WO2021129766A1 - 一种il-15人源化小鼠模型及其用途 - Google Patents

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Abstract

提供了一种小鼠及其功能活性部分，其包含人源化的IL-15基因，其中所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，其中所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分，其中所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。还提供了所述小鼠的制备方法及用途。

Description

一种IL-15人源化小鼠模型及其用途 技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种IL-15人源化小鼠模型及其用途。
背景技术
正常情况下，免疫系统作为人体重要的防御武器可以通过识别和排除抗原性异物，并与其他系统相互协调，共同维护机体的体内平衡。免疫系统一旦失控，包括自身免疫病，肿瘤，感染以及代谢类的疾病将会席卷人体，对于人类的健康将是致命的。
对于免疫系统的研究涉及方方面面，由于伦理上的限制，科学研究通常都以大型哺乳动物及小型啮齿动物为主。啮齿类动物作为应用最广泛的实验小动物模型，已成为人类免疫研究中不可或缺的替代模型。但由于种属特异性的存在，啮齿类动物模型得到的结论并不能直接推导于人类免疫系统。
鉴于此，期望获得一种动物模型，用于人源免疫系统重建，以便更好地研究人源免疫细胞发育及相关药物筛选。
发明内容
一方面，本申请提供一种小鼠或其功能活性部分，其包含人源化的IL-15基因，其中所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，
其中所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分，
其中所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段还包含小鼠IL-15基因的调控序列。
在某些实施方式中，所述人IL-15基因区段中的外显子由人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分组成。
在某些实施方式中，所述人IL-15基因区段包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
在某些实施方式中，所述小鼠为NCG小鼠。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段包含编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段包含编码5’UTR的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码5’UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段包含编码3’UTR的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码3’UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供所述的小鼠的后代或其功能活性部分，其中所述后代或其功能活性部分包含人源化的IL-15基因，所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分，所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
另一方面，本申请提供细胞系或原代细胞培养物，其源自所述的小鼠或其功能活性部分；或源自所述的小鼠的后代。
另一方面，本申请提供组织，其源自所述的小鼠或其功能活性部分；或源自所述的小鼠的后代。
在某些实施方式中，所述组织包括所述小鼠或所述小鼠的后代的体液。
在某些实施方式中，所述体液选自下组：血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液。
在某些实施方式中，所述组织选自下组：上皮组织、结缔组织、神经组织和肌肉组织。
另一方面，本申请提供细胞，其源自所述的小鼠或其功能活性部分；或源自所述的小鼠的后代。
在某些实施方式中，所述细胞选自下组：上皮细胞、神经细胞、红细胞、白细胞、血小板、吞噬细胞、B淋巴细胞、效应B细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、血细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞和内分泌细胞。
在某些实施方式中，所述细胞不能发育为完整的小鼠。
另一方面，本申请提供制备经遗传修饰的小鼠的方法，所述方法包括：
用编码成熟人IL-15多肽的人IL-15基因区段替换在内源小鼠IL-15基因座上的编码成熟小鼠IL-15多肽的小鼠IL-15基因区段以形成人源化的IL-15基因，其中所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段还包含小鼠IL-15基因的调控序列。
在某些实施方式中，所述人IL-15基因区段中的外显子由人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分组成。
在某些实施方式中，所述人IL-15基因区段包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
在某些实施方式中，所述小鼠为NCG小鼠。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段包含编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段包含编码5’UTR的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码5’UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述小鼠IL-15基因区段包含编码3’UTR的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述编码3’UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述替换包括使用Cas9-gRNA系统。
在某些实施方式中，所述gRNA与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补。
在某些实施方式中，所述gRNA与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补。
在某些实施方式中，与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:10-11中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:12-13中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；且与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；或者，
与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；且与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供所述的小鼠在制备小鼠模型中的用途。
在某些实施方式中，所述小鼠模型用于评估IL-15拮抗剂对所述小鼠中人IL-15介导的功能的拮抗作用。
在某些实施方式中，所述人IL-15介导的功能包括人IL-15介导的淋巴细胞发育。
在某些实施方式中，所述人IL-15介导的功能包括人IL-15介导的组织或关节的淋巴细胞浸润。
在某些实施方式中，所述人IL-15介导的功能包括人IL-15介导的诱导性的关节炎。
在某些实施方式中，所述人IL-15介导的功能包括人IL-15介导NK细胞的发育。
在某些实施方式中，所述小鼠模型可用于评价药物的抗肿瘤疗效。例如，所述肿瘤包括淋巴细胞肿瘤。例如，所述肿瘤包括肺癌。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1为F0代小鼠5’端与3’端的鉴定电泳图。
