용이하게 하는 SRG-15 생착된 마우스로부터 NK 세포의 능력을 증명하기 위해, SRG 및 SRG-15 마우스 둘 모두로부터 비장 NK 세포는 시험되었고 세포 수로 정규화된 경우 항-CD20 치료된 Raji 세포에 대해 비교할만한 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 활성을 나타내는 것으로 보여졌다 (도 24C (우측)).
예를 들면, 도 8 및 9에서 묘사된 바와 같이, SRG-15 동물의 양쪽 비장 및 혈액내 NK 세포의 상당한 상향조절이 있다. SRG-15 마우스내 NK 세포의 활성화용 수용력은 폴리-IC 주사 이후 CD69 마커 활성화 측정에 의해 시험되었다. 도 24A에서 나타낸 바와 같이, 활성화 마커 CD69에 대하여 NK 세포 양성의 백분율은 SRG 마우스에 비하여 SRG-15 마우스에서 증가되었다. SRG-15 NK 세포가 정규화된 조건하에 시험관내 SRG NK 세포에 비교할만한 ADCC를 매개한다고 보여졌음에 따라, 생체내 더 큰 활성화된 표현형을 나타내는 SRG-15 NK 세포의 능력, 뿐만 아니라 SRG-15 마우스내 NK 세포의 더 큰 수는 SRG-15 마우스가 인간 NK 세포 ADCC 연구에 적합한 생체내 모델일 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 8: SRG 및 SRG-15 유래된 NK 세포로부터 IFNγ 생산
물질 및 방법
NK 세포는 SRG 또는 SRG-15 마우스의 풀링된 비장세포 (3 비장 / 그룹)로부터 단리되었고 NK 세포는 EasySep Human NK 농축 키트 (StemCell Technologies; Cat #19055)를 이용하여 단리되었다.
NK 세포는 건강한 인간 PBMCs로부터 또한 단리되었다. NK 세포는 1Ong/mL 인간 IL-2로 밤새 치료되었다. 다음 날, 세포는 밤새 1Ong/mL 인간 IL-12p70 또는 2mg/mL 폴리 I:C로 자극되었거나 미치료되었다. 다음 날, 상청액은 수확되었고 IFNg 수준은 Human IFNg Quantikine ELISA 키트 (R&D systems; Cat # DIF50)을 이용하여 평가되었다. NK 세포 순도는 개별 NK 세포에 의해 생산된 피코그램 (pg)으로서 정규화된 FACS 및 IFNg 수준에 의해 분석되었다. 통계 분석은 ANOVA 시험을 이용하여 수행되었다.
결과
도 24B에서 나타낸 바와 같이, SRG 및 SRG-15 유래된 NK 세포는 비교할만한 IFNγ 분비를 갖지만, IL-12p70 치료시 인간 PBMC-유래된 NK 세포 미만이다.
실시예 9: 인간 NK 세포가 SRG-15 마우스내 종양 성장을 저해한다
인간 종양 제노그래프를 침투하는 및 SRG-15 마우스 (마우스 2)에서 종양 성장을 저해하는 인간 NK 세포의 능력이 시험되었다.
물질 및 방법
리툭시맙은 하루 걸러 i.p. 주사되었다 (5 백만 Raji 세포의 s.c. 주사 후 14 일째에 개시되었다). 종양 성장은 캘리퍼스 측정으로 평가되었고 용적은 하기 식: 종양 용적 = 0.5 x (길이 x 폭∧2)를 이용하여 계산되었다. 데이터는 2 독립 실험으로부터 풀링되었다. 통계 분석은 생착된, 미치료된 SRG-15 및 생착된, RTX-치료된 SRG-15 마우스 (* P < 0.05)를 비교하는 비쌍체, 2-테일드 만-휘트니 U-검정을 이용하여 수행되었다.
s.c. 종양은 분쇄되었고 콜라겐분해효소 D (1 시간, 37 C)를 이용하여 소화되었다. 종양 및 면역 세포를 포함한, 회수된 세포는 LSRII 유세포측정기로 분석되었다.
결과
도 25A에서 나타낸 바와 같이, SRG-15 마우스내 인간 NK 세포는 리툭시맙 (RTX)으로 치료 이후 종양 성장을 저해한다. 도 25B는 미치료된 (n=5) 및 RTX-치료된 SRG-15 마우스 (n=1)의 인간 종양 이종이식내 인간 NK 세포 및 T 세포의 빈도를 보여준다. 도 25C는 미치료된 (n=2) 및 RTX-치료된 SRG-15 마우스 (n=1)의 혈액 및 종양에서 인간 NK 세포 서브셋을 보여준다.
실시예 10: 상기 실시예와 관련하여 이용된 추가 물질 및 방법
인간 CD34 + 세포 단리 및 주사. 인간 CD34+ 세포 단리 및 주사는, 예를 들어, Rongvaux A, Willinger T, Martinek J 등 Nat Biotechnol 2014; 32:364-372에서 기재된 방법에 따라 수행되었다.
인간 세포 집단의 유세포측정 분석. 인간 세포 집단의 유세포측정 분석은 Strowig T, Rongvaux A, Rathinam C 등 Proc Natl Acad Sci USA 2011; 108: 13218-13223, 및 Rongvaux A, Willinger T, Martinek J 등 Nat Biotechnol 2014; 32:364-372에서 기재된 바와 같이 수행되었다.
조직학. 조직은 밤새 4% 파라포름알데하이드에 고정되었고, 70% 에탄올에 이동되었고 파라핀에 포매되었다.
정량적 RT-PCR. 정량적 RT-PCR은 Rongvaux A, Willinger T, Martinek J 등 Nat Biotechnol 2014; 32:364-372에서 기재된 바와 같이 수행되었다.
16S rRNA 서열분석. 16S rRNA 서열분석은 Palm NW, de Zoete MR, Cullen TW 등 Cell 2014; 158: 1000-1010에서 기재된 바와 같이 수행되었다.
바이러스성 감염. 로타바이러스 및 인플루엔자 바이러스는 수득되었고 대상 방법에 적용되었다.
통계 분석. 통계적 유의도는 2-테일드 비쌍체 스튜던트 t-검정을 이용하여 Prism 6 소프트웨어 (GraphPad)로 수행되었다.
FACS 항체는 BD Biosciences 및 BioLegend에서 수득되었다.
상술한 것은 본 발명의 원리를 단지 예시한다. 당해 분야의 숙련가가, 본원에서 명백하게 기재되지 않거나 보이지 않아도, 본 발명의 원리를 구현하고 이의 정신 및 범위 내에 포함되는 다양한 배열을 고안할 수 있을 것이라는 것이 인정될 것이다. 더욱이, 본원에서 인용된 모든 예 및 조건적 언어는 본 발명의 원리 및 발명자들에 의해 기여된 개념 이해에서 독자를 돕도록 주요하게 의도되고, 상기 구체적으로 인용된 예 및 조건인 것으로 제한 없이 해석되어야 한다. 또한, 본 발명의 원리, 측면, 및 구현예 뿐만 아니라 이들의 구체적인 예를 인용한 본원에서 모든 서술은 이들의 구조적 및 기능적 등가물 모두를 포함하도록 의도된다. 추가로, 상기 등가물이 현재 공지된 등가물 및 미래에서 개발된 등가물 모두, 즉, 구조와 무관하게, 동일한 기능을 수행하는 개발된 임의의 요소를 포함하는 것이 의도된다. 본 발명의 범위는, 따라서, 본원에서 기재된 및 보여진 예시적인 구현예로 제한되도록 의도되지 않는다. 오히려, 본 발명의 범위 및 정신은 첨부된 청구항에 의해 형체화된다.
추가 서열 정보
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Herndler-Brandstetter, Dietmar
Flavell, Richard
Frleta, Davor
Gurer, Cagan
Manz, Markus
Murphy, Andrew J.
Palm, Noah W.
Shan, Liang
Stevens, Sean
Strowig, Till
Yancopoulos, George D.
