CN115003387A - 用于活化和扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法 - Google Patents

用于活化和扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115003387A
CN115003387A CN202080093941.8A CN202080093941A CN115003387A CN 115003387 A CN115003387 A CN 115003387A CN 202080093941 A CN202080093941 A CN 202080093941A CN 115003387 A CN115003387 A CN 115003387A
Authority
CN
China
Prior art keywords
til
agonist
population
days
expanded
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080093941.8A
Other languages
English (en)
Inventor
迈卡·本森
尼古拉斯·约翰·科莱蒂
诺亚·雅各布·图博
迈克尔·施拉巴赫
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ksq Treatment Co
Original Assignee
Ksq Treatment Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ksq Treatment Co filed Critical Ksq Treatment Co
Publication of CN115003387A publication Critical patent/CN115003387A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/0068—General culture methods using substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2121/00—Preparations for use in therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/51—B7 molecules, e.g. CD80, CD86, CD28 (ligand), CD152 (ligand)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/515—CD3, T-cell receptor complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/11—Coculture with; Conditioned medium produced by blood or immune system cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

提供了用于以一步法活化和扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法。还提供了用于在不使用饲养细胞的情况下活化和扩增TIL的方法。除了富集中枢记忆T细胞表型的经扩增TIL的经分离群体之外，还提供了扩增的TIL群体的组合物。

Description

用于活化和扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法
相关申请
本申请要求2019年11月25日提交的美国临时专利申请号62/940,035；和2020年9月22日提交的美国临时专利申请号63/081,539的优先权，这些申请中的每个以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本公开涉及用于活化和扩增淋巴细胞群体、尤其是肿瘤浸润淋巴细胞的方法。
背景技术
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继性转移是治疗体积大、难治性癌症的强有力的方法，尤其是在预后差的患者中。成功的免疫治疗需要大量的TIL，其必需一个稳健且可靠的扩增过程。多步方法，通常包括基于IL-2的TIL扩增“前-REP”，随后是“快速扩增方案”(REP)，由于它能够产生治疗有效数量的TIL，因此已成为TIL扩增的优选方法，但由于此过程的耗时性质而仍然受到限制。在最多可持续6周的前-REP步骤之后，然后REP可以导致TIL在14天期间内1,000倍的扩增。REP是一个困难的过程，除了需要大剂量的抗CD3抗体(OKT3)和IL-2之外，还需要大量过量(例如200倍)的饲养细胞来活化TIL。
目前现有的基于REP的TIL扩增方法最具挑战性的方面之一是获取和使用饲养细胞的必要性。在这些基于REP的方法中，TIL的活化依赖饲养细胞的存在。饲养细胞群通常从3-5个同种异体供体收集，这使得控制收集、辐照和维持饲养细胞群的过程既昂贵又困难。因此，即使使用饲养细胞成本高昂且具有挑战性，但它们被认为在TIL活化和扩增过程中是必不可少的。
因此，需要更简化的TIL扩增方法。
发明内容
提供了用于使用更简化的方法来活化和扩增TIL的方法，包括一步法、需要较短扩增期的方法、使用可溶性试剂进行刺激的方法、更适合临床制造的方法以及不使用饲养细胞的方法。除了富集中枢记忆T细胞表型的扩增的TIL的分离的群体之外，还提供了扩增的TIL群体的组合物。
如本文所公开的，出乎意料地发现，可以在不存在饲养细胞的情况下使用T细胞受体(TCR)激动剂(例如，CD3激动剂)和CD28激动剂的组合来活化和扩增TIL。TCR激动剂和CD28激动剂可以是彼此连接或复合的抗体，或连接到纳米基质。令人惊讶的是，本文所述的无饲养细胞的TIL活化和扩增方法可导致150,000倍的TIL扩增，并且还导致中枢记忆T细胞表型的富集。令人惊讶的是，本文所述的无饲养细胞的TIL活化和扩增方法还可以在一步法的第14天导致4,000至100,000倍的扩增。甚至在来自多个供体的样品中也观察到了这种稳健扩增，所述样品在前-REP的条件下未能扩增。因此，本文所述的方法能够在当前实践标准的两步TIL扩增方法失败的情况下产生扩增的TIL。
如本文所公开的，还出乎意料地发现，可以用一步法活化和扩增TIL，从而消除了对于单独的前-REP和REP步骤的需要。
在一个方面，本发明涉及一种在分解的肿瘤样品中扩增TIL群体的方法，所述方法包括在培养基中培养分解的肿瘤样品，其中使TIL与TCR激动剂、CD28激动剂、和T细胞刺激性细胞因子接触。
在一些实施方案中，培养基以选自由以下组成的组的时间间隔补充T细胞刺激性细胞因子：1天、2天、3天、4天、5天和6天。
在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为10U/ml至7,000U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，培养基以选自由以下组成的组的时间间隔进行更换：1天、2天、3天、4天、5天和6天。
在一些实施方案中，培养基的组分保持不变。在一些实施方案中，培养基的30％至99％以选自由以下组成的组的时间间隔进行更换：1天、2天、3天、4天、5天和6天。
在一些实施方案中，本文的方法可以从先前失败的前-REP扩增中挽救TIL样品。在一些实施方案中，肿瘤样品来自先前已提交肿瘤样品用于TIL扩增的受试者，其中先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自前-REP步骤的TIL的数量小于1000个TIL。在一些实施方案中，肿瘤样品来自先前已提交肿瘤样品用于TIL扩增的受试者，其中先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自前-REP步骤的TIL的扩增倍数小于5倍。
在一些实施方案中，分解的肿瘤样品包含大小为0.5至4mm3的肿瘤片段。在一些实施方案中，分解的肿瘤样品包含消化的肿瘤片段。
在一些实施方案中，培养基包含饲养细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是外周血单核细胞或抗原呈递细胞。在一些实施方案中，饲养细胞表达TCR激动剂、CD28激动剂和/或4-1BB激动剂。在一些实施方案中，TCR激动剂、CD28激动剂和/或4-1BB激动剂在饲养细胞的表面上表达。在一些实施方案中，饲养细胞被遗传修饰以表达TCR激动剂、CD28激动剂和/或4-1BB配体。在一些实施方案中，TCR激动剂是CD3激动剂。在一些实施方案中，CD3激动剂是OKT3。在一些实施方案中，CD28激动剂是CD86。在一些实施方案中，饲养细胞是抗原呈递细胞。在一些实施方案中，抗原呈递细胞包括K562细胞。在一些实施方案中，饲养细胞表达TCR激动剂和/或4-1BB激动剂。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是4-1BB配体。在一些实施方案中，饲养细胞被遗传修饰以表达T细胞刺激性细胞因子。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子是IL-2。
在一些实施方案中，培养基不包含饲养细胞。在一些实施方案中，CD28激动剂可溶于培养基。
在一些实施方案中，TCR激动剂是CD3激动剂。
在一些实施方案中，TCR激动剂和/或CD28激动剂连接到聚合物链基质的胶体悬浮液的纳米基质，其中每个基质在其最大维度上的长度为1至500nm。在一些实施方案中，TCR激动剂和CD28激动剂附接到相同的聚合物链。在一些实施方案中，TCR激动剂和CD28激动剂附接到不同的聚合物链。在一些实施方案中，TCR激动剂以每mg纳米基质25μg附接到纳米基质。
在一些实施方案中，TCR激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD3抗体。在一些实施方案中，CD28激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD28抗体。在一些实施方案中，培养基包含CD2激动剂。在一些实施方案中，CD2激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD2抗体。
在另一个方面，本发明涉及一种用于扩增TIL群体的方法，其包括使所述TIL群体与包含聚合物链基质的胶体悬浮液的纳米基质接触，其中所述基质附接到CD3激动剂和CD28激动剂，其中所述纳米基质向TIL群体提供活化信号，从而活化并诱导TIL群体增殖，其中每个基质在其最大维度上的长度为1至500nm，并且其中所述方法不包括在TIL群体扩增期间使用饲养细胞。
在一些实施方案中，与纳米基质接触的TIL群体还包含肿瘤细胞。
在一些实施方案中，TIL群体是从受试者中分离的并且与纳米基质接触，在使TIL群体与纳米基质接触之前没有另外的TIL群体的扩增过程。
在一些实施方案中，CD3激动剂和CD28激动剂附接到相同的聚合物链。在一些实施方案中，CD3激动剂和CD28激动剂附接到不同的聚合物链。在一些实施方案中，CD3激动剂以每mg纳米基质25μg附接到纳米基质。
在一些实施方案中，纳米基质还包含嵌入在聚合物链基质之间或之内的磁性、顺磁性或超顺磁性纳米晶体。
在一些实施方案中，聚合物链基质包含葡聚糖聚合物。
在一些实施方案中，聚合物链是胶体聚合物链。
在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:5。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:500。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90、1:100、1:200、1:300、1:400或1:500。
在一些实施方案中，CD28激动剂以每mg纳米基质25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，激动剂是重组激动剂。在一些实施方案中，激动剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，CD3激动剂是OKT3或UCHT1。
在一些实施方案中，本文的方法可以从先前失败的前-REP扩增中挽救TIL样品。在一些实施方案中，待扩增的TIL来自先前已提交TIL样品用于扩增的受试者，其中先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自前-REP步骤的TIL的数量小于1000个TIL。在一些实施方案中，待扩增的TIL来自先前已提交TIL样品用于扩增的受试者，其中先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自前-REP步骤的TIL的扩增倍数小于5倍。
在另一个方面，本发明涉及一种用于扩增TIL群体的方法，其包括使TIL群体与包含第一、第二和第三可溶性单特异性复合物的组合物接触，其中每个可溶性单特异性复合物包含连接在一起的两个抗体或其片段，其中每个可溶性单特异性复合物的每个抗体或其片段特异性结合至TIL群体上的相同抗原，其中第一可溶性单特异性复合物包含抗CD3抗体，其中第二可溶性单特异性复合物包含抗CD28抗体，并且其中第三可溶性单特异性复合物包含抗CD2抗体，并且所述方法不包括在TIL群体扩增期间使用饲养细胞。
在一些实施方案中，与组合物接触的TIL群体还包含肿瘤细胞。
在一些实施方案中，TIL群体是从受试者中分离的并且与组合物接触，在使TIL群体与组合物接触之前没有另外的TIL群体的扩增过程。
在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为0.2-25μl/ml。
在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物是四聚体抗体复合物(TAC)。在一些实施方案中，每个TAC包含来自第一种动物物种的两个抗体，所述两个抗体与来自第二物种的两个抗体分子结合，所述第二物种的两个抗体分子特异性结合至来自第一动物物种的抗体的Fc部分。
在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3抗体或UCHT1抗体。在一些实施方案中，所述方法还包括使TIL群体与细胞因子IL-2接触。在一些实施方案中，TIL与细胞因子IL-2以选自由以下组成的组的时间间隔接触：1天、2天、3天、4天、5天和6天。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为100U/ml至7,000U/ml。
在一些实施方案中，本文的方法可以从先前失败的前-REP扩增中挽救TIL样品。在一些实施方案中，待扩增的TIL来自先前已提交TIL样品用于扩增的受试者，其中先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自前-REP步骤的TIL的数量小于1000个TIL。在一些实施方案中，待扩增的TIL来自先前已提交TIL样品用于扩增的受试者，其中先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自前-REP步骤的TIL的扩增倍数小于5倍。
在一些实施方案中，TIL扩增长达9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。在一些实施方案中，TIL扩增9至25天、9至21天或9至14天。
在一些实施方案中，TIL扩增500至500,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增自100个至100,000个TIL的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少1,500倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多100,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少15,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多500,000倍。
在一些实施方案中，TIL群体的成员被遗传修饰。
在一些实施方案中，TIL群体的成员通过基因调控系统进行修饰。在一些实施方案中，TIL群体的成员使用RNA干扰进行修饰。在一些实施方案中，TIL群体的成员使用转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)进行修饰。在一些实施方案中，TIL群体的成员使用锌指核酸酶进行修饰。在一个实施方案中，TIL群体的成员使用RNA引导的核酸酶进行修饰。在一些实施方案中，TIL群体的成员使用Cas酶和至少一种指导RNA进行修饰。在一些实施方案中，Cas酶是Cas9。
在一些实施方案中，TIL群体的成员在选自由以下组成的组的一个或多个基因处被修饰：ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。在一些实施方案中，TIL群体的成员在选自由以下组成的组的一个或多个基因处被修饰：SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA。在一些实施方案中，在一个或多个基因处的修饰是一个或多个核酸的插入、缺失或突变。在一些实施方案中，在一个或多个基因处的修饰导致基因的表达和/或由基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。在一些实施方案中，TIL群体的成员被表观遗传修饰。在一些实施方案中，表观遗传修饰是组蛋白修饰。
在一些实施方案中，TIL群体的成员在选自由以下组成的组的一个或多个基因处被修饰：ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。在一个或多个基因处的修饰是一个或多个核酸的甲基化。在一些实施方案中，在一个或多个基因处的修饰是一个或多个核酸的甲基化。在一些实施方案中，在一个或多个基因处的修饰导致基因的表达和/或由基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
在一些实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1基因处被修饰。在一些实施方案中，SOCS1基因的修饰导致基因的表达和/或由基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
在一些实施方案中，TIL群体的成员在多于一个基因处被修饰。在一些实施方案中，TIL群体的成员在选自由SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA组成的组的两个或更多个基因处被修饰。在一些实施方案中，所述两个或更多个基因选自由以下组成的组：ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。在一些实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1基因和一个或多个另外的基因处被修饰。在一些实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1基因以及选自由ZC3H12A、PTPN2、CBLB、RC3H1或NFKBIA组成的组的一个或多个另外的基因处被修饰。在具体实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1和ZC3H12A基因处被修饰。在一些实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1和PTPN2基因处被修饰。在一些实施方案中，SOCS1和PTPN2基因的修饰导致基因的表达和/或由基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。在一些实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1和ZC3H12A基因处被修饰。在一些实施方案中，SOCS1和ZC3H12A基因的修饰导致基因的表达和/或由基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。在一些实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1和CBLB基因处被修饰。在一些实施方案中，SOCS1和CBLB基因的修饰导致基因的表达和/或由基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。在一些实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1和RC3H1基因处被修饰。在一些实施方案中，SOCS1和RC3H1基因的修饰导致基因表达和/或由基因编码的蛋白质的功能的减少或抑制。在一些实施方案中，TIL群体的成员在SOCS1和NFKBIA基因处被修饰。在一些实施方案中，SOCS1和NFKBIA基因的修饰导致基因的表达和/或由基因编码的蛋白质的功能的减少或抑制。
在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少10％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少15％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中5％至50％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中10％至25％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。
在另一个方面，本发明涉及一种组合物，其包含通过本文公开的方法中的任一种产生的扩增的TIL群体。
附图说明
从以下结合附图对说明性实施方案的详细描述，将更全面地理解本发明的前述和其他特征和优点。
图1是绘示出使用饲养细胞的TIL生产工作流程的示意图。
图2是绘示出TIL制造的四种方法的示意图：方法1(使用饲养细胞但没有前-REP步骤的一步REP(“REP样”))；方法2(使用缀合抗CD3和抗CD28抗体的Dynabead(“Dynabead”))；方法3(使用基于抗CD3、抗CD2和抗CD28抗体的四聚体抗体复合物(TAC)(“Stemcell”))；和方法4(使用缀合抗CD3和抗CD28抗体的纳米基质(“Transact”))。
图3.图3A绘示了显示在第14天的TIL扩增倍数的图。图3B绘示了显示在第21天的TIL扩增倍数的图。在每张小图中，每个点代表独立的黑色素瘤供体。示出了使用方法1(REP样)、方法2(以1.5或0.5x106珠/孔的Dynabead)、方法3(Stemcell)、方法4(Transact)和对照(单独IL-2)产生的数据。
图4绘示了一系列FACS分析，为细胞计数提供了门控策略。
图5.图5A绘示了显示在第0、9和14天培养物中的活细胞为CD3+T细胞的百分比的图。图5B绘示了显示在第14天具有中枢记忆表型(Tcm，定义为CCR7+CD45RO+)的T细胞百分比的图。示出了使用方法1(REP样)、方法3(Stemcell)、方法4(Transact)和对照(单独IL-2)产生的数据。
图6绘示了显示在第14天来自三个独立供体的中枢记忆T细胞表型的百分比的一系列FACS分析。
图7绘示了显示使用FACS计数珠分析的在第14天来自三个独立供体的TIL泛T细胞扩增的扩增倍数的条形图。
图8绘示了显示使用FACS计数珠分析的在第14天来自组合供体的TIL泛T细胞扩增的扩增倍数的条形图。示出了使用方法1(REP样)、方法2(以1.5或0.5x106珠/孔的Dynabead)、方法3(Stemcell)、方法4(Transact)和对照(单独IL-2)产生的数据。
图9.绘示了显示使用FACS计数珠分析的在第21天来自三个独立供体的TIL泛T细胞扩增的外推扩增倍数的条形图。示出了使用方法1(REP样)、方法3(Stemcell)和方法4(Transact)产生的数据。
图10绘示了显示在第14天相对于培养的第0天的扩增倍数随时间作为接种密度的函数的图。
图11绘示了显示使用方法1(REP样)、方法3(Stemcell)和方法4(Transact)在TIL供体样品中产生的IFNγ(图11A)、IL-2(图11B)、IL-6(图11C)和TNFα(图11D)表达的倍数诱导的条形图。
图12绘示了电穿孔后8天TIL的CD45编辑百分比和活力，其中使用方法1(REP样)、方法3(Stemcell)或方法4(Transact)扩增TIL。
图13绘示了显示使用方法1(REP样或“REP”)、方法3(Stemcell或“Stem”)、方法4(Transact或“Trans”)、方法5(aAPC-OKT3或“OKT3”)和方法6(aAPC-OKT3-CD86或“OKT3+CD86”)在第10或第11天可溶性四聚体和aAPC的扩增倍数的条形图。
图14绘示了显示可溶性四聚体和aAPC编辑的TIL在第18天(D3399)或第23天(D6752和D6755)的扩增倍数的条形图。
图15绘示了显示在第18天(D3399)或第23天(D6752和D6755)的编辑的TIL的中枢记忆表型的条形图。
图16绘示了在第18天(D3399)或第23天(D6752和D6755)的编辑频率的表。
图17绘示了显示在第14天或第20天的TIL肿瘤片段外推细胞计数的条形图。
图18绘示了显示在第14天或第20天的中枢记忆表型(％)的条形图。
图19绘示了在第14天或第20天的编辑频率的表。
图20绘示了在第14天或第20天的编辑频率的表。
图21绘示了显示由肿瘤片段和消化物制备的来自不同供体的TIL活力的条形图。
图22绘示了显示由肿瘤片段和消化物制备的来自不同供体的TIL细胞数的条形图。
具体实施方式
TIL的常规活化和扩增方法除了多步骤(包括至少单独的前-REP步骤和REP步骤)之外，还需要使用饲养细胞。这两个要求都使常规方法既耗时又昂贵。需要使用过继性转移TIL进行免疫治疗的患者通常预后非常差，并且更快地具有可用于治疗的扩增和分化的TIL群体可能构成生存或死亡之间的差异。
为实现足以用于治疗用途的TIL的活化和扩增倍数，在一般较快的REP步骤之前需要执行一般较慢的前-REP步骤，这既耗时又昂贵。在某些应用中，常规方法的前-REP步骤可持续2至6周，以及另外1至3周的REP。因此，需要消除前-REP步骤并将TIL制造方法简化为一个步骤，无论使用或不使用饲养细胞。
出于至少几个原因，对饲养细胞的依赖尤其具有挑战性。首先，很难获得活饲养细胞群体，因为这些细胞是从3至5个同种异体供体中收集的。饲养细胞的异质来源使其使用不可标准化，因为每个供体细胞群体扩增TIL的能力都必须单独合格。此外，由于饲养细胞的固有可变性，使用饲养细胞的TIL扩增变得不太可重复和可预测。其次，当使用饲养细胞时，TIL只能在REP阶段之前或之后，而不是在期间被工程化或遗传修饰，因为TIL不能在饲养细胞存在下被工程化。第三，在涉及REP步骤的TIL制造方法中，REP不能缩短，因为在饲养细胞死亡之前无法使用扩增的TIL群体。第四，使用饲养细胞刺激TIL会导致无法洗除和/或去除刺激剂。因此，在一些情况下，常规方法的前-REP和REP步骤未能产生所需数量的TIL。出于以上描绘的至少四个原因，需要消除对饲养细胞的依赖，这是在本发明中已经实现并在本文中公开的。消除饲养细胞能够增强对TIL扩增过程的控制。例如，当达到所需的TIL数量时，可以停止TIL扩增过程。
为了提供改进的、更快和更简单的用于产生TIL的方法，本公开提供了使用更简化的方法来活化和扩增TIL的方法，包括一步法、需要较短扩增期的方法、使用可溶性试剂进行刺激的方法，以及不使用饲养细胞的方法。除了富集中枢记忆T细胞表型的扩增的TIL的分离的群体之外，还提供了扩增的TIL群体的组合物。
在一些方面，本公开涉及在不使用饲养细胞的一步法中活化和扩增TIL的方法，其中活化通过与CD3和CD28激动剂的接触而发生。在某些实施方案中，CD3和CD28激动剂与聚合物链的纳米基质结合。在某些实施方案中，CD3和CD28激动剂是彼此连接或复合的抗体或其片段。在某些实施方案中，与使用基于饲养细胞的方法分离的TIL相比，扩增的TIL具有更高百分比的具有中枢记忆T细胞表型的细胞。在某些实施方案中，所述方法还包括使用至少一种4-1BB激动剂来活化TIL。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是4-1BB配体。
在一些方面，本公开涉及用于在一步法中活化和扩增TIL的方法，消除了对前-REP步骤和单独的快速扩增方案(“REP”)和前-REP的需要。
一般来说，关于本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学和蛋白质与核酸化学及杂交所用的命名法是本领域中熟知且常用的。本文提供的方法和技术通常根据本领域熟知，并且如在本说明书通篇中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法进行，除非另有说明。酶促反应和纯化技术是根据制造商说明书，如本领域中通常所实现或如本文所述来进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的命名法，以及所述分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域熟知和常用的。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
除非本文另有定义，否则本文使用的科学和技术术语具有本领域普通技术人员通常理解的含义。如果存在任何潜在的歧义，本文提供的定义优先于任何字典或外在定义。除非上下文另有需要，否则单数术语应包括复数且复数术语应包括单数。除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。术语“包括(including)”以及其他形式(诸如“包括(includes)”和“包括(included)”)的使用不具有限制性。
如本文所用，术语“约”和“大约”是指在给定值或范围的5％内的值。
如本文所用，短语“肿瘤浸润淋巴细胞”或“TIL”是指已离开受试者血流并迁移到肿瘤中的淋巴细胞群体。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞、Th1和Th17 CD4+T细胞以及自然杀伤(NK)细胞。TIL包括原代和次代TIL两者。“原代TIL”是从本文概述的患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，并且“次代TIL”是如本文所讨论的已经扩增或增殖的任何TIL细胞群体，包括但不限于大量TIL(bulk TIL)和扩增的TIL(“REP TIL”或“post-REP TIL”)。在一些实施方案中，原代TIL包括从患者外周血获得的肿瘤反应性T细胞。TIL细胞群体可以包括遗传修饰的TIL。“TIL”还指已离开受试者血流、已迁移到肿瘤中然后离开以再次进入血流的淋巴细胞群体。
如本文所用，短语“细胞群体”或“TIL群体”是指拥有共同性状的许多细胞或TIL。一般来说，群体的数量一般在1×106至1×1010的范围内，不同的TIL群体包含不同的数量。例如，在IL-2存在下原代TIL的初始生长可导致大约1×107个细胞的大量TIL群体。一般进行REP扩增以提供1.5×109至1.5×1010个细胞的群体用于输注。
如本文所用，短语“扩增TIL群体”与“增殖TIL群体”同义，并且是指增加TIL群体中的细胞数量。
如本文所用，短语“扩增过程”是指TIL群体中的细胞数量由此增加的过程。仅分离或富集TIL而没有实质上增加TIL数量的过程不是扩增过程。
如本文所用，术语“基质”或“可移动基质”是指离散的、可分离的、三维网格型(lattice-type)结构，其中该结构的主链可以是柔性的或可移动的并且可以由诸如聚合物和陶瓷的材料构成。作为三维结构，基质可以具有最小维度和最大维度，诸如长度。可移动基质可以是胶原蛋白、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖或细胞外基质组合物。多糖可以包括例如纤维素醚、淀粉、阿拉伯树胶、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、果胶、黄原胶、瓜尔胶或藻酸盐。其他聚合物可以包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、多胺、聚乙烯亚胺、聚季铵聚合物、聚磷腈、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、嵌段共聚物或聚氨酯。可移动基质可以包含葡聚糖聚合物。“基质”是指多于一个基质的集合。
如本文所用，基质的上下文中的短语“最大维度”是指基质的最长长度。
如本文所用，术语“激动剂”是指在细胞表面或以可溶形式与靶标结合的化学物质、分子、大分子、分子复合物或大分子复合物。在某些实施方案中，当激动剂与细胞表面上的靶标结合时，激动剂激活靶标以产生生物反应。激动剂包括激素、神经递质、抗体和抗体片段。
如本文所用，术语“纳米基质”是指多于一个聚合物链基质的胶体悬浮液。纳米基质是一种多相材料，其尺寸小于500nm或在构成材料的不同相之间具有纳米级重复距离的结构。聚合物可以包括聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、多糖、葡聚糖和其他大分子，它们由许多重复的亚基构成。纳米基质也可能在其中嵌入了另外的功能性化合物，诸如磁性、顺磁性或超顺磁性纳米晶体。此外，功能性部分，诸如配体或激动剂，可以共价附接或结合到聚合物链上用于特定应用。
如本文所用，术语“葡聚糖”是指复合支化葡聚糖，一种衍生自葡萄糖的缩合的多糖。葡聚糖链具有不同的长度，从3至2000千道尔顿。聚合物主链由葡萄糖单体之间的α-1,6糖苷键组成，并带有来自α-1,3键的分支。
如本文所用，短语“结合至纳米基质的激动剂”是指共价附接到包含纳米基质内的基质的聚合物链的激动剂。
如本文所用，短语“胶体悬浮液”是指一种混合物，其中一种物质(诸如基质)悬浮在另一种物质(诸如液体)中。因此，胶体悬浮液具有分散相，即悬浮物质，以及连续相，即悬浮介质，诸如液体。
如本文所用，短语“使TIL群体与纳米基质接触”是指将TIL与纳米基质接触在一起，使得TIL可以通过离子、氢键或其他类型的物理或化学相互作用与纳米基质结合的功能性部分(诸如配体或激动剂)或嵌入纳米基质的功能性化合物(诸如纳米晶体)缔合。
如本文所用，术语“受试者”是指患有肿瘤的人，已经离开人血流的淋巴细胞群体迁移到此肿瘤中并转化为TIL。此人可能是需要涉及患者自身TIL群体扩增的免疫疗法的患者。
如本文所用，术语“CD3”是指有助于活化细胞毒性T细胞(CD8+初始T细胞)和辅助性T细胞(CD4+初始T细胞)的CD3(分化簇3)T细胞共受体。CD3是由六条不同的多肽链(2条CD3ζ链、2条CD3ε链、1条CD3eγ链和1条CD3δ链)构成的蛋白质复合物。这些链与T细胞受体(TCR)α和β链(或γ和δ链)缔合，在T淋巴细胞中产生活化信号。TCRα和β链(或γ和δ链)和CD3分子共同构成TCR复合物。人CD3E基因由国家生物技术信息中心(NCBI)Gene ID 916鉴定。人CD3E基因的示例性核苷酸序列是NCBI参考序列：NG_007383.1。人CD3E多肽的示例性氨基酸序列提供为SEQ ID NO:876。
表1：人分化簇多肽和细胞因子的序列
Figure BDA0003756012870000171
Figure BDA0003756012870000181
在表1中，具有前导序列的蛋白质的推测的前导序列以加下划线显示。
如本文所用，术语“CD28”是指分化簇28，其是在T细胞上表达的蛋白质中的一种，其提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。除了T细胞受体(TCR)之外，还可以通过CD28刺激T细胞为各种细胞因子(诸如白介素)的产生提供有效信号。CD28是CD80和CD86蛋白的受体。当被Toll样受体配体激活时，CD80表达在抗原呈递细胞(APC)中上调。人CD28基因由NCBI Gene ID 940鉴定。人CD28基因的示例性核苷酸序列是NCBI参考序列：NG_029618.1。人CD28多肽的示例性氨基酸序列提供为SEQ ID NO:877。
如本文所用，术语“CD2”是指分化簇2，其是在T细胞和自然杀伤(NK)细胞表面上发现的细胞粘附分子。CD2与其他粘附分子相互作用，并充当T细胞和NK细胞的共刺激分子。人CD2基因由NCBI Gene ID 914鉴定。人CD2基因的示例性核苷酸序列是NCBI参考序列：NG_050908.1。人CD2多肽的示例性氨基酸序列提供为SEQ ID NO:878。
如本文所用，术语“4-1BB”是指CD137，它是一种T细胞共刺激物。人4-1BB基因的示例性核苷酸序列是NCBI参考序列：NC_000001.11。人4-1BB的示例性氨基酸序列是NCBI参考序列：NP_001552.2(SEQ ID NO:880)。
如本文所用，术语“4-1BB配体”是指在活化的T淋巴细胞上表达并结合4-1BB的2型跨膜糖蛋白。人4-1BB配体基因的示例性核苷酸序列是NCBI参考序列：NC_000019.10。人4-1BB配体的示例性氨基酸序列是NCBI参考序列：AAA53134.1(SEQ ID NO:881)。
如本文所用，与激动剂或抗体相关联使用的术语“片段”是指保留特异性结合抗原的能力的激动剂或抗体的片段。抗体片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段，其包含单一可变结构域；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但其可使用重组方法通过合成接头加以接合，所述合成接头使其能够以单一蛋白链形式制得，在所述单一蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv))。此类单链抗体也意图涵盖于术语抗体的“抗原结合部分”内。还涵盖其他形式的单链抗体，诸如双抗体。此外，单链抗体还包括“线性抗体”，其包含与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区的一对串联Fv区段(VH-CH1-VH-CH1)。
术语“抗体”是指一般包含四条多肽链(两条重(H)链和两条轻(L)链)的免疫球蛋白(Ig)分子，或其保留了Ig分子的表位结合特征的功能片段、突变体、变体或衍生物。此类片段、突变体、变体或衍生抗体形式是本领域已知的。在全长抗体的实施方案中，每条重链包含重链可变区(VH)和重链恒定区(CH)。在本公开中，重链可变区(结构域)也称为VDH。CH包含三个结构域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)。CL包含单一CL结构域。在本公开中，轻链可变区(结构域)也称为VDL。VH和VL可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守的区域，称为框架区(FR)。一般来说，每个VH和VL由按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
如本文所用的短语“选择性结合”或“选择性地结合”是指激动剂结合至预定抗原上的表位。通常，激动剂以大约小于10-5M，诸如大约小于10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的亲和力(KD)结合。
如本文所用，术语“KD”是指特定激动剂-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本文所述的激动剂以小于约10-6M、10-7M、10-8M、10-9M或10-10M或甚至更低的解离平衡常数(KD)结合至靶标，例如，在Biacore仪器中使用表面等离子体共振(SPR)技术测定的，使用激动剂作为配体以及靶标作为分析物，并以对应于比结合至预定抗原或密切相关抗原以外的非特异性抗原(例如，BSA、酪蛋白)的亲和力低至少十倍，诸如低至少100倍，例如低至少1000倍，诸如低至少10,000倍，例如低至少100,000倍的KD的亲和力结合至靶蛋白。亲和力所低的量取决于激动剂的KD，因此当激动剂的KD非常低(即，激动剂具有高度特异性)时，对抗原的亲和力比对非特异性抗原的亲和力所低的量可以是至少10,000倍。
如本文所用，术语“kd”(sec-1)是指特定激动剂-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为koff值。
如本文所用，术语“ka”(M-1×sec-1)是指特定激动剂-抗原相互作用的缔合速率常数。
如本文所用，术语“KD”(M)是指特定激动剂-抗原相互作用的解离平衡常数。
如本文所用，术语“KA”(M-1)是指特定激动剂-抗原相互作用的缔合平衡常数并且通过将ka除以kd获得。
如本文所用，短语“活化信号”是指导致T细胞变得活化的一种或多种非内源性刺激。在内源性过程中，T细胞通过在抗原呈递细胞(APC)的表面上表达的MHC II类分子呈递肽抗原时变得活化。一旦被活化，T细胞会迅速分裂并分泌调控或协助免疫应答的细胞因子。内源性T细胞活化过程涉及至少(a)涉及CD3的TCR复合物的活化和(b)APC表面上的蛋白质对CD28或4-1BB的共刺激。本领域已知T细胞的内源性活化可以通过用CD3、CD28或4-1BB激动剂(例如抗体)刺激T细胞来模拟。因此，CD3、CD28和/或4-1BB可以一起向T细胞提供活化信号。
如本文所用，短语“活化和诱导TIL群体增殖”是指使TIL群体经受活化信号的过程，以使TIL数量增加或增殖并开始产生细胞因子(活化的TIL)以增强免疫应答。
如本文所用，术语“纳米晶体”是指基于量子点并且由单晶或多晶排列的原子构成的具有至少一个小于100nm的维度的材料颗粒。纳米晶体的大小将它们与较大的晶体区分开来。
如本文所用，短语“磁性、顺磁性或超顺磁性纳米晶体”是指可以使用磁场操纵的纳米晶体。此类纳米晶体通常由至少一种磁性材料组分(诸如铁、镍或钴)组成。
如本文所用，短语“肿瘤细胞”或“癌细胞”是指以不受控制的方式分裂、形成实体瘤或使血液充满异常细胞的细胞。当不再需要更多子细胞时，健康细胞停止分裂，但肿瘤细胞或癌细胞继续产生拷贝。它们还能够在称为转移的过程中从身体的一个部位扩散到另一个部位。肿瘤细胞可以从多种癌症类型中分离出来，包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、唇癌和口腔癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、肺癌、非小细胞癌肺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、小细胞肺癌和甲状腺癌。肿瘤细胞可以分离自原发性肿瘤和转移瘤。
如本文所用，短语“肿瘤样品”是指从受试者分离的肿瘤细胞。在某些实施方案中，肿瘤样品是整体或部分分离自患有肿瘤的受试者或患者的实体瘤的至少一部分。肿瘤样品可以从多种癌症类型中分离出来，包括膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、唇癌和口腔癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、肺癌、非小细胞癌肺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、小细胞肺癌和甲状腺癌。肿瘤样品可以分离自原发性肿瘤和转移瘤。
如本文所用，短语“分解的肿瘤样品”是指已被片段化成“肿瘤片段”的肿瘤样品。片段化可以是物理片段化、机械片段化、超声片段化、酶促片段化或其任何组合。片段化可以机械方式进行，并且任选地随后将肿瘤片段通过酶消化成单细胞悬浮液。机械分解方法可包括将肿瘤切碎或切片成更小的肿瘤片段，而酶分解方法可包括用特定的酶诸如蛋白酶处理肿瘤片段。
在一些实施方案中，本文的方法可以从先前失败的前-REP扩增中挽救TIL样品。在某些实施方案中，肿瘤样品分离自先前已有样品经受了TIL扩增技术的受试者。在一些实施方案中，先前的TIL扩增技术包括前-REP扩增。在一些实施方案中，前-REP扩增包括将IL-2施用于来自受试者的分解的肿瘤样品。在一些实施方案中，在前-REP扩增中，施用于肿瘤样品或从肿瘤样品扩增的TIL的唯一免疫调节剂是IL-2。在一些实施方案中，先前的TIL扩增技术失败了。在一些实施方案中，当没有扩增足够数量的TIL时，TIL扩增技术失败。在一些实施方案中，足够数量的TIL是大于1000、5000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000或100,000个TIL。在一些实施方案中，当没有诱导TIL的足够扩增倍数时，TIL扩增技术失败。在一些实施方案中，TIL的足够扩增倍数大于50、100、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10,000倍扩增。在一些实施方案中，相同肿瘤样品的一部分用于先前的TIL扩增技术和本文公开的TIL扩增方法。在一些实施方案中，两个不同的样品分离自相同的受试者。在一些实施方案中，本文所述的方法能够提供比先前扩增技术更多数量或扩增倍数的TIL。在一些实施方案中，本文所述的方法能够提供临床可用数量的TIL，其中先前的扩增技术不能够提供该数量的TIL。
如本文所用，短语“T细胞受体激动剂”或“TCR激动剂”是指T细胞受体复合物的激动剂。合适的TCR激动剂包括但不限于CD3激动剂(例如抗CD3抗体)。
如本文所用，术语“培养基”是指设计用于支持细胞在人工环境中的存活、生长和/或增殖的液体或凝胶。培养基通常包含一组限定的组分。此类组分可以包括能源、生长因子、激素、刺激剂、活化剂、糖、盐、维生素和/或氨基酸，和/或这些的组合。
如本文所用，短语“培养基的组分保持不变”是指包含一组限定的组分(诸如特定的刺激剂和活化剂)的培养基，其中组分的同一性保持恒定，但一种或多种组分的浓度可能会变化。在某些实施方案中，当细胞在培养基中培养时，培养基中一种或多种组分的浓度随时间变化。然而，当更换培养基时，每次更换的新培养基都具有相同的组分。
如本文所用，短语“饲养细胞”是指用于提供帮助另一细胞类型增殖的细胞外分泌物的细胞。在某些实施方案中，本文所指的饲养细胞是外周血单核细胞(PBMC)或抗原呈递细胞(APC)。
如本文所用，短语“重组激动剂”是指由重组基因编码的激动剂蛋白，所述重组基因已被克隆到支持基因表达和mRNA翻译的系统中。重组基因被设计为受充分表征的启动子控制，并且在选定的宿主细胞内表达目标激动剂蛋白，以实现高水平的蛋白质表达。通过重组DNA技术对基因进行修饰可以导致突变蛋白质或大量蛋白质的表达。
如本文所用，短语“胶体聚合物链”是指当通过共价键或其他物理或化学相互作用彼此连接时可形成胶体悬浮液的聚合物链。
如本文所用，短语“特异性结合”是指蛋白质复合物，诸如激动剂、拮抗剂、抗体或可溶性单特异性复合物与特定的抗原，与以较低亲和力缔合此复合物的其他抗原相比，以高特异性相互作用。特异性结合相互作用可以通过离子键、氢键或其他类型的化学或物理缔合来介导。在某些实施方案中，当蛋白质复合物在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中识别其靶抗原时，蛋白质复合物特异性结合特定抗原。如果激动剂交叉竞争(一者阻止另一者的结合或调节效应)，那么两种或更多种激动剂、拮抗剂、抗体或可溶性单特异性复合物“结合至相同的表位”。
如本文所用，短语“中枢记忆T细胞表型”是指在人类中是CD45RO+并表达CCR7(CCR7hi)和CD62L(CD62hi)的T细胞亚群。中枢记忆T细胞的表面表型还包括TCR、CD3、CD127(IL-7R)。中枢记忆T细胞在TCR触发后主要分泌作为效应子分子IL-2和CD40L。中枢记忆T细胞在血液中的CD4隔室中占主导优势，并且在人类中按比例富集在淋巴结和扁桃体中。
如本文所用，短语“抗CD3抗体”是指抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括针对在成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD3受体的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或鼠抗体。抗CD3抗体包括OKT-3，也称为莫罗单抗(muromonab)。抗CD3抗体还包括UCHT1克隆，也称为T3和CD3c。其他抗CD3抗体包括，例如，奥昔珠单抗(otelixizumab)、替利珠单抗(teplizumab)和维西珠单抗(visilizumab)。
如本文所用，短语“抗CD28抗体”是指抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括针对在成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD28受体的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或鼠抗体。
如本文所用，短语“抗4-1BB抗体”是指抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括针对4-1BB的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或鼠抗体。在一些实施方案中，抗4-1BB抗体可用作4-1BB配体。
如本文所用，短语“抗CD2抗体”是指抗体或其变体，例如单克隆抗体，并且包括针对在成熟T细胞的T细胞抗原受体中的CD2受体的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或鼠抗体。
如本文所用，术语“OKT-3”(本文也称为“OKT3”)是指由Miltenyi Biotech,Inc.,San Diego,Calif.,USA)生产的抗CD3抗体和或其生物类似物或变体(例如，人源化变体、嵌合变体或亲和力成熟的变体)。能够产生OKT-3的杂交瘤可在美国典型培养物保藏中心获得，并分配了ATCC登录号CRL 8001。能够产生OKT-3的杂交瘤可在欧洲认证细胞培养物保藏中心(ECACC)中获得，并分配了目录号86022706。
