CN105744829A - 人源化的il-15动物 - Google Patents

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Abstract

提供了包含人源化的白细胞介素?15(IL?15)基因的经遗传修饰的非人动物。提供了包含人IL?15基因的细胞、胚胎和非人动物。提供了表达人源化或人的IL?15蛋白质的啮齿类动物。

Description

人源化的IL-15动物
领域
提供了在其种系中包含人源化的内源非人IL-15基因座的非人动物。提供了在其种系中包含处于内源非人调节元件的控制之下的人源化IL-15编码序列的非人动物。提供了包含经遗传修饰的非人动物(例如哺乳动物，例如啮齿类动物例如小鼠、大鼠和仓鼠)，所述遗传修饰包括在内源基因座上用人或人源化的IL-15基因序列替换非人IL-15基因序列。提供了从内源的经修饰的非人IL-15基因座表达人或人源化IL-15的啮齿类动物及其它非人动物。提供了在非人IL-15启动子和/或调节序列的控制下表达人或人源化IL-15的非人动物。
通过引用并入的序列表
以ASCII文本文件形式，命名为31013_SEQ.txt，于2014年10月14日创建，并且经由EFS-Web提交给美国专利商标局的9KB的序列表通过引用并入本文。
背景
具有随机插入的包含人IL-15序列的转基因的转基因小鼠是本领域已知的。然而，从随机整合的转基因表达人IL-15的转基因小鼠在一个方面或另一个方面不是最佳的。例如，大多数对于人IL-15是转基因的小鼠显示出某些细胞包括淋巴细胞(例如T细胞)的异常水平和/或比率，这可能是由于免疫细胞功能的失调。这样的小鼠还显示出一系列病理状态，推测根本地是由于转基因IL-15的失调。这样的失调可起因于例如内源控制元件的缺失，和/或人IL-15序列置于远离内源IL-15基因座之处。
本领域存在对于包含人IL-15编码序列的非人动物的需要，其中所述人IL-15编码序列在内源非人IL-15基因座上，和/或处于内源非人IL-15元件(例如上游和/或下游非编码区)的调节控制下。本领域存在对于在内源非人调节元件的控制下表达人IL-15的非人动物的需要。本领域存在对于非人动物的需要，所述非人动物以在非人动物中生理学相关的方式表达人IL-15。本领域存在对于表达人IL-15的非人动物的需要，其中所述非人动物没有在淋巴细胞群体例如T细胞群体中的显著异常性。本领域还存在对于非人动物的需要，所述非人动物表达人或人源化的IL-15，并且没有由对于人IL-15是转基因的非人动物所显示出的病理状态中的一种或多种。
概述
在各个方面和实施方案中，提供了包含人源化的IL-15基因座的遗传修饰的非人生物体。提供了包含人源化的IL-15基因的非人生物体，其中所述人源化的IL-15基因处于一种或多种内源非人调节元件的控制之下。提供了在内源非人IL-15基因座上包含人源化的IL-15基因的非人生物体。提供了包含内源的人源化的IL-15基因座的非人生物体，所述内源的人源化的IL-15基因座能够通过生物体的种系传递。提供了从经修饰的内源IL-15基因座表达人IL-15的非人动物，例如哺乳动物(例如啮齿类动物，例如小鼠或大鼠)，其中所表达的IL-15是完全或部分人的。
提供了经遗传修饰的非人动物、胚胎、细胞、组织和核酸，其包含通过非人IL-15调节控件调节的人IL-15基因组序列。非人动物表达人源化的IL-15蛋白质或完全人IL-15蛋白质(例如完全人成熟IL-15蛋白质)，并且不显示出本领域已知的转基因人IL-15非人动物的病理状态中的一种或多种。在各个实施方案中，非人动物是哺乳动物，例如啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。在具体实施方案中，哺乳动物是啮齿类动物；在另一个具体实施方案中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。
提供了经遗传修饰的非人动物、胚胎、细胞、组织和核酸，其包含在内源非人IL-15基因座上的人IL-15基因组序列。非人动物从经修饰的内源非人基因座(其通过经修饰的内源IL-15基因座的一种或多种内源非人调节序列调节)表达人源化的IL-15蛋白质或完全人IL-15蛋白质(例如完全人成熟IL-15蛋白质)，并且不显示出本领域已知的转基因人IL-15非人动物的病理状态中的一种或多种。在各个实施方案中，非人动物是哺乳动物，例如啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。在具体实施方案中，哺乳动物是啮齿类动物；在另一个具体实施方案中，啮齿类动物是小鼠或大鼠。
在各个实施方案和方面中，非人动物包含在非人动物的基因组中的经修饰的IL-15基因座，以使得经修饰的IL-15基因座能够通过种系传递，其中经修饰的内源IL-15基因座包含内源IL-15基因座的至少成熟蛋白质编码部分的人源化。在各个实施方案中，非人动物是哺乳动物。在各个实施方案中，哺乳动物是啮齿类动物，并且啮齿类动物就经修饰的IL-15基因座而言是杂合或纯合的。在各个实施方案中，啮齿类动物选自小鼠和大鼠。在各个实施方案中，小鼠和大鼠对于经修饰的IL-15基因座是纯合的，并且不能表达内源的完全小鼠或完全大鼠IL-15蛋白质，并且小鼠和大鼠表达成熟人IL-15蛋白质。
在一个实施方案中，提供了包含第一内源野生型IL-15等位基因和人源化的第二内源IL-15等位基因的非人动物。
在一个实施方案中，提供了包含第一内源IL-15等位基因的缺失和第二内源IL-15等位基因的人源化的非人动物。
在一个实施方案中，提供了包含功能性内源IL-15等位基因的缺失，并且包含处于内源非人调节元件的控制之下的至少一个拷贝的人源化IL-15等位基因的非人动物。在一个实施方案中，所述至少一个拷贝的人源化IL-15等位基因在内源IL-15基因座上。
在各个实施方案和方面中，人源化是在内源非人IL-15基因座上的一个或多个外显子和/或内含子的人源化。在各个实施方案和方面中，提供了具有经修饰的IL-15基因座的非人动物，其中内源非人5'非翻译区和内源非人3'非翻译区之一或两者保留在经修饰的非人动物中。
在一个实施方案中，内源非人IL-15基因座的人源化是具有其为人IL-15基因座的基因组片段的编码区(或其片段)，所述人IL-15基因座的基因组片段包含至少一个人IL-15蛋白质编码外显子。
在一个实施方案中，内源非人IL-15基因座的人源化是具有其为人IL-15基因座的基因组片段的编码区，所述人IL-15基因座的基因组片段包含每个人IL-15蛋白质编码外显子，但不包含非人IL-15蛋白质编码外显子。
在一个实施方案中，包含人基因组片段的IL-15基因座导致当成熟时为完全人的IL-15蛋白质的表达。在一个实施方案中，内源非人IL-15基因座的人源化是具有编码人IL-15蛋白质的cDNA，以使得在非人动物中加工后，通过人源化的基因座产生的成熟IL-15蛋白质是完全人的。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人动物，其包含整个或部分人源化的内源IL-15基因座，其中所述人源化的IL-15基因座包含处于内源非人调节元件的控制下的人源化的IL-15编码基因。在一个实施方案中，内源非人调节元件包含在人源化的IL-15基因的第一蛋白质编码区或外显子上游(就IL-15基因的转录方向而言)的所有内源IL-15调节元件。在一个实施方案中，内源非人调节元件包含在人源化的IL-15基因的末个蛋白质编码区或外显子下游(就IL-15基因的转录方向而言)的所有内源IL-15调节元件。在一个实施方案中，人源化的IL-15编码基因包含人3’UTR。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其包含在内源啮齿类动物IL-15基因座上用人IL-15基因组序列对内源啮齿类动物IL-15基因组序列的替换。在一个实施方案中，遗传修饰在非人动物的种系中。
在一个实施方案中，经遗传修饰的啮齿类动物包含在人IL-15基因组序列上游(就IL-15基因的转录方向而言)的第一啮齿类动物调节序列，以及在人IL-15基因组序列下游的第二啮齿类动物调节序列。在一个实施方案中，第一啮齿类动物调节序列包含啮齿类动物启动子和/或增强子，并且第二啮齿类动物调节序列包含3’-UTR。
在一个方面，提供了表达人或人源化的IL-15蛋白质的经遗传修饰的非人动物。
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其包含在内源小鼠IL-15基因座上用人IL-15基因组序列(或其片段)对内源小鼠IL-15基因组序列(或其片段)的替换，以形成经修饰的基因座，其中所述人IL-15基因组序列包含至少一个人蛋白质编码外显子。