图2为F1代小鼠5’端与3’端的鉴定电泳图。
图3显示NCG-IL15人源化小鼠与NCG背景鼠中各组织中IL-15的mRNA表达情况。
图4显示NCG-IL15人源化小鼠与NCG背景鼠外周血清中IL-15蛋白水平。
图5A和5B分别显示人外周血NK细胞重建小鼠中的人白细胞和人NK细胞的含量。
图6A和6B显示人外周血NK细胞重建小鼠中的人NK细胞的流式检测结果。
图7显示人外周血NK细胞重建NCG-IL15人源化小鼠分泌人穿孔素的结果。
图8A和图8B显示人HSC重建后小鼠存活及体重变化情况。
图9为人HSC重建后NCG-IL15人源化小鼠人源免疫系统重建情况。
图10A和10B显示人HSC重建13周小鼠中的人NK细胞功能蛋白的流式检测结果。
图11显示人HSC重建18周NCG-IL15人源化小鼠中的人NK细胞功能蛋白的流式检测 结果。
图12显示HSC重建后NCG-IL15人源化小鼠脾脏分离人NK细胞的肿瘤细胞杀伤作用及ADCC作用。
图13显示皮下接种人非小细胞肺癌HCC827细胞的HSC重建后NCG-IL15人源化小鼠模型构建及小鼠外周血及肿瘤组织中人免疫细胞情况。
图14显示的是皮下接种人淋巴癌细胞Raji的HSC重建后NCG-IL15人源化小鼠模型评价肿瘤免疫治疗抗体的抗肿瘤作用。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本申请中，术语“功能活性部分”通常是指保留活性功能的部分结构。例如，生物体的功能活性部分，其不同于完整的生物体，可以为部分组织或部分器官，但具有与该功能活性部分所来源于的完整的生物体基本上相同的功能和/或活性。例如，生物体的功能活性部分可以为血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液、骨骼、胃、肾、心、肝、胰、肺脏、唾液腺或肠。
在本申请中，术语“IL-15”,“IL15”和“白细胞介素15”在本文中可互换使用，并且包括由细胞天然表达的其任何变体或同种型。白细胞介素15是充当T细胞(特别是肠上皮内淋巴细胞(IEL))和自然杀伤(NK)细胞的有效生长、存活和活化因子的促炎细胞因子。已在多种炎性疾患，包括CD、类风湿性关节炎(RA)和牛皮癣中证实了IL-15的表达增加(Malamut等人,2010)。IL-15被认为是CD免疫病理的中心调控因子和RCD中淋巴瘤形成的非冗余驱动因子。拮抗剂对IL-15的抑制是治疗CD的有吸引力的治疗靶标。通过用于结合IL-15的完全人单克隆抗体靶向IL-15有助于阐明CD中由IL-15促进的信号传导机制，并且已经确立了调节IL-15的下游效应子的优点的实验证明原理(Malamut等人,2010)。
在本申请中，术语“sgRNA”，“指导RNA”，“单指导RNA”和“合成指导RNA”是可互换的，并且通常是指包含指导序列的多核苷酸序列。指导序列约20bp，并且在指定靶 位点的指导RNA内。
在本申请中，术语“CRISPR”通常是指成簇的规则间隔的短回文重复序列。CRISPR基因座通常与其他SSR的不同之处在于重复序列的结构，这些重复序列被称为短规则间隔重复序列(SRSR)。通常，重复序列是短的元件，以规则间隔的簇出现，具有基本恒定长度的独特插入序列。菌株之间的重复序列高度保守，但是散布的重复序列的数目和间隔区的序列通常因菌株而异。
在本申请中，术语“同源重组”通常是指一种遗传重组类型，其中核苷酸序列在被称为同源序列或同源臂的两个相似或相同的DNA分子之间交换。
在本申请中，术语“CRISPR相关蛋白9”或“Cas9蛋白”通常是指与某些细菌中发现的II型CRISPR(有规律地间隔的短回文重复序列)自适应免疫系统相关的RNA引导的DNA核酸内切酶，比如，化脓性链球菌等细菌。例如，Cas9蛋白不仅可以包含在化脓链球菌中发现的野生型Cas9，而且可以包括其各种变体，例如WO2013/176772A1中描述的那些。在一些实施方案中，如Esvelt等人，Nature Methods，10(11)：1116-1121，2013中所述，Cas9蛋白可包含来自化脓性链球菌，脑膜炎奈瑟氏球菌，嗜热链球菌和树突线虫的Cas9序列。
在本申请中，术语“Cas9编码序列”通常是指能够根据在宿主细胞/宿主动物中起作用的遗传密码被转录和/或翻译以产生Cas9蛋白的多核苷酸序列。Cas9编码序列可以是DNA(例如质粒)或RNA(例如mRNA)。
在本申请中，术语“Cas9核糖蛋白”通常是指由Cas9蛋白和相关的指导RNA组成的蛋白/RNA复合物。
在本申请中，术语“CRISPR/Cas9系统”也可称为“Cas9-gRNA系统”，通常是指用于生物体中位点特异性基因组靶向的工具。例如，它可以是II型CRISPR/Cas系统，它是一种原核适应性免疫反应系统，该系统使用非编码RNA指导Cas9核酸酶诱导位点特异性DNA切割。通过细胞DNA修复机制，可以通过非同源末端连接DNA修复途径(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)途径修复这种DNA损伤。可以利用CRISPR/Cas9系统创建一种简单的RNA可编程方法来介导哺乳动物细胞中的基因组编辑，并可以用于生成基因敲除(通过插入/缺失)或敲入(通过HDR)。
在本申请中，术语“敲入”通常是指涉及基因序列中DNA序列信息的一对一替换或内源基因座中未发现的序列信息的插入的基因工程过程。敲入可能涉及插入特定基因座的基因，因此可以是“靶向”插入。
在本申请中，术语“靶向载体”通常是指携带要插入或掺入宿主基因组和/或用于替代内源DNA片段的靶向序列的载体。
在本申请中，术语“胚胎干细胞”或“ES细胞”通常是指源自胚泡(哺乳动物的早期植入前胚胎)的内部细胞团(ICM)的多能干细胞，可以在延长的体外培养后进行培养，然后将其插入/注入正常的胚泡腔中，并诱导其恢复正常的胚胎发育程序，以分化为成年哺乳动物的各种细胞类型，包括生殖细胞。
在本申请中，术语“合子”通常是指通过两个配子例如卵和来自哺乳动物的精子之间的受精事件形成的真核细胞。
在本申请中，术语“合子性”通常是指生物体中性状的等位基因的相似度。
在本申请中，术语“纯合子”是针对特定基因或DNA(例如已被敲入的异源核酸序列)使用的，并且是指二倍体细胞或生物。这两个同源染色体都具有相同的等位基因或基因/DNA拷贝。
在本申请中，术语“杂合子”是针对特定基因或DNA(例如已被敲入的异源核酸序列)使用的，并且是指二倍体细胞或生物。这两个同源染色体具有不同的基因或DNA等位基因/拷贝/版本。
在本申请中，术语“IL-15拮抗剂”通常是指减少、阻断、抑制、废除或干扰产生自IL-15与其一种或多种结合配偶体的相互作用的信号转导的分子。所述IL-15拮抗剂的类型的例子可以包括结合IL-15家族细胞因子且抑制它与IL-15受体的相互作用的分子。例如，特异性结合IL-15家族细胞因子的抗体、含有IL-15受体的至少一个外显子的可溶性多肽、和/或结合IL-15受体且抑制它与IL-15家族细胞因子的相互作用的分子(例如特异性结合IL-15受体的抗体)。在一些实施方案中，IL-15拮抗剂调控，阻断，抑制，降低，拮抗，中和或以其它方式干扰IL-15细胞因子的生物学活性。在一些实施方案中，IL-15拮抗剂调控，阻断，抑制，降低，拮抗，中和或以其它方式干扰IL-15受体的生物学活性。在一些实施方案中，IL-15拮抗剂可以包括小分子。
在本申请中，术语“人IL-15介导的功能”通常是指由患有障碍的受试者中异常的人IL-15水平引起的(单独或与其他介导物相关联的)、恶化的、相关的、或延长的任何病变。在一些实施例中，该人IL-15介导的功能可以是淋巴细胞发育障碍。例如，组织或关节的淋巴细胞浸润或者诱导性的关节炎。
在本申请中，术语“人IL-15介导NK细胞的发育”通常是指人IL-15能够诱导支持NK细胞的发育。在某些情形下，人IL-15介导发育出的NK细胞可以表达功能性蛋白。在某些情形下，人IL-15介导发育出的NK细胞可以介导ADCC作用，杀伤肿瘤细胞。在某些情形下，人IL-15介导发育出的NK细胞作为先天免疫系统的成员，可以杀伤入侵机体的病原体。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
小鼠或其功能活性部分
一方面，本申请提供一种小鼠或其功能活性部分，其包含人源化的IL-15基因，其中所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，