de Zoete, Marcel
<120> GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMALS AND METHODS OF USE THEREOF
<130> REGN-016WO
<150> US62/146938
<151> 2015-04-13
<150> US62/148667
<151> 2015-04-16
<150> US62/287842
<151> 2016-01-27
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
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<213> Homo sapiens
<400> 11
tccggcccgc acccaccccc aagaggggcc ttcagctttg gggctcagag gcacgacctc 60
ctggggaggg ttaaaaggca gacgcccccc cgccccccgc gcccccgcgc cccgactcct 120
tcgccgcctc cagcctctcg ccagtgggaa gcggggagca gccgcgcggc cggagtccgg 180
aggcgagggg aggtcggccg caacttcccc ggtccacctt aagaggacga tgtagccagc 240
tcgcagcgct gaccttagaa aaacaagttt gcgcaaagtg gagcggggac ccggcctctg 300
ggcagccccg gcggcgcttc cagtgccttc cagccctcgc gggcggcgca gccgcggccc 360
atggagcccg ccggcccggc ccccggccgc ctcgggccgc tgctctgcct gctgctcgcc 420
gcgtcctgcg cctggtcagg agtggcgggt gaggaggagc tgcaggtgat tcagcctgac 480
aagtccgtgt tggttgcagc tggagagaca gccactctgc gctgcactgc gacctctctg 540
atccctgtgg ggcccatcca gtggttcaga ggagctggac caggccggga attaatctac 600
aatcaaaaag aaggccactt cccccgggta acaactgttt cagacctcac aaagagaaac 660
aacatggact tttccatccg catcggtaac atcaccccag cagatgccgg cacctactac 720
tgtgtgaagt tccggaaagg gagccccgat gacgtggagt ttaagtctgg agcaggcact 780
gagctgtctg tgcgcgccaa accctctgcc cccgtggtat cgggccctgc ggcgagggcc 840
acacctcagc acacagtgag cttcacctgc gagtcccacg gcttctcacc cagagacatc 900
accctgaaat ggttcaaaaa tgggaatgag ctctcagact tccagaccaa cgtggacccc 960
gtaggagaga gcgtgtccta cagcatccac agcacagcca aggtggtgct gacccgcgag 1020
gacgttcact ctcaagtcat ctgcgaggtg gcccacgtca ccttgcaggg ggaccctctt 1080
cgtgggactg ccaacttgtc tgagaccatc cgagttccac ccaccttgga ggttactcaa 1140
cagcccgtga gggcagagaa ccaggtgaat gtcacctgcc aggtgaggaa gttctacccc 1200
cagagactac agctgacctg gttggagaat ggaaacgtgt cccggacaga aacggcctca 1260
accgttacag agaacaagga tggtacctac aactggatga gctggctcct ggtgaatgta 1320
tctgcccaca gggatgatgt gaagctcacc tgccaggtgg agcatgacgg gcagccagcg 1380
gtcagcaaaa gccatgacct gaaggtctca gcccacccga aggagcaggg ctcaaatacc 1440
gccgctgaga acactggatc taatgaacgg aacatctata ttgtggtggg tgtggtgtgc 1500
accttgctgg tggccctact gatggcggcc ctctacctcg tccgaatcag acagaagaaa 1560
gcccagggct ccacttcttc tacaaggttg catgagcccg agaagaatgc cagagaaata 1620
acacaggaca caaatgatat cacatatgca gacctgaacc tgcccaaggg gaagaagcct 1680
gctccccagg ctgcggagcc caacaaccac acggagtatg ccagcattca gaccagcccg 1740
cagcccgcgt cggaggacac cctcacctat gctgacctgg acatggtcca cctcaaccgg 1800
acccccaagc agccggcccc caagcctgag ccgtccttct cagagtacgc cagcgtccag 1860
gtcccgagga agtgaatggg accgtggttt gctctagcac ccatctctac gcgctttctt 1920
gtcccacagg gagccgccgt gatgagcaca gccaacccag ttcccggagg gctggggcgg 1980
tgcaggctct gggacccagg ggccagggtg gctcttctct ccccacccct ccttggctct 2040
ccagcacttc ctgggcagcc acggccccct ccccccacat tgccacatac ctggaggctg 2100
acgttgccaa accagccagg gaaccaacct gggaagtggc cagaactgcc tggggtccaa 2160
gaactcttgt gcctccgtcc atcaccatgt gggttttgaa gaccctcgac tgcctccccg 2220
atgctccgaa gcctgatctt ccagggtggg gaggagaaaa tcccacctcc cctgacctcc 2280
accacctcca ccaccaccac caccaccacc accaccacta ccaccaccac ccaactgggg 2340
ctagagtggg gaagatttcc cctttagatc aaactgcccc ttccatggaa aagctggaaa 2400
aaaactctgg aacccatatc caggcttggt gaggttgctg ccaacagtcc tggcctcccc 2460
catccctagg ctaaagagcc atgagtcctg gaggaggaga ggacccctcc caaaggactg 2520
gagacaaaac cctctgcttc cttgggtccc tccaagactc cctggggccc aactgtgttg 2580
ctccacccgg acccatctct cccttctaga cctgagcttg cccctccagc tagcactaag 2640
caacatctcg ctgtggacgc ctgtaaatta ctgagaaatg tgaaacgtgc aatcttgaaa 2700
ctgaggtgtt agaaaacttg atctgtggtg ttttgttttg ttttttttct taaaacaaca 2760
gcaacgtgat cttggctgtc tgtcatgtgt tgaagtccat ggttgggtct tgtgaagtct 2820
gaggtttaac agtttgttgt cctggaggga ttttcttaca gcgaagactt gagttcctcc 2880
aagtcccaga accccaagaa tgggcaagaa ggatcaggtc agccactccc tggagacaca 2940
gccttctggc tgggactgac ttggccatgt tctcagctga gccacgcggc tggtagtgca 3000
gccttctgtg accccgctgt ggtaagtcca gcctgcccag ggctgctgag ggctgcctct 3060
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gtgaagatga cacccctccc caccacctct cataagcact ttaggaacac acagagggta 3180
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tgagctgatc cttgaagaag aaatcttcca tttctgctct caaaccctac tgggatcaaa 3300
ctggaataaa ttgaagacag ccagggggat ggtgcagctg tgaagctcgg gctgattccc 3360
cctctgtccc agaaggttgg ccagagggtg tgacccagtt accctttaac ccccaccctt 3420
ccagtcgggt gtgagggcct gaccgggccc agggcaagca gatgtcgcaa gccctattta 3480
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gatgcccaag ggatttctgg ctcaggctgt aaaagtagct gagccatcct gcccattcct 3600
ggaggtccta caggtgaaac tgcaggagct cagcatagac ccagctctct gggggatggt 3660
cacctggtga tttcaatgat ggcatccagg aattagctga gccaacagac catgtggaca 3720
gctttggcca gagctcccgt gtggcatctg ggagccacag tgacccagcc acctggctca 3780
ggctagttcc aaattccaaa agattggctt gtaaaccttc gtctccctct cttttaccca 3840
gagacagcac atacgtgtgc acacgcatgc acacacacat tcagtatttt aaaagaatgt 3900
tttcttggtg ccattttcat tttattttat tttttaattc ttggaggggg aaataaggga 3960
ataaggccaa ggaagatgta tagctttagc tttagcctgg caacctggag aatccacata 4020
ccttgtgtat tgaaccccag gaaaaggaag aggtcgaacc aaccctgcgg aaggagcatg 4080
gtttcaggag tttattttaa gactgctggg aaggaaacag gccccatttt gtatatagtt 4140
gcaacttaaa ctttttggct tgcaaaatat ttttgtaata aagatttctg ggtaataatg 4200
a 4201
<210> 12
<211> 504
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ala Ser Cys Ala Trp Ser Gly Val Ala Gly Glu Glu
20 25 30
Glu Leu Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Leu Val Ala Ala Gly
35 40 45
Glu Thr Ala Thr Leu Arg Cys Thr Ala Thr Ser Leu Ile Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Gly Arg Glu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Asn Gln Lys Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser Asp Leu
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Gly Asn Ile Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys Gly Ser
115 120 125
Pro Asp Asp Val Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser Val
130 135 140
Arg Ala Lys Pro Ser Ala Pro Val Val Ser Gly Pro Ala Ala Arg Ala
145 150 155 160
Thr Pro Gln His Thr Val Ser Phe Thr Cys Glu Ser His Gly Phe Ser
165 170 175
Pro Arg Asp Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asn Gly Asn Glu Leu Ser
180 185 190
Asp Phe Gln Thr Asn Val Asp Pro Val Gly Glu Ser Val Ser Tyr Ser
195 200 205
Ile His Ser Thr Ala Lys Val Val Leu Thr Arg Glu Asp Val His Ser
210 215 220
Gln Val Ile Cys Glu Val Ala His Val Thr Leu Gln Gly Asp Pro Leu
225 230 235 240
Arg Gly Thr Ala Asn Leu Ser Glu Thr Ile Arg Val Pro Pro Thr Leu
245 250 255
Glu Val Thr Gln Gln Pro Val Arg Ala Glu Asn Gln Val Asn Val Thr
260 265 270
Cys Gln Val Arg Lys Phe Tyr Pro Gln Arg Leu Gln Leu Thr Trp Leu
275 280 285
Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Thr Glu Thr Ala Ser Thr Val Thr Glu
290 295 300
Asn Lys Asp Gly Thr Tyr Asn Trp Met Ser Trp Leu Leu Val Asn Val
305 310 315 320
Ser Ala His Arg Asp Asp Val Lys Leu Thr Cys Gln Val Glu His Asp
325 330 335
Gly Gln Pro Ala Val Ser Lys Ser His Asp Leu Lys Val Ser Ala His
340 345 350
Pro Lys Glu Gln Gly Ser Asn Thr Ala Ala Glu Asn Thr Gly Ser Asn
355 360 365
Glu Arg Asn Ile Tyr Ile Val Val Gly Val Val Cys Thr Leu Leu Val
370 375 380
Ala Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Val Arg Ile Arg Gln Lys Lys
385 390 395 400
Ala Gln Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn
405 410 415
Ala Arg Glu Ile Thr Gln Asp Thr Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu
420 425 430
Asn Leu Pro Lys Gly Lys Lys Pro Ala Pro Gln Ala Ala Glu Pro Asn
435 440 445
Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Gln Thr Ser Pro Gln Pro Ala Ser
450 455 460
Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Asn Arg
465 470 475 480
Thr Pro Lys Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr
485 490 495
Ala Ser Val Gln Val Pro Arg Lys
500
<210> 13
<211> 4109
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 13
ctctctggcc gcccctggct ttatttctcg cgcgcttggg gtctctccca gtctccgtct 60
ctccatttct cctggggggc ggggaggggg ggtctccaaa aaccgcggcg gcggcggcgg 120
ccgctccagg cgcccgttcc ggagtcgggg ggaggcccag ccgggagggg ggaagggggg 180
gagccttagt catttccccg ctccagcctg ctcccgcccg agcgcgcact cacggccgct 240
ctccctcctc gctccgcagc cgcggcccat ggagcccgcc ggcccggccc ccggccgcct 300
cgggccgctg ctctgcctgc tgctcgccgc gtcctgcgcc tggtcaggag tggcgggtga 360
ggaggagctg caggtgattc agcctgacaa gtccgtgttg gttgcagctg gagagacagc 420
cactctgcgc tgcactgcga cctctctgat ccctgtgggg cccatccagt ggttcagagg 480
agctggacca ggccgggaat taatctacaa tcaaaaagaa ggccacttcc cccgggtaac 540
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caccccagca gatgccggca cctactactg tgtgaagttc cggaaaggga gccccgatga 660
cgtggagttt aagtctggag caggcactga gctgtctgtg cgcgccaaac cctctgcccc 720
cgtggtatcg ggccctgcgg cgagggccac acctcagcac acagtgagct tcacctgcga 780
gtcccacggc ttctcaccca gagacatcac cctgaaatgg ttcaaaaatg ggaatgagct 840
ctcagacttc cagaccaacg tggaccccgt aggagagagc gtgtcctaca gcatccacag 900
cacagccaag gtggtgctga cccgcgagga cgttcactct caagtcatct gcgaggtggc 960
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cacctgccag gtgaggaagt tctaccccca gagactacag ctgacctggt tggagaatgg 1140
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ctggatgagc tggctcctgg tgaatgtatc tgcccacagg gatgatgtga agctcacctg 1260
ccaggtggag catgacgggc agccagcggt cagcaaaagc catgacctga aggtctcagc 1320
ccacccgaag gagcagggct caaataccgc cgctgagaac actggatcta atgaacggaa 1380
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gtccttctca gagtacgcca gcgtccaggt cccgaggaag tgaatgggac cgtggtttgc 1800
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caacccagtt cccggagggc tggggcggtg caggctctgg gacccagggg ccagggtggc 1920
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gttttgaaga ccctcgactg cctccccgat gctccgaagc ctgatcttcc agggtgggga 2160
ggagaaaatc ccacctcccc tgacctccac cacctccacc accaccacca ccaccaccac 2220
caccactacc accaccaccc aactggggct agagtgggga agatttcccc tttagatcaa 2280
actgcccctt ccatggaaaa gctggaaaaa aactctggaa cccatatcca ggcttggtga 2340
ggttgctgcc aacagtcctg gcctccccca tccctaggct aaagagccat gagtcctgga 2400
ggaggagagg acccctccca aaggactgga gacaaaaccc tctgcttcct tgggtccctc 2460
caagactccc tggggcccaa ctgtgttgct ccacccggac ccatctctcc cttctagacc 2520
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gagaaatgtg aaacgtgcaa tcttgaaact gaggtgttag aaaacttgat ctgtggtgtt 2640
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<210> 14
<211> 3868
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 14
cgctcgctcg cagagaagcc gcggcccatg gagcccgccg gcccggcccc cggccgcctc 60
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cttctctccc cacccctcct tggctctcca gcacttcctg ggcagccacg gccccctccc 1740
cccacattgc cacatacctg gaggctgacg ttgccaaacc agccagggaa ccaacctggg 1800
aagtggccag aactgcctgg ggtccaagaa ctcttgtgcc tccgtccatc accatgtggg 1860
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ttagtgaccg cccccatccc ggctttctga gctgatcctt gaagaagaaa tcttccattt 2940
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catagaccca gctctctggg ggatggtcac ctggtgattt caatgatggc atccaggaat 3360
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aaccttcgtc tccctctctt ttacccagag acagcacata cgtgtgcaca cgcatgcaca 3540
cacacattca gtattttaaa agaatgtttt cttggtgcca ttttcatttt attttatttt 3600
ttaattcttg gagggggaaa taagggaata aggccaagga agatgtatag ctttagcttt 3660
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tcgaaccaac cctgcggaag gagcatggtt tcaggagttt attttaagac tgctgggaag 3780
gaaacaggcc ccattttgta tatagttgca acttaaactt tttggcttgc aaaatatttt 3840
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<210> 15
<211> 4031
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 15
cgggaaggtg cgggcgcgag gagggggcgc tcggccgggc cgccctcgcg ctggcctcgc 60
gacggctccg cacagcccgc actcgctctg cgagctgtcc ccgctcgcgc ttgctctccg 120
atctccgtcc ccgctccctc tccctcttcc tctccccctc tttccttctc cctcgctatc 180
cgctcccccg cccccgtgcc tctggctctg cgcctggctc cctcgggtcc gctccccttt 240
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tcttttcttt ttaatttctt tttctttttt gatttttttt ctttccctta aaacaacagc 2760
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<212> PRT
<213> Mus musculus
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Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys
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Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
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Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser
115 120 125
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130 135 140
Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe
165 170 175
Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu
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His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn
210 215 220
Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro
225 230 235 240
Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr
245 250 255
Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu
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Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp
275 280 285
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr
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Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn
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Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His
325 330 335
Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala
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355 360 365
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370 375 380
Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Ile Gln Asp Thr Asn Asp Ile Asn
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Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu Lys Lys Pro Ala
435 440 445
Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu
450 455 460
Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu
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Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro
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Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg Lys
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<212> DNA
<213> Mus musculus
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gcaaaccaga acttgtcttt gtccgggcca tgttcttggg ctgtcttcta attccaaagg 3660
gttggttggt aaagctccac ccccttctcc tctgcctaaa gacatcacat gtgtatacac 3720
acacgggtgt atagatgagt taaaagaatg tcctcgctgg catcctaatt ttgtcttaag 3780
tttttttgga gggagaaagg aacaaggcaa gggaagatgt gtagctttgg ctttaaccag 3840
gcagcctggg ggctcccaag cctatggaac cctggtacaa agaagagaac agaagcgccc 3900
tgtgaggagt gggatttgtt tttctgtaga ccagatgaga aggaaacagg ccctgttttg 3960
tacatagttg caacttaaaa tttttggctt gcaaaatatt tttgtaataa agatttctgg 4020
gtaacaataa aaaaaaaaaa aaa 4043
<210> 20
<211> 513
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 20
Met Glu Pro Ala Gly Pro Ala Pro Gly Arg Leu Gly Pro Leu Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys
20 25 30
Glu Leu Lys Val Thr Gln Pro Glu Lys Ser Val Ser Val Ala Ala Gly
35 40 45
Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly
50 55 60
Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr
85 90 95
Thr Lys Arg Asn Asn Met Asp Phe Ser Ile Arg Ile Ser Asn Val Thr
100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Ala Lys Pro Ser Pro Pro Glu Val Ser Gly Pro Ala Asp Arg