在一个实施方案中，替换包含人基因组片段，其包含人IL-15的至少两个蛋白质编码外显子。在一个实施方案中，替换包含人基因组片段，其包含人IL-15的至少三个蛋白质编码外显子。在一个实施方案中，替换包含人基因组片段，其包含人IL-15的至少四个蛋白质编码外显子。在一个实施方案中，替换包含人基因组片段，其包含人IL-15的蛋白质编码外显子3、4、5和6。在一个实施方案中，替换包含少于所有人IL-15外显子，其中替换的人外显子由人IL-15基因的最下游(就IL-15基因的转录方向而言)四个蛋白质编码外显子组成。在一个实施方案中，替换基本上由人基因组片段组成，所述人基因组片段含有人IL-15的不超过四个蛋白质编码外显子；在一个实施方案中，替换进一步基本上由最5'的人外显子上游的人内含子序列以及在人终止密码子下游和人3’UTR下游的人非蛋白质编码序列组成。
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其包含人源化的IL-15基因座，其中所述人源化的IL-15基因座包含非蛋白质编码小鼠外显子，其中每个(成熟)蛋白质编码小鼠外显子替换为(成熟)蛋白质编码人外显子。在一个实施方案中，人源化的IL-15基因座包含用编码成熟(即非前蛋白)人IL-15蛋白质序列的人基因组片段对编码成熟(即非前蛋白)小鼠IL-15蛋白质序列的小鼠基因组片段的替换。
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其包含与SEQ ID NO:5至少95％、96％、97％、98％、或99％同一或与其相同的序列。
在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其包含与SEQ ID NO:5至少95％、96％、97％、98％、或99％同一或与其相同的序列；其中所述小鼠缺乏编码如本文描述的小鼠IL-15蛋白质的外显子3至6的内源序列，并且所述小鼠包含在内源小鼠IL-15基因座上的核酸序列，其中所述核酸序列编码如本文描述的人IL-15外显子3、4、5和6。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其从内源小鼠IL-15基因座表达人或人源化的IL-15蛋白质，所述内源小鼠IL-15基因座经修饰以包含编码成熟人IL-15蛋白质中的氨基酸的至少一个人IL-15外显子。在一个实施方案中，内源啮齿类动物IL-15基因座包含编码成熟人IL-15蛋白质中的氨基酸的至少两个人IL-15外显子。在一个实施方案中，内源啮齿类动物IL-15基因座包含编码成熟人IL-15蛋白质中的氨基酸的至少三个人IL-15外显子。在一个实施方案中，内源啮齿类动物IL-15基因座包含编码成熟人IL-15蛋白质中的氨基酸的至少四个人IL-15外显子。在一个实施方案中，内源啮齿类动物包含编码成熟人IL-15蛋白质中的氨基酸的人IL-15外显子3、4、5和6。在一个实施方案中，内源啮齿类动物IL-15基因座包含编码成熟人IL-15蛋白质中的氨基酸的所有人核酸序列。
在一个实施方案中，人源化包含人IL-15 3’UTR。在一个实施方案中，啮齿类动物基因座包含不编码成熟IL-15蛋白质的氨基酸的至少一个外显子，或包含包括不编码成熟IL-15蛋白质的氨基酸的核苷酸序列的至少一个外显子。在一个实施方案中，啮齿类动物基因座包含不编码成熟IL-15蛋白质的氨基酸的至少两个外显子。在一个实施方案中，啮齿类动物基因座包含不编码成熟IL-15蛋白质的氨基酸的至少三个外显子。在一个实施方案中，啮齿类动物基因座包含不编码成熟IL-15蛋白质的氨基酸的四个外显子。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物的淋巴细胞群体的特征在于其T细胞群体与年龄匹配的野生型小鼠中的T细胞群体在数目上大约相同。在一个实施方案中，经修饰的啮齿类动物的特征在于成熟T细胞群体与年龄匹配的野生型小鼠中的成熟T细胞群体在数目上大约相同。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物的淋巴细胞群体的特征在于T细胞群体与年龄匹配的野生型小鼠中的T细胞群体在数目上大约相同。在一个实施方案中，经修饰的啮齿类动物显示出与年龄匹配的野生型小鼠中的成熟T细胞群体在数目上大约相同的成熟T细胞群体。在一个实施方案中，经修饰的啮齿类动物显示出与年龄匹配的野生型小鼠中的外周T细胞群体在数目上大约相同的外周T细胞群体。在一个实施方案中，成熟的人源化IL-15蛋白质等同于成熟人IL-15蛋白质。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物的淋巴细胞群体的特征在于T细胞群体显示出与年龄匹配的野生型小鼠中的T细胞群体中的CD4:CD8比率大约相同的CD4:CD8比率。在一个实施方案中，人源化的IL-15蛋白质等同于人IL-15蛋白质。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物的淋巴细胞群体的特征在于自然杀伤(NK)细胞群体与年龄匹配的野生型小鼠中的NK细胞群体在尺寸上大约相同。在一个实施方案中，人源化的IL-15蛋白质等同于人IL-15蛋白质。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人或人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物的淋巴细胞群体的特征在于T细胞群体和NK细胞群体各自与年龄匹配的野生型小鼠中的T细胞群体和NK细胞群体在尺寸上大约相同。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不发展自发性肠炎症。在一个实施方案中，啮齿类动物不展示比年龄匹配的野生型啮齿类动物任何更多的发展肠炎症的倾向。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不发展在十二指肠-空肠区域中的自发性炎症。在一个实施方案中，啮齿类动物不展示比年龄匹配的野生型啮齿类动物任何更多的在十二指肠-空肠区域中发展炎症的倾向。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不显示出比年龄匹配的野生型啮齿类动物更大的肠上皮破坏。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不显示出比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高速率或频率的乳糜泻。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不显示出比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的对饮食诱导的肥胖的抵抗，并且不显示出比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的胰岛素敏感性。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物在被病原体感染后不比年龄匹配的野生型啮齿类动物对脂多糖诱导的致命性肝损伤更敏感。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展银屑病皮损。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展关节炎。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展关节的淋巴细胞浸润。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率发展炎性滑膜炎。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人或人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展一种或多种病理状态，其中所述一种或多种病理状态选自关节炎、关节的淋巴细胞浸润、炎性滑膜炎、银屑病皮损、病原体相关的脂多糖诱导的致命性肝损伤、胰岛素抵抗、对饮食引起的肥胖的抵抗、自发性肠炎症、十二指肠-空肠区域中的自发性炎症、肠上皮的破坏、乳糜泻及其组合。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人或人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展两种或更多种病理状态，其中所述两种或更多种病理状态选自关节炎、关节的淋巴细胞浸润、炎性滑膜炎、银屑病皮损、病原体相关的脂多糖诱导的致命性肝损伤、胰岛素抵抗、对饮食引起的肥胖的抵抗、自发性肠炎症、十二指肠-空肠区域中的自发性炎症、肠上皮的破坏和乳糜泻。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人或人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展三种或更多种病理状态，其中所述三种或更多种病理状态选自关节炎、关节的淋巴细胞浸润、炎性滑膜炎、银屑病皮损、病原体相关的脂多糖诱导的致命性肝损伤、胰岛素抵抗、对饮食引起的肥胖的抵抗、自发性肠炎症、十二指肠-空肠区域中的自发性炎症、肠上皮的破坏和乳糜泻。