其中所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分，
其中所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
例如，所述小鼠或其功能活性部分，其包含人源化的IL-15基因，所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，其中所述人IL-15基因区段可以包含人IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及一部分外显子8，所述小鼠IL-15基因区段可以包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
所述功能活性部分是指保留活性功能的部分结构。例如，生物体的功能活性部分，其不同于完整的生物体，可以为部分组织或部分器官，但具有与该功能活性部分所来源于的完整的生物体基本上相同的功能和/或活性。例如，生物体的功能活性部分可以为血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液、骨骼、胃、肾、心、肝、胰、肺脏、唾液腺或肠。又例如，所述小鼠的功能活性部分可以为小鼠的血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液、骨骼、胃、肾、心、肝、胰、肺脏、唾液腺或肠。
在本申请中，所述人IL-15基因区段中的外显子可以由人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分组成。
例如，所述人IL-15基因区段中的外显子可以由人IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8组成。
在某些实施方式中，所述人源化的IL-15基因可以包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分。
例如，所述人源化的IL-15基因可以包含人IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8。
在本申请中，所述人IL-15基因区段可以包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。所述人IL-15基因区段编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段还可以包含小鼠IL-15基因的调控序列。在某些情 形中，所述调控序列可以包括编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列、编码5’UTR的核苷酸序列和/或3’UTR的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码5’UTR的核苷酸序列。所述编码5’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码3’UTR的核苷酸序列。所述编码3’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述人源化的IL-15基因可以包含编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述人源化的IL-15基因可以包含编码5’UTR的核苷酸序列。所述编码5’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述人源化的IL-15基因可以包含编码3’UTR的核苷酸序列。所述编码3’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以不包含小鼠IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分。
例如，所述小鼠IL-15基因区段可以不包含小鼠IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8。
在某些实施方式中，所述人源化的IL-15基因可以缺乏小鼠IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分。
例如，所述人源化的IL-15基因可以缺乏小鼠IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8。
在本申请中，所述小鼠可以为NCG小鼠。所述NCG小鼠是一种重度免疫缺陷小鼠，该小鼠的T细胞、B细胞和NK细胞均缺陷。
在某些实施方案中，所述人源化的IL-15基因可以包含SEQ ID NO:2所示的核酸序列。所述人源化的IL-15基因编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述野生型小鼠(即IL-15未被人源化)的IL-15基因可以包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。所述野生型小鼠(即IL-15未被人源化)的IL-15蛋白可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
后代、细胞系、组织和细胞
另一方面，本申请提供所述的小鼠的后代或其功能活性部分，其中所述后代或其功能活性部分包含人源化的IL-15基因，所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分，所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
所述后代可以通过使本发明的小鼠与第二只小鼠杂交而获得，其中所述第二只小鼠可以包含或可以不包含本申请所述的人源化的IL-15基因。例如，后代可以通过使本申请的小鼠与携带不相同或不同的遗传信息的另一只小鼠杂交。
另一方面，本申请提供一种细胞系或原代细胞培养物，其源自所述的小鼠或其功能活性部分；或源自所述的小鼠的后代。
另一方面，本申请提供一种组织，其源自所述的小鼠或其功能活性部分；或源自所述的小鼠的后代。在某些实施方式中，所述组织可以包括所述小鼠或所述小鼠的后代的体液。所述体液可以选自下组：血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液。
在某些实施方式中，所述组织可以选自下组：上皮组织、结缔组织、神经组织和肌肉组织。
另一方面，本申请提供一种细胞，其源自所述的小鼠或其功能活性部分；或源自所述的小鼠的后代。在某些实施方式中，所述细胞可以选自下组：上皮细胞、神经细胞、红细胞、白细胞、血小板、吞噬细胞、B淋巴细胞、效应B细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、血细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞和内分泌细胞。
在某些实施方式中，所述细胞不能发育为完整的小鼠。例如，所述细胞可以不是全能干细胞或胚胎干细胞。
在某些实施方式中，所述组织或细胞可直接获自本申请的小鼠或其功能活性部分。备选地，可以通过将所述人源化的IL-15基因序列引入其基因组并任选地进一步培养这些修饰的细胞/组织来产生所述组织或细胞。
制备方法
另一方面，本申请提供制备经遗传修饰的小鼠的方法，所述方法包括：
用编码成熟人IL-15多肽的人IL-15基因区段替换在内源小鼠IL-15基因座上的编码成熟小鼠IL-15多肽的小鼠IL-15基因区段以形成人源化的IL-15基因，其中所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部 分。
例如，本申请所述的制备经遗传修饰的小鼠的方法，可以包括：将编码成熟人IL-15多肽的人IL-15基因区段敲入内源小鼠IL-15基因座，以替代在内源小鼠IL-15基因座上的编码成熟小鼠IL-15多肽的小鼠IL-15基因区段，从而形成人源化的IL-15基因，其中所述人IL-15基因区段可以包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分。所述被替代的小鼠IL-15基因区段可以包括小鼠IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分。