145 150 155 160
Gly Ile Pro Asp Gln Lys Val Asn Phe Thr Cys Lys Ser His Gly Phe
165 170 175
Ser Pro Arg Asn Ile Thr Leu Lys Trp Phe Lys Asp Gly Gln Glu Leu
180 185 190
His Pro Leu Glu Thr Thr Val Asn Pro Ser Gly Lys Asn Val Ser Tyr
195 200 205
Asn Ile Ser Ser Thr Val Arg Val Val Leu Asn Ser Met Asp Val Asn
210 215 220
Ser Lys Val Ile Cys Glu Val Ala His Ile Thr Leu Asp Arg Ser Pro
225 230 235 240
Leu Arg Gly Ile Ala Asn Leu Ser Asn Phe Ile Arg Val Ser Pro Thr
245 250 255
Val Lys Val Thr Gln Gln Ser Pro Thr Ser Met Asn Gln Val Asn Leu
260 265 270
Thr Cys Arg Ala Glu Arg Phe Tyr Pro Glu Asp Leu Gln Leu Ile Trp
275 280 285
Leu Glu Asn Gly Asn Val Ser Arg Asn Asp Thr Pro Lys Asn Leu Thr
290 295 300
Lys Asn Thr Asp Gly Thr Tyr Asn Tyr Thr Ser Leu Phe Leu Val Asn
305 310 315 320
Ser Ser Ala His Arg Glu Asp Val Val Phe Thr Cys Gln Val Lys His
325 330 335
Asp Gln Gln Pro Ala Ile Thr Arg Asn His Thr Val Leu Gly Phe Ala
340 345 350
His Ser Ser Asp Gln Gly Ser Met Gln Thr Phe Pro Asp Asn Asn Ala
355 360 365
Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val Gly Val Ala Cys Ala Leu
370 375 380
Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr Leu Leu Arg Ile Lys Gln
385 390 395 400
Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr Arg Leu His Glu Pro Glu
405 410 415
Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln Ser Leu Ile Gln Asp Thr
420 425 430
Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp Leu Asn Leu Pro Lys Glu
435 440 445
Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr
450 455 460
Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr
465 470 475 480
Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro
485 490 495
Lys Pro Glu Pro Ser Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg
500 505 510
Lys
<210> 21
<211> 3845
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 21
aagctcccct gccgcgggca gcctcttgcc cactggagtc taaggactgg ccgggtgaga 60
ggccgagacc agggggcgat cggccgccac ttccccagtc caccttaaga ggaccaagta 120
gccagcccgc cgcgccgacc tcagaaaaac aagtttgcgc aaagtggtgc gcggccagcc 180
tctgggcaga gggagcggtg cttccaccgc ctggcagccc tgcgcgcggc ggcgcagccg 240
cggcccatgg agcccgccgg cccggcccct ggccgcctag ggccgctgct gctctgcctg 300
ctgctctccg cgtcctgttt ctgtacagga gccacgggga aggaactgaa ggtgactcag 360
cctgagaaat cagtgtctgt tgctgctggg gattcgaccg ttctgaactg cactttgacc 420
tccttgttgc cggtgggacc cattaggtgg tacagaggag tagggccaag ccggctgttg 480
atctacagtt tcgcaggaga atacgttcct cgaattagaa atgtttcaga tactactaag 540
agaaacaata tggacttttc catccgtatc agtaatgtca ccccagcaga tgctggcatc 600
tactactgtg tgaagttcca gaaaggatca tcagagcctg acacagaaat acaatctgga 660
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gacaggggca tacctgacca gaaagtgaac ttcacctgca agtctcatgg cttctctccc 780
cggaatatca ccctgaagtg gttcaaagat gggcaagaac tccacccctt ggagaccacc 840
gtgaacccta gtggaaagaa tgtctcctac aacatctcca gcacagtcag ggtggtacta 900
aactccatgg atgttaattc taaggtcatc tgcgaggtag cccacatcac cttggataga 960
agccctcttc gtgggattgc taacctgtct aacttcatcc gagtttcacc caccgtgaag 1020
gtcacccaac agtccccgac gtcaatgaac caggtgaacc tcacctgccg ggctgagagg 1080
ttctaccccg aggatctcca gctgatctgg ctggagaatg gaaacgtatc acggaatgac 1140
acgcccaaga atctcacaaa gaacacggat gggacctata attacacaag cttgttcctg 1200
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ctcacctatg ctgacctgga catggtccac ctcagccggg cacagccagc ccccaagcct 1740
gagccatctt tctcagagta tgctagtgtc caggtccaga ggaagtgaat ggggctgtgg 1800
tctgtactag gccccatccc cacaagtttt cttgtcctac atggagtggc catgacgagg 1860
acatccagcc agccaatcct gtccccagaa ggccaggtgg cacgggtcct aggaccaggg 1920
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ctttttaatt tctttttctt ttttgatttt ttttctttcc cttaaaacaa cagcagcagc 2580
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aaaaa 3845
<210> 22
<211> 3389
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 22
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<213> Mus musculus
<400> 23
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Cys Leu Leu Leu Ser Ala Ser Cys Phe Cys Thr Gly Ala Thr Gly Lys
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Asp Ser Thr Val Leu Asn Cys Thr Leu Thr Ser Leu Leu Pro Val Gly
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Pro Ile Arg Trp Tyr Arg Gly Val Gly Pro Ser Arg Leu Leu Ile Tyr
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Ser Phe Ala Gly Glu Tyr Val Pro Arg Ile Arg Asn Val Ser Asp Thr
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100 105 110
Pro Ala Asp Ala Gly Ile Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Gln Lys Gly Ser
115 120 125
Ser Glu Pro Asp Thr Glu Ile Gln Ser Gly Gly Gly Thr Glu Val Tyr
130 135 140
Val Leu Asp Asn Asn Ala Thr His Asn Trp Asn Val Phe Ile Gly Val
145 150 155 160
Gly Val Ala Cys Ala Leu Leu Val Val Leu Leu Met Ala Ala Leu Tyr
165 170 175
Leu Leu Arg Ile Lys Gln Lys Lys Ala Lys Gly Ser Thr Ser Ser Thr
180 185 190
Arg Leu His Glu Pro Glu Lys Asn Ala Arg Glu Ile Thr Gln Val Gln
195 200 205
Ser Leu Ile Gln Asp Thr Asn Asp Ile Asn Asp Ile Thr Tyr Ala Asp
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Leu Asn Leu Pro Lys Glu Lys Lys Pro Ala Pro Arg Ala Pro Glu Pro
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Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu Thr Gly Lys Val Pro Arg
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Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp Met Val His Leu Ser
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275 280 285
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<211> 3020
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 24
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ctccagctag cactaactca gcagcatcgc tctgtggacg cctgtaaatt attgagaaat 1620
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atggctactg tggtaagtgc agccttgtct gacccaatgc tgacctaatg ttggccattc 2040
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tttgccagca aacctcagca ggatcacact ggaacagaac ctggtcatac ctgtgacaac 2220
acagctgtga gccagggcaa accacccact gtcactggct cgagagtctg ggcagaggct 2280
ctgaccctcc accctttaaa ctggatgccg gggcctggct gggcccaatg ccaagtggtt 2340
atggcaaccc tgactatctg gtcttaacat gtagctcagg aagtggaggc gctaatgtcc 2400
ccaatccctg gggattcctg attccagcta ttcatgtaag cagagccaac ctgcctattt 2460
ctgtaggtgc gactgggatg ttaggagcac agcaaggacc cagctctgta gggctggtga 2520
cctgatactt ctcataatgg catctagaag ttaggctgag ttggcctcac tggcccagca 2580
aaccagaact tgtctttgtc cgggccatgt tcttgggctg tcttctaatt ccaaagggtt 2640
ggttggtaaa gctccacccc cttctcctct gcctaaagac atcacatgtg tatacacaca 2700
cgggtgtata gatgagttaa aagaatgtcc tcgctggcat cctaattttg tcttaagttt 2760
ttttggaggg agaaaggaac aaggcaaggg aagatgtgta gctttggctt taaccaggca 2820
gcctgggggc tcccaagcct atggaaccct ggtacaaaga agagaacaga agcgccctgt 2880
gaggagtggg atttgttttt ctgtagacca gatgagaagg aaacaggccc tgttttgtac 2940
atagttgcaa cttaaaattt ttggcttgca aaatattttt gtaataaaga tttctgggta 3000
acaataaaaa aaaaaaaaaa 3020
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<213> Mus musculus
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100 105 110
Arg Ala Pro Glu Pro Asn Asn His Thr Glu Tyr Ala Ser Ile Glu Thr
115 120 125
Gly Lys Val Pro Arg Pro Glu Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Asp Leu Asp
130 135 140
Met Val His Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Pro Lys Pro Glu Pro Ser
145 150 155 160
Phe Ser Glu Tyr Ala Ser Val Gln Val Gln Arg Lys
165 170
<210> 26
<211> 3393
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 26
actctaccct gcagccttca gcttggcaca aactaaacag tgactcttcc ccaagtgccg 60
agtttaattc ctggcttggc cgaaaggatt cagagaggga taagcagccc ctctggcctt 120