如本文所用，术语“UCHT1”是指描述于Beverley和Callard(1981)EurJ.Immunol.11:329-334中的抗CD3抗体和或其生物类似物或变体(例如，人源化变体、嵌合变体或亲和力成熟的变体)。能够产生示例性UCHT1的杂交瘤可从Creative Diagnostics,Shirley,NY,USA获得，并分配了目录号CSC-H3068。
如本文所用，短语“四聚体抗体复合物”或“TAC”是指包含充当第一激动剂和第二激动剂的两种抗体的蛋白质复合物，所述第一激动剂和第二激动剂通过一个或两个接头抗体连接，所述接头抗体与充当第一激动剂和第二激动剂的抗体结合。接头抗体可以结合激动剂抗体的恒定区，并且在恒定区具有不同同种型的情况下，也可以使用具有用于每种同种型的一个结合区的双特异性抗体。对这些复合物的支持也可以在美国专利号4,868,109中找到，其以引用的方式整体并入本文。在其他实施方案中，充当第一配体和第二配体的抗体或其抗原结合片段可以通过一个或多个接头分子共价结合或非共价结合。此类接头分子的非限制性实例包括亲和素或链霉亲和素，它们可用于连接生物素化抗体，诸如在Fc区具有生物素部分的抗体。在另外的实施方案中，四聚体抗体复合物可以用作复合物混合物。这包括使用多于一种在复合物混合物中复合物，其中整个混合物的复合物可以接触多于两种不同的配体。
如本文所用，短语“RNA引导的核酸酶”是指基于天然存在的II型CRISPR-Cas系统的核酸/蛋白质复合物，其是可用于进行靶向基因组编辑的可编程内切核酸酶。RNA引导的核酸酶由两种组分组成：短的约100个核苷酸的指导RNA(gRNA)，在其5'末端使用20个可变核苷酸与靶基因组DNA序列进行碱基配对，以及切割靶DNA的核酸酶，例如Cas9核酸内切酶。
如本文所用，术语“Cas9”是指CRISPR相关蛋白9，该蛋白在某些细菌对DNA病毒的免疫防御中起重要作用，并在遗传工程应用中大量使用。Cas9是RNA引导的DNA核酸内切酶，与酿脓链球菌中的CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)适应性免疫系统相关联。Cas9可以通过检查与指导RNA(gRNA)互补的位点来查询DNA节段。如果DNA底物与gRNA互补，那么Cas9会切割DNA。因为Cas9的靶向特异性源于gRNA:DNA的互补性，而不是对蛋白质本身的修饰(像TALEN和锌指)，所以工程化Cas9以靶向新的DNA是直接的。结合但不切割同源DNA的Cas9版本可用于将转录激活物或阻遏物定位到特定DNA序列，以控制转录的活化和阻遏。天然Cas9需要由两个不同的RNA缔合构成的指导RNA，即CRISPR RNA(crRNA)和反式激活crRNA(tracrRNA)。Cas9靶向已通过嵌合单指导RNA的工程化得到简化。
如本文所用，短语“失活Cas9(dead Cas9)”或“dCas9”是指Cas9核酸内切酶失活，它是Cas9的突变形式，其核酸内切酶活性通过其核酸内切酶结构域中的点突变而被去除。与其未突变形式相似，dCas9与gRNA一起用于CRISPR系统，以靶向与gRNA互补的特定基因或核苷酸，所述gRNA带有允许与Cas9结合的PAM序列。Cas9通常具有2个核酸内切酶结构域，称为RuvC和HNH结构域。点突变D10A和H840A改变了核酸内切酶活性的两个重要残基，最终导致其失活。尽管dCas9缺乏核酸内切酶活性，但它仍然能够与其指导RNA和靶DNA链结合，因为这种结合是由其他结构域管理的。如果gRNA以阻止转录因子和RNA聚合酶访问DNA的方式定位dCas9，仅此一项通常足以减弱(如果不是完全阻断)靶基因的转录。然而，也可以采用这种结合DNA的能力来活化，因为dCas9具有可修饰的区域，通常是可用于附接转录激活物的蛋白质的N末端和C末端。
如本文所用，术语“细胞因子”是指在细胞信号传导中重要的广泛类别的小蛋白(大小约为5-20kDa)。细胞因子是肽，并且不能穿过细胞的脂质双层进入细胞质。已显示细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子，但一般不包括激素或生长因子，尽管在术语上有一些重叠。细胞因子由广泛范围的细胞产生，包括免疫细胞，像巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。细胞因子一般通过与细胞表面受体结合而起作用，并且在免疫应答中尤其重要，因为它们参与调控特定细胞群体的成熟、生长和应答性。
如本文所用，短语“T细胞刺激性细胞因子”是指刺激和/或活化T淋巴细胞的细胞因子。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子是IL-2。
如本文所用，术语“IL-2”(本文也称为“IL2”)是指称为白介素-2的细胞因子和T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式、具有保守氨基酸取代的形式、糖型、生物类似物及其变体。IL-2描述于例如Nelson,J.Immunol.2004,172,3983-88和Malek,Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79中，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。术语IL-2涵盖人、重组形式的IL-2，诸如阿地白介素(PROLEUKIN，可从多个供应商处以每一次性小瓶2200万IU商购获得)，以及由CellGenix,Inc.,Portsmouth,N.H.,USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,East Brunswick,N.J.,USA(目录号CYT-209-b)在商业上供应的重组形式的IL-2和来自其他供应商的其他商业等效物。阿地白介素(des-alanyl-1，丝氨酸-125人IL-2)是一种非糖基化人重组形式的IL-2，分子量大约为15kDa。术语IL-2还涵盖聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL-2前药NKTR-214，可从Nektar Therapeutics,South San Francisco,Calif.,USA获得。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公布号US 2014/0328791 A1和国际专利申请公布号WO 2012/065086 A1中，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。适用于本发明的缀合IL-2的替代形式描述于美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502中，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。适用于本发明的IL-2的制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。人IL2基因由NCBIGene ID 3558鉴定。人IL2基因的示例性核苷酸序列是NCBI参考序列：NG_016779.1。人IL-2多肽的示例性氨基酸序列提供为SEQ ID NO:879。
如本文所用，短语“可溶性单特异性复合物”是指包含两个结合蛋白的复合物，所述结合蛋白彼此直接或间接连接并结合至相同的抗原。所述两个结合蛋白是可溶的，并且不固定在表面、颗粒或珠子上。
此外，根据本公开，可以采用本领域技术范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。此类技术在文献中有充分的解释。参见例如Sambrook,Fritsch和Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(此处为“Sambrook等人,1989”)；DNACloning:A Practical Approach,第I卷和第II卷(D.N.Glover编1985)；OligonucleotideSynthesis(M.J.Gait编1984)；Nucleic Acid Hybridization[B.D.Hames和S.J.Higgins编(1985)]；Transcription And Translation[B.D.Hames和S.J.Higgins,编(1984)]；AnimalCell Culture[R.I.Freshney,编(1986)]；Immobilized Cells And Enzymes[IRL Press,(1986)]；B.Perbal,A Practical Guide To Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。这些参考文献中的每一个都以引用的方式整体并入本文。
除非另外说明，否则本文提供的序列同一性/相似性值是指使用默认参数的BLAST2.0程序套件获得的值(Altschul,等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-402，其以引用的方式整体并入本文)。
如本文所用，“核酸靶向序列”和“核酸结合序列”可互换使用，并且是指结合和/或靶向核酸的序列。
如本文所用，在两个核酸或多肽序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”包括对这两个序列中的残基的提及，当在指定的比较窗口上比对以获得最大对应性时它们是相同的。当序列同一性百分比用于蛋白质的提及时，应认识到不相同的残基位置通常因保守氨基酸取代而不同，其中氨基酸残基被具有相似化学特性(例如，电荷或疏水性)的其他氨基酸残基取代，并且因此不会改变分子的功能特性。如果序列的不同之处在于保守取代，序列同一性百分比可以向上调整以针对取代的保守性质加以校正。因此类保守取代而不同的序列被说成具有“序列相似性”或“相似性”。用于进行这种调整的手段是本领域技术人员公知的。通常，这包括将保守取代评分为部分错配而非完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在给予相同的氨基酸以1分的评分并且给予非保守取代以零分的评分的情况下，给予保守取代以零分与1分之间的评分。例如，根据Meyers和Miller,(1988)ComputerApplic.Biol.Sci.4:11-17的算法计算保守取代的评分，例如，在程序PC/GENE(Intelligenetics,Mountain View,Calif.,USA)中实现。这些参考文献中的每一个都以引用的方式整体并入本文。
如本文所用，“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的值，其中与参考序列(不包含添加或缺失)相比，多核苷酸序列在比较窗口中的部分可以包含添加或缺失(即空位)以对这两个序列进行最佳比对。所述百分比通过以下进行计算：确定两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数以得到匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗口中的位置总数，并且将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
在多核苷酸序列的上下文中，术语“实质同一性”或“实质上相同”意指多核苷酸包含与使用标准参数描述的比对程序中的一个的参考序列相比，具有介于50％-100％之间序列同一性、优选至少50％序列同一性、优选至少60％序列同一性、优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％并且最优选至少95％序列同一性的序列。技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应的同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指序列同一性介于55％-100％之间，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，并且最优选至少95％。
I.肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)
肿瘤浸润淋巴细胞或TIL是最初作为白细胞获得的细胞群体，这些白细胞已离开受试者的血流并迁移到肿瘤中。TIL包括但不限于CD8+细胞毒性T细胞(淋巴细胞)、Th1和Th17 CD4+ T细胞以及自然杀伤(NK)细胞。TIL包括原代和次代TIL两者。“原代TIL”是从本文概述的患者组织样品中获得的那些(有时称为“新鲜收获的”)，并且“次代TIL”是如本文所讨论的已经扩增或增殖的任何TIL细胞群体。
TIL通常可以使用细胞表面标志物在生化上定义，或者通过其浸润肿瘤并影响治疗的能力在功能上定义。TIL一般可分类为表达以下一种或多种生物标志物：CD4、CD8、TCRαβ、TCRγδ、CD27、CD28、CD56、CCR7、CD45RA、CD45RO、CD95、PD-1和CD25。另外，以及或者，TIL可以通过它们在重新引入患者时浸润实体瘤的能力在功能上定义。TIL还可以效力来表征；例如，如果在TCR刺激时干扰素γ(IFNγ)释放大于约50pg/mL、大于约100pg/mL、大于约150pg/mL或大于约200pg/mL，那么可认为TIL是有效的。
利用通过常规TIL制造方法离体培养的TIL的过继性细胞疗法涉及至少两个步骤，即在前-REP步骤之后有至少一个快速扩增方案(REP)步骤。过继性细胞疗法已导致黑色素瘤患者在宿主免疫抑制后的成功治疗。目前的输注接受参数依赖于TIL组成的读数(例如，CD28、CD8或CD4阳性)以及REP产物的扩增倍数和活力。
实验结果表明，肿瘤特异性T淋巴细胞过继性转移之前的淋巴细胞清除在通过消除调节性T细胞和免疫系统的竞争元件(“细胞因子沉降”)来增强治疗效果方面起着关键作用。因此，本发明的一些实施方案可以在引入本发明的TIL之前对患者使用淋巴细胞清除步骤(有时也称为“免疫抑制调理”)。在一些实施方案中，不使用淋巴清除步骤。
A.TIL的扩增
如本文一般概述的，TIL通常取自患者样品并在移植到患者体内之前进行操纵以扩增其数量。在一些实施方案中，TIL可以如下文所讨论的进行遗传操纵。一般来说，TIL最初是从患者肿瘤样品(“原代TIL”)中获得的，并且然后扩增为更大的群体以进行如本文所述的进一步操纵，任选地冷藏保存和再刺激，并且任选地评价表型和代谢参数作为TIL健康的指示。
可以使用本领域已知的方法获得患者肿瘤样品，一般通过手术切除、穿刺活检或用于获得含有肿瘤和TIL细胞混合物的样品的其他手段。一般来说，肿瘤样品可以来自任何实体瘤，包括原发性肿瘤、侵袭性肿瘤或转移瘤。实体瘤可以是任何癌症类型，包括但不限于膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠和直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、唇癌和口腔癌、肝癌、黑色素瘤、间皮瘤、肺癌、非小细胞癌肺癌、头颈癌、神经母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、非黑色素瘤皮肤癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌、肉瘤、小细胞肺癌和甲状腺癌)。在一些实施方案中，可用的TIL获自恶性黑色素瘤肿瘤，因为据报道这些具有特别高水平的TIL。原发性黑色素瘤肿瘤或其转移瘤可用于获得TIL。
在一些实施方案中，实体瘤是通常不含有囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性的或恶性的。实体瘤癌症是指恶性、赘生性或癌性实体瘤。实体瘤癌症包括但不限于淋巴瘤、肉瘤、乳腺癌(包括三阴性乳腺癌)、胰腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、膀胱癌、肺癌(包括非小细胞肺癌(NSCLC))、脑癌、肾癌、胃癌和皮肤癌(包括但不限于鳞状细胞癌、基底细胞癌和黑色素瘤)。在一些实施方案中，癌症选自宫颈癌、头颈癌(包括例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC))神经母细胞瘤、胶质母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、肝癌、卵巢癌、肉瘤、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、三阴性乳腺癌和非小细胞肺癌。实体瘤的组织结构包括相互依赖的组织区室，包括实质(癌细胞)和支持性基质细胞，所述支持性基质细胞中分散着癌细胞并可以提供支持性微环境。
一旦获得，肿瘤样品通常使用锐器解剖法片段化为从约1至约8mm3或从约0.5至约4mm3的小块，其中约2-3mm3的特别有用。使用酶促肿瘤消化物从这些片段中培养TIL。此类肿瘤消化物可通过在酶培养基(例如，Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640缓冲剂、2mM谷氨酸、10mcg/mL庆大霉素、30单位/mL DNA酶和1.0mg/mL胶原酶)中孵育产生，然后通过机械解离(例如，使用组织解离器)。肿瘤消化物可以通过以下方法来产生：将肿瘤置于酶培养基中并机械解离肿瘤大约1分钟，接着在37℃、5％CO2中孵育30分钟，然后在前述条件下重复机械解离和孵育循环直到只有小组织块存在。在此过程结束时，如果细胞悬浮液中含有大量红细胞或死细胞，那么可以使用FICOLL支化亲水多糖进行密度梯度分离以去除这些细胞。可以使用本领域已知的替代方法，诸如在美国专利申请公布号2012/0244133 A1中描述的那些，其公开内容以引用的方式整体并入本文。前述方法中的任一种可用于本文所述的实施方案中的任一种，用于扩增TIL的方法或治疗癌症的方法。
一般来说，收获的细胞悬浮液称为“原代细胞群体”或“新鲜收获的”细胞群体。在一些实施方案中，片段化包括物理片段化，包括例如解剖以及消化。在一些实施方案中，片段化是物理片段化。在一些实施方案中，片段化是通过解剖进行的。在一些实施方案中，片段化是通过消化进行的。在一些实施方案中，TIL可以从酶促肿瘤消化物和获自患者的肿瘤片段中进行最初培养。
在一些实施方案中，其中肿瘤是实体瘤，在获得肿瘤样品后肿瘤经历物理片段化。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之前。在一些实施方案中，片段化发生在冷冻保存之后。在一些实施方案中，片段化发生在获得肿瘤之后并且不存在任何冷冻保存。在一些实施方案中，肿瘤被片段化并且在每个容器中放置10、20、30、40或更多个片段或块用于第一次扩增。在一些实施方案中，肿瘤被片段化并且在每个容器中放置30或40个片段或块用于第一次扩增。在一些实施方案中，肿瘤被片段化并且在每个容器中放置40个片段或块用于第一次扩增。在一些实施方案中，多片段包含约4至约50个片段，其中每个片段具有约27mm3的体积。在一些实施方案中，多片段包含约30至约60个片段，总体积为约1300mm3至约1500mm3。在一些实施方案中，多片段包含约50个片段，总体积为约1350mm3。在一些实施方案中，多片段包含约50个片段，总质量为约1克至约1.5克。在一些实施方案中，多片段包含约4个片段。
在一些实施方案中，TIL获自肿瘤片段。在一些实施方案中，肿瘤片段通过锐器解剖法获得。在一些实施方案中，肿瘤片段介于约1mm3与10mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段在约1mm3与8mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段在约0.5mm3与4mm3之间。在一些实施方案中，肿瘤片段为约1mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约2mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约3mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约4mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约5mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约6mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约7mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约8mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约9mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段为约10mm3。
在一些实施方案中，TIL获自肿瘤消化物。在一些实施方案中，肿瘤消化物通过在酶培养基中孵育产生，例如但不限于RPMI 1640、2mM GlutaMAX、10mg/mL庆大霉素、30U/mLDNA酶和1.0mg/mL胶原酶，然后进行机械解离(GentleMACS,Miltenyi Biotec,Auburn,Calif.)。将肿瘤放置于酶培养基中后，可将肿瘤机械解离大约1分钟。然后可以将溶液在37℃、5％CO2中孵育30分钟，并且可以然后再次机械破坏大约1分钟。在37℃、5％CO2中再次孵育30分钟后，可以将肿瘤第三次机械破坏大约1分钟。在一些实施方案中，在第三次机械破坏之后如果存在大块组织，那么可以对样品施加一次或两次另外的机械解离，在37℃、5％CO2中进行或不进行另外的30分钟孵育。在一些实施方案中，在最终孵育结束时如果细胞悬浮液中含有大量红细胞或死细胞，那么可以使用FICOLL进行密度梯度分离以去除这些细胞。
在一些实施方案中，细胞可任选地在样品收获后冷冻或冷藏保存，并且在进入扩增阶段之前冷冻保存。
1.TIL扩增的常规方法概述
在活化和扩增TIL的常规方法中，除了使用饲养细胞之外，还采用了多步方法。该多步方法包括在单独的前-REP步骤后的至少一个快速扩增方案(REP)步骤。
a常规多步TIL制造中的第一次扩增步骤：前-REP
常规多步TIL制造方法从前-REP或第一次扩增开始。一般来说，前-REP使用已被片段化和/或酶消化的肿瘤样品开始，并向其中添加IL-2以减缓细胞因子驱动的肿瘤样品中的TIL生长。一般来说，IL-2是添加到前-REP中的唯一细胞因子或免疫调节剂。前-REP或第一次扩增步骤可能需要介于2周与几个月之间的时间。前-REP可以从获得年轻TIL开始，所述年轻TIL在施用于受试者/患者时能够增加复制循环，并且因此可以比较老的TIL(即，在向受试者/患者施用前进一步经历了更多轮复制的TIL)提供另外的治疗益处。
在一些实施方案中，在前-REP期间肿瘤组织或来自肿瘤组织的细胞在标准实验室培养基(包括但不限于RPMI)中生长，并用诸如经辐照的饲养细胞和抗CD3抗体的试剂处理以实现所需的效果，诸如增加TIL的数量和/或富集含有所需细胞表面标志物或其他结构性、生化或功能性特征的细胞群体。前-REP可以使用实验室级试剂(假设实验室级试剂在之后的REP阶段被稀释)，使得更容易并入替代策略来提高TIL生产。因此，在一些实施方案中，所公开的TLR激动剂和/或肽或肽模拟物可以在前-REP阶段包括在培养基中。在一些实施方案中，前-REP培养物可以包含IL-2。
在一些情况下，在解剖或消化肿瘤片段后，将所得细胞在含有IL-2的培养基中在有利于TIL生长超过肿瘤和其他细胞生长的条件下培养。肿瘤消化物在包含灭活人AB血清和6000IU/mL的IL-2的培养基中的2mL孔中孵育。在一些实例中，添加300-6000IU/mL的IL-2。在前-REP期间，此原代细胞群体培养数天至数月的一段时间，从而产生大量TIL群体，一般为约1×108的大量TIL细胞。
在一些情况下，在前-REP或第一次扩增步骤期间，TIL培养是通过小(约2mm3)肿瘤片段的外植体或通过将酶消化的肿瘤组织的单细胞悬浮液的1x106个活细胞铺种到含有6000IU/ml的IL-2的2ml完全培养基(基于RPMI1640的培养基，补充有10％人血清)中开始的。将培养物维持在5x105至2x106个细胞/ml的细胞浓度下，直到获得几百万个TIL细胞，通常需要2-4周。通过细胞因子分泌测定筛选多个独立培养物，以识别自体肿瘤细胞(如果有)和HLA-A2+肿瘤细胞系。然后将表现出最高细胞因子分泌的两到六个独立TIL培养物在具有6000IU/ml IL-2的完全培养基中进一步扩增，直到细胞数超过5x107个细胞(这个细胞数通常实现于肿瘤切除后3-6周)。
在一些情况下，前-REP期间的第一次扩增在封闭系统生物反应器，诸如G-REX-10或G-REX-100中进行。
在将遗传修饰的TIL用于治疗的情况下，第一个TIL群体(也称为大量TIL群体)可以在REP步骤中的第二次扩增之前进行遗传修饰。
在包含前-REP步骤的常规方法中，一旦TIL在IL-2存在下经历扩增并且达到开始REP所需的适当细胞数，或已经历了预定时间段的前-REP，就会产生前-REP和REP之间的分界。在各种实施方案中，根据所使用的制造方案，当获得的TIL的数量是1x106、10x106、4x106或40x106个细胞时，可以完成前-REP。在另一个实施方案中，当达到的培养持续时间为3至14天或从发生片段化以来达到9至14天时，可以完成前-REP。然后，TIL可以直接冷藏保存以供进一步使用，或者转移到REP。
在一些情况下，从前-REP或第一次扩增步骤中获得的TIL会被储存起来，直到进行表型选择。在一些情况下，从第一次扩增获得的TIL不会被储存，而是直接进行第二次扩增或REP步骤。在一些情况下，从前-REP步骤获得的TIL在第一次扩增后与第二次扩增或REP步骤之前不进行冷藏保存。
b.常规多步TIL制造中的第二次和后续扩增步骤：REP
在常规多步TIL制造中，在一些情况下，TIL细胞群体在收获后在数量上扩增并开始大量过程，即前-REP。这种进一步的扩增被称为第二次扩增，其可以包括在本领域中一般称为快速扩增方案(REP)的扩增过程。第二次扩增或REP一般在气体可渗透容器中使用包含多种组分的培养基完成，所述组分包括饲养细胞、细胞因子来源和抗CD3抗体。在一些情况下，可以使用本领域技术人员已知的任何TIL烧瓶或容器进行第二次扩增或REP，并且可以进行7-14天或更长时间。
在一些情况下，可以使用本领域已知的方法在气体可渗透容器中进行第二次扩增或REP。例如，可以在白介素2(IL-2)存在下使用非特异性T细胞受体刺激快速扩增TIL。非特异性T细胞受体刺激物可以包括例如抗CD3抗体，诸如约30ng/ml OKT3、小鼠单克隆抗CD3抗体(可从Ortho-McNeil，Raritan，N.J.或Miltenyi Biotech,Auburn,Calif.商购获得)或UCHT-1(可从BioLegend,San Diego,Calif.,USA商购获得)。通过在第二次扩增期间包括一种或多种癌症抗原，包括其抗原性部分(诸如表位)，TIL可以扩增以在体外诱导TIL的进一步刺激，所述抗原可以任选地在T细胞生长因子，诸如300IU/mL IL-2存在下，任选地从载体(诸如人白细胞抗原A2(HLA-A2)结合肽，例如0.3μM MART-1:26-35(27L)或gpl 00:209-217(210M))表达。其他合适的抗原可以包括例如NY-ESO-1、TRP-1、TRP-2、酪氨酸酶癌抗原、MAGE-A3、SSX-2和VEGFR2，或其抗原部分。TIL也可以通过用脉冲到表达HLA-A2的抗原呈递细胞上的相同癌症抗原再刺激来快速扩增。或者，TIL可以进一步用例如辐照的自体淋巴细胞或辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2再刺激。在一些实施方案中，再刺激作为第二次扩增的一部分发生。在一些实施方案中，第二次扩增在辐照的自体淋巴细胞或辐照的HLA-A2+同种异体淋巴细胞和IL-2存在下发生。
在一些情况下，第二次扩增或REP可以在包含IL-2、OKT-3和抗原呈递饲养细胞的补充细胞培养基中进行。在一些情况下，抗原呈递饲养细胞(APC)是PBMC(外周血单核细胞)。在一些情况下，快速扩增和/或第二次扩增中TIL与PBMC和/或抗原呈递细胞的比率为1比25和1比500。在一些情况下，REP和/或第二次扩增在烧瓶中进行，其中大量TIL与100或200倍过量的灭活饲养细胞、30mg/mL OKT3抗CD3抗体和3000IU/mL IL-2在150ml培养基中混合。完成培养基更换(一般用新鲜培养基通过气体交换(respiration)更换1/2或2/3的培养基)，直到细胞转移到替代生长室。替代生长室包括G-REX烧瓶和气体可渗透容器。
在一些情况下，进行第二次扩增或REP，并且还包括选择TIL以获得优异的肿瘤反应性的步骤。可以使用本领域已知的任何选择方法。例如，美国专利申请公布号2016/0010058A1中描述的方法可用于选择TIL以获得优异的肿瘤反应性，其公开内容以引用的方式整体并入本文。任选地，可以使用本领域已知的标准测定在第二次扩增(包括称为REP扩增的扩增)之后进行细胞活力测定。例如，可以对大量TIL样品进行台盼蓝排除测定，其选择性地标记死细胞并允许进行活力评估。在一些情况下，可以使用Cellometer K2自动细胞计数器(Nexcelom Bioscience，Lawrence，Mass)对TIL样品进行计数和活力测定。
在一些情况下，除了第二次扩增之外，还可以执行进一步的扩增步骤。
c.饲养细胞
在许多情况下，常规多步基于饲养细胞的TIL扩增方法中使用的饲养细胞是从健康献血者的标准全血单位获得的外周血单核细胞(PBMC)。使用标准方法，诸如FICOLL-Paque梯度分离获得PBMC。一般来说，同种异体PBMC通过辐照或热处理被灭活，并用于REP程序。在一些情况下，如果第14天的活细胞总数少于REP第0天和/或第二次扩增第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数，那么认为PBMC不能复制并被接受用于TIL扩增程序。
在一些情况下，如果在OKT3和IL-2存在下培养的第7天和第14天的活细胞总数没有比在REP第0天和/或第二次扩增第0天(即第二次扩增的开始日)投入培养的初始活细胞数增加，那么认为PBMC不能复制并被接受用于本文所述的TIL扩增程序。在一些情况下，PBMC在30ng/ml OKT3抗体和3000IU/ml IL-2的存在下培养。
在一些情况下，第二次扩增或REP程序需要大约2.5×109个饲养细胞与介于12.5×106个TIL和100×106个TIL之间的比率。
在第二次扩增步骤或REP之后，可以收获细胞。在一些实施方案中，在一个、两个、三个、四个或更多个扩增步骤之后收获TIL。TIL可以任何适当的和无菌的方式收获，包括例如通过离心。用于TIL收获的方法在本领域中是熟知的，并且任何此类已知的方法可以与本方法一起采用。
2.扩增和活化TIL的新一步法
上述TIL的常规多步饲养细胞依赖性扩增和活化方法需要多步骤和饲养细胞；这两个要求都使常规方法既耗时又昂贵。需要使用过继性转移TIL进行免疫治疗的患者通常预后非常差，并且快速地用扩增和分化的TIL群体进行治疗可能构成生存或死亡之间的差异。
在一个实例中，扩增的持续时间具有挑战性，因为需要此类治疗的患者通常病情危重，并且延迟可能会导致在施用治疗之前死亡。通过本文所述的方法缩短TIL扩增所需持续时间的能力提供了优于常规和冗长方法的显著优势。此外，经遗传工程化以产生如本文所述的增加的效应子功能的TIL是有利的，因为它们能够更快地增殖，从而减少扩增时间，并且更有效地杀伤肿瘤细胞。
此外，至少有几个原因，对饲养细胞的依赖提出了挑战。首先，很难获得活饲养细胞群体，因为这些细胞是从3至5个同种异体供体中收集的。饲养细胞的异质来源使其使用不可标准化，因为每个供体细胞群体扩增TIL的能力都必须单独合格。此外，由于饲养细胞的固有可变性，使用饲养细胞的TIL扩增变得不太可重复和可预测。其次，当使用饲养细胞时，TIL只能在REP阶段之前或之后，而不是在期间被工程化或遗传修饰，因为TIL不能在饲养细胞存在下被工程化。第三，在涉及快速扩增方案(REP)的TIL制造方法中，REP不能缩短，因为在饲养细胞死亡之前无法使用扩增的TIL群体。第四，使用饲养细胞刺激TIL会导致无法洗除和/或去除刺激剂。因此，在一些情况下，常规方法的前-REP和REP步骤未能产生所需数量的TIL。出于以上描述的至少三个原因，在一些实施方案中，需要消除对饲养细胞的依赖，这是本文已经实现并公开的。消除饲养细胞能够增强对TIL扩增过程的控制。例如，当达到所需的TIL数量时，可以停止TIL扩增过程。
在本文所公开的方法的一个方面，常规TIL扩增方案的前-REP步骤被完全跳过。令人惊讶的是，在这个不使用前-REP步骤的单一扩增步骤中，即在一步TIL活化和扩增方法中，可以在21天或更短的时间内获得大量的TIL。在一些实施方案中，使用依赖饲养细胞的一步REP样方法扩增TIL。在一些实施方案中，在一步法中使用颗粒诸如Dynabead扩增TIL。在一些实施方案中，使用诸如来自Stemcell的四聚体抗体复合物(TAC)，以一步法扩增TIL。在一些实施方案中，在一步法中使用诸如来自Miltenyi Biotec(Transact)的纳米基质扩增TIL。在一些实施方案中，在一步TIL扩增过程中对TIL进行工程化或遗传修饰。
在一些实施方案中，TIL来自先前使用上述常规前-REP失败的情况。在某些实施方案中，前-REP失败是使用前-REP方案在23天内未能将分离自人受试者的TIL扩增到4×107个细胞。在其他实施方案中，前-REP失败是未能将分离自人受试者的TIL扩增至超过原始数量的100倍。在其他实施方案中，前-REP失败是使用前-REP方案未能将分离自人受试者的TIL扩增到1x106或1x107个细胞。在某些实施方案中，本文提供的方法能够挽救前-REP失败，即从经历前-REP失败的样品中扩增细胞。
在本文公开的方法的一个方面，在分解的肿瘤样品中扩增TIL群体的方法包括在培养基中培养分解的肿瘤样品，其中TIL与T细胞受体(TCR)激动剂、CD28激动剂和/或T细胞刺激性细胞因子接触。在一些实施方案中，TIL与4-1BB激动剂接触。
在一些实施方案中，分解的肿瘤样品包含大小为0.5至4mm3的肿瘤片段。在一些实施方案中，肿瘤片段的大小为0.5至1mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段的大小为1至1.5mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段的大小为1.5至2mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段的大小为2至2.5mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段的大小为2.5至3mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段的大小为3至3.5mm3。在一些实施方案中，肿瘤片段的大小为3.5至4mm3。在一些实施方案中，分解的肿瘤样品包含消化的肿瘤片段。
在一些实施方案中，培养基以1-2天、2-3天、3-4天、4-5天或5-6天范围的时间间隔补充T细胞刺激性细胞因子。在一些实施方案中，时间间隔为1天。在一些实施方案中，时间间隔为2天。在一些实施方案中，时间间隔为3天。在一些实施方案中，时间间隔为4天。在一些实施方案中，时间间隔为5天。在一些实施方案中，时间间隔为6天。
在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为10U/ml至7,000U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为100U/ml至200U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为200U/ml至300U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为300U/ml至400U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为400U/ml至500U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为500U/ml至600U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为600U/ml至700U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为700U/ml至800U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为800U/ml至900U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为900U/ml至1000U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为1,000U/ml至1,500U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为1,500U/ml至2,000U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为2,000U/ml至2,500U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为2,500U/ml至3,000U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为3,000U/ml至3,500U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为3,500U/ml至4,000U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为4,000U/ml至4,500U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为4,500U/ml至5,000U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为5,000U/ml至5,500U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为5,500U/ml至6,000U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为6,000U/ml至6,500U/ml。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为6,500U/ml至7,000U/ml。
T细胞刺激性细胞因子可以是能有效刺激T细胞的任何细胞因子。在一些实施方案中，T细胞刺激性细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，本文公开的方法还包括使分解的肿瘤样品和/或TIL群体与细胞因子IL-2接触。在一些实施方案中，TIL与细胞因子IL-2每隔一天接触。在一些实施方案中，TIL与细胞因子IL-2以2、3、4、5或6天的时间间隔接触。在一些实施方案中，TIL与细胞因子IL-2以2天的时间间隔接触。在一些实施方案中，TIL与细胞因子IL-2以3天的时间间隔接触。在一些实施方案中，TIL与细胞因子IL-2以4天的时间间隔接触。在一些实施方案中，TIL与细胞因子IL-2以5天的时间间隔接触。在一些实施方案中，TIL与细胞因子IL-2以6天的时间间隔接触。
在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为100U/ml至7,000U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为100U/ml至200U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为200U/ml至300U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为300U/ml至400U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为400U/ml至500U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为500U/ml至600U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为600U/ml至700U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为700U/ml至800U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为800U/ml至900U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为900U/ml至1000U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为1,000U/ml至1,500U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为1,500U/ml至2,000U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为2,000U/ml至2,500U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为2,500U/ml至3,000U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为3,000U/ml至3,500U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为3,500U/ml至4,000U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为4,000U/ml至4,500U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为4,500U/ml至5,000U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为5,000U/ml至5,500U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为5,500U/ml至6,000U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为6,000U/ml至6,500U/ml。在一些实施方案中，细胞因子IL-2的最终浓度为6,500U/ml至7,000U/ml。
在一些实施方案中，培养基的组分保持不变。在一些实施方案中，培养基的30％至99％以1-2天、2-3天、3-4天、4-5天或5-6天范围的时间间隔进行更换。在一些实施方案中，时间间隔为1天。在一些实施方案中，时间间隔为2天。在一些实施方案中，时间间隔为3天。在一些实施方案中，时间间隔为4天。在一些实施方案中，时间间隔为5天。在一些实施方案中，时间间隔为6天。
a.饲养细胞
在一些实施方案中，培养基包含饲养细胞。在一些实施方案中，饲养细胞是外周血单核细胞(PBMC)。在一些实施方案中，饲养细胞是抗原呈递细胞(APC)。在一些实施方案中，饲养细胞表达T细胞受体(TCR)激动剂、CD28激动剂和/或4-1BB激动剂。在一些实施方案中，饲养细胞表达41BB激动剂，如Bartkowiak和Curran,Front Oncol,5:117(2015)中所述，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，4-1BB激动剂是4-1BB配体。在一些实施方案中，T细胞受体(TCR)激动剂、CD28激动剂和/或4-1BB激动剂在饲养细胞的表面上表达。在一些实施方案中，TCR激动剂是CD3激动剂。在一些实施方案中，CD3激动剂是OKT3或UCHT。在一些实施方案中，CD28激动剂是CD80或CD86。在一些实施方案中，CD28激动剂是CD86。在一些实施方案中，CD28激动剂可溶于培养基。在一些实施方案中，饲养细胞是APC。在一些实施方案中，APC是K562细胞。在一些实施方案中，APC被修饰以表达上述的蛋白质。
在一些实施方案中，TIL被遗传修饰以减少一个或多个基因的表达。下文提供了关于这些遗传修饰的另外的公开内容。
在一些实施方案中，K562细胞被工程化以表达OKT3“aAPC-OKT3”。在一些实施方案中，工程化的细胞在使用前被辐照(例如，15,000拉德)。在一些实施方案中，K562细胞被工程化以表达OKT3和CD86“aAPC-OKT3-CD86”。在一些实施方案中，工程化的细胞在使用前被辐照(例如，15,000拉德)。在一些情况下，使用可溶性活化剂或人工抗原呈递细胞(aAPC)扩增前-REP失败的TIL。
在一些实施方案中，饲养细胞被遗传修饰以表达T细胞刺激性细胞因子。在一些实施方案中，饲养细胞被遗传修饰以表达的T细胞刺激性细胞因子是IL-2。在一些实施方案中，培养基不包含饲养细胞。
在一些实施方案中，使用T细胞刺激性细胞因子和饲养细胞扩增TIL。在一些实施方案中，使用T细胞刺激性细胞因子而不使用饲养细胞来扩增TIL。
b.纳米基质
小于1μm或500nm的纳米基质具有可移动的基质并附接到能够刺激T细胞刺激剂或激动剂。在某些实施方案中，与相同尺寸的珠子或微球相比，小于500nm的基质没有固相表面(导致柔性和可移动相)。纳米基质就像由可移动的聚合材料组成的网格或网。在某些实施方案中，聚合物材料是葡聚糖。在某些实施方案中，纳米基质是可塑的，导致其能够接近靶细胞例如T细胞的细胞表面膜。因此，纳米基质以其附接在可移动基质上的激动剂与细胞表面上的各个靶标(例如受体)结合，由此基质的柔性允许与结合配偶体的最佳相互作用。纳米基质的形状在某种程度上适应靶细胞表面，从而延伸纳米基质与靶细胞之间的接触表面。由于1至500nm的基质尺寸，它们太小以至于不能在细胞中引起扰动，即纳米基质在改变细胞功能方面是生物学惰性的。如果使用尺寸为1μm或更大的珠子或微球，那么此类由直接的细胞/珠子接触引发的干扰是有问题的。此外，优选地，由于组合物由可生物降解的聚合物材料(例如葡聚糖的聚合物)组成，纳米基质是可生物降解的并且对细胞无毒。其结果是，纳米基质在改变细胞功能方面是完全生物学惰性的实体但其是可生物降解的。因此，在将纳米基质与T细胞接触用于刺激和增殖后不需要将其去除。在这些细胞随后的分析、实验和/或临床应用中没有因为活化的T细胞组合物中存在纳米基质而出现干扰效应。
此外，由于其是可溶的或胶体的，未结合的纳米基质在T细胞刺激过程后可以容易地通过重复洗涤步骤稀释至低于T细胞活化阈值的有效浓度。
纳米基质的可移动基质上附接有一种或多种向T细胞提供活化信号的刺激性激动剂，从而活化并诱导T细胞增殖。激动剂是能够结合细胞表面结构并诱导细胞的多克隆刺激的分子。与纳米基质的可移动基质连接的剂的一个实例是抗CD3单克隆抗体(mAb)与共刺激蛋白(诸如抗CD28 mAb)的组合。
纳米基质能够通过无菌过滤器的特征允许其被添加到配备有或可配备无菌过滤器的封闭细胞培养系统中，例如细胞培养袋(Miltenyi Biotec、Baxter、CellGenics)、G-Rex装置(Wilson Wolf manufacturing)、WAVE生物反应器(GE Healthcare)、量子细胞扩增系统(Terumo BCT)、
Figure BDA0003756012870000461
Prodigy(Miltenyi Biotec，参见Apel等人2013,Chemie Ingenieur Technik 85:103-110，其以引用的方式整体并入本文)。可以从袋或小瓶(连接到排气小瓶适配器)中用注射器推注纳米基质通过过滤器或用泵拉动纳米基质通过过滤器从而将纳米基质添加到封闭细胞培养系统中。
接触可以发生在例如在体外任何能够容纳细胞的容器中，优选在无菌环境中。此类容器可以是例如培养瓶、培养袋、生物反应器或可用于细胞生长的任何装置(例如WO2009072003的样品处理系统，即
Figure BDA0003756012870000471
Prodigy系统，其以引用的方式整体并入本文)。
本发明中所用的纳米基质可以是其中至少一种第一剂和一种第二剂附接到同一可移动基质的纳米基质。将这种纳米基质与T细胞接触，从而活化并诱导T细胞增殖。附接到同一柔性基质的第一剂和第二剂的比率可以在100:1至1:100的范围内，优选介于10:1与1:10之间，最优选介于2:1与1:2之间。
此外，本发明的纳米基质可以是其中至少一种第一激动剂和一种第二激动剂附接到单独的可移动基质的纳米基质。将这些纳米基质的混合物与T细胞接触，从而活化并诱导T细胞增殖。附接有第一剂的可移动基质和附接有第二剂的可移动基质的比率和/或浓度可以根据所用T细胞种类和/或所用的剂而改变以产生最佳刺激结果。通过滴定附接有第一剂的可移动基质和附接有第二剂的可移动基质的各种浓度和比率，促进特定T细胞亚群活化条件的优化。
纳米基质可以通过本领域已知的各种方法制备，包括溶剂蒸发、相分离、喷雾干燥或低温溶剂萃取。选择的方法应当简单、可重复的且可规模化。产生的纳米基质应当是自由流动的并且不会聚集以产生均匀的可注射悬浮液。纳米基质还应当是无菌的。这可以通过例如过滤、最终灭菌步骤和/或通过无菌处理来确保。纳米基质的制备如实施例1中所述。
如本文所用，术语“可移动聚合物链的基质”和“可移动基质”具有可互换的含义。术语“可移动”是指有机生物聚合物诸如葡聚糖或纳米颗粒上的其他生物聚合物的常见且充分描述的特征(参见Bertholon等人Langmuir 2006，第45485-5490页，其以引用的方式整体并入本文)。这些聚合物包括可移动的(能动的)链，优先高度可移动的(能动的)链，因此该基质的特征是不存在作为刺激剂(诸如抗体)的附接点固体表面，这与目前使用的通常具有非柔性、僵硬表面的珠子或微球形成强烈对比。因此，包含可移动聚合物链基质的纳米基质是柔性的并且可根据细胞表面的形式进行调节。此外，因此，该纳米基质是其中在水溶液中纳米基质总体积的大部分(即，大于50％)、优选大于80％且更优选大于90％且最优选大于99％由可移动的聚合物链组成的纳米基质。
