CN114107385A - 人源化转基因动物 - Google Patents

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Abstract

提供了人源化转基因动物。本发明涉及人源化改造的转基因非人动物，尤其是啮齿类动物，例如转基因小鼠。具体而言，本发明涉及包含人白介素17A(IL‑17A)基因、人基因17RA(IL‑17RA)和/或人TNF‑α基因的序列的转基因小鼠，制备方法和用途。

Description

人源化转基因动物
本申请是申请日为2020年01月17日，申请号为202010052686.4，发明名称为“人源化转基因动物”的中国发明专利申请的分案申请。
本申请要求于2019年01月17日递交的申请号为CN 201910044180.6，发明名称为“人源化转基因动物”的中国专利申请的优先权，以及2019年07月09日递交的申请号为CN201910616231.8，发明名称为“人源化转基因动物”的中国专利申请的优先权，在此全文引用上述中国专利申请公开的内容以作为本申请的一部分。
技术领域：
本发明涉及基因工程领域，具体人源化改造的转基因非人动物，尤其是啮齿类动物，例如转基因小鼠。具体而言，本发明涉及包含人白介素17A(IL-17A)基因、人基因17RA(IL-17RA)和/或人TNF-α基因的序列的转基因小鼠，其制备方法和用途。
技术背景：
白细胞介素(interleukin,IL)17细胞因子(简称“IL-17”或“IL-17”)家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的T细胞分泌。IL-17家族目前已经发现了6个成员，分别是IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(又称IL-25)和IL-17F。IL-17受体(简称“IL-17R”或“IL-17R”)也形成了一个独特的家族，目前发现了5个同源亚基，分别是IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE。IL-17通过与受体结合，启动其下游信号通路(包括MAP激酶途径、NF-kB途径、mRNA稳定信号途径、ERK信号途径以及JAK/STAT信号途径等)，刺激多种细胞产生炎症介质，已成为免疫和炎性疾病的关键参与因子，并可导致器官特异性或全身性自身免疫疾病。
大量的研究已经证实多种自身免疫性疾病有着高水平的IL-17表达(如多发性硬化、哮喘、炎症性肠病、银屑病、和类风湿性关节炎等)。此外，IL-17还与多种自身免疫性疾病的发生发展密切相关，包括克罗恩病，白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、多发性硬化、心肌炎、I型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、类风湿性关节炎、移植物抗宿主病、银屑病等。此外，IL-17还在多种肿瘤组织中表达。IL-17具有与TNF-α、LTα、IFNγ和IL-1β等细胞因子协同扩大炎症的生物学效应。IL-17和IL-17R缺乏导致过敏原特异性免疫反应和自身免疫性炎症反应减少。通过特异性抗体阻断IL-17的体内生物学活性，在临床中已经表现出显著的效果。目前美国FDA已经批准三款靶向人IL-17/IL-17R相关抗体，包括IL-17A单抗Secukinumab、Ixekizumab和IL-17RA单抗Brodalumab，适应症主要是中重度斑块状银屑病。然而，这些药物存在明显的副作用，比如感染、腹泻等，以及Brodalumab与患者自杀倾向相关。更多靶向该信号通路的新型药物正在或已经进入临床研究。考虑到现有治疗自身免疫性疾病的药物大多只能改善疾病症状，远不能充分满足临床需求，仍需要开发更多靶向IL-17/IL-17R的药物。
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和药物是不可缺少的研究工具。由于人IL-17及其受体家族的氨基酸序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，如人IL-17A和小鼠IL-17A蛋白序列的一致性仅为60％，因此，识别人IL-17A蛋白的抗体通常无法识别小鼠IL-17A，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向IL-17/IL-17R信号通路药物的药效。鉴于IL-17/IL-17R在疾病发生过程中的广泛参与性和靶向该信号通路的巨大应用价值，为了使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域仍急需开发人源化IL-17/IL-17R信号通路相关的非人动物模型。
发明内容
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual,2ndEd.,ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989)；DNA Cloning,Volumes I andII(D.N.Glovered.,1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.,1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss,Inc.,1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press,1986)；B.Perbal,A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series,Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.–in-chief,Academic Press,Inc.,New York),Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185,″Gene Expression Technology″(D.Goeddel,ed.)；GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller and M.P.Caloseds.,1987,ColdSpring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods In Cell And MolecularBiology(Mayer and Walker,eds.,Academic Press,London,1987)；Handbook OfExperimental Immunology,Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.,1986)；和Manipulating the Mouse Embryo,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,N.Y.,1986)。
IL-17A/IR-17RA
白细胞介素17细胞因子(简称“IL-17”或“IL-17”)家族是一类特征性细胞因子，主要由活化的T细胞分泌。IL-17家族目前已经发现了6个成员，分别是IL-17A、IL-17B、IL-17C、IL-17D、IL-17E(又称IL-25)和IL-17F。IL-17家族的成员与任何其它已知的细胞因子序列相似性很差，而且家族成员之间的序列相似性也比较低：IL-17F与IL-17A具有最高的同源性(55％)，并且通常与IL-17A共表达；IL-17B，IL-17D和IL-17C的序列与IL-17A重叠29％至23％，而IL-17E似乎是该家族中最不同的成员，仅具有16％的序列同源性(GaffenSL,Nat.Rev.Immunol.2009Aug；9(8):556-67)。IL-17受体(简称“IL-17R”或“IL17R”)也形成了一个独特的家族，目前发现了5个同源亚基，分别是IL-17RA、IL-17RB、IL-17RC、IL-17RD、IL-17RE，其中IL-17RB、RC、RD、RE与最早发现的IL-17RA具有同源性。IL17通过与受体结合，启动其下游信号通路(包括MAP激酶途径、NF-kB途径、mRNA稳定信号途径、ERK信号途径以及JAK/STAT信号途径等)刺激多种细胞产生炎症介质，已成为免疫和炎性疾病的关键参与成分，并可导致器官特异性或全身性自身免疫疾病。
IL17受体属于I型跨膜蛋白，其中IL-17RA为普遍表达；IL-17RB优势表达在一类介导气道过敏反应的NKT细胞表面；IL-17RC的表达仅限于细胞基质细胞和非造血细胞，在胸腺和白细胞中不表达；IL-17RD主要表达在内皮细胞、上皮细胞和平滑肌细胞；表达IL-17RE的细胞尚不明确，有研究表明小鼠结肠、肾脏等可表达。IL-17家族成员都含有4个半胱氨酸和2个丝氨酸残基形成的半胱氨酸结节，除了IL-17B外，IL-17家族成员都形成二聚体。IL-17A和IL-17F可以同源二聚体或者互相形成异源二聚体的形式存在，与IL-17RA和IL-17RC形成的异源二聚受体复合物结合启动下游的信号转导信号通路，其中IL-17A或者IL-17F的二聚体先与IL17-RA或者IL17-RC中的一种受体结合，一旦结合一种受体，则二聚体中没有结合的单体会对前面结合的同种受体的亲和力下降，导致剩余单体只结合另外一种类型的受体。但是在小鼠体内，有一定的区别，虽然鼠IL-17RA可以结合鼠IL-17A和IL17-F，但是鼠IL-17RC只能结合IL-17F。目前对于每个IL-17R与哪个配体结合还没有完全弄清楚(见表1)，但已有研究提示显示普遍表达的IL-17RA可能是所有IL-17家族成员共用的信号传导亚基。根据激活细胞的不同，IL-17RA信号可诱导多种分子的合成，如细胞因子、趋化因子、抗菌肽、粘液素等。IL-17RA缺陷小鼠对多种炎性疾病，如风湿性关节炎、多发性硬化症(MS)、哮喘具有抵抗能力，但同时易发生多种病原体，如弓形虫和白色念珠菌感染。另外，人IL-17A和人IL-17F都能在鼠源细胞中引起趋化因子配体(CXCL)1的产生，提示不存在种属特异性。但是hIL-17AR单独却不能在IL-17RA-/-的小鼠成纤维细胞中启动信号通路，提示hIL-17AR和hIL-17RC具有种属特异性。
表1 IL17/IL-17R家族
受体(复合物) 配体
IL-17RA/RC IL-17A,IL-17F,IL-17A/F,vIL-17<sup>*</sup>
IL-17RA/RB IL-17E(IL-25)
IL-17RD(SEF) 未知
IL-17RA/RD 未知
IL-17RE IL-17C
未知 IL-17D
*表示病毒IL-17，见Gaffen SL.Current opinion in immunology.2011；23(5):613-619。
由于人IL-17及其受体家族的氨基酸序列与啮齿类动物中的对应蛋白存在显著差异，如人IL-17A和小鼠IL-17A蛋白序列的一致性仅为60％，因此，识别人IL-17A蛋白的抗体通常无法识别小鼠IL-17A，即无法用普通小鼠来筛选和评价靶向IL-17/IL-17R信号通路药物的药效。
转基因非人动物
本发明通过构建在基因组中包含人IL-17A基因和/或IL-17RA基因的序列的转基因非人动物，例如转基因小鼠，解决了上述技术问题。
相应地，在一个方面，本发明涉及一种转基因非人动物，所述动物的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列。
如本文所用，“可表达形式”的基因是指基因在启动子的控制下在动物或动物细胞中表达，所述启动子在所述动物或动物细胞中能够发挥功能。启动子没有特别限制，只要其在引入了所述基因的动物或动物细胞中发挥功能。启动子可以是源自所述动物或动物细胞的启动子，或异源启动子。启动子也可以是待引入的基因的天然启动子或另一基因的启动子。
在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。在一些实施方案中，人IL-17A基因的外显子1-3中的至少1个、至少2个，或全部3个的序列全部或部分替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
如本文使用的术语“对应”是指用来确定对应于某段核苷酸/氨基酸序列的对应核苷酸/氨基酸序列的方式。例如出于本发明的目的，当参考某段核苷酸/氨基酸序列时，本领域技术人员能够将另一核苷酸/氨基酸序列与参考的序列进行比对，以便在所述另一核苷酸/氨基酸序列中确定哪段序列是与参考的核苷酸/氨基酸序列对应的核苷酸/氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因的编码序列。在一些实施方案中，其中所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因自起始密码子至终止密码子的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7，或由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7组成。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性是通过参数“序列一致性”进行描述。
在上述转基因非人动物的一些实施方案中，所述动物对于所述人IL-17A基因序列或其片段是纯合的。在另一些实施方案中，所述动物对于所述人IL-17A基因序列或其片段是杂合的。
生物的群体或物种的个体之间通常在每个基因座包括多种等位基因。外源性等位基因是引入生物体中的一个等位基因，而内源性等位基因是天然存在于细胞中的一个等位基因，通常是野生型未修饰状态的生物体中的那一个。杂合的动物具有两种等位基因。在一些情况下，期望引入外源等位基因来制造对于等位基因纯合的动物，所述等位基因已存在于杂合动物中。
在一些实施方案中，除包含可表达形式的人IL-17A基因的序列外，所述转基因动物的基因组中还可以包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列。在一些实施方案中，所述动物对于所述人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列可以是纯合的，或者是杂合的。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。在一些实施方案中，人IL-17RA基因的外显子1-11中的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个或全部11个的序列全部或部分替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含人IL-17RA基因的编码序列。在另一些实施方案中，所述人IL-17RA的序列包含人IL-17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列的全部或部分。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:31或SEQ IDNO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含SEQ IDNO:31或SEQ ID NO:35，或由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:35组成。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因自起始密码子至终止密码子的序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61组成。
在另一个方面，本发明涉及一种转基因非人动物，所述动物的基因组中包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述动物表达人IL-17RA蛋白。在另一些实施方案中，所述，所述动物表达嵌合IL-17RA蛋白。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含人IL-17RA基因的编码序列。在另一些实施方案中，所述人IL-17RA的序列包含人IL-17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:31或SEQ IDNO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含SEQ IDNO:31或SEQ ID NO:35，或由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:35组成。
在一些实施方案中，所述动物对于所述人IL-17RA基因的序列是纯合的。在另一些实施方案中，所述动物对于所述人IL-17RA基因的序列是杂合的。
在一些实施方案中，除包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列外，所述转基因动物的基因组中还可以包含可表达形式的人TNF-α基因的序列。所述动物对于所述人TNF-α基因的序列可以是纯合的，或者是杂合的。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因自起始密码子至终止密码子的序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61组成。
在上述转基因非人动物的任何实施方案中，所述动物可以选自哺乳动物，例如非灵长类动物，例如，家畜、猪、牛、绵羊、山羊、鸡、兔、鱼、斑马鱼、狗、小鼠、猫、大鼠，以及实验室动物。
在一些实施方案中，所述其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠和大鼠。在优选的实施方案中，所述动物是小鼠。
本领域已知各种品系的小鼠和大鼠，并可以用于制备如本申请所述的转基因非人动物。例如，所述小鼠可以选自以下品系：
C57BL株的小鼠，例如选自C57BL/A，C57BL/An，C57BL/GrFa，C57BL/KaLwN，C57BL/6，C57BL/6J，C57BL/6ByJ，C57BL/6NJ，C57BL/10，C57BL/10ScSn，C57BL/10Cr，C57BL/Ola；
129株的小鼠，例如选自129P1，129P2，129P3，129X1，129S1(如，129S1/SV，129S1/SvIm)，129S2，129S4，129S5，129S9/SvEvH，129S6(129/SvEvTac)，129S7，129S8，129T1，129T2；
BALB株，例如BALB/c；和
上述品系的杂交体，例如50％BALB/c-50％12954/Sv；或50％C57BL/6-50％129。
所述大鼠可以选自以下品系：Wistar大鼠、LEA株、Sprague Dawley株、Fischer株、F344、F6和Dark Agouti，以及两个或更多个上述品系的的杂交体。
在另一个方面，本发明涉及从上述转基因非人动物获得的细胞。在一些实施方案中，所述细胞可以选自体细胞、干细胞例如胚胎干细胞、生殖细胞和受精卵。
动物细胞
在一个方面，本发明涉及一种非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因自起始密码子至终止密码子的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7，或由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7组成。
在一些实施方案中，所述细胞对于所述人IL-17A基因序列或其片段是纯合的。在另一些实施方案中，所述细胞对于所述人IL-17A基因序列或其片段是杂合的。
在一些实施方案中，所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含人IL-17RA基因的编码序列。在另一些实施方案中，所述人IL-17RA的序列包含人IL-17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:31或SEQ IDNO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含SEQ IDNO:31或SEQ ID NO:35，或由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:35组成。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因自起始密码子至终止密码子的序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61组成。
在另一个方面，本发明涉及一种非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含人IL-17RA基因的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述细胞表达人IL-17RA蛋白。在另一些实施方案中，所述，所述细胞表达嵌合IL-17RA蛋白。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含人IL-17RA基因的编码序列。在另一些实施方案中，所述人IL-17RA的序列包含人IL-17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:31或SEQ IDNO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含SEQ IDNO:31或SEQ ID NO:35，或由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:35组成。
在一些实施方案中，所述细胞对于所述人IL-17RA基因的序列是纯合的。在另一些实施方案中，所述细胞对于所述人IL-17RA基因的序列是杂合的。
在一些实施方案中，除包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列外，所述细胞的基因组中还可以包含可表达形式的人TNF-α基因的序列。所述细胞对于所述人TNF-α基因的序列可以是纯合的，或者是杂合的。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列。在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因自起始密码子至终止密码子的序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61组成。
在上述关于非人动物细胞的任何实施方案中，所述细胞可以是啮齿类动物细胞，例如小鼠或大鼠细胞。所述小鼠和大鼠可以是本领域已知的任何品系的小鼠和大鼠，例如上文所述的任何品系的小鼠和大鼠。
在上述关于非人动物细胞的任何实施方案中，所述细胞可以选自体细胞、干细胞例如胚胎干细胞、生殖细胞和受精卵。
在一个方面，本发明涉及本发明的非人动物细胞在制备转基因非人动物中的用途。
在另一个方面，本发明涉及本发明的转基因非人动物和非人动物细胞在筛选调节IL-17A/IL-17-RA信号通路的试剂中的用途。
在一些实施方案中，所述试剂可以选自抗体、抗体片段、对应受体或配体或其片段、融合蛋白和小分子化合物。
在再一个方面，本发明涉及本发明的转基因非人动物在构建与IL-17A/IL-17RA信号通路异常相关的疾病模型中的用途。
在一些实施方案中，所述疾病选自自身免疫病和肿瘤。在一些实施方案中，所述疾病可以选自多发性硬化症、哮喘、炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、心肌炎、I型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、移植物抗宿主病。
在一个方面，本发明涉及本发明的IL-17A人源化动物在测试针对人IL-17A的试剂的体内药效中的用途。
在一些实施方案中，所述试剂选自针对人IL-17A的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
在一些实施方案中，所述转基因非人动物用于构建与IL-17A信号通路异常相关的疾病模型，并在所述疾病模型中测试所述试剂的体内药效。
在一些实施方案中，所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和银屑病模型。在一些实施方案中，所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
在另一个方面，本发明涉及一种测试针对人IL-17A的试剂的体内药效的方法，所述方法包括：
a.使用本发明的IL-17A人源化动物构建与IL-17A信号通路异常相关的疾病模型；
b.对所述疾病模型动物施用所述针对人IL-17A的试剂；和
c.评估所述针对IL-17A的试剂的体内药效。
在一些实施方案中，所述试剂选自针对人IL-17A的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
在一些实施方案中，所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和银屑病模型。在一些实施方案中，所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
重组载体
在一个方面，本发明涉及一种重组载体，所述载体包含人IL-17A基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠IL-17A基因上游和下游同源臂序列。
如本文所用，术语“重组载体”是指可以在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制的载体。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体通常是质粒的形式。然而，本发明旨在包括其他形式的表达载体，例如病毒载体(例如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)，它们发挥等同的功能。
在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人IL-17A基因的序列包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7，或由SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:7组成。
在一些实施方案中，所述小鼠IL-17A基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-5000个核苷酸或者5000-10000个核苷酸。优选所述小鼠IL-17A基因上游和下游同源臂序列各自包含3000至5000个核苷酸。
在优选的实施方案中，所述重组载体中小鼠IL-17A基因上游同源臂序列包含SEQID NO:5，且所述下游同源臂序列包含SEQ ID NO:6。
在另一个方面，本发明涉及一种重组载体，所述重组载体包含人IL-17RA基因的编码序列或自2号外显子至11号外显子的序列和小鼠IL-17RA基因上游和下游同源臂序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:31或SEQ IDNO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列包含SEQ IDNO:31或SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:31或SEQ ID NO:35组成。
在一些实施方案中，所述小鼠IL-17RA基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-5000个核苷酸或者5000-10000个核苷酸。优选所述小鼠IL-17RA基因上游和下游同源臂序列各自包含3000至5000个核苷酸。
在优选的实施方案中，所述重组载体中小鼠IL-17RA基因上游同源臂序列包含SEQID NO:33，且所述下游同源臂序列包含SEQ ID NO:34。
在再一个方面，本发明涉及一种重组载体，所述重组载体包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列。
在一些实施方案中，所述重组载体包含人TNF-α基因自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述人TNF-α基因的序列包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61组成。
在一些实施方案中，所述小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-7000个核苷酸或者7000-10000个核苷酸。优选所述小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列各自包含3000至7000个核苷酸。
在优选的实施方案中，所述小鼠TNF-α基因上游同源臂序列包含SEQ ID NO:59，且所述下游同源臂序列包含SEQ ID NO:60。
在关于重组载体的任何实施方案中，所述重组载体还可以包含用于阳性筛选的抗性基因。在一些实施方案中，所述抗性基因是新霉素磷酸转移酶的编码序列。
避免报告基因通常是有益的，因为不需要之后将其移除。但是在胚胎/细胞水平修饰阶段报告基因的表达允许对不表达所述报告基因的细胞的排除。或者，其允许挑选表达所述报告基因的细胞，通过克隆或其它转基因动物技术用于动物中，或者转移到第二个培养物中，用于进一步培养和/或数量扩增和/或增加其它载体和/或核酸和/或其它遗传修饰。基于其报告基因的表达来选择细胞是一种共选择方法，所述报告基因不依赖于感兴趣的基因。术语报告基因，如本文所使用的，包括报告基因和选择标记。术语选择标记，如本文所使用的，指代遗传表达的生物分子，其赋予通过阳性或阴性生存选择标准来允许分离的性状。所述报告基因可以是，例如荧光标记物，例如绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。所述报告基因可以是选择标记物，例如嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)，或黄嘌呤-鸟嘌林转磷酸核糖基酶(XGPRT)。例如，可以从细胞培养物移出细胞并用于克隆。或者，可以从培养物中移出细胞并置于第二个培养物中，来建立克隆系或用于进一步的方法。或者，表达所述报告基因的胚胎或受精卵可以用于植入代孕动物或者用于克隆，而其它不表达所述报告基因的胚胎或受精卵不用于克隆。在一些实施方案中，所述报告基因是选择标记物，其用于选择表达所述标记物的细胞或胚胎。
在一些实施方案中，所述重组载体还包含用于负筛选的标记基因。在一些实施方案中，所述标记基因是白喉毒素A亚基的编码序列。
在关于重组载体的任何实施方案中，所述载体可以用于替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列。
在再一个方面，本发明涉及本发明的重组载体在替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列中的用途。
在另一个方面，本发明涉及本发明的重组载体在构建转基因小鼠或转基因小鼠细胞中的用途。
动物制备方法
在一个方面，本发明涉及一种制备包含人IL-17A基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人IL-17A基因的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17A基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
在一些时实施方案中，所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
在一些实施方案中，所述方法包括以下：
a.提供本发明的包含人IL-17A基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠IL-17A基因上游和下游同源臂序列；
b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠。
从培养的细胞制造克隆细胞的集落的方法是已知的。一种此类方法涉及将来自第一个培养物的细胞分散到第二个培养物中，其中各个细胞不互相接触，例如，通过将细胞稀释到多孔板中，或稀释到对于铺到其中的细胞数，具有相对大表面积的板中。培养所述细胞一段时间，允许其增殖。增殖的细胞在它们不太可能移动到离它们原来的位置很远的条件下培养。作为结果，一段时间后使用者可以观察到细胞并看到由单个细胞及其后代建立的各个集落。可以对集落中细胞的子集取样，而不破坏所述集落中的其它细胞。
在一些实施方案中，步骤c2包括将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人IL-17A基因序列的转基因小鼠的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人IL-17A基因的序列纯合的小鼠的步骤。
在另一个方面，本发明涉及一种制备包含人IL-17RA基因的序列的转基因动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人IL-17RA基因的序列。
在一些实施方案中，所述人IL-17RA基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：
a.提供包含人IL-17RA基因的编码序列或自2号外显子至11号外显子的序列和小鼠IL-17RA基因上游和下游同源臂序列的重组载体；
b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠。
在一些实施方案中，步骤c2包括将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人IL-17RA基因的序列的转基因小鼠的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人IL-17RA基因的序列纯合的小鼠的步骤。
在另一个方面，本发明涉及一种制备包含人TNF-α基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人TNF-α基因的序列。
在一些实施方案中，所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
在一些实施方案中，所述方法包括一些步骤：
a.提供包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列的重组载体；
b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠。
在一些实施方案中，步骤c2包括将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
在一些实施方案中，所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人TNF-α基因的序列的转基因小鼠的步骤。
在一些实施方案中，所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人TNF-α基因的序列纯合的小鼠的步骤。
在上述方法的任何实施方案中，所述动物可以是啮齿类动物，例如大鼠或小鼠。在优选的实施方案中，所述动物是小鼠。