cagtgccaaa ataagaaaga gtatttcaca tccacaagca ggaagtacac ttcatacctc 180
tctaagataa aagacctatt cacaatcaaa aatgtccctg cagatggtaa cagtgggtca 240
taacatagcc ttaattcaac caggcttctc acttatgaat tttgatggcc aagttttctt 300
ctttggccag aaaggctggc ctaagagatc ctgtcctact ggagtctttc attttgatat 360
aaaacaaaat catctcaaac tgaagcctgc aatcttctct aaagattcct gctacctccc 420
acctcttcgt tatccagcta cttgctcata caaaggcagc atagactctg acaagcatca 480
atatatcatt cacggaggga aaacaccaaa caatgagctt tccgataaga tttatatcat 540
gtctgtcgct tgcaagaata acaaaaaagt tactttccgt tgcacagaga aagacttagt 600
aggagatgtc cctgaaccca gatacggcca ttccattgac gtggtgtata gtcgagggaa 660
aagcatgggt gttctctttg gaggacgttc atacatgcct tctacccaga gaaccacaga 720
aaaatggaat agtgtagctg actgcctacc ccatgttttc ttgatagatt ttgaatttgg 780
gtgtgctaca tcatatattc tcccagaact tcaggatggg ctgtcttttc atgtttctat 840
tgccagaaac gataccgttt atattttggg aggacactca cttgccagta atatacgccc 900
tgctaacttg tatagaataa gagtggacct tcccctgggt accccagcag tgaattgcac 960
agtcttgcca ggaggaatct ctgtctccag tgcaatcctc actcaaacaa acaatgatga 1020
atttgttatt gtgggtggtt atcagctgga aaatcagaaa aggatggtct gcagccttgt 1080
ctctctaggg gacaacacga ttgaaatcag tgagatggag actcctgact ggacctcaga 1140
tattaagcat agcaaaatat ggtttggaag caacatggga aacgggacta ttttccttgg 1200
cataccagga gacaataagc aggctatgtc agaagcattc tatttctata ctttgagatg 1260
ctctgaagag gatttgagtg aagatcagaa aattgtctcc aacagtcaga catcaacaga 1320
agatcctggg gactccactc cctttgaaga ctcagaggaa ttttgtttca gtgctgaagc 1380
aaccagtttt gatggtgacg atgaatttga cacctacaat gaagatgatg aagatgacga 1440
gtctgtaacc ggctactgga taacatgttg ccctacttgt gatgttgaca tcaatacctg 1500
ggttccgttc tattcaacgg agctcaataa acccgccatg atctattgtt ctcatgggga 1560
tgggcactgg gtacatgccc agtgcatgga tttggaagaa cgcacactca tccacttgtc 1620
agaaggaagc aacaagtatt attgcaatga acatgtacag atagcaagag cattgcaaac 1680
tcccaaaaga aaccccccct tacaaaaacc tccaatgaaa tccctccaca aaaaaggctc 1740
tgggaaagtc ttgactcctg ccaagaaatc cttccttaga agactgtttg attaatttag 1800
caaaagcccc tcagactcag gtatattgct ctctgaatct actttcaatc ataaacatta 1860
ttttgatttt tgtttactga aatctctatg ttatgtttta gttatgtgaa ttaagtgctg 1920
ttgtgattta ttgttaagta taactattct aatgtgtgtt ttttaacatc ttatccagga 1980
atgtcttaaa tgagaaatgt tatacagttt tccattaagg atatcagtga taaagtatag 2040
aactcttaca ttattttgta acaatctaca tattgaatag taactaaata ccaataaata 2100
aactaatgca caaaaagtta agttcttttg tgtaataagt agcctatagt tggtttaaac 2160
agttaaaacc aacagctata tcccacacta ctgctgttta taaattttaa ggtggcctct 2220
ggtttatact tatgagcaga attatatata ttggtcaata ccatgaagaa aaatttaatt 2280
ctatatcaag ccaggcatgg tgatggtgat acatgcctgt aatcctggca cttaggaagt 2340
ggaagaagga agtttgtgag tttgatgctt gttgaggtat gaccttttgc tatgtattgt 2400
agtgtatgag ccccaagacc tgcttgaccc agagacaaga gagtccacac atagatccaa 2460
gtaatgctat gtgaccttgc cccccggtta cttgtgatta ggtgaataaa gatgtcaaca 2520
gccaatagct gggcagaaga gccaaaagtg gggattgagg gtaccctggc ttgatgtagg 2580
aggagaccat gaggaaaggg gagaaaaaag tgatggagga ggagaaagat gccatgagct 2640
aggagttaag aaagcatggc catgagtgct ggccaattgg agttaagagc agcccagatg 2700
aaacatagta agtaataact cagggttatc gatagaaaat agattttagt gccgtactct 2760
ccccagccct agagctgact atggcttact gtaaatataa agtttgtatg tgtcttttat 2820
ccaggaacta aatggtcaaa ggtggagtag aaactctgga ttgggattaa atttttctac 2880
aacaaatgct ggcctgggct agattttatc tcatatccga aggctgacag aacacagagc 2940
actggtaaca ttgccacctg ccatgcacaa agacctgagt ctaatactgt ggacattttc 3000
ttgaagtatc tacatgtact tctggagtga aaacatattc caacaatatg cctttgttta 3060
aatcactcac tcactttggg ccctcacatt atatcctttc aaaatcaatg gttcacccct 3120
ttgaaaatgc ttagccatag tccctcatct tccttaaaga cagttgtcat ctctggaaat 3180
agtcacatgt cattcaaggt ccaatactgt gcagctctga agtatggcat taccacttta 3240
agtgaaaagt gaaatatgaa catgagctca gacaaaggtt tgggactatc actctcaagg 3300
aggctctact gctaagtcct gaactgcttt cacatgaata cagaaattat aacaaaaaat 3360
atgtaatcaa taaaaagaaa actttcatat tcc 3393
<210> 27
<211> 527
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 27
Met Ser Leu Gln Met Val Thr Val Gly His Asn Ile Ala Leu Ile Gln
1 5 10 15
Pro Gly Phe Ser Leu Met Asn Phe Asp Gly Gln Val Phe Phe Phe Gly
20 25 30
Gln Lys Gly Trp Pro Lys Arg Ser Cys Pro Thr Gly Val Phe His Phe
35 40 45
Asp Ile Lys Gln Asn His Leu Lys Leu Lys Pro Ala Ile Phe Ser Lys
50 55 60
Asp Ser Cys Tyr Leu Pro Pro Leu Arg Tyr Pro Ala Thr Cys Ser Tyr
65 70 75 80
Lys Gly Ser Ile Asp Ser Asp Lys His Gln Tyr Ile Ile His Gly Gly
85 90 95
Lys Thr Pro Asn Asn Glu Leu Ser Asp Lys Ile Tyr Ile Met Ser Val
100 105 110
Ala Cys Lys Asn Asn Lys Lys Val Thr Phe Arg Cys Thr Glu Lys Asp
115 120 125
Leu Val Gly Asp Val Pro Glu Pro Arg Tyr Gly His Ser Ile Asp Val
130 135 140
Val Tyr Ser Arg Gly Lys Ser Met Gly Val Leu Phe Gly Gly Arg Ser
145 150 155 160
Tyr Met Pro Ser Thr Gln Arg Thr Thr Glu Lys Trp Asn Ser Val Ala
165 170 175
Asp Cys Leu Pro His Val Phe Leu Ile Asp Phe Glu Phe Gly Cys Ala
180 185 190
Thr Ser Tyr Ile Leu Pro Glu Leu Gln Asp Gly Leu Ser Phe His Val
195 200 205
Ser Ile Ala Arg Asn Asp Thr Val Tyr Ile Leu Gly Gly His Ser Leu
210 215 220
Ala Ser Asn Ile Arg Pro Ala Asn Leu Tyr Arg Ile Arg Val Asp Leu
225 230 235 240
Pro Leu Gly Thr Pro Ala Val Asn Cys Thr Val Leu Pro Gly Gly Ile
245 250 255
Ser Val Ser Ser Ala Ile Leu Thr Gln Thr Asn Asn Asp Glu Phe Val
260 265 270
Ile Val Gly Gly Tyr Gln Leu Glu Asn Gln Lys Arg Met Val Cys Ser
275 280 285
Leu Val Ser Leu Gly Asp Asn Thr Ile Glu Ile Ser Glu Met Glu Thr
290 295 300
Pro Asp Trp Thr Ser Asp Ile Lys His Ser Lys Ile Trp Phe Gly Ser
305 310 315 320
Asn Met Gly Asn Gly Thr Ile Phe Leu Gly Ile Pro Gly Asp Asn Lys
325 330 335
Gln Ala Met Ser Glu Ala Phe Tyr Phe Tyr Thr Leu Arg Cys Ser Glu
340 345 350
Glu Asp Leu Ser Glu Asp Gln Lys Ile Val Ser Asn Ser Gln Thr Ser
355 360 365
Thr Glu Asp Pro Gly Asp Ser Thr Pro Phe Glu Asp Ser Glu Glu Phe
370 375 380
Cys Phe Ser Ala Glu Ala Thr Ser Phe Asp Gly Asp Asp Glu Phe Asp
385 390 395 400
Thr Tyr Asn Glu Asp Asp Glu Asp Asp Glu Ser Val Thr Gly Tyr Trp
405 410 415
Ile Thr Cys Cys Pro Thr Cys Asp Val Asp Ile Asn Thr Trp Val Pro
420 425 430
Phe Tyr Ser Thr Glu Leu Asn Lys Pro Ala Met Ile Tyr Cys Ser His
435 440 445
Gly Asp Gly His Trp Val His Ala Gln Cys Met Asp Leu Glu Glu Arg
450 455 460
Thr Leu Ile His Leu Ser Glu Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Cys Asn Glu
465 470 475 480
His Val Gln Ile Ala Arg Ala Leu Gln Thr Pro Lys Arg Asn Pro Pro
485 490 495
Leu Gln Lys Pro Pro Met Lys Ser Leu His Lys Lys Gly Ser Gly Lys
500 505 510
Val Leu Thr Pro Ala Lys Lys Ser Phe Leu Arg Arg Leu Phe Asp
515 520 525
<210> 28
<211> 1612
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 28
gacacagact acacccagag aaagaagagc aagcaccatg ttgaaactat tattgtcacc 60
tagatccttc ttagtccttc agctgctcct gctgagggca gggtggagct ccaaggtcct 120
catgtccagt gcgaatgaag acatcaaagc tgatttgatc ctgacttcta cagcccctga 180
acacctcagt gctcctactc tgccccttcc agaggttcag tgctttgtgt tcaacataga 240
gtacatgaat tgcacttgga atagcagttc tgagcctcag gcaaccaacc tcacgctgca 300
ctataggtac aaggtatctg ataataatac attccaggag tgcagtcact atttgttctc 360
caaagagatt acttctggct gtcagataca aaaagaagat atccagctct accagacatt 420
tgttgtccag ctccaggacc cccagaaacc ccagaggcga gctgtacaga agctaaacct 480
acagaatctt gtgatcccac gggctccaga aaatctaaca ctcagcaatc tgagtgaatc 540
ccagctagag ctgagatgga aaagcagaca tattaaagaa cgctgtttac aatacttggt 600
gcagtaccgg agcaacagag atcgaagctg gacggaacta atagtgaatc atgaacctag 660
attctccctg cctagtgtgg atgagctgaa acggtacaca tttcgggttc ggagccgcta 720
taacccaatc tgtggaagtt ctcaacagtg gagtaaatgg agccagcctg tccactgggg 780
gagtcatact gtagaggaga atccttcctt gtttgcactg gaagctgtgc ttatccctgt 840
tggcaccatg gggttgatta ttaccctgat ctttgtgtac tgttggttgg aacgaatgcc 900
tccaattccc cccatcaaga atctagagga tctggttact gaataccaag ggaacttttc 960