偶联有一种或多种刺激剂的纳米基质与待刺激的细胞之间的接触受益于此纳米基质不具有允许纳米基质接近细胞表面的固定、僵硬或刚性表面这一事实。在某些实施方案中，纳米基质由亲水性聚合物链构成，由于链的水合，其在水溶液中获得最大的流动性。可移动基质是纳米基质的唯一或至少主要组分，与附接于其上的剂无关。
激动剂可以通过本领域已知和可用的多种方法附接或偶联到可移动基质上。附接可以是共价的或非共价的、静电的或疏水的，并且可以通过多种附接手段来实现，包括例如化学、机械、酶促或其中的剂能够刺激细胞的其他手段。例如，可以首先将针对细胞表面结构的抗体附接到基质上，或者可以将亲和素或链霉亲和素附接到基质上以结合生物素化剂。可以将针对细胞表面结构的抗体直接或间接(例如，通过抗同种型抗体)附接到基质上。另一实例包括使用附接到基质的蛋白质A或蛋白质G，或其他非特异性抗体结合分子以结合抗体。或者，可以通过化学手段将剂连接到基质上，诸如与基质交联。
如本文所用的短语“生物学惰性”是指纳米基质的特性，即对活细胞无毒并且不会由于其尺寸小而通过与细胞表面的物理相互作用诱导细胞功能的强烈改变，除了所附接的配体或抗体的特异性配体/受体触发功能。此外，纳米基质可以是可生物降解的，例如被酶活性降解或被吞噬细胞清除。可生物降解材料可以来源于在生物流体例如细胞培养基和血液中降解的天然或合成材料。降解可以使用酶促手段发生或可以在不使用酶促手段的情况下发生。可生物降解的材料在几天、几周或几个月内降解，这可能取决于其暴露的环境条件。可生物降解的材料对活细胞和人体应该是无毒且非抗原性的。降解产物必须产生无毒的副产物。在生物学惰性的上下文中的一个重要方面是纳米基质不会诱导标记细胞的结构、功能、活性状态或活力的强烈改变这一事实，即它不会引起细胞的扰动并且不会干扰经刺激的细胞随后的实验和治疗应用。由于纳米基质非常小，即纳米级范围，并且具有紧靠到细胞表面而不改变细胞表面形状或对细胞施加强大的剪切力(例如导致膜破裂)的纳米基质的性质，细胞的机械或化学刺激降低了。
在一些实施方案中，TCR激动剂和/或CD28激动剂连接到聚合物链基质的胶体悬浮液的纳米基质，其中每个基质在其最大维度上的长度为1至500nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为1至50nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为50至100nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为100至150nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为150至200nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为200至250nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为250至300nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为300至350nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为350至400nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为400至450nm。在一些实施方案中，纳米基质在其最大维度上的长度为450至500nm。
在一些实施方案中，TCR激动剂和CD28激动剂附接到相同的聚合物链。在一些实施方案中，TCR激动剂和CD28激动剂附接到不同的聚合物链。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约5μg至约10μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约10μg至约15μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约15μg至约20μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约20μg至约25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约25μg至约30μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约30μg至约35μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约35μg至约40μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约40μg至约45μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂或其片段以每mg纳米基质约45μg至约50μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，TCR激动剂是CD3激动剂。
在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约5μg至约10μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约10μg至约15μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约15μg至约20μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约20μg至约25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约25μg至约30μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约30μg至约35μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约35μg至约40μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约40μg至约45μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约45μg至约50μg附接到纳米基质。
在一些实施方案中，纳米基质还包含嵌入在聚合物链基质之间或之内的磁性、顺磁性或超顺磁性纳米晶体。在一些实施方案中，聚合物链基质包含葡聚糖聚合物。在一些实施方案中，聚合物链是胶体聚合物链。
在一些实施方案中，纳米基质的体积与分解的肿瘤样品中TIL的体积的比率大于或等于1:5。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:10。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:25。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:50。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:100。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:200。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:300。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:400。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:500。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:600。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:700。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:800。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:900。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:1,000。
在一些实施方案中，基质的数量与分解的肿瘤样品中的TIL的比率大于或等于1:500。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:500至1:750。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:750至1:1,000。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:1,000至1:1,250。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:1,250至1:1,500。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:1,500至1:1,750。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:1,750至1:2,000。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:2,000至1:2,250。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:2,250至1:2,500。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:2,500至1:2,750。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:2,750至1:3,000。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:3,000至1:3,500。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:3,500至1:4,000。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:4,000至1:5,000。
在一些实施方案中，激动剂是重组激动剂。在一些实施方案中，激动剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，CD3激动剂是OKT3抗体或UCHT1抗体。
在本文公开的方法的另一个方面，用于扩增TIL群体的方法包括使TIL群体与包含聚合物链基质的胶体悬浮液的纳米基质接触，其中所述基质附接到CD3激动剂和CD28激动剂，其中所述纳米基质向TIL群体提供活化信号，从而活化并诱导TIL群体增殖，其中每个基质在其最大维度上的长度为1至500nm，并且其中所述方法不包括在TIL群体扩增期间使用饲养细胞。
在一些实施方案中，与纳米基质接触的TIL群体还包含肿瘤细胞。在一些实施方案中，TIL群体是从受试者中分离的并且与纳米基质接触，在使TIL群体与纳米基质接触之前没有另外的TIL群体的扩增过程。
在一些实施方案中，CD3激动剂和CD28激动剂附接到相同的聚合物链。在一些实施方案中，CD3激动剂和CD28激动剂附接到不同的聚合物链。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约5μg至约10μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约10μg至约15μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约15μg至约20μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约20μg至约25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约25μg至约30μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约30μg至约35μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约35μg至约40μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约40μg至约45μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD3激动剂或其片段以每mg纳米基质约45μg至约50μg附接到纳米基质。
在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约5μg至约10μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约10μg至约15μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约15μg至约20μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约20μg至约25μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约25μg至约30μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约30μg至约35μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约35μg至约40μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约40μg至约45μg附接到纳米基质。在一些实施方案中，CD28激动剂或其片段以每mg纳米基质约45μg至约50μg附接到纳米基质。
在一些实施方案中，纳米基质还包含嵌入在聚合物链基质之间或之内的磁性、顺磁性或超顺磁性纳米晶体。在一些实施方案中，聚合物链基质包含葡聚糖聚合物。在一些实施方案中，聚合物链是胶体聚合物链。
在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:5。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:10。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:25。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:50。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:100。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:200。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:300。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:400。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:500。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:600。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:700。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:800。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:900。在一些实施方案中，纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:1,000。
在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率大于或等于1:500。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:500至1:750。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:750至1:1,000。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:1,000至1:1,250。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:1,250至1:1,500。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:1,500至1:1,750。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:1,750至1:2,000。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:2,000至1:2,250。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:2,250至1:2,500。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:2,500至1:2,750。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:2,750至1:3,000。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:3,000至1:3,500。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:3,500至1:4,000。在一些实施方案中，基质的数量与TIL的比率为1:4,000至1:5,000。
在一些实施方案中，激动剂是重组激动剂。在一些实施方案中，激动剂是抗体。在一些实施方案中，抗体是人源化抗体。在一些实施方案中，CD3激动剂是OKT3抗体或UCHT1抗体。
c.可溶性单特异性复合物
在本文公开的方法的另一个方面，用于扩增TIL群体的方法包括使TIL群体与包含第一、第二和第三可溶性单特异性复合物的组合物接触，其中每个可溶性单特异性复合物包含连接在一起的两个抗体或其片段，其中每个可溶性单特异性复合物的每个抗体或其片段特异性结合至TIL群体上的相同抗原，其中第一可溶性单特异性复合物包含抗CD3抗体，其中第二可溶性单特异性复合物包含抗CD28抗体，并且其中第三可溶性单特异性复合物包含抗CD2抗体，并且所述方法不包括在TIL群体扩增期间使用饲养细胞。
在一些实施方案中，TCR激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD3抗体。在一些实施方案中，CD28激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD28抗体。
在一些实施方案中，培养基包含CD2激动剂。在一些实施方案中，CD2激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD2抗体。
在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为0.2-25μl/ml。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为0.2-1μl/ml。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为1-2μl/ml。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为2-5μl/ml。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为5-10μl/ml。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为10-15μl/ml。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为15-20μl/ml。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物的浓度为20-25μl/ml。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物是四聚体抗体复合物(TAC)。在一些实施方案中，每个TAC包含来自第一种动物物种的两个抗体，所述两个抗体与来自第二物种的两个抗体分子结合，所述第二物种的两个抗体分子特异性结合至来自第一动物物种的抗体的Fc部分。在一些实施方案中，抗CD3抗体是OKT3抗体或UCHT1抗体。在一些实施方案中，可溶性单特异性复合物特别有效地增加中枢记忆T细胞表型。
d.TIL扩增
在一些实施方案中，从初始肿瘤片段化或分解起，TIL扩增长达总共9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天。在一些实施方案中，TIL扩增总共9-25天、9-21天或9-14天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共9天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共10天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共11天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共12天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共13天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共14天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共15天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共16天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共17天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共18天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共19天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共20天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共21天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共22天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共23天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共24天。在一些实施方案中，TIL扩增长达总共25天。
在一些实施方案中，TIL群体扩增500至500,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增500至1,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增1,000至2,500倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增2,500至5,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增5,000至10,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增10,000至20,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增20,000至30,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增30,000至40,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增40,000至50,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增50,000至100,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增100,000至150,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增150,000至200,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增200,000至250,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增250,000至300,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增300,000至350,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增350,000至400,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增400,000至450,000倍。在一些实施方案中，TIL群体扩增450,000至500,000倍。
在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于100与100,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于100与1,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于1,000与2,500个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于2,500与5,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于5,000与7,500个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于7,500与10,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于10,000与20,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于20,000与30,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于30,000与40,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于40,000与50,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于50,000与60,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于60,000与70,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于70,000与80,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于80,000与90,000个TIL之间的初始TIL群体。在一些实施方案中，TIL群体扩增自介于90,000与100,000个TIL之间的初始TIL群体。
在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少150倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少500倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少750倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少1000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少1500倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少2000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少2500倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少3000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少4000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少5000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少6000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少7000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少8000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少9000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第10天扩增至少10,000倍。在一些实施方案中，第10天的这些扩增倍数发生在来自前-REP失败的TIL中。
在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少1,500倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少5,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少7,500倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少10,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少15,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少20,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少25,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少30,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少40,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少50,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少60,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少70,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少80,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少90,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少100,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少110,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少120,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少130,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至少140,000倍。在一些实施方案中，第14天的这些扩增倍数发生在来自前-REP失败的TIL中。
在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多150,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多5,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多7,500倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多10,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多15,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多20,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多25,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多30,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多40,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多50,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多60,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多70,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多80,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多90,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多100,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多110,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多120,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多130,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第14天扩增至多140,000倍。在一些实施方案中，第14天的这些扩增倍数发生在来自前-REP失败的TIL中。
在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少15,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少20,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少25,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少30,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少40,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少50,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少60,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少70,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少80,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少90,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少100,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少110,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少120,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少130,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少140,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少150,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少200,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少300,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至少400,000倍。在一些实施方案中，第21天的这些扩增倍数发生在来自前-REP失败的TIL中。
在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多500,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多20,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多25,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多30,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多40,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多50,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多60,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多70,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多80,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多90,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多100,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多110,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多120,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多130,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多140,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多150,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多200,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多300,000倍。在一些实施方案中，TIL群体在扩增的第21天扩增至多400,000倍。在一些实施方案中，第21天的这些倍数扩增发生在来自前-REP失败的TIL中。
在一些实施方案中，TIL群体的成员被遗传修饰。在一些实施方案中，使用RNA引导的核酸酶对TIL群体进行遗传修饰。在一些实施方案中，使用Cas9和至少一种指导RNA对TIL群体进行遗传修饰。在一些实施方案中，TIL群体的成员被表观遗传修饰。
在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少2％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少3％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少4％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少5％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少6％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少7％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少8％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少9％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少10％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少11％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少12％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少13％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少14％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少15％的扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。
在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中5％至50％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中10％至25％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中5％至10％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中10％至15％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中15至20％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中20至25％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中25至30％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中30至35％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中35至40％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中40至45％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中45至50％的扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。
在一些实施方案中，扩增TIL群体以产生扩增的TIL群体，其具有增加的CD8+细胞丰度。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了10％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了20％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了30％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了40％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了50％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了60％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了70％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了80％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了90％。在一些实施方案中，与起始TIL群体相比，TIL群体在扩增后富集了100％。
在另一个方面，本文公开的本发明涉及一种组合物，其包含通过本文公开的方法中的任一种产生的扩增的TIL群体。
B.扩增TIL的表型特征
在一些情况下，分析扩增的TIL的许多表型标志物的表达，包括本文所述的那些。在一些情况下，标志物选自：TCRα/β、CD57、CD28、CD4、CD27、CD56、CD8a、CD45RA、CD45RO、CD8a、CCR7、CD4、CD3、CD38和HLA-DR。在一些情况下，测量一种或多种调控标志物的表达，即来自以下组：CD137、CD8a、Lag3、CD4、CD3、PD-1、TIM-3、CD69、CD8a、TIGIT、CD4、CD3、KLRG1和CD154。
在一些情况下，记忆标志物是CCR7或CD62L。在一些情况下，也可以使用细胞因子释放测定来评价再刺激的TIL的细胞因子释放。在一些情况下，可以评价TIL响应于OKT3或与自体肿瘤消化物共培养的刺激的干扰素-γ(IFN-γ)分泌。
在一些情况下，评价TIL的各种调控标志物，诸如TCRα/β、CD56、CD27、CD28、CD57、CD45RA、CD45RO、CD25、CD127、CD95、IL-2R、CCR7、CD62L、KLRG1和CD122。
C.TIL的遗传修饰
在一些情况下，TIL被遗传工程化为包括另外的功能，包括但不限于高亲和力T细胞受体(TCR)，例如靶向肿瘤相关抗原诸如MAGE-1、HER2或NY-ESO-1的TCR，或与肿瘤相关细胞表面分子(例如，间皮素)或谱系限制性细胞表面分子(例如，EGFR、CD19或HER2)结合的嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其涵盖包含导致降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的一种或多种基因组修饰的TIL，以及包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统的免疫效应细胞。在一些实施方案中，这些内源基因包括ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。(参见国际公布号WO 2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文。)在一些实施方案中，这些基因包括SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1、NFKBIA。在一些实施方案中，这些基因包括SOCS1和选自PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一种、两种或更多种基因。
本文中，术语“修饰的TIL”涵盖包含通过非天然手段起作用导致降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的一种或多种基因组修饰的TIL，以及包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的非天然存在的基因调控系统的TIL。术语“修饰的TIL”可与术语“工程化的TIL”或“eTILTM”互换使用。
本文中，“未修饰的TIL”或“对照TIL”是指其中基因组未使用外源手段修饰并且不包含外源基因调控系统或包含对照基因调控系统(例如，空载体对照、非靶向gRNA、加扰siRNA等)的细胞或细胞群体。可以对TIL进行的示例性修饰在国际公布号WO 2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421中示出，所述专利以引用的方式整体并入本文。天然存在的具有降低的一种或多种内源基因表达和/或功能的TIL包括在术语未修饰或对照TIL下。