本发明还包括通过本发明的方法制备的备包含人IL-17A基因的序列、人IL-17RA基因的序列或人TNF-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠。
在另一个方面，本发明涉及制备包含人IL-17A基因的序列和人IL-17RA基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括将本发明的包含人IL-17A基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠与包含人IL-17RA基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠进行杂交的步骤。
在一个方面，本发明涉及制备包含IL-17A基因的序列和人TNF-α基因序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括将本发明的包含人IL-17A基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠与包含人TNF-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠进行杂交的步骤。
在另一个方面，本发明涉及制备包含IL-17RA基因的序列和人TNF-α基因序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括将本发明的包含人IL-17RA基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠与包含人TNF-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠进行杂交的步骤。
在再一个方面，本发明涉及制备包含人IL-17A基因的序列、人IL-17RA基因的序列和人TNF-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括将本发明的包含人IL-17A基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠、本发明的包含人IL-17RA基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠和包含人TNF-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠进行杂交的步骤。
在一个方面，本发明涉及一种制备包含人IL-17A基因的序列和人IL-17RA基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠的方法，所述方法包括：
a1.提供从本发明的包含人IL-17A基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
b1.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人IL-17RA基因的序列，从而制备包含人IL-17A基因的序列和人IL-17RA基因的序列的转基因小鼠；或者
a2.提供从本发明的包含人IL-17RA基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
b2.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人IL-17A基因的序列，从而制备包含人IL-17A基因的序列和人IL-17RA基因的序列的转基因小鼠。
在另一个方面，本发明涉及一种制备包含人IL-17A基因的序列和人TNF-α基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括：
a1.提供从本发明的包含人IL-17A基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
b1.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人TNF-α基因的序列，从而制备包含人IL-17A基因的序列和人人TNF-α基因的序列的转基因小鼠；或者
a2.提供从本发明的包含人TNF-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
b2.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人IL-17A基因的序列，从而制备包含人IL-17A基因的序列和人TNF-α基因的序列的转基因小鼠。
在再一个方面，本发明涉及一种制备包含人IL-17RA基因的序列和人TNF-α基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括：
a1.提供从本发明的包含人IL-17RA基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
b1.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人TNF-α基因的序列，从而制备包含人IL-17RA基因的序列和人人TNF-α基因的序列的转基因小鼠；或者
a2.提供从本发明的包含人TNF-α基因的序列的转基因非人动物例如转基因小鼠获得的受精卵或胚胎干细胞；
b2.使用所述受精卵或胚胎干细胞，通过本发明的方法在所述转基因非人动物例如转基因小鼠的基因组中插入人IL-17RA基因的序列，从而制备包含人IL-17RA基因的序列和人TNF-α基因的序列的转基因小鼠。
多肽和编码其的多核苷酸
在一个方面，本发明涉及一种多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述多肽包含SEQ ID NO:39，或由SEQ IDNO:39组成。
在另一个方面，本发明涉及编码本发明的多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:38。
在再一个方面，本发明涉及包含本发明的多核苷酸的载体。
本发明包括以下实施方案：
实施方案1.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
实施方案2.如实施方案1所述的细胞，其中所述细胞表达人IL-17A蛋白，任选所述蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成。
实施方案3.如实施方案1所述的细胞，其中所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
实施方案4.如实施方案1所述的细胞，其中所述人IL-17A基因的序列包含与SEQID NO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成。
实施方案5.如实施方案1至3中任一项所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
实施方案6.如实施方案5所述的细胞，其中所述细胞表达人IL-17RA蛋白或人源化IL-17RA蛋白，和/或人TNF-α蛋白，任选其中所述人IL-17RA包含与SEQ ID NO:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32或由SEQ ID NO:32组成；
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQID NO:39或由SEQ ID NO:39组成；和
和/或所述人TNF-α蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ IDNO:58或由SEQ ID NO:58组成。
实施方案7.如实施方案5所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含人IL-17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列。
实施方案8.如实施方案5所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQID NO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或所述人IL-17RA基因的序列包含SEQ ID NO:35或由SEQID NO:35组成。
实施方案9.如实施方案5所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
实施方案10.如实施方案5所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成。
实施方案11.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
实施方案12.如实施方案11所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35组成。
实施方案13.如实施方案11或12所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人TNF-α基因的序列，其中所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
实施方案14.如实施方案13所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
实施方案15.如实施方案13所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成。
实施方案16.如实施方案1至15中任一项所述的细胞，其中所述转基因非人动物细胞是转基因啮齿类动物细胞或转基因小鼠细胞。
实施方案17.如实施方案1至16中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自体细胞和干细胞例如胚胎干细胞。
实施方案18.如或实施方案1至17中任一项所述的细胞在筛选调节IL-17A/IL-17-RA信号通路的试剂中的用途，任选地所述试剂选自抗体、抗体片段、对应受体或配体或其片段、融合蛋白和小分子化合物。
实施方案19.转基因非人动物在构建与IL-17A/IL-17RA信号通路异常相关的疾病模型中的用途，其中转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列，优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
实施方案20.如实施方案19所述的用途，其中所述疾病选自自身免疫病和肿瘤，任选所述自身免疫病选自多发性硬化症、哮喘、炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、心肌炎、I型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、移植物抗宿主病。
实施方案21.转基因非人动物在测试针对人IL-17A的试剂的体内药效中的用途，其中所述转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列，优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
实施方案22.如实施方案21所述的用途，其中所述试剂选自针对人IL-17A的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
实施方案23.如实施方案21或22所述的用途，其中所述转基因非人动物用于构建与IL-17A信号通路异常相关的疾病模型，并在所述疾病模型中测试所述试剂的体内药效。
实施方案24.如实施方案23所述的用途，其中所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自自身免疫病模型选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和银屑病模型，例如所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
实施方案25.一种测试针对人IL-17A的试剂的体内药效的方法，所述方法包括：
a.使用转基因非人动物构建与IL-17A信号通路异常相关的疾病模型，其中所述转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列；
b.对所述疾病模型动物施用所述针对人IL-17A的试剂；和
c.评估所述针对IL-17A的试剂的体内药效，
优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
实施方案26.如实施方案25所述的方法，其中所述试剂选自针对人IL-17A的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
实施方案27.如实施方案25或26所述的方法，其中所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和银屑病模型，例如所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
实施方案28.如实施方案19-24中任一项所述的用途，或如实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述转基因非人动物表达人IL-17A蛋白，任选所述蛋白包含与SEQ IDNO:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成。
实施方案29.如实施方案19-24中任一项所述的用途，或如实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
实施方案30.如实施方案19-24中任一项所述的用途，或如实施方案25-27中任一项所述的方法，其中所述人IL-17A基因的序列包含与SEQ ID NO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成。
实施方案31.如实施方案29或30所述的方法或用途，其中所述转基因非人动物的基因组中还包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
实施方案32.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述转基因非人动物表达人IL-17RA蛋白或人源化IL-17RA蛋白，和/或人TNF-α蛋白，任选其中所述人IL-17RA包含与SEQ ID NO:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32或由SEQ ID NO:32组成；
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQID NO:39或由SEQ ID NO:39组成；和
和/或所述人TNF-α蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ IDNO:58或由SEQ ID NO:58组成。
实施方案33.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述人IL-17RA基因的序列包含人IL-17RA基因自2号外显子至11号外显子的全部或部分序列。
实施方案34.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或所述人IL-17RA基因的序列包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35组成。
实施方案35.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
实施方案36.如实施方案31所述的方法或用途，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成
实施方案37.一种重组载体，所述载体包含人IL-17A基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠IL-17A基因上游和下游同源臂序列。
实施方案38.如实施方案37所述的重组载体，其中所述人IL-17A基因的序列包含与SEQ ID NO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成。
实施方案39.如实施方案37或38所述的重组载体，其中所述小鼠IL-17A基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-5000个核苷酸或者5000-10000个核苷酸，优选所述小鼠IL-17A基因上游和下游同源臂序列各自包含3000-5000个核苷酸。
实施方案40.如实施方案37或38所述的重组载体，其中所述小鼠IL-17A基因上游同源臂序列包含SEQ ID NO:5，且所述下游同源臂序列包含SEQ ID NO:6。
实施方案41.一种重组载体，所述重组载体包含人IL-17RA基因的编码序列或自2号外显子至11号外显子的序列和小鼠IL-17RA基因上游和下游同源臂序列。
实施方案42.如实施方案41所述的重组载体，其中所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35组成。
实施方案43.如实施方案41或42所述的重组载体，其中所述小鼠IL-17RA基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-5000个核苷酸或者5000-10000个核苷酸，优选所述小鼠IL-17RA基因上游和下游同源臂序列各自包含3000-5000个核苷酸。
实施方案44.如实施方案41或42所述的重组载体，其中所述小鼠IL-17RA基因上游同源臂序列包含SEQ ID NO:33，且所述下游同源臂序列包含SEQ ID NO:34。
实施方案45.一种重组载体，所述重组载体包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列。
实施方案46.如实施方案45所述的重组载体，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成。
实施方案47.如实施方案45或46所述的重组载体，其中所述小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-7000个核苷酸或者7000-10000个核苷酸，优选所述小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列各自包含3000-7000个核苷酸。
实施方案48.如实施方案45或46所述的重组载体，其中所述小鼠TNF-α基因上游同源臂序列包含SEQ ID NO:59，且所述下游同源臂序列包含SEQ ID NO:60。
实施方案49.如实施方案37至48中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体还包含用于阳性筛选的抗性基因，例如所述抗性基因是新霉素磷酸转移酶的编码序列。
实施方案50.如实施方案37至49中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体还包含用于负筛选的标记基因，其中所述标记基因是白喉毒素A亚基的编码序列。
实施方案51.如实施方案37至50中任一项所述的重组载体，所述载体用于替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列。
实施方案52.如实施方案37至50中任一项所述的重组载体在替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列中的用途。
实施方案53.如实施方案37至50中任一项所述的重组载体在构建转基因小鼠或转基因小鼠细胞中的用途。
实施方案54.一种制备包含人IL-17A基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
实施方案55.如实施方案54所述的方法，其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
实施方案56.如实施方案55所述的方法，其中所述方法包括：
a.提供如实施方案37至40中任一项所述的重组载体；
b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠，任选其中将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
实施方案57.如实施方案56所述的方法，其中所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人IL-17A基因序列的转基因小鼠的步骤。
实施方案58.如实施方案56或57所述的方法，其中所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人IL-17A基因的序列纯合的小鼠的步骤。
实施方案59.一种制备包含人IL-17RA基因的序列的转基因动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人IL-17RA基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
实施方案60.如实施方案59所述的方法，其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
实施方案61.如实施方案60所述的方法，其中所述方法包括：
a.提供如实施方案41至44中任一项所述的重组载体；
b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠，任选其中将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
实施方案62.如实施方案61所述的方法，其中所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人IL-17RA基因的序列的转基因小鼠的步骤。
实施方案63.如实施方案61或62所述的方法，其中所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人IL-17RA基因的序列纯合的小鼠的步骤。
实施方案64.一种制备包含人TNF-α基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人TNF-α基因的序列，任选其中所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
实施方案65.如实施方案64所述的方法，其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
实施方案66.如实施方案67所述的方法，其中所述方法包括：
a.提供如实施方案45至48中任一项所述的重组载体；
b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠，任选其中将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
实施方案67.如实施方案66所述的方法，其中所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人TNF-α基因的序列的转基因小鼠的步骤。
实施方案68.如实施方案66或67中所述的方法，其中所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人TNF-α基因的序列纯合的小鼠的步骤。
实施方案69.一种制备包含人IL-17A基因的序列和人IL-17RA基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括将通过实施方案54-58中任一项所述的方法获得的转基因小鼠与通过实施方案59-63中任一项的方法获得的转基因小鼠进行杂交的步骤。
实施方案70.一种制备包含人IL-17A基因的序列和人TNF-α基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括将通过实施方案54-58中任一项所述的方法获得的转基因小鼠与通过实施方案64-68中任一项的方法获得的转基因小鼠进行杂交的步骤。
实施方案71.一种制备包含人IL-17RA基因的序列和人TNF-α基因序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括将通过实施方案59-63中任一项所述的方法获得的转基因小鼠与通过实施方案64-68中任一项的方法获得的转基因小鼠进行杂交的步骤。
实施方案72.一种制备包含人IL-17A基因的序列、人IL-17RA基因的序列和人TNF-α基因的序列的转基因小鼠的方法，所述方法包括将通过实施方案54-58中任一项所述的方法获得的转基因小鼠、通过实施方案64-68中任一项的方法获得的转基因小鼠和通过实施方案64-68中任一项的方法获得的转基因小鼠进行杂交的步骤。
实施方案73.一种多肽，所述多肽包含与SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或所述多肽包含SEQ ID NO:39，或由SEQ ID NO:39组成；或
所述多肽是人源化IL-17RA蛋白，所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列。
实施方案74.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码实施方案73所述的多肽。
实施方案75.如实施方案74所述的多核苷酸，所述多核苷酸包含SEQ ID NO:38。
实施方案76.一种载体，所述载体包含实施方案74或75所述的多核苷酸。实施方案77.一种嵌合IL17-RA基因，其中所述嵌合IL-17RA基因包含部分人IL-17RA基因序列和部分非人动物IL-17RA基因序列，优选的所述部分人IL17RA基因序列的全部或部分与SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36或SEQ ID NO:37具有至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％一致性，更优选的所述部分人IL17RA基因序列为SEQ ID NO:35。
实施方案78.一种嵌合TNF-α基因，其中所述嵌合TNF-α基因包含部分人TNF-α基因序列和部分非人动物TNF-α基因序列，优选的所述部分人TNF-α基因序列与SEQ ID NO:61具有至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％一致性，更优选的所述部分人TNF-α基因序列为SEQ ID NO:61。
实施方案79.一种嵌合IL-17A基因，其中所述嵌合IL-17A基因包含部分人IL-17A基因序列和部分非人动物IL-17A基因序列，优选的所述部分人IL-17A基因序列的全部或部分与SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9具有至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％一致性，更优选的所述部分人IL-17A基因序列为SEQ ID NO:7。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：小鼠和人IL-17A基因对比示意图(非按比例)。
图2：人源化小鼠IL-17A基因示意图(非按比例)。
图3：使用包含人IL-17A基因序列的重组载体替换小鼠内源性IL-17A基因序列的打靶策略示意图(非按比例)。
图4：来自不同阳性克隆细胞的SouthernBlot结果，其中WT为野生型对照。
图5：FRT重组过程示意图(非按比例)。
图6：F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，图(A)使用引物对WT-F和WT-R用于扩增小鼠内源的野生型IL-17A基因片段；图(B)使用引物对WT-F和Mut-R用于扩增修饰后的IL-17A基因片段，用以验证重组载体是否正确插入小鼠基因组位点；图(C)使用引物对Frt-F和Frt-R用以扩增neo片段以验证抗性基因是否去除；图(D)使用引物对Flp-F2和Flp-R2用以确认Flp片段的存在；其中，WT为野生型小鼠，M为Marker，PC为阳性对照。
图7：人IL-17A的ELISA检测结果。
图8：小鼠和人IL-17RA基因对比示意图(非按比例)。
图9：人源化小鼠IL-17RA基因示意图(非按比例)。
图10：使用包含人IL-17RA基因序列的重组载体替换小鼠内源性IL-17RA基因序列的打靶策略示意图(非按比例)。
图11：来自不同阳性克隆细胞的SouthernBlot结果，其中WT为野生型对照。
图12：F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，图(A)使用引物对WT-F和WT-R用于扩增小鼠内源的野生型IL-17RA基因片段；图(B)使用引物对WT-F和Mut-R用于扩增修饰后的IL-17RA基因片段，用以验证重组载体是否正确插入小鼠基因组位点；图(C)使用引物对Frt-F和Frt-R用以扩增neo片段以验证抗性片段是否去除；图(D)使用引物对Flp-F2和Flp-R2用以确认Flp片段的存在；其中，WT为野生型，M为Marker，PC为阳性对照。
图13：流式分析结果，其中，图(A)、(C)为C57BL/6野生型鼠的结果，图(B)、(D)为IL-17RA人源化转基因小鼠的结果，分别使用mIL-17RA PE(图(A)、(C))或hIL-17RA PE(图(B)、(D))和mGR1 PerCP进行细胞标记。
图14：F1代鼠尾PCR鉴定结果，其中，图(A)使用引物对WT-F和WT-R用于扩增小鼠内源的野生型TNF-α基因片段；图(B)使用引物对Neo-F和WT-R用于扩增修饰后的TNF-α基因片段，用以验证neo片段是否存在并正确插入基因组位点；其中，WT为野生型，M为Marker，+为阳性对照。
图15：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在MOG诱导的EAE模型和对照组(未诱导)中小鼠的体重随时间变化的曲线图。G1、G3为对照组；G2、G4为EAE模型组。
图16：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在MOG诱导的EAE模型和对照组中小鼠的临床评分随时间变化的曲线图。G1、G3为对照组；G2、G4为EAE模型组。
图17：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在MOG诱导的EAE模型和对照组中在诱导后第45天小鼠脊髓组织切片的HE染色结果(100x)。G1为对照组，G2为EAE模型组。
图18：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在MOG诱导的EAE模型和对照组中在诱导后第45天小鼠脊髓组织切片的免疫组化染色结果(100x)。绿色：MBP；蓝色：DAPI。G1为对照组，G2为EAE模型组。
图19：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在MOG诱导的EAE模型和对照组中在诱导后第45天取小鼠淋巴结体外诱导，检测IL-17和IFNγ的示例性FACS结果。图A显示了来自对照组G1的一只小鼠的结果，图B显示了来自模型组G2的一只小鼠的结果。
图20：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在MOG诱导的EAE模型中评估抗人IL-17A抗体的药效的实验流程图。
图21：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在MOG诱导的EAE模型中抗人IL-17抗体给药组和对照组(PBS)小鼠的体重统计图。
图22：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在MOG诱导的EAE模型中抗人IL-17A抗体给药组和对照组小鼠临床评分统计图。
图23：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中评估抗人IL-17A抗体的药效的实验流程图。
图24：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(G1)、模型组(G2)和抗人IL-17A抗体给药组(G3)小鼠的体重统计图。
图25：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(G1)、模型组(G2)和抗人IL-17A抗体给药组(G3)小鼠的银屑病样皮损处红斑(erythema)评分统计图。
图26：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(G1)、模型组(G2)和抗人IL-17A抗体给药组(G3)小鼠的银屑病样鳞屑(scales)评分统计图。
图27：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中对照组(G1)、模型组(G2)和抗人IL-17A抗体给药组(G3)小鼠的PASI综合评分统计图。
图28：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(G1)、模型组(G2)和抗人IL-17A抗体给药组(G3)小鼠的背部组织切片的HE染色结果。
图29：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(G1)、模型组(G2)和抗人IL-17A抗体给药组(G3)小鼠的背部组织表皮厚度统计图。
图30：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型对照组(G1)、模型组(G2)和抗人IL-17A抗体给药组(G3)小鼠的背部组织切片的病理学评分统计图。
图31：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中评估不同剂量的抗人IL-17A抗体的药效的实验流程图。
图32：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(G1)、NaCl对照组(G2)、IgG4同型对照组(G3)和不同浓度的抗人IL-17A抗体给药组(G4-G6)小鼠的体重统计图。
图33：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(G1)、NaCl对照组(G2)、IgG4同型对照组(G3)和不同浓度的抗人IL-17A抗体给药组(G4-G6)小鼠的银屑病样皮损处红斑评分统计图。
图34：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(G1)、NaCl对照组(G2)、IgG4同型对照组(G3)和不同浓度的抗人IL-17A抗体给药组(G4-G6)小鼠的银屑病样鳞屑评分统计图。
图35：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(G1)、NaCl对照组(G2)、IgG4同型对照组(G3)和不同浓度的抗人IL-17A抗体给药组(G4-G6)小鼠的PASI综合评分统计图。