ggcctggagt ggtgtgtcta aagggctgac tgagagtctg cagccagact acagtgaacg 1020
gttctgccac gtcagcgaga ttccccccaa aggaggggcc ctaggagagg ggcctggagg 1080
ttctccttgc agcctgcata gcccttactg gcctccccca tgttattctc tgaagccgga 1140
agcctgaaca tcaatccttt gatggaacct caaagtccta tagtcctaag tgacgctaac 1200
ctcccctact caccttggca atctggatcc aatgctcact gccttccctt ggggctaagt 1260
ttcgatttcc tgtcccatgt aactgctttt ctgttccata tgccctactt gagagtgtcc 1320
cttgccctct ttccctgcac aagccctccc atgcccagcc taacaccttt ccactttctt 1380
tgaagagagt cttaccctgt agcccagggt ggctgggagc tcactatgta ggccaggttg 1440
gcctccaact cacaggctat cctcccacct ctgcctcata agagttgggg ttactggcat 1500
gcaccaccac acccagcatg gtccttctct tttataggat tctccctccc tttttctacc 1560
tatgattcaa ctgtttccaa atcaacaaga aataaagttt ttaaccaatg at 1612
<210> 29
<211> 369
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 29
Met Leu Lys Leu Leu Leu Ser Pro Arg Ser Phe Leu Val Leu Gln Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Arg Ala Gly Trp Ser Ser Lys Val Leu Met Ser Ser Ala
20 25 30
Asn Glu Asp Ile Lys Ala Asp Leu Ile Leu Thr Ser Thr Ala Pro Glu
35 40 45
His Leu Ser Ala Pro Thr Leu Pro Leu Pro Glu Val Gln Cys Phe Val
50 55 60
Phe Asn Ile Glu Tyr Met Asn Cys Thr Trp Asn Ser Ser Ser Glu Pro
65 70 75 80
Gln Ala Thr Asn Leu Thr Leu His Tyr Arg Tyr Lys Val Ser Asp Asn
85 90 95
Asn Thr Phe Gln Glu Cys Ser His Tyr Leu Phe Ser Lys Glu Ile Thr
100 105 110
Ser Gly Cys Gln Ile Gln Lys Glu Asp Ile Gln Leu Tyr Gln Thr Phe
115 120 125
Val Val Gln Leu Gln Asp Pro Gln Lys Pro Gln Arg Arg Ala Val Gln
130 135 140
Lys Leu Asn Leu Gln Asn Leu Val Ile Pro Arg Ala Pro Glu Asn Leu
145 150 155 160
Thr Leu Ser Asn Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Arg Trp Lys Ser
165 170 175
Arg His Ile Lys Glu Arg Cys Leu Gln Tyr Leu Val Gln Tyr Arg Ser
180 185 190
Asn Arg Asp Arg Ser Trp Thr Glu Leu Ile Val Asn His Glu Pro Arg
195 200 205
Phe Ser Leu Pro Ser Val Asp Glu Leu Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val
210 215 220
Arg Ser Arg Tyr Asn Pro Ile Cys Gly Ser Ser Gln Gln Trp Ser Lys
225 230 235 240
Trp Ser Gln Pro Val His Trp Gly Ser His Thr Val Glu Glu Asn Pro
245 250 255
Ser Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Leu Ile Pro Val Gly Thr Met Gly
260 265 270
Leu Ile Ile Thr Leu Ile Phe Val Tyr Cys Trp Leu Glu Arg Met Pro
275 280 285
Pro Ile Pro Pro Ile Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr Gln
290 295 300
Gly Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Thr Glu Ser
305 310 315 320
Leu Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Phe Cys His Val Ser Glu Ile Pro
325 330 335
Pro Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Gly Ser Pro Cys Ser
340 345 350
Leu His Ser Pro Tyr Trp Pro Pro Pro Cys Tyr Ser Leu Lys Pro Glu
355 360 365
Ala
<210> 30
<211> 2012
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 30
gttgggactc cgggtggcag gcgcccgggg gaatcccagc tgactcgctc actgccttcg 60
aagtccggcg ccccccggga gggaactggg tggccgcacc ctcccggctg cggtggctgt 120
cgccccccac cctgcagcca ggactcgatg gagaatccat tccaatatat ggccatgtgg 180
ctctttggag caatgttcca tcatgttcca tgctgctgac gtcacatgga gcacagaaat 240
caatgttagc agatagccag cccatacaag atcgtattgt attgtaggag gcattgtgga 300
tggatggctg ctggaaaccc cttgccatag ccagctcttc ttcaatactt aaggatttac 360
cgtggctttg agtaatgaga atttcgaaac cacatttgag aagtatttcc atccagtgct 420
acttgtgttt acttctaaac agtcattttc taactgaagc tggcattcat gtcttcattt 480
tgggctgttt cagtgcaggg cttcctaaaa cagaagccaa ctgggtgaat gtaataagtg 540
atttgaaaaa aattgaagat cttattcaat ctatgcatat tgatgctact ttatatacgg 600
aaagtgatgt tcaccccagt tgcaaagtaa cagcaatgaa gtgctttctc ttggagttac 660
aagttatttc acttgagtcc ggagatgcaa gtattcatga tacagtagaa aatctgatca 720
tcctagcaaa caacagtttg tcttctaatg ggaatgtaac agaatctgga tgcaaagaat 780
gtgaggaact ggaggaaaaa aatattaaag aatttttgca gagttttgta catattgtcc 840
aaatgttcat caacacttct tgattgcaat tgattctttt taaagtgttt ctgttattaa 900
caaacatcac tctgctgctt agacataaca aaacactcgg catttcaaat gtgctgtcaa 960
aacaagtttt tctgtcaaga agatgatcag accttggatc agatgaactc ttagaaatga 1020
aggcagaaaa atgtcattga gtaatatagt gactatgaac ttctctcaga cttactttac 1080
tcattttttt aatttattat tgaaattgta catatttgtg gaataatgta aaatgttgaa 1140
taaaaatatg tacaagtgtt gttttttaag ttgcactgat attttacctc ttattgcaaa 1200
atagcatttg tttaagggtg atagtcaaat tatgtattgg tggggctggg taccaatgct 1260
gcaggtcaac agctatgctg gtaggctcct gccagtgtgg aaccactgac tactggctct 1320
cattgacttc cttactaagc atagcaaaca gaggaagaat ttgttatcag taagaaaaag 1380
aagaactata tgtgaatcct cttctttata ctgtaattta gttattgatg tataaagcaa 1440
ctgttatgaa ataaagaaat tgcaataact ggcatataat gtccatcagt aaatcttggt 1500
ggtggtggca ataataaact tctactgata ggtagaatgg tgtgcaagct tgtccaatca 1560
cggattgcag gccacatgcg gcccaggaca actttgaatg tggcccaaca caaattcata 1620
aactttcata catctcgttt ttagctcatc agctatcatt agcggtagtg tatttaaagt 1680
gtggcccaag acaattcttc ttattccaat gtggcccagg gaaatcaaaa gattggatgc 1740
ccctggtata gaaaactaat agtgacagtg ttcatatttc atgctttccc aaatacaggt 1800
attttatttt cacattcttt ttgccatgtt tatataataa taaagaaaaa ccctgttgat 1860
ttgttggagc cattgttatc tgacagaaaa taattgttta tattttttgc actacactgt 1920
ctaaaattag caagctctct tctaatggaa ctgtaagaaa gatgaaatat ttttgtttta 1980
ttataaattt atttcacctt aaaaaaaaaa aa 2012
<210> 31
<211> 160
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
Met Arg Ile Ser Lys Pro His Leu Arg Ser Ile Ser Ile Gln Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Leu Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Phe Ser Ala Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys Ile Glu Asp Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr Glu Ser Asp Val His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile His Asp Thr Val Glu
100 105 110
Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser Ser Asn Gly Asn Val
115 120 125
Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Asn Ile
130 135 140
Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
<210> 32
<211> 2333
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 32
gttgggactc cgggtggcag gcgcccgggg gaatcccagc tgactcgctc actgccttcg 60
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taacctatag ttatataatc tgactctcag ttcagtttta ctctactaat gccttcatgg 780
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ggaataatgt aaaatgttga ataaaaatat gtacaagtgt tgttttttaa gttgcactga 1500
tattttacct cttattgcaa aatagcattt gtttaagggt gatagtcaaa ttatgtattg 1560
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gaaccactga ctactggctc tcattgactt ccttactaag catagcaaac agaggaagaa 1680
tttgttatca gtaagaaaaa gaagaactat atgtgaatcc tcttctttat actgtaattt 1740
agttattgat gtataaagca actgttatga aataaagaaa ttgcaataac tggcatataa 1800
tgtccatcag taaatcttgg tggtggtggc aataataaac ttctactgat aggtagaatg 1860
gtgtgcaagc ttgtccaatc acggattgca ggccacatgc ggcccaggac aactttgaat 1920
gtggcccaac acaaattcat aaactttcat acatctcgtt tttagctcat cagctatcat 1980
tagcggtagt gtatttaaag tgtggcccaa gacaattctt cttattccaa tgtggcccag 2040
ggaaatcaaa agattggatg cccctggtat agaaaactaa tagtgacagt gttcatattt 2100
catgctttcc caaatacagg tattttattt tcacattctt tttgccatgt ttatataata 2160
ataaagaaaa accctgttga tttgttggag ccattgttat ctgacagaaa ataattgttt 2220
atattttttg cactacactg tctaaaatta gcaagctctc ttctaatgga actgtaagaa 2280
agatgaaata tttttgtttt attataaatt tatttcacct taaaaaaaaa aaa 2333
<210> 33
<211> 135
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 33
Met Val Leu Gly Thr Ile Asp Leu Cys Ser Cys Phe Ser Ala Gly Leu
1 5 10 15
Pro Lys Thr Glu Ala Asn Trp Val Asn Val Ile Ser Asp Leu Lys Lys
20 25 30
Ile Glu Asp Leu Ile Gln Ser Met His Ile Asp Ala Thr Leu Tyr Thr
35 40 45
Glu Ser Asp Val His Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Lys Cys Phe