不希望受理论的束缚，认为TIL对肿瘤抗原具有增加的特异性(Radvanyi等人,2012Clin Canc Res 18:6758-6770，以引用的方式整体并入本文)，并且因此可以介导肿瘤抗原特异性免疫应答(例如，对癌细胞的活化、增殖和细胞毒性活性)，从而在不引入外源工程化受体的情况下导致癌细胞破坏(Brudno等人,2018Nat Rev Clin Onc 15:31-46，以引用的方式整体并入本文)。因此，在一些实施方案中，从受试者的肿瘤中分离出TIL，将其进行离体扩增，并再输注到受试者中。在一些实施方案中，修饰TIL以表达对自体肿瘤抗原具有特异性的一种或多种外源受体，将TIL进行离体扩增，并再输注到受试者中。可以使用体内小鼠模型对此类实施方案进行建模，其中小鼠已经移植了表达癌症抗原(例如CD19)的癌细胞系，并且用表达对癌症抗原具有特异性的外源受体的修饰的T细胞治疗。
在一些实施方案中，修饰的TIL包含在内源靶基因的基因组DNA序列中的一个或多个修饰(例如，一个或多个核酸的插入、缺失或突变)，从而导致降低的内源基因的表达和/或功能。此类修饰在本文中称为“失活突变”，而包含失活突变的内源基因称为“修饰的内源靶基因”。在一些实施方案中，失活突变降低或抑制mRNA转录，从而降低编码的mRNA转录物和蛋白质的表达水平。在一些实施方案中，失活突变降低或抑制mRNA翻译，从而降低编码的蛋白的表达水平。在一些实施方案中，失活突变编码与内源蛋白的未修饰(即，野生型)型式(例如，下文所述的显性-负突变体)相比功能降低或改变的修饰的内源蛋白。可以对TIL进行的示例性修饰在国际公布号WO 2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421中示出，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，修饰的TIL包含选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一个、两个或更多个修饰的内源靶基因。在一些实施方案中，修饰的TIL包含修饰的内源靶基因SOCS1和选自PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一个、两个或更多个修饰的内源性靶基因。
在一些实施方案中，修饰的TIL包含在内源靶基因以外的基因组位置处的一种或多种基因组修饰，其导致降低的内源靶基因的表达和/或功能或导致内源蛋白的修饰型式的表达。例如，在一些实施方案中，将编码基因调控系统的多核苷酸序列插入基因组中的一个或多个位置中，从而在基因调控系统表达时降低内源靶基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，将编码内源蛋白的修饰型式的多核苷酸序列插入基因组中的一个或多个位置处，其中与蛋白质的未修饰或野生型型式(例如，下文所述的显性负突变体)相比，蛋白质的修饰型式的功能降低。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含一种或多种修饰的内源靶基因，其中与未修饰的TIL相比，所述一种或多种修饰导致由内源靶基因编码的基因产物(即，mRNA转录物或蛋白质)的表达和/或功能降低。例如，在一些实施方案中，修饰的TIL表现出降低的mRNA转录物表达和/或降低的蛋白质表达。在一些实施方案中，与未修饰的TIL中基因产物的表达相比，修饰的TIL中基因产物的表达降低至少5％。在一些实施方案中，与未修饰的TIL中基因产物的表达相比，修饰的TIL中基因产物的表达降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，与未修饰的TIL中基因产物的表达相比，本文所述的修饰的TIL表现出由多种(例如，两种或更多种)内源靶基因编码的基因产物的表达和/或功能降低。例如，在一些实施方案中，与未修饰的TIL中基因产物的表达相比，修饰的TIL表现出2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因的基因产物的表达和/或功能降低。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其中一种或多种内源靶基因或其部分被缺失(即，“敲除”)，使得修饰的TIL不表达mRNA转录物或蛋白质。在一些实施方案中，修饰的TIL包含多种内源靶基因或其部分的缺失。在一些实施方案中，修饰的TIL包含2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种内源靶基因的缺失。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含一种或多种修饰的内源靶基因，其中与在未修饰的TIL中表达的对应蛋白质(例如，“未修饰的内源蛋白”)的功能相比，对靶DNA序列的一种或多种修饰导致功能降低或改变的蛋白质(例如，“修饰的内源蛋白”)的表达。在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含编码2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种修饰的内源蛋白的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种修饰的内源靶基因。在一些实施方案中，修饰的内源蛋白表现出对由修饰的TIL表达或由另一种细胞表达的另一种蛋白质的降低或改变的结合亲和力；降低或改变的信号传导能力；降低或改变的酶活性；降低或改变的DNA结合活性；或者降低或改变的作为支架蛋白的能力。
在一些实施方案中，修饰的内源靶基因包含一个或多个显性负突变。如本文所用，“显性负突变”是指靶基因的一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，使得编码的蛋白质对由未修饰的靶基因编码的蛋白质起拮抗作用。突变是显性负突变，因为负表型相对于对应的未修饰基因的正表型赋予基因优势。包含一个或多个显性负突变的基因和由其编码的蛋白质被称为“显性负突变体”，例如，显性负基因和显性负蛋白质。在一些实施方案中，显性负突变蛋白质由插入在TIL的基因组中一个或多个位置处的外源转基因编码。
显性负性的各种机制是已知的。通常，显性负突变体的基因产物保留未修饰基因产物的一些功能，但缺乏未修饰基因产物的一种或多种关键的其他功能。这导致显性负突变体拮抗未修饰的基因产物。例如，作为说明性的实施方案，转录因子的显性负突变体可能缺少功能性活化结构域，但是保留功能性DNA结合结构域。在此实例中，显性负转录因子不能像未修饰的转录因子那样活化DNA的转录，但是显性负转录因子可以通过阻止未修饰的转录因子与转录因子结合位点的结合来间接抑制基因表达。作为另一个说明性的实施方案，作为二聚体的蛋白质的显性负突变是已知的。此类二聚体蛋白的显性负突变体可以保留与未修饰的蛋白质二聚的能力，但是不能发挥其他功能。显性负单体通过与未修饰的单体二聚形成异二聚体，阻止未修饰的单体形成功能性同二聚体。SOCS1基因的显性负突变是本领域已知的并且包括通过人和鼠SOCS1氨基酸序列的序列比对鉴定的鼠F59D突变体(参见例如，Hanada等人,J Biol Chem,276:44:2(2001),40746-40754；和Suzuki等人,J ExpMed,193:4(2001),471-482)和人F58D突变体。
在一些实施方案中，修饰的TIL包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达或功能的基因调控系统。在一些实施方案中，一个或多个靶基因选自：ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。(参见国际公布号WO 2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文。)在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统。在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含能够降低选自SOCS1的一种或多种内源靶基因和选自PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一种、两种或更多种修饰的内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含能够降低两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统。在一些实施方案中，两个或更多个靶基因选自：ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统。在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含能够降低选自SOCS1和选自PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一种、两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统。基因调控系统可以通过多种机制降低内源靶基因的表达和/或功能，所述机制包括通过修饰内源靶基因的基因组DNA序列(例如，通过在基因组DNA序列中插入、缺失或突变一个或多个核酸)；通过调控内源靶基因的转录(例如，抑制或阻遏mRNA转录)；和/或通过调控内源靶基因的翻译(例如，通过mRNA降解)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含基因调控系统(例如，基于核酸的基因调控系统、基于蛋白质的基因调控系统或基于蛋白质/核酸组合的基因调控系统)。在此类实施方案中，包含在修饰的TIL中的基因调控系统能够修饰一种或多种内源靶基因。在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含基因调控系统，其包含：
a.一种或多种核酸分子，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
b.一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的核酸分子；
c.一种或多种蛋白质，其能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能；
d.一种或多种多核苷酸，其编码能够降低由一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达或修饰其功能的蛋白质；
e.一种或多种指导RNA(gRNA)，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
f.一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gRNA；
g.一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
h.一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
i.一种或多种指导DNA(gDNA)，其能够与内源基因中的靶DNA序列结合；
j.一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与内源基因中的靶DNA序列结合的gDNA；
k.一种或多种定点修饰多肽，其能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列；
l.一种或多种多核苷酸，其编码能够与gDNA相互作用并修饰内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
m.一种或多种gRNA，其能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合；
n.一种或多种多核苷酸，其编码一种或多种能够与由内源基因编码的靶mRNA序列结合的gRNA；
o.一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列；
p.一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰由内源基因编码的靶mRNA序列的定点修饰多肽；或
q.以上的任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含基因调控系统，其包含：
a.一种或多种核酸分子，其能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达和/或修饰其功能；
b.一种或多种多核苷酸，其编码能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达和/或修饰其功能的一种或多种核酸分子；
c.一种或多种蛋白质，其能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达和/或修饰其功能；
d.一种或多种多核苷酸，其编码能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源靶基因编码的基因产物的表达和/或修饰其功能的一种或多种蛋白质；
e.一种或多种指导RNA(gRNA)，其能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源基因中的靶DNA序列；
f.一种或多种多核苷酸，其编码能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源基因中的靶DNA序列的一种或多种gRNA；
g.一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的内源基因中的靶DNA序列；
h.一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
i.一种或多种指导DNA(gDNA)，其能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因中的靶DNA序列；
j.一种或多种多核苷酸，其编码能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因中的靶DNA序列的一种或多种gDNA；
k.一种或多种定点修饰多肽，其能够与gDNA相互作用并修饰选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的内源基因中的靶DNA序列；
l.一种或多种多核苷酸，其编码能够与gDNA相互作用并修饰选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的内源基因中的靶DNA序列的定点修饰多肽；
m.一种或多种gRNA，其能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源基因编码的靶mRNA序列；
n.一种或多种多核苷酸，其编码能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因编码的靶mRNA序列的一种或多种gRNA；
o.一种或多种定点修饰多肽，其能够与gRNA相互作用并修饰选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的内源基因编码的靶mRNA序列；
p.一种或多种多核苷酸，其编码能够与gRNA相互作用并修饰选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的内源基因编码的靶mRNA序列的定点修饰多肽；
q.以上的任何组合。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含基因调控系统，其包含：
a.两种或更多种核酸分子，其能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源靶基因编码的基因产物的表达和/或修饰其功能；
b.一种或多种多核苷酸，其编码能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源靶基因编码的基因产物的表达和/或修饰其功能的两种或更多种核酸分子；
c.两种或更多种蛋白质，其能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源靶基因编码的基因产物的表达和/或修饰其功能；
d.一种或多种多核苷酸，其编码能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源靶基因编码的基因产物的表达和/或修饰其功能的两种或更多种蛋白质；
e.两种或更多种指导RNA(gRNA)，其能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因中的靶DNA序列；
f.一种或多种多核苷酸，其编码能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因中的靶DNA序列的两种或更多种gRNA；
g.两种或更多种指导DNA(gDNA)，其能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因中的靶DNA序列；
h.一种或多种多核苷酸，其编码能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因中的靶DNA序列的两种或更多种gDNA；
i.两种或更多种gRNA，其能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因编码的靶mRNA序列；
j.一种或多种多核苷酸，其编码能够结合选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的两种或更多种内源基因编码的靶mRNA序列的两种或更多种gRNA；
k.以上的任何组合。
在一些实施方案中，将编码基因调控系统的一种、两种或更多种多核苷酸插入TIL的基因组中。在一些实施方案中，编码基因调控系统的一种或多种多核苷酸是附加型表达的，并且不插入TIL的基因组中。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含插入在一个或多个基因组基因座处的一种或多种外源转基因(例如，遗传“敲入”)。在一些实施方案中，一种或多种外源转基因编码可检测标签、安全转换系统、嵌合转换受体和/或工程化抗原特异性受体。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL还包含编码可检测标签的外源转基因。可检测标签的实例包括但不限于FLAG标签、聚组氨酸标签(例如6xHis)、SNAP标签、Halo标签、cMyc标签、谷胱甘肽-S-转移酶标签、抗生物素蛋白、酶、荧光蛋白、发光蛋白、化学发光蛋白、生物发光蛋白和磷光蛋白。在一些实施方案中，荧光蛋白选自由以下组成的组：蓝色/UV蛋白(诸如BFP、TagBFP、mTagBFP2、Azurite、EBFP2、mKalama1、Sirius、Sapphire和T-Sapphire)；青色蛋白(诸如CFP、eCFP、Cerulean、SCFP3A、mTurquoise、mTurquoise2、单体Midoriishi-Cyan、TagCFP和mTFP1)；绿色蛋白(诸如：GFP、eGFP、meGFP(A208K突变)、Emerald、Superfolder GFP、单体Azami Green、TagGFP2、mUKG、mWasabi、Clover和mNeonGreen)；黄色蛋白(诸如YFP、eYFP、Citrine、Venus、SYFP2和TagYFP)；橙色蛋白(诸如单体Kusabira-Orange、mKOκ、mKO2、mOrange和mOrange2)；红色蛋白(诸如RFP、mRaspberry、mCherry、mStrawberry、mTangerine、tdTomato、TagRFP、TagRFP-T、mApple、mRuby和mRuby2)；远红色蛋白(诸如mPlum、HcRed-Tandem、mKate2、mNeptune和NirFP)；近红外蛋白(诸如TagRFP657、IFP1.4和iRFP)；长斯托克斯位移蛋白(诸如mKeima Red、LSS-mKate1、LSS-mKate2和mBeRFP)；光活化蛋白(诸如PA-GFP、PAmCherry1和PATagRFP)；光转换蛋白(诸如Kaede(绿色)、Kaede(红色)、KikGR1(绿色)、KikGR1(红色)、PS-CFP2、PS-CFP2、mEos2(绿色)、mEos2(红色)、mEos3.2(绿色)、mEos3.2(红色)、PSmOrange和PSmOrange)；和光可转换蛋白(诸如Dronpa)。在一些实施方案中，可检测标签可以选自AmCyan、AsRed、DsRed2、DsRedExpress、E2-Crimson、HcRed、ZsGreen、ZsYellow、mCherry、mStrawberry、mOrange、mBanana、mPlum、mRasberry、tdTomato、DsRed单体和/或AcGFP，所有这些均可从Clontech获得。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL还包含编码安全转换系统的外源转基因。安全转换系统(本领域中也称为自杀基因系统)包含编码一种或多种蛋白质的外源转基因，所述蛋白质能够在将细胞施用于受试者后消除修饰的TIL。安全转换系统的实例在本领域中是已知的。例如，安全转换系统包括编码将无毒性前药转化为有毒性化合物的蛋白质的基因，诸如单纯疱疹胸苷激酶(Hsv-tk)和更昔洛韦(GCV)系统(Hsv-tk/GCV)。Hsv-tk将无毒性GCV转化为细胞毒性化合物，其导致细胞凋亡。因此，向已经用包含编码Hsv-tk蛋白的转基因的修饰的TIL治疗的受试者施用GCV可以选择性地消除修饰的TIL，同时保留内源TIL。参见例如，Bonini等人,Science,1997,276(5319):1719-1724；Ciceri等人,Blood,2007,109(11):1828-1836；Bondanza等人,Blood 2006,107(5):1828-1836，所述文献以引用的方式整体并入本文。
另外的安全转换系统包括编码细胞表面标记的基因，使得通过经由ADCC施用对细胞表面标记具有特异性的单克隆抗体能够消除修饰的TIL。在一些实施方案中，细胞表面标记是CD20，并且可以通过施用抗CD20单克隆抗体(诸如利妥昔单抗)来消除修饰的TIL(参见例如，Introna等人,Hum Gene Ther,2000,11(4):611-620；Serafini等人,Hum Gene Ther,2004,14,63-76；van Meerten等人,Gene Ther,2006,13,789-797，所述文献以引用的方式整体并入本文)。在国际PCT公布号WO 2018006880中描述了使用EGF-R和西妥昔单抗或帕尼单抗的相似系统，其以引用的方式整体并入本文。另外的安全转换系统包括编码促凋亡分子的转基因，所述促凋亡分子包含一个或多个用于二聚化的化学诱导剂(CID)的结合位点，使得能够通过施用CID来消除修饰的TIL，所述CID诱导促凋亡分子的寡聚化和凋亡途径的活化。在一些实施方案中，促凋亡分子是Fas(也称为CD95)(Thomis等人,Blood,2001,97(5),1249-1257，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，促凋亡分子是胱天蛋白酶9(Straathof等人,Blood,2005,105(11),4247-4254，其以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL还包含编码嵌合转换受体的外源转基因。嵌合转换受体是工程化细胞表面受体，其包含来自内源细胞表面受体的细胞外结构域和异源细胞内信号传导结构域，使得细胞外结构域对配体的识别导致信号级联的活化，其与野生型形式的细胞表面受体所活化的信号级联不同。在一些实施方案中，嵌合转换受体包含与细胞内结构域融合的抑制性细胞表面受体的细胞外结构域，所述细胞内结构域导致传递活化信号而不是通常由抑制性细胞表面受体转导的抑制信号。在特定的实施方案中，来源于已知抑制TIL活化的细胞表面受体的细胞外结构域可以与活化细胞内结构域融合。然后，对应配体的接合将活化信号级联，其增加而不是抑制TIL的活化。例如，在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含编码PD1-CD28转换受体的转基因，其中PD1的细胞外结构域与CD28的细胞内信号传导结构域融合(参见例如，Liu等人,Cancer Res 76:6(2016),1578-1590和Moon等人,Molecular Therapy 22(2014),S201，所述文献以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含编码CD200R的细胞外结构域和CD28的细胞内信号传导结构域的转基因(参见Oda等人，Blood 130:22(2017),2410-2419，其以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL还包含工程化的抗原特异性受体，其识别由靶细胞(诸如肿瘤细胞或抗原呈递细胞(APC))表达的蛋白质靶标，本文称为“修饰的受体工程化细胞”或“修饰的RE细胞”。术语“工程化抗原受体”是指非天然存在的抗原特异性受体，诸如嵌合抗原受体(CAR)或重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，工程化抗原受体是CAR，其包含经由铰链和跨膜结构域与包含信号传导结构域的细胞质结构域融合的细胞外抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR细胞外结构域以MHC非依赖性方式与由靶细胞表达的抗原结合，从而导致RE细胞的活化和增殖。在一些实施方案中，CAR的细胞外结构域识别与抗体或其抗原结合片段融合的标签。在此类实施方案中，CAR的抗原特异性取决于标记的抗体的抗原特异性，使得单个CAR构建体可以通过用一种抗体取代另一种抗体来靶向多种不同的抗原(参见例如，美国专利号9,233,125和9,624,279；美国专利申请公布号20150238631和20180104354)。在一些实施方案中，CAR的细胞外结构域可包含来源于抗体的抗原结合片段。可用于本公开的抗原结合结构域包括例如scFv；抗体；抗体的抗原结合区；重链/轻链的可变区；和单链抗体。
在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域可以来源于TCR复合物ζ链(诸如CD3ξ信号传导结构域)、FcγRIII、FcεRI或T淋巴细胞活化结构域。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域还包含共刺激结构域，例如4-1BB、CD28、CD40、MyD88或CD70结构域。在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含两个共刺激结构域，例如4-1BB、CD28、CD40、MyD88或CD70结构域中的任何两个。示例性CAR结构和细胞内信号传导结构域是本领域已知的(参见例如，WO 2009/091826；US 20130287748；WO 2015/142675；WO 2014/055657；和WO 2015/090229，以引用的方式并入本文)。
对多种肿瘤抗原具有特异性的CAR是本领域已知的，例如CD171特异性CAR(Park等人,Mol Ther(2007)15(4):825-833)、EGFRvIII特异性CAR(Morgan等人,Hum Gene Ther(2012)23(10):1043-1053)、EGF-R特异性CAR(Kobold等人,J Natl Cancer Inst(2014)107(1):364)、碳酸酐酶K特异性CAR(Lamers等人,Biochem Soc Trans(2016)44(3):951-959)、FR-α特异性CAR(Kershaw等人,Clin Cancer Res(2006)12(20):6106-6015)、HER2特异性CAR(Ahmed等人,J Clin Oncol(2015)33(15)1688-1696；Nakazawa等人,Mol Ther(2011)19(12):2133-2143；Ahmed等人,Mol Ther(2009)17(10):1779-1787；Luo等人,Cell Res(2016)26(7):850-853；Morgan等人,Mol Ther(2010)18(4):843-851；Grada等人,Mol TherNucleic Acids(2013)9(2):32)、CEA特异性CAR(Katz等人,Clin Cancer Res(2015)21(14):3149-3159)、IL13Rα2特异性CAR(Brown等人,Clin Cancer Res(2015)21(18):4062-4072)、GD2特异性CAR(Louis等人,Blood(2011)118(23):6050-6056；Caruana等人,Nat Med(2015)21(5):524-529)、ErbB2特异性CAR(Wilkie等人,J Clin Immunol(2012)32(5):1059-1070)、VEGF-R特异性CAR(Chinnasamy等人,Cancer Res(2016)22(2):436-447)、FAP特异性CAR(Wang等人,Cancer Immunol Res(2014)2(2):154-166)、MSLN特异性CAR(Moon等人,Clin Cancer Res(2011)17(14):4719-30)、NKG2D特异性CAR(VanSeggelen等人,MolTher(2015)23(10):1600-1610)、CD19特异性CAR(Axicabtagene ciloleucel
Figure BDA0003756012870000791
和Tisagenlecleucel
Figure BDA0003756012870000792
还参见Li等人,J Hematol and Oncol(2018)11(22)，其综述了肿瘤特异性CAR的临床试验。适合根据本公开使用的示例性CAR描述于下表2中。
表2：示例性CAR构建体
Figure BDA0003756012870000793
Figure BDA0003756012870000801
在一些实施方案中，工程化抗原受体是重组TCR。重组TCR包含已从识别特定靶抗原的T细胞群体分离并克隆的TCRα和/或TCRβ链。例如，TCRα和/或TCRβ基因(即，TRAC和TRBC)可以从分离自患有特定恶性肿瘤的个体的T细胞群体或已分离自用特异性肿瘤抗原或肿瘤细胞免疫的人源化小鼠的T细胞群体中克隆而来。重组TCR通过与其内源对应物相同的机制识别抗原(例如，通过识别在靶细胞表面上表达的主要组织相容性复合物(MHC)蛋白的背景下呈递的其同源抗原)。这种抗原接合刺激内源信号转导途径，从而导致TCR工程化细胞的活化和增殖。
对肿瘤抗原特异的重组TCR在本领域中是已知的，例如WT1特异性TCR(JTCR016，Juno Therapeutics；WT1-TCRc4，描述于美国专利申请公布号20160083449)、MART-1特异性TCR(包括DMF4T克隆，Morgan等人,Science 314(2006)126-129)中描述；DMF5T克隆，描述于Johnson等人，Blood 114(2009)535-546)；和ID3T克隆，描述于van den Berg等人,Mol.Ther.23(2015)1541-1550)、gp100特异性TCR(Johnson等人,Blood 114(2009)535-546)、CEA特异性TCR(Parkhurst等人,Mol Ther.19(2011)620-626)、NY-ESO和LAGE-1特异性TCR(1G4T克隆，描述于Robbins等人,J Clin Oncol 26(2011)917-924；Robbins等人,Clin Cancer Res 21(2015)1019-1027；和Rapoport等人，Nature Medicine 21(2015)914-921)，以及MAGE-A3特异性TCR(Morgan等人，J Immunother 36(2013)133-151)和Linette等人,Blood 122(2013)227-242)。(还参见，Debets等人,Seminars in Immunology 23(2016)10-21)。
为了产生重组TCR，天然TRAC(SEQ ID NO:882)和TRBC(SEQ ID NO:883)蛋白序列分别与特异于目标蛋白质或肽的TCR-α和TCR-β链可变区的C末端融合。例如，工程化TCR可以识别NY-ESO肽(SLLMWITQC，SEQ ID NO:884)，诸如1G4 TCR或95:LY TCR(Robbins等人,Journal of Immunology 2008 180:6116-6131)。在此类说明性实施方案中，配对的1G4-TCRα/β链分别包含SEQ ID NO:885和886，并且配对的95:LY-TCRα/β链分别包含SEQ ID NO:887和888。重组TCR可以识别MART-1肽(AAGIGILTV，SEQ ID NO:889)，诸如DMF4和DMF5 TCR(Robbins等人，Journal of Immunology 2008 180:6116-6131)。在此类说明性实施方案中，配对的DMF4-TCRα/β链分别包含SEQ ID NO:890和891，并且配对的DMF5-TCRα/β链分别包含SEQ ID NO:892和893。重组TCR可以识别WT-1肽(RMFPNAPYL,SEQ ID NO:894)，诸如DLTTCR(Robbins等人，Journal of Immunology 2008 180:6116-6131)。在此类说明性实施方案中，配对的高亲和力DLT-TCRα/β链分别包含SEQ ID NO:895和896。
可以产生编码重组TCRα和TCRβ链蛋白的密码子优化的DNA序列，使得两个TCR链的表达以化学计量的方式从单个启动子脱离。在此类实施方案中，P2A序列(SEQ ID NO:897)可插入编码TCRβ和TCRα链的DNA序列之间，使得编码重组TCR链的表达盒包含以下格式：TCRβ-P2A-TCRα。作为说明性实施方案，从这种盒表达的1G4NY-ESO特异性TCR的蛋白质序列将包含SEQ ID NO:898，从这种盒表达的95:LY NY-ESO特异性TCR的蛋白质序列将包含SEQ IDNO:899，从这种盒表达的DMF4 MART1特异性TCR的蛋白质序列将包含SEQ ID NO:900，从这种盒表达的DMF5 MART1特异性TCR的蛋白质序列将包含SEQ ID NO:901，并且从这种盒表达的DLT WT1特异性TCR的蛋白质序列将包含SEQ ID NO:902。
在一些实施方案中，工程化抗原受体针对选自以下的靶抗原：分化分子簇，诸如CD3、CD4、CD8、CD16、CD24、CD25、CD33、CD34、CD45、CD64、CD71、CD78、CD80(也称为B7-1)、CD86(也称为B7-2)、CD96、CD116、CD117、CD123、CD133和CD138、CD371(也称为CLL1)；肿瘤相关表面抗原，诸如5T4、BCMA(也称为CD269和TNFRSF17，UniProt#Q02223)、癌胚抗原(CEA)、碳酸酐酶9(CAIX或MN/CAIX)、CD19、CD20、CD22、CD30、CD40、双唾液酸神经节苷脂诸如GD2、ELF2M、导管上皮粘蛋白、肝配蛋白B2、上皮细胞粘附分子(EpCAM)、ErbB2(HER2/neu)、FCRL5(UniProt#Q68SN8)、FKBP11(UniProt#Q9NYL4)、神经胶质瘤相关抗原、糖鞘脂、gp36、GPRC5D(UniProt#Q9NZD1)、mut hsp70-2、肠羧基酯酶、IGF-I受体、ITGA8(UniProt#P53708)、KAMP3、LAGE-1a、MAGE、间皮素、嗜中性粒细胞弹性蛋白酶、NKG2D、Nkp30、NY-ESO-1、PAP、前列腺酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、前列腺素(prostein)、RAGE-1、ROR1、RU1(SFMBT1)、RU2(DCDC2)、SLAMF7(UniProt#Q9NQ25)、存活素、TAG-72和端粒酶；呈递肿瘤特异性肽表位的主要组织相容性复合物(MHC)分子；肿瘤基质抗原，诸如纤连蛋白的额外结构域A(EDA)和额外结构域B(EDB)；腱生蛋白C的A1结构域(TnCA1)和成纤维细胞相关蛋白(FAP)；细胞因子受体，诸如表皮生长因子受体(EGFR)、EGFR变体III(EGFRvIII)、TFGβ-R或其组分诸如内皮糖蛋白；主要组织相容性复合物(MHC)分子；病毒特异性表面抗原，诸如HIV特异性抗原(诸如HIV gp120)；EBV特异性抗原、CMV特异性抗原、HPV特异性抗原、Lassa病毒特异性抗原、流感病毒特异性抗原以及这些表面抗原的任何衍生物或变体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的一种、两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。在一些实施方案中，这些内源基因包括ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。(参见国际公布号WO 2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文。)
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和PTPN2的表达和/或功能或能够降低SOCS1和PTPN2的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的SOCS1和PTPN2的表达和/或功能或能够降低SOCS1和PTPN2的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和ZC3H12A的表达和/或功能或能够降低SOCS1和ZC3H12A的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的SOCS1和ZC3H12A的表达和/或功能或能够降低SOCS1和ZC3H12A的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的PTPN2和ZC3H12A的表达和/或功能或能够降低PTPN2和ZC3H12A的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的PTPN2和ZC3H12A的表达和/或功能或能够降低PTPN2和ZC3H12A的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的PTPN2和CBLB的表达和/或功能或能够降低PTPN2和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的PTPN2和CBLB的表达和/或功能或能够降低PTPN2和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的ZC3H12A和CBLB的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的ZC3H12A和CBLB的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和CBLB的表达和/或功能或能够降低SOCS1和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的SOCS1和CBLB的表达和/或功能或能够降低SOCS1和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的PTPN2和RC3H1的表达和/或功能或能够降低PTPN2和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的PTPN2和RC3H1的表达和/或功能或能够降低PTPN2和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的ZC3H12A和RC3H1的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的ZC3H12A和RC3H1的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和RC3H1的表达和/或功能或能够降低SOCS1和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的SOCS1和RC3H1的表达和/或功能或能够降低SOCS1和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的CBLB和RC3H1的表达和/或功能或能够降低CBLB和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的CBLB和RC3H1的表达和/或功能或能够降低CBLB和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的PTPN2和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低PTPN2和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的PTPN2和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低PTPN2和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的ZC3H12A和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的ZC3H12A和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低SOCS1和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的SOCS1和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低SOCS1和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的CBLB和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低CBLB和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的CBLB和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低CBLB和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的RC3H1和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低RC3H1和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含在细胞表面上表达的CAR或重组TCR。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的RC3H1和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低RC3H1和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，并且还包含编码CAR或重组TCR的重组表达载体。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含能够降低一种或多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控系统。在一些实施方案中，这些内源基因包括ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。(参见国际公布号WO 2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文。)
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和PTPN2的表达和/或功能或能够降低SOCS1和PTPN2的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和ZC3H12A的表达和/或功能或能够降低SOCS1和ZC3H12A的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的PTPN2和ZC3H12A的表达和/或功能或能够降低PTPN2和ZC3H12A的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的PTPN2和CBLB的表达和/或功能或能够降低PTPN2和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的ZC3H12A和CBLB的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和CBLB的表达和/或功能或能够降低SOCS1和CBLB的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的PTPN2和RC3H1的表达和/或功能或能够降低PTPN2和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的ZC3H12A和RC3H1的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和RC3H1的表达和/或功能或能够降低SOCS1和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的CBLB和RC3H1的表达和/或功能或能够降低CBLB和RC3H1的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的PTPN2和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低PTPN2和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的ZC3H12A和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低ZC3H12A和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的SOCS1和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低SOCS1和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的CBLB和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低CBLB和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
在一些实施方案中，本公开提供了修饰的TIL，其包含降低的RC3H1和NFKBIA的表达和/或功能或能够降低RC3H1和NFKBIA的表达和/或功能的基因调控系统，其中所述免疫效应细胞是TIL。
D.效应子功能
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的选自ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能(或能够降低所述表达和/或功能的基因调控系统)(参见国际公布号WO 2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文)，并且表现出一种或多种免疫细胞效应子功能的增加。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种或多种内源靶基因的表达和/或功能(或能够降低所述表达和/或功能的基因调控系统)，并且表现出一种或多种免疫细胞效应子功能的增加。在本文中，术语“效应子功能”是指与针对靶细胞或靶抗原的免疫应答的产生、维持和/或增强有关的免疫细胞的功能。在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，本文所述的修饰的TIL表现出以下特征中的一种或多种：增加的向肿瘤的浸润或迁移，增加的增殖，增加的或延长的细胞活力，增加的对周围微环境中抑制因子的抗性使得细胞的活化状态延长或增加，增加的促炎免疫因子(例如，促炎细胞因子、趋化因子和/或酶)的产生，增加的细胞毒性，增加的对耗竭的抗性和/或增加的Tcm百分比。
在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，本文所述的修饰的TIL表现出增加的向肿瘤的浸润。在一些实施方案中，增加的修饰的TIL对肿瘤的浸润是指与在相同的时间段内浸润到肿瘤中的未修饰的TIL的数目相比，在给定的时间段内浸润到肿瘤中的修饰的TIL的数量增加。在一些实施方案中，与未修饰的免疫细胞相比，修饰的TIL表现出1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍的肿瘤浸润增加。可以通过从受试者中分离一个或多个肿瘤并通过流式细胞术、免疫组织化学和/或免疫荧光评估样品中修饰的免疫细胞的数目来测量肿瘤浸润。