图36：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(G1)、NaCl对照组(G2)、IgG4同型对照组(G3)和不同浓度的抗人IL-17A抗体给药组(G4-G6)小鼠的背部组织表皮厚度统计图。
图37：使用IL-17A基因人源化小鼠纯合子，在咪喹莫特诱导的银屑病模型中空白对照组(G1)、NaCl对照组(G2)、IgG4同型对照组(G3)和不同浓度的抗人IL-17A抗体给药组(G4-G6)小鼠的病理学评分统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
EcoRI、ScaI、HindIII、amHI、XhoI、EcoRV、SalI、BbsI酶购自NEB，货号分别为R3101M、R3122M、R3104M、R3136M、R0146M、R3195M、R3138M、R0539L；
C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
小鼠结肠癌细胞MC38购自上海酶研生物技术有限公司；
BAC文库订购自invitrogen，货号分别为RPCI23.C、RPCI11.C；
BV711仓鼠抗小鼠CD3e(mCD3)购自BD公司，货号为63123；
流式细胞仪生产厂家BD，型号为Calibur；
IL-17A ELISA试剂盒购自Biolegend，货号为433917；
CD217(IL-17Ra)单克隆抗体(PAJ-17R),PE(mIL17RA PE)购自ebioscience，货号为12-7182-80；
CD217(IL-17Ra)单克隆抗体(J10MBS),PE(hIL17RA PE)购自ebioscience，货号为12-7517-41；
APC抗小鼠Ly-6G/Ly-6C(Gr-1)抗体(mGR1PerCP)购自Biolegend，货号为108412；
PE抗人IL-17A抗体(抗人IL-17A PE)购自Biolegend，货号为512305；
APC抗小鼠IFN-γ抗体(抗小鼠IFN-γAPC)购自Biolegend，货号为505809；
Alexa
Figure BDA0003404399620000331
488抗小鼠CD3抗体购自Biolegend，货号为100212；
Brilliant Violet 421TM抗小鼠CD4抗体购自Biolegend，货号为100443；
Brilliant Violet 510TM抗小鼠CD45抗体购自Biolegend，货号为103137；
eBioscienceTM Foxp3/Transcription Factor Staining Buffer Set购自ThermoFisher，货号为00-5523-00；
咪喹莫特乳膏(艾达乐)购自3M Health Care Limited，规格为250mg:12.5mg，批准文号为H20160079；
MOG35-55购自ProSpec，规格100mg；
百日咳毒素(PTX)购自millipore，货号516560。
实施例1IL-17A基因人源化小鼠
小鼠IL-17A基因(NCBI Gene ID：16171，Primary source：MGI：107364，UniProtID：Q62386，位于1号染色体NC_000067.6的第20730905至20734496位，基于转录本NM_010552.3(SEQ ID NO：1)及其编码蛋白NP_034682.1(SEQ ID NO：2))和人IL-17A基因(NCBIGene ID：3605，Primary source：HGNC:5981，UniProt ID：Q16552，位于6号染色体NC_000006.12的第52186387至52190638位，基于转录本NM_002190.3(SEQ ID NO：3)及其编码蛋白NP_002181.1(SEQ ID NO：4))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL-17A基因座引入编码人IL-17A蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人IL-17A蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源IL-17A基因座上用人IL-17A基因的序列替换特定小鼠IL-17A基因序列，如将至少包含小鼠IL-17A基因的起始密码子ATG至终止密码子TAA的约2.9kb(2898bp)的序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL-17A基因座(示意图如图2所示)，实现对小鼠IL-17A基因的人源化改造。
分别用细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)获得小鼠和人IL-17A基因的DNA序列。在如图3所示的打靶策略示意图中，显示了重组载体上上游和下游的同源臂序列分别为3708bp和4765bp，以及2861bp人IL-17A基因的序列(从外显子1中的ATG延伸至外显子3中的终止密码子TAA)。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ IDNO：5)与NCBI登录号为NC_000067.6的第20727254-20730961位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：6)与NCBI登录号为NC_000067.6的第20735137-20739901位核苷酸序列相同；人IL-17A基因的序列(SEQ ID NO：7)与NCBI登录号为NC_000006.12的第52186432-52189292位核苷酸序列相同。其中，人IL-17A基因的序列和鼠基因座的上游连接设计为在5’-GCACCCAGCACCAGCTGATCAGGACGCGCAAACATGACTCCTGGGAAGACCTCATTGGTG-3’(SEQ ID NO：8)内，其中序列“CAAAC”的最后一个“C”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“ATGAC”的第一个“A”是人序列的第一个核苷酸；人IL-17A基因的序列和鼠基因座的下游连接设计为在5’-CGATTGTCCACCATGTGGCCTAAACAGAGACCCGCGGCTGACCCCTAAGA-3’(SEQ ID NO：9)内，其中序列“CCTAA”的最后一个“A”是人序列的最后一个核苷酸，序列“ACAGA”的第一个“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠IL-17A的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：66和SEQ ID NO：4所示。
此外，打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒。其中Neo盒5’端与小鼠基因座的连接设计为5’-CCGGTGGACACATCTGGAGTACAGCGTCTGCGTCGACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAG-3’(SEQ ID NO：10)内，其中序列“TCTGC”的最后一个“C”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“GTCGA”的第一个“G”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒3’端与小鼠基因座的接合设计为5’-AGTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCACTAGTATCTGTAGCTCGGGGAACATCATGAGAGAGGAGC-3’(SEQ ID NO：11)内，其中序列“CTAGT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“ATCTG”的“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，即白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的重组载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的重组载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经PCR鉴定为阳性的克隆(PCR结果未显示)再进行Southern Blot(分别用EcoRV或SpeI或SacI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)检测，结果见如图4所示，检测结果表明8个经PCR验证为阳性的克隆中，有6个克隆(1-A10，1-B7，1-C10，2-G3，2-H5，2-H12)为阳性杂合克隆且无随机插入。
PCR测定包括使用下述引物：
F1：5’-CTTCTGATACATATGCATCCACGTGC-3’(SEQ ID NO：12)
R1：5’-ATGCCCACGGTCCAGAAATACTAT-3’(SEQ ID NO：13)
F2：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’(SEQ ID NO：14)
R2：5’-GTGAGAGCAGCAAGTGCTCTTAACC-3’(SEQ ID NO：15)
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针(5’Probe)：
F：5’-AGAGCAGCATACCAATTAGCAACAT-3’(SEQ ID NO：16)
R：5’-CTAGGTGGGTTCCTCACTGGTCT-3’(SEQ ID NO：17)
3’探针(3’Probe)：
F：5’-ACCAAAGGAACAAGTGGAAAGAATCGG-3’(SEQ ID NO：18)
R：5’-ATCTTCCTGCCCAGCATTGCCT-3’(SEQ ID NO：19)
Neo探针(Neo Probe)：
F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGATGG-3’(SEQ ID NO：20)
R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’(SEQ ID NO：21)
按照本领域已知的技术将筛选出的阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到表达人IL-17A蛋白的IL-17A基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-2、F1-5、F1-7、F1-21、F1-26的小鼠为阳性杂合小鼠。PCR测定包括下述引物：
WT-F：5’-TCTCTGTTCAGCTCCCAAGAAGTCA-3’(SEQ ID NO：22)
WT-R：5’-CTCATTGCATAGCGTCATGTGACA-3’(SEQ ID NO：23)
WT-F：(SEQ ID NO：22)
Mut-R：5’-ATGCCCACGGTCCAGAAATACTAT-3’(SEQ ID NO：24)
Frt-F：5’-GAATGTAGCTAGCCTGTGCAAGGA-3’(SEQ ID NO：25)
Frt-R：5’-CAGCAGACTTCCTGTTGTTCTGCTC-3’(SEQ ID NO：26)
Flp-F2：5’-GACAAGCGTTAGTAGGCACATATAC-3’(SEQ ID NO：27)
Flp-R2：5’-GCTCCAATTTCCCACAACATTAGT-3’(SEQ ID NO：28)
通过本方法，能构建了可稳定传代且无随机插入的IL-17A基因人源化的转基因小鼠。
可通过常规检测方法确认获得的阳性小鼠体内人IL-17A蛋白的表达情况，例如使用ELISA方法，选取野生型C57BL/6小鼠和IL-17A基因人源化小鼠杂合子各1只，先给小鼠腹腔注射7.5μg抗鼠CD3抗体(mCD3)和4μg抗鼠CD28抗体(mCD28)，2h后取血清，稀释2倍后检测人IL-17A蛋白水平。检测结果(见图7)显示，在野生型C57BL/6小鼠体内未检测到人或人源化IL-17A蛋白的表达，在IL-17A基因人源化小鼠杂合子体内可检测到人IL-17A蛋白的表达。
实施例2 IL-17RA基因人源化小鼠
小鼠IL-17RA基因(NCBI Gene ID：16172，Primary source：MGI：107399，UniProtID：Q60943，位于6号染色体NC_000072.6的第120463181至120483731位，基于转录本NM_008359.2(SEQ ID NO：29)及其编码蛋白NP_032385.1(SEQ ID NO：30))和人IL-17RA基因(NCBI Gene ID：23765，Primary source：HGNC:5985，UniProt ID：Q96F46，位于22号染色体NC_000022.11的第17084959至17115694位，基于转录本NM_014339.6(SEQ ID NO：31)及其编码蛋白NP_055154.3(SEQ ID NO：32))对比示意图如图8所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL-17RA基因座的胞外区引入编码人IL-17RA蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化的IL-17RA蛋白。具体而言，用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在小鼠内源IL-17RA基因座上用人IL-17RA基因的序列替换特定小鼠IL-17RA基因序列。在小鼠IL-17RA基因调节元件的控制下，如将至少包含小鼠IL-17RA基因的2号至11号外显子约8.9kb的序列用对应的人基因序列替换，得到小鼠人源化IL-17RA基因座，示意图如图9所示。
进一步的，设计如图10所示的打靶策略。分别用细菌人工染色体(BAC)获得小鼠和人IL-17RA基因的DNA序列。其中图10所示的打靶载体上含有5’同源臂(SEQ ID NO：33)、3’同源臂(SEQ ID NO：34)以及人IL-17RA基因片段(SEQ ID NO：35)，其中5’同源臂与NCBI登录号与NC_000072.6的第120467551-120472097位核苷酸序列相同；3’同源臂与NCBI登录号与NC_000072.6的第120478869-120482476位核苷酸序列相同；人IL-17RA基因片段与NCBI登录号与NC_000022.11的第17097068-17105932位核苷酸序列相同。其中，人IL-17RA基因的序列和鼠基因座的上游连接设计为5’-CTTCCTTTCTTCCCACAGGGGCTGAACTGCACGGTCAAGAATAGTAAGTC-3’(SEQ ID NO：36)内，其中序列“GGCTG”的最后一个“G”是小鼠序列的最后一个核苷酸，序列“AACTG”的第一个“A”是人序列的第一个核苷酸；人IL-17RA基因的序列和鼠基因座的下游连接设计为5’-TGGTGGGCTCCGTCATCCTGCTCATCGTCTGTATGACCTGGAGGCTTTCTGGTAAGGACT-3’(SEQ ID NO：37)，其中序列“TCGTC”的最后一个“C”是人序列的最后一个核苷酸，序列“TGTAT”的第一个“T”是小鼠序列的第一个核苷酸。改造后的人源化小鼠IL-17RA的mRNA序列及其编码的蛋白序列分别如SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39所示。
打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠IL-17RA基因座的连接设计为5’-AGGAGCAGACCCTGAACTCACAAGGGAAGACCCTCACTCGATATCGAATTCCGAAGTTCCTATTCTCTAGAAAGTATAGG-3’(SEQID NO：40)内，其中序列“CACTC”的最后一个“C”是鼠的最后一个核苷酸，序列“GATAT”的“G”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒3’端与小鼠IL-17RA基因座的连接设计为5’-GTATAGGAACTTCATCAGTCAGGTACATAATGGTGGATCCCAATTGTCCACCAGCTTTGTAGTCACAGGAGACCTAATCT-3’(SEQID NO：41)内，其中序列“AATTG”的“G”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“TCCAC”的“T”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，即白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
打靶载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的重组载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的重组载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用PstI或MfeI或SspI消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)检测，Southern Blot结果见如图11所示，检测结果表明PCR鉴定为阳性的12个克隆(1-A02、1-B07、1-D07、1-E05、1-F05、1-G06、2-A09、2-A10、2-D03、2-E06、2-F07、2-G10)均确定为阳性杂合克隆且无随机插入。
PCR测定包括下述引物：
F1：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’(SEQ ID NO：42)
R1：5’-TCTTAAGTAGCAGGCTCAGGAGGCC-3’(SEQ ID NO：43)
F2：5’-GTTCACCAGCGTGAATGCTCACA-3’(SEQ ID NO：44)
R2：5’-CTGTCAGAAGTTGGCAGCAGG-3’(SEQ ID NO：45)
Southern Blot检测包括如下探针引物：
5’探针(5’Probe)：
F：5’-GGACTGGATGAGACAGCTCAAAGGG-3’(SEQ ID NO：46)
R：5’-GCTGCTTACAGGGCTTCTTCCTCAA-3’(SEQ ID NO：47)
3’探针(3’Probe)：
F：5’-GAGACGCAATGGGCAGTTAGATTCC-3’(SEQ ID NO：48)
R：5’-AAATGTTCCAGCACTTCCTGGGTGT-3’(SEQ ID NO：49)
Neo探针(Neo Probe)：
F：(SEQ ID NO：20)
R：(SEQ ID NO：21)
按前述实施例1中所述方法进行囊胚注射和子代繁育，可得到表达人源化IL-17RA蛋白的IL-17RA基因人源化杂合子和纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型。示例性的F1代小鼠(已去Neo)的鉴定结果见图12，其中，编号为R-F1-1、R-F1-2、R-F1-5的小鼠为阳性杂合小鼠。PCR测定包括下述引物：
WT-F：5’-ACCACTCACCTCCTCTGCTGGA-3’(SEQ ID NO：50)
WT-R：5’-CCTCATGGAGCACAGATGCCTAT-3’(SEQ ID NO：51)
WT-F：(SEQ ID NO：50)
Mut-R：5’-CTGTCAGAAGTTGGCAGCAGG-3’(SEQ ID NO：52)
Frt-F：5’-CAAACAGCAGCCTACACAACTTCAT-3’(SEQ ID NO：53)
Frt-R：5’-CTAGGCAACACACCTTCTCCCTGT-3’(SEQ ID NO：54)
Flp-F2：(SEQ ID NO：27)
Flp-R2：(SEQ ID NO：28)
通过本方法，构建了可稳定传代且无随机插入的IL-17RA基因人源化的转基因小鼠。
通过常规检测方法可确认小鼠体内人源化IL-17RA蛋白的表达情况，例如可用抗鼠IL-17RA抗体mIL-17RA PE和抗鼠Gr-1抗体mGR1PerCP，或抗人IL-17RA抗体hIL-17RA PE和抗鼠Gr-1抗体mGR1PerCP对小鼠的骨髓细胞识别染色后进行流式检测IL-17RA蛋白的表达。流式分析结果(见图13)显示。在IL-17RA基因人源化的杂合子小鼠脾脏内，检测到表达鼠IL-17RA蛋白(图B)和人源化IL-17RA蛋白(图D)的细胞；而在野生型C57BL/6小鼠的脾脏内，只能检测到表达鼠IL-17RA蛋白(图A)，未检测到表达人或人源化IL-17RA蛋白的细胞(图C)。
实施例3TNF-α基因人源化小鼠
小鼠TNF-α基因(NCBI Gene ID：21926，Primary source：MGI：104798，UniProtID：P06804，位于17号染色体NC_000083.6的第35199367至35202007位，基于转录本NM_013693.3(SEQ ID NO：55)及其编码蛋白NP_038721.1(SEQ ID NO：56))，人TNF-α基因(NCBIGene ID：7124，Primary source：HGNC:11892，UniProt ID：P01375，位于6号染色体NC_000006.12的第31575567至31575567位，基于转录本NM_000594.3(SEQ ID NO：57)及其编码蛋白NP_000585.2(SEQ ID NO：58))。
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠TNF-α基因座引入编码人TNF-α蛋白的基因序列，使得该小鼠表达人TNF-α蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源TNF-α基因座上用人TNF-α基因的序列替换特定小鼠TNF-α基因序列。例如，将至少包含小鼠TNF-α基因的起始密码子ATG至终止密码子TAA的约1.8kb(1796bp)序列用对应的人基因序列替换，实现对小鼠TNF-α基因的人源化改造。
构建用于同源重组的打靶载体，所述打靶载体上含有上游和下游的同源臂序列(小鼠内源TNF-α基因座上游6173bp和下游4033bp的DNA序列)，并含有人TNF-α基因座序列。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：59)与NCBI登录号为NC_0000083.6的第35209909-35203737位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：60)与NCBI登录号为NC_0000083.6的第35197201至35193169位核苷酸序列相同；含有人TNF-α基因序列的DNA片段(6287bp，SEQ ID NO：61)与NCBI登录号为NC_000006.12的第31573694-31579980位核苷酸序列相同。
打靶载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧具有两个同向排列的位点特异性重组系统LoxP重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与含有人TNF-α的DNA片段序列(SEQ ID NO：61)直接连接，Neo盒3’端与小鼠基因座的接合设计为5’-AATGTATGCTATACGAAGTTATTAGGTCCCTCGAGGGGATCCGAATTCATCGGCTTCCTCCTGGAACTCCTCCTCCTCG-3’(SEQ ID NO：62)，其中序列“GAATT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“CATCG”的第一个“C”是小鼠序列的第一个核苷酸。此外，还在重组载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因，例如白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。
载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的重组载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的重组载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。按前述实施例1中所述方法进行囊胚注射和子代繁育，可得到表达人TNF-α蛋白的TNF-α基因人源化杂合子和纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠的鉴定结果见图14，其中编号为10的小鼠为阳性杂合小鼠。PCR测定包括下述引物：
WT-F：5’-GGTGACCTAGATAGTGCCTGG-3’(SEQ ID NO：63)
WT-R：5’-TCAGTCGCAGGCACGTTAAG-3’(SEQ ID NO：64)
Neo-F：5’-TGCATCGCATTGTCTGAGTAGG-3’(SEQ ID NO：65)
WT-R：5’-TCAGTCGCAGGCACGTTAAG-3’(SEQ ID NO：64)
通过本方法，构建了可稳定传代且无随机插入的TNF-α基因人源化的转基因小鼠。
实施例4双重人源化或多重人源化小鼠的制备及鉴定
利用本方法或制得的IL-17A、IL-17RA、TNF-α基因人源化的转基因小鼠还可以用于制备双人源化或多人源化小鼠模型。例如，在前述实施例1中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有其它基因修饰的小鼠。或者，也可在IL-17A和/或IL-17RA和/或TNF-α人源化的转基因小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因同源重组打靶技术，获得IL-17A和/或IL-17RA和/或TNF-α基因与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。
还可将本方法得到的IL-17A和/或IL-17RA和/或TNF-α转基因小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选。根据孟德尔遗传规律，可有一定几率得到IL-17A和/或IL-17RA和/或TNF-α基因人源化与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合小鼠。利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人IL-17A和/或IL-17RA和/或TNF-α和其它基因的相关信号通路的调节剂的体内药效验证等。
以IL-17A/TNF-α基因双重人源化的小鼠为例，由于小鼠IL-17A与TNF-α基因分别位于1号和17号染色体上，选择IL-17A基因人源化小鼠与TNF-α基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终得到IL-17A/TNF-α基因双重人源化的小鼠。
以IL-17A/IL-17RA基因双重人源化的小鼠为例，由于鼠IL-17A与IL-17RA基因分别位于1号和6号染色体上，选择IL-17A基因人源化小鼠与IL-17RA基因人源化小鼠交配，通过阳性子代小鼠的筛选，最终IL-17A/IL-17RA基因双重人源化的小鼠。
实施例5使用人源化小鼠建立EAE疾病模型
利用本发明公开的人源化小鼠可以诱导制备多种人类疾病模型，包括多发性硬化、哮喘、过敏等模型，可以用于测试人特异性抗体的体内药效。例如，IL-17A和/或IL-17RA基因人源化小鼠可用于评估人特异性IL-17信号通路的拮抗剂的药效、药代动力学及在本领域已知的各种疾病模型中的体内治疗功效。
以实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental Autoimmune Encephalomyelitis，EAE)模型的制备为例，可以使用本发明制备的IL-17A、IL-17A/IL-17RA等基因人源化小鼠(约10周龄)，采用MOG免疫1次(第0天，皮下注射200μg/只)，并给予腹腔注射百日咳毒素(PTX)两次(第0天和第1天，剂量为400μg/只)。首次免疫后每天对小鼠称重并连续观察，待小鼠发病后分组，通过灌胃、腹腔注射或鼠尾静脉注射等多种途径给药。可通过行为学评分、脑/脊髓IHC病理、HE病理学检查、血清/脑匀浆的Th17型多细胞因子检测和CNS及脾、淋巴结的流式细胞术等多重检测指标评定不同人用药物的体内药效情况。
在一项研究中，使用如实施例1所述的IL-17A人源化小鼠纯合子建立EAE疾病模型，实验分组如表1所示。使用上述方法诱导后，PBS对照组(G1、G3)无一小鼠发病，仅在建模组(G2、G4)发现小鼠患病，临床症状表现为精神萎靡、体重下降、鼠尾张力消失、后肢或四肢麻痹、大小便失禁，个别小鼠表现为共济失调。两个建模组共10只小鼠全部发病，发病时间为首次免疫后第10-12天，并出现体重减轻。随着致敏后天数的增加发病例数逐渐增加，发病后3-5天临床症状达高峰，此后进入缓解期，体重逐渐增加，呈现“发病-缓解”的趋势。
比较建模组雌性和雄性小鼠的发病情况，每天测量动物体重并根据4点评分体系(临床评分)评价神经病学指标：0＝正常；1＝尾巴软弱无力；2＝部分后肢麻痹；3＝全部后肢麻痹；4＝四肢麻痹。发现两性小鼠在建模过程中发病率、发病时间、达峰时间及症状严重程度无明显差别，但雌性小鼠体重和临床症状自行恢复程度较好(见图15、图16)，在实验结束时(第45天)取雌性小鼠的脊髓组织进行多聚甲醛固定、石蜡包埋切片后HE和IHC染色观察组织病理学改变。对脊髓腰膨大白质纵切面进行染色，如图17和图18中的结果所示，MOG免疫小鼠(建模组)的脊髓中有大量炎症细胞浸润，髓鞘蛋白大大减少，对照组小鼠脊髓未见异常。
表1
组别 免疫 周龄 小鼠数量 性别 基因型
G1(对照组) PBS 10 4 雌性 IL17A(h/h)
G2(建模组) MOG 10 5 雌性 IL17A(h/h)
G3(对照组) PBS 10 5 雄性 IL17A(h/h)
G4(建模组) MOG 10 5 雄性 IL17A(h/h)
在EAE模型中，IL-17A主要由疾病发展期间的CD4+Th17细胞产生。为了检测小鼠中人IL-17的产生，分离MOG免疫的IL-17A人源化小鼠纯合子(雌性，n＝5)的淋巴结细胞，并在布雷菲德菌素A的存在下用PMA和离子霉素刺激6小时。通过FACS分析产生IL-17和IFNγ的细胞。图19显示了示例性的流式细胞术结果。结果表明，MOG免疫后小鼠淋巴结的CD3+CD4+T细胞中hIL-17+CD3+CD4+T细胞和IFNγ+T细胞的百分比均增加，从分子层面证明EAE模型建造成功。
以上结果表明，使用本发明的方法制备的基因人源化小鼠可以用于建立稳定的EAE模型。
实施例6使用人源化IL-17A小鼠EAE模型评估体内药效
使用雌性IL-17A人源化小鼠纯合子根据实施例5中所述的方法建立EAE模型。在发病后，将小鼠分组并按照不同给药方案腹腔注射抗人IL-17A抗体Ixekizumab，对照组注射PBS。实验流程如图20所示，且给药方案如表2所示。具体来说，在MOG免疫当天(第0天)开始每天记录小鼠体重并对小鼠发病情况进行临床评分，观察神经功能表现。在第15天对小鼠进行分组。如图21和图22所示，与对照组相比，给药组小鼠体重减轻情况得到显著缓解，临床评分显著下降，且G2组的给药方式与G3、G4组相比对具有更好的改善作用。上述结果表明，使用本发明的IL-17A人源化小鼠建立的EAE模型能够用于评估靶向人IL-17A的药物的体内功效。
表2
Figure BDA0003404399620000441
BIW：两周一次，QW：每周一次
实施例7使用人源化IL-17A小鼠建立银屑病模型及其用于评估体内药效
Toll样受体在银屑病发生和发展进程中起重要作用，咪喹莫特是Toll样受体激动剂，可用于银屑病造模。在本实施例中，使用如实施例1所述的IL-17A人源化小鼠纯合子通过咪喹莫特诱导的方法建立银屑病模型。将雌性IL-17A人源化小鼠随机分为对照组(G1；不进行诱导)、模型组(G2)和给药组(G3)，每组5只小鼠。实验开始时(-D3)用剃毛器去除小鼠背部毛发，露出2cm×3cm的皮肤区域。3天后(D0)，模型组和给药组小鼠使用5％咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)乳膏(局部剂量83mg)每天对背部皮肤区域涂抹，连续涂抹12天；对照组小鼠涂抹凡士林。给药组小鼠在-D3、D0、D4、D7和D11腹腔注射抗人IL-17A抗体(Ixekizumab，100mg/kg单次剂量)，共给药5次。全部实验周期为17天，具体实验方案如图23所示。
从D0开始每天称量小鼠体重，对小鼠进行拍照并观察小鼠背部情况，并对小鼠发病情况进行临床评分。评分项目包括小鼠皮损处红斑(erythema)及鳞屑(scales)。每项根据严重程度分为0-4分，PASI评分标准如下：0-无；1-轻度；2-中度；3-重度；4-极重度。对各组小鼠每项评分和两项总分取平均值后进行比较。实验结束(D14)时，取小鼠背部及右耳皮肤标本切片处理后用苏木精和伊红染色(HE)。对各组小鼠背部糜烂、棘突出现、角化不全、混合炎细胞浸润情况按照严重程度进行评分(0.5-2分)：0.5-轻微、1-轻度、1.5-中度、2-重度；对基质细胞增生进行评分(0.5-2分)：0.5为2-4层、1为4-6层、1.5为6-8层、2为8-10层；出现痂皮：0.5分。进行结果统计和组间病理学分析评分，并测量表皮厚度。
从小鼠体重随时间的变化情况(图24)可知，对照组整个实验周期内体重平稳；模型组、给药组体重趋势一致，均从D0开始先下降，D2左右降至最低，再缓慢上升，实验过程中两组体重差异不大，实验终点时所有组小鼠体重接近且无明显差异。如图25-27所示的背部皮肤红斑、鳞屑和综合PASI评分结果表明，对照组无一小鼠发病，而模型组和给药组表现出不同程度的疾病。对比模型组和给药组而言，给药组的小鼠皮肤PASI评分明显低于模型组，说明对模型小鼠给予抗人IL-17A抗体治疗对银屑病具有治疗作用。小鼠的背部组织切片的HE染色结果(图28)、背部组织表皮厚度统计结果(图29)和背部组织切片的病理学评分统计结果(图30)表明，给药组背部皮肤在基质细胞增生、表皮增厚方面的病变程度均低于模型组。另外，模型组中部分小鼠的背部和耳朵皮肤可见痂皮，而给药组中未见此种病变，提示模型组动物皮肤出现过溃破或糜烂，病变严重程度高于给药组。
上述结果证明，本发明的人源化小鼠可以用于建立银屑病模型以评估针对人IL-17A的药物的体内功效。
实施例8使用人源化IL-17A小鼠建立的银屑病模型测试体内剂量
使用如实施例1所述的IL-17A人源化小鼠纯合子通过咪喹莫特诱导的方法建立银屑病模型。取雌性小鼠随机分为空白对照G1组(凡士林；不诱导疾病)和不同处理的模型组(以下剂量均为单次剂量)：对照G2组(0.9％Nacl)、同型对照G3组(10mg/kg IgG4)，G4组(1mg/kg ixekizumab)、G5组(3mg/kg ixekizumab)、G6组(10mg/kg ixekizumab)，每组5只实验动物。实验开始时(-D3)用剃毛器去除背部毛发，露出2cm×3cm的皮肤区域。3天后(D0)给药组使用5％咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)乳膏(局部剂量80mg)每天对背部涂抹造模，连续涂抹12天，G1组小鼠涂抹凡士林作为空白对照。给药组实验开始(-D3)起每周腹腔注射抗人IL17A抗体(ixekizumab)、0.9％Nacl或IgG4，共给药5次。全部实验周期为14天，具体实验方案如图31所示。