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人或人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展四种或更多种病理状态，其中所述四种或更多种病理状态选自关节炎、关节的淋巴细胞浸润、炎性滑膜炎、银屑病皮损、病原体相关的脂多糖诱导的致命性肝损伤、胰岛素抵抗、对饮食引起的肥胖的抵抗、自发性肠炎症、十二指肠-空肠区域中的自发性炎症、肠上皮的破坏和乳糜泻。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人或人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展五种或更多种病理状态，其中所述五种或更多种病理状态选自关节炎、关节的淋巴细胞浸润、炎性滑膜炎、银屑病皮损、病原体相关的脂多糖诱导的致命性肝损伤、胰岛素抵抗、对饮食引起的肥胖的抵抗、自发性肠炎症、十二指肠-空肠区域中的自发性炎症、肠上皮的破坏和乳糜泻。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其表达人或人源化的IL-15蛋白质，其中啮齿类动物不以比年龄匹配的野生型啮齿类动物更高的速率或频率发展六种或更多种病理状态，其中所述六种或更多种病理状态选自关节炎、关节的淋巴细胞浸润、炎性滑膜炎、银屑病皮损、病原体相关的脂多糖诱导的致命性肝损伤、胰岛素抵抗、对饮食引起的肥胖的抵抗、自发性肠炎症、十二指肠-空肠区域中的自发性炎症、肠上皮的破坏和乳糜泻。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人动物，其包含内源IL-15基因座的人源化，其中所述动物表达部分或完全人的成熟IL-15蛋白质，并且其中所述部分或完全人的成熟IL-15蛋白质以与年龄匹配的野生型动物中的内源IL-15蛋白质可比较的水平且在相同组织中表达。
在一个方面，提供了大的靶向载体(LTVEC)，其包含针对内源非人IL-15基因座的同源臂，其中LTVEC包含置于所述同源臂之间的连续人基因组片段，其包含人IL-15基因的蛋白质编码外显子。在一个实施方案中，连续人基因组片段不包含人IL-15基因座的非蛋白质编码外显子。在一个实施方案中，连续人基因组片段进一步包含IL-15基因的人3’UTR。
在一个方面，提供了核酸(例如DNA)构建体，其就转录方向而言从5’到3’包含与小鼠IL-15 5'非编码序列同源的核酸序列、包含人IL-15蛋白质编码外显子但不包含就人IL-15蛋白质编码序列而言上游的人调节序列的人基因组片段、以及与小鼠IL-15 3’非编码序列同源的核酸序列。在一个实施方案中，人基因组片段进一步包含人IL-153’UTR。
在一个方面，提供了核酸(例如DNA)构建体，其就转录方向而言从5’到3’包含含有针对在第一小鼠IL-15蛋白质编码外显子上游的小鼠IL-15基因序列的同源区域的核酸序列、编码人IL-15蛋白质但不包含在编码人IL-15蛋白质的序列上游的人调节序列的人基因组片段、以及与小鼠IL-15 3’非编码序列同源的核酸序列。在一个实施方案中，人基因组片段进一步包含人IL-15 3’UTR。
在一个方面，提供了经遗传修饰的非人细胞，其中所述非人细胞包含在内源非人IL-15基因座上用编码人IL-15的人基因组序列对编码非人IL-15的基因序列的替换。
在一个实施方案中，人基因组序列包含跨人IL-15基因的所有蛋白质编码外显子的连续人核酸序列。
在一个实施方案中，经遗传修饰的啮齿类动物包含在内源非人IL-15基因座上的非人IL-15启动子。
在一个实施方案中，经遗传修饰的非人动物包含所有啮齿类动物非蛋白质编码外显子和在啮齿类动物IL-15基因的第一蛋白质编码外显子上游的调节区。
在一个实施方案中，细胞选自多能细胞、诱导多能细胞、全能细胞、ES细胞、体细胞和卵子。
在一个实施方案中，细胞表达人IL-15蛋白质。
在一个实施方案中，非人动物是哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是啮齿类动物。在一个实施方案中，啮齿类动物选自小鼠和大鼠。
在一个方面，提供了非人胚胎，其中所述胚胎包含至少一种非人供体细胞(例如ES细胞、多能细胞、全能细胞等)，其包含在内源非人IL-15基因座上内源非人IL-15编码核酸序列由人IL-15编码核酸序列的替换。在一个实施方案中，供体细胞是非人ES细胞，并且胚胎是宿主非人动物胚胎，其为前桑椹胚、桑葚胚或胚泡。
在一个实施方案中，非人胚胎是大鼠胚胎，并且所述至少一种非人供体细胞是大鼠细胞。在一个实施方案中，非人ES细胞是大鼠ES细胞，并且宿主胚胎是大鼠胚胎。
在一个实施方案中，非人胚胎是小鼠胚胎，并且所述至少一种非人供体细胞是小鼠细胞。在一个实施方案中，非人ES细胞是小鼠ES细胞，并且宿主胚胎是小鼠胚胎。
在一个方面，提供了在内源啮齿类动物IL-15基因座上包含人源化的IL-15基因的啮齿类动物组织。在一个实施方案中，组织选自上皮组织、皮肤组织和肌肉组织。
在一个方面，提供了经遗传修饰的啮齿类动物，其包含编码人IL-15蛋白质的核酸(例如DNA)序列，其中所述啮齿类动物不表达啮齿类动物IL-15，并且其中所述啮齿类动物显示出与野生型啮齿类动物的NK细胞群体大约相同尺寸的NK细胞群体。在一个实施方案中，啮齿类动物是大鼠。在一个实施方案中，啮齿类动物是小鼠。
在一个实施方案中，啮齿类动物显示出与年龄匹配的野生型啮齿类动物的外周T细胞群体大约相同尺寸的外周T细胞群体。
在一个方面，提供了用于制备表达人或人源化的IL-15蛋白质的非人动物的方法，其包括如本文描述遗传修饰非人动物，以在非人动物中形成核酸序列，其包含编码人或人源化的IL-15蛋白质的核酸序列(例如DNA)，其中所述核酸序列在内源非人上游和下游调节元件的控制下。
在一些实施方案中，通过将在内源IL-15基因座上的内源IL-15基因组序列(或其片段)替换为人IL-15基因组序列(或其片段)以形成经修饰的基因座，来遗传修饰非人动物，其中人IL-15基因组序列包含至少一个人蛋白质编码外显子。在一个实施方案中，替换包含人基因组片段，其包含人IL-15的至少两个蛋白质编码外显子。在一个实施方案中，替换包含人基因组片段，其包含人IL-15的至少三个蛋白质编码外显子。在一个实施方案中，替换包含人基因组片段，其包含人IL-15的至少四个蛋白质编码外显子。在具体实施方案中，替换包含人基因组片段，其包含人IL-15的蛋白质编码外显子3、4、5和6。在一个实施方案中，替换进一步包含在人终止密码子下游的人非蛋白质编码序列(例如人3’UTR)。
在一个实施方案中，由多能或全能细胞(例如ES细胞)产生非人动物。在一个实施方案中，采用核注射步骤产生非人动物，其中通过原核注射引入包含人源化的IL-15基因(任选具有上游和/或下游内源非人调节序列)的核酸构建体。在一个实施方案中，核酸构建体包含人基因组片段，其包含人IL-15的蛋白质编码外显子3、4、5和6。在一个实施方案中，核酸构建体进一步包含在人终止密码子下游的人非蛋白质编码序列(例如人3’UTR)。在一个实施方案中，采用非人成纤维细胞产生非人动物，所述非人成纤维细胞用人或人源化的IL-15基因以及(任选的)上游和/或下游非人IL-15调节元件进行遗传修饰。
在一个方面，提供了用于鉴定其为人IL-15的拮抗剂的试剂的方法，其包括下述步骤：给如本文描述的经遗传修饰的啮齿类动物施用试剂，测定试剂对啮齿类动物中的人IL-15介导的功能的作用，并且如果试剂在经遗传修饰的啮齿类动物中拮抗人IL-15的功能，则将它鉴定为IL-15拮抗剂。
在一个实施方案中，试剂包含结合IL-15的免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方案中，试剂特异性结合人IL-15而不是啮齿类动物IL-15。在一个实施方案中，试剂是抗体。
在一个方面，提供了用于测定试剂是否减少IL-15介导的淋巴细胞发育的方法，其包括下述步骤：给如本文描述的经遗传修饰的啮齿类动物施用IL-15拮抗剂一段时间，在施用后的一个或多个时间点测量啮齿类动物的淋巴细胞数目，并且测定IL-15拮抗剂是否减少淋巴细胞群体。
在一个方面，提供了用于测定试剂是否减少IL-15介导的组织或关节的淋巴细胞浸润的方法，其包括下述步骤：给如本文描述的经遗传修饰的啮齿类动物施用IL-15拮抗剂一段时间，在施用后的一个或多个时间点测量组织或关节的淋巴细胞浸润，以及测定IL-15拮抗剂是否减少组织或关节的淋巴细胞浸润。
在一个方面，提供了用于测定试剂是否减少IL-15介导的关节炎进展的方法，其包括下述步骤：给如本文描述且进一步包含经诱导的关节炎的经遗传修饰的啮齿类动物施用IL-15拮抗剂一段时间，测量关节炎进展，并且测定IL-15拮抗剂是否影响啮齿类动物中的关节炎进展。
除非另有说明或由上下文显而易见，否则两个或更多个方面和/或实施方案可进行组合。
附图简述