在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，本文所述的修饰的TIL表现出细胞增殖的增加。在这些实施方案中，结果是在给定的时间段之后，与未修饰的TIL相比，存在的修饰的TIL的数量增加。例如，在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，修饰的TIL表现出增加的增殖速率，其中修饰的TIL以比未修饰的TIL更快的速率分裂。在一些实施方案中，与未修饰的免疫细胞相比，修饰的TIL表现出1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍的增殖速率增加。在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，修饰的TIL表现出延长的增殖时间，其中修饰的TIL和未修饰的TIL以相似的速率分裂，但是其中修饰的TIL维持更长一段时间的增殖状态。在一些实施方案中，修饰的TIL维持增殖状态的时间比未修饰的免疫细胞长1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍。
在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，本文所述的修饰的TIL表现出增加的或延长的细胞活力。在此类实施方案中，结果是在给定的时间段之后，与未修饰的TIL相比，修饰的TIL的数量或存在增加。例如，在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL保持活力并持续的时间比未修饰的免疫细胞长1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍。
在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，本文所述的修饰的TIL表现出增加的对抑制因子的抗性。示例性抑制因子包括免疫检查点分子(例如，PD1、PDL1、CTLA4、LAG3、IDO)和/或抑制性细胞因子(例如，IL-10、TGFβ)的信号传导。
在一些实施方案中，与未修饰的T细胞相比，本文所述的修饰的T细胞表现出增加的对T细胞耗竭的抗性。T细胞耗竭是抗原特异性T细胞功能障碍的一种状态，其特征在于效应子功能降低并导致随后的抗原特异性T细胞的缺失。在一些实施方案中，耗竭的T细胞缺乏响应于抗原而增殖的能力，表现出细胞因子产量的降低，和/或表现出对靶细胞(诸如肿瘤细胞)的细胞毒性的降低。在一些实施方案中，耗竭的T细胞通过改变的细胞表面标记物和转录因子的表达来鉴定，诸如通过降低的CD122和CD127的细胞表面表达；增加的抑制性细胞表面标记物(诸如PD1、LAG3、CD244、CD160、TIM3和/或CTLA4)的表达；和/或增加的转录因子(诸如Blimp1、NFAT和/或BATF)的表达。在一些实施方案中，耗竭的T细胞表现出改变的敏感性细胞因子信号传导，诸如增加的对TGFβ信号传导的敏感性和/或降低的对IL-7信号传导的敏感性。T细胞耗竭可以例如通过将T细胞与靶细胞群体共培养并测量T细胞增殖、细胞因子产量和/或靶细胞的裂解来确定。在一些实施方案中，将本文所述的修饰的TIL与靶细胞群体(例如，自体肿瘤细胞或已经被工程化以表达靶肿瘤抗原的细胞系)共培养，并测量效应细胞增殖、细胞因子产量和/或靶细胞裂解。然后将这些结果与靶细胞和对照免疫细胞群体(诸如未修饰的TIL或具有对照修饰的免疫效应细胞)共培养获得的结果进行比较。
在一些实施方案中，通过与从对照免疫细胞群体观察到的细胞因子产量相比，修饰的TIL的一种或多种细胞因子(例如，IFNγ、TNFα或IL-2)的产量增加证明了对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与来自对照免疫细胞群体的细胞因子产量相比，修饰的TIL的细胞因子产量增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。在一些实施方案中，通过与从对照免疫细胞群体观察到的增殖相比，修饰的TIL的增殖增加证明了对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与对照免疫细胞群体的增殖相比，修饰的TIL的增殖增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。在一些实施方案中，通过与从对照免疫细胞群体观察到的靶细胞裂解相比，修饰的TIL的靶细胞裂解增加证明了对T细胞耗竭的抗性。在一些实施方案中，与对照免疫细胞群体的靶细胞裂解相比，修饰的TIL的靶细胞裂解增加1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍，这表明对T细胞耗竭的抗性增加。
在一些实施方案中，在体外或离体制造方法中，测量了与对照免疫细胞群体相比修饰的TIL的耗竭。例如，在一些实施方案中，根据本文所述的方法修饰从肿瘤片段分离的TIL，并且然后将其在一轮或多轮扩增中扩增以产生修饰的TIL群体。在此类实施方案中，可以在收获之后并且在第一轮扩增之前，在第一轮扩增之后但是在第二轮扩增之前和/或在第一轮和第二轮扩增之后立即测定修饰的TIL的耗竭。在一些实施方案中，在将修饰的TIL转移到受试者之后的一个或多个时间点测量与对照免疫细胞群体相比修饰的TIL的耗竭。例如，在一些实施方案中，修饰的细胞根据本文所述的方法产生，并施用于受试者。然后可以在转移之后的多个时间点从受试者获取样品，以测定修饰的TIL在体内随时间推移的耗竭。
在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，本文所述的修饰的TIL表现出增加的促炎免疫因子的表达或产量。促炎免疫因子的实例包括溶细胞因子，诸如粒酶B、穿孔素和颗粒溶素；和促炎细胞因子，诸如干扰素(IFNα、IFNβ、IFNγ)、TNFα、IL-1β、IL-12、IL-2、IL-17、CXCL8和/或IL-6。
在一些实施方案中，与未修饰的TIL相比，本文所述的修饰的TIL表现出增加的对靶细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，与未修饰的免疫细胞相比，修饰的TIL表现出1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多倍的对靶细胞的细胞毒性的增加。
用于测量免疫效应子功能的测定是本领域已知的。例如，肿瘤浸润可以通过从受试者分离肿瘤并通过流式细胞术、免疫组织化学和/或免疫荧光测定存在于肿瘤中的淋巴细胞的总数和/或表型来测量。细胞表面受体表达可以通过流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹和/或qPCR测定。细胞因子和趋化因子的表达和产量可以通过流式细胞术、免疫组织化学、免疫荧光、蛋白质印迹、ELISA和/或qPCR来测量。对细胞外刺激(例如，细胞因子、抑制性配体或抗原)的应答性或敏感性可以通过测定响应于所述刺激的细胞增殖和/或下游信号传导途径的活化(例如下游信号传导中间体的磷酸化)来测量。细胞毒性可以通过本领域已知的靶细胞裂解测定来测量，包括修饰的TIL与靶细胞的体外或离体共培养以及体内鼠肿瘤模型，诸如整个实施例中所述的那些。
E.内源途径和基因的调控
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL表现出降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的一种、两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能的基因调控。关于内源靶基因的更多细节提供于下表3中。在此类实施方案中，降低的一种、两种或更多种内源靶基因的表达或功能增强免疫细胞的一种或多种效应子功能。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的细胞因子信号传导抑制因子SOCS 1(SOCS1)基因的表达和/或功能。SOCS1蛋白包含C末端SOCS盒基序、SH2结构域、ESS结构域和N末端KIR结构域。已发现称为激酶抑制区(KIR)的12个氨基酸残基在SOCS1负调控JAK1、TYK2和JAK2酪氨酸激酶功能的能力中是至关重要。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的PTPN2基因的表达和/或功能。蛋白酪氨酸磷酸酶家族(PTP)通过其磷酸酶催化结构域使磷酸酪氨酸残基去磷酸化。PTPN2充当TCR和细胞因子两者的制动因子，它们通过JAK/STAT信号传导复合物发信号，并且因此充当信号1和3两者上的检查点。T细胞与抗原接合并活化TCR后，激酶Lck和Fyn通过酪氨酸残基的磷酸化在下游扩增阳性信号。PTPN2用于使Lck和Fyn两者去磷酸化，从而减弱TCR信号传导。此外，在T细胞遭遇细胞因子和通过共同γ链受体复合物(其通过JAK/STAT信号传导传递阳性信号)的信号传导后，PTPN2也通过STAT1和STAT3的去磷酸化而减弱。PTPN2损失对T细胞功能的总功能影响是通过TCR降低暴发性T细胞活化所需的活化阈值，以及对增强生长和分化的细胞因子的超敏反应。
此外，在整只小鼠中PTPN2的缺失增加细胞因子水平、非淋巴组织中的淋巴细胞浸润和类风湿性关节炎样症状的早期迹象；这些小鼠不能存活超过5周龄。因此，PTPN2已被确定为对小鼠的出生后发育至关重要。与这种自身免疫表型一致，T细胞谱系中Ptpn2从出生起的缺失也导致非淋巴组织中淋巴细胞浸润的增加。重要的是，成年小鼠T细胞中Ptpn2的可诱导敲除不导致任何自身免疫表现。在其自身免疫中的作用以外，Ptpn2缺失被确定为与小百分比的人T细胞急性淋巴细胞白血病(ALL)相关联；并且在两阶段化学诱导的致癌性中增强皮肤肿瘤发展。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的ZC3H12A基因的表达和/或功能。Zc3h12，也称为MCPIP1和Regnase-1，是一种恰好在CCCH型锌指基序的上游具有RNA酶结构域的RNA酶。通过其核酸酶活性，Zc3h12a通过结合这些基因的3’UTR内的保守茎环结构来靶向并去稳定转录物(诸如IL-6)的mRNA。在T细胞中，Zc3h12a控制许多促炎基因(包括c-Rel、Ox40和IL-2)的转录水平。Regnase-1活化是瞬时的并且受到负反馈机制的影响，包括蛋白酶体介导的降解或粘膜相关的淋巴样组织1(MALT1)介导的切割。Regnase-1的主要功能是通过特异性靶向不同细胞类型中的基因子集，经由其核糖核酸酶活性促进mRNA衰变。在单核细胞中，Regnase-1下调IL-6和IL-12B mRNA，从而减轻炎症，而在T细胞中，它通过靶向c-Rel、Ox40和IL-2转录物来限制T细胞活化。在癌细胞中，Regnase-1通过抑制抗凋亡基因(包括Bcl2L1、Bcl2A1、RelB和Bcl3)来促进细胞凋亡。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的CBLB基因的表达和/或功能。此基因编码CBL-B，也称为RNF56、Nbla00127和Cbl原癌基因B。CBL-B是一种E3泛素蛋白连接酶，并且是CBL基因家族的成员。CBL-B充当T细胞活化的负调控因子。T细胞中CBL-B的表达导致配体诱导的T细胞受体下调，控制了抗原呈递过程中T细胞的活化程度。CBLB基因的突变与自身免疫性疾病如1型糖尿病相关联。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的RC3H1基因的表达和/或功能。此基因编码Ring指和CCCH型结构域1，也称为Roquin-1。Roquin-1识别并结合mRNA的3'UTR中的组成性衰变元件(CDE)，导致mRNA脱腺苷酸化和降解。替代性剪接导致多个转录变体。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL包含降低的NFKBIA基因的表达和/或功能。此基因编码IκBα，也称为NFKB抑制剂α、MAD-3、NFKBI和EDAID2。IκBα是具有抑制NF-κB转录因子功能的细胞蛋白家族的一个成员。IκBα通过掩盖NF-κB蛋白的核定位信号(NLS)并使其在细胞质中以非活性状态多价螯合来抑制NF-κB。此外，IκBα阻断NF-κB转录因子与DNA结合的能力，这是NF-κB正常起作用所必需的。NFKBIA基因在一些霍奇金淋巴瘤细胞中发生突变；此类突变使IκBα蛋白失活，从而导致NF-κB在淋巴瘤肿瘤细胞中长期活化，并且这种活性导致这些肿瘤细胞的恶性状态。
表3：内源靶基因
Figure BDA0003756012870000961
在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1或NFKBIA中的一种或两种或更多种的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、RC3H1和NFKBIA的至少一种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的CBLB的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、RC3H1和NFKBIA的至少两种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的CBLB的表达和/或功能。
在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、PTPN2、ZC3H12A、RC3H1和NFKBIA的至少一种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的SOCS1的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、PTPN2、ZC3H12A、RC3H1和NFKBIA的至少两种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的SOCS1的表达和/或功能。
在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、SOCS1、ZC3H12A、RC3H1和NFKBIA的至少一种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的PTPN2的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、SOCS1、ZC3H12A、RC3H1和NFKBIA的至少两种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的PTPN2的表达和/或功能。
在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、SOCS1、PTPN2、RC3H1和NFKBIA的至少一种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的ZC3H12A的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、SOCS1、PTPN2、RC3H1和NFKBIA的至少两种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的ZC3H12A的表达和/或功能。
在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、SOCS1、PTPN2、ZC3H12A和NFKBIA的至少一种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的RC3H1的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、SOCS1、PTPN2、ZC3H12A和NFKBIA的至少两种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的RC3H1的表达和/或功能。
在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、SOCS1、PTPN2、ZC3H12A和RC3H1的至少一种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的NFKBIA的表达和/或功能。在一些实施方案中，修饰的TIL包含降低的选自CBLB、SOCS1、PTPN2、ZC3H12A和RC3H1的至少两种内源靶基因的表达和/或功能，并且还包含降低的NFKBIA的表达和/或功能。
II.基因调控系统
本文中，术语“基因调控系统”是指在引入细胞时能够修饰内源靶DNA序列从而调控编码的基因产物的表达或功能的蛋白质、核酸或其组合。适用于本公开的方法的多种基因调控系统是本领域已知的，包括但不限于shRNA、siRNA、锌指核酸酶系统、TALEN系统和CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，基因调控系统是基因编辑系统。适用于本公开的方法的基因编辑系统是本领域已知的，包括但不限于锌指核酸酶系统、TALEN系统和CRISPR/Cas系统。
如本文所用，“调控”在提及基因调控系统对内源靶基因的作用时涵盖内源靶基因序列的任何变化，内源靶基因的表观遗传状态的任何变化，和/或由内源靶基因编码的蛋白质的表达或功能的任何变化。
在一些实施方案中，基因调控系统可介导内源靶基因序列的变化，例如，通过将一个或多个突变引入内源靶序列，诸如通过在内源靶序列中插入或缺失一个或多个核酸。可以介导内源靶序列的改变的示例性机制包括但不限于非同源末端连接(NHEJ)(例如，经典或替代)、微同源性介导的末端连接(MMEJ)、同源性定向修复(例如，内源供体模板介导的)、SDSA(合成依赖性链退火)、单链退火或单链入侵。
在一些实施方案中，基因调控系统可以介导内源靶序列的表观遗传状态的变化。例如，在一些实施方案中，基因调控系统可介导内源靶基因DNA的共价修饰(例如，胞嘧啶甲基化和羟甲基化)或相关组蛋白的共价修饰(例如赖氨酸乙酰化、赖氨酸和精氨酸甲基化、丝氨酸和苏氨酸磷酸化以及赖氨酸泛素化和类泛素化)。
在一些实施方案中，基因调控系统可以介导由内源靶基因编码的蛋白质的表达的变化。在此类实施方案中，基因调控系统可通过修饰内源靶DNA序列或通过作用于由DNA序列编码的mRNA产物来调控编码的蛋白质的表达。在一些实施方案中，基因调控系统可以导致修饰的内源蛋白的表达。在此类实施方案中，由基因调控系统介导的对内源DNA序列的修饰导致内源蛋白的表达，其与未修饰的TIL中的对应内源蛋白相比，表现出降低的功能。在此类实施方案中，与未修饰的免疫细胞中对应的内源蛋白的表达水平相比，修饰的内源蛋白的表达水平可以增加、减少或者可以相同或基本上相似。
A.基于核酸的基因调控系统
在一些实施方案中，本公开提供核酸基因调控系统，其包含一种、两种或更多种核酸，所述核酸能够降低选自ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A的至少一种、两种或更多种内源基因的表达和/或功能。(参见国际公布号WO2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文。)在一些实施方案中，本公开提供了核酸基因调控系统，其包含能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一种内源基因的表达和/或功能的一种、两种或更多种核酸。在一些实施方案中，本公开提供了核酸基因调控系统，其包含能够降低SOCS1和选自PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一种、两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能的核酸。在一些实施方案中，本公开提供了用本文所述的方法制造的包含此类基因调控系统的修饰的TIL。如本文所用，基于核酸的基因调控系统是包含一种或多种核酸分子的系统，所述核酸分子能够调控内源靶基因的表达而无需外源蛋白。在一些实施方案中，基因调控系统包含与靶核酸序列互补的RNA干扰分子或反义RNA分子。
“反义RNA分子”是指与mRNA转录物互补的RNA分子，无论长度如何。反义RNA分子是指可以引入细胞、组织或受试者中并通过不依赖于内源基因沉默途径而是依赖于RNA酶H介导的靶mRNA转录物的降解的机制导致内源靶基因产物表达降低的单链RNA分子。在一些实施方案中，反义核酸包含修饰的骨架，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或本领域已知的其他骨架，或可以包含非天然的核苷间键联。在一些实施方案中，反义核酸可包含锁核酸(LNA)。
如本文所用，“RNA干扰分子”是指通过内源基因沉默途径(例如，Dicer和RNA诱导的沉默复合物(RISC))降解靶mRNA来介导内源靶基因产物的降低的表达的RNA多核苷酸。示例性RNA干扰剂包括微小RNA(在本文中也称为“miRNA”)、短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、RNA适体和吗啉代。
在一些实施方案中，基因调控系统包含一种或多种miRNA。miRNA是天然存在的，长度约21-25个核苷酸的小非编码RNA分子。miRNA与一种或多种靶mRNA分子至少部分互补。miRNA可以通过翻译抑制、mRNA的切割和/或脱腺苷酸化来下调(例如降低)内源靶基因产物的表达。
在一些实施方案中，基因调控系统包含一种或多种shRNA。shRNA是长度约50-70个核苷酸的单链RNA分子，其形成茎环结构并导致互补mRNA序列的降解。可以将shRNA克隆到质粒或非复制型重组病毒载体中，以引入细胞内，并导致shRNA编码序列整合到基因组中。因此，shRNA可以提供对内源靶基因翻译和表达的稳定且一致的抑制。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含一种或多种siRNA。siRNA是指长度通常约21-23个核苷酸的双链RNA分子。siRNA与称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的多蛋白复合物缔合，在此过程中，“过客”有义链被酶切割。然后，由于序列同源性，活化的RISC中含有的反义“指导”链将RISC指导至对应的mRNA，并且相同的核酸酶切割靶mRNA，从而导致特异性基因沉默。siRNA的长度最佳为18、19、20、21、22、23或24个核苷酸，并在其3'末端具有2个碱基的突出端。可以将siRNA引入单个细胞和/或培养系统，并导致靶mRNA序列的降解。siRNA和shRNA在Fire等人,Nature,391:19,1998和美国专利号7,732,417；8,202,846和8,383,599中进一步描述。
在一些实施方案中，基因调控系统包含一种或多种吗啉代。如本文所用，“吗啉代”是指修饰的核酸寡聚体，其中标准核酸碱基与吗啉环结合并通过二氨基磷酸酯键联连接。类似于siRNA和shRNA，吗啉代与互补mRNA序列结合。然而，吗啉代通过空间抑制mRNA翻译和改变mRNA剪接而不是靶向互补mRNA序列进行降解来发挥作用。
在一些实施方案中，基因调控系统包含与表4、-表5、表9-表12和表17-表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有90％同一性的靶RNA序列结合的核酸分子。在整个本申请中，参考的基因组坐标基于来自可在国家生物技术信息中心网站获得的基因组参考联盟(Genome Reference Consortium)的人类基因组的GRCh38(也称为hg38)装配体中的基因组注释。用于在一个装配体与另一个装配体之间转换基因组坐标的工具和方法在本领域中是已知的，并且可以用于将本文提供的基因组坐标转换为人类基因组的另一个装配体中的对应坐标，包括转换为由相同机构或使用相同算法产生的较早期的装配体(例如，从GRCh38到GRCh37)，以及转换为由不同机构或算法产生的装配体(例如，从GRCh38到NCBI33，由国际人类基因组测序联盟(International Human Genome SequencingConsortium)产生)。本领域已知的可用方法和工具包括但不限于，NCBI基因组重映射服务(可从国家生物技术信息中心网站获得)、UCSC LiftOver(可从UCSC Genome Brower网站获得)和Assembly Converter(可从Ensembl.org网站获得)。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少一种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向SOCS1的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4(人基因组)或表5(小鼠基因组)中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQID NO:23-200中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-35和56-187中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-35和56-187中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的靶人RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子是靶向SOCS1的shRNA或siRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的shRNA或siRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的shRNA或siRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:23-55或23-200中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:23-35和56-187中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶人RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的shRNA或siRNA分子结合与SEQ IDNO:23-55或23-200中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:23-35和56-187中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的靶人RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少一种选自本领域已知的那些的靶向SOCS1的siRNA分子或shRNA分子。例如，在一些实施方案中，靶向SOCS1的核酸分子是靶向SOCS1的siRNA，其包含选自SEQ ID NO:13-22的核酸序列。(参见国际PCT公布号WO2017120996；WO 2018137295；WO 2017120998；和WO 2018137293，所述专利以引用的方式整体并入本文)(表6)。在一些实施方案中，靶向SOCS1的siRNA分子或shRNA分子是由选自SEQID NO:13-200的核酸序列编码的。在一些实施方案中，靶向SOCS1的siRNA分子或shRNA分子是由选自SEQ ID NO:23-35和56-187的人核酸序列编码的。在一些实施方案中，靶向SOCS1的核酸分子是靶向SOCS1的shRNA分子或siRNA分子，其结合选自SEQ ID NO:23-35的人靶序列(参见美国专利号8,324,369，其以引用的方式整体并入本文。(表7)。在一些实施方案中，靶向SOCS1的核酸分子是靶向SOCS1的shRNA分子或siRNA分子，其结合选自SEQ ID NO:36-55的小鼠靶序列(参见美国专利号9,944,931，其以引用的方式整体并入本文)(表8)。
表4：SOCS1人基因组坐标
Figure BDA0003756012870001041
Figure BDA0003756012870001051
Figure BDA0003756012870001061
表5：Socs1鼠基因组坐标
靶标 坐标
Socs1 chr16:10784479-10784498
Socs1 chr16:10784409-10784428
Socs1 chr16:10784456-10784475
Socs1 chr16:10784322-10784341
Socs1 chr16:10784548-10784567
Socs1 chr16:10784596-10784615
Socs1 chr16:10784264-10784283
Socs1 chr16:10784628-10784647
Socs1 chr16:10784526-10784545
Socs1 chr16:10784508-10784527
Socs1 chr16:10784565-10784584
Socs1 chr16:10784474-10784493
Socs1 chr16:10784293-10784312
表6：示例性人SOCS1 siRNA
Figure BDA0003756012870001063
表7：示例性人SOCS1 shRNA和siRNA靶序列
Figure BDA0003756012870001062
Figure BDA0003756012870001071
表8：示例性鼠Socs1 shRNA和siRNA靶序列
靶标 序列 SEQ ID
ND000214 TTTCGAGCTGCTGGAGCACTA 36
ND000219 TCGAGCTGCTGGAGCACTACG 37
TRCN0000231240 TCGCCAACGGAACTGCTTCTT 38
ND000218 ACTTCTGGCTGGAGACCTCAT 39
TRCN0000067420 GCGAGACCTTCGACTGCCTTT 40
TRCN0000067418 CGACACTCACTTCCGCACCTT 41
ND000220 CTACCTGAGTTCCTTCCCCTT 42
TRCN0000231238 TTCCGCTCCCACTCCGATTAC 43
TRCN0000231241 TAACCCGGTACTCCGTGACTA 44
ND000216 TACTCCGTGACTACCTGAGTT 45
ND000211 CTTCCGCTCCCACTCCGATTA 46
TRCN0000067422 GCGCGACAGTCGCCAACGGAA 47
TRCN0000231239 TGGACGCCTGCGGCTTCTATT 48
TRCN0000067419 CGCATCCCTCTTAACCCGGTA 49
ND000212 TACATATTCCCAGTATCTTTG 50
TRCN0000231242 GCGCCTTATTATTTCTTATTA 51
TRCN0000067421 CCGTGACTACCTGAGTTCCTT 52
ND000215 GGAGGGTCTCTGGCTTCATTT 53
ND000213 TTCGCGCTCAGCGTGAAGATG 54
ND000217 ATCCCTCTTAACCCGGTACTC 55
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少一种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向PTPN2的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9(人基因组)或表10(小鼠基因组)中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-314中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-314中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的人靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子是靶向SOCS1的shRNA或siRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的shRNA或siRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的shRNA或siRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的shRNA或siRNA分子结合与SEQID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:201-314中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:201-314中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
表9：PTPN2人基因组坐标
Figure BDA0003756012870001091
Figure BDA0003756012870001101
Figure BDA0003756012870001111
Figure BDA0003756012870001121
表10：Ptpn2鼠基因组坐标
靶标 坐标
Ptpn2 Chr18:67680998-67681017
Ptpn2 Chr18:67677801-67677820
Ptpn2 Chr18:67680904-67680923
Ptpn2 Chr18:67681553-67681572
Ptpn2 Chr18:67688965-67688984
Ptpn2 Chr18:67680958-67680977
Ptpn2 Chr18:67688944-67688963
Ptpn2 Chr18:67677855-67677874
Ptpn2 Chr18:67677734-67677753
Ptpn2 Chr18:67680967-67680986
Ptpn2 Chr18:67688912-67688931
Ptpn2 Chr18:67680881-67680900
Ptpn2 Chr18:67681529-67681548
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少一种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向ZC3H12A的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11(人基因组)或表12(小鼠基因组)中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-337或331-797中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-337或331-797中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子是靶向ZC3H12A的shRNA或siRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的shRNA或siRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的shRNA或siRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。例如，在一些实施方案中，靶向ZC3H12A的核酸分子是靶向ZC3H12A的siRNA，其包含选自SEQ ID NO:328-330或329和330(人)的核酸序列(参见Liu等人,Scientific Reports(2016),6,Article#24073和Mino等人,Cell(2015)161(5),1058-1073，所述文献以引用的方式整体并入本文)。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:336-789中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的shRNA或siRNA分子结合与SEQID NO:336-789中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，靶向ZC3H12A的核酸分子是靶向ZC3H12A的shRNA分子，其由选自SEQ ID NO:331-337的核酸序列编码(参见Huang等人,J Biol Chem(2015)290(34),20782-20792，其以引用的方式整体并入本文)。
表11：ZC3H12A人基因组坐标
Figure BDA0003756012870001141
Figure BDA0003756012870001151
Figure BDA0003756012870001161
Figure BDA0003756012870001171
Figure BDA0003756012870001181
Figure BDA0003756012870001191
Figure BDA0003756012870001201
Figure BDA0003756012870001211
Figure BDA0003756012870001221
Figure BDA0003756012870001231
Figure BDA0003756012870001241
Figure BDA0003756012870001251
表12：Zc3h12a鼠基因组坐标
靶标 坐标
Zc3h12a Chr1:125122335-125122354
Zc3h12a Chr1:125121083-125121102
Zc3h12a Chr1:125120961-125120980
Zc3h12a Chr1:125122390-125122409
Zc3h12a Chr1:125120373-125120392
Zc3h12a Chr1:125122250-125122269
Zc3h12a Chr1:125122375-125122394
Zc3h12a Chr1:125120975-125120994
表13：示例性鼠Zc3h12a siRNA序列
Figure BDA0003756012870001261
表14：示例性人ZC3H12A siRNA序列
靶标 序列 SEQ ID
ZC3H12A_siRNA_2 GUGUCCCUAUGGAAGGAAA 329
ZC3H12A_siRNA_3 CAACUUCCUUCGUAAGAAA 330
表15：鼠Zc3h12a shRNA和siRNA靶序列
Zc3h12a_shRNA_1 AGCGAGGCCACACAGATATTA 331
Zc3h12a_shRNA_2 GCTATGATGACCGCTTCATTG 332
Zc3h12a_shRNA_3 TGGTCTGAGCCGTACCCATTA 333
Zc3h12a_shRNA_4 CTGTGTACAGAGGCGAGATTT 334
Zc3h12a_siRNA_1 CCTGGACAACTTCCTTCGTAAGAAA 335
表16：人ZC3H12A shRNA和siRNA靶序列
靶标 序列 SEQ ID
ZC3H12A_siRNA_2 GTGTCCCTATGGAAGGAAA 336
ZC3H12A_siRNA_3 CAACTTCCTTCGTAAGAAA 337
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少一种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向CBLB的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ IDNO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17(人基因组)或表18(小鼠基因组)中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-808中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-808中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的人靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子是靶向CBLB的shRNA或siRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的shRNA或siRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的shRNA或siRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:798-808中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:798-808中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的人靶RNA序列。
表17：CBLB人基因组坐标
靶标 坐标
CBLB chr3:105853475-105853494
CBLB chr3:105853600-105853619
CBLB chr3:105720111-105720130
CBLB chr3:105867412-105867431
CBLB chr3:105867529-105867548
CBLB chr3:105720160-105720179
CBLB chr3:105853421-105853440
CBLB chr3:105751453-105751472
CBLB chr3:105693541-105693560
CBLB chr3:105867449-105867468
CBLB chr3:105853514-105853533
表18：Cblb小鼠基因组坐标
靶标 坐标
Cblb chr16:52152499-52152518
Cblb chr16:52139574-52139593
Cblb chr16:52139603-52139622
Cblb chr16:52112122-52112141
Cblb chr16:52112134-52112153
Cblb chr16:52152535-52152554
Cblb chr16:52142891-52142910
Cblb chr16:52135797-52135816
Cblb chr16:52131105-52131124
Cblb chr16:52112169-52112188
Cblb chr16:52204542-52204561
Cblb chr16:52131058-52131077
Cblb chr16:52135876-52135895
Cblb chr16:52135763-52135782
Cblb chr16:52139509-52139528
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少一种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向RC3H1的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19(人基因组)或表20(小鼠基因组)中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-836中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-836中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的人靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子是靶向RC3H1的shRNA或siRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的shRNA或siRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的shRNA或siRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的shRNA或siRNA分子结合与SEQID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:824-836中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:824-836中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的人靶RNA序列。
表19：RC3H1人基因组坐标
靶标 坐标
RC3H1 chr1:173946812-173946831
RC3H1 chr1:173992926-173992945
RC3H1 chr1:173980872-173980891
RC3H1 chr1:173982779-173982798
RC3H1 chr1:173980941-173980960
RC3H1 chr1:173992844-173992863
RC3H1 chr1:173992895-173992914
RC3H1 chr1:173992882-173992901
RC3H1 chr1:173961717-173961736
RC3H1 chr1:173984495-173984514
RC3H1 chr1:173980811-173980830
RC3H1 chr1:173964926-173964945
RC3H1 chr1:173982894-173982913
表20：Rc3h1小鼠基因组坐标
靶标 坐标
Rc3h1 chr1:160930251-160930270
Rc3h1 chr1:160930280-160930299
Rc3h1 chr1:160930154-160930173
Rc3h1 chr1:160942614-160942633
Rc3h1 chr1:160930266-160930285
Rc3h1 chr1:160930185-160930204
Rc3h1 chr1:160938126-160938145
Rc3h1 chr1:160930198-160930217
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少一种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向NFKBIA的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21(人基因组)或表22(小鼠基因组)中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-856中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-856中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的人靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子是靶向NFKBIA的shRNA或siRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的shRNA或siRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的shRNA或siRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:845-856中的一种编码的人RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的人靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的shRNA或siRNA分子结合与SEQ ID NO:845-856中的一种编码的人RNA序列具有100％同一性的人靶RNA序列。
表21：NFKBIA人基因组坐标
靶标 坐标
NFKBIA chr14:35404635-35404654
NFKBIA chr14:35402653-35402672
NFKBIA chr14:35402494-35402513
NFKBIA chr14:35404445-35404464
NFKBIA chr14:35403152-35403171
NFKBIA chr14:35403258-35403277
NFKBIA chr14:35404463-35404482
NFKBIA chr14:35403202-35403221
NFKBIA chr14:35404411-35404430
NFKBIA chr14:35402666-35402685
NFKBIA chr14:35403330-35403349
NFKBIA chr14:35403695-35403714
表22：Nfkbia小鼠基因组坐标
靶标 坐标
Nfkbia chr12:55491236-55491255
Nfkbia chr12:55491172-55491191
Nfkbia chr12:55491206-55491225
Nfkbia chr12:55490633-55490652
Nfkbia chr12:55491112-55491131
Nfkbia chr12:55490800-55490819
Nfkbia chr12:55490821-55490840
Nfkbia chr12:55490526-55490545
Nfkbia chr12:55491657-55491676
Nfkbia chr12:55491177-55491196
Nfkbia chr12:55491675-55491694
Nfkbia chr12:55490773-55490792