50 55 60
Leu Leu Glu Leu Gln Val Ile Ser Leu Glu Ser Gly Asp Ala Ser Ile
65 70 75 80
His Asp Thr Val Glu Asn Leu Ile Ile Leu Ala Asn Asn Ser Leu Ser
85 90 95
Ser Asn Gly Asn Val Thr Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu
100 105 110
Glu Glu Lys Asn Ile Lys Glu Phe Leu Gln Ser Phe Val His Ile Val
115 120 125
Gln Met Phe Ile Asn Thr Ser
130 135
<210> 34
<211> 1297
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 34
ttcttgacca agacttcaat actcagtggc actgtattcc ccttctgtcc agccactctt 60
ccccagagtt ctcttcttca tcctccccct tgcagagtag ggcagcttgc aggtcctcct 120
gcaagtctct cccaattctc tgcgcccaaa agacttgcag tgcatctcct tacgcgctgc 180
agggaccttg ccagggcagg actgcccccg cccagttgca gagttggacg aagacgggat 240
cctgctgtgt ttggaaggct gagttccaca tctaacagct cagagaggtc aggaaagaat 300
ccaccttgac acatggccct ctggctcttc aaagcactgc ctcttcatgg tccttgctgg 360
tgaggtcctt aagaacacag aaacccatgt cagcagataa ccagcctaca ggaggccaag 420
aagagttctg gatggatggc agctggaagc ccatcgccat agccagctca tcttcaacat 480
tgaagctctt acctgggcat taagtaatga aaattttgaa accatatatg aggaatacat 540
ccatctcgtg ctacttgtgt ttccttctaa acagtcactt tttaactgag gctggcattc 600
atgtcttcat tttgggctgt gtcagtgtag gtctccctaa aacagaggcc aactggatag 660
atgtaagata tgacctggag aaaattgaaa gccttattca atctattcat attgacacca 720
ctttatacac tgacagtgac tttcatccca gttgcaaagt tactgcaatg aactgctttc 780
tcctggaatt gcaggttatt ttacatgagt acagtaacat gactcttaat gaaacagtaa 840
gaaacgtgct ctaccttgca aacagcactc tgtcttctaa caagaatgta gcagaatctg 900
gctgcaagga atgtgaggag ctggaggaga aaaccttcac agagtttttg caaagcttta 960
tacgcattgt ccaaatgttc atcaacacgt cctgactgca tgcgagcctc ttccgtgttt 1020
ctgttattaa ggtacctcca cctgctgctc agaggcagca cagctccatg catttgaaat 1080
ctgctgggca aactaagctt cctaacaagg agataatgag ccacttggat cacatgaaat 1140
cttggaaatg aagagaggaa aagagctcgt ctcagactta tttttgcttg cttattttta 1200
atttattgct tcatttgtac atatttgtaa tataacagaa gatgtggaat aaagttgtat 1260
ggatatttta tcaattgaaa tttaaaaaaa aaaaaaa 1297
<210> 35
<211> 160
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 35
Met Lys Ile Leu Lys Pro Tyr Met Arg Asn Thr Ser Ile Ser Cys Tyr
1 5 10 15
Leu Cys Phe Leu Leu Asn Ser His Phe Leu Thr Glu Ala Gly Ile His
20 25 30
Val Phe Ile Leu Gly Cys Val Ser Val Gly Leu Pro Lys Thr Glu Ala
35 40 45
Asn Trp Ile Asp Val Arg Tyr Asp Leu Glu Lys Ile Glu Ser Leu Ile
50 55 60
Gln Ser Ile His Ile Asp Thr Thr Leu Tyr Thr Asp Ser Asp Phe His
65 70 75 80
Pro Ser Cys Lys Val Thr Ala Met Asn Cys Phe Leu Leu Glu Leu Gln
85 90 95
Val Ile Leu His Glu Tyr Ser Asn Met Thr Leu Asn Glu Thr Val Arg
100 105 110
Asn Val Leu Tyr Leu Ala Asn Ser Thr Leu Ser Ser Asn Lys Asn Val
115 120 125
Ala Glu Ser Gly Cys Lys Glu Cys Glu Glu Leu Glu Glu Lys Thr Phe
130 135 140
Thr Glu Phe Leu Gln Ser Phe Ile Arg Ile Val Gln Met Phe Ile Asn
145 150 155 160
<210> 36
<211> 1287
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 36
ttcttgacca agacttcaat actcagtggc actgtattcc ccttctgtcc agccactctt 60
ccccagagtt ctcttcttca tcctccccct tgcagagtag ggcagcttgc aggtcctcct 120
gcaagtctct cccaattctc tgcgcccaaa agacttgcag tgcatctcct tacgcgctgc 180
agggaccttg ccagggcagg actgcccccg cccagttgca gagttggacg aagacgggat 240
cctgctgtgt ttggaaggct gagttccaca tctaacagct cagagagaat ccaccttgac 300
acatggccct ctggctcttc aaagcactgc ctcttcatgg tccttgctgg tgaggtcctt 360
aagaacacag aaacccatgt cagcagataa ccagcctaca ggaggccaag aagagttctg 420
gatggatggc agctggaagc ccatcgccat agccagctca tcttcaacat tgaagctctt 480
acctgggcat taagtaatga aaattttgaa accatatatg aggaatacat ccatctcgtg 540
ctacttgtgt ttccttctaa acagtcactt tttaactgag gctggcattc atgtcttcat 600
tttgggctgt gtcagtgtag gtctccctaa aacagaggcc aactggatag atgtaagata 660
tgacctggag aaaattgaaa gccttattca atctattcat attgacacca ctttatacac 720
tgacagtgac tttcatccca gttgcaaagt tactgcaatg aactgctttc tcctggaatt 780
gcaggttatt ttacatgagt acagtaacat gactcttaat gaaacagtaa gaaacgtgct 840
ctaccttgca aacagcactc tgtcttctaa caagaatgta gcagaatctg gctgcaagga 900
atgtgaggag ctggaggaga aaaccttcac agagtttttg caaagcttta tacgcattgt 960
ccaaatgttc atcaacacgt cctgactgca tgcgagcctc ttccgtgttt ctgttattaa 1020
ggtacctcca cctgctgctc agaggcagca cagctccatg catttgaaat ctgctgggca 1080
aactaagctt cctaacaagg agataatgag ccacttggat cacatgaaat cttggaaatg 1140
aagagaggaa aagagctcgt ctcagactta tttttgcttg cttattttta atttattgct 1200
tcatttgtac atatttgtaa tataacagaa gatgtggaat aaagttgtat ggatatttta 1260
tcaattgaaa tttaaaaaaa aaaaaaa 1287
Claims (67)
- 하기를 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물:
서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및
서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 인간 SIRPα 단백질 및 상기 인간 IL-15 단백질을 발현시키는, 동물. - 청구항 1에 있어서, 상기 SIRPα 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 2에 있어서, 상기 SIRPα 유전자 프로모터가 상기 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 상기 내인성 비-인간 SIRPα 유전자 프로모터인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 3에 있어서, 상기 비-인간 동물 SIRPα 유전자좌에서 상기 비-인간 SIRPα 유전자내 삭제 돌연변이를 포함한, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 상기 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 SIRPα 엑손 2-4의 결실인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열을 포함한 상기 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열을 포함한 상기 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 1-7 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 SIRPα 단백질이 전장 인간 SIRPα 단백질의 기능성 단편인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 기능성 단편이 인간 SIRPα의 세포외 도메인인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 1-9 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 IL-15 유전자 프로모터가 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 IL-15 유전자 프로모터가 상기 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 상기 내인성 비-인간 IL-15 유전자 프로모터인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 11에 있어서, 상기 비-인간 동물 IL-15 유전자좌에서 상기 비-인간 IL-15 유전자내 삭제 돌연변이를 포함한, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 마우스이고 상기 삭제 돌연변이가 적어도 마우스 IL-15 엑손 5-8의 결실인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열을 포함한 상기 대립유전자에 대하여 이종접합성인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 12에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열을 포함한 상기 대립유전자에 대하여 동종접합성인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 1-15 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열이 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 1-16 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 IL-15 단백질이 전장 인간 IL-15 단백질의 기능성 단편인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 1-17 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 면역결핍되는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 18에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 Rag2 유전자 녹-아웃을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 18 또는 19에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 IL2rg 유전자 녹-아웃을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 1-20 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 비-인간 동물이 포유동물인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 21에 있어서, 상기 포유동물이 설치류인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 22에 있어서, 상기 설치류가 마우스인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 1-23 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 조혈 세포의 생착을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 24에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 25에 있어서, 상기 인간 병원체가 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 25에 있어서, 상기 인간 병원체가 인간 장을 감염시키는 병원체인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 27에 있어서, 상기 인간 병원체가 인간 로타바이러스인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 25에 있어서, 상기 병원체가 인간 폐를 감염시키는, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 청구항 29에 있어서, 상기 인간 병원체가 인플루엔자 바이러스인, 유전자 변형된 비-인간 동물.