图1描述了野生型小鼠IL-15基因基因座(上)和人源化的内源小鼠IL-15基因座(下)的示意图(不按照比例)。空心符号指示人序列；实心符号指示小鼠序列；斑点项目指示非翻译区。小鼠IL-15基因的上游(图左侧)非编码外显子未示出(并且不是人源化的)。下方的构建体描述了包含人源化的3’UTR(斑点的)和可移去的药物选择盒(其任选在人源化动物中去除)的人源化IL-15基因的实施方案。
图2是描述了小鼠序列和人序列之间的上游(就IL-15基因的转录方向而言)接合处的核酸序列(SEQ ID NO:1)；所示序列以大写字母的小鼠序列开始，随后为小写字母的AsisI限制位点，随后为大写字母的人IL-15核酸序列。省略号指示序列在所示序列的上游和下游继续。
图3是核酸序列(SEQ ID NO:2)的实施方案，指示大写字母的下游人IL-15编码和非编码序列(下划线了人3’UTR)，随后为小写字母的XhoI位点，随后为lox位点(大写字母，下划线)，随后为下游neo选择盒的序列(大写字母)，其在下游延伸2.6kb。
图4是描述了neo选择盒的下游部分(大写字母)与lox位点(大写字母且下划线)之间的接合、随后的NheI位点(小写字母)、以及随后的人源化下游的小鼠序列(大写字母)的核酸序列(SEQ IDNO:3)；2.6kb指示选择盒进一步上游延伸；省略号指示序列继续。
图5描述了下述蛋白质序列的比对：小鼠IL-15前体蛋白质(上，“mIL15_前体”，SEQ ID NO:4)；通过图1中所描述的基因座人源化产生的混合小鼠/人IL-15前体蛋白质(中，“Regn_混合_m/h”，SEQ IDNO:5)；以及已知的人IL-15同种型1前原蛋白(下，“hIL15同种型1”，SEQ ID NO:6)；由如图1描述的人源化产生的接合通过垂直箭头指示，所述垂直箭头将C指示为替换的第一氨基酸；成熟hIL-15蛋白质起始通过在第一氨基酸N处的弯曲箭头指示。
图6描述了在来自聚I:C注射的杂合hIL-15小鼠的血清中检测到的IL-15。对照指示在来自聚I:C注射的野生型小鼠的培养脾细胞中未检测到hIL-15。
图7描述了人IL-15在ELISA测定中不与小鼠IL-15或聚I:C反应。小鼠IL-15为1000pg/mL。
图8描述了来自对于人IL-15为杂合的小鼠的BM-DC，对于未经处理的小鼠、聚I:C处理的小鼠和LPS处理的小鼠，使用7倍浓缩的BM-DC上清液。
图9描述了来自对于人IL-15为杂合的小鼠的BM-DC产生人IL-15转录物(RT-PCR数据)。泳道1：未经处理的小鼠；泳道2：聚I:C处理的小鼠；泳道3：仅LPS；泳道4：野生型未经处理的小鼠；泳道5：野生型聚I:C处理的小鼠；泳道6：野生型LPS处理的小鼠；泳道7：无cDNA对照(仅水)。
图10描述了在聚I:C注射后，MAID 5218het小鼠以与MAID5217het小鼠可比较的水平产生人IL-15。
详述
提供了经遗传修饰的非人生物体，其包含经修饰的内源IL-15基因座，所述基因座包含人序列，例如一种或多种非人序列由一种或多种人序列的替换。生物体一般能够将修饰传递给后代，即通过种系传递。特别地，提供了经遗传修饰的非人动物。
经遗传修饰的非人动物可以选自：小鼠、大鼠、兔、猪、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如狨猴、猕猴)。对于其中合适的可遗传修饰的ES细胞并非可容易获得的非人动物，利用其它方法来制备包含遗传修饰的非人动物。这样的方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导多能细胞)，采用核转移将经修饰的基因组转移至合适的细胞例如卵母细胞，以及在合适的条件下在非人动物中孕育经修饰的细胞(例如经修饰的卵母细胞)，以形成胚胎。
在一个方面，非人动物是哺乳动物。在一个方面，非人动物是例如跳鼠总科(Dipodoidea)或即鼠总科(Muroidea)的小型哺乳动物。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物是啮齿类动物。在一个实施方案中，啮齿类动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方案中，啮齿类动物选自即鼠总科。在一个实施方案中，经遗传修饰的动物来自选自下述的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、棘鼠、冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(爬鼠、岩鼠、具尾鼠(with-tailed rat)、马达加斯加大鼠和小鼠)、猪尾鼠科(Platacanthomyidae)(例如刺榛睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)。在具体实施方案中，经遗传修饰的啮齿类动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、棘鼠和冠鼠。在一个实施方案中，经遗传修饰的小鼠是来自鼠科的成员。在一个实施方案中，动物是啮齿类动物。在具体实施方案中，啮齿类动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方案中，非人动物是小鼠。
在具体实施方案中，非人动物是啮齿类动物，其为选自下述的C57BL品系的小鼠：C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、和C57BL/Ola。在另一个实施方案中，小鼠是选自其为下述品系的129品系：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等人(1999)Revised nomenclature for strain129mice，Mammalian Genome 10:836，还参见Auerbach等人(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-andC57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在具体实施方案中，经遗传修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL/6品系的混合体。在另一个具体实施方案中，小鼠是前述129品系的混合体，或前述BL/6品系的混合体。在具体实施方案中，混合体中的129品系是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方案中，小鼠是BALB品系，例如BALB/c品系。在另外一个实施方案中，小鼠是BALB品系和另一种前述品系的混合体。在另外一个实施方案中，小鼠是杂交系(例如50％BALB/c–50％129S4/Sv；或50％C57BL/6–50％129；例如F1H4细胞，参见例如Auerbach等人(2000))。
在一个实施方案中，非人动物是大鼠。在一个实施方案中，大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一个实施方案中，大鼠品系是选自Wistar、LEA、Sprague Dawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti的两个或更多个品系的混合体。
非人动物可具有一种或多种其它遗传修饰，和/或其它修饰，其适合于制备人源化IL-15小鼠所用于的特定目的。例如，用于维持异种移植物(例如人癌症或肿瘤)的合适小鼠可以包含一种或多种修饰，其使整个或部分的非人动物的免疫系统妥协、失活或破坏。非人动物的免疫系统的妥协、失活或破坏可以包括例如通过化学手段(例如施用毒素)、物理手段(例如照射动物)和/或遗传修饰(例如敲除一种或多种基因)破坏造血细胞和/或免疫细胞。这样的小鼠的非限制性例子可以包括例如NOD小鼠、SCID小鼠、NON/SCID小鼠、IL2Rγ敲除小鼠、NOD/SCID/γcnull小鼠(参见例如Ito，M.等人(2002)NOD/SCID/γcnull mouse:an excellent recipient mouse model forengraftment of human cells，Blood 100(9):3175-3182)、裸鼠以及Rag1和/或Rag2敲除小鼠。这些小鼠可以任选被照射或以其它方式进行处理，以破坏一种或多种免疫细胞类型。因此，在各个实施方案中，提供了经遗传修饰的小鼠，其包含内源非人IL-15基因座的至少一部分的人源化，并且进一步包含使整个或部分的非人动物的免疫系统(或者免疫系统的一个或多个细胞类型)妥协、失活或破坏的修饰。在一个实施方案中，修饰例如选自导致NOD小鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠、IL-2Rγ敲除小鼠、NOD/SCID/γcnull小鼠、裸鼠、Rag1和/或Rag2敲除小鼠及其组合的修饰。在具体实施方案中，小鼠包含用人成熟IL-15编码序列对所有成熟IL-15编码序列的替换。