Nfkbia chr12:55490809-55490828
Nfkbia chr12:55491735-55491754
Nfkbia chr12:55490571-55490590
Nfkbia chr12:55490588-55490607
Nfkbia chr12:55491715-55491734
Nfkbia chr12:55492316-55492335
Nfkbia chr12:55491207-55491226
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1或NFKBIA的siRNA分子或shRNA分子获自商业供应商，诸如Sigma
Figure BDA0003756012870001341
等。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1、PTPN2或ZC3H12A的siRNA分子是表23中所示的一种。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1、PTPN2或ZC3H12A的shRNA分子是表24中所示的一种。
表23：示例性SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、RC3H1和NFKBIA siRNA
Figure BDA0003756012870001342
Figure BDA0003756012870001351
表24：示例性SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、RC3H1和NFKBIA shRNA
Figure BDA0003756012870001352
Figure BDA0003756012870001361
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向SOCS1的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向PTPN2的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ IDNO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ IDNO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向SOCS1的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向ZC3H12A的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ IDNO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具体100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向PTPN2的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向ZC3H12A的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ IDNO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ IDNO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具体100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向CBLB的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向PTPN2的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向CBLB的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向CBLB的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向ZC3H12A的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向CBLB的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ IDNO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向SOCS1的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向CBLB的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向CBLB的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向CBLB的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向RC3H1的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向PTPN2的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ IDNO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向RC3H1的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向ZC3H12A的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ IDNO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具体100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向SOCS1的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向RC3H1的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ IDNO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ IDNO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向CBLB的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向RC3H1的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向CBLB的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向RC3H1的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向NFKBIA的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向PTPN2的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向PTPN2的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向NFKBIA的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向ZC3H12A的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向ZC3H12A的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797或331-337中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向SOCS1的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向NFKBIA的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ IDNO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ IDNO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200或23-55中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向CBLB的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向NFKBIA的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向CBLB的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ IDNO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种核酸分子(例如，siRNA、shRNA、RNA适体或吗啉代)，其中至少一种核酸分子是靶向RC3H1的核酸分子并且至少一种核酸分子是靶向NFKBIA的核酸分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，基于核酸的基因调控系统包含至少两种siRNA或shRNA分子，其中至少一种siRNA或shRNA分子是靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子，并且至少一种siRNA或shRNA分子是靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的核酸分子是siRNA或shRNA分子，并且至少一种靶向NFKBIA的核酸分子是siRNA或shRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ IDNO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶RNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的siRNA或shRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875中的一种编码的RNA序列具有100％同一性的靶RNA序列。
B.基于蛋白质的基因调控系统
在一些实施方案中，本公开提供了蛋白质基因调控系统，其包含能够降低选自ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A的至少一种、两种或更多种内源基因的表达和/或功能的一种、两种或更多种蛋白质。(参见国际公布号WO 2019/178422、WO 2019/178420和WO2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文。)在一些实施方案中，本公开提供了蛋白质基因调控系统，其包含能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一种、两种或更多种内源基因的表达和/或功能的一种、两种或更多种蛋白质。在一些实施方案中，本公开提供了用本文所述的方法制造的包含此类基因调控系统的修饰的TIL。在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统是包含一种或多种蛋白质的系统，所述蛋白质能够以序列特异性方式调控内源靶基因表达而无需核酸指导分子。在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含含有一种或多种锌指结合结构域和酶结构域的蛋白质。在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含含有转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)结构域和酶结构域的蛋白质。此类实施方案在本文中被称为“TALEN”。
1锌指系统
在一些实施方案中，本公开提供了锌指基因调控系统，其包含能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一种、两种或更多种内源基因的表达和/或功能的一种、两种或更多种锌指融合蛋白。在一些实施方案中，本公开提供了用本文所述的方法制造的包含此类基因调控系统的修饰的TIL。本文中，基于锌指的系统包含具有两个蛋白质结构域的融合蛋白：锌指DNA结合结构域和酶结构域。“锌指DNA结合结构域”、“锌指蛋白”或“ZFP”是通过一种或多种锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述一种或多种锌指是其结构通过锌离子配位而稳定的结合结构域内的氨基酸序列区。锌指结构域通过与靶DNA序列结合，将酶结构域的活性导向序列的附近，并因此诱导靶序列附近的内源靶基因的修饰。锌指结构域可以被工程化以实际上与任何所需的序列结合。因此，在鉴定出包含需要切割或重组的靶DNA序列的靶遗传基因座(例如，表2或表3中提及的靶基因中的靶基因座)之后，可将一种或多种锌指结合结构域工程化以与靶遗传基因座中的一种或多种靶DNA序列结合。包含锌指结合结构域和酶结构域的融合蛋白在细胞中的表达影响靶遗传基因座的修饰。
在一些实施方案中，锌指结合结构域包含一个或多个锌指。Miller等人(1985)EMBO J.4:1609-1614；Rhodes(1993)Scientific American Febuary:56-65；美国专利号6,453,242。通常，单个锌指结构域的长度为约30个氨基酸。单个锌指与三核苷酸(即三联体)序列(或可以与相邻锌指的四核苷酸结合位点重叠一个核苷酸的四核苷酸序列)结合。因此，锌指结合结构域被工程化以结合的序列(例如，靶序列)的长度将决定工程化锌指结合结构域中锌指的数目。例如，对于其中指基序不与重叠的亚位点结合的ZFP，六核苷酸靶序列被两指结合结构域结合；九核苷酸靶序列被三指结合结构域结合，诸如此类。靶位点中单个锌指的结合位点(即亚位点)不必是连续的，而是可以被一个或若干个核苷酸隔开，这取决于多指结合结构域中锌指之间氨基酸序列(即指间接头)的长度和性质。在一些实施方案中，单个ZFP的DNA结合结构域包含三与六个之间的单个锌指重复序列，并且每个可识别9与18个之间的碱基对。
锌指结合结构域可以被工程化以与选择的序列结合。例如，参见Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotech nol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可以具有新颖的结合特异性。工程化方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择。
用于被锌指结构域结合的靶DNA序列的选择可以例如根据美国专利号6,453,242中公开的方法来完成。本领域技术人员将清楚，核苷酸序列的简单视觉检查也可用于选择靶DNA序列。因此，用于靶DNA序列选择的任何手段均可用于本文所述的方法。靶位点通常具有至少9个核苷酸的长度，并因此被包含至少三个锌指的锌指结合结构域结合。然而，例如4指结合结构域与12核苷酸靶位点的结合，5指结合结构域与15核苷酸靶位点的结合或6指结合结构域与18核苷酸靶位点的结合也是可以的。显而易见，较大的结合结构域(例如7、8、9指和更多指)与较长的靶位点的结合也是可以的
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种锌指融合蛋白(ZFP)，其包含靶向SOCS1的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200中的一种具有至少90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种锌指融合蛋白(ZFP)，其包含靶向PTPN2的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种锌指融合蛋白(ZFP)，其包含靶向ZC3H12A的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向CBLB的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向RC3H1的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向NFKBIA的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1或NFKBIA的ZFP获自商业供应商，诸如Sigma Aldrich、Dharmacon、ThermoFisher等。例如，在一些实施方案中，至少一种SOCS1、PTPN2或ZC3H12A ZFP是表25中所示的一种。
表25：示例性SOCS1、PTPN2和ZC3H12A锌指系统
Figure BDA0003756012870001811
Figure BDA0003756012870001821
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向SOCS1的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向PTPN2的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向SOCS1的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向ZC3H12A的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ IDNO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ IDNO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向PTPN2的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向ZC3H12A的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ IDNO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ IDNO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向CBLB的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向PTPN2的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ IDNO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向CBLB的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向ZC3H12A的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向SOCS1的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向CBLB的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ IDNO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向RC3H1的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向PTPN2的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向RC3H1的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向ZC3H12A的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ IDNO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向SOCS1的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向RC3H1的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向CBLB的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向RC3H1的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ IDNO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向NFKBIA的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向PTPN2的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ IDNO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ IDNO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向NFKBIA的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向ZC3H12A的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ IDNO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与ZC3H12A基因(SEQID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向SOCS1的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向NFKBIA的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ IDNO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ IDNO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向CBLB的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向NFKBIA的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种ZFP，其中至少一种ZFP包含靶向RC3H1的锌指结合结构域并且至少一种ZFP包含靶向NFKBIA的锌指结合结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ IDNO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ IDNO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的锌指结合结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
锌指融合蛋白的酶结构域部分可从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。可以衍生出酶结构域的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见，例如，2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,Mass.；和Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。切割DNA的另外的酶是已知的(例如51核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；也参见Linn等人(编)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能片段)中的一种或多种可以用作切割结构域的来源。
适合用作本文所述的ZFP的酶结构域的示例性限制性核酸内切酶(限制性酶)存在于许多物种中，并且能够与DNA进行序列特异性结合(在识别位点处)，并能够在结合位点处或附近切割DNA。某些限制性酶(例如，IIS型)在从识别位点去除的位点处切割DNA，并具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶FokI在一条链上距其识别位点9个核苷酸处和在另一条链上距其识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人。(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:31978-31982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的酶结构域和一种或多种锌指结合结构域。
其切割结构域可与结合结构域分离的示例性IIS型限制性酶是FokI。这种特定的酶作为二聚体具有活性。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。因此，对于使用锌指-FokI融合物的靶向双链DNA切割，可以使用两个融合蛋白(每个包含FokI酶结构域)来重构催化活性的切割结构域。或者，也可以使用包含锌指结合结构域和两个FokI酶结构域的单个多肽分子。在美国专利号9,782,437中描述了包含FokI酶结构域的示例性ZFP。
2.TALEN系统
在一些实施方案中，本公开提供了TALEN基因调控系统，其包含能够降低选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA的至少一种、两种或更多种内源基因的表达和/或功能的一种、两种或更多种TALEN融合蛋白。在一些实施方案中，本公开提供了用本文所述的方法制造的包含此类基因调控系统的修饰的TIL。基于TALEN的系统包含含有TAL效应子DNA结合结构域和酶结构域的TALEN融合蛋白。它们是通过将TAL效应子DNA结合结构域与DNA切割结构域(切割DNA链的核酸酶)融合而制成的。上述的FokI限制性酶是适用于基于TALEN的基因调控系统的示例性酶结构域。
TAL效应子是黄单孢菌属(Xanthomonas)细菌在感染植物时通过其III型分泌系统分泌的蛋白质。DNA结合结构域包含重复的高度保守的33-34个氨基酸的序列，其中第12和第13个氨基酸不同。这两个位置(称为重复可变二残基(RVD))是高度可变的并且与特定性核苷酸识别高度相关。因此，TAL效应子结构域可以被工程化以通过选择包含适当RVD的重复区段的组合来结合特异性靶DNA序列。对RVD组合具有特异性的核酸如下：HD靶向胞嘧啶，NI靶向腺嘌呤，NG靶向胸腺嘧啶，并且NN靶向鸟嘌呤(尽管在一些实施方案中，NN也可以以较低的特异性结合腺嘌呤)。
用于装配TAL效应子重复序列的方法和组合物是本领域已知的。参见例如，Cermak等人,Nucleic Acids Research,39:12,2011,e82。用于构建TAL效应子重复序列的质粒可购自Addgene。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向SOCS1的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向PTPN2的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQID NO:6)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向CBLB的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向RC3H1的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表7或表8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少一种TALEN融合蛋白，其包含靶向NFKBIA的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的靶DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ IDNO:12)中的靶DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向SOCS1的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向PTPN2的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-18723-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ IDNO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向SOCS1的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-18723-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向PTPN2的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向CBLB的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向PTPN2的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向CBLB的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向SOCS1的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向CBLB的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向RC3H1的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向PTPN2的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向RC3H1的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ IDNO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向SOCS1的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向RC3H1的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向CBLB的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向RC3H1的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向NFKBIA的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向PTPN2的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ IDNO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向NFKBIA的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:331-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的TAL效应子结构域结合与SEQ IDNO:331-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向SOCS1的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向NFKBIA的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:23-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向CBLB的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向NFKBIA的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，基于蛋白质的基因调控系统包含至少两种Talen融合蛋白，其中至少一种Talen融合蛋白包含靶向RC3H1的TAL效应子结构域，并且至少一种Talen融合蛋白包含靶向NFKBIA的TAL效应子结构域。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的TAL效应子结构域结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
C.基于组合核酸/蛋白质的基因调控系统
组合基因调控系统包含定点修饰多肽和核酸指导分子。本文中，“定点修饰多肽”是指结合核酸指导分子的多肽，通过其结合的核酸指导分子靶向靶核酸序列(例如，内源靶DNA或RNA序列)，并修饰靶核酸序列(例如，靶核酸序列的切割、突变或甲基化)。
定点修饰多肽包含两个部分，与核酸指导物结合的部分和活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含表现出定点酶活性(例如，DNA甲基化、DNA或RNA切割、组蛋白乙酰化、组蛋白甲基化等)的活性部分，其中酶活性的位点由指导核酸确定。在一些情况下，定点修饰多肽包括具有修饰内源靶核酸序列的酶活性(例如，核酸酶活性、甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、DNA修复活性、DNA损伤活性、脱氨活性、歧化酶活性、烷基化活性、脱嘌呤活性、氧化活性、嘧啶二聚体形成活性、整合酶活性、转座酶活性、重组酶活性、聚合酶活性、连接酶活性、解旋酶活性、光解酶活性或糖基化酶活性)的活性部分。在其他情况下，定点修饰多肽包含具有修饰与内源靶核酸序列相关联的多肽(例如组蛋白)的酶活性(例如甲基转移酶活性、脱甲基酶活性、乙酰转移酶活性、脱乙酰酶活性、激酶活性、磷酸酶活性、泛素连接酶活性、脱泛素化活性、腺苷酰化活性、脱腺苷酰化活性、SUMO化活性、脱SUMO化活性、核糖基化活性、脱核糖基化活性、豆蔻酰化活性或脱豆蔻酰化活性)的活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含调节靶DNA序列的转录(例如，增加或减少转录)的活性部分。在一些实施方案中，定点修饰多肽包含调节靶RNA序列的表达或翻译(例如，增加或减少转录)的活性部分。
核酸指导物包含两个部分：与内源靶核酸序列互补并能够与其结合的第一部分(本文中称为“核酸结合区段”)，以及能够与定点修饰多肽相互作用的第二部分(本文中称为“蛋白质结合区段”)。在一些实施方案中，核酸指导物的核酸结合区段和蛋白质结合区段包含在单个多核苷酸分子内。在一些实施方案中，核酸指导物的核酸结合区段和蛋白质结合区段各自包含在单独的多核苷酸分子内，使得核酸指导物包含两个彼此缔合以形成功能性指导物的多核苷酸分子。
核酸指导物通过与靶核酸序列特异性杂交来介导组合的蛋白质/核酸基因调控系统的靶特异性。在一些实施方案中，靶核酸序列是RNA序列，诸如包含在靶基因的mRNA转录物中的RNA序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是包含在靶基因的DNA序列中的DNA序列。本文提及靶基因涵盖所述特定基因的全长DNA序列，其包含多个靶遗传基因座(即，特定靶基因序列的部分(例如，外显子或内含子))。在每个靶遗传基因座内的是本文中称为“靶DNA序列”的DNA序列的较短片段，其可以通过本文所述的基因调控系统进行修饰。此外，每个靶遗传基因座包含“靶修饰位点”，其是指由基因调控系统诱导的修饰的精确位置(例如，插入、缺失或突变的位置，DNA断裂的位置或表观遗传修饰的位置)。本文所述的基因调控系统可包含2个或更多个核酸指导物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个核酸指导物)。
在一些实施方案中，组合的蛋白质/核酸基因调控系统包含衍生自Argonaute(Ago)蛋白(例如，T.thermophiles Ago或TtAgo)的定点修饰多肽。在此类实施方案中，定点修饰多肽是T.thermophiles Ago DNA核酸内切酶，并且核酸指导物是指导DNA(gDNA)(参见，Swarts等人,Nature 507(2014),258-261)。在一些实施方案中，本公开提供了编码gDNA的多核苷酸。在一些实施方案中，gDNA编码核酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。在一些实施方案中，本公开提供了编码TtAgo定点修饰多肽或其变体的多核苷酸。在一些实施方案中，编码TtAgo定点修饰多肽的多核苷酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。
在一些实施方案中，本文所述的基因编辑系统是CRISPR(成簇的规则间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)核酸酶系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是2类系统。2类CRISPR/Cas系统分为三种类型：II型、V型和VI型系统。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas9蛋白的2类II型系统。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas9 DNA核酸内切酶(或其变体)，并且核酸指导分子是指导RNA(gRNA)。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas12蛋白(例如，Cas12a(也称为Cpf1)、Cas12b(也称为C2c1)、Cas12c(也称为C2c3)、Cas12d(也称为CasY)和Cas12e(也称为CasX))的2类V型系统。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas12DNA核酸内切酶(或其变体)，并且核酸指导分子是gRNA。在一些实施方案中，CRISPR/Cas系统是利用Cas13蛋白(例如，Cas13a(也称为C2c2)、Cas13b和Cas13c)的2类VI型系统。(参见，Pyzocha等人,ACS Chemical Biology,13(2),347-356)。在此类实施方案中，定点修饰多肽是Cas13 RNA核糖核酸内切酶，并且核酸指导分子是gRNA。
Cas多肽是指可以与gRNA分子相互作用并且与gRNA分子一起归巢或定位于靶DNA或靶RNA序列的多肽。Cas多肽包括天然存在的Cas蛋白，以及与天然存在的Cas序列相差一个或多个氨基酸残基的工程化的、改变的或以其他方式修饰的Cas蛋白。
指导RNA(gRNA)包含两个区段，DNA结合区段和蛋白质结合区段。在一些实施方案中，gRNA的蛋白质结合区段包含在一个RNA分子中，而DNA结合区段包含在另一个单独的RNA分子中。此类实施方案在本文中称为“双分子gRNA”或“两分子gRNA”或“双gRNA”。在一些实施方案中，gRNA是单个RNA分子，并且在本文中被称为“单指导RNA”或“sgRNA”。术语“指导RNA”或“gRNA”是包含性的，是指两分子指导RNA和sgRNA两者。
gRNA的蛋白质结合区段部分地包含两个互补的核苷酸片段，它们彼此杂交以形成双链RNA双链体(dsRNA双链体)，其促进与Cas蛋白的结合。gRNA的核酸结合区段(或“核酸结合序列”)包含与特异性靶核酸序列互补并能够与其结合的核苷酸序列。gRNA的蛋白质结合区段与Cas多肽相互作用，并且gRNA分子与定点修饰多肽的相互作用导致Cas与内源核酸序列结合，并在靶核酸序列内或周围产生一个或多个修饰。靶修饰位点的精确位置由以下两者确定：(i)gRNA与靶核酸序列之间的碱基配对互补性；和(ii)短基序(称为前间隔序列邻近基序(PAM))在靶DNA序列中的位置(在靶RNA序列中称为前间隔序列侧翼序列(PFS))。PAM/PFS序列是Cas与靶核酸序列结合所必需的。多种PAM/PFS序列是本领域已知的并且适用于特定的Cas核酸内切酶(例如，Cas9核酸内切酶)。(参见例如，Nat Methods.2013年11月；10(11):1116–1121和Sci Rep.2014；4:5405)。在一些实施方案中，PAM序列位于靶DNA序列中靶修饰位点的50个碱基对内。在一些实施方案中，PAM序列位于靶DNA序列中靶修饰位点的10个碱基对内。可以通过这种方法靶向的DNA序列仅受限于PAM序列与靶修饰位点的相对距离以及介导序列特异性的gRNA介导的Cas结合的独特20个碱基对序列的存在。在一些实施方案中，PFS序列位于靶RNA序列的3'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的5'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的3'末端。在一些实施方案中，靶修饰位点位于靶基因座的内含子或外显子内。
在一些实施方案中，本公开提供了编码gRNA的多核苷酸。在一些实施方案中，编码gRNA的核酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。在一些实施方案中，本公开提供了编码定点修饰多肽的多核苷酸。在一些实施方案中，编码定点修饰多肽的多核苷酸包含在表达载体中，例如重组表达载体中。
1.Cas蛋白
在一些实施方案中，定点修饰多肽是Cas蛋白。多种物种的Cas分子可用于本文所述的方法和组合物中，包括来源于以下的Cas分子：酿脓链球菌(S.pyogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、脑膜炎奈瑟氏菌(N.meningitidis)、嗜热链球菌(S.thermophiles)、燕麦嗜酸菌(Acidovorax avenae)、胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)、琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、猪放线杆菌(Actinobacillus suis)、放线菌属某种(Actinomyces sp.)、Cycliphilus denitrificans、少食氨基单胞菌(Aminomonas paucivorans)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、史密斯芽孢杆菌(Bacillus smithii)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、拟杆菌属某种(Bacteroides sp)、海洋芽小梨形菌(Blastopirellula marina)、慢生根瘤菌属某种(Bradyrhizobium sp.)、侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterospoxus)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、拉里弯曲杆菌(Campylobacter lari)、Candidatus puniceispirillum、解纤梭菌(Clostridiumcellulolyticum)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、拥挤棒杆菌(Corynebacterium accolens)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、马氏棒杆菌(Corynebacterium matruchotii)、恒雄芝氏沟鞭藻玫瑰杆菌(Dinoroseobactershibae)、细长真杆菌(Eubacterium dolichum)、伽马变形杆菌(Gammaproteobacterium)、重氮葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter diazotrophicus)、流感嗜血菌(Haemophilusparainfluenzae)、唾液嗜血菌(Haemophilus sputomm)、加拿大螺杆菌(Helicobactercanadensis)、同性恋螺杆菌(Helicobacter cinaedi)、雪貂螺杆菌(Helicobactermustelae)、多养型泥杆菌(Ilyobacter polytropus)、金氏金菌(Kingella kingae)、卷曲乳酸杆菌(Lactobacillus crispatus)、伊氏李斯特氏菌(Listeria ivanovii)、单增李斯特菌(Listeria monocytogenes)、李斯特菌科细菌(Listeriaceae bacterium)、甲基孢囊菌属某种(Methylocystis sp.)、发孢甲基弯曲菌(Methylosinus trichosporium)、羞怯动弯杆菌(Mobiluncus mulieris)、杆状奈瑟氏菌(Neisseria bacilliformis)、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea)、浅黄奈瑟氏菌(Neisseria flavescens)、乳糖奈瑟氏菌(Neisseria lactamica)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、奈瑟氏菌属某种(Neisseria sp.)、沃氏奈瑟氏菌(Neisseria wadsworthii)、亚硝化单胞菌属某种(Nitrosomonas sp.)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida)、食琥珀酸考拉杆菌(Phascolarctobacteriumsuccinatutens)、蒲桃雷尔氏菌(Ralstonia syzygii)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、小红卵菌属某种(Rhodovulum sp.)、米氏西蒙斯氏菌(Simonsiella muelleri)、鞘氨醇单胞菌属某种(Sphingomonas sp.)、葡萄园芽孢乳杆菌(Sporolactobacillus vineae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)、链球菌属某种(Streptococcus sp.)、罕见小球菌属某种(Subdoligranulum sp.)、运动替斯崔纳菌(Tistrella mobilis)、密螺旋体属某种(Treponema sp.)或Verminephrobacter eiseniae。
在一些实施方案中，Cas蛋白是天然存在的Cas蛋白。在一些实施方案中，Cas核酸内切酶选自由以下组成的组：C2C1、C2C3、Cpf1(也称为Cas12a)、Cas12b、Cas12c、Cas12d、Cas12e、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13d、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csx12)、Cas10、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csfl、Csf2、Csf3和Csf4。
在一些实施方案中，Cas蛋白是核糖核酸内切酶，诸如Cas13蛋白。在一些实施方案中，Cas13蛋白是Cas13a(Abudayyeh等人,Nature550(2017),280-284)、Cas13b(Cox等人,Science(2017)358:6336,1019-1027)、Cas13c(Cox等人,Science(2017)358:6336,1019-1027)或Cas13d(Zhang等人,Cell 175(2018),212-223)蛋白。