例如，在所述小鼠的编码区中，所述小鼠IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6和外显子7，以及外显子8的至少一部分可以被替换为所述人IL-15基因区段，从而形成人源化的IL-15基因，所述编码区是会翻译产生蛋白质的核酸序列。
又例如，在所述小鼠的编码区中，所述小鼠IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6和外显子7，以及一部分外显子8可以被替换为所述人IL-15基因区段，从而形成人源化的IL-15基因，所述编码区是会翻译产生蛋白质的核酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3，所述小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3是不被替换的。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段还可以包含小鼠IL-15基因的调控序列。在某些情形中，所述调控序列可以包括编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列、编码5’UTR的核苷酸序列和/或3’UTR的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码5’UTR的核苷酸序列。所述编码5’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码3’UTR的核苷酸序列。所述编码3’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
在某些实施方案中，所述人源化的IL-15基因可以包含SEQ ID NO:2所示的核酸序列。所述人源化的IL-15基因编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述小鼠可以为NCG小鼠。
在某些实施方式中，所述人IL-15基因区段中的外显子可以由人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分组成。
例如，所述人IL-15基因区段中的外显子可以由人IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8组成。
在本申请中，所述人IL-15基因区段可以包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
在本申请中，所述替换可以包括使用Cas9-gRNA系统。所述“Cas9-gRNA系统”也可称为“CRISPR/Cas9系统”，是一种用于生物体中位点特异性基因组靶向的工具。例如，它可以是II型CRISPR/Cas系统，它是一种原核适应性免疫反应系统，该系统使用非编码RNA指导Cas9核酸酶诱导位点特异性DNA切割。通过细胞DNA修复机制，可以通过非同源末端连接DNA修复途径(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)途径修复这种DNA损伤。可以利用CRISPR/Cas9系统创建一种简单的RNA可编程方法来介导哺乳动物细胞中的基因组编辑，并可以用于生成基因敲除(通过插入/缺失)或敲入(通过HDR)。
在本申请中，所述gRNA可以与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补。在某些情形中，与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:10-11中任一项所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述gRNA可以与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补。在某些情形中，与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:12-13中任一项所示的核苷酸序列。
在某些情形中，与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；且与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；或者，与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；且与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
在某些情形中，与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；且与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；或者，与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；且与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA可以包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
用途
另一方面，本申请提供所述小鼠在制备小鼠模型中的用途。
在本申请中，所述小鼠模型包含人源化的IL-15基因，其中所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，
其中所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分，
其中所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
例如，所述小鼠模型，其包含人源化的IL-15基因，所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，其中所述人IL-15基因区段可以包含人IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及一部分外显子8，所述小鼠IL-15基因区段可以包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
在本申请中，所述人IL-15基因区段中的外显子可以由人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分组成。
例如，所述人IL-15基因区段中的外显子可以由人IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8组成。
在某些情形中，所述人源化的IL-15基因可以包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分。
例如，所述人源化的IL-15基因可以包含人IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8。
在本申请中，所述人IL-15基因区段可以包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。所述人IL-15基因区段编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段还可以包含小鼠IL-15基因的调控序列。在某些情形中，所述调控序列可以包括编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列、编码5’UTR的核苷酸序列和/或3’UTR的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码5’UTR的核苷酸序列。所述编码5’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以包含编码3’UTR的核苷酸序列。所述编码3’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
例如，所述人源化的IL-15基因可以包含编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
例如，所述人源化的IL-15基因可以包含编码5’UTR的核苷酸序列。所述编码5’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