在一个实施方案中，小鼠包含用人成熟IL-15编码序列对所有成熟IL-15编码序列的替换，并且小鼠是NOD小鼠。在一个实施方案中，小鼠包含用人成熟IL-15编码序列对所有成熟IL-15编码序列的替换，并且小鼠是SCID小鼠。在一个实施方案中，小鼠包含用人成熟IL-15编码序列对所有成熟IL-15编码序列的替换，并且小鼠是NOD/SCID小鼠。在一个实施方案中，小鼠包含用人成熟IL-15编码序列对所有成熟IL-15编码序列的替换，并且小鼠包含IL-2Rγ敲除。在一个实施方案中，小鼠包含用人成熟IL-15编码序列对所有成熟IL-15编码序列的替换，并且小鼠是NOD/SCID/γcnull小鼠。在一个实施方案中，小鼠包含用人成熟IL-15编码序列对所有成熟IL-15编码序列的替换，并且小鼠是裸鼠。在一个实施方案中，小鼠包含用人成熟IL-15编码序列对所有成熟IL-15编码序列的替换，并且小鼠包含Rag1和/或Rag2敲除。
提供了经遗传修饰的非人动物，其包含内源非人IL-15基因座的修饰，其中所述修饰包含编码成熟IL-15蛋白质的至少一部分的人核酸序列。尽管还提供了包含本文描述的修饰的经遗传修饰的细胞(例如ES细胞、体细胞)，但在许多方面和实施方案中，经遗传修饰的非人动物包含在动物种系中的内源IL-15基因座的修饰。
提供了经遗传修饰的非人动物，其包含用人IL-15基因序列对非人IL-15基因序列的替换。在各个实施方案中，内源非人IL-15基因座整个或部分地被修饰以包含编码成熟IL-15蛋白质的至少一个蛋白质编码外显子的人核酸序列。在各个实施方案中，人序列是人基因组序列，例如包含编码成熟IL-15蛋白质的一部分的一个或多个外显子的连续人基因组序列，或例如编码至少一个或多个外显子(其编码成熟IL-15蛋白质的一部分)的cDNA。在各个实施方案中，编码出现在成熟人IL-15蛋白质中的蛋白质序列的所有IL-15蛋白质编码外显子是人源化的。在各个实施方案中，人源化的IL-15基因座处于上游内源调节序列(例如在人源化上游的所有内源序列)的控制下。在各个实施方案中，人源化包含人3’UTR。
在各个实施方案中，非人动物是哺乳动物。在某些实施方案中，哺乳动物是啮齿类动物。提供了在内源啮齿类动物IL-15基因座上包含IL-15基因的人源化的啮齿类动物。提供了用于制备啮齿类动物例如小鼠的方法，所述啮齿类动物包含在内源IL-15基因座上用人源化的IL-15基因或其片段(例如包含一个或多个外显子的片段)对内源IL-15基因或其片段(例如包含一个或多个外显子的片段)的替换。提供了包含人源化基因的细胞、组织和小鼠，以及从内源非人IL-15基因座表达人IL-15的细胞、组织和小鼠。还提供了在内源啮齿类动物启动子的控制下表达人IL-15蛋白质的啮齿类动物。
IL-15作为IL-2不依赖性T细胞生长因子被发现，其刺激T细胞增殖且支持胸腺发育和自然杀伤(NK)细胞发育(Burton，J.D.等人(1994)A lymphokine，provisionally designated interleukin T andproduced by a human adult T-cell leukemia line，stimulates T-cellproliferation and the induction of lymphokine-activated killer cells，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:4935-4939；Grabstein，K.H.等人(1994)Cloning of a T Cell Growth Factor That Interacts with theβChain ofthe Interleukin-2Receptor，Science 264:965-968)。IL-2和IL-15共享受体亚基。然而，IL-15在免疫细胞群体的维持中的独立重要性是无可争议的；IL-15/IL-15R敲除小鼠显示出低CD8+T细胞、低记忆CD8+T细胞和低NK细胞、以及其它细胞类型(在Steel，J.C.等人(2012)Interleukin-15biology and its therapeutic implications incancer，Trends in Pharmacological Sciences，33(1):35-41中综述)。
IL-15已知在内皮细胞中表达；衍生自内皮细胞的IL-15刺激T细胞的经内皮迁移(参见Oppenheimer-Marks，N.(1998)Interleukin15is Produced by Endothelial Cells and Increases theTransendothelial Migration of T Cells in Vitro and in the SCIDMouse-Human Rheumatoid Arthritis Model In Vivo，J.Clin.Invest.101(6):1261-1272)。因此，早期工作建立了T细胞至炎症部位的召募是通过IL-15介导的可能性(同上)。该事实是重要的，因为IL-15的不恰当表达或过表达可以容易地导致病态表型-表达失调的IL-15的转基因非人动物所面临的情形。适当的IL-15调节是重要的，因为IL-15被认为是处于促炎细胞因子级联的顶点处的促炎细胞因子，从而优先于许多炎症介质的表达(McInnes，I.B.等人(1997)Interleukin-15mediates T cell-dependent regulation of tumor necrosisfactor-αproduction in rheumatoid arthritis，Nature Med.3:189-195，引用于Waldmann，T.A.(2006)The biology of interleukin-2andinterleukin-15:implications for cancer therapy and vaccine design，Nature Rev.Immunol.6:595-601中)。
在肠细胞特异性启动子(T3b启动子)控制下表达人IL-15以在肠上皮细胞中表达人IL-15的转基因小鼠发展在十二指肠-空肠区域中的自发性炎症(Yokoyama，S.等人(2008)Antibody-mediated blockadeof IL-15reverses the autoimmune intestinal damage in transgenicmice that overexpress IL-15in enterocytes，Proc.Natl.Acad.Sci.USA106(37)15849-15854；Ohta，N.等人(2002)IL-15-dependentactivation-induced cell death-resistant Th1type CD8alpha beta+NK1.1+T cells for the development of small intestinal inflammation，J.Immunol.169:460-468)。还参见Nishimura，H.等人(2005)A novelautoregulatory mechanism for transcriptional activation of the IL-15gene by nonsecretable isoform of IL-15generated by alternativesplicing，FASEB J.19:19-28(具有随机插入的mIL-15基因变体的转基因小鼠)。
对于在MHC I类启动子控制下的IL-15的可分泌同种型为转基因的小鼠已被制备，但它们过表达IL-15(Yajima，T.等人(2001)Memoryphenotype CD8(+)T cells in IL-15transgenic mice are involved inearly protection against a primary infection with Listeriamonocytogenes，Eur.J.Immunol.31(3):757-766)。IL-15的过表达与乳糜泻中通过IL-15活化的细胞毒性T淋巴细胞破坏肠上皮关联(Yokoyama，S.等人(2011)Transgenic Mice that Overexpress HumanIL-15in Enterocytes Recapitulate Both B and T Cell-MediatedPathologic Manifestations of Celiac Disease，J.Clin.Immunol.31:1038-1044)，推测是由于促进CD8+T细胞的增殖，所述CD8+T细胞通过NKG2D(自然杀伤2组，成员D)介导的过程靶向肠细胞，所述过程包括同族受体例如MICA/B(同上，在第1039页)。目前似乎显而易见的是局部表达的IL-15引起乳糜泻中的肠中T细胞介导的组织损伤(同上)。