在一些实施方案中，Cas蛋白是野生型或天然存在的Cas9蛋白或Cas9直系同源物。野生型Cas9是一种多结构域酶，其使用HNH核酸酶结构域来切割DNA的靶链，并使用RuvC样结构域来切割非靶链。野生型Cas9与DNA的基于gRNA特异性的结合导致双链DNA断裂，其可通过非同源末端连接(NHEJ)或同源性定向修复(HDR)进行修复。示例性的天然存在的Cas9分子在Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述，并且另外的Cas9直系同源物在国际PCT公布号WO 2015/071474中描述。此类Cas9分子包括第1类群细菌科、第2类群细菌科、第3类群细菌科、第4类群细菌科、第5类群细菌科、第6类群细菌科、第7类群细菌科、第8类群细菌科、第9类群细菌科、第10类群细菌科、第11类群细菌科、第12类群细菌科、第13类群细菌科、第14类群细菌科、第15类群细菌科、第16类群细菌科、第17类群细菌科、第18类群细菌科、第19类群细菌科、第20类群细菌科、第21类群细菌科、第22类群细菌科、第23类群细菌科、第24类群细菌科、第25类群细菌科、第26类群细菌科、第27类群细菌科、第28类群细菌科、第29类群细菌科、第30类群细菌科、第31类群细菌科、第32类群细菌科、第33类群细菌科、第34类群细菌科、第35类群细菌科、第36类群细菌科、第37类群细菌科、第38类群细菌科、第39类群细菌科、第40类群细菌科、第41类群细菌科、第42类群细菌科、第43类群细菌科、第44类群细菌科、第45类群细菌科、第46类群细菌科、第47类群细菌科、第48类群细菌科、第49类群细菌科、第50类群细菌科、第51类群细菌科、第52类群细菌科、第53类群细菌科、第54类群细菌科、第55类群细菌科、第56类群细菌科、第57类群细菌科、第58类群细菌科、第59类群细菌科、第60类群细菌科、第61类群细菌科、第62类群细菌科、第63类群细菌科、第64类群细菌科、第65类群细菌科、第66类群细菌科、第67类群细菌科、第68类群细菌科、第69类群细菌科、第70类群细菌科、第71类群细菌科、第72类群细菌科、第73类群细菌科、第74类群细菌科、第75类群细菌科、第76类群细菌科、第77类群细菌科或第78类群细菌科的Cas9分子。
在一些实施方案中，天然存在的Cas9多肽选自由以下组成的组：SpCas9、SpCas9-HF1、SpCas9-HF2、SpCas9-HF3、SpCas9-HF4、SaCas9、FnCpf、FnCas9、eSpCas9和NmeCas9。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含与Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737；Hou等人,PNAS Early Edition 2013,1-6)中描述的Cas9氨基酸序列具有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，Cas多肽包含以下活性中的一种或多种：
a.切口酶活性，即切割核酸分子的单链，例如非互补链或互补链的能力；
b.双链核酸酶活性，即切割双链核酸的两条链并产生双链断裂的能力，在一个实施方案中，这是存在两种切口酶活性；
c.核酸内切酶活性；
d.核酸外切酶活性；和/或
e.解旋酶活性，即解旋双链核酸的螺旋结构的能力。
在一些实施方案中，将Cas多肽与募集DNA损伤信号传导蛋白、核酸外切酶或磷酸酶的异源蛋白融合，以进一步增加通过一种或另一种修复机制修复靶序列的可能性或速率。在一些实施方案中，野生型Cas多肽与核酸修复模板共表达以促进外源核酸序列通过同源性定向修复的引入。
在一些实施方案中，不同的Cas蛋白(即，来自各种物种的Cas9蛋白)可有利地用于各种提供的方法中，以便利用不同Cas蛋白的各种酶特征(例如，用于不同的PAM序列偏好；用于增加或减小的酶活性；用于增加或减小的细胞毒性水平；改变NHEJ、同源性定向修复、单链断裂、双链断裂等之间的平衡)。
在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于酿脓链球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGG、NAG、NGA(Mali等人,Science 2013；339(6121):823-826)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于嗜热链球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGGNG和/或NNAGAAW(W＝A或T)(参见，例如，Horvath等人,Science,2010；327(5962):167-170和Deveau等人,J Bacteriol2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于变形链球菌(S.mutans)的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NGG和/或NAAR(R＝A或G)(参见，例如，Deveau等人,JBACTERIOL 2008；190(4):1390-1400)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序NNGRR(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序N GRRT(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序N GRRV(R＝A或G)。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于脑膜炎奈瑟氏菌的Cas9蛋白，并识别PAM序列基序N GATT或N GCTT(R＝A或G，V＝A，G或C)(参见，例如，Hou等人,PNAS 2013,1-6)。在上述实施方案中，N可以是任何核苷酸残基，例如，A、G、C或T中的任一种。在一些实施方案中，Cas蛋白是来源于沙氏纤毛菌(Leptotrichia shahii)的Cas13a蛋白，并识别单个3'A、U或C的PFS序列基序。
在一些实施方案中，提供了编码Cas蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公布号WO 2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述的Cas蛋白具有至少90％同一性的Cas蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公布号2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 201310:5,727-737中描述的Cas蛋白具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的Cas蛋白。在一些实施方案中，多核苷酸编码与国际PCT公布号WO 2015/071474或Chylinski等人,RNA Biology 2013 10:5,727-737中描述的Cas蛋白具有100％同一性的Cas蛋白。
2.Cas突变体
在一些实施方案中，Cas多肽被工程化以改变Cas多肽的一种或多种特性。例如，在一些实施方案中，Cas多肽包含改变的酶特性，例如改变的核酸酶活性(与天然存在的或其他参考Cas分子相比)或改变的解旋酶活性。在一些实施方案中，工程化的Cas多肽可具有改变其大小的改变，例如氨基酸序列的缺失，其减小序列大小，但对Cas多肽的另一种特性没有显著影响。在一些实施方案中，工程化的Cas多肽包含影响PAM识别的改变。例如，可以改变工程化的Cas多肽以识别除了被对应的野生型Cas蛋白识别的PAM序列以外的PAM序列。
具有所需特性的Cas多肽可以通过多种方式制备，包括改变天然存在的Cas多肽或亲本Cas多肽，以提供具有所需特性的突变体或改变的Cas多肽。例如，可以将一个或多个突变引入亲本Cas多肽(例如，天然存在或工程化的Cas多肽)的序列。此类突变和差异可以包括取代(例如，保守取代或非必需氨基酸的取代)；插入；或缺失。在一些实施方案中，相对于亲本Cas多肽，突变体Cas多肽包含一个或多个突变(例如，至少1、2、3、4、5、10、15、20、30、40或50个突变)。
在一个实施方案中，突变体Cas多肽包含与天然存在的Cas多肽不同的切割特性。在一些实施方案中，Cas是失活的Cas(dCas)突变体。在此类实施方案中，Cas多肽不包含任何内在的酶活性，并且不能介导靶核酸切割。在此类实施方案中，dCas可以与能够以基于非切割的方式修饰靶核酸的异源蛋白融合。例如，在一些实施方案中，dCas蛋白与转录激活物或转录阻遏物结构域(例如，Kruppel相关盒(KRAB或SKD)；Mad mSIN3相互作用结构域(SID或SID4X)；ERF阻遏物结构域(ERD)；MAX相互作用蛋白1(MXI1)；甲基CpG结合蛋白2(MECP2)等)融合。在一些此类情况下，dCas融合蛋白被sgRNA靶向靶核酸中的具体位置(即序列)，并发挥基因座特异性调控，诸如阻断RNA聚合酶与启动子的结合(其选择性地抑制转录激活物功能)，和/或修饰局部染色质状态(例如，当使用修饰靶DNA或修饰与靶DNA相关联的多肽的融合序列时)。在一些情况下，变化是瞬时的(例如，转录阻遏或活化)。在一些情况下，变化是可遗传的(例如，当对靶DNA或与靶DNA相关联的蛋白质例如核小体组蛋白进行表观遗传修饰时)。
在一些实施方案中，dCas是dCas13突变体(Konermann等人,Cell173(2018),665-676)。然后可以将这些dCas13突变体与修饰RNA的酶融合，包括腺苷脱氨酶(例如ADAR1和ADAR2)。腺苷脱氨基酶将腺嘌呤转化为肌苷，翻译机制将其视为鸟嘌呤，从而在RNA序列中产生功能性A→G变化。在一些实施方案中，dCas是dCas9突变体。
在一些实施方案中，突变体Cas9是Cas9切口酶突变体。Cas9切口酶突变体仅包含一个催化活性结构域(HNH结构域或RuvC结构域)。Cas9切口酶突变体保留基于gRNA特异性的DNA结合，但仅能够切割一条DNA链，从而导致单链断裂(例如“切口”)。在一些实施方案中，两个互补的Cas9切口酶突变体(例如，一个具有失活的RuvC结构域的Cas9切口酶突变体，以及一个具有失活的HNH结构域的Cas9切口酶突变体)在同一细胞中用对应于两个各自靶序列的两个gRNA表达；一个在有义DNA链上的靶序列，以及一个在反义DNA链上的靶序列。这种双切口酶系统导致交错的双链断裂，并且可以增加靶特异性，因为它不太可能产生两个足够近的脱靶切口以产生双链断裂。在一些实施方案中，Cas9切口酶突变体与核酸修复模板共表达，以促进外源核酸序列通过同源性定向修复的引入。
在一些实施方案中，本文所述的Cas多肽可以被工程化以改变Cas多肽的PAM/PFS特异性。在一些实施方案中，突变体Cas多肽具有与亲本Cas多肽的PAM/PFS特异性不同的PAM/PFS特异性。例如，可以修饰天然存在的Cas蛋白，以改变突变体Cas多肽识别的PAM/PFS序列，来减少脱靶位点、提高特异性或消除PAM/PFS识别需求。在一些实施方案中，可以修饰Cas蛋白以增加PAM/PFS识别序列的长度。在一些实施方案中，PAM识别序列的长度为至少4、5、6、7、8、9、10或15个氨基酸。可以使用定向进化产生识别不同PAM/PFS序列和/或具有降低的脱靶活性的Cas多肽。可用于Cas多肽的定向进化的示例性方法和系统描述于例如Esvelt等人Nature2011,472(7344):499-503中。
示例性Cas突变体描述于国际PCT公布号WO 2015/161276和Konermann等人,Cell173(2018),665-676中，其以引用的方式整体并入本文。
3.gRNA
本公开提供了将定点修饰多肽定向至具体靶核酸序列的指导RNA(gRNA)。gRNA包含核酸靶向区段和蛋白质结合区段。gRNA的核酸靶向区段包含与靶核酸序列中的序列互补的核苷酸序列。因此，gRNA的核酸靶向区段经由杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用，并且核酸靶向区段的核苷酸序列决定gRNA将结合的靶核酸内的位置。gRNA的核酸靶向区段可以被修饰(例如，通过遗传工程)以与靶核酸序列内的任何所需序列杂交。
指导RNA的蛋白结合区段与定点修饰多肽(例如，Cas蛋白)相互作用以形成复合物。指导RNA通过上述核酸靶向区段将结合的多肽指导至靶核酸内的特定核苷酸序列。指导RNA的蛋白结合区段包含两段核苷酸，它们彼此互补并形成双链RNA双链体。
在一些实施方案中，gRNA包含两个单独的RNA分子。在此类实施方案中，两个RNA分子中的每一个都包含一段彼此互补的核苷酸，使得两个RNA分子的互补核苷酸杂交以形成蛋白质结合区段的双链RNA双链体。在一些实施方案中，gRNA包含单个RNA分子(sgRNA)。
gRNA对靶基因座的特异性由核酸结合区段的序列介导，所述核酸结合区段包含与靶基因座内的靶核酸序列互补的约20个核苷酸。在一些实施方案中，对应的靶核酸序列的长度为约20个核苷酸。在一些实施方案中，本公开的gRNA序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列至少90％互补。在一些实施方案中，本公开的gRNA序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列至少95％、96％、97％、98％或99％互补。在一些实施方案中，本公开的gRNA序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列100％互补。在一些实施方案中，靶核酸序列是RNA靶序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是DNA靶序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是来自内源基因的DNA靶序列，包括ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。(参见国际公布号WO 2019/178422、WO2019/178420和WO 2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文。)
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向SOCS1的核酸结合区段(即靶向SOCS1的gRNA)。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子的核酸结合区段结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子的核酸结合区段结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子的核酸结合区段结合与表3或表4中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子的核酸结合区段结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。示例性SOCS1靶DNA序列示于表26和27中。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ IDNO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ IDNO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。编码靶向SOCS1的gRNA的核酸结合区段的示例性DNA序列示于表26和27中。
表26：示例性人SOCS1靶序列
Figure BDA0003756012870002361
Figure BDA0003756012870002371
Figure BDA0003756012870002381
Figure BDA0003756012870002391
Figure BDA0003756012870002401
表27：示例性鼠Socs1靶序列
Figure BDA0003756012870002402
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向PTPN2的核酸结合区段(即靶向PTPN2的gRNA)。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。示例性PTPN2靶DNA序列示于表28和29中。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ IDNO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。编码靶向PTPN2的gRNA的核酸结合区段的示例性DNA序列示于表28和29中。
表28：示例性人PTPN2 gRNA序列
Figure BDA0003756012870002411
Figure BDA0003756012870002421
Figure BDA0003756012870002431
Figure BDA0003756012870002441
表29：示例性鼠Ptpn2 gRNA序列
Figure BDA0003756012870002442
Figure BDA0003756012870002451
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向ZC3H12A的核酸结合区段(即靶向ZC3H12A的gRNA)。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。示例性ZC3H12A靶DNA序列示于表30和31中。
在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。编码靶向ZC3H12A的gRNA的核酸结合区段的示例性DNA序列示于表30和31中。
表30：示例性人ZC3H12A gRNA序列
Figure BDA0003756012870002461
Figure BDA0003756012870002471
Figure BDA0003756012870002481
Figure BDA0003756012870002491
Figure BDA0003756012870002501
Figure BDA0003756012870002511
Figure BDA0003756012870002521
Figure BDA0003756012870002531
Figure BDA0003756012870002541
Figure BDA0003756012870002551
Figure BDA0003756012870002561
Figure BDA0003756012870002571
表31：示例性鼠Zc3h12a gRNA序列
靶标 序列 SEQ ID
mZc3h12a_gRNA_1 GCTGGCTGTGAACTGGTTTC 790
mZc3h12a_gRNA_2 CTAGTTCCCGAAGGATGTGC 791
mZc3h12a_gRNA_3 ATTGGAGACCACCACTCCGT 792
mZc3h12a_gRNA_4 TTCCCTCCTCTGCCAGCCAT 793
mZc3h12a_gRNA_5 CGAAGGAAGTTGTCCAGGCT 794
mZc3h12a_gRNA_6 ATACCTGTGATAGGCACATC 795
mZc3h12a_gRNA_7 GACTTCCTTGTTCCCATGGC 796
mZc3h12a_gRNA_8 GGCCTTCGAATCCGACGGAG 797
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向CBLB的核酸结合区段(即靶向CBLB的gRNA)。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子的核酸结合区段结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子的核酸结合区段结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子的核酸结合区段结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子的核酸结合区段结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。示例性CBLB靶DNA序列示于表32和33中。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ IDNO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。编码靶向CBLB的gRNA的核酸结合区段的示例性DNA序列示于表32和33中。
表32：示例性人CBLB gRNA序列
Figure BDA0003756012870002581
Figure BDA0003756012870002591
表33：示例性鼠Cblb gRNA序列
Figure BDA0003756012870002592
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向RC3H1的核酸结合区段(即靶向RC3H1的gRNA)。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子的核酸结合区段结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子的核酸结合区段结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子的核酸结合区段结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子的核酸结合区段结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。示例性RC3H1靶DNA序列示于表34和35中。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ IDNO:824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ ID NO:824-844或824-836中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。编码靶向RC3H1的gRNA的核酸结合区段的示例性DNA序列示于表34和35中。
表34：示例性人RC3H1 gRNA序列
Figure BDA0003756012870002601
Figure BDA0003756012870002611
表35：示例性鼠Rc3h1 gRNA序列
靶标 序列 SEQ ID
m Rc3h1_gRNA_1 CAAATGGGCAAGCCTTACGG 837
m Rc3h1_gRNA_2 CTCAATGTCCGTATTGATAG 838
m Rc3h1_gRNA_3 AGTCTGAGTGCAAATTGGGC 839
m Rc3h1_gRNA_4 CCAGATAGTGCAAATTGCTA 840
m Rc3h1_gRNA_5 TGATAGTGGTCTGGTCAAAT 841
m Rc3h1_gRNA_6 AATTCGAAAGCCCATCAGTT 842
m Rc3h1_gRNA_7 GCCCATTACTTTGTGTAGTG 843
m Rc3h1_gRNA_8 TGGCCACAGCCCAAACTGAT 844
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少一种gRNA分子，所述gRNA分子包含靶向NFKBIA的核酸结合区段(即靶向NFKBIA的gRNA)。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子的核酸结合区段结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQID NO:12)编码的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子的核酸结合区段结合与NFKBIA基因(SEQID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子的核酸结合区段结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子的核酸结合区段结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ IDNO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子的核酸结合区段结合与SEQ IDNO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。示例性NFKBIA靶DNA序列示于表36和37中。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ IDNO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子的核酸结合区段由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。编码靶向NFKBIA的gRNA的核酸结合区段的示例性DNA序列示于表36和37中。
表36：示例性人NFKBIA gRNA序列
Figure BDA0003756012870002621
表37：示例性鼠Nfkbia gRNA序列
Figure BDA0003756012870002622
Figure BDA0003756012870002631
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向SOCS1的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向PTPN2的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ IDNO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向SOCS1的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向ZC3H12A的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向PTPN2的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向ZC3H12A的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向CBLB的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向PTPN2的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ IDNO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向CBLB的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向ZC3H12A的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ IDNO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ IDNO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向SOCS1的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向CBLB的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向RC3H1的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向PTPN2的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ IDNO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向RC3H1的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向ZC3H12A的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向SOCS1的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向RC3H1的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向CBLB的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向RC3H1的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ IDNO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ ID NO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向NFKBIA的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向PTPN2的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ IDNO:4)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与PTPN2基因(SEQ ID NO:3)或Ptpn2基因(SEQ ID NO:4)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与表9或表10中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子结合与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向PTPN2的gRNA分子由与SEQ ID NO:201-327或201-314中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向NFKBIA的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向ZC3H12A的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与ZC3H12A基因(SEQ ID NO:5)或Zc3h12a基因(SEQ ID NO:6)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与表11或表12中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子结合与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向ZC3H12A的gRNA分子由与SEQ ID NO:331-797、338-797或338-789中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向SOCS1的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向NFKBIA的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQID NO:2)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ IDNO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SOCS1基因(SEQ ID NO:1)或Socs1基因(SEQ ID NO:2)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与表4或表5中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向SOCS1的gRNA分子由与SEQ ID NO:23-200、56-200或56-187中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向CBLB的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向NFKBIA的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ IDNO:8)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与CBLB基因(SEQ ID NO:7)或Cblb基因(SEQ IDNO:8)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与表17或表18中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列码。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子结合与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向CBLB的gRNA分子由与SEQ ID NO:798-823或798-808中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，基因调控系统包含至少两种gRNA分子，其中至少一种gRNA分子是靶向RC3H1的gRNA分子，并且至少一种gRNA分子是靶向NFKBIA的gRNA分子。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQID NO:10)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ IDNO:12)中的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与RC3H1基因(SEQ ID NO:9)或Rc3h1基因(SEQ ID NO:10)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与NFKBIA基因(SEQ ID NO:11)或Nfkbia基因(SEQ ID NO:12)中的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与表19或表20中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与表21或表22中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列编码的DNA序列具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的靶DNA序列。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子结合与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的靶DNA序列，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子结合与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的靶DNA序列。
在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的DNA序列编码。在一些实施方案中，至少一种靶向RC3H1的gRNA分子由与SEQ ID NO:824-844或824-844或824-836中的一种具有100％同一性的DNA序列编码，并且至少一种靶向NFKBIA的gRNA分子由与SEQ ID NO:845-875或845-856中的一种具有100％同一性的DNA序列编码。
在一些实施方案中，使用本领域已知的算法(例如Cas-OFF finder)设计本文所述的gRNA序列的核酸结合区段以使脱靶结合最小化，来鉴定特定靶基因座或靶基因所特有的靶序列。
在一些实施方案中，本文所述的gRNA可包含一种或多种引入对核酸酶的稳定性的修饰的核苷或核苷酸。在此类实施方案中，与未修饰的gRNA相比，这些修饰的gRNA可引发降低的先天免疫。术语“先天免疫应答”包括对一般病毒或细菌来源的外源核酸(包括单链核酸)的细胞应答，其涉及诱导细胞因子(特别是干扰素)表达和释放以及细胞死亡。
在一些实施方案中，本文所述的gRNA在5'末端处或附近(例如，在其5'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)被修饰。在一些实施方案中，通过包含真核mRNA帽结构或帽类似物(例如，G(5')ppp(5')G帽类似物、m7G(5')ppp(5')G帽类似物或3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G抗反向帽类似物(ARCA))来修饰gRNA的5'末端。在一些实施方案中，通过用磷酸酶(例如小牛肠碱性磷酸酶)处理以除去5'三磷酸基团来修饰体外转录的gRNA。在一些实施方案中，gRNA包含在其3'末端处或附近(例如，在其3'末端的1-10、1-5或1-2个核苷酸内)的修饰。例如，在一些实施方案中，通过添加一个或多个(例如25-200个)腺嘌呤(A)残基来修饰gRNA的3'末端。
在一些实施方案中，修饰的核苷和修饰的核苷酸可以存在于gRNA中，但是也可以存在于其他基因调控系统中，例如，基于mRNA、RNAi或siRNA的系统中。在一些实施方案中，修饰的核苷和核苷酸可包括以下中的一种或多种：
a.磷酸二酯骨架键联中非连接的磷酸氧中的一个或两个和/或连接的磷酸氧中的一个或多个的改变，例如替换；
b.核糖组分例如核糖上的2'羟基的改变，例如替换；
c.用“脱磷”接头批量替换磷酸部分；
d.天然存在的核碱基的修饰或替换；
e.核糖磷酸骨架的替换或修饰；
f.寡核苷酸的3'末端或5'末端的修饰，例如末端磷酸基团的去除、修饰或替换或部分的缀合；以及
g.糖的修饰。
在一些实施方案中，以上列出的修饰可以组合以提供可以具有两个、三个、四个或更多个修饰的修饰的核苷和核苷酸。例如，在一些实施方案中，修饰的核苷或核苷酸可以具有修饰的糖和修饰的核碱基。在一些实施方案中，gRNA的每个碱基均被修饰。在一些实施方案中，gRNA分子的磷酸基团中的每一个均被硫代磷酸酯基团替换。
在一些实施方案中，可以使用软件工具来优化对用户靶序列内gRNA的选择，例如以使整个基因组的总脱靶活性最小化。脱靶活性可能与切割不同。例如，对于使用酿脓链球菌Cas9进行的每种可能的gRNA选择，软件工具可以鉴定整个基因组中所有的包含多达一定数目(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)的错配碱基对的潜在脱靶序列(在NAG或NGG PAM之前)。可以例如使用实验得出的加权方案来预测在每个脱靶序列处的切割效率。然后可以根据其总的预测的脱靶切割对每种可能的gRNA进行排序；排序最高的gRNA表示可能具有最大的在靶切割和至少的脱靶切割的那些gRNA。其他功能，例如用于gRNA载体构建的自动试剂设计、用于在靶Surveyor测定的引物设计以及用于通过下一代测序进行高通量检测和脱靶切割定量的引物设计，也可以包括在所述工具中。
III.产生修饰的TIL的方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于产生修饰的TIL的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将基因调控系统引入免疫效应细胞群体，其中所述基因调控系统能够降低选自ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A的一种、两种或更多种内源靶基因的表达和/或功能。(参见国际公布号WO2019/178422、WO 2019/178420和WO 2019/178421，所述专利以引用的方式整体并入本文。)在一些实施方案中，一种、两种或更多种内源靶基因选自SOCS1、PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1和NFKBIA。
可以使用多种递送方法和制剂以多种形式将本文所述的基因调控系统(例如基于核酸、蛋白质或核酸/蛋白质的系统)的组分引入靶细胞。在一些实施方案中，编码系统的一种或多种组分的多核苷酸通过重组载体(例如，病毒载体或质粒)递送。在一些实施方案中，当系统包含多于一种单一组分时，载体可以包含多个多核苷酸，每个多核苷酸都编码所述系统的组分。在一些实施方案中，当系统包含多于一种单一组分时，可以使用多个载体，其中每个载体包含编码所述系统的特定组分的多核苷酸。在一些实施方案中，载体还可以包含编码信号肽的序列(例如，用于核定位、核仁定位、线粒体定位)，所述序列与编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸融合。例如，载体可以包含与编码所述系统的一种或多种组分的多核苷酸融合的核定位序列(例如，来自SV40)。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入在体外发生。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入在体内发生。在一些实施方案中，基因调控系统向细胞的引入离体发生。
在一些实施方案中，包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的重组载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于基于以下的病毒载体：痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见例如，Li等人,Invest Opthalmol Vis Sci 35:25432549,1994；Borras等人,Gene Ther 6:515 524,1999；Li和Davidson,PNAS 92:7700 7704,1995；Sakamoto等人,H Gene Ther 5:1088 1097,1999；WO 94/12649、WO 93/03769；WO 93/19191；WO 94/28938；WO 95/11984和WO 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如，美国专利号7,078,387；Ali等人,Hum Gene Ther 9:81 86,1998，Flannery等人，，PNAS 94:6916 6921,1997；Bennett等人,Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863,1997；Jomary等人,GeneTher 4:683 690,1997，Rolling等人,Hum Gene Ther 10:641 648,1999；Ali等人,Hum MolGenet 5:591 594,1996；Srivastava的WO 93/09239，Samulski等人,J.Vir.(1989)63:3822-3828；Mendelson等人，，Virol.(1988)166:154-165；以及Flotte等人,PNAS(1993)90:10613-10617)；SV40；单纯疱疹病毒；人类免疫缺陷病毒(参见，例如，Miyoshi等人,PNAS94:10319 23,1997；Takahashi等人,J Virol 73:7812 7816,1999)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒和衍生自逆转录病毒的载体，诸如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人类免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。
在一些实施方案中，包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的重组载体是质粒。许多合适的质粒表达载体是本领域技术人员已知的，并且许多是可商购获得的。以举例的方式提供以下载体；对于真核宿主细胞：pXT1、pSG5(Stratagene)、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。然而，可以使用任何其他质粒载体，只要它与宿主细胞相容即可。根据所使用的细胞类型和基因调控系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一个(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)都可用于表达载体中(参见例如，Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
在一些实施方案中，编码本文描述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到控制元件，例如转录控制元件，诸如启动子。转录控制元件在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)或原核细胞(例如，细菌或古细菌细胞)中可以是功能性的。在一些实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到多个控制元件，其允许多核苷酸在原核和真核细胞中都表达。根据所使用的细胞类型和基因调控系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一个(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)都可用于表达载体中(参见例如，Bitter等人(1987)Methods in Enzymology,153:516-544)。
合适的真核启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-1的那些。合适的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内。表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。表达载体还可包含编码与定点修饰多肽融合的蛋白质标签(例如，6xHis标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生嵌合多肽。
在一些实施方案中，将编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到诱导型启动子。在一些实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到组成型启动子。
将多核苷酸和重组载体引入宿主细胞的方法是本领域已知的，并且可以使用任何已知方法来将基因调控系统的组分引入细胞。合适的方法包括例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送(参见例如，Panyam等人,Adv Drug Deliv Rev.2012年9月13日.pii:S0169-409X(12)002839)、微流体递送方法(参见例如，国际PCT公布号WO 2013/059343)等。在一些实施方案中，经由电穿孔的递送包括将细胞与基因调控系统的组分在盒、室或试管中混合，并施加一个或多个限定持续时间和振幅的电脉冲。在一些实施方案中，将细胞与基因调控系统的组分在连接到装置(例如泵)的容器中混合，所述装置将混合物进料到盒、室或试管中，在其中施加一个或多个具有限定持续时间和振幅的电脉冲，之后将细胞递送到第二容器。
在一些实施方案中，电穿孔用于将基因调控系统的组分引入细胞中。在使用前-REP和REP方案的一些实施方案中，电穿孔用于在前-REP阶段之后但在REP阶段之前将基因调控系统的组分引入细胞中。
在一些实施方案中，将基因调控系统的一种或多种组分或编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列在非病毒递送媒介物中引入细胞，所述非病毒递送媒介物诸如转座子、纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)、脂质体、外来体、减毒细菌或病毒样颗粒。在一些实施方案中，媒介物是减毒细菌(例如，天然或人工工程化成侵入性但减毒以防止致病性，包括单增李斯特菌、某些沙门氏菌属(Salmonella)菌株、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)和修饰的大肠杆菌(Escherichia coli)、对靶特异性细胞具有营养和组织特异性向性的细菌以及具有修饰的表面蛋白以改变靶细胞特异性的细菌。在一些实施方案中，媒介物是遗传修饰的噬菌体(例如，具有大包装能力、较低免疫原性、含有哺乳动物质粒维持序列并且掺入了靶向配体的工程化噬菌体)。在一些实施方案中，媒介物是哺乳动物病毒样颗粒。例如，可以产生修饰的病毒颗粒(例如，通过纯化“空”颗粒，然后将病毒与所需物质离体装配)。媒介物也可以被工程化以掺入靶向配体来改变靶组织特异性。在一些实施方案中，媒介物是生物脂质体。例如，生物脂质体是来源于人细胞的基于磷脂的颗粒(例如，红细胞血影，其是分解成来源于受试者的球形结构的红细胞，并且其中组织靶向可以通过附着各种组织或细胞特异性配体来实现)、分泌性外来体或内吞来源的受试者衍生膜结合的纳米囊泡(30-100nm)(例如，可以由各种细胞类型产生并且因此可以被细胞摄取而不需要靶向配体)。