例如，所述人源化的IL-15基因可以包含编码3’UTR的核苷酸序列。所述编码3’UTR的核苷酸序列可以包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
在本申请中，所述小鼠IL-15基因区段可以不包含小鼠IL-15基因的外显子4、外显子5、 外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分。
例如，所述小鼠IL-15基因区段可以不包含小鼠IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8。
例如，所述人源化的IL-15基因可以缺乏小鼠IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分。
例如，所述人源化的IL-15基因可以缺乏小鼠IL-15基因的一部分外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和一部分外显子8。
在本申请中，所述小鼠模型可以为NCG小鼠。所述NCG小鼠是一种重度免疫缺陷小鼠，该小鼠的T细胞、B细胞和NK细胞均缺陷。
在本申请中，所述人源化的IL-15基因可以包含SEQ ID NO:2所示的核酸序列。所述人源化的IL-15基因编码的蛋白可以包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述野生型小鼠(即IL-15未被人源化)的IL-15基因可以包含SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。所述野生型小鼠(即IL-15未被人源化)的IL-15蛋白可以包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
在本申请中，所述小鼠模型可以用于评估IL-15拮抗剂对所述小鼠中人IL-15介导的功能的拮抗作用。
例如，所述小鼠模型可以用于评估IL-15拮抗剂对所述小鼠中人IL-15介导的功能的拮抗作用。
在本申请中，所述小鼠可以用于重建人淋巴细胞。
在本申请中，所述淋巴细胞可以是NK细胞、T细胞、B细胞。
在本申请中，所述小鼠可用于评价药物的抗肿瘤疗效。
例如，所述小鼠可用于评价药物治疗人淋巴瘤的疗效。
例如，所述小鼠可用于评价药物治疗人肺癌的疗效。
在本申请中，所述“IL-15拮抗剂”通常是指减少、阻断、抑制、废除或干扰产生自IL-15与其一种或多种结合配偶体的相互作用的信号转导的分子。所述IL-15拮抗剂的类型的例子可以包括结合IL-15家族细胞因子且抑制它与IL-15受体的相互作用的分子。例如，特异性结合IL-15家族细胞因子的抗体、含有IL-15受体的至少一个外显子的可溶性多肽、和/或结合IL-15受体且抑制它与IL-15家族细胞因子的相互作用的分子(例如特异性结合IL-15受体的抗体)。在一些实施方案中，IL-15拮抗剂调控，阻断，抑制，降低，拮抗，中和或以其它方式干扰IL-15细胞因子的生物学活性。在一些实施方案中，IL-15拮抗剂调控，阻断，抑制，降低，拮抗，中和或以其它方式干扰IL-15受体的生物学活性。在一些实施方案中，IL-15拮 抗剂可以包括小分子。
在本申请中，所述“人IL-15介导的功能”通常是指由患有障碍的受试者中异常的人IL-15水平引起的(单独或与其他介导物相关联的)、恶化的、相关的、或延长的任何病变。在一些实施例中，该人IL-15介导的功能可以是淋巴细胞发育障碍。例如，组织或关节的淋巴细胞浸润、诱导性的关节炎，或者淋巴细胞肿瘤(例如B细胞肿瘤或T细胞肿瘤)。
例如，所述人IL-15介导的功能可以包括人IL-15介导的淋巴细胞发育。在某些实施方案中，所述人IL-15介导的功能可以包括人IL-15介导的组织或关节的淋巴细胞浸润。在本申请中，所述人IL-15介导的功能可以包括人IL-15介导的诱导性的关节炎。在本申请中，所述人IL-15介导的功能可以包括淋巴细胞肿瘤，例如B细胞肿瘤或T细胞肿瘤。在本申请中，所述人IL-15介导的功能可以包括类风湿性关节炎。在本申请中，所述IL-15介导的功能可以包括介导NK细胞的发育。例如，所述NK细胞可以杀伤肿瘤细胞。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的小鼠模型、制备方法。用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd edition，Cold spring Harbor Laboratory Press。
实施例
实施例1.制备本申请所述的小鼠
利用CRISPR/Cas9的方式将人类IL-15基因的部分外显子4(Exon4)、外显子5(Exon5)、外显子6(Exon6)、外显子7(Exon7)和部分外显子8(Exon8)融合，然后用融合后的基因替换小鼠IL-15基因的部分外显子4(Exon4)、外显子5(Exon5)、外显子6(Exon6)、外显子7(Exon7)和部分外显子8(Exon8)，建立IL-15基因人源化小鼠模型(即本申请所述的小鼠)。需要说明的是，制备过程中使用的小鼠为NCG小鼠(雌鼠8周龄，雄鼠10周龄，由集萃药康生物科技有限公司提供)。本申请所述小鼠的具体制备步骤如下：
1.1.确定人源片段替换区域及插入的人源序列
根据人源IL-15蛋白功能域及人鼠同源性比较，选取人源IL-15基因的部分外显子4(Exon4)、外显子5(Exon5)、外显子6(Exon6)、外显子7(Exon7)、部分外显子8(Exon8)融合后替换小鼠IL-15基因的部分外显子4(Exon4)、外显子5(Exon5)、外显 子6(Exon6)、外显子7(Exon7)、部分外显子8(Exon8)，保留小鼠IL-15基因的部分信号肽及全部UTR序列。选取的人源IL-15基因序列(即本申请所述的人IL-15基因区段)如SEQ ID No：1所示，其编码区氨基酸序列如SEQ ID No：7所示；小鼠未被人源化处理前，其IL-15基因序列如SEQ ID No：6所示，其IL-15氨基酸序列如SEQ ID No：9所示。
1.2.IL-15人源化小鼠制备的sgRNA筛选
根据人IL-15基因区段确定sgRNA大概区域，针对目的片段选取脱靶率最低的几组序列(表1-1)作为待选sgRNA。设计并合成识别5’端靶位点和3’端靶位点，并构建sgRNA表达载体。两端sgRNA识别位点分别位于小鼠IL-15基因的第四个和第八个外显子上，各sgRNA在IL-15上的靶位点序列及引物序列如表1-1和表1-2所示。
表1-1.sgRNA序列信息
Figure PCTCN2020139153-appb-000001
表1-2.sgRNA引物信息
Figure PCTCN2020139153-appb-000002
sgRNA转录：以PrimerStar Max体系(详见表2-1和表2-2)，sgRNA-F、sgRNA-R为引物(即以表1-2中的序列为引物)，测序正确的puc57-sgRNA质粒(购于NEB公司，货号 R0535V，1：30稀释)为模板进行PCR，PCR产物进行纯化，制备sgRNA转录制备模板。使用T7-ShortScript体外转录试剂盒(购于Invitrogen公司，AM1354)进行sgRNA的转录。
表2-1.PCR反应体系
试剂(Takara R045) 体积(μl) 规格
2×Taq Master Mix(Dye Plus) 12.5 \
ddH 2O 9.5 \
引物 1 10μM
引物 1 10μM
模板 1  
表2-2.PCR反应条件
Figure PCTCN2020139153-appb-000003
sgRNA筛选：将5’端靶位点和3’端靶位点sgRNA分别筛选并进行两两配对，组合成2对sgRNA，各sgRNA组合详见表3。分别将这些sgRNA与Cas9蛋白(购于强耀生物科技有限公司)进行孵育后，将混合液注射至0.5天的小鼠受精卵(集萃药康生物科技有限公司)中，培养至囊胚阶段后，进行小鼠IL-15基因的KO阳性率的鉴定，以此筛选sgRNA对。
sgRNA切割鉴定：对收集的囊胚进行PCR扩增(PCR方案如下)，根据PCR结果进行统计(发生KO才可扩增出目的条带)，统计发生KO的概率(即切割效率，鉴定结果见表3)，根据各sgRNA所处位置和各种组合切割效率最终选择IL15-5S1+IL15-3S2组合进行后续实验。
表3.sgRNA切割活性
Figure PCTCN2020139153-appb-000004
1.3.人源化打靶载体构建