- 하기 단계를 포함한, 인간 IL-15 단백질 및 인간 SIRPα 단백질을 발현한 비-인간 동물의 제조 방법:
인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 제1 비-인간 동물의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 상기 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 상기 서열이 SIRPα 유전자 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는, 단계;
인간 IL-15 단백질을 인코딩한 핵산 서열을 제2 비-인간 동물의 게놈 속에 도입하는 단계로서, 상기 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 상기 서열이 IL-15 프로모터 서열에 작동가능하게 연결되는, 단계; 및
상기 인간 IL-15 단백질을 인코딩한 상기 핵산 서열 및 상기 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 상기 핵산 서열을 포함하는 제3 비-인간 동물을 제조하는 단계로서, 상기 제3 비-인간 동물이 상기 인간 IL-15 단백질 및 상기 인간 SIPRα 단백질을 발현하는, 단계. - 청구항 31에 있어서, 상기 도입의 단계가 인간 IL-15 또는 인간 SIRPα를 인코딩한 상기 핵산을 포함한 만능 줄기 세포로부터 비-인간 동물의 생성을 포함하는, 방법.
- 청구항 31 또는 청구항 32에 있어서, 상기 제1 동물이 상기 제2 동물과 상이하고, 상기 제3 동물의 상기 제조의 단계가 상기 제1 및 상기 제2 동물의 교배를 포함하는, 방법.
- 청구항 31에 있어서, 상기 제1 동물 및 상기 제2 동물이 동일하고, 상기 제1 동물의 상기 게놈 속에 상기 도입의 단계가 제2 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 상기 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 상기 핵산 서열과 제1 만능 줄기 세포의 접촉을 포함하고, 상기 제2 동물의 상기 게놈 속에 상기 도입의 단계가 제3 만능 줄기 세포를 수득하기 위해 상기 인간 SIRPα 단백질을 인코딩한 상기 핵산 서열과 상기 제2 만능 줄기 세포의 접촉을 포함하고, 상기 제3 비-인간 동물이 상기 제3 만능 줄기 세포로부터 제조되는, 방법.
- 청구항 31-34 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 ES 세포 또는 iPS 세포인, 방법.
- 청구항 31-34 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 Rag2에 대하여 결핍되는, 방법.
- 청구항 31-36 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 만능 줄기 세포가 IL2rg에 대하여 결핍되는, 방법.
- 청구항 31-37 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제3 비-인간 동물이 Rag2 및 IL2rg의 한쪽 또는 양쪽에서 결핍되는, 방법.
- 청구항 31-38 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 IL-15 프로모터 서열이 인간 IL-15 프로모터 서열인, 방법.
- 청구항 31-38 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 IL-15 프로모터 서열이 내인성 비-인간 동물 IL-15 프로모터 서열인, 방법.
- 청구항 31-38 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 통합이 상기 비-인간 IL-15 유전자좌에서 상기 비-인간 IL-15 유전자의 대체를 초래하는, 방법.
- 청구항 31-41 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 IL-15 단백질을 인코딩하는 상기 핵산 서열이 인간 IL-15 게놈성 코딩 및 비-코딩 서열을 포함하는, 방법.
- 하기 단계를 포함한, 인간 IL-15 단백질을 발현한 유전자 변형된 비-인간 동물의 생착 방법:
청구항 31-42 중 어느 하나의 항에 따른 방법에 의해 제조된 상기 유전자 변형된 비-인간 동물 속에 인간 조혈 세포를 포함한 세포의 집단의 이식 단계. - 청구항 43에 있어서, 상기 이식 단계가 꼬리-정맥 주사, 태아 간 주사, 또는 안와후 주사를 포함하는, 방법.
- 청구항 43 또는 44에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 이식에 앞서 치사량에 가깝게 조사되는, 방법.
- 청구항 43-45 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 조혈 세포가 CD34+ 세포인, 방법.
- 청구항 43-46 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 인간 조혈 세포가 태아 간, 성인 골수, 또는 탯줄 혈액 출신인, 방법.
- 하기 단계를 포함한, 인간 IL-15 단백질을 발현한 유전자 변형된 비-인간 동물의 생착 방법:
청구항 18-23 중 어느 하나의 항에 따른 상기 유전자 변형된 비-인간 동물 속에 인간 조혈 세포를 포함한 세포의 집단의 이식 단계. - 하기를 포함한 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, 동물 생착 모델:
서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열;
서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및
인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 (i) 상기 인간 SIRPα 단백질 및 상기 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 소장내 인간 상피내 림프구 (IEL) 및 페이에르 판을 포함하는, 모델. - 청구항 48에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는, 모델.
- 청구항 49에 있어서, 상기 인간 병원체가 장 병원체인, 모델.
- 청구항 50에 있어서, 상기 장 병원체가 하기로부터 선택되는, 모델: 캄필로박터 제주니, 클로스트리듐 디피실레, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 엔테로코쿠스 패슘, 에스케리치아 콜라이, 인간 로타바이러스, 리스테리아 모노사이토게네스, 노워크 바이러스, 살모넬라 엔테리카, 시겔라 플렉스네리, 시겔라 손네이, 시겔라 다이센테리애, 예르시니아 페스티스, 예르시니아 엔테로콜리티카, 및 헬리코박터 파일로리.
- 하기를 포함한 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, 동물 생착 모델:
서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열;
서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및
인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 (i) 상기 인간 SIRPα 단백질 및 상기 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 폐내 인간 상피내 림프구 (IEL)를 포함하는, 모델. - 청구항 53에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 인간 병원체로 감염을 포함하는, 모델.
- 청구항 54에 있어서, 상기 인간 병원체가 폐 병원체인, 모델.
- 청구항 55에 있어서, 상기 폐 병원체가 하기로부터 선택되는, 모델: 연쇄상구균 파이오제네스, 헤모필루스 인플루엔자, 코리네박테리움 디프테리아, SARS 코로나바이러스, 보데텔라 페르투스시스, 모락셀라 카타르할리스, 인플루엔자 바이러스 (A, B, C), 코로나바이러스, 아데노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스, 볼거리 바이러스, 연쇄상구균 뉴모니애, 스타필로코쿠스 아우레스, 레지오넬라 뉴모필라, 클렙시엘라 뉴모니애, 슈도모나스 에어루기노사, 마이코플라스마 뉴모니아, 마이코박테리움 투베르쿨로시스, 클라미디아 뉴모니애, 블라스토마이세스 더마티티디스, 크립토코쿠스 네오포르만스, 및 아스페르길루스 푸미가투스.
- 하기 단계를 포함하는, 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 (NK) 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 병원체에 의해 감염을 저해하는 제제의 확인 방법:
유전자 변형된 비-인간 동물에 제제를 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계:
(i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(iii) 인간 조혈 세포의 생착, 및
(iv) 인간 T 세포 및/또는 자연 살해 세포를 활성화, 유도 및/또는 표적화하는 병원체에 의한 감염, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 인간 SIRPα 단백질 및 상기 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및
상기 제제가 상기 병원체-감염된 비-인간 동물내 상기 병원체의 상기 양을 감소시키는지 여부를 결정하는 단계. - 하기 단계를 포함한, 표적 세포의 NK-세포 매개된 살해에서 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질의 상기 효능 결정 방법:
유전자 변형된 비-인간 동물에 상기 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질을 투여하는 단계로서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 단계:
(i) 서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열,
(ii) 서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열, 및
(iii) 인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 인간 SIRPα 단백질 및 상기 인간 IL-15 단백질을 발현하는, 단계; 및
상기 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질이 상기 유전자 변형된 비-인간 동물내 상기 표적 세포에 대해 NK 세포 항체-의존성 세포 독성을 활성화하는지 여부를 결정하는 단계. - 청구항 58에 있어서, 상기 표적 세포가 종양 세포, 바이러스성으로-감염된 세포, 박테리아성으로-감염된 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 및 기생충 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
- 청구항 59에 있어서, 상기 표적 세포가 종양 세포인, 방법.
- 청구항 60에 있어서, 상기 종양 세포가 B-세포 림프종 세포인, 방법.
- 유전자 변형된 비-인간 동물을 포함한, NK 세포 매개된 항체-의존성 세포 독성의 모델로서,
상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 내인성 면역 시스템에 대하여 결핍되고 하기를 포함하는, 모델:
서열이 인간 SIRPα 단백질을 인코딩하고 SIRPα 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열;
서열이 인간 IL-15 단백질을 인코딩하고 IL-15 유전자 프로모터에 작동가능하게 연결되는, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 게놈 속에 편입된 핵산 서열; 및
인간 조혈 세포의 생착, 여기서 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 (i) 상기 인간 SIRPα 단백질 및 상기 인간 IL-15 단백질을 발현하고, (ii) 인간 림프구를 포함하고, (iii) 종양 세포, 바이러스성으로-감염된 세포, 박테리아성으로-감염된 세포, 박테리아 세포, 진균 세포, 및 기생충 세포로 구성된 군으로부터 선택된 표적 세포를 포함하는, 모델. - 청구항 62에 있어서, 상기 표적 세포가 종양 세포인, 모델.
- 청구항 63에 있어서, 상기 종양 세포가 B-세포 림프종 세포인, 모델.
- 청구항 63 또는 청구항 64에 있어서, 상기 모델이 외인성 후보 치료적 항체 또는 항원-결합 단백질을 포함하는, 모델.
- 청구항 62-65 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 소장내 인간 상피내 림프구 (IEL) 및 페이에르 판을 포함하는, 모델.
- 청구항 62-66 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 유전자 변형된 비-인간 동물이 상기 유전자 변형된 비-인간 동물의 상기 폐내 인간 상피내 림프구 (IEL)를 포함하는, 모델.
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