从小鼠体重随时间的变化情况(图32)可见，对照组整个实验周期内体重平稳，模型组、给药组体重趋势一致，均从D0开始先下降，D2左右降至最低，再缓慢上升。实验过程中两组体重差异不大，所有组小鼠体重接近且无明显差异。如图33-35所示的背部皮肤红斑、鳞屑和综合PASI评分结果表明，空白对照组无一小鼠发病，而不同处理的模型组表现出不同程度的皮肤疾病。使用抗人IL-17A抗体药物ixekizumab处理的小鼠(G4-G6)皮肤PASI评分低于Nacl及IgG4处理的小鼠，说明对模型小鼠给予抗人IL-17A抗体治疗缓解了咪喹莫特引起的皮肤炎症的临床体征，其中使用剂量10mg/kg ixekizumab处理的效果最好。
对各组小鼠的背部组织表皮厚度统计结果(图36)表明，抗人IL-17A抗体给药组小鼠的背部皮肤在基质细胞增生、表皮增厚方面的病变程度均低于Nacl及IgG4注射组的动物，说明抗人IL-17A抗体减轻了疾病模型小鼠的表皮增厚。小鼠的背部组织切片的病理学评分统计结果如图37所示，给药组背部皮肤在基质细胞增生、表皮增厚方面的病变程度均低于模型组。另外，模型组中部分小鼠的背部和耳朵皮肤可见痂皮，而给药组中未见此种病变，提示模型组动物皮肤出现过溃破或糜烂，病变严重程度高于给药组。说明给予小鼠抗人IL-17A抗体缓解了咪喹莫特引起的炎症体征。其中使用剂量10mg/kg ixekizumab处理的效果最好。上述结果表明，本发明的人源化小鼠可以用于建立银屑病模型以评估针对人IL-17A的药物的体内剂量。
本发明提供以下内容：
1.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列。
2.如项1所述的细胞，其中所述细胞表达人IL-17A蛋白，任选所述蛋白包含与SEQID NO:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成。
3.如项1所述的细胞，其中所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
4.如项1所述的细胞，其中所述人IL-17A基因的序列包含与SEQ ID NO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成。
5.如项1至3中任一项所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
6.如项5所述的细胞，其中所述细胞表达人IL-17RA蛋白或人源化IL-17RA蛋白，和/或人TNF-α蛋白，任选其中所述人IL-17RA包含与SEQ ID NO:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32或由SEQ ID NO:32组成；
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQID NO:39或由SEQ ID NO:39组成；和
和/或所述人TNF-α蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ IDNO:58或由SEQ ID NO:58组成。
7.如项5所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含人IL-17RA基因自2号外显子至11号外显子的序列。
8.如项5所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或所述人IL-17RA基因的序列包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35组成。
9.如项5所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
10.如项5所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成。
11.一种转基因非人动物细胞，所述细胞的基因组中包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
12.如项11所述的细胞，其中所述人IL-17RA基因的序列包含与SEQ ID NO:35具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:35或由SEQ ID NO:35组成。
13.如项11或12所述的细胞，其中所述细胞的基因组中还包含可表达形式的人TNF-α基因的序列，其中所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
14.如项13所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
15.如项13所述的细胞，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成。
16.如项1至15中任一项所述的细胞，其中所述转基因非人动物细胞是转基因啮齿类动物细胞或转基因小鼠细胞。
17.如项1至16中任一项所述的细胞，其中所述细胞选自体细胞和干细胞例如胚胎干细胞。
18.如或项1至17中任一项所述的细胞在筛选调节IL-17A/IL-17-RA信号通路的试剂中的用途，任选地所述试剂选自抗体、抗体片段、对应受体或配体或其片段、融合蛋白和小分子化合物。
19.转基因非人动物在构建与IL-17A/IL-17RA信号通路异常相关的疾病模型中的用途，其中转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列，优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
20.如项19所述的用途，其中所述疾病选自自身免疫病和肿瘤，任选所述自身免疫病选自多发性硬化症、哮喘、炎症性肠病、银屑病、类风湿性关节炎、克罗恩氏病、白塞病、系统性红斑狼疮、原发性干燥综合征、心肌炎、I型糖尿病、甲状腺炎、特异性皮炎、超敏反应、移植物抗宿主病。
21.转基因非人动物在测试针对人IL-17A的试剂的体内药效中的用途，其中所述转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列，优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
22.如项21所述的用途，其中所述试剂选自针对人IL-17A的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
23.如项21或22所述的用途，其中所述转基因非人动物用于构建与IL-17A信号通路异常相关的疾病模型，并在所述疾病模型中测试所述试剂的体内药效。
24.如项23所述的用途，其中所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自自身免疫病模型选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和银屑病模型，例如所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
25.一种测试针对人IL-17A的试剂的体内药效的方法，所述方法包括：
a.使用转基因非人动物构建与IL-17A信号通路异常相关的疾病模型，其中所述转基因非人动物的基因组中包含可表达形式的人IL-17A基因的序列，任选其中所述人IL-17A基因的序列替换所述细胞的基因组中对应的内源性序列；
b.对所述疾病模型动物施用所述针对人IL-17A的试剂；和
c.评估所述针对IL-17A的试剂的体内药效，
优选所述转基因非人动物是转基因啮齿类动物，例如转基因小鼠。
26.如项25所述的方法，其中所述试剂选自针对人IL-17A的抗体或抗体片段，或小分子拮抗剂。
27.如项25或26所述的方法，其中所述疾病模型是自身免疫病模型，例如选自实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)和银屑病模型，例如所述银屑病模型是咪喹莫特诱导的银屑病模型。
28.如项19-24中任一项所述的用途，或如项25-27中任一项所述的方法，其中所述转基因非人动物表达人IL-17A蛋白，任选所述蛋白包含与SEQ ID NO:4具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:4或由SEQ ID NO:4组成。
29.如项19-24中任一项所述的用途，或如项25-27中任一项所述的方法，其中所述人IL-17A基因的序列包含人IL-17A基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
30.如项19-24中任一项所述的用途，或如项25-27中任一项所述的方法，其中所述人IL-17A基因的序列包含与SEQ ID NO:7具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:7或由SEQ ID NO:7组成。
31.如项29或30所述的方法或用途，其中所述转基因非人动物的基因组中还包含可表达形式的人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列，任选其中所述人IL-17RA基因的序列和/或人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列。
32.如项31所述的方法或用途，其中所述转基因非人动物表达人IL-17RA蛋白或人源化IL-17RA蛋白，和/或人TNF-α蛋白，任选其中所述人IL-17RA包含与SEQ ID NO:32具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32或由SEQ ID NO:32组成；
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:32第49-341位所示的氨基酸序列；或
所述人源化IL-17RA蛋白包含与SEQ ID NO:39具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQID NO:39或由SEQ ID NO:39组成；和
和/或所述人TNF-α蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ IDNO:58或由SEQ ID NO:58组成。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，本领域技术人员将理解，在本发明的技术构思范围内可以对本发明的技术方案进行多种变型，这些变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的精神，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 人源化转基因动物
<130> C19P5835D2
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1171
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 1
atccacctca cacgaggcac aagtgcaccc agcaccagct gatcaggacg cgcaaacatg 60
agtccaggga gagcttcatc tgtgtctctg atgctgttgc tgctgctgag cctggcggct 120
acagtgaagg cagcagcgat catccctcaa agctcagcgt gtccaaacac tgaggccaag 180
gacttcctcc agaatgtgaa ggtcaacctc aaagtcttta actcccttgg cgcaaaagtg 240
agctccagaa ggccctcaga ctacctcaac cgttccacgt caccctggac tctccaccgc 300
aatgaagacc ctgatagata tccctctgtg atctgggaag ctcagtgccg ccaccagcgc 360
tgtgtcaatg cggagggaaa gctggaccac cacatgaatt ctgttctcat ccagcaagag 420
atcctggtcc tgaagaggga gcctgagagc tgccccttca ctttcagggt cgagaagatg 480
ctggtgggtg tgggctgcac ctgcgtggcc tcgattgtcc gccaggcagc ctaaacagag 540
acccgcggct gacccctaag aaacccccac gtttctcagc aaacttactt gcatttttaa 600
aacagttcgt gctattgatt ttcagcaagg aatgtggatt cagaggcaga ttcagaattg 660
tctgccctcc acaatgaaaa gaaggtgtaa aggggtccca aactgcttcg tgtttgtttt 720
tctgtggact ttaaattatt tgtgtattta caatatccca agatagcttt gaagcgtaac 780
ttattttaat gaagtatcta cattattatt atgtttcttt ctgaagaaga caaaattcaa 840
gactcagaaa ttttattatt taaaaggtaa agcctatatt tatatgagct atttatgaat 900
ctatttattt ttcttcagta tttgaagtat taagaacatg attttcagat ctacctaggg 960
aagtcctaag taagattaaa tattaatgga aatttcagct ttactatttg tttatttaag 1020
gttctctcct ctgaatgggg tgaaaaccaa acttagtttt atgtttaata actttttaaa 1080
ttattgaaga ttcaaaaaat tggataattt agctccctac tctgttttaa aaaaaaattg 1140
taacaatatc actgtaataa taaagttttg g 1171
<210> 2
<211> 158
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
Met Ser Pro Gly Arg Ala Ser Ser Val Ser Leu Met Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Ala Ala Thr Val Lys Ala Ala Ala Ile Ile Pro Gln Ser
20 25 30
Ser Ala Cys Pro Asn Thr Glu Ala Lys Asp Phe Leu Gln Asn Val Lys
35 40 45
Val Asn Leu Lys Val Phe Asn Ser Leu Gly Ala Lys Val Ser Ser Arg
50 55 60
Arg Pro Ser Asp Tyr Leu Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Thr Leu His
65 70 75 80
Arg Asn Glu Asp Pro Asp Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Gln
85 90 95
Cys Arg His Gln Arg Cys Val Asn Ala Glu Gly Lys Leu Asp His His
100 105 110
Met Asn Ser Val Leu Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Lys Arg Glu
115 120 125
Pro Glu Ser Cys Pro Phe Thr Phe Arg Val Glu Lys Met Leu Val Gly
130 135 140
Val Gly Cys Thr Cys Val Ala Ser Ile Val Arg Gln Ala Ala
145 150 155
<210> 3
<211> 1871
<212> DNA
<213> 人类
<400> 3
gtccatctca tagcaggcac aaactcatcc atccccagtt gattggaaga aacaacgatg 60
actcctggga agacctcatt ggtgtcactg ctactgctgc tgagcctgga ggccatagtg 120
aaggcaggaa tcacaatccc acgaaatcca ggatgcccaa attctgagga caagaacttc 180
ccccggactg tgatggtcaa cctgaacatc cataaccgga ataccaatac caatcccaaa 240
aggtcctcag attactacaa ccgatccacc tcaccttgga atctccaccg caatgaggac 300
cctgagagat atccctctgt gatctgggag gcaaagtgcc gccacttggg ctgcatcaac 360
gctgatggga acgtggacta ccacatgaac tctgtcccca tccagcaaga gatcctggtc 420
ctgcgcaggg agcctccaca ctgccccaac tccttccggc tggagaagat actggtgtcc 480
gtgggctgca cctgtgtcac cccgattgtc caccatgtgg cctaagagct ctggggagcc 540
cacactcccc aaagcagtta gactatggag agccgaccca gcccctcagg aaccctcatc 600
cttcaaagac agcctcattt cggactaaac tcattagagt tcttaaggca gtttgtccaa 660
ttaaagcttc agaggtaaca cttggccaag atatgagatc tgaattacct ttccctcttt 720
ccaagaagga aggtttgact gagtaccaat ttgcttcttg tttacttttt taagggcttt 780
aagttattta tgtatttaat atgccctgag ataactttgg ggtataagat tccattttaa 840
tgaattacct actttatttt gtttgtcttt ttaaagaaga taagattctg ggcttgggaa 900
ttttattatt taaaaggtaa aacctgtatt tatttgagct atttaaggat ctatttatgt 960
ttaagtattt agaaaaaggt gaaaaagcac tattatcagt tctgcctagg taaatgtaag 1020
atagaattaa atggcagtgc aaaatttctg agtctttaca acatacggat atagtatttc 1080
ctcctctttg tttttaaaag ttataacatg gctgaaaaga aagattaaac ctactttcat 1140
atgtattaat ttaaattttg caatttgttg aggttttaca agagatacag caagtctaac 1200
tctctgttcc attaaaccct tataataaaa tccttctgta ataataaagt ttcaaaagaa 1260
aatgtttatt tgttctcatt aaatgtattt tagcaaactc agctcttccc tattgggaag 1320
agttatgcaa attctcctat aagcaaaaca aagcatgtct ttgagtaaca atgacctgga 1380
aatacccaaa attccaagtt ctcgatttca catgccttca agactgaaca ccgactaagg 1440
ttttcatact attagccaat gctgtagaca gaagcatttt gataggaata gagcaaataa 1500
gataatggcc ctgaggaatg gcatgtcatt attaaagatc atatggggaa aatgaaaccc 1560
tccccaaaat acaagaagtt ctgggaggag acattgtctt cagactacaa tgtccagttt 1620
ctcccctaga ctcaggcttc ctttggagat taaggcccct cagagatcaa cagaccaaca 1680
tttttctctt cctcaagcaa cactcctagg gcctggcttc tgtctgatca aggcaccaca 1740
caacccagaa aggagctgat ggggcagaac gaactttaag tatgagaaaa gttcagccca 1800
agtaaaataa aaactcaatc acattcaatt ccagagtagt ttcaagtttc acatcgtaac 1860
cattttcgcc c 1871
<210> 4
<211> 155
<212> PRT
<213> 人类
<400> 4
Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser
1 5 10 15
Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly
20 25 30
Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn
35 40 45
Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser
50 55 60
Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu
65 70 75 80
Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His
85 90 95
Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser
100 105 110
Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His
115 120 125
Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys
130 135 140
Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala
145 150 155
<210> 5
<211> 3708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 5
tagtactcat tactgggact tcccatcata gaattgttca gagtggtcct cagaagcaca 60
aattataggt aagactgagt taaaatgtag atctggataa gatcctagct ttaccaattc 120
cataaggcct cccatgtggt cattattgca aataccctcc taccttaaca acaaatcttt 180
cctttaagtg tcaatttggg atttttttcc agtccaggtt gggcatcttc atacagtagc 240
tcctacattt aggacctaag gacactttct ctagaactgt tctctattaa acaaaaccaa 300
tggagaagga gccttatgca atactgtaca atgcattaaa ctaaatggca cctacctgtt 360
caaacagcca ttgtcttctt taaattagga tgcatgttaa ccactttaaa ctgtgaaatc 420
cctccttttt acagaccact gctgttattg ctttttcctg aaaagggcca tagaatacaa 480
attagtgaaa taatagattc tcaatggtag ccctgccatc tgagcagaaa acaaaactga 540
tttttatgtt tttagtaacg tcttaatttt ccaccacact gagacaaaag atattttatc 600
ctgtttacaa aagtaagaat tttcccttat ttttggtgtt atcctctctt ataggtagaa 660
aataatactg tataatggcc taatgatttc aagaagcccc aaagtatctt ttcccttaaa 720
acatcacttg actacaagca tcctcctgtt tcataccctc ccacacacag ccctggtcct 780
taaactgtag ctgcccagtc ttgtagctgc tgttttgaat ctgcagagaa gcaagatgga 840
tacacttgaa ggccactcct gagcaaaatc atcattccta acctactgct tttgtttatt 900
cattgctatt ttccttctgc aaaaagtcaa ccacaatgaa caggtgagac aaaacctcat 960
tttataaaac agaagagcat gtctacaaaa aagatgaagt aggtctcaga aaggcaaagg 1020
cacaacgaaa gtgaagatgc caatctcttg gtaccctcag cacaccaggt ctcactatgg 1080
ccttccttct gcctctgaag gctaagagcc aatcctgaat aacagcaagc acaaaagaaa 1140
cctgaccttc tgtgcacagc ccctgtgttc ccaattgctc ctccaaggac aaggctttca 1200
gatggaggga gtctctatgg ctgggaaatc cgttcttctc aaagccaggc acagccagct 1260
ccatgtctaa atcttcacac tgttgtgaaa actgatcttg tctctccccc ttccctttat 1320
ttttagacaa agattgtcac ctctcaaagg cccatacata ggctgagttt tacgactgtg 1380
ggacagtgga ctggggagat tattagatct tcctcttcat catcagttga cagatttggc 1440
aggaaacctc ttcctctcct gccagatagc aacaaggagt gtttattcct tggagttcag 1500
cataggctac aacatagtca tacacttttc aaaggcataa ggatttagag ccaagggata 1560
agacaaccca ggaatgtctt agactgcagc tgagttctaa aaagaaacaa ggtcatgaat 1620
ttctgacata atgtttcata ttgccaatca ataacaacaa caacaacaaa agttcagctg 1680
ttattttcta aaccctatgc agttggtaca aagattaaca aaatagctac aggtgttcaa 1740
gtaacttaca atatagaaag taaatcagta agcaaacaat atacaggtca agagaaacag 1800
acagccacat accaaagaga caaatgagtc taaagtaatc catggagctg gagagatggc 1860
tcagcagtta agagtactga ctgctcttcc agaggtcttg agttcaattc ccagaaacca 1920
catggtggct cacaaccatt tgtaatggga tctgatacct tcttctggtg tgtctgaaga 1980
tagcatcagt gtattcacat atattaaata aataaatatt ttttaaaaag taatccatga 2040
agacctatgt tgtataaaaa gttatattat gtacaacaaa atttaagaaa atgagtaaca 2100
cattagccca taaagaagcc aatgttgtgg tatgtttatt ccagtgatgt tattccccga 2160
tagaataact atttgaatag gatcctacaa gtgtgctgat aaacagggtg aaagaggaca 2220
ttgcctaggc tgtattttaa cagaaggtat gtaatttgta gaaggatgac acgtagaaag 2280
ccaggacctg gtgaacccta acatggagca tagtaacatg gaggctagaa gggatgttaa 2340
ttcaaactgc aatactaatt caaggagttc atgcttctca ttcaggaagc tagagaatgg 2400
gaaaagacct ggcaatcaga ggtgtgtgtg agcattatcc cagggataat gccaagggta 2460
ttatcccaag ggtatcccaa gaagtgtcag aaaagcaaac atgatccaaa caggtgaaag 2520
tcagagttac cagccagcaa aagacctaga aagaagagca aggtgtgagg tgctgcaact 2580
tctgagaaca cggtgatcat gaacagaatc cagcaatcct accagacatg ccatctattg 2640
aacaggagct atcggtccac ctcatgctgc atgtcagaca aaagctgaag agctgggacc 2700
taatgacccc catattcacc atcttgtcct catatctgct attcctgaag aaaaagactt 2760
ctcaaagaca taaaggcaaa ggtcatctca tggagaggag agaacatgag agagctgttt 2820
ccatcttccc ttctcatccc tcatctcctc ctgttagtag tctccacccg gcagtgcctc 2880
agtgtctcca ctgtctttca gccttcatct tgatttctaa ttctttcttc gatttatcca 2940
atcagtccct tattctttca cttcatttcc ttcctcctta aaagaaaggc ttgataccga 3000
acctcaaaac agcaaatatt aacaggtttc ttgataacat gcaaccgtaa tgacttcact 3060
agtaaacctc atgtctctcg ctactcctta ataactaact agcctttgtg attgtttctt 3120
gcagagaata gacattcaag gaaaaacagt tgcggtactc agttaaatag aacgtgttcc 3180
gttggtgtta aattatttat tttgtatgtc tgtttacata ctaagacatt gagtgggttt 3240
ctttgggcaa gggatgctct ctagccaggg aatttggtag aaaagtgaga aagatcaagt 3300
caaaattcaa agtgtgtgtc actaggagac tgtcaagaga ctcacaaacc attactatgg 3360
agcccagctc tgcagcagct tcagatatgt ccatacacac atgatactga atcacagcaa 3420
agcatctctg ttcagctccc aagaagtcat gcttctttgc atagtgaact tctgcccttc 3480
ccatctacct tcgagacaga tgttgcccgt cataaagggg tggttctgtg ctgacctcat 3540
ttgaggatgg aatctttact caaatggtgt caccccccaa cccactcttg acgtaagtga 3600
ccacagaggt agtaaaaccg tataaaaaga gagaaaggag cactactctt catccacctc 3660
acacgaggca caagtgcacc cagcaccagc tgatcaggac gcgcaaac 3708
<210> 6
<211> 4765
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 6
atctgtagct cggggaacat catgagagag gagcagaaag attgtaagag cagaacaaca 60
ggaagtctgc tgggaaacag tctcctagaa atgtcttcat gaacaagcca agacaatatc 120
aatggatata ttaacatgga aggggtaatt tcctcaggtc ctacccctaa acaaagaact 180
acaggcatcc attgacttct gggagaatgt aaaagcctct accagagatg agccccttat 240
tgtttgccta atgcagagca gtcagccctg aaaccatatg cacaacaaca acaaaaatgg 300
actcagcagg ttgtgagtgc atgtgtgtgt gtgtgtatgt gtatgcaaac acatacatgt 360
gcatatacat gtatgtggca ataataaaga aaaatactat catttaagag tggaggtata 420
tggaaggggt tcaaggaaga gtgggtctgg aggaagaaag ggaagtggaa aatgacatga 480
ttctatctgt accaaaaaaa acactttttt aaaatgtaat atgttgagtc ccccaggaag 540
tagggaggtc tggtggggtg ggaggaatgc aatgaagaac tgtcagaagg tagaccagaa 600
gggggataat gaccagactg taaaaaagag attaaagaaa ataaatttta taaataaata 660
aattaattaa ttgattgatt gattccaaca aaaatagtat attttacacg attataaatt 720
tgtggtaatt gtacatgaat aatagaaatt tgtgactgca caaatttgga tttcaatcct 780
ggctttcctt attcgctgct ccctgagaaa tatttctaag cctcttccct cttaatccat 840
gaaatagaaa actgtgagag taaaacataa ataaataaag aatggcgtag tctctgatag 900