利用同源重组的技术，用上述人源IL-15基因替换小鼠IL-15基因的部分外显子4(Exon4)、外显子5(Exon5)、外显子6(Exon6)、外显子7(Exon7)和部分外显子8(Exon8)，构建成功的打靶载体序列如SEQ ID No：2所示。将构建好的打靶载体通过转录然后再逆转录，获得可用于注射的ssDNA(单链)供体。
1.4.IL-15人源化小鼠模型建立
将ssDNA(单链)供体及Cas9/sgRNA系统(即包含Cas9蛋白的sgRNA)注射至0.5天的小鼠受精卵(集萃药康生物科技有限公司)中，移植至0.5天假孕雌鼠(集萃药康生物科技有限公司)体内，等小鼠出生后，经基因鉴定筛选出中靶小鼠。需要说明的是，出生后的小鼠统称为F0代小鼠，将其中的中靶小鼠(即包含本申请所述的人源化的IL-15基因)统称为阳性F0代小鼠。
人源化小鼠F0代基因型鉴定：对获得的F0代小鼠的鼠尾基因组DNA分别使用两对引物进行中靶后的两端PCR鉴定，引物710022-IL15-5tF1/710022-IL15-5tR1分别位于5’同源臂外及ssDNA(单链)供体的人源片段内，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标供体在小鼠基因组5’进行了有效插入；710022-IL15-3tF1/710022-IL15-3tR1分别位于ssDNA(单链)供体的人源片段内及3’同源臂外，如该对引物扩增产生PCR产物，说明目标供体在小鼠基因组3’进行了有效插入。引物序列具体请见表4，PCR反应体系和反应条件请见表2-1和表2-2。
表4.F0代小鼠基因鉴定引物
引物名称 引物序列(SEQ ID No：)
710022-IL15-5tF1 22
710022-IL15-5tR1 23
710022-IL15-3tF1 24
710022-IL15-3tR1 25
对两端PCR鉴定阳性的小鼠克隆进行测序验证，测序引物具体请见表5。测序后，发现阳性F0代小鼠的IL-15蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：8所示，编码IL-15蛋白的核苷酸序列(即本申请所述的人源化的IL-15基因)如SEQ ID No：2所示。
表5.两端PCR鉴定阳性的小鼠克隆的测序引物
引物名称 引物序列(SEQ ID No：)
710022-IL15-5tF1 22
710022-IL15-5tR1 23
710022-IL15-3tF1 24
710022-IL15-3seqR1 26
710022-IL15-WT-TF1 27
710022-IL15-WT-TR1 28
最终获得4只阳性F0代小鼠。如图1所示，图中WT为未被基因敲除/敲入的NCG小鼠基因组DNA(阴性对照)；N为空白对照(即无模板的对照)；P为阳性对照(即打靶载体)；M为marker：TRANS 2K PLUS II条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500b p\250bp\100bp)，可以看出，152#，153#，158#，169#，174#，178#小鼠的人源IL-15基因5’及3’鉴定均为阳性，测序无突变，表明小鼠为正确进行基因重组的阳性F0代小鼠。
阳性F0代小鼠与背景鼠(即未被基因敲除/敲入的NCG小鼠)配繁获得F1代小鼠，对F1代小鼠的鼠尾进行基因鉴定，将其中的中靶小鼠(即包含本申请所述的人源化的IL-15基因)统称为阳性F1代小鼠。测序引物如表5所示，其中引物710022-IL15-WT-TF1和710022-IL15-WT-TR1用于检测未被基因敲除/敲入的NCG小鼠基因组DNA。测序后，发现阳性F1代小鼠的IL-15蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No：8所示，编码IL-15蛋白的核苷酸序列(即本申请所述的人源化的IL-15基因)如SEQ ID No：2所示。
F1代小鼠PCR实验结果如图2所示，图中WT为未被基因敲除/敲入的NCG小鼠基因组DNA(阴性对照)；N为空白对照(即无模板的对照)；P为阳性对照(即打靶载体；M为marker：TRANS 2K PLUS II条带：8000bp\5000bp\3000bp\2000bp\1000bp\750bp\500bp\2 50bp\100bp)，可以看出，560#，561#，562#，563#，567#，788#，789#，790#小鼠人源IL-15基因5’及3’鉴定均为阳性，同时鼠源检测也为阳性，表明获得的小鼠为正确进行基因重组的杂合阳性小鼠。F1代小鼠大量扩繁后进行互配，获得纯合子。
实施例2.NCG-IL15小鼠中人源IL-15表达检测
2.1.人源IL-15mRNA表达检测
选取NCG背景鼠(即未被基因敲除/敲入的NCG小鼠)及NCG-IL15人源化小鼠(即本申请所述的小鼠，实施例1中的F1代小鼠的后代小鼠，纯合子)的心、肝、脾、肺、肾、肠、胃、肌肉、卵巢、骨髓、外周血、脑组织，提取mRNA，反转为cDNA，并通过Q-PCR检测NCG小鼠中鼠源IL-15及NCG-IL15人源化小鼠中人源IL-15的mRNA表达水平，表达检测引物具体请见表6。
表6.IL-15表达检测引物
引物名称 引物序列(SEQ ID No：)
mIL15-RT-qTF1 29
mIL15-RT-qTR1 30
hIL15-RT-qTF1 31
hIL15-RT-qTR1 32
Q-PCR检测结果如图3所示，图中NCG表示NCG背景鼠，NCG-hIL15表示NCG-IL15人源化小鼠，可以看出，背景鼠中心脏、肝脏、肾脏、小肠及肌肉组织中鼠源IL15的表达水平较高，脾脏、肺脏、胃、卵巢、骨髓、外周血及脑组织中表达水平较低，而NCG-IL15人源化小鼠中人源IL15组织表达特异性与NCG背景鼠一致，在心脏、肝脏、肾脏、小肠及肌肉组织中表达水平较高，脾脏、肺脏、胃、卵巢、骨髓、外周血及脑组织中表达水平较低。
2.2.蛋白表达检测
选取NCG背景鼠(即未被基因敲除/敲入的NCG小鼠)及NCG-IL15人源化小鼠(即本申请所述的小鼠，实施例1中的F1代小鼠的后代小鼠，杂合子NCG-hIL15h/m及纯合子NCG-hIL15h/h)的外周血，使用人源IL-15Elisa检测试剂盒(购于R&D公司，货号D1500)检测血清中人IL-15蛋白的表达情况。
结果如图4所示，图中NCG-hIL15表示NCG-IL15人源化小鼠，可以看出，背景鼠中未检测到人源IL15表达，而NCG-IL15人源化小鼠的杂合子及纯合子中均能检测到人源IL15 的表达，纯合子表达水平高于杂合子。
实施例3.NCG-IL15小鼠中移植人源NK细胞的发育检测
选取NCG背景鼠(即未被基因敲除/敲入的NCG小鼠)及NCG-IL15人源化小鼠(即本申请所述的小鼠，实施例1中的阳性F1代小鼠的后代小鼠，为杂合子)，使用人源外周血纯化的NK细胞(huPBMC-NK，购于妙通生物科技有限公司)通过尾静脉注射的方式注射至小鼠体内，通过流式细胞仪(购于Thermo Attune NxT公司)检测外周血中人NK细胞的发育情况。
结果如图5A和图5B所示，可以看出，背景鼠中人白细胞(检测Marker：hCD45)比例较低，人NK细胞(检测Marker：hCD56hCD16)比例较低，且仅可以维持2周左右，而NCG-IL15人源化小鼠中人白细胞比例高于背景鼠，人NK细胞可以维持至10周，且比例高于NCG背景鼠。
检测NCG-IL15人源化小鼠中重建的人NK细胞的功能，结果如图6A和图6B所示，可以看出，在NCG-IL15人源化小鼠中重建的人NK的功能性Marker比例较移植前无明显变化，且可分泌穿孔素(图7所示)，说明在NCG-IL15人源化小鼠中发育出来的人NK细胞具有正常生理功能。
实施例4.NCG-IL15小鼠中移植人源造血干细胞HSC的免疫重建进程检测
选取NCG背景鼠(即未被基因敲除/敲入的NCG小鼠)及NCG-IL15人源化小鼠(即本申请所述的小鼠，实施例1中的阳性F1代小鼠的后代小鼠，为杂合子)，使用人源CD34+造血干细胞HSC(huHSC，购于妙通生物科技有限公司)通过尾静脉注射的方式注射至小鼠体内，监测小鼠存活及体重变化情况，并通过流式细胞仪(购于Thermo Attune NxT公司)检测外周血中人免疫细胞的发育情况。