经改造以在肌肉组织和循环中过表达IL-15(采用骨骼肌启动子)的转基因小鼠的至少一项研究确定IL-15过表达影响代谢；这样的小鼠看起来采用IL-15作为减少体脂并提供对饮食诱导的肥胖的抵抗的肌肉因子(myokine)(Quinn，L.S.等人(2009)Oversecretion ofinterleukin-15from skeletal muscle reduces adiposity，Am.J.Physiol.Endocrinol.Metab.296:E191-E202)。
IL-15还被认为牵涉类风湿性关节炎，可能是通过关节的异常T细胞浸润(在例如Fehninger T.A.and Caligiuri，M.A.(2001)Interleukin 15:biology and relevance to human disease，Blood 97(1):14-32中综述)。结节病患者还产生表达IL-15的肺泡巨噬细胞，其可介导肺中的T细胞增殖(同上，在第23页)。IL-15还可以经由T细胞的增殖介导同种异体移植物中的器官排斥(同上，在第24页)。IL-15还可牵涉成人T细胞白血病(例如HTLV-1介导的)，至少部分基于患有成人T细胞白血病的患者中IL-15介导的途径的活化(同上)。体外工作提示IL-15活化HIV复制，这也可能是在人中的情形(同上，在第25页)。
在由牛分枝杆菌卡介苗(Mycobacterium bovis bacillusCalmette-Guérin)感染的表达通过MHC I类启动子驱动的IL-15的转基因小鼠中，IL-15的过度产生致使小鼠对LPS诱导的致命性肝损伤易感，这是当CD8+T细胞从小鼠中耗尽时未观察到的效应(Yajima，T.(2004)Overexpression of Interleukin-15IncreasesSusceptibility to Lipopolysaccharide-Induced Liver Injury in MIcePrimed with Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin，Infectionand Immunity 72(7):3855-3862)，提示通过IL-15过度产生介导的效应。
表达由骨骼肌启动子驱动的IL-15的转基因小鼠显示出更高的胰岛素敏感性和对饮食诱导的肥胖的抵抗，并且看起来促进脂肪酸代谢(Quinn，L.S.等人(2011)Overexpression of interleukin-15in micepromotes resistance to diet-induced obesity，increased insulinsensitivity，and markers of oxidative skeletal muscle metabolism，International Journal of Interferon，Cytokine and MediatorResearch，3:29-42)。
已对鼠IL-15的选择性阻断进行了研究，包括可溶性IL-15Rα，其可能在控制类风湿性关节炎中具有临床益处(同上，在第27页)。因此，表达人或人源化的IL-15(包括以生理学相关方式)的非人动物可用于评价或鉴定人IL-15的选择性阻断。根据一个综述者，“具有体内阻断活性的…有效人IL-15阻断试剂的开发可以促进这样的方法到临床的快速转换”(同上，在第27页)。因此，经遗传修饰的非人动物，例如在其种系中包含人IL-15基因的非人动物会是相当有用的，其中非人动物以生理学适当的方式表达人IL-15。
IL-15是NK细胞发育和功能以及T细胞稳态所需的多效细胞因子。它对于记忆CD8+T细胞区室是特别重要的。IL-15主要由树突状细胞和巨噬细胞产生，并且经由IL-15/IL-15R复合物转呈(transpresent)给NK细胞和T细胞。IL-15还已知为促炎细胞因子，其诱导其它细胞因子的产生，召募并活化T细胞及其它炎症细胞，促进NK细胞的发育和存活，并且促进血管生成；并且许多这些特点展示在银屑病皮损中(在Villadsen，L.S.(2003)Resolution of psoriasisupon blockade of IL-15biological activity in a xenograft mousemodel，J.Clin.Invest.112(10):1571-1580中综述和报道)。已提出IL-15处于促炎细胞因子级联的顶点处，其中调节IL-15信号传导用于疾病治疗的各种策略在进行中(在Waldman(2006)The biology ofinterleukin-2and interleukin-15:implications for cancer therapy andvaccine design，Nature Reviews Immmunology，6:595-601中综述)。在SCID小鼠中的银屑病的异种移植物小鼠模型中，使用针对IL-15R(或IL-15)的抗体阻断IL-15导致银屑病严重度降低(同上)。因此，以生理学相关方式表达人IL-15的非人动物可用于人疾病的模型(例如具有充分确定的效用)，包括但不限于在免疫妥协的小鼠中的模型，例如SCID小鼠及其它免疫妥协的小鼠。因此，在一个实施方案中，提供了包含在内源非人调节元件的控制下的人或人源化的IL-15基因(例如啮齿类动物例如小鼠中的IL-15编码基因的人源化)的啮齿类动物(例如小鼠)。
IL-15基因被发现在人染色体4q31和小鼠染色体8上。人基因含有8个外显子(7个是编码性的)，并且看起来在人和小鼠两者中以两种同种型存在(参见例如Fehninger T.A.and Caligiuri，M.A.(2001)Interleukin 15:biology and relevance to human disease，Blood 97(1):14-32)。IL-15的mRNA在广泛多样的组织和细胞类型中产生，并且IL-15基因在人中的调节看起来受上游区域的负向调节，所述上游区域的缺失导致IL-15启动子活性的急剧增加(同上，在第17页)。缺乏IL-15的转录后控制的转基因小鼠显示出致死性淋巴细胞白血病(同上)。IL-15表达的调节看起来非常紧密，至少通过5'非翻译区AUG三联体、3'调节元件和推定的C末端区域调节位点介导(在McInnes，I.B.and Gracie，J.A.(2004)Interleukin-15:a new cytokinetarget for the treatment of inflammatory diseases，Current Opinion inPharmacology 4:392-397中综述)。人IL-15基因具有九个外显子和八个内含子，其包括存在于人中而不是小鼠中的外显子4a，尽管成熟IL-15蛋白质仅由外显子5至8编码(在Budagian，V.等人(2006)IL-15/IL-15receptor biology:A guided tour through an expandinguniverse，Cytokine&Growth Factor Reviews 17:259-280中综述)。存在产生两种IL-15同种型的两种可变剪接的mRNA产物，其不同之处仅在于信号肽的长度，这对于小鼠和人蛋白是事实(参见例如同上)。为简单起见，描述小鼠IL-15基因座的人源化策略的图1省略了未人源化的上游小鼠序列(包括在成熟蛋白质不出现的外显子)，并且呈现了与所示人源化有关的外显子的重新编号。
IL-15在许多细胞类型和组织中表达，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、角化细胞、表皮细胞、成纤维细胞以及神经、肾、胎盘、肺、心脏和肌肉的上皮细胞(Grabstein，K.H.等人(1994)Cloning ofa T Cell Growth Factor That Interacts with theβChain of theInterleukin-2receptor，Science 264:965-968)。
小鼠IL-15编码序列如图1中所述进行人源化，图1省略了在编码外显子遥远上游的两个非编码外显子(其不是人源化的)的描述。小鼠序列的12299个核苷酸被替换为人序列的12896个核苷酸，以使IL-15基因人源化。
在一个实施方案中，人源化的IL-15基因座缺乏人IL-15 5’UTR。在一个实施方案中，人源化的IL-15基因座包含啮齿类动物5’UTR。在具体实施方案中，啮齿类动物是小鼠，并且人源化的IL-15基因座包含小鼠IL-15 5’UTR。