gtgtcagtag agaaggacac atacagcctt ctcccctgtc agtcttccct aaaacaatgc 960
ggcagtgcag atgtttgcac agggtcacat tctgtgagat actgtaagta ttacagatga 1020
gtttcagcac aatggaagga tggagggagg ttacatgcaa acaccactat cttatgcaag 1080
gagatgagcg tctgcagact ttgatatgtg ggagggactg tcctgttact cacctcaaac 1140
actctgaagg tcttttgaac ttcagcccct tcagctctcc cctgttggga aaaatatgcc 1200
tcagagtaac aatgcccttg aaccacccaa ctccacattt ccaatttcat attgccttta 1260
agacaatgag gacaaggctc ttcccgtacc aggcaatgct atgagcagaa gcattctgca 1320
ataaattaag caaaaagaac agtggcccta ggaaaagaca catcgctgtt agagaccggg 1380
gtgggggggg ggggggcgtc ctaaaactat aacctgatat ttgacataaa agaaattctt 1440
caaggaaact ctgttttcaa aataggagtc cttgctgtga tgaccaaggg ccaccagaga 1500
tcaggattcc ctctcagagc ttaggtctgc cctcagtctc tcatccagtg cacccaagca 1560
ttcagaaggg aagcggcaag aaagagtcag cctcaagaat aaaagttgtt caacacaagc 1620
aaagtcaaaa ctgagtcata tttgccaaca ggtcagtttc aagctttgaa tcatagccat 1680
cccagtcccc acgcccgagc ctgttattat gcccagttca gggatccttc tgaatggttc 1740
tccagccatt cccacgggct ctctgcttct tcttttaatt aatttctttg ggaagaggaa 1800
gcaggcacct ttagctgctg agctgtctca ttagccttca ctctttactc tctagcaggt 1860
ccatcaccac ccagaggtct acagtacagc ttccctctcc ttcattctaa tcccaaagcc 1920
aggaggcaac ttccccagtt cctcttgtca ctagcacctt gtgctctttc agcttggtac 1980
tgagagccaa cgcgtcacaa gcacacacgc acacacacag ccactgtagt ggtttgaatg 2040
tgcctggccc agtgagtggc actattagga gatgtggcct tgttggagtg ggtgtggcct 2100
tgttagagaa agtgtgtcac tgtgggcatg agctttaaga ccctcatccc agcttcattg 2160
gaagacagtc ttctagcggc cttcagatga agatgtagaa ctcgcagctc ctccagcatt 2220
atgccatgct cccaccttga tgataataga ctgaatctct gaacctgtaa gccagtccca 2280
attaaacgtt gtccttacaa gagttgcctt ggtcatgtgt ctgttcacag cagtaaaatt 2340
ctaagacaca cacacatatg cgcatggggg gggaggggag agagagagag agcattcaca 2400
ggtgctatct taatgtttta taatcctgct gctcatcatt tctttgggct tcgcagcatg 2460
gaagctttag gagcaccact aaggaagagc acacatgaac ctgtagtccc agaccgttat 2520
ttcatattag ttttactatt attggaggct aggaaaaagc cttctgtctt aggatttttg 2580
ttgttgttgt tgttgttgtt tgtttgtttg tttgtttgtt tttttagtgt tgttataact 2640
gtaacaaaaa ttttgaattc tgtttattaa gaaaagagat ttatttcact gacagttcta 2700
gagttgatgg ccattgcacc tgcatcctgc atcagtgtag cttctggtca aggcttcatg 2760
gcaaatgtca tccacataaa gaaacatgtc ctaaagtggc atagagagga ggtaccaggc 2820
tcttctagaa cagcccatct gtcaggacag tcccatgaga cctggtctgc tctctaatga 2880
cagtactgat ctctcccaac agtgattcct tctacaacta aattaccttg cactaggtct 2940
aactctttaa agctgtaagc acttcaaacc caccacaatg gagaccgagt atccagcagt 3000
ggatatttag agaccttatt ggatactttt ttgttttttc tttttctagg aattcaatgg 3060
tgtgttattt tagtgtactt tatttattca ctttacatcc caatcacagc ccccccccaa 3120
cctgtcatcc cccctcctcc ctgcttctct tctcctctag aaggatggag gggtcccctg 3180
ggcatccact ccccaccctg gcacatcaag tctctgaaag gctaggtgct tcctctccca 3240
ctgaggccag acaaaacagc ccagctagaa gaacatatcc cacagacagc caactgcttt 3300
gaggatagct cccgttccag ttgttcagga cccacatgaa gaccaagctg cacatctgct 3360
acatatgaac agggaggcct aggtccagtc catgtatgct tttttgttgg tagttcagtc 3420
cctgagaccc tccaagggtc caggttaatt gactgtgttg gtcttcctgt ggagttccta 3480
tccccttcag gctgaaatcc tttcttctgt tcttctataa gagcccagga gctccatcta 3540
ctgtttgtct gaagctccac aacctctcca aacagtgctg taagctagtc attaaatgct 3600
taaagatgca cctacagggg acagttcaca gaacaatctt gcgcatctct cattccctga 3660
tacacatcac ttggattcta actttgtctt cccaactctc accattgctc tggatggttt 3720
ccatgcgcct gcagatgcta cctacacaca aagtcaaagg ccacaaagta ctgtctggtt 3780
tacctcacgc cactttctgc ataggtatgt tctaagtgca gtgaggttca cagcctgtgc 3840
actggggctc ctctgctgga atggcttaac ctttctttcc tagttgttcc tagttgctcc 3900
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gagtacactg tcactctatt cagagacacc agaaattaca ttacagatgt ctgtgagcca 4020
ccatgtggtt gctgggattt gaactcggga cctctggtta agagctactg ctcttaaccg 4080
ctgagctatc tctccagccc tgctagctct tctttatatt catagccttc ctttccttcc 4140
tgctatacct taaccctatt ttgtgatgaa agcatgtggc aaaggaaaca aaatgagaga 4200
gaataagagt ctgaggtcgc agccccttca agggtctgcc cacaaaagcc ttactgcctt 4260
ctattaggtc tcatctgcta aaggttccac ctcctcccac tatcactaaa ggctaggaac 4320
caaaccccta acatgcagcc cttcagaaaa cactggccaa aacaacatca tgcctggatt 4380
tgttcattct tacccactca tttcaagctc aatgctttgc cttatacaac aaaactcttc 4440
ccttcatatt cacaagggct tcacatcctt aggatccatg ttttgtgtct tttgctacct 4500
ttctcaagat gctctgtgga gacagggagt gattagaaga cctcatagat gggcccagac 4560
gaccaagagt ggttgctaat gcccctatct cagagtatcc atgatggagc aggatttaat 4620
gagaggcatt gaagaattgc cttcacaagc tgtgtaacta ggtttttctc cactgaagca 4680
aacccaactg accaaatgca gtttatgtcc tttctcagca cagagccaca gagtatggat 4740
ccaatgtgac agaaaccggt cagtg 4765
<210> 7
<211> 2861
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 7
atgactcctg ggaagacctc attggtggtg agtcctgcac taacgtgcga tgctcttgct 60
gatttggacc agatagtatt tctggaccgt gggcatgaaa cgctgggttc tgactatgga 120
gatccaggaa tactgtatat gtaggatagg aaatgaaagc tttggtaggt atttaagtca 180
ttgtgcagca ttttcaagaa ctgatacaca gcagtttgaa agataagatt aaaactgaaa 240
gatagctata ttggggctaa accacacaag aagtgtcaca tgatgctgtg cagtaagaaa 300
gaaaatttat tgaaagtctg tttttctgag tacaaaggat ttaatataat tctcccacgg 360
catttttctt taaaatgggt cactatcctt gagattttga aagccgtagc agcaacaacc 420
tttgtttcca ttatctcgta ccatattctc agtacattga aactatgtat tctaactaaa 480
cataggtata actgtgtttt agaataagtg gggtttatat tttttaaata tttaacttca 540
agtatctttt ttgaaatctg attttattac agaatcaata catgttaaat ttagaacaac 600
tggaaaatat acctaagaaa acatgaagga gatcgagttt ttagttggat gcctgccagt 660
agcaccaaca gcacttctag catgaatatt gataccacat agattttcta tagctctttc 720
ttccaatgtg aatgtttgac ttcacgatga gtttcacaga atatgggact gagaacaatg 780
gtgcaggagg atatttctac ctagaaaatc aaggttatta ttccttccca gacctgacaa 840
tgatgcatgt gctgataggc taatgacatg ccatgacttg acatttttat taaaattatt 900
gccaaccaat ggataacatg tctttcctaa gtcaaaagga gaatgttgaa actagttttt 960
ttaaaaaaat tttaaagcca tggtgttaac attatgttgg tcatctacct agatttttct 1020
ctagctgatc tgaaaaatgt agtatagatt gtcctggaac attgtgtgtt ctctatgatt 1080
agcaatgcat catcatcaca attaatttgt caaaaagaac cacatagtaa tctaatctcc 1140
aacctctctc tcctttccca ttcaattcta gtcactgcta ctgctgctga gcctggaggc 1200
catagtgaag gcaggaatca caatcccacg aaatccagga tgcccaaatt ctgaggacaa 1260
gaacttcccc cggactgtga tggtcaacct gaacatccat aaccggaata ccaataccaa 1320
tcccaaaagg tcctcagatt actacaaccg atccacctca ccttggaatc tccagtacgt 1380
aaagcttcca gataaaaatg ctatattctt catccctctt atgcatcaga ctgccagtta 1440
aatctccctg aggatgattt tattcattta gaattaccag tcaaacctgg aaggaccact 1500
gtgaagagca attctcaaac tttctacaga tttctttaac caagcacagg acagcctcca 1560
ataatcccta tcctgttaga tctaattgtc actgacacca ataatcaacc caaattaatt 1620
ataatcatta ttctaatatt tatgagaccc caagtctatt ctttatttat tcaaagaata 1680
gacatttatc aaagaggatt aatgctttta ttatcttaac cagagctgcc attgagaaga 1740
tttattgcaa ataattaata attagggttt tttactttta ttcttttgct tatttttgtt 1800
tttgaatccc agtggaataa gtatcactgg ggtatttcta cccctttgtg tgttaaatag 1860
tcttgatcta cttcctaaca tacctatgct tgctgtatcc ttagtatacc cagtatttag 1920
accccatcaa gggttaaata ccaaatgtat tttgatcatt tgacttcata caaataagtc 1980
tctgttctgt ggagcctaca gattggtctg attgtaggat ttcttctctt cttcccatta 2040
ctaggaagag tcaaaataaa tcaattcaaa aatgcaagca aatcattcac tgatctaaaa 2100
gagagaggga agagaaggtc atagagacac ttaacctttt gtttccagcc ctttatctca 2160
gctctgggct ctgtcccacg aatgtgatct cagataaaat tttgatgtat tccctcttca 2220
aagacagact tcatcaagtc aaataaacag ctatcttatt ctagatggtt ccaagtctac 2280
tcttcctttg gtcttcttct gtctgtcaaa tgtaccctaa aaaagctatc atttgtgtca 2340
aacttaaatt ttttctgtgg cctcagtcta tcttatttta ttcattcttc aaataaattg 2400
gagaaaaact gatcactgtc ttcttttcta taacaattca cgtgcttgaa aaaaaaatcc 2460
aatttgtccc caaagttctt cttcaaacta acatcattta aagaatttgc aatgcctata 2520
atttgtcatc ctgtgaactt gcctctcttc atgtattcct gttttatttc tttcccactt 2580
taccaggaat tcactttcct cctgattttt ctcccctctg cagccgcaat gaggaccctg 2640
agagatatcc ctctgtgatc tgggaggcaa agtgccgcca cttgggctgc atcaacgctg 2700
atgggaacgt ggactaccac atgaactctg tccccatcca gcaagagatc ctggtcctgc 2760
gcagggagcc tccacactgc cccaactcct tccggctgga gaagatactg gtgtccgtgg 2820
gctgcacctg tgtcaccccg attgtccacc atgtggccta a 2861
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 8
gcacccagca ccagctgatc aggacgcgca aacatgactc ctgggaagac ctcattggtg 60
<210> 9
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 9
cgattgtcca ccatgtggcc taaacagaga cccgcggctg acccctaaga 50
<210> 10
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 10
ccggtggaca catctggagt acagcgtctg cgtcgacggt atcgataagc ttgatatcga 60
attccgaagt tcctattctc tag 83
<210> 11
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 11
agtataggaa cttcatcagt caggtacata atggtggatc cactagtatc tgtagctcgg 60
ggaacatcat gagagaggag c 81
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 12
cttctgatac atatgcatcc acgtgc 26
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 13
atgcccacgg tccagaaata ctat 24
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 14
gctcgactag agcttgcgga 20
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 15
gtgagagcag caagtgctct taacc 25
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 16
agagcagcat accaattagc aacat 25
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 17
ctaggtgggt tcctcactgg tct 23
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 18
accaaaggaa caagtggaaa gaatcgg 27
<210> 19
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 19
atcttcctgc ccagcattgc ct 22
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 20
ggatcggcca ttgaacaaga tgg 23
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 21
cagaagaact cgtcaagaag gcg 23
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 22
tctctgttca gctcccaaga agtca 25
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 23
ctcattgcat agcgtcatgt gaca 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 24
atgcccacgg tccagaaata ctat 24
<210> 25
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 25
gaatgtagct agcctgtgca agga 24
<210> 26
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 26
cagcagactt cctgttgttc tgctc 25
<210> 27
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 27
gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 28
gctccaattt cccacaacat tagt 24
<210> 29
<211> 3970
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 29
gggggagccg gaagcgggac agaggaggcc gtgtgaagcc gacgagcgcc agtcctcggc 60
cgggaaagcc atcgcgggcc ctcgctgtcg cgcggagcca gctgcgagcg ctccgcgacc 120
gggccgaggg ctatggcgat tcggcgctgc tggccacggg tcgtccccgg gcccgcgctg 180
ggatggctgc ttctgctgct gaacgttctg gccccgggcc gcgcctcccc gcgcctcctc 240
gacttcccgg ctccggtctg cgcgcaggag gggctgagct gcagagtcaa gaatagtact 300
tgtctggatg acagctggat ccaccccaaa aacctgaccc cgtcttcccc aaaaaacatc 360
tatatcaatc ttagtgtttc ctctacccag cacggagaat tagtccctgt gttgcatgtt 420
gagtggaccc tgcagacaga tgccagcatc ctgtacctcg agggtgcaga gctgtccgtc 480
ctgcagctga acaccaatga gcggctgtgt gtcaagttcc agtttctgtc catgctgcag 540
catcaccgta agcggtggcg gttttccttc agccactttg tggtagatcc tggccaggag 600
tatgaagtga ctgttcacca cctgccgaag cccatccctg atggggaccc aaaccacaaa 660
tccaagatca tctttgtgcc tgactgtgag gacagcaaga tgaagatgac tacctcatgc 720
gtgagctcag gcagcctttg ggatcccaac atcactgtgg agaccttgga cacacagcat 780
ctgcgagtgg acttcaccct gtggaatgaa tccaccccct accaggtcct gctggaaagt 840
ttctccgact cagagaacca cagctgcttt gatgtcgtta aacaaatatt tgcgcccagg 900
caagaagaat tccatcagcg agctaatgtc acattcactc taagcaagtt tcactggtgc 960
tgccatcacc acgtgcaggt ccagcccttc ttcagcagct gcctaaatga ctgtttgaga 1020
cacgctgtga ctgtgccctg cccagtaatc tcaaatacca cagttcccaa gccagttgca 1080
gactacattc ccctgtgggt gtatggcctc atcacactca tcgccattct gctggtggga 1140
tctgtcatcg tgctgatcat ctgtatgacc tggaggcttt ctggcgccga tcaagagaaa 1200
catggtgatg actccaaaat caatggcatc ttgcccgtag cagacctgac tcccccaccc 1260
ctgaggccca ggaaggtctg gatcgtctac tcggccgacc accccctcta tgtggaggtg 1320
gtcctaaagt tcgcccagtt cctgatcact gcctgtggca ctgaagtagc ccttgacctc 1380
ctggaagagc aggttatctc tgaggtgggg gtcatgacct gggtgagccg acagaagcag 1440
gagatggtgg agagcaactc caaaatcatc atcctgtgtt cccgaggcac ccaagcaaag 1500
tggaaagcta tcttgggttg ggctgagcct gctgtccagc tacggtgtga ccactggaag 1560
cctgctgggg accttttcac tgcagccatg aacatgatcc tgccagactt caagaggcca 1620
gcctgcttcg gcacctacgt tgtttgctac ttcagtggca tctgtagtga gagggatgtc 1680
cccgacctct tcaacatcac ctccaggtac ccactcatgg acagatttga ggaggtttac 1740
ttccggatcc aggacctgga gatgtttgaa cccggccgga tgcaccatgt cagagagctc 1800
acaggggaca attacctgca gagccctagt ggccggcagc tcaaggaggc tgtgcttagg 1860
ttccaggagt ggcaaaccca gtgccccgac tggttcgagc gtgagaacct ctgcttagct 1920
gatggccaag atcttccctc cctggatgaa gaagtgtttg aagacccact gctgccacca 1980
gggggaggaa ttgtcaaaca gcagcccctg gtgcgggaac tcccatctga cggctgcctt 2040
gtggtagatg tctgtgtcag tgaggaagaa agtagaatgg caaagctgga ccctcagcta 2100
tggccacaga gagagctagt ggctcacacc ctccaaagca tggtgctgcc agcagagcag 2160
gtccctgcag ctcatgtggt ggagcctctc catctcccag acggcagtgg agcagctgcc 2220
cagctgccca tgacagagga cagcgaggct tgcccgctgc tgggggtcca gaggaacagc 2280
atcctttgcc tccccgtgga ctcagatgac ttgccactct gtagcacccc aatgatgtca 2340
cctgaccacc tccaaggcga tgcaagagag cagctagaaa gcctaatgct ctcggtgctg 2400
cagcagagcc tgagtggaca gcccctggag agctggccga ggccagaggt ggtcctcgag 2460
ggctgcacac cctctgagga ggagcagcgg cagtcggtgc agtcggacca gggctacatc 2520
tccaggagct ccccgcagcc ccccgagtgg ctcacggagg aggaagagct agaactgggt 2580
gagcccgttg agtctctctc tcctgaggaa ctacggagcc tgaggaagct ccagaggcag 2640
cttttcttct gggagctcga gaagaaccct ggctggaaca gcttggagcc acggagaccc 2700
accccagaag agcagaatcc ctcctaggcc tcctgagcct gctacttaag agggtgtata 2760
ttgtactctg tgtgtgcgtg cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg cgtgtgtgtg 2820
tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtagtgc ccggcttaga aatgtgaaca tctgaatctg 2880
acatagtgtt gtatacctga agtcccagca cttgggaact gagacttgat gatctcctga 2940
agccaggtgt tcagggccag tgtgaaaaca tagcaagacc tcagagaaat caatgcagac 3000
atcttggtac tgatccctaa acacacccct ttccctgata acccgacatg agcatctggt 3060
catcattgca caagaatcca cagcccgttc ccagagctca tagccaagtg tgttgctcat 3120
tccttgaata tttattctgt acctactatt catcagacat ttggaattca aaaacaagtt 3180
acatgacaca gccttagcca ctaagaagct taaaattcgg taaggatgta aaattagcca 3240
ggatgaatag agggctgctg ccctggctgc agaagaaccc gagagagcct gcgggtggcg 3300
tctgggcaag aggggagtgg cctgtggatt gagtattagg aaggagccag agctcagggt 3360
ggagagagct ctgtggggct agggtgggag cagctgggga ctcctctcat gagtggatct 3420
gttgccctac gggggaggaa acttcatgcc aaatataccc agaagtcttc tcagatcagt 3480
tctttagaaa gagctggtat agaaatgggt gatgtaaaac ttgagaagca ggaagaggcg 3540
tgtgaaatcc tgtgctctct caagtgctgg ctgccagtcc gtgggagggc tgcggcatgt 3600
gattcttcat gggctgcagc caccagatcc ctggagagct ctacctcggg gtacagtgag 3660
ggagttgaga aagatgtgag ggtagtgggc atgggggcgt ggcataacag gagaactcgg 3720
gaggccctca aggtcagagg aaagtatgtc actgtataac tacagtaaga gaggttgttt 3780
aaagtagctc cagggcgccc tcatggggca gacagcagcc ttgtggcgta ggttctagag 3840
aatgcacagg tcttcctaga cttaggtgag aaaaggacca tgaaatgctg tgggaagcac 3900
gaattcagtg attgtgtgtg tgcatatgtg tgtgcagtaa tgaagactta ataaagttgc 3960
tgtattggta 3970
<210> 30
<211> 864
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 30
Met Ala Ile Arg Arg Cys Trp Pro Arg Val Val Pro Gly Pro Ala Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Leu Leu Leu Leu Asn Val Leu Ala Pro Gly Arg Ala Ser
20 25 30
Pro Arg Leu Leu Asp Phe Pro Ala Pro Val Cys Ala Gln Glu Gly Leu
35 40 45
Ser Cys Arg Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
50 55 60
Pro Lys Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asn Ile Tyr Ile Asn Leu
65 70 75 80
Ser Val Ser Ser Thr Gln His Gly Glu Leu Val Pro Val Leu His Val
85 90 95
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Lys
115 120 125
Phe Gln Phe Leu Ser Met Leu Gln His His Arg Lys Arg Trp Arg Phe
130 135 140
Ser Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Val Thr
145 150 155 160
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Lys
165 170 175
Ser Lys Ile Ile Phe Val Pro Asp Cys Glu Asp Ser Lys Met Lys Met
180 185 190
Thr Thr Ser Cys Val Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