小鼠存活及体重变化情况如图8A和图8B所示，移植人源造血干细胞HSC后18周内没有出现小鼠死亡，同时小鼠体重呈现稳定上升趋势。同时，于第5、7、9、11、13周收集NCG背景鼠及huHSC-NCG-hIL15小鼠外周血，通过流式细胞仪(购于Thermo Attune NxT公司)检测NCG背景鼠及NCG-IL15小鼠免疫重建进程监测，检测指标为hCD45、hCD3、hCD19、hCD4、hCD8、hCD56。如图9A-9E所示，注射HSC细胞后的NCG-IL15小鼠于第5周起外周血中hCD45+白细胞水平在已达20％以上，且重建比例高于NCG背景鼠；于第9周起hCD3+T细胞水平逐渐增加，且分化出hCD4+及hCD8+T细胞亚群。如图9F所示，与NCG背景鼠相比，NCG-IL15人源化小鼠外周血hCD45+中hCD56+NK细胞重建水平明显升高(约20％)，表明NCG-IL15人源化小鼠表达的IL15支持NK细胞在小鼠体内的定植和扩增。
检测NCG-IL15人源化小鼠移植造血干细胞HSC后重建的人NK细胞的功能，重建后第13周结果如图10A和图10B所示，可以看出，在NCG-IL15人源化小鼠中重建的人NK的可表达功能性Marker(hCD16、hKIR3DL、hNKG2D)。重建后第18周结果如图11所示，可以看出在NCG-IL15人源化小鼠中重建的人NK的可持续表达功能性Marker(hCD16、hKIR3DL、hNKG2D，hNKG2A)，说明在NCG-IL15人源化小鼠中由造血干细胞分化扩增出来的人NK细胞具有持续正常生理功能。
实施例5.NCG-IL15小鼠中移植人源造血干细胞HSC重建NK细胞杀伤及ADCC作用检测
分离NCG-IL15人源化小鼠(即本申请所述的小鼠，实施例1中的阳性F1代小鼠的后代小鼠，为杂合子)，使用人源CD34+造血干细胞HSC(huHSC，购于妙通生物科技有限公司)通过尾静脉注射的方式注射至小鼠体内进行人源免疫系统的重建。
将对数生长期人白血病细胞K562细胞浓度调整至5×10 3/50μL/孔加入96孔板中，并采用人CD56阳性细胞分离磁珠(购自Miltenyi Biotec)分选重建NCG-IL15小鼠脾脏中NK细胞，按照NK：K562效靶比为2:1，5:1，10:1每孔加入50μL的NK细胞混匀。将96孔板放入37℃培养箱中培养4小时，通过LDH(购自Abcam)检测NK细胞对K562的杀伤作用。结果如图12A所示，随着效靶比的增加，NCG-IL15人源化小鼠重建NK细胞对于K562细胞的杀伤率也随之增加。
将对数生长期人淋巴瘤细胞Raji细胞浓度调整至5×10 3/50μL/孔加入96孔板中，分别加入0μg/mL及10μg/mL的Rituximab(靶向CD20抗体，购自Roche，主要通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用ADCC杀伤CD20+肿瘤细胞)放入37℃培养箱中孵育1小时。采用人CD56阳性细胞分离磁珠(购自Miltenyi Biotec)分选重建NCG-IL15小鼠脾脏中NK细胞，按照NK：Raji效靶比为2:1，5:1每孔加入50μL的NK细胞到抗体孵育后50μL的Raji细胞中混匀。将96孔板放入37℃培养箱中培养4小时，通过LDH(购自Abcam)检测Rituximab抗体介导对Raji细胞的ADCC杀伤作用。结果如图12B所示，随着效靶比的增加，NCG-IL15人源化小鼠重建NK细胞对于Raji细胞的杀伤率也随之增加。
实施例6.移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠用于抗肿瘤药效评估
收集对数生长期人非小细胞肺癌细胞HCC827细胞浓度调整至1×10 7/100μL/只分别接种NCG-IL15及移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠皮下。待细胞接种出瘤后，每周称量体重两次。每周测量瘤体积两次，瘤体积计算方式为：肿瘤体积(mm 3)＝0.5×(肿瘤长 径×肿瘤短径 2)。并在实验终点通过流式检测移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠外周血中免疫细胞重建情况及皮下形成的HCC827肿瘤组织中免疫细胞浸润情况。
结果如图13所示，HCC827细胞在NCG-IL15小鼠及移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠上均表现出良好的成瘤性，接种40天后平均肿瘤体积均达到900mm 3以上；在观测40天中无小鼠出现死亡，且小鼠体重无明显下降，说明免疫重建并不影响HCC827细胞的成瘤性及小鼠状态。在实验终点对移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠外周血进行流式检测显示人hCD45+白细胞的比例超过20％，并可分化出较高比例的hCD3+T细胞及hCD3-hCD56+NK细胞；其中CD3+T细胞可分化出hCD4+及hCD8+细胞，CD4+细胞中也可检测到一定比例的hCD25+hCD127-调节性T细胞；hCD56+NK细胞可表达功能性Marker(hCD16、hKIR3DL、hCD335、hNKG2D/CD314)。同时在实验终点对移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠的肿瘤组织进行流式检测显示有大量人hCD45+细胞的浸润，包括hCD3+T细胞及其个亚型细胞与可表达功能性marker的hCD3-hCD56+NK细胞。以上数据表明移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠可以用于评价借助T细胞及NK细胞发挥抗肿瘤作用的肿瘤免疫治疗相关药效的肿瘤模型构建。
收集对数生长期人淋巴瘤细胞Raji细胞浓度调整至1×10 7/100μL/只接种移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠皮下，待肿瘤生长至平均体积约40～50mm 3时，随机分为PBS组，Rituximab给药组及Blincyto(靶向CD3及CD19的双特异性抗体，购自百英生物科技有限公司，主要通过介导CD3+T细胞杀伤CD19+肿瘤细胞)给药组，并使用相应的药物进行治疗。PBS和Rituximab每3天给药1次，共给药5次；Blincyto每天给药1次，共给药5次。
结果如图14所示，Rituximab组及Blincyto组对移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15的Raji细胞荷瘤鼠上肿瘤生长有抑制作用(Rituximab治疗组TGI＝59.67％，Blincyto治疗组TGI＝48.95％)。以上结果说明移植人源造血干细胞HSC的NCG-IL15小鼠结合人来源的肿瘤构建的动物模型可以用于评价借助T细胞及NK细胞发挥抗肿瘤作用的肿瘤免疫治疗相关药效评估。
前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本申请所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

Claims (47)

  1. 小鼠或其功能活性部分，其包含人源化的IL-15基因，其中所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，
    其中所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分，
    其中所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
  2. 根据权利要求1所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述小鼠IL-15基因区段还包含小鼠IL-15基因的调控序列。
  3. 根据权利要求1-2中任一项所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述人IL-15基因区段中的外显子由人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分组成。
  4. 根据权利要求1-3中任一项所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述人IL-15基因区段包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
  5. 根据权利要求1-4中任一项所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述小鼠为NCG小鼠。
  6. 根据权利要求1-5中任一项所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述小鼠IL-15基因区段包含编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。