例如以生理学适当的方式表达人或人源化的IL-15蛋白质的啮齿类动物提供了各种用途，包括但不限于开发用于人疾病和病症的治疗剂。IL-15拮抗剂例如可溶形式或IL-15受体可以阻止动物模型中胶原介导的关节炎的发展(参见Ruchatz，H.等人(1998)Soluble IL-15receptorα-chain administration prevents murine collagen-inducedarthritis:a role for IL-15in development of antigen-inducedimmunopathology，J.Immunol.160:5654-5660)；抗IL-15抗体已显示出针对各种疾病包括银屑病和类风湿性关节炎的功效；在关节炎的动物模型中，IL-15受体拮抗剂阻止关节炎的发展和进展，以及减少关节的淋巴细胞浸润(Ferrari-Lacraz，S.等人(2004)Targeting IL-15Receptor-Bearing Cells with an Antagonist Mutant IL-15/Fc ProteinPrevents Disease Development and Progression in MurineCollagen-Induced Arthritis，J.Immunol..173:5815-5826)；IL-15介导的信号传导还牵涉IBD、SLE、炎性滑膜炎、糖尿病和哮喘(在Budagian，V.等人(2006)IL-15/IL-15receptor biology:A guided tourthrough an expanding universe，Cytokine&Growth Factor Reviews17:259-280中综述)。
利用IL-15敲除小鼠的研究确定IL-15是某些免疫细胞特别是NK细胞的发育所必需的(在Lodolce，J.P.(2002)Regulation of lymphoidhomeostasis by interleukin-15，Cytokine&Growth Factor Reviews，13:429-439中综述)。事实上，暴露于某些病原体(例如牛痘病毒)的IL-15敲除小鼠无法长期存活，推测是由于NK和CD8+T细胞的缺乏(同上)。因此，hIL-15拮抗剂对人NK细胞功能的作用代表人源化的IL-15动物的重要应用。
在各个方面，提供了表达人或人源化的IL-15的经遗传修饰的动物，其可用于测试针对人IL-15的拮抗剂。经遗传修饰的动物可进一步包括人疾病的动物模型，例如疾病被遗传地(敲入或敲除)或以其它方式诱导。在各个实施方案中，经遗传修饰的非人动物进一步包含受损的免疫系统，例如非人动物经遗传修饰以经受或维持人异种移植物，例如人实体瘤或血细胞肿瘤(例如淋巴细胞肿瘤，例如B或T细胞肿瘤)。
实施例
实施例1：使小鼠IL-15基因座人源化
使用遗传工程技术，将小鼠ES细胞进行修饰以在内源小鼠IL-15基因座上用某些人IL-15基因序列替换某些小鼠IL-15基因序列处于小鼠IL-15调节元件的控制下，以产生如图1中所示的人源化基因座。图1未显示小鼠基因的上游(就IL-15基因的转录方向而言)5'非翻译外显子；图1的Ex1显示了编码外显子上游的小的非翻译区(未填充的)。如在图1的底部所示的人源化，小鼠编码外显子1和2得到保留，而小鼠编码外显子3至6被替换为人外显子3至6。在下游末端处，人外显子6之后为终止密码子和人3’-UTR，并且进一步随后为发现于人3’UTR下游的人序列。为了选择目的，包括了选择盒(两侧接上loxP位点(floxed)用于通过Cre去除)。图1的人源化基因座表达完全人的成熟IL-15蛋白质。
靶向构建体。使用标准细菌同源重组(BHR)技术(参见例如Valenzuela等人(2003)High-throughput engineering of the mousegenome coupled with high-resolution expression analysis，NatureBiotech.21(6):652-659)和缺口修复BHR执行BHR以构建含有人IL-15基因的序列的大的靶向载体(LTVEC)用于靶向小鼠IL-15基因座。通过将PCR生成的同源盒连接至克隆盒随后凝胶分离连接产物并电穿孔到BHR感受态细菌(其具有靶细菌人工染色体(BAC))内，来生成线性片段。小鼠BAC PRCI23-203P7用作小鼠序列的来源；人BAC RP11-103B12用作人IL-15基因序列的来源。在选择步骤后，通过跨越新接合处的PCR和限制性分析来鉴定正确重组的克隆。制备含有同源臂和人IL-15基因序列的大的靶向载体(LTVEC)。小鼠ES细胞用LTVEC构建体进行电穿孔，在选择培养基上生长，并且用作供体ES细胞以制备包含如图1中所示的在内源小鼠IL-15基因座上使用人序列的替换的人源化IL-15小鼠。
小鼠IL-15基因(小鼠GeneID:103014；RefSeq转录物:NM_008357.2；ensemble eID:16168)通过下述进行修饰：使用基因组坐标用于删除GRCM38：ch 8:82331173-82343471(负链)；基因组坐标用于替换GRCh37：ch4:142642924-142655819(正链)。小鼠序列的12299个核苷酸被替换为人序列的128996个核苷酸。如上所述的小鼠IL-15序列的替换在图1中图解呈现。
包含人源化的IL-15基因的LTVEC具有在上游由MluI位点侧接的大约13kb的上游小鼠靶向臂，以及在下游由AscI位点侧接的27kb的下游小鼠靶向臂。LTVEC用MluI和AscI进行线性化用于电穿孔。
在LTVEC构建后，跨小鼠/人5’接合处和人/小鼠3’接合处的LTVEC的核苷酸序列如图2-4中所示。
在ES细胞的电穿孔后，执行天然等位基因丢失测定(参见例如Valenzuela等人(2003))以检测因靶向而引起的内源IL-15序列的丢失。
正确靶向的ES细胞(MAID 5217)进一步用瞬时Cre表达载体进行电穿孔，以去除Neo药物选择盒。所得的缺失盒的ES细胞指定为MAID 5218。
实施例2：人源化的IL-15小鼠
生成人源化的IL-15小鼠。通过方法(Poueymirou等人(2007)F0generation mice fully derived fromgene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypicanalyses，Nat Biotechnol 25:91-99)，将包含人源化的IL-15基因座的供体小鼠ES细胞(例如MAID 5217or MAID 5218)引入早期小鼠胚胎内。获得杂合小鼠，并且为了获得就人源化IL-15而言的纯合体，将杂合体进行育种。
实施例3：对人源化的IL-15小鼠表型分型
小鼠。小鼠为野生型(WT)8-10周龄Balb/c雌性或年龄匹配的MAID 5217(对于人IL-15基因是杂合的)雌性。可替代地，小鼠为野生型(WT)或者年龄匹配的MAID 5217或MAID 5218(两者对于人IL-15基因均为杂合的)小鼠。
体内聚I:C注射。将WT Balb/c或MAID 5217het经由尾静脉(IV注射)注射50μg聚I:C(Invivogen；Cat#tlrl-pic)。在24小时后，将小鼠处死并且经由心脏穿刺放血且分离血清。还收获脾，并且通过经由70μM筛网过滤器机械破坏脾，随后通过ACK裂解缓冲液(Invitrogen)处理以裂解红血细胞(RBC)，来制备脾细胞。将经分离的脾细胞培养用于另外的刺激(参见下文)。使用R&D Systems人IL-15QUANTIKINETM试剂盒，就人IL-15分析血清。WT或MAID5218het小鼠经由IP注射50μg聚I:C(Invivogen；Cat#tlrl-pic)。小鼠在第二天经由心脏穿刺进行放血，并且通过ELISA(R&D SystemsQUANTIKINETMELISA试剂盒)就人IL-15分析血清。
骨髓衍生的树突状细胞(BM-DC)制备。将骨髓从未注射的小鼠的胫骨中冲出，并且用ACK裂解缓冲液裂解RBC。将细胞用完全RPMI(w/HEPES、庆大霉素、丙酮酸钠、L-谷氨酰胺和非必需氨基酸)+10％胎牛血清(FBS)进行洗涤，并且计数。2x106细胞在6孔板的每孔中用3mL/孔的完全RPMI+10％FBS+50ng/mL鼠GM-CSF+50ng/mL鼠IL-4进行培养。细胞在37℃/5％CO2下进行培养，并且在培养第2和4天时给予新鲜的GM-CSF/IL-4。在培养第5天时，从培养物中收集非贴壁BM-DC，并且各自保存培养基(条件化培养基)。
脾细胞培养。从各自小鼠收获脾，并且通过经由70μM筛网过滤器机械破坏脾，随后用ACK裂解缓冲液(Invitrogen)处理以裂解RBC，来制备脾细胞。将经分离的脾细胞在48孔板中以2x106/mL脾细胞在1mL完全RPMI+10％FBS中进行培养。细胞用10μg/mL聚I:C、10μg/mL PMA进行处理，或不予以处理。细胞像这样培养过夜，并且第二天收获上清液，并且使用具有3kd分子量截断(MWCO)的Amicon 2mL滤器浓缩8倍。使用R&D Systems人IL-15QUANTIKINETM试剂盒，就人IL-15分析浓缩的上清液。
BM-DC培养。将2x106/mL BM-DC在24孔板中在0.5mL新鲜的完全RPMI+10％FBS和0.5mL条件化培养基中进行铺平板。细胞用25μg/mL聚I:C、1μg/mL LPS进行处理，或不予以处理。所有条件均一式两份执行。细胞像这样培养36小时，并且随后收获上清液。使用具有3kd MWCO的Amicon 2mL滤器，将上清液浓缩7倍。使用R&D Systems人IL-15QUANTIKINETM试剂盒，分析浓缩上清液中的人IL-15水平。经由来自Qiagen的RNAeasyTM微型制备试剂盒，从细胞中分离RNA，用于人IL-15转录物水平的RT-PCR分析。