195 200 205
Val Glu Thr Leu Asp Thr Gln His Leu Arg Val Asp Phe Thr Leu Trp
210 215 220
Asn Glu Ser Thr Pro Tyr Gln Val Leu Leu Glu Ser Phe Ser Asp Ser
225 230 235 240
Glu Asn His Ser Cys Phe Asp Val Val Lys Gln Ile Phe Ala Pro Arg
245 250 255
Gln Glu Glu Phe His Gln Arg Ala Asn Val Thr Phe Thr Leu Ser Lys
260 265 270
Phe His Trp Cys Cys His His His Val Gln Val Gln Pro Phe Phe Ser
275 280 285
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ala Val Thr Val Pro Cys Pro
290 295 300
Val Ile Ser Asn Thr Thr Val Pro Lys Pro Val Ala Asp Tyr Ile Pro
305 310 315 320
Leu Trp Val Tyr Gly Leu Ile Thr Leu Ile Ala Ile Leu Leu Val Gly
325 330 335
Ser Val Ile Val Leu Ile Ile Cys Met Thr Trp Arg Leu Ser Gly Ala
340 345 350
Asp Gln Glu Lys His Gly Asp Asp Ser Lys Ile Asn Gly Ile Leu Pro
355 360 365
Val Ala Asp Leu Thr Pro Pro Pro Leu Arg Pro Arg Lys Val Trp Ile
370 375 380
Val Tyr Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Glu Val Val Leu Lys Phe
385 390 395 400
Ala Gln Phe Leu Ile Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Asp Leu
405 410 415
Leu Glu Glu Gln Val Ile Ser Glu Val Gly Val Met Thr Trp Val Ser
420 425 430
Arg Gln Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile Ile Leu
435 440 445
Cys Ser Arg Gly Thr Gln Ala Lys Trp Lys Ala Ile Leu Gly Trp Ala
450 455 460
Glu Pro Ala Val Gln Leu Arg Cys Asp His Trp Lys Pro Ala Gly Asp
465 470 475 480
Leu Phe Thr Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg Pro
485 490 495
Ala Cys Phe Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Gly Ile Cys Ser
500 505 510
Glu Arg Asp Val Pro Asp Leu Phe Asn Ile Thr Ser Arg Tyr Pro Leu
515 520 525
Met Asp Arg Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met
530 535 540
Phe Glu Pro Gly Arg Met His His Val Arg Glu Leu Thr Gly Asp Asn
545 550 555 560
Tyr Leu Gln Ser Pro Ser Gly Arg Gln Leu Lys Glu Ala Val Leu Arg
565 570 575
Phe Gln Glu Trp Gln Thr Gln Cys Pro Asp Trp Phe Glu Arg Glu Asn
580 585 590
Leu Cys Leu Ala Asp Gly Gln Asp Leu Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val
595 600 605
Phe Glu Asp Pro Leu Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ile Val Lys Gln Gln
610 615 620
Pro Leu Val Arg Glu Leu Pro Ser Asp Gly Cys Leu Val Val Asp Val
625 630 635 640
Cys Val Ser Glu Glu Glu Ser Arg Met Ala Lys Leu Asp Pro Gln Leu
645 650 655
Trp Pro Gln Arg Glu Leu Val Ala His Thr Leu Gln Ser Met Val Leu
660 665 670
Pro Ala Glu Gln Val Pro Ala Ala His Val Val Glu Pro Leu His Leu
675 680 685
Pro Asp Gly Ser Gly Ala Ala Ala Gln Leu Pro Met Thr Glu Asp Ser
690 695 700
Glu Ala Cys Pro Leu Leu Gly Val Gln Arg Asn Ser Ile Leu Cys Leu
705 710 715 720
Pro Val Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Cys Ser Thr Pro Met Met Ser
725 730 735
Pro Asp His Leu Gln Gly Asp Ala Arg Glu Gln Leu Glu Ser Leu Met
740 745 750
Leu Ser Val Leu Gln Gln Ser Leu Ser Gly Gln Pro Leu Glu Ser Trp
755 760 765
Pro Arg Pro Glu Val Val Leu Glu Gly Cys Thr Pro Ser Glu Glu Glu
770 775 780
Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg Ser Ser
785 790 795 800
Pro Gln Pro Pro Glu Trp Leu Thr Glu Glu Glu Glu Leu Glu Leu Gly
805 810 815
Glu Pro Val Glu Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Lys
820 825 830
Leu Gln Arg Gln Leu Phe Phe Trp Glu Leu Glu Lys Asn Pro Gly Trp
835 840 845
Asn Ser Leu Glu Pro Arg Arg Pro Thr Pro Glu Glu Gln Asn Pro Ser
850 855 860
<210> 31
<211> 8608
<212> DNA
<213> 人类
<400> 31
ctgggcccgg gctggaagcc ggaagcgagc aaagtggagc cgactcgaac tccaccgcgg 60
aaaagaaagc ctcagaacgt tcgttcgctg cgtccccagc cggggccgag ccctccgcga 120
cgccagccgg gccatggggg ccgcacgcag cccgccgtcc gctgtcccgg ggcccctgct 180
ggggctgctc ctgctgctcc tgggcgtgct ggccccgggt ggcgcctccc tgcgactcct 240
ggaccaccgg gcgctggtct gctcccagcc ggggctaaac tgcacggtca agaatagtac 300
ctgcctggat gacagctgga ttcaccctcg aaacctgacc ccctcctccc caaaggacct 360
gcagatccag ctgcactttg cccacaccca acaaggagac ctgttccccg tggctcacat 420
cgaatggaca ctgcagacag acgccagcat cctgtacctc gagggtgcag agttatctgt 480
cctgcagctg aacaccaatg aacgtttgtg cgtcaggttt gagtttctgt ccaaactgag 540
gcatcaccac aggcggtggc gttttacctt cagccacttt gtggttgacc ctgaccagga 600
atatgaggtg accgttcacc acctgcccaa gcccatccct gatggggacc caaaccacca 660
gtccaagaat ttccttgtgc ctgactgtga gcacgccagg atgaaggtaa ccacgccatg 720
catgagctca ggcagcctgt gggaccccaa catcaccgtg gagaccctgg aggcccacca 780
gctgcgtgtg agcttcaccc tgtggaacga atctacccat taccagatcc tgctgaccag 840
ttttccgcac atggagaacc acagttgctt tgagcacatg caccacatac ctgcgcccag 900
accagaagag ttccaccagc gatccaacgt cacactcact ctacgcaacc ttaaagggtg 960
ctgtcgccac caagtgcaga tccagccctt cttcagcagc tgcctcaatg actgcctcag 1020
acactccgcg actgtttcct gcccagaaat gccagacact ccagaaccaa ttccggacta 1080
catgcccctg tgggtgtact ggttcatcac gggcatctcc atcctgctgg tgggctccgt 1140
catcctgctc atcgtctgca tgacctggag gctagctggg cctggaagtg aaaaatacag 1200
tgatgacacc aaatacaccg atggcctgcc tgcggctgac ctgatccccc caccgctgaa 1260
gcccaggaag gtctggatca tctactcagc cgaccacccc ctctacgtgg acgtggtcct 1320
gaaattcgcc cagttcctgc tcaccgcctg cggcacggaa gtggccctgg acctgctgga 1380
agagcaggcc atctcggagg caggagtcat gacctgggtg ggccgtcaga agcaggagat 1440
ggtggagagc aactctaaga tcatcgtcct gtgctcccgc ggcacgcgcg ccaagtggca 1500
ggcgctcctg ggccgggggg cgcctgtgcg gctgcgctgc gaccacggaa agcccgtggg 1560
ggacctgttc actgcagcca tgaacatgat cctcccggac ttcaagaggc cagcctgctt 1620
cggcacctac gtagtctgct acttcagcga ggtcagctgt gacggcgacg tccccgacct 1680
gttcggcgcg gcgccgcggt acccgctcat ggacaggttc gaggaggtgt acttccgcat 1740
ccaggacctg gagatgttcc agccgggccg catgcaccgc gtaggggagc tgtcggggga 1800
caactacctg cggagcccgg gcggcaggca gctccgcgcc gccctggaca ggttccggga 1860
ctggcaggtc cgctgtcccg actggttcga atgtgagaac ctctactcag cagatgacca 1920
ggatgccccg tccctggacg aagaggtgtt tgaggagcca ctgctgcctc cgggaaccgg 1980
catcgtgaag cgggcgcccc tggtgcgcga gcctggctcc caggcctgcc tggccataga 2040
cccgctggtc ggggaggaag gaggagcagc agtggcaaag ctggaacctc acctgcagcc 2100
ccggggtcag ccagcgccgc agcccctcca caccctggtg ctcgccgcag aggagggggc 2160
cctggtggcc gcggtggagc ctgggcccct ggctgacggt gccgcagtcc ggctggcact 2220
ggcgggggag ggcgaggcct gcccgctgct gggcagcccg ggcgctgggc gaaatagcgt 2280
cctcttcctc cccgtggacc ccgaggactc gccccttggc agcagcaccc ccatggcgtc 2340
tcctgacctc cttccagagg acgtgaggga gcacctcgaa ggcttgatgc tctcgctctt 2400
cgagcagagt ctgagctgcc aggcccaggg gggctgcagt agacccgcca tggtcctcac 2460
agacccacac acgccctacg aggaggagca gcggcagtca gtgcagtctg accagggcta 2520
catctccagg agctccccgc agccccccga gggactcacg gaaatggagg aagaggagga 2580
agaggagcag gacccaggga agccggccct gccactctct cccgaggacc tggagagcct 2640
gaggagcctc cagcggcagc tgcttttccg ccagctgcag aagaactcgg gctgggacac 2700
gatggggtca gagtcagagg ggcccagtgc atgagggcgg ctccccaggg accgcccaga 2760
tcccagcttt gagagaggag tgtgtgtgca cgtattcatc tgtgtgtaca tgtctgcatg 2820
tgtatatgtt cgtgtgtgaa atgtaggctt taaaatgtaa atgtctggat tttaatccca 2880
ggcatccctc ctaacttttc tttgtgcagc ggtctggtta tcgtctatcc ccaggggaat 2940
ccacacagcc cgctcccagg agctaatggt agagcgtcct tgaggctcca ttattcgttc 3000
attcagcatt tattgtgcac ctactatgtg gcgggcattt gggataccaa gataaattgc 3060
atgcggcatg gccccagcca tgaaggaact taaccgctag tgccgaggac acgttaaacg 3120
aacaggatgg gccgggcacg gtggctcacg cctgtaatcc cagcacactg ggaggccgag 3180
gcaggtggat cactctgagg tcaggagttt gagccagcct ggccaacatg gtgaaacccc 3240
atctccacta aaaatagaaa aattagccgg gcatggtgac acatgcctgt agtcctagct 3300
acttgggagg ctgaggcagg agaattgctt gaatctggga ggcagaggtt gcagtgagcc 3360
gagattgtgc cattgcactg cagcctggat gacagagcga gactctatct caaaaaaaaa 3420
aaaaaaaaaa gatggtcacg cgggatgtaa acgctgaatg ggccaggtgc agtggctcat 3480
gcttgtaatc ccagcacttt gggaaggcga ggcaggtgga ttgcttgagc tcaggagttc 3540
aagaccagcc tgggcgacat agtgagacct catctctacc taaatttttt tttagtcagt 3600
catggtggca catgcctgta gtcccagcta ctcgggaggc tgatgccaga tgatcacttg 3660
agcccaggag gtagaggctg cagtgagcta taatggtacc attgcaatcc agcctgggca 3720
gcagagtgag accctgtctc aaaaaaaata aaaaagtaga aagatggagt ggaagcctgc 3780
ccagggttgt gagcatgcac gggaaaggca cccaggtcag gggggatccc cgaggagatg 3840
cctgagctga aggattgtgg ttggggaaag cgtagtccca gcaaggaagc agtttgtggg 3900
taagtgctgg gaggtgagtg gagtgagctt gtcagggagc tgctggtgga gcctggaggg 3960
gaaggaggga ggcagtgaga gagatcgggg tggggggtgg ggggatgtcg ccagagctca 4020
ggggtgggga cagccttgtg cgcatcagtc ctgaggcctg gggcaccttt cgtctgatga 4080
gcctctgcat ggagagaggc tgagggctaa acacagctgg atgtcacctg agttcattta 4140
taggaagaga gaaatgtcga ggtgaaacgt aaaagcatct ggcaggaagg tgagtctgaa 4200
gccctgcacc cgcgttccga ctatcagtgg ggagctgtta gcacgtagga ttcttcagag 4260
cagctgggct ggagctcccc tgagctcagg aagccccagg gtgcaagggc aaggaaatga 4320
ggggtggtgg gtcagtgaag atctgggcag accttgtgtg gggaaggggt gctgctgtga 4380
cttcagggtc tgaggtccaa agacagcatt tgaaaagagg ctctgaagcc agtgtttgaa 4440
gaatttgttc ctgaagtacc tcctgggggt aggctagagg cttctggctt cagggtcctg 4500
aagaacacat tgaggtgccg tctgacactg gaatagggtg cccttcattc ctatgcctga 4560
gtccttaact atatttccaa cctccagtga ggaggagaag attcggaaat gtgacaggag 4620
agcaaacagg acagtttgca tgtgtgtgtg cgcacacata catgtgcgtg aaagattatc 4680
aataaaagtg cataaatttg ttgatctggt aagagtttct agcaggaagg tcgagccact 4740
tactgtaggt caagaagttg ctagttgcgg agttttttct tgcagttaga ctttacctag 4800
tggtagcagg gccaccaaag ctctgtgtcc cagatggtgt atggcccata atccacccaa 4860
cagcagcaaa ggaccaggca aaggagaaca ggagcagaag cctcccagcc actagccttt 4920
tgggctcagt ctctccaata atcctggaga ggggcttcgt tgggtctgga cacctaccat 4980
gcattctgtg acctttccct agcttccaat aaataactgt ttgacgccca gagtacagga 5040
taccacaatg cactcttcct gcgtagagca catgttccca tctgctccca ttcctcagga 5100
accttgaatt ctagctctgc tggcctttga gcccatgcca gtaaatgtcc tgatgggcat 5160
tgcctactat ctccagggca gctgcctttg tcctcctaac agctttattg gagtacagtt 5220
cacttaccat acaatccaca attgaccctg cacaatttga tgccggttta gtatagtcac 5280
agttcagcag ccatcagcac agtcagtctt agagtttact acccccaaaa gaaatccagc 5340
cccccttagt caccacccca acctccccat ccctaggcac ccctaggcta ctttgatctc 5400
tgtagacttg cctcttctgg acatgacata gagaaaggag tcataaattc tccaaggtgt 5460
ctgtttcttc tttaatgtca ttccctgttt ctcctcacat tccctcccca tttcctgggc 5520
ccagtctcac actggtcctt gcttacccta aatgctatta attccatcac tctgagtatg 5580
gtgtttgctg tccgctgaat gccaagagct tcaagagtgt gtgtaaataa agccacacct 5640
ttatttttgt attattctga accatggcta ataaattgtt tcaccaagaa atgtctctct 5700
aagaacaggt gccctccacg ctgtgcccct cccacctctt cagctcgtct cctgagtgtg 5760
cagaggtggt tccggttggg aaagaagcag cggagcatct aaccatgcct gtgtccaggc 5820
cgattatgca cgcagccacc aacaagctcc caactcccgc gtagagtttc atgacttttt 5880
cctgcctact atcttgatcc tagttttttt tttgtttttt ttttttttaa ggaataatta 5940
ctttgattca aaaccagttt ctcttttctg cataggaagg tccttgaagg tgtttagggt 6000
ctaaaaaggg tggtgttcgg tctctgaaac atccattcag cagtttgagc tgggatctct 6060
gaatgcaagg gtatgatgga tatacttctt tcttgctttt gttgtgtttt ggttttttgt 6120
ttgtttttaa gtcagggtct ctctgtcacc aggctgtatt acagtggtgc aatcatggct 6180
cactgcagcc tcgacctccc aggctcaagc catctttcca cctcagcctg ccagtggcta 6240
gaactacagg cgtgcaccac tgtgcccggc taatttgtgt gtatatattt tgtagaaatg 6300
gggtttcacc atgttgtcca ggctggtcac gaactcctgg gctcaagcca tctgcccgcc 6360
tcatcctccc aaagtgctgg gattataggc ctgagcccac cgtgcctggc ctttcctgtt 6420
tatctttgaa aattaaatag ggcataagag agaagaagat gtacttacaa tgcagtgggt 6480
ggttttaact ctatagcctt tgggctctgt ggttggtgct ccccttccta aataaatgag 6540
gtgtatgcag ggccctcttc tgccttagcg ccctgccagc tgggactcca gcaaggcccg 6600
gggcacctga ggacagagtg agatggaggg ccgctgctcc agcagccggg cctgcatccc 6660
acaagtcaac tgtgtcggac agaggatcct tacaaagaag aggcagcagg gttgggggct 6720
ggccagctgc tcgtccgccc taggtagctt gctcatctgt aaagtgggtg gggcaggagt 6780
tcccacctca tggggtcctg gcaagcctgc agtatccccg agtggcacca gcctgcttct 6840
ggggcagagc agtttgtgcc ccctgaggta ccactgatcc tctttccctg ctattaggta 6900
ttgctctctt cctccggtgt ttgccttttc agattataga agtaatatgt gttcccatat 6960
ttggcgtctc tcaggagctc aggaagtact tggctgagtg aacatgtcca ttgtggaaaa 7020
atggcaacaa tatggattcc atgggtatat tttatagaag aatatgaaga aaagcagcta 7080
cccctaaacc cattgcacaa gctgttcatg ttaattctgt acccgacgct ttccccacgg 7140
ggcctcccct cactctgaaa tggcatccag gtccatcttg ccctccacct ctgcatggct 7200
ctccatgccc catcgcctct cccagatcct agcactgggt ccacactctc gccctgtcca 7260
tttaggttga tgaaagcagg cagtcacccg ggtgggccag tcttgcctgt gggaggaaca 7320
tgcagtctcc tgtctcatgg tttgaagtgt gccaggaagc ctggcccagc ccacctcccc 7380
ctggagtcct tcccaggagg aataacccct taggtcattg actataagat gagttcgctc 7440
actggatcct tcctctctga tgagacagga agaaggtaca cagtgaccag gtaggaggag 7500
gagagggagt agaaaggagg gatgcgggtg gctggtccct gcatttgcct gcttccctgc 7560
acgggtgtcc cactggccgc ctctgctcac cagtgtcatg ggattctctc agaagatgaa 7620
aacagcccct gcttttttgc tagaatggct gagctttcat ggaaaggaag ctggacccaa 7680
gcaacagccg actaccgaag gttgcctgga gcagtgcaga tgtgggagga agaagggcct 7740
tggtgcacac tggcttttct tcctgactgc aatgtggcat tgtgccagct acctcctctt 7800
tctcggcctc aggaaaatgg agagaaagca gccctgaagg tggctgtgac gagggaaggg 7860
gcagagggcc tgacagtcaa ccacgcgcta tattttcctg ttcttcctta gggcaagaac 7920
tgcatggcca gactcaggca aggcctaggt gtgggctggg cattgcctac acgtgaagag 7980
atcactccgc gtccctactg cacctgtcac aaagtgcctt ctgatatgcc tggcaaacca 8040
aaatcggtga gcgccagctt gcttccctag aagacatttc taaatattca taacatgctt 8100
gctcaaatca atcaccttat tttacatccg ctccagggag aaatgaagac atggtcctac 8160
gttgttctgt aattattttc tatgtaaatt ttgttccttg ttacaattat atatgtctta 8220
ggggaaagga ccatttcaca tgtgtcacct catgtgattc tcaccacagc cctgtgattg 8280
ctcctgtttt ataaataatg acatagttcc agttgatggc caaagccaca gctaacgaga 8340
ggcagagaga gctcaggctc ccaggagctt ccactctcag accttgcctc ccgggctgcc 8400
ctgagtgaaa cgcctgctta gcatttggca cagccagaag cagcaagcta gggtcacaac 8460
acagagaggg gctgtgtaat actggctgcc tctgtgctaa gaaaaaaaaa aaatcactgt 8520
gtgtttgttt attttggtgc aggcccagtg ttcttgctta gacttaatac tacccttcat 8580
gttaaaataa aaccaaacaa aaacccat 8608
<210> 32
<211> 866
<212> PRT
<213> 人类
<400> 32
Met Gly Ala Ala Arg Ser Pro Pro Ser Ala Val Pro Gly Pro Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Leu Ala Pro Gly Gly Ala Ser
20 25 30
Leu Arg Leu Leu Asp His Arg Ala Leu Val Cys Ser Gln Pro Gly Leu
35 40 45
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
50 55 60
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
65 70 75 80
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
85 90 95
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
115 120 125
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe
130 135 140
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr
145 150 155 160
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
165 170 175
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val
180 185 190
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
195 200 205
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
210 215 220
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
225 230 235 240
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
260 265 270
Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
275 280 285
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro
290 295 300
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
305 310 315 320
Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu Val Gly Ser Val
325 330 335
Ile Leu Leu Ile Val Cys Met Thr Trp Arg Leu Ala Gly Pro Gly Ser
340 345 350
Glu Lys Tyr Ser Asp Asp Thr Lys Tyr Thr Asp Gly Leu Pro Ala Ala
355 360 365
Asp Leu Ile Pro Pro Pro Leu Lys Pro Arg Lys Val Trp Ile Ile Tyr
370 375 380
Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Asp Val Val Leu Lys Phe Ala Gln
385 390 395 400
Phe Leu Leu Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu
405 410 415
Glu Gln Ala Ile Ser Glu Ala Gly Val Met Thr Trp Val Gly Arg Gln
420 425 430
Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile Val Leu Cys Ser
435 440 445
Arg Gly Thr Arg Ala Lys Trp Gln Ala Leu Leu Gly Arg Gly Ala Pro
450 455 460
Val Arg Leu Arg Cys Asp His Gly Lys Pro Val Gly Asp Leu Phe Thr
465 470 475 480
Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg Pro Ala Cys Phe
485 490 495
Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Glu Val Ser Cys Asp Gly Asp
500 505 510