  7. 根据权利要求6所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
  8. 根据权利要求1-7中任一项所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述小鼠IL-15基因区段包含编码5’UTR的核苷酸序列。
  9. 根据权利要求8所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述编码5’UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
  10. 根据权利要求1-9中任一项所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述小鼠IL-15基因区段包含编码3’UTR的核苷酸序列。
  11. 根据权利要求10所述的小鼠或其功能活性部分，其中所述编码3’UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
  12. 根据权利要求1-11中任一项所述的小鼠的后代或其功能活性部分，其中所述后代或其功能活性部分包含人源化的IL-15基因，所述人源化的IL-15基因包含人IL-15基因区段和小鼠IL-15基因区段，所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分，所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
  13. 细胞系或原代细胞培养物，其源自权利要求1-11中任一项所述的小鼠或其功能活性部分；或源自权利要求12所述的小鼠的后代。
  14. 组织，其源自权利要求1-11中任一项所述的小鼠或其功能活性部分；或源自权利要求12所述的小鼠的后代。
  15. 根据权利要求14所述组织，其包括所述小鼠或所述小鼠的后代的体液。
  16. 根据权利要求15所述组织，其中所述体液选自下组：血液、血浆、血清、尿液、汗液、泪液、唾液、精液和脑脊髓液。
  17. 根据权利要求14-16中任一项所述的组织，其选自下组：上皮组织、结缔组织、神经组织、和肌肉组织。
  18. 细胞，其源自权利要求1-11中任一项所述的小鼠或其功能活性部分；或源自权利要求12所述的小鼠的后代。
  19. 根据权利要求18所述的细胞，其中所述细胞选自下组：上皮细胞、神经细胞、红细胞、白细胞、血小板、吞噬细胞、B淋巴细胞、效应B细胞、记忆B细胞、T淋巴细胞、记忆T细胞、效应T细胞、NK细胞、树突状细胞、粒细胞、血细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、心肌细胞、成骨细胞、神经胶质细胞、肝细胞、肾细胞、腺细胞和内分泌细胞。
  20. 根据权利要求18-19中任一项所述的细胞，其中所述细胞不能发育为完整的小鼠。
  21. 制备经遗传修饰的小鼠的方法，所述方法包括：
    用编码成熟人IL-15多肽的人IL-15基因区段替换在内源小鼠IL-15基因座上的编码成熟小鼠IL-15多肽的小鼠IL-15基因区段以形成人源化的IL-15基因，其中所述人IL-15基因区段包含人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7，以及外显子8的至少一部分。
  22. 根据权利要求21所述的方法，其中所述小鼠IL-15基因区段包含小鼠IL-15基因的外显子1，外显子2和外显子3。
  23. 根据权利要求21-22中任一项所述的方法，其中所述小鼠IL-15基因区段还包含小鼠IL-15基因的调控序列。
  24. 根据权利要求21-23中任一项所述的方法，其中所述人IL-15基因区段中的外显子由人IL-15基因的外显子4、外显子5、外显子6、外显子7和外显子8的至少一部分组成。
  25. 根据权利要求21-24中任一项所述的方法，其中所述人IL-15基因区段包含SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
  26. 根据权利要求21-25中任一项所述的方法，其中所述小鼠为NCG小鼠。
  27. 根据权利要求21-26中任一项所述的方法，其中所述小鼠IL-15基因区段包含编码小 鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列。
  28. 根据权利要求27所述的方法，其中所述编码小鼠IL-15的信号肽的核苷酸序列包含SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
  29. 根据权利要求21-28中任一项所述的方法，其中所述小鼠IL-15基因区段包含编码5’UTR的核苷酸序列。
  30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述编码5’UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列。
  31. 根据权利要求21-30中任一项所述的方法，其中所述小鼠IL-15基因区段包含编码3’UTR的核苷酸序列。
  32. 根据权利要求31所述的方法，其中所述编码3’UTR的核苷酸序列包含SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
  33. 根据权利要求21-32中任一项所述的方法，其中所述替换包括使用Cas9-gRNA系统。
  34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述gRNA与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补。
  35. 根据权利要求33-34中任一项所述的方法，其中所述gRNA与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补。
  36. 根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:10-11中任一项所示的核苷酸序列。
  37. 根据权利要求33-36中任一项所述的方法，其中与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:12-13中任一项所示的核苷酸序列。
  38. 根据权利要求33-37中任一项所述的方法，其中与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；且与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列；或者，
    与所述小鼠IL-15基因的外显子4互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；且与所述小鼠IL-15基因的外显子8互补的所述gRNA包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列。
  39. 权利要求1-11中任一项所述的小鼠在制备小鼠模型中的用途。
  40. 根据权利要求39所述的用途，其中所述小鼠模型用于评估IL-15拮抗剂对所述小鼠中人IL-15介导的功能的拮抗作用。
  41. 根据权利要求39-40中任一项所述的用途，其中所述人IL-15介导的功能包括人IL-15介导的淋巴细胞发育。
  42. 根据权利要求39-41中任一项所述的用途，其中所述人IL-15介导的功能包括人IL-15介导的组织或关节的淋巴细胞浸润。
  43. 根据权利要求39-42中任一项所述的用途，其中所述人IL-15介导的功能包括人IL-15介导的诱导性的关节炎。
  44. 根据权利要求39-43中任一项所述的用途，其中所述人IL-15介导的功能包括人IL-15介导NK细胞的发育。
  45. 根据权利要求39-44中任一项所述的用途，其中所述小鼠模型可用于评价药物的抗肿瘤疗效。
  46. 根据权利要求45中所述的用途，其中所述肿瘤包括淋巴细胞肿瘤。
  47. 根据权利要求45中所述的用途，其中所述肿瘤包括肺癌。
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