ELISA。R&D Systems人IL-15QUANTIKINETM试剂盒用于测量血清和浓缩的脾细胞或BM-DC上清液中的人IL-15。试剂盒根据制造商的说明书进行使用。执行另外的对照以验证该试剂盒的特异性(仅检测人而不是小鼠IL-15)，并且证实它不与聚I:C反应。因此，在ELISA上运行1000pg/mL鼠IL-15(注：人IL-15的最高标准为250pg/mL)，以及25μg/mL和12.5μg/mL的单独的聚I:C。发现试剂盒与人IL-15特异性反应(不检测小鼠IL-15)，并且不与聚I:C反应。
RT-PCR。根据制造商的说明书，使用用于RT-PCR的SUPERSCRIPTTMIII第一链合成系统试剂盒(Invitrogen)，由～200ng经分离的RNA制备cDNA。通过使用Taqman DNA聚合物利用下述引物来扩增特异性人IL-15转录物：hIL-15正向引物：gtaaraagtgatttgaaaaa aattgaagat(SEQ ID NO:7)；hIL-15反向引物：tacaaaactctgcaaaaatt ctttaatat(SEQ ID NO:8)。用下述的40个循环执行PCR反应：在90℃下变性15秒，在60℃下退火30秒，在72℃下延伸并且反应随后保持在4℃。转录物在1％琼脂糖凝胶上使用Promega 6x上样染料进行电泳。
结果。在聚I:C注射的MAID 5217het而不是聚I:C注射的年龄/性别匹配的WT Balb/c小鼠的血清中观察到人IL-15(图6；和图10，右图)。类似地，在聚I:C注射的MAID 5218het而不是聚I:C注射的年龄/性别匹配的WT小鼠的血清中观察到人IL-15(图10，左图)。在MAID 5218中产生的IL-15水平与MAID 5217是可比较的(图10)。来自MAID 5217的PMA刺激的脾细胞在体外分泌低水平的人IL-15(在来自WT小鼠的脾细胞中未观察到)。
另外，衍生自MAID 5217het的BM-DC证实用聚I:C(TLR3激动剂)和LPS(TLR4激动剂)体外刺激后的人IL-15分泌，以及显著的基础水平。RT-PCR分析证实仅在来自MAID 5217het小鼠的BM-DC中的特异性人IL-15转录物。
总之，数据指示MAID 5217het和MAID 5218het表达人IL-15。
实施例4：对于人IL-15是纯合的小鼠
将杂合小鼠进行育种，随后如上所述进行基因分型。纯合hIL-15小鼠通过近交进行维持。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种经遗传修饰的小鼠，其基因组包含在内源小鼠IL-15基因座上用含有人IL-15外显子3-6且编码成熟人IL-15多肽的人基因组区段对含有编码成熟小鼠IL-15多肽的小鼠IL-15外显子序列的小鼠基因组片段的替换，以形成人源化的IL-15基因，其中所述人源化的IL-15基因处于内源小鼠IL-15基因座上的内源小鼠IL-15上游调节元件的控制之下。
2.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其中所述人基因组区段中的人IL-15外显子由人IL-15外显子3、4、5和6组成。
3.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其中人源化的IL-15编码基因编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质。
4.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其中所述人基因组区段还包含存在于人IL-15基因座上的人IL-15 3’-UTR下游的人核酸。
5.一种制备经遗传修饰的小鼠的方法，其包括通过用含有人IL-15外显子3-6且编码成熟人IL-15多肽的人基因组区段替换在内源小鼠IL-15基因座上的含有编码成熟小鼠IL-15多肽的小鼠IL-15外显子序列的小鼠基因组片段以形成人源化的IL-15基因，从而修饰小鼠的基因组，其中所述人源化的IL-15基因处于内源小鼠IL-15基因座上的内源小鼠IL-15上游调节元件的控制之下。
6.权利要求5的方法，其中所述人基因组区段中的人IL-15外显子由人IL-15外显子3、4、5和6组成。
7.权利要求5的方法，其中所述人基因组区段还包含存在于人IL-15基因座上的人IL-15 3’-UTR下游的人核酸。
8.权利要求5的方法，其中人源化的IL-15编码基因编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质。
9.一种经遗传修饰的小鼠，其基因组包含人源化的IL-15基因，其中所述人源化的IL-15基因包含小鼠IL-15外显子1-2和含有人IL-15外显子3-6的人基因组区段，其中所述人源化的IL-15基因处于来自内源小鼠IL-15基因座的小鼠IL-15上游调节元件的控制之下，并且所述人源化的IL-15基因编码包含成熟人IL-15多肽序列的蛋白质。
10.权利要求9的经遗传修饰的小鼠，其中所述人基因组区段中的人IL-15外显子由人IL-15外显子3、4、5和6组成。
11.权利要求9的经遗传修饰的小鼠，其中人源化的IL-15编码基因编码包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列的蛋白质。
12.权利要求9的经遗传修饰的小鼠，其中所述人基因组区段还包含存在于人IL-15基因座上的人IL-15 3’-UTR下游的人核酸。
13.权利要求9的经遗传修饰的小鼠，其中所述人源化的IL-15基因在小鼠基因组中除内源IL-15基因座外的位置处。
14.一种制备经遗传修饰的小鼠的方法，其包括向小鼠基因组中引入人源化的IL-15基因，所述人源化的IL-15基因包含含有小鼠IL-15外显子1-2的小鼠基因组区段和含有人IL-15外显子3-6的人基因组区段，其中所述人源化的IL-15基因处于来自内源小鼠IL-15基因座的小鼠IL-15上游调节元件的控制之下，并且所述人源化的IL-15基因编码包含成熟人IL-15多肽序列的蛋白质。
15.权利要求14的方法，其中将所述人源化的IL-15基因在除内源IL-15基因座外的位置上整合至基因组中。

Claims (21)

1.一种包含经修饰的内源IL-15基因座的非人动物，其中所述经修饰的基因座包含非人IL-15基因组序列，其包含含有至少一个人IL-15外显子的人核酸序列，以及野生型非人上游调节区和野生型非人下游调节区。
2.权利要求1的非人动物，其包含含有至少三个人IL-15外显子的人核酸序列。
3.权利要求1的非人动物，其包含含有至少四个人IL-15外显子的人核酸序列。
4.权利要求3的非人动物，其中所述至少四个人IL-15外显子包含人IL-15外显子3、4、5和6。
5.权利要求1的非人动物，其中所述经修饰的内源IL-15基因座包含IL-15编码序列，其产生与人IL-15蛋白质至少95％同一的IL-15蛋白质。
6.权利要求1的非人动物，其为啮齿类动物。
7.权利要求6的啮齿类动物，其选自小鼠和大鼠。
8.一种包含经修饰的IL-15基因座的非人动物，其中所述经修饰的基因座包含含有至少一个人IL-15外显子的人核酸序列，以及野生型非人上游调节区和野生型非人下游调节区。
9.权利要求8的非人动物，其包含含有至少三个人IL-15外显子的人核酸序列。
10.权利要求8的非人动物，其包含含有至少四个人IL-15外显子的人核酸序列。
11.权利要求10的非人动物，其中所述至少四个人IL-15外显子包含人IL-15外显子3、4、5和6。
12.权利要求8的非人动物，其中所述经修饰的IL-15基因座包含IL-15编码序列，其编码与人IL-15蛋白质至少95％同一的IL-15蛋白质。
13.权利要求8的非人动物，其为啮齿类动物。
14.权利要求13的啮齿类动物，其选自小鼠和大鼠。
15.权利要求8的非人动物，其中所述经修饰的IL-15基因座在所述动物的基因组中除内源IL-15基因座外的位置处。
16.一种制备经遗传修饰的非人动物的方法，其包括用包含至少一个人IL-15外显子的人DNA替换内源非人IL-15基因组DNA，以形成经修饰的IL-15基因座，其中所述经修饰的IL-15基因座包含野生型非人上游调节区和野生型非人下游调节区。
17.权利要求16的方法，其中所述人DNA包含人IL-15外显子3、4、5和6。
18.权利要求17的方法，其中所述人DNA进一步包含人IL-153’-UTR。
19.权利要求16的方法，其中所述经修饰的IL-15基因座包含IL-15编码序列，其编码与人IL-15蛋白质至少95％同一的IL-15蛋白质。
20.权利要求16的方法，其中所述非人动物是啮齿类动物。
21.权利要求20的方法，其中所述啮齿类动物选自小鼠和大鼠。
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