Val Pro Asp Leu Phe Gly Ala Ala Pro Arg Tyr Pro Leu Met Asp Arg
515 520 525
Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met Phe Gln Pro
530 535 540
Gly Arg Met His Arg Val Gly Glu Leu Ser Gly Asp Asn Tyr Leu Arg
545 550 555 560
Ser Pro Gly Gly Arg Gln Leu Arg Ala Ala Leu Asp Arg Phe Arg Asp
565 570 575
Trp Gln Val Arg Cys Pro Asp Trp Phe Glu Cys Glu Asn Leu Tyr Ser
580 585 590
Ala Asp Asp Gln Asp Ala Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu Glu
595 600 605
Pro Leu Leu Pro Pro Gly Thr Gly Ile Val Lys Arg Ala Pro Leu Val
610 615 620
Arg Glu Pro Gly Ser Gln Ala Cys Leu Ala Ile Asp Pro Leu Val Gly
625 630 635 640
Glu Glu Gly Gly Ala Ala Val Ala Lys Leu Glu Pro His Leu Gln Pro
645 650 655
Arg Gly Gln Pro Ala Pro Gln Pro Leu His Thr Leu Val Leu Ala Ala
660 665 670
Glu Glu Gly Ala Leu Val Ala Ala Val Glu Pro Gly Pro Leu Ala Asp
675 680 685
Gly Ala Ala Val Arg Leu Ala Leu Ala Gly Glu Gly Glu Ala Cys Pro
690 695 700
Leu Leu Gly Ser Pro Gly Ala Gly Arg Asn Ser Val Leu Phe Leu Pro
705 710 715 720
Val Asp Pro Glu Asp Ser Pro Leu Gly Ser Ser Thr Pro Met Ala Ser
725 730 735
Pro Asp Leu Leu Pro Glu Asp Val Arg Glu His Leu Glu Gly Leu Met
740 745 750
Leu Ser Leu Phe Glu Gln Ser Leu Ser Cys Gln Ala Gln Gly Gly Cys
755 760 765
Ser Arg Pro Ala Met Val Leu Thr Asp Pro His Thr Pro Tyr Glu Glu
770 775 780
Glu Gln Arg Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg Ser
785 790 795 800
Ser Pro Gln Pro Pro Glu Gly Leu Thr Glu Met Glu Glu Glu Glu Glu
805 810 815
Glu Glu Gln Asp Pro Gly Lys Pro Ala Leu Pro Leu Ser Pro Glu Asp
820 825 830
Leu Glu Ser Leu Arg Ser Leu Gln Arg Gln Leu Leu Phe Arg Gln Leu
835 840 845
Gln Lys Asn Ser Gly Trp Asp Thr Met Gly Ser Glu Ser Glu Gly Pro
850 855 860
Ser Ala
865
<210> 33
<211> 4547
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 33
gcagttcagt attagctgct gtcataatct cttcatcatt ctgaatattc tgtgatttct 60
ccaagatggc taacaatgcc attcaatggt attcgtcttg tttgattgct tggttggtag 120
gttggttggt ttggttttgt tttttaagag ggtttctctc ttgtagacca ggctggcctt 180
gaacagaggg ccactagaga gacactgagg tttttgtttt aaagagcata ttttgtactc 240
accttcaacc ccaggactca gtccctgagt ttgaggccag cgtggtctac agagcgagtg 300
tacagcaggg ctgtataaag aatgagtatc cttcatagag tatgagtgtc cttctgtttg 360
ggggaaggag tggttggttg gtgttggtgc ctggggccgt acagggcgag catgcgtgca 420
tttatgctgt tgggattgaa cctaggtcgt acatgtcctt aaacatttcc tagtgactta 480
ccccttagtc ccaggaatag ggcttctgaa aggattaagg agacagctgg ggagcaaatc 540
acgggcagaa caagatctat attagtagtg tccaacgatg ataccaaatg cattttatat 600
taagaagatt tacaggggct gttggtggtt cactgggtaa aggtgctggc caccatacct 660
cacaacctga gttcaatccc tgggaccaac aaagtgaaag gaaagaacca actcctgaaa 720
gttatctccc ggcctctctg tatgtgtgcc tgtgtgcatc acacacacaa taaataaaaa 780
tgaaaaaaaa aagttgtagg gactgagaga cttagtgggt aagctcttgc taagcaagca 840
tgaaagcctg tgttcagatt tctaccgacc acaagccagg tgtagcagct gtgcctataa 900
ccccagtgtc agaggacaga aacaagtgga tcctgagggc tcactggcca tcttagaaca 960
ctgagttcca aattcactga gaggccttgt ctcaaaagaa taaggtagag aaagaccctg 1020
tctcagaaca agacaaggta gagaaactac aggggaggcg ccttgacctc aacctccggc 1080
tcccacacac ctgcacacaa gtacatgtgc atacctcaac atcagtgcaa attctatatt 1140
gaaattaaat tataaataaa aataaataga ggtggaatag atggctcagt ggttaaggat 1200
actgtctggt cttccagagg accagcgttc aattcccagc caccatatcg tggctcacaa 1260
ctacttataa ttccaacttc aagggatcct gcttccattt ctaacttctt ctggcatgca 1320
aatggtacac agatacacat gcaggcaaaa caccaggcac atagaatata tattttttaa 1380
ttttaaagaa gcatatgtct cttccccaaa taatattctc atttgctcac ctcttttttt 1440
tttttttttt ttttggtttt tcgagacagg gtttctctgt gtagccctgg ctgtcctggt 1500
actcactttg tagaccaggc tggcctcaaa ctcagaaatc cgcctgcctc tgcctcccta 1560
gtgctgggat taaaggcgtg cgccaccaag ctcggcgctt atctcatttt taaatctttt 1620
gtttagatta atatcataaa ctttcatctt taaattcatt tttaaatttt atttatttac 1680
atcctaaatg ttgcccctca aagatttttt taaatattta tttacttaat gtatatgggt 1740
gcactgtcgc tgtcttcaga cacaccagga gagggcattg aatcccatta cagatggttt 1800
tcagccacca tgtggttgct gcccctcaaa gatttattaa ttaattttac atatatgagt 1860
gctctacctg cttgtacgcc tgcaaaccag aagagggcat cacatcccaa tatagatggt 1920
tgtgagccaa catgtggtag ctgggagttg aactcaggac ctctggtaga gcagacagtg 1980
ctcttaactg ctgagccatc tctccagctc tttaaattcg tttttattaa gtaatgtagg 2040
gattcctttt ttaaaattgt actgggatat ttaaaacagc tccctaagtc acactcaagc 2100
ctgctcccca aaggcaggca cttataatgg acttgtttgt ttcttttgac acctatgttt 2160
tcgcagtgtg cctttttact caccccgggt aatagaggaa acatcacttg ctccagatct 2220
ctgctttccc attacatttg tatcatggtt tgattttcag cttcctgttg ttacagcaag 2280
gcagctgttg tctctagtga ggcaagagat gcactttgat aaacattttt ctggtagtta 2340
ctcccctctc cccttcacag atgatcacac atccaactat taacaagcaa gactgaaact 2400
gtagggcttg aagtatcaag ctatttctgt cagttgtagc aagctagtca gccaagtgtt 2460
tccaaacccc tcccacttcc tcctcttgtc aggataggta gcatcttgcc ctggatttta 2520
agtagcttct gatgggtaag aaagagggag tcccccaaat gcagtatagc tgctgttgtt 2580
tctgtaagag tcccagtccc aggagcagtt tctgtcctgt gtcccagttc acaggagtgc 2640
tggatgggaa gagaggagca ggcttgtagg acttaatctc agaacatggt atgctgtgtg 2700
tctgtgggaa cgagcagaga catcgagata ggtcttgttt tacacctgca aggaccattt 2760
ggcaggctgt gatgttagcc cagggcagtg aaggacagtt agtcacaaag aactgggaga 2820
cgtacgtgaa gtctggaccc caagagcatg tgaactggtg ccccaaacag gtaggaagga 2880
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<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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gcagaatc 3608
<210> 35
<211> 8865
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 35
aactgcacgg tcaagaatag taagtcatct ttttctgttc ttcttcttgt tgccttctta 60
atcaagtgag agcctgctgc caacttctga cagaagtctt gccatgccac tccaggttca 120
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gccagcccgg ggtggggggt gagaccatgg tttgtcgtgg tggggccaga gaggacagag 8700
cctggggctg gggagcaggg ctgggggcct cagggtgggc agggcaggcc ccgccgcatc 8760
actcacgctg ttctgctcac cgcagactac atgcccctgt gggtgtactg gttcatcacg 8820
ggcatctcca tcctgctggt gggctccgtc atcctgctca tcgtc 8865
<210> 36
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 36
cttcctttct tcccacaggg gctgaactgc acggtcaaga atagtaagtc 50
<210> 37
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 37
tggtgggctc cgtcatcctg ctcatcgtct gtatgacctg gaggctttct ggtaaggact 60
<210> 38
<211> 3964
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化IL-17RA
<400> 38
gggggagccg gaagcgggac agaggaggcc gtgtgaagcc gacgagcgcc agtcctcggc 60
cgggaaagcc atcgcgggcc ctcgctgtcg cgcggagcca gctgcgagcg ctccgcgacc 120
gggccgaggg ctatggcgat tcggcgctgc tggccacggg tcgtccccgg gcccgcgctg 180
ggatggctgc ttctgctgct gaacgttctg gccccgggcc gcgcctcccc gcgcctcctc 240
gacttcccgg ctccggtctg cgcgcaggag gggctgaact gcacggtcaa gaatagtacc 300
tgcctggatg acagctggat tcaccctcga aacctgaccc cctcctcccc aaaggacctg 360
cagatccagc tgcactttgc ccacacccaa caaggagacc tgttccccgt ggctcacatc 420
gaatggacac tgcagacaga cgccagcatc ctgtacctcg agggtgcaga gttatctgtc 480
ctgcagctga acaccaatga acgtttgtgc gtcaggtttg agtttctgtc caaactgagg 540
catcaccaca ggcggtggcg ttttaccttc agccactttg tggttgaccc tgaccaggaa 600
tatgaggtga ccgttcacca cctgcccaag cccatccctg atggggaccc aaaccaccag 660
tccaagaatt tccttgtgcc tgactgtgag cacgccagga tgaaggtaac cacgccatgc 720
atgagctcag gcagcctgtg ggaccccaac atcaccgtgg agaccctgga ggcccaccag 780
ctgcgtgtga gcttcaccct gtggaacgaa tctacccatt accagatcct gctgaccagt 840
tttccgcaca tggagaacca cagttgcttt gagcacatgc accacatacc tgcgcccaga 900
ccagaagagt tccaccagcg atccaacgtc acactcactc tacgcaacct taaagggtgc 960
tgtcgccacc aagtgcagat ccagcccttc ttcagcagct gcctcaatga ctgcctcaga 1020
cactccgcga ctgtttcctg cccagaaatg ccagacactc cagaaccaat tccggactac 1080
atgcccctgt gggtgtactg gttcatcacg ggcatctcca tcctgctggt gggctccgtc 1140
atcctgctca tcgtctgtat gacctggagg ctttctggcg ccgatcaaga gaaacatggt 1200
gatgactcca aaatcaatgg catcttgccc gtagcagacc tgactccccc acccctgagg 1260
cccaggaagg tctggatcgt ctactcggcc gaccaccccc tctatgtgga ggtggtccta 1320
aagttcgccc agttcctgat cactgcctgt ggcactgaag tagcccttga cctcctggaa 1380
gagcaggtta tctctgaggt gggggtcatg acctgggtga gccgacagaa gcaggagatg 1440
gtggagagca actccaaaat catcatcctg tgttcccgag gcacccaagc aaagtggaaa 1500
gctatcttgg gttgggctga gcctgctgtc cagctacggt gtgaccactg gaagcctgct 1560
ggggaccttt tcactgcagc catgaacatg atcctgccag acttcaagag gccagcctgc 1620
ttcggcacct acgttgtttg ctacttcagt ggcatctgta gtgagaggga tgtccccgac 1680
ctcttcaaca tcacctccag gtacccactc atggacagat ttgaggaggt ttacttccgg 1740
atccaggacc tggagatgtt tgaacccggc cggatgcacc atgtcagaga gctcacaggg 1800
gacaattacc tgcagagccc tagtggccgg cagctcaagg aggctgtgct taggttccag 1860
gagtggcaaa cccagtgccc cgactggttc gagcgtgaga acctctgctt agctgatggc 1920
caagatcttc cctccctgga tgaagaagtg tttgaagacc cactgctgcc accaggggga 1980
ggaattgtca aacagcagcc cctggtgcgg gaactcccat ctgacggctg ccttgtggta 2040
gatgtctgtg tcagtgagga agaaagtaga atggcaaagc tggaccctca gctatggcca 2100
cagagagagc tagtggctca caccctccaa agcatggtgc tgccagcaga gcaggtccct 2160
gcagctcatg tggtggagcc tctccatctc ccagacggca gtggagcagc tgcccagctg 2220
cccatgacag aggacagcga ggcttgcccg ctgctggggg tccagaggaa cagcatcctt 2280
tgcctccccg tggactcaga tgacttgcca ctctgtagca ccccaatgat gtcacctgac 2340
cacctccaag gcgatgcaag agagcagcta gaaagcctaa tgctctcggt gctgcagcag 2400
agcctgagtg gacagcccct ggagagctgg ccgaggccag aggtggtcct cgagggctgc 2460
acaccctctg aggaggagca gcggcagtcg gtgcagtcgg accagggcta catctccagg 2520
agctccccgc agccccccga gtggctcacg gaggaggaag agctagaact gggtgagccc 2580
gttgagtctc tctctcctga ggaactacgg agcctgagga agctccagag gcagcttttc 2640
ttctgggagc tcgagaagaa ccctggctgg aacagcttgg agccacggag acccacccca 2700
gaagagcaga atccctccta ggcctcctga gcctgctact taagagggtg tatattgtac 2760
tctgtgtgtg cgtgcgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgcgtgtg tgtgtgtgtg 2820
tgtgtgtgtg tgtgtgtgta gtgcccggct tagaaatgtg aacatctgaa tctgacatag 2880
tgttgtatac ctgaagtccc agcacttggg aactgagact tgatgatctc ctgaagccag 2940
gtgttcaggg ccagtgtgaa aacatagcaa gacctcagag aaatcaatgc agacatcttg 3000
gtactgatcc ctaaacacac ccctttccct gataacccga catgagcatc tggtcatcat 3060
tgcacaagaa tccacagccc gttcccagag ctcatagcca agtgtgttgc tcattccttg 3120
aatatttatt ctgtacctac tattcatcag acatttggaa ttcaaaaaca agttacatga 3180
cacagcctta gccactaaga agcttaaaat tcggtaagga tgtaaaatta gccaggatga 3240
atagagggct gctgccctgg ctgcagaaga acccgagaga gcctgcgggt ggcgtctggg 3300
caagagggga gtggcctgtg gattgagtat taggaaggag ccagagctca gggtggagag 3360
agctctgtgg ggctagggtg ggagcagctg gggactcctc tcatgagtgg atctgttgcc 3420
ctacggggga ggaaacttca tgccaaatat acccagaagt cttctcagat cagttcttta 3480
gaaagagctg gtatagaaat gggtgatgta aaacttgaga agcaggaaga ggcgtgtgaa 3540
atcctgtgct ctctcaagtg ctggctgcca gtccgtggga gggctgcggc atgtgattct 3600
tcatgggctg cagccaccag atccctggag agctctacct cggggtacag tgagggagtt 3660
gagaaagatg tgagggtagt gggcatgggg gcgtggcata acaggagaac tcgggaggcc 3720
ctcaaggtca gaggaaagta tgtcactgta taactacagt aagagaggtt gtttaaagta 3780
gctccagggc gccctcatgg ggcagacagc agccttgtgg cgtaggttct agagaatgca 3840
caggtcttcc tagacttagg tgagaaaagg accatgaaat gctgtgggaa gcacgaattc 3900
agtgattgtg tgtgtgcata tgtgtgtgca gtaatgaaga cttaataaag ttgctgtatt 3960
ggta 3964
<210> 39
<211> 862
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化IL-17RA
<400> 39
Met Ala Ile Arg Arg Cys Trp Pro Arg Val Val Pro Gly Pro Ala Leu
1 5 10 15
Gly Trp Leu Leu Leu Leu Leu Asn Val Leu Ala Pro Gly Arg Ala Ser
20 25 30
Pro Arg Leu Leu Asp Phe Pro Ala Pro Val Cys Ala Gln Glu Gly Leu
35 40 45
Asn Cys Thr Val Lys Asn Ser Thr Cys Leu Asp Asp Ser Trp Ile His
50 55 60
Pro Arg Asn Leu Thr Pro Ser Ser Pro Lys Asp Leu Gln Ile Gln Leu
65 70 75 80
His Phe Ala His Thr Gln Gln Gly Asp Leu Phe Pro Val Ala His Ile
85 90 95
Glu Trp Thr Leu Gln Thr Asp Ala Ser Ile Leu Tyr Leu Glu Gly Ala
100 105 110
Glu Leu Ser Val Leu Gln Leu Asn Thr Asn Glu Arg Leu Cys Val Arg
115 120 125
Phe Glu Phe Leu Ser Lys Leu Arg His His His Arg Arg Trp Arg Phe
130 135 140
Thr Phe Ser His Phe Val Val Asp Pro Asp Gln Glu Tyr Glu Val Thr
145 150 155 160
Val His His Leu Pro Lys Pro Ile Pro Asp Gly Asp Pro Asn His Gln
165 170 175
Ser Lys Asn Phe Leu Val Pro Asp Cys Glu His Ala Arg Met Lys Val
180 185 190
Thr Thr Pro Cys Met Ser Ser Gly Ser Leu Trp Asp Pro Asn Ile Thr
195 200 205
Val Glu Thr Leu Glu Ala His Gln Leu Arg Val Ser Phe Thr Leu Trp
210 215 220
Asn Glu Ser Thr His Tyr Gln Ile Leu Leu Thr Ser Phe Pro His Met
225 230 235 240
Glu Asn His Ser Cys Phe Glu His Met His His Ile Pro Ala Pro Arg
245 250 255
Pro Glu Glu Phe His Gln Arg Ser Asn Val Thr Leu Thr Leu Arg Asn
260 265 270
Leu Lys Gly Cys Cys Arg His Gln Val Gln Ile Gln Pro Phe Phe Ser
275 280 285
Ser Cys Leu Asn Asp Cys Leu Arg His Ser Ala Thr Val Ser Cys Pro
290 295 300
Glu Met Pro Asp Thr Pro Glu Pro Ile Pro Asp Tyr Met Pro Leu Trp
305 310 315 320
Val Tyr Trp Phe Ile Thr Gly Ile Ser Ile Leu Leu Val Gly Ser Val
325 330 335
Ile Leu Leu Ile Val Cys Met Thr Trp Arg Leu Ser Gly Ala Asp Gln
340 345 350
Glu Lys His Gly Asp Asp Ser Lys Ile Asn Gly Ile Leu Pro Val Ala
355 360 365
Asp Leu Thr Pro Pro Pro Leu Arg Pro Arg Lys Val Trp Ile Val Tyr
370 375 380
Ser Ala Asp His Pro Leu Tyr Val Glu Val Val Leu Lys Phe Ala Gln
385 390 395 400
Phe Leu Ile Thr Ala Cys Gly Thr Glu Val Ala Leu Asp Leu Leu Glu
405 410 415
Glu Gln Val Ile Ser Glu Val Gly Val Met Thr Trp Val Ser Arg Gln
420 425 430
Lys Gln Glu Met Val Glu Ser Asn Ser Lys Ile Ile Ile Leu Cys Ser
435 440 445
Arg Gly Thr Gln Ala Lys Trp Lys Ala Ile Leu Gly Trp Ala Glu Pro
450 455 460
Ala Val Gln Leu Arg Cys Asp His Trp Lys Pro Ala Gly Asp Leu Phe
465 470 475 480
Thr Ala Ala Met Asn Met Ile Leu Pro Asp Phe Lys Arg Pro Ala Cys
485 490 495
Phe Gly Thr Tyr Val Val Cys Tyr Phe Ser Gly Ile Cys Ser Glu Arg
500 505 510
Asp Val Pro Asp Leu Phe Asn Ile Thr Ser Arg Tyr Pro Leu Met Asp
515 520 525
Arg Phe Glu Glu Val Tyr Phe Arg Ile Gln Asp Leu Glu Met Phe Glu
530 535 540
Pro Gly Arg Met His His Val Arg Glu Leu Thr Gly Asp Asn Tyr Leu
545 550 555 560
Gln Ser Pro Ser Gly Arg Gln Leu Lys Glu Ala Val Leu Arg Phe Gln
565 570 575
Glu Trp Gln Thr Gln Cys Pro Asp Trp Phe Glu Arg Glu Asn Leu Cys
580 585 590
Leu Ala Asp Gly Gln Asp Leu Pro Ser Leu Asp Glu Glu Val Phe Glu
595 600 605
Asp Pro Leu Leu Pro Pro Gly Gly Gly Ile Val Lys Gln Gln Pro Leu
610 615 620
Val Arg Glu Leu Pro Ser Asp Gly Cys Leu Val Val Asp Val Cys Val
625 630 635 640
Ser Glu Glu Glu Ser Arg Met Ala Lys Leu Asp Pro Gln Leu Trp Pro
645 650 655
Gln Arg Glu Leu Val Ala His Thr Leu Gln Ser Met Val Leu Pro Ala
660 665 670
Glu Gln Val Pro Ala Ala His Val Val Glu Pro Leu His Leu Pro Asp
675 680 685
Gly Ser Gly Ala Ala Ala Gln Leu Pro Met Thr Glu Asp Ser Glu Ala
690 695 700
Cys Pro Leu Leu Gly Val Gln Arg Asn Ser Ile Leu Cys Leu Pro Val
705 710 715 720
Asp Ser Asp Asp Leu Pro Leu Cys Ser Thr Pro Met Met Ser Pro Asp
725 730 735
His Leu Gln Gly Asp Ala Arg Glu Gln Leu Glu Ser Leu Met Leu Ser
740 745 750
Val Leu Gln Gln Ser Leu Ser Gly Gln Pro Leu Glu Ser Trp Pro Arg
755 760 765
Pro Glu Val Val Leu Glu Gly Cys Thr Pro Ser Glu Glu Glu Gln Arg
770 775 780
Gln Ser Val Gln Ser Asp Gln Gly Tyr Ile Ser Arg Ser Ser Pro Gln
785 790 795 800
Pro Pro Glu Trp Leu Thr Glu Glu Glu Glu Leu Glu Leu Gly Glu Pro
805 810 815
Val Glu Ser Leu Ser Pro Glu Glu Leu Arg Ser Leu Arg Lys Leu Gln
820 825 830
Arg Gln Leu Phe Phe Trp Glu Leu Glu Lys Asn Pro Gly Trp Asn Ser
835 840 845
Leu Glu Pro Arg Arg Pro Thr Pro Glu Glu Gln Asn Pro Ser
850 855 860
<210> 40
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 40
aggagcagac cctgaactca caagggaaga ccctcactcg atatcgaatt ccgaagttcc 60
tattctctag aaagtatagg 80
<210> 41
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 41
gtataggaac ttcatcagtc aggtacataa tggtggatcc caattgtcca ccagctttgt 60
agtcacagga gacctaatct 80
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 42
gctcgactag agcttgcgga 20
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 43
tcttaagtag caggctcagg aggcc 25
<210> 44
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 44
gttcaccagc gtgaatgctc aca 23
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 45
ctgtcagaag ttggcagcag g 21
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 46
ggactggatg agacagctca aaggg 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 47
gctgcttaca gggcttcttc ctcaa 25
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 48
gagacgcaat gggcagttag attcc 25
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 探针
<400> 49
aaatgttcca gcacttcctg ggtgt 25
<210> 50
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 50
accactcacc tcctctgctg ga 22
<210> 51
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 51
cctcatggag cacagatgcc tat 23
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 52
ctgtcagaag ttggcagcag g 21
<210> 53
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
caaacagcag cctacacaac ttcat 25
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
ctaggcaaca caccttctcc ctgt 24
<210> 55
<211> 1653
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 55
agcagaagct ccctcagcga ggacagcaag ggactagcca ggagggagaa cagaaactcc 60
agaacatctt ggaaatagct cccagaaaag caagcagcca accaggcagg ttctgtccct 120
ttcactcact ggcccaaggc gccacatctc cctccagaaa agacaccatg agcacagaaa 180
gcatgatccg cgacgtggaa ctggcagaag aggcactccc ccaaaagatg gggggcttcc 240
agaactccag gcggtgccta tgtctcagcc tcttctcatt cctgcttgtg gcaggggcca 300
ccacgctctt ctgtctactg aacttcgggg tgatcggtcc ccaaagggat gagaagttcc 360
caaatggcct ccctctcatc agttctatgg cccagaccct cacactcaga tcatcttctc 420
aaaattcgag tgacaagcct gtagcccacg tcgtagcaaa ccaccaagtg gaggagcagc 480
tggagtggct gagccagcgc gccaacgccc tcctggccaa cggcatggat ctcaaagaca 540
accaactagt ggtgccagcc gatgggttgt accttgtcta ctcccaggtt ctcttcaagg 600
gacaaggctg ccccgactac gtgctcctca cccacaccgt cagccgattt gctatctcat 660
accaggagaa agtcaacctc ctctctgccg tcaagagccc ctgccccaag gacacccctg 720
agggggctga gctcaaaccc tggtatgagc ccatatacct gggaggagtc ttccagctgg 780
agaaggggga ccaactcagc gctgaggtca atctgcccaa gtacttagac tttgcggagt 840
ccgggcaggt ctactttgga gtcattgctc tgtgaaggga atgggtgttc atccattctc 900
tacccagccc ccactctgac ccctttactc tgaccccttt attgtctact cctcagagcc 960
cccagtctgt atccttctaa cttagaaagg ggattatggc tcagggtcca actctgtgct 1020
cagagctttc aacaactact cagaaacaca agatgctggg acagtgacct ggactgtggg 1080
cctctcatgc accaccatca aggactcaaa tgggctttcc gaattcactg gagcctcgaa 1140
tgtccattcc tgagttctgc aaagggagag tggtcaggtt gcctctgtct cagaatgagg 1200
ctggataaga tctcaggcct tcctaccttc agacctttcc agattcttcc ctgaggtgca 1260
atgcacagcc ttcctcacag agccagcccc cctctattta tatttgcact tattatttat 1320
tatttattta ttatttattt atttgcttat gaatgtattt atttggaagg ccggggtgtc 1380
ctggaggacc cagtgtggga agctgtcttc agacagacat gttttctgtg aaaacggagc 1440
tgagctgtcc ccacctggcc tctctacctt gttgcctcct cttttgctta tgtttaaaac 1500
aaaatattta tctaacccaa ttgtcttaat aacgctgatt tggtgaccag gctgtcgcta 1560
catcactgaa cctctgctcc ccacgggagc cgtgactgta atcgccctac gggtcattga 1620
gagaaataaa gatcgcttgg aaaagaaatg tga 1653
<210> 56
<211> 235
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 56
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Gln Lys Met Gly Gly Phe Gln Asn Ser Arg Arg Cys Leu Cys
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Leu Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu Asn Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Asp Glu Lys Phe
50 55 60
Pro Asn Gly Leu Pro Leu Ile Ser Ser Met Ala Gln Thr Leu Thr Leu
65 70 75 80
Arg Ser Ser Ser Gln Asn Ser Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val
85 90 95
Ala Asn His Gln Val Glu Glu Gln Leu Glu Trp Leu Ser Gln Arg Ala
100 105 110
Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Met Asp Leu Lys Asp Asn Gln Leu Val
115 120 125
Val Pro Ala Asp Gly Leu Tyr Leu Val Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys
130 135 140
Gly Gln Gly Cys Pro Asp Tyr Val Leu Leu Thr His Thr Val Ser Arg
145 150 155 160
Phe Ala Ile Ser Tyr Gln Glu Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Val Lys
165 170 175
Ser Pro Cys Pro Lys Asp Thr Pro Glu Gly Ala Glu Leu Lys Pro Trp
180 185 190
Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp
195 200 205
Gln Leu Ser Ala Glu Val Asn Leu Pro Lys Tyr Leu Asp Phe Ala Glu
210 215 220
Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Val Ile Ala Leu
225 230 235
<210> 57
<211> 1686
<212> DNA
<213> 人类
<400> 57
cagacgctcc ctcagcaagg acagcagagg accagctaag agggagagaa gcaactacag 60
accccccctg aaaacaaccc tcagacgcca catcccctga caagctgcca ggcaggttct 120
cttcctctca catactgacc cacggctcca ccctctctcc cctggaaagg acaccatgag 180
cactgaaagc atgatccggg acgtggagct ggccgaggag gcgctcccca agaagacagg 240
ggggccccag ggctccaggc ggtgcttgtt cctcagcctc ttctccttcc tgatcgtggc 300
aggcgccacc acgctcttct gcctgctgca ctttggagtg atcggccccc agagggaaga 360
gttccccagg gacctctctc taatcagccc tctggcccag gcagtcagat catcttctcg 420
aaccccgagt gacaagcctg tagcccatgt tgtagcaaac cctcaagctg aggggcagct 480
ccagtggctg aaccgccggg ccaatgccct cctggccaat ggcgtggagc tgagagataa 540
ccagctggtg gtgccatcag agggcctgta cctcatctac tcccaggtcc tcttcaaggg 600
ccaaggctgc ccctccaccc atgtgctcct cacccacacc atcagccgca tcgccgtctc 660
ctaccagacc aaggtcaacc tcctctctgc catcaagagc ccctgccaga gggagacccc 720
agagggggct gaggccaagc cctggtatga gcccatctat ctgggagggg tcttccagct 780
ggagaagggt gaccgactca gcgctgagat caatcggccc gactatctcg actttgccga 840
gtctgggcag gtctactttg ggatcattgc cctgtgagga ggacgaacat ccaaccttcc 900
caaacgcctc ccctgcccca atccctttat taccccctcc ttcagacacc ctcaacctct 960
tctggctcaa aaagagaatt gggggcttag ggtcggaacc caagcttaga actttaagca 1020
acaagaccac cacttcgaaa cctgggattc aggaatgtgt ggcctgcaca gtgaagtgct 1080
ggcaaccact aagaattcaa actggggcct ccagaactca ctggggccta cagctttgat 1140
ccctgacatc tggaatctgg agaccaggga gcctttggtt ctggccagaa tgctgcagga 1200
cttgagaaga cctcacctag aaattgacac aagtggacct taggccttcc tctctccaga 1260
tgtttccaga cttccttgag acacggagcc cagccctccc catggagcca gctccctcta 1320
tttatgtttg cacttgtgat tatttattat ttatttatta tttatttatt tacagatgaa 1380
tgtatttatt tgggagaccg gggtatcctg ggggacccaa tgtaggagct gccttggctc 1440
agacatgttt tccgtgaaaa cggagctgaa caataggctg ttcccatgta gccccctggc 1500
ctctgtgcct tcttttgatt atgtttttta aaatatttat ctgattaagt tgtctaaaca 1560
atgctgattt ggtgaccaac tgtcactcat tgctgagcct ctgctcccca ggggagttgt 1620
gtctgtaatc gccctactat tcagtggcga gaaataaagt ttgcttagaa aagaaaaaaa 1680
aaaaaa 1686
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<211> 233
<212> PRT
<213> 人类
<400> 58
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1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
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Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
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Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
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Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
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agcctgctta gcctgctcag gctgtgggtc ccatggccag ttctgccaaa ggccaaaaga 60
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tagaactcaa gactttctgc atgctaggca ggcatgtgcc aattgaactg catcctctag 300
ccctgaaaga ggtgtttatg cgtttccttc ctccattaca tctgggcagc caccaatgct 360
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<212> DNA
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<220>
<223> 未知
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<220>
<223> 未知
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cgcaggccag acaggcagcc agctgttcct cctttaaggg tgactccctc gatgttaacc 2820
attctccttc tccccaacag ttccccaggg acctctctct aatcagccct ctggcccagg 2880
cagtcagtaa gtgtctccaa acctctttcc taattctggg tttgggtttg ggggtagggt 2940
tagtaccggt atggaagcag tgggggaaat ttaaagtttt ggtcttgggg gaggatggat 3000
ggaggtgaaa gtaggggggt attttctagg aagtttaagg gtctcagctt tttcttttct 3060
ctctcctctt caggatcatc ttctcgaacc ccgagtgaca agcctgtagc ccatgttgta 3120
ggtaagagct ctgaggatgt gtcttggaac ttggagggct aggatttggg gattgaagcc 3180
cggctgatgg taggcagaac ttggagacaa tgtgagaagg actcgctgag ctcaagggaa 3240
gggtggagga acagcacagg ccttagtggg atactcagaa cgtcatggcc aggtgggatg 3300
tgggatgaca gacagagagg acaggaaccg gatgtggggt gggcagagct cgagggccag 3360
gatgtggaga gtgaaccgac atggccacac tgactctcct ctccctctct ccctccctcc 3420
agcaaaccct caagctgagg ggcagctcca gtggctgaac cgccgggcca atgccctcct 3480
ggccaatggc gtggagctga gagataacca gctggtggtg ccatcagagg gcctgtacct 3540
catctactcc caggtcctct tcaagggcca aggctgcccc tccacccatg tgctcctcac 3600
ccacaccatc agccgcatcg ccgtctccta ccagaccaag gtcaacctcc tctctgccat 3660
caagagcccc tgccagaggg agaccccaga gggggctgag gccaagccct ggtatgagcc 3720
catctatctg ggaggggtct tccagctgga gaagggtgac cgactcagcg ctgagatcaa 3780
tcggcccgac tatctcgact ttgccgagtc tgggcaggtc tactttggga tcattgccct 3840
gtgaggagga cgaacatcca accttcccaa acgcctcccc tgccccaatc cctttattac 3900
cccctccttc agacaccctc aacctcttct ggctcaaaaa gagaattggg ggcttagggt 3960
cggaacccaa gcttagaact ttaagcaaca agaccaccac ttcgaaacct gggattcagg 4020
aatgtgtggc ctgcacagtg aagtgctggc aaccactaag aattcaaact ggggcctcca 4080
gaactcactg gggcctacag ctttgatccc tgacatctgg aatctggaga ccagggagcc 4140
tttggttctg gccagaatgc tgcaggactt gagaagacct cacctagaaa ttgacacaag 4200
tggaccttag gccttcctct ctccagatgt ttccagactt ccttgagaca cggagcccag 4260
ccctccccat ggagccagct ccctctattt atgtttgcac ttgtgattat ttattattta 4320
tttattattt atttatttac agatgaatgt atttatttgg gagaccgggg tatcctgggg 4380
gacccaatgt aggagctgcc ttggctcaga catgttttcc gtgaaaacgg agctgaacaa 4440
taggctgttc ccatgtagcc ccctggcctc tgtgccttct tttgattatg ttttttaaaa 4500
tatttatctg attaagttgt ctaaacaatg ctgatttggt gaccaactgt cactcattgc 4560
tgagcctctg ctccccaggg gagttgtgtc tgtaatcgcc ctactattca gtggcgagaa 4620
ataaagtttg cttagaaaag aaacatggtc tccttcttgg aattaattct gcatctgcct 4680
cttcttgtgg gtgggaagaa gctccctaag tcctctctcc acaggcttta agatccctcg 4740
gacccagtcc catccttaga ctcctagggc cctggagacc ctacataaac aaagcccaac 4800
agaatattcc ccatccccca ggaaacaaga gcctgaacct aattacctct ccctcagggc 4860
atgggaattt ccaactctgg gaattccaat ccttgctggg aaaatcctgc agctcaggtg 4920
agatttccgg ctgttgcagc tggccagcag tccggagaga gctggagagg agccgcattc 4980
tcaggtacct gaatcacaca gccaagggac ttccagagat tcgggtgtct aggcttcaaa 5040
tcaccctgtc ctaactctgc aacctgaacc agccacttaa cctatctatc caatggggat 5100
aggaatgtcc accacacata gggcatgtga gagaaggcct gacctccatc agaggacctc 5160
actcagccct tggcacagtg ggcacttagt gaattctggc ttccttcaac cagtttccag 5220
ctgttctatc cccttccatt ctctcagtgg gtgaaatcga agagactgag gacaataaag 5280
aacaaggaac cgaactgccg gacgtggtgg catgcacctg taatcctacc actttgcaag 5340
gccaaggtga gaggatcgct tgaacccagg agttccagag caacctgggc aacatagtga 5400
gatcctgtct ctatttttta aaaaagaatg aaacatagga ataagatgtg ggtgaaggac 5460
tcacatgccg gcttggtccc actggtcttt gtggtgaagg aggggagagg tgagaggtgg 5520
gtaatccgga aagagaaaag caccccctcc ctggatgaag gctcttctgg agagagtcaa 5580
agacaaataa gggtggggcg cagtggctca tgcctgttat cccaacactt tgggaggctg 5640
aggtgggagg accacttgag cccactagtt caagaccagc ctgtgcaaca tagcaagacc 5700
ttgtttctag aaaaaaaatt aaagattagt caggtgtagt ggtgcatgcc tgtaatccta 5760
gctcctcagg aggctgaggc aggaggatca ctcaagccca ggagtttgag gttacagtaa 5820
gctatgatca tgccactgta cccccgtctg ggtgacagaa cgagaccctg tctcaaaaaa 5880
ataataattc caaaaacaaa tatggagacg gaaattgagc ccccctagac tgggagcccc 5940
cactgagttc ggaaattagg ctttacctcc agccctgggg tgccaggcag gagaaaacca 6000
tgtggtaggc tgagggggta gggtgaccca ttggggtgac ctagataggg ccttgggtca 6060
ccctctgcct cctccagcct gtggctgaaa gtcagccatg aagtaatggg ggacactgtt 6120
actcatccca gaagcaccca cacttactca cttttgggaa gggggaccta aagtgtgaaa 6180
aaaaggtgag gattttccgt ctcaccctaa atgggacacc ctaagtgggg catcggtttt 6240
tcctcctccc cagaacttcc tggtgttttc aggcaccaca ggctcct 6287
<210> 62
<211> 79
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 未知
<400> 62
aatgtatgct atacgaagtt attaggtccc tcgaggggat ccgaattcat cggcttcctc 60
ctggaactcc tcctcctcg 79
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
ggtgacctag atagtgcctg g 21
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
tcagtcgcag gcacgttaag 20
<210> 65
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
tgcatcgcat tgtctgagta gg 22
<210> 66
<211> 1162
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源化IL-17A
<400> 66
atccacctca cacgaggcac aagtgcaccc agcaccagct gatcaggacg cgcaaacatg 60
actcctggga agacctcatt ggtgtcactg ctactgctgc tgagcctgga ggccatagtg 120
aaggcaggaa tcacaatccc acgaaatcca ggatgcccaa attctgagga caagaacttc 180
ccccggactg tgatggtcaa cctgaacatc cataaccgga ataccaatac caatcccaaa 240
aggtcctcag attactacaa ccgatccacc tcaccttgga atctccaccg caatgaggac 300
cctgagagat atccctctgt gatctgggag gcaaagtgcc gccacttggg ctgcatcaac 360
gctgatggga acgtggacta ccacatgaac tctgtcccca tccagcaaga gatcctggtc 420
ctgcgcaggg agcctccaca ctgccccaac tccttccggc tggagaagat actggtgtcc 480
gtgggctgca cctgtgtcac cccgattgtc caccatgtgg cctaaacaga gacccgcggc 540
tgacccctaa gaaaccccca cgtttctcag caaacttact tgcattttta aaacagttcg 600
tgctattgat tttcagcaag gaatgtggat tcagaggcag attcagaatt gtctgccctc 660
cacaatgaaa agaaggtgta aaggggtccc aaactgcttc gtgtttgttt ttctgtggac 720
tttaaattat ttgtgtattt acaatatccc aagatagctt tgaagcgtaa cttattttaa 780
tgaagtatct acattattat tatgtttctt tctgaagaag acaaaattca agactcagaa 840
attttattat ttaaaaggta aagcctatat ttatatgagc tatttatgaa tctatttatt 900
tttcttcagt atttgaagta ttaagaacat gattttcaga tctacctagg gaagtcctaa 960
gtaagattaa atattaatgg aaatttcagc tttactattt gtttatttaa ggttctctcc 1020
tctgaatggg gtgaaaacca aacttagttt tatgtttaat aactttttaa attattgaag 1080
attcaaaaaa ttggataatt tagctcccta ctctgtttta aaaaaaaatt gtaacaatat 1140
cactgtaata ataaagtttt gg 1162

Claims (17)

1.一种重组载体，所述重组载体包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列和小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列。
2.如权利要求1所述的重组载体，其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成。
3.如权利要求1或2所述的重组载体，其中所述小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列各自包含至少100个核苷酸，例如至少200个核苷酸，至少300个核苷酸，至少500个核苷酸，至少1000个核苷酸，至少2000个核苷酸，或至少3000个核苷酸，例如100-500个核苷酸，500-1000个核苷酸，1000-2000个核苷酸，2000-3000个核苷酸，3000-7000个核苷酸或者7000-10000个核苷酸，优选所述小鼠TNF-α基因上游和下游同源臂序列各自包含3000-7000个核苷酸。
4.如权利要求1至3中任一项所述的重组载体，其中所述小鼠TNF-α基因上游同源臂序列包含SEQ ID NO:59，且所述下游同源臂序列包含SEQ ID NO:60。
5.如权利要求1至4中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体还包含用于阳性筛选的抗性基因，例如所述抗性基因是新霉素磷酸转移酶的编码序列。
6.如权利要求1至5中任一项所述的重组载体，其中所述重组载体还包含用于负筛选的标记基因，其中所述标记基因是白喉毒素A亚基的编码序列。
7.如权利要求1至6中任一项所述的重组载体，所述载体用于替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列。
8.如权利要求1至6中任一项所述的重组载体在替换小鼠基因组中对应的内源性基因序列中的用途。
9.如权利要求1至6中任一项所述的重组载体在构建转基因小鼠或转基因小鼠细胞中的用途。
10.一种制备包含人TNF-α基因的序列的转基因非人动物的方法，所述方法包括在所述动物的基因组中插入人TNF-α基因的序列，任选其中所述人TNF-α基因的序列替换所述动物的基因组中对应的内源性序列，任选其中所述动物表达人TNF-α蛋白，任选其中所述人TNF-α蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:58或由SEQ ID NO:58组成。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述动物是啮齿类动物，例如小鼠。
12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述方法包括：
a.提供如权利要求1至7中任一项所述的重组载体；
b1.将所述重组载体注射到小鼠的受精卵中；
c1.通过将所述受精卵移植到代孕母鼠中并繁殖从而获得所述转基因小鼠；或者
b2.将所述重组载体注射到小鼠的胚胎干细胞中；
c2.通过所述胚胎干细胞的克隆获得所述转基因小鼠，任选其中将所述胚胎干细胞导入分离的囊胚中，并将获得的嵌合囊胚移植到代孕母鼠中，通过繁殖获得所述转基因小鼠。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述方法还包括对所述代孕母鼠繁殖的后代进行检测以筛选其基因组中包含人TNF-α基因的序列的转基因小鼠的步骤。
14.如权利要求12或13中所述的方法，其中所述方法还包括通过所述转基因小鼠的杂交以获得对所述人TNF-α基因的序列纯合的小鼠的步骤。
15.一种嵌合TNF-α基因，其中所述嵌合TNF-α基因包含部分人TNF-α基因序列和部分非人动物TNF-α基因序列，优选的所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列或自起始密码子至终止密码子的序列。
16.根据权利要求15所述的TNF-α基因，优选所述人TNF-α基因序列与SEQ ID NO:61具有至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％一致性，或包含SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:61组成。
17.一种转基因非人动物细胞，其中TNF-α基因的序列替换所述动物细胞的基因组中对应的内源性序列中；其中TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因的编码序列；任选其中所述人TNF-α基因的序列包含人TNF-α基因自起始密码子至终止密码子的序列；任选其中所述人TNF-α基因的序列包含与SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的核苷酸序列，任选其中所述人TNF-α基因的序列包含SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:61，或由SEQ ID NO:57或SEQ IDNO:61组成；任选其中所述转基因非人动物细胞表达人TNF-α蛋白，任选其中所述人TNF-α蛋白包含与SEQ ID NO:58具有至少80％序列一致性，例如至少85％，至少90％，至少95％，至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列，或包含SEQ ID NO:58或由SEQ ID NO:58组成。
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