在一些实施方案中，本文所述的修饰的TIL的方法包括从样品获得免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，样品包括组织样品、流体样品、细胞样品、蛋白质样品或DNA或RNA样品。在一些实施方案中，组织样品可以来源于任何组织类型，包括但不限于皮肤、毛发(包括根)、骨髓、骨骼、肌肉、唾液腺、食道、胃、小肠(例如，来自十二指肠、空肠或回肠的组织)、大肠、肝脏、胆囊、胰腺、肺、肾、膀胱、子宫、卵巢、阴道、胎盘、睾丸、甲状腺、肾上腺、心脏组织、胸腺、脾脏、淋巴结、脊髓、大脑、眼、耳、舌、软骨、白色脂肪组织或棕色脂肪组织。在一些实施方案中，组织样品可以来源于癌性、癌前性或非癌性肿瘤。在一些实施方案中，流体样品包含口腔拭子、血液、血浆、口腔粘液、阴道粘液、外周血、脐带血、唾液、精子、尿液、腹水、胸膜液、脊髓液、肺灌洗液、眼泪、汗液、精子、精液、精浆、前列腺液、射精前液(Cowper液)、排泄物、脑脊液、淋巴液、包含一种或多种细胞群体的细胞培养基、包含一种或多种细胞群体的缓冲溶液等。
在一些实施方案中，处理样品以从样品的其余部分富集或分离特定细胞类型，诸如免疫效应细胞。在某些实施方案中，样品是外周血样品，然后对其进行白细胞去除术以分离红细胞和血小板并分离淋巴细胞。在一些实施方案中，样品是leukopak，可从中分离或富集免疫效应细胞。在一些实施方案中，样品是肿瘤样品，其被进一步处理以分离存在于肿瘤中的淋巴细胞(即，分离肿瘤浸润淋巴细胞)。
在一些实施方案中，分离的免疫效应细胞在培养物中扩增以产生扩增的免疫效应细胞群体。在扩增过程中可以向培养系统中加入一种或多种活化或生长因子。例如，在一些实施方案中，可将一种或多种细胞因子(诸如IL-2和/或IL-7)加入培养系统中以增强或促进细胞增殖和扩增。在一些实施方案中，可以向培养系统中加入一种或多种活化抗体，诸如抗CD3抗体，以增强或促进细胞增殖和扩增。在一些实施方案中，免疫效应细胞可以在扩增过程中与饲养细胞共培养。在一些实施方案中，本文提供的方法包括一个或多个扩增阶段。例如，在一些实施方案中，免疫效应细胞可以在从样品分离后扩增，使其静置，然后再次扩增。在一些实施方案中，可以在一组扩增条件下扩增免疫效应细胞，接着在第二组不同的扩增条件下进行第二轮扩增。用于离体扩增免疫细胞的先前方法是本领域已知的，例如，如美国专利申请公布号20180282694和20170152478以及美国专利号8,383,099和8,034,334中所述。
在培养和扩增过程中的任何时间点，可将本文所述的基因调控系统导入免疫效应细胞以产生修饰的TIL群体。在一些实施方案中，在从样品中富集后立即将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在一个或多个扩增过程之前、期间或之后，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在从样品中富集或从受试者中收获之后，并且在任何扩增回合之前，立即将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在第一轮扩增之后并且第二轮扩增之前，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。在一些实施方案中，在第一轮和第二轮扩增之后，将基因调控系统引入免疫效应细胞群体。
在一些实施方案中，通过本文描述的方法产生的修饰的TIL可以立即使用。或者，细胞可以在液氮温度下冷冻并长期储存，解冻并能够再次使用。在此类情况下，通常将细胞在10％二甲亚砜(DMSO)、50％血清、40％缓冲培养基或本领域中通常用于在此类冷冻温度下保存细胞的某种其他这种溶液中冷冻，并以本领域公知的解冻冷冻的培养细胞的方式解冻。
在一些实施方案中，可以在不同的培养条件下对修饰的TIL进行体外培养。细胞可以在培养物中扩增，即在促进其增殖的条件下生长。培养基可以是液体或半固体，例如含有琼脂、甲基纤维素等。细胞群体可以悬浮在适当的营养培养基中，诸如Iscove改良DMEM或RPMI1640，通常补充有胎牛血清(约5-10％)、L-谷氨酰胺、硫醇(特别是2-巯基乙醇)和抗生素，例如青霉素和链霉素。培养物可以含有调节性T细胞对其具有应答性的生长因子。本文定义的生长因子是能够通过对跨膜受体的特异性作用促进培养物或完整组织中细胞的存活、生长和/或分化的分子。生长因子包括多肽和非多肽因子。
A.使用CRISPR/Cas系统产生修饰的TIL
在一些实施方案中，产生修饰的免疫效应细胞的方法包括使靶DNA序列与包含gRNA和Cas多肽的复合物接触。如上所述，gRNA和Cas多肽形成复合物，其中gRNA的DNA结合结构域将复合物靶向靶DNA序列，并且其中Cas蛋白(或与无酶活性的Cas蛋白融合的异源蛋白)修饰靶DNA序列。在一些实施方案中，在将gRNA和Cas蛋白(或编码gRNA和Cas蛋白的多核苷酸)引入细胞之后，在细胞内形成此复合物。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的核酸是DNA核酸，并将其通过转导引入细胞。在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑系统的Cas和gRNA组分由单个多核苷酸分子编码。在一些实施方案中，编码Cas蛋白和gRNA组分的多核苷酸包含在病毒载体中，并通过病毒转导引入细胞。在一些实施方案中，CRISPR/Cas基因编辑系统的Cas9和gRNA组分由不同的多核苷酸分子编码。在一些实施方案中，编码Cas蛋白的多核苷酸包含在第一病毒载体中，而编码gRNA的多核苷酸包含在第二病毒载体中。在此实施方案的一些方面中，将第一病毒载体在第二病毒载体之前引入细胞。在此实施方案的一些方面中，将第二病毒载体在第一病毒载体之前引入细胞。在此类实施方案中，载体的整合导致Cas9和gRNA组分的持续表达。然而，Cas9的持续表达可能会在一些细胞类型中导致增加的脱靶突变和切割。因此，在一些实施方案中，可以通过转染将编码Cas蛋白的mRNA核酸序列引入细胞群体。在此类实施方案中，Cas9的表达将随时间推移而降低，并且可以减少脱靶突变或切割位点的数目。
在一些实施方案中，通过将gRNA分子和Cas蛋白混合在一起并孵育足以允许复合物形成的一段时间，在无细胞系统中形成此复合物。然后可以将包含gRNA和Cas蛋白并且在本文中称为CRISPR-核糖核蛋白(CRISPR-RNP)的此预形成的复合物引入细胞，以便修饰靶DNA序列。复合也可以随着单独地引入Cas蛋白和gRNA而发生在靶细胞中。
B.使用shRNA系统产生修饰的TIL
在一些实施方案中，公开了一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，所述方法通过将编码一种或多种具有与靶基因的mRNA转录物互补的序列的shRNA分子的一种或多种DNA多核苷酸引入细胞。可以经由小基因盒将具体的DNA序列引入细胞核，从而修饰免疫效应细胞以产生shRNA。逆转录病毒和慢病毒均可用于将编码shRNA的DNA引入免疫效应细胞。引入的DNA可以成为细胞自身DNA的一部分或保留在细胞核中，并指导细胞机制以产生shRNA。shRNA可以通过细胞内部的Dicer或AGO2介导的切割活性进行处理，以诱导RNAi介导的基因敲低。
C.使用siRNA系统产生修饰的TIL
在一些实施方案中，公开了一种产生修饰的免疫效应细胞的方法，所述方法通过将编码一种或多种具有与靶基因的mRNA转录物互补的序列的siRNA分子的一种或多种DNA多核苷酸引入细胞。可以经由小基因盒将具体的DNA序列引入细胞核，从而修饰免疫效应细胞以产生siRNA。逆转录病毒、腺相关病毒、腺病毒和慢病毒均可用于将编码siRNA的DNA引入免疫效应细胞。引入的DNA可以成为细胞自身DNA的一部分或保留在细胞核中，并指导细胞机制以产生siRNA。siRNA可以干扰基因表达。
IV.过继性细胞转移
过继性细胞转移(ACT)是一种非常有效的免疫治疗形式，并涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移到癌症患者体内。ACT是一种治疗方法，其包括在体外鉴定具有抗肿瘤活性的淋巴细胞，将这些细胞在体外大量扩增，并将它们输注到携带癌症的宿主中。用于过继性转移的淋巴细胞可以来源于切除肿瘤的基质(肿瘤浸润淋巴细胞或TIL)。用于ACT的TIL可如本文所述制备。如果TIL被遗传工程化以表达抗肿瘤T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)，用混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(MLTC)进行富集或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽进行克隆，则TIL可以衍生自或来自血液。淋巴细胞来源于待输注的携带癌症的宿主的ACT称为自体ACT。以引用的方式整体并入本文的美国公布号2011/0052530涉及进行过继性细胞疗法以促进癌症消退的方法，主要用于治疗罹患转移性黑色素瘤的患者，这些方法以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，TIL可以如本文所述施用。在一些实施方案中，TIL可以单剂量施用。此类施用可以通过注射，例如静脉内注射进行。在一些实施方案中，TIL和/或细胞毒性淋巴细胞可以多剂量施用。
在将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移到癌症患者体内之前，可以对患者使用淋巴清除步骤。淋巴清除部分或完全消除调节性T细胞和免疫系统的竞争元件。在一些实施方案中，使用淋巴清除。在其他实施方案中，不使用淋巴清除。
V.抗体和抗体复合物
A.抗体复合物
与固定化抗体不同，可溶性抗体复合物可以为T细胞提供更温和的活化信号。美国公布号US 2007/0036783(以引用的方式整体并入本文)描述了可溶性双特异性四聚体抗体复合物(TAC)的用途，该复合物由一种抗CD3抗体与可启动T细胞活化和扩增的针对CD28的第二种抗体复合构成。
本公开提供活化TIL的方法，其包括用包含至少一种可溶性单特异性复合物的组合物培养含有TIL的样品，其中每个可溶性单特异性复合物包含两种结合蛋白，所述结合蛋白与TIL上的相同抗原连接并特异性结合。在某些实施方案中，TIL在IL-2存在下培养。在某些实施方案中，两种结合蛋白是相同的结合蛋白并且结合抗原上的相同表位。
在某些实施方案中，结合蛋白是抗体或其片段。可以使用的抗体片段包括来自重组来源和/或在转基因动物中产生的Fab、Fab'、F(ab)2、scFv和dsFv片段。抗体或片段可以来自任何物种，包括小鼠、大鼠、兔、仓鼠和人。嵌合抗体衍生物，即结合非人动物可变区和人恒定区的抗体分子也包括在本发明的范围内。嵌合抗体分子可以包括例如人源化抗体，所述人源化抗体包含来自小鼠、大鼠或其他物种的抗体的抗原结合结构域，及人恒定区。常规方法可用于制备嵌合抗体。(参见，例如，Morrison等人；Takeda等人，Cabilly等人，美国专利号4,816,567；Boss等人，美国专利号4,816,397；Tanaguchi等人，欧洲专利公布EP171496；欧洲专利公布0173494，英国专利GB 2177096B)。人源化抗体的制备描述于EP-B10 239400中。人源化抗体也可以商业化生产(Scotgen Limited,2Holly Road,Twickenham,Middlesex,Great British)。预期嵌合抗体在人受试者中的免疫原性低于对应的非嵌合抗体。人源化抗体可以进一步稳定，例如如WO 00/61635中所述。所有这些出版物都以引用的方式整体并入本文。
与TIL抗原结合的抗体或其片段可商购获得或可由本领域技术人员制备。在一个实施方案中，与相同抗原结合的两种抗体或其片段直接连接。抗体的直接连接可以通过将一种抗体与另一种抗体化学偶联来制备，例如通过使用N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)。
在另一个实施方案中，所述两种抗体在可溶性单特异性复合物中间接连接。“间接连接”意指两种抗体彼此不直接共价连接，而是通过连接部分诸如免疫复合物附接。在一个优选的实施方案中，两种抗体通过制备四聚体抗体复合物间接连接。四聚体抗体复合物可以通过将结合相同抗原且属于相同动物物种的单克隆抗体与大约等摩尔量的直接针对第一动物物种抗体Fc片段的第二动物物种的单克隆抗体混合来制备。第一抗体和第二抗体也可以与约等摩尔量的针对第一动物物种抗体Fc片段的第二动物物种的单克隆抗体的F(ab')2片段反应。关于四聚体抗体复合物及其制备方法的描述参见Lansdorp的美国专利号4,868,109，其以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，组合物包含至少两种不同的单特异性复合物，其各自与TIL上的不同抗原结合。在一个实施方案中，组合物包含至少两种不同的可溶性单特异性复合物，并且所述至少两种不同的可溶性单特异性复合物中的每种结合选自由以下组成的组的不同抗原：CD3、CD28、CD2、CD7、CD11a、CD26、CD27、CD30L、CD40L、OX-40、ICES、GITR、CD137和HLA-DR。
在具体实施方案中，一种单特异性复合物将结合CD3，并且第二种单特异性复合物将结合CD28。在另一个实施方案中，组合物包含至少三种不同的可溶性单特异性复合物，其各自与TIL上的三种不同抗原中的一种结合。在此类实施方案中，没有两个单特异性复合物将结合相同的抗原。在具体实施方案中，组合物包含三种不同的可溶性单特异性复合物，一种对CD3具有特异性，第二种对CD28具有特异性，并且第三种对CD2具有特异性。在具体实施方案中，在可溶性单特异性复合物存在下TIL的活化大于使用包含两种不同结合蛋白或抗体(其中每种结合蛋白或抗体与TIL上的不同抗原结合)的双特异性复合物的TIL的活化。
B.抗CD3和抗CD28抗体
如本领域技术人员将理解的，存在许多可用于本发明的合适的抗人CD3和抗人CD28抗体。抗人CD3抗体包括来自各种哺乳动物的多克隆和单克隆抗体，包括但不限于鼠、人、灵长类动物、大鼠和犬抗体。在特定实施方案中，使用OKT3抗CD3抗体(可从Ortho-McNeil，Raritan，N.J.或Miltenyi Biotech，Auburn，Calif.商购获得)。如本领域技术人员也将理解的，存在许多可用于本发明的合适的抗人CD28抗体，包括抗人CD28多克隆和单克隆抗体。
针对CD3的抗体是许多T细胞增殖方案中的中心元件。固定在表面上的抗CD3通过交联T细胞表面上的T细胞受体复合物来传递活化和增殖诱导信号。通过固定抗CD3和抗CD28以同时传递信号和共刺激信号，可以增加增殖(Baroja等人(1989),CellularImmunology,120:205-217)。在W009429436A1中，固相表面诸如培养皿和珠子用于固定抗CD3和抗CD28抗体。通常，在直径为4.5μm的
Figure BDA0003756012870002991
M-450上进行在珠子上的固定。所有这些出版物都以引用的方式整体并入本文。
VI.细胞因子
如本领域已知的，本文所述的扩增方法一般使用具有高剂量细胞因子(特别是IL-2)的培养基。
如本文所用，术语“IL-2”(本文也称为“IL2”)是指称为白介素-2的细胞因子和T细胞生长因子，并且包括所有形式的IL-2，包括人和哺乳动物形式、具有保守氨基酸取代的形式、糖型、生物类似物及其变体。IL-2描述于例如Nelson,J.Immunol.2004,172,3983-88和Malek,Annu.Rev.Immunol.2008,26,453-79中，所述文献的公开内容以引用的方式整体并入本文。术语IL-2涵盖人、重组形式的IL-2，诸如阿地白介素(PROLEUKIN，可从多个供应商处以每一次性小瓶2200万IU商购获得)，以及由CellGenix,Inc.,Portsmouth,N.H.,USA(CELLGRO GMP)或ProSpec-Tany TechnoGene Ltd.,East Brunswick,N.J.,USA(目录号CYT-209-b)在商业上供应的重组形式的IL-2和来自其他供应商的其他商业等效物。阿地白介素(des-alanyl-1，丝氨酸-125人IL-2)是一种非糖基化人重组形式的IL-2，分子量大约为15kDa。术语IL-2还涵盖聚乙二醇化形式的IL-2，包括聚乙二醇化IL-2前药NKTR-214，可从Nektar Therapeutics,South San Francisco,Calif.,USA获得。适用于本发明的NKTR-214和聚乙二醇化IL-2描述于美国专利申请公布号US 2014/0328791 A1和国际专利申请公布号WO2012/065086A1中，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。适用于本发明的缀合IL-2的替代形式描述于美国专利号4,766,106、5,206,344、5,089,261和4,902,502中，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入本文。适用于本发明的IL-2的制剂描述于美国专利号6,706,289中，其公开内容以引用的方式整体并入本文。人IL2基因由NCBI GeneID 3558鉴定。人IL2基因的示例性核苷酸序列是NCBI参考序列：NG_016779.1。人IL-2多肽的示例性氨基酸序列提供为SEQ ID NO:879。
白介素2(IL-2)是一种白介素，是免疫系统中的一种细胞因子信号传导分子。它是一种15.5-16kDa的蛋白质，可调控负责免疫的白细胞(白细胞，通常是淋巴细胞)的活性。IL-2是身体对微生物感染的自然反应的一部分。IL-2通过与淋巴细胞表达的IL-2受体结合来介导其作用。IL-2的主要来源是活化的CD4+T细胞和活化的CD8+T细胞。
IL-2在免疫系统的关键功能、耐受性和免疫中具有重要作用，主要是通过其对T细胞的直接作用。在T细胞成熟的胸腺中，它通过促进某些未成熟T细胞分化为调节性T细胞来预防自身免疫性疾病，所述调节性T细胞抑制另外准备攻击体内正常健康细胞的其他T细胞。IL-2增强活化诱导的细胞死亡(AICD)。当初始T细胞也受到抗原刺激时，IL-2还促进T细胞分化为效应T细胞和记忆T细胞，从而帮助身体抵御感染。与其他极化细胞因子一起，IL-2刺激初始CD4+T细胞分化为Th1和Th2淋巴细胞，同时阻碍分化为Th17和滤泡Th淋巴细胞。其表达和分泌受到严格调控，并作为瞬时正反馈和负反馈循环的一部分，在发动和减弱免疫应答中发挥作用。通过其在免疫记忆T细胞发展中的作用(这取决于抗原选择的T细胞克隆的数量和功能的扩增)，它在持久的细胞介导免疫中发挥作用。
VII.药物组合物、剂量和给药方案
在一个实施方案中，使用本公开的方法扩增的TIL作为药物组合物向患者施用。在一个实施方案中，药物组合物是TIL在无菌缓冲剂中的悬浮液。使用本公开的PBMC扩增的TIL可以通过本领域已知的任何合适的途径施用。在一些实施方案中，T细胞作为单次动脉内或静脉内输注施用，优选持续大约30至60分钟。其他合适的施用途径包括腹膜内、鞘内和淋巴内施用。
可以施用任何合适剂量的TIL。在一些实施方案中，施用约1×109至约2×1011个TIL。在一些实施方案中，施用约2.3×1010至约13.7×1010个TIL，平均约7.8×1010个TIL，特别是如果癌症是黑色素瘤。在一个实施方案中，施用约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约3×1010至约12×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约4×1010至约10×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，施用约7×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约2.3×1010至约13.7×1010。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7.8×1010个TIL，特别是癌症是黑色素瘤。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约1.2×1010至约4.3×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约3×1010至约12×1010个TIL。
在一些实施方案中，治疗有效剂量为约4×1010至约10×1010个TIL。
在一些实施方案中，治疗有效剂量为约5×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约6×1010至约8×1010个TIL。在一些实施方案中，治疗有效剂量为约7×1010至约8×1010个TIL。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL数量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1012、4×1012、5×1012、6×1012、7×1012、8×1012、9×1012、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013个。在一个实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL数量在以下范围内：1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×1011至1×1012、1×1012至5×1012和5×1012至1×1013个。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度为小于例如药物组合物的100％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度为大于药物组合物的90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、19.75％、19.50％、19.25％19％、18.75％、18.50％、18.25％18％、17.75％、17.50％、17.25％17％、16.75％、16.50％、16.25％16％、15.75％、15.50％、15.25％15％、14.75％、14.50％、14.25％14％、13.75％、13.50％、13.25％13％、12.75％、12.50％、12.25％12％、11.75％、11.50％、11.25％11％、10.75％、10.50％、10.25％10％、9.75％、9.50％、9.25％9％、8.75％、8.50％、8.25％8％、7.75％、7.50％、7.25％7％、6.75％、6.50％、6.25％6％、5.75％、5.50％、5.25％5％、4.75％、4.50％、4.25％、4％、3.75％、3.50％、3.25％、3％、2.75％、2.50％、2.25％、2％、1.75％、1.50％、125％、1％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％、0.01％、0.009％、0.008％、0.007％、0.006％、0.005％、0.004％、0.003％、0.002％、0.001％、0.0009％、0.0008％、0.0007％、0.0006％、0.0005％、0.0004％、0.0003％、0.0002％或0.0001％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度在以下范围内：药物组合物的约0.0001％至约50％、约0.001％至约40％、约0.01％至约30％、约0.02％至约29％、约0.03％至约28％、约0.04％至约27％、约0.05％至约26％、约0.06％至约25％、约0.07％至约24％、约0.08％至约23％、约0.09％至约22％、约0.1％至约21％、约0.2％至约20％、约0.3％至约19％、约0.4％至约18％、约0.5％至约17％、约0.6％至约16％、约0.7％至约15％、约0.8％至约14％、约0.9％至约12％或约1％至约10％w/w、w/v或v/v。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物中提供的TIL的浓度在以下范围内：药物组合物的约0.001％至约10％、约0.01％至约5％、约0.02％至约4.5％、约0.03％至约4％、约0.04％至约3.5％、约0.05％至约3％、约0.06％至约2.5％、约0.07％至约2％、约0.08％至约1.5％、约0.09％至约1％、约0.1％至约0.9％w/w、w/v或v/v。
本发明的药物组合物中提供的TIL在宽剂量范围内是有效的。精确剂量将取决于施用途径、施用化合物所采用的形式、待治疗的受试者、待治疗的受试者的性别和年龄、待治疗的受试者的体重以及主治医师的偏好和经验。在适当情况下也可以使用临床确定的TIL的剂量。使用本文的方法施用的药物组合物的量，诸如TIL的剂量将取决于所治疗的人或哺乳动物、病症或病状的严重性、施用速率、活性药物组分的处置和处方医师的判断。
在一些实施方案中，TIL可以单剂量施用。此类施用可以通过注射，例如静脉内注射进行。在一些实施方案中，TIL可以多剂量施用。给药可以为每年一次、两次、三次、四次、五次、六次或大于六次。给药可以为每月一次、每两周一次、每周一次或每隔一天一次。只要是必要的，就可持续施用TIL。
在一些实施方案中，TIL的有效性剂量为约1×106、2×106、3×106、4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107、4×107、5×107、6×107、7×107、8×107、9×107、1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010、5×1010、6×1010、7×1010、8×1010、9×1010、1×1011、2×1011、3×1011、4×1011、5×1011、6×1011、7×1011、8×1011、9×1011、1×1012、2×1012、3×1011、4×1012、5×1012、6×1012、7×1011、8×1012、9×1011、1×1013、2×1013、3×1013、4×1013、5×1013、6×1013、7×1013、8×1013和9×1013个细胞。在一些实施方案中，TIL的有效剂量在以下范围内：1×106至5×106、5×106至1×107、1×107至5×107、5×107至1×108、1×108至5×108、5×108至1×109、1×109至5×109、5×109至1×1010、1×1010至5×1010、5×1010至1×1011、5×10″至1×1012、1×1012至5×1012和5×10″至1×1013个细胞。
可通过具有类似效用的剂的已接受的施用方式中的任一种以单剂量或多剂量来施用有效量的TIL，这些施用方式包括鼻内和经皮途径、通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌肉内、皮下、口服、局部、通过植入或通过吸入。在某些实施方案中，TIL通过静脉内施用。
VIII.细胞计数、细胞活力、流式细胞术
在一些实施方案中，测量细胞计数和/或活力。诸如但不限于CD3、CD4、CD8和CD56以及本文公开或描述的任何其他标志物的表达可以通过流式细胞术用抗体测量，例如但不限于可从BD Bio-sciences(BD Biosciences,San Jose,Calif.)商购获得的使用FACSCantoTM流式细胞仪(BD Biosciences)的那些。可以使用一次性c-chip血细胞计数器(VWR,Batavia,IL)手动计数细胞，并且可以使用本领域已知的任何方法评估活力，包括但不限于台盼蓝染色。
在一个实施方案中，用于扩增TIL的方法可包括使用约5,000mL至约25,000mL的细胞培养基、约5,000mL至约10,000mL的细胞培养基或约5,800mL至约8,700mL的细胞培养基。在一个实施方案中，使用不超过一种类型的细胞培养基扩增TIL的数量。可以使用任何合适的细胞培养基，例如AIM-V细胞培养基(L-谷氨酰胺、50μM硫酸链霉素和10μM硫酸庆大霉素)细胞培养基(Invitrogen,Carlsbad Calif.)。
在一个实施方案中，TIL在气体可渗透容器中扩增。气体可渗透容器已用于使用本领域已知的方法、组合物和装置使用PBMC扩增TIL，包括在美国专利申请公布号2005/0106717A1中描述的那些，其公开内容以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，TIL在气体可渗透袋中扩增。在一个实施方案中，TIL使用在气体可渗透袋中扩增TIL的细胞扩增系统进行扩增，例如Xuri细胞扩增系统W25(GE Healthcare)。在一个实施方案中，使用在气体可渗透袋中扩增TIL的细胞扩增系统来扩增TIL，例如WAVE生物反应器系统，也称为Xuri细胞扩增系统W5(GE Healthcare)。在一个实施方案中，细胞扩增系统包括气体可渗透细胞袋，其体积选自由以下组成的组：约100mL、约200mL、约300mL、约400mL、约500mL、约600mL、约700mL、约800mL、约900mL、约1L、约2L、约3L、约4L、约5L、约6L、约7L、约8L、约9L和约10L。在一个实施方案中，TIL可以在G-Rex烧瓶(可从Wilson Wolf Manufacturing商购获得)中扩增。此类实施方案允许细胞群体从约5×105个细胞/cm2扩增到介于10×106与30×106个细胞/cm2之间。在一个实施方案中，这种扩增是在不向细胞中添加新鲜细胞培养基的情况下进行的(也称为为细胞补料)。在一个实施方案中，只要培养基在G-Rex烧瓶中的高度为约10cm，就不补料。在一个实施方案中，不补料而是添加一种或多种细胞因子。在一个实施方案中，细胞因子可以以大丸剂的形式添加，而无需将细胞因子与培养基混合。此类容器、装置和方法在本领域中是已知的并且已经用于扩增TIL，并且包括在美国专利申请公布号US 2014/0377739A1、国际公布号WO 2014/210036 A1、美国专利申请公布号us 2013/0115617A1、国际公布号WO 2013/188427 A1、美国专利申请公布号US 2011/0136228 A1、美国专利号8,809,050B2、国际公布号WO 2011/072088 A2、美国专利申请公布号US 2016/0208216A1、美国专利申请公布号US 2012/0244133 A1、国际公布号WO 2012/129201 A1、美国专利申请公布号US 2013/0102075A1、美国专利号8,956,860B2、国际公布号WO 2013/173835 A1、美国专利申请公布号US 2015/0175966 A1中描述的那些。此类方法还描述于Jin等人,J.Immunotherapy,2012,35:283-292中。所有这些出版物都以引用的方式整体并入本文。
实施例
实施例1：用于扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的方法
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)直接从原发性人黑色素瘤转移的单细胞悬浮液中扩增。TIL获自三个不同的供体：供体1(D3239)、供体2(D3399)和供体3(D6755)。在培养的第0天，从单细胞悬浮液中取200,000-800,000个活细胞并接种到24孔Grex板(Wilson Wolf，目录号80192M)的孔中的6ml体积的TIL培养基(RPMI 1640和AIM V的1:1混合物，补充有5％人AB血清)并补充有6,000U/ml重组人IL-2(CellGenix，目录号1020-1000)内。如通过流式细胞术所测定，每种条件接种的活细胞含有3.4K至52K个CD3+T细胞。使用四种不同的方法活化和扩增细胞，如下所述(图2)：
·TIL扩增方法1(“REP样”)——没有前-REP的一步快速扩增方案。对来自五名健康供体的饲养细胞(PBMC)进行辐照(6,000拉德)并以1:1:1:1:1的比例汇集。向每个孔中添加10M个辐照的PBMC，以及360ng OKT3(Biolegend，目录号317326)，得到最终浓度为60ng/ml。
·TIL扩增方法2(“Dynabeads”)——以1.5或0.5x106个珠子/孔添加Dynabead。向TIL中添加具有与其表面缀合的抗CD3和抗CD28抗体的Dynabead。
·TIL扩增方法3(“Stemcell”)——来自Stemcell的四聚体抗体复合物(TAC)。向TIL中添加来自Stemcell Technologies(目录号10970)的37.5μl抗CD3/抗CD2/抗CD28四聚体抗体复合物(TAC)，得到最终浓度为6.25μl/ml。
·TIL扩增方法4(“Transact”)——来自Miltenyi Biotec的纳米基质。向TIL中添加324μl共价附接到来自Miltenyi Biotec的针对人CD3和CD28的人源化重组激动剂(MACSGMP T Cell Transact，目录号130-019-011)的胶体聚合物纳米基质，得到最终浓度为54μl/ml。
对于以上概述的所有四种TIL扩增方法，在离散的时间间隔处遵循通用方案，每种方法的变化如下所示(图2)：
·第2天：假设消耗，将36,000U重组人IL-2添加到每个孔中，得到最终浓度6,000U/ml。
·第4天：替换/交换50％的培养基。对于方法1，从每个孔中移除并弃去4mL细胞上清液，注意不要扰动孔底部的细胞。然后，假设消耗，随后添加4mL新鲜TIL培养基和35,000U的IL-2，得到最终浓度6,000U/ml。对于方法2，收获细胞并将其置于磁体中以移除Dynabead，然后以300xg离心5分钟。对于方法3和4，收获培养物，并将TIL以300xg离心5分钟。吸出细胞上清液，并将每种细胞培养物重悬于6mL TIL培养基+6,000U/ml IL-2中，然后接种回24孔G-rex板的孔中。
·第7天：假设消耗，将IL-2添加到培养基中，得到最终浓度6,000U/ml。当培养物达到大于5M个细胞(反映为大于2.5M个细胞/cm2Grex膜)时，将它们转移到6孔Grex板(Wilson wolf)的孔中，并用补充有6000U/ml IL-2的TIL培养基加至100mL。
·第9天：如在第4天，替换/交换50％的培养基。
·第12天：假设消耗，将IL-2添加到培养基中，得到最终浓度6,000U/ml。当培养物达到大于5M个细胞(反映为大于2.5M个细胞/cm2Grex膜)时，将它们转移到6孔Grex板(Wilson wolf)的孔中，并用补充有6000U/ml IL-2的TIL培养基加至100mL。
·第14天：从培养物中取10M个细胞并与40ml TIL培养基+6,000U/ml IL-2一起重新接种到Grex-10容器中。如图3A所示，平均而言，在第14天时，单独在IL-2中生长的细胞培养物(标记为“对照”)扩增了约27倍，通过方法1(REP样)生长的细胞扩增了5063倍，通过方法3(“Stemcell”)生长的细胞扩增了3755倍，并且通过方法4(“Transact”)生长的细胞扩增了7924倍。
·第16天：如在第4天，替换/交换50％的培养基。
·第17天：假设消耗，将IL-2添加到培养基中，得到最终浓度6,000U/ml。
·第21天：收获细胞培养物。如图3B所示，到第21天，平均而言，通过方法1(REP样)生长的细胞扩增了60166倍，通过方法3(“Stemcell”)生长的细胞扩增了37596倍，并且通过方法4(“Transact”)生长的细胞扩增了80373倍。
实施例2：TIL的表型表征
通过流式细胞术评估在TIL扩增过程中作为时间函数的TIL细胞组成(图4)。如实施例1中培养细胞，并在第0、9和14天用抗体对细胞等分试样进行染色以检测表达CD45和CD3e的细胞。对于所有供体，随时间观察到CD45+CD3+T细胞的逐渐富集(图5A)，证明了当使用实施例1中所述的方法1、3和4时T细胞的特异性扩增。
此外，评估了产生的T细胞的表型。特别是，通过流式细胞术测定了被定义为中枢记忆T细胞表型(Tcm，具有标志物表型CD45RO+CCR7+CD45RA-)的细胞比例。取如实施例1中培养的细胞，并在第14天用荧光标记的检测CD45RO、CCR7和CD45RA的抗体对细胞等分试样进行染色。与使用饲养细胞的方法1(REP样)相比，方法3(Stemcell)和方法4(Transact)产生更大比例的Tcm(图5B)。
通过对中枢记忆T细胞表型的标志物CD45RO和CCR7共表达进行FACS来分析TIL(图6)。对于供体3，使用实施例1中所述的三种无饲养细胞TIL扩增方法(方法2(使用1.5或0.5x106珠/孔的“Dynabeads”)、方法3(“Stemcell”)和方法4(“Transact”))中任一种扩增的TIL与使用方法1(“REP”)扩增的TIL(其中中枢记忆T细胞表型仅占约1％)相比，显示出具有中枢记忆T细胞表型的细胞的更大富集，在介于约6％与14％之间。对于供体2，使用实施例1中所述的三种无饲养细胞TIL扩增方法(方法2(使用1.5或0.5x106珠/孔的“Dynabeads”)、方法3(“Stemcell”)和方法4(“Transact”))中任一种扩增的TIL与使用方法1(“REP样”)扩增的TIL(其中中枢记忆T细胞表型仅占约3％)相比，显示出具有中枢记忆T细胞表型的细胞的更大富集，在介于约5％与29％之间。对于供体1，使用实施例1中所述的三种无饲养细胞TIL扩增方法(方法2(使用1.5或0.5x106珠/孔的“Dynabeads”)、方法3(“Stemcell”)和方法4(“Transact”))中任一种扩增的TIL与使用方法1(“REP样”，基于饲养细胞)扩增的TIL(其中中枢记忆T细胞表型仅占4％左右)相比，显示出具有中枢记忆T细胞表型的细胞的更大富集，在介于约7％与19％之间。总结了使用来自所有三个供体的TIL通过所有四种方法扩增的TIL的中枢记忆T细胞表型％数据，显示出方法4(“Transact”)为三个供体中的两者产生了中枢记忆T细胞表型显著富集的TIL(图6)。
评估了通过单独添加IL-2(“对照”)和实施例1中所述的所有四种方法(方法1(“REP样”)、方法2(使用1.5或0.5x106珠/孔的“Dynabeads”)、方法3(“Stemcell”)和方法4(“Transact”))扩增的TIL在第14天(相对于第0天的细胞数量)的TIL倍数扩增(图7)。对于供体3和供体1，与方法1(基于饲养细胞)相比，方法4导致约4-5倍的扩增，而对于供体2，与方法4相比，方法1导致大约20倍的扩增。对于供体1，与方法1(基于饲养细胞)相比，方法3导致约4.5倍的扩增(图7)。合并所有三个供体的数据，显示平均而言，通过方法3和方法4扩增的TIL显示至少与通过方法1(REP样)扩增的TIL一样高(如果不是更高)的倍数扩增(图8)。一些细胞培养超过14天，以评估是否有可能进一步扩增。细胞在第14天与第21天之间继续扩增，在一些情况下表现出大于150,000的总倍数扩增(图9)。
肿瘤是异质的，并且含有变化的T细胞百分比；稳健的T细胞扩增方法必须能够以高和低T细胞密度两者扩增细胞。尚不清楚是否可以在不存在饲养细胞的情况下扩增低接种密度的T细胞。因此，评估了第0天T细胞的接种密度对到第14天TIL倍数扩增的影响。对于通过方法1(“REP样”)和方法3(“Stemcell”)扩增的TIL，倍数扩增相对线性增加，但对于通过方法4(“Transact”)扩增的TIL，倍数扩增在介于约2,000个T细胞/cm2与约9,000个T细胞/cm2之间的接种密度达到峰值(图10)。因此，在低密度扩增T细胞时，方法4约等效于方法1，并且在更低密度时，方法3优于方法1。这证明了以低至每mL培养基85个T细胞(在6mL体积中)的密度扩增T细胞时，本质上不需要饲养细胞。
供体3之前提供了使用前-REP/REP方法进行TIL扩增的样品。来自供体3的样品未能从前-REP步骤中提供足够数量的TIL以继续进行REP步骤。来自供体3的样品提供了比使用前-REP实现的更高倍数的TIL扩增。这表明本文所述的方法可以挽救在前-REP期间发生不充分扩增的情况。
实施例3：无饲养细胞方法细胞的功能(通过TIL进行细胞因子产生)
评估了使用无饲养细胞方法(TIL扩增方法3和方法4)产生的TIL产生的细胞因子IL-2、IFNγ和TNFα。如实施例1中所述，从解离的组织细胞扩增TIL。在该过程的第14天，取200,000个扩增的TIL(来自三个独立的供体)并在200μl体积的另外补充有6.6μl四聚体抗CD3试剂(Stemcell Technologies，定制试剂)的TIL培养基中刺激18小时。随后，收获细胞上清液，并用Quickplex S120(Mesoscale Discovery)使用一式两份样品测定上清液中细胞因子的浓度。如图11中所示，对于三个不同的供体，直接从解离的肿瘤细胞产生的TIL能够在再刺激后产生IFNγ、IL-2、TNFα和IL-6。另外，使用无饲养细胞方法产生的TIL(方法3：“Stemcell”)和方法4：“Transact”)与使用方法1(使用饲养细胞的“REP样”)产生的TIL相比，能够产生最多多了约6倍的IFNγ、多了约4倍的IL-2、多了约10倍的TNFα和多了约25倍的IL-6(图11)。
实施例4：使用CRISPR-Cas9对TIL进行遗传工程化的方法
使用CRISPR-Cas9对使用实施例1中所述的方案扩增的TIL进行遗传工程化，以产生靶基因的功能性基因敲除。该遗传工程化在实施例1中所述的每种方法的第13天进行，并且也在从0-21天范围内的其他天进行。简而言之，在第13天，将1.2x106个扩增的TIL以300xg离心5分钟，并用40μl MaxCyte电穿孔缓冲剂(HyClone目录号EPB1)重悬。制备含有52pmol Cas9蛋白(Aldevron，目录号9212)和240pmol靶向编码CD45抗原的PTPRC基因(IDT，GAGTTTAAGCCACAAATACA SEQ ID NO:909)的sgRNA的核糖核蛋白(RNP)主混合物。通过将10nmol冻干sgRNA与100μl无核酸酶双链体缓冲剂(IDT目录号1072570)重悬，制备100μMPTPRC sgRNA溶液。试剂添加如下：
Figure BDA0003756012870003121
将全部10μl RNP主混合物添加到40μl细胞悬浮液中。然后将50μl细胞悬浮液转移至OC100 X 2处理组件(MaxCyte，目录号SOC-1X2)。使用“Optimization#9”程序在MaxCyteExPERT电穿孔仪上对细胞进行电穿孔。随后，向孔中添加50μl TIL培养基，并将细胞转移到含有100μl TIL培养基的96孔板中，然后将其在37℃下孵育20分钟。随后，对细胞进行计数，并然后将500K个活细胞接种到含有补充有6,000U/ml IL-2的6mL TIL培养基的24孔Grex板中。
一天后(培养的第14天)，假设消耗，添加IL-2至6,000U/ml。在培养的第17天，从每个孔中移除3mL细胞上清液并弃去(注意不要扰动孔底部的细胞)。将其替换为3mL新鲜TIL培养基，并添加IL-2至最终浓度为6,000U/ml(假设消耗)。在第18天，假设消耗，添加IL-2至6,000U/ml。在第21天，收获细胞并计数。细胞沉淀被冷冻，并通过扩增子测序测定编辑。
对编辑的TIL对比未遗传修饰的TIL的细胞活力和CD45编辑百分比进行了评估(图12)。在电穿孔后8天对使用方法1(使用饲养细胞的“REP样”)、方法3(“Stemcell”)和方法4(“Transact”)扩增的TIL进行测定。
实施例5：用可溶性活化剂或人工抗原呈递细胞(aAPC)扩增前-REP失败TIL的方法
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)直接从原发性人黑色素瘤转移的单细胞悬浮液中扩增。TIL获自三个不同的供体：供体3239、供体6752和供体6755。供体6752和供体6755先前被确定为前-REP失败，在前-REP中在23天内未能扩增到4×107个细胞。在培养的第0天，从单细胞悬浮液中取400,000-800,000个活细胞并接种到24孔Grex板(Wilson Wolf，目录号80192M)的孔中的6ml体积的TIL培养基(RPMI 1640和AIM V的1:1混合物，补充有5％人AB血清)并补充有6,000U/ml重组人IL-2(Peprotech，目录号200-02)内。如通过流式细胞术所测定，每种条件接种的活细胞含有22K至52K个CD3+T细胞。使用五种不同的方法活化和扩增细胞，如下所述：
·TIL扩增方法1(“REP样”)——没有前-REP的一步快速扩增方案。对来自五名健康供体的饲养细胞(PBMC)进行辐照(6,000拉德)并以1:1:1:1:1的比例合并。向每个孔中添加1×107个辐照的PBMC，以及360ng OKT3(Biolegend，目录号317326)，得到最终浓度为60ng/ml。
·TIL扩增方法3(“Stemcell”)——来自Stemcell的四聚体抗体复合物(TAC)。向TIL中添加来自Stemcell Technologies(目录号10970)的37.5μl抗CD3/抗CD2/抗CD28四聚体抗体复合物(TAC)，得到最终浓度为6.25μl/ml。
·TIL扩增方法4(“Transact”)——来自Miltenyi Biotec的纳米基质。向TIL中添加85μl共价附接到来自Miltenyi Biotec的针对人CD3和CD28的人源化重组激动剂(MACSGMP T Cell Transact，目录号170-076-156)的胶体聚合物纳米基质，得到最终稀释度70:1。
·TIL扩增方法5(“aAPC-OKT3”)——对工程化以表达OKT3的K562细胞进行辐照(15,000拉德)。将1×106个辐照的aAPC-OKT3细胞添加到每个孔中，得到最终细胞与面积比率为5×105细胞/cm2。
·TIL扩增方法6(“aAPC-OKT3-CD86”)——对工程化以表达OKT3和CD86的K562细胞进行辐照(15,000拉德)。将1×106个辐照的aAPC-OKT3细胞添加到每个孔中，得到最终细胞与面积比率为5×105细胞/cm2。
对于以上概述的所有五种TIL扩增方法，在离散的时间间隔处遵循通用方案，每种方法的变化如下所示：
·第2天：假设消耗到对应的孔中，将36,000U重组人IL-2添加到每个孔中，得到最终浓度6,000U/ml。
·第4天和第6天：替换/交换50％的培养基。从每个孔中移除并弃去3ml细胞上清液，注意不要扰动孔底部的细胞。然后，假设消耗，随后添加3ml新鲜TIL培养基和36,000U的IL-2，得到最终浓度6,000U/ml。第7天：对于所有条件，对细胞进行计数。将整个体积(6ml)转移到含有100ml TIL培养基和6000U/ml IL-2的6孔Grex(Wilson Wolf)中。
·第10天或第11天：在第10天和第11天，所有aAPC样品和可溶性活化剂样品分别使用如实施例4中所述的CRISPR-Cas9进行工程化。电穿孔后，将2×105个细胞转移到在24孔Grex(Wilson Wolf)中的含有6000U/ml的IL-2的6ml TIL培养基内。
·第13天：假设消耗到对应的孔中，将36,000U重组人IL-2添加到每个孔中，得到最终浓度6,000U/ml。
·第15天：替换/交换50％的培养基。从每个孔中移除并弃去50ml细胞上清液，注意不要扰动孔底部的细胞。然后，假设消耗，随后添加50ml新鲜TIL培养基和36,000U的IL-2，得到最终浓度6,000U/ml。
·第18天：收获供体3339的样品。收获供体6755的样品，如第15天所述，对在IL-2中用aAPC-OKT3或aAPC-OKT3-CD86激活的嗅觉(O)、SOCS1(S)和SOCS1+PTPN2(S+P2)样品进行了50％的培养基交换。如第15天所述，对供体6752样品进行了50％的培养基交换。
·第21天：如在第15天所述，对剩余的供体6755样品和供体6752样品进行了50％的培养基交换。
·第23天：收获剩余的供体6755样品和供体6752样品。
实施例6：使用CRISPR-Cas9对用可溶性活化剂或aAPC进行的前-REP失败的TIL进行遗传工程化的方法
使用CRISPR-Cas9对使用实施例5中所述的方案扩增的TIL进行遗传工程化，以产生靶基因的功能性基因敲除。该遗传工程化在实施例5中所述的每种方法的第10天进行，并且也在从0-21天范围内的其他天进行。简而言之，在第10天，将1.2x106个扩增的TIL以300xg离心5分钟，并用20μl MaxCyte电穿孔缓冲剂(HyClone目录号EPB1)重悬。制备含有52pmol Cas9蛋白(Aldevron，目录号9212)和120pmol每种单个sgRNA的几种核糖核蛋白(RNP)主混合物。主混合物1含有OR1A2基因(O)(IDT,AGATGATGTCAACCAAGGAG SEQ ID NO:910)的sgRNA。主混合物2含有SOCS1基因(S)(IDT，GACGCCTGCGGATTCTACTG SEQ ID NO：61)的sgRNA。主混合物3含有SOCS1基因和PTPN2基因(S+P2)(IDT,GGAAAACTTGGCCACTCTATG SEQID NO:206)的sgRNA。通过将10nmol冻干sgRNA与100μl无核酸酶双链体缓冲剂(IDT目录号1072570)重悬，制备100μM OR1A2 sgRNA溶液。试剂添加如下：
Figure BDA0003756012870003151
将全部5μl的RNP主混合物添加到20μl细胞悬浮液中。然后将25μl细胞悬浮液转移至OC25 X 3处理组件(MaxCyte，目录号OC-25x3)。使用“Optimization#9”程序在MaxCyteExPERT电穿孔仪上对细胞进行电穿孔。随后，将25μl TIL转移到96孔板中，每个室用25μLTIL培养基洗涤两次并转移到96孔回收板中，然后在37℃下孵育20分钟。随后，对细胞进行计数，并将2x105个活细胞接种到含有补充有6,000U/ml IL-2的6ml TIL培养基的24孔Grex板中。如实施例5中所述，从第13天开始进行进一步的细胞操纵。在第18天和第23天，收获细胞并计数。细胞沉淀被冷冻，并通过扩增子测序测定编辑(图16)。
实施例7：用可溶性活化剂或aAPC进行的前-REP失败的TIL的表型表征
评估了第18天或第23天产生的T细胞的表型。特别地，通过流式细胞术测定了被定义为中枢记忆T细胞表型(Tcm，具有标志物表型CD45RO+CCR7+CD45RA-)的细胞比例。取如实施例5中培养的细胞，并在第18或23天用荧光标记的检测CD45RO、CCR7和CD45RA的抗体对细胞等分试样进行染色。与前-RNP(电穿孔前的细胞)相比，方法3(Stemcell)和方法4(Transact)在第18天或第23天产生相似的Tcm细胞百分比(图15)。对于所有方法，在第18天或第23天，与前-RNP细胞相比，CD8+T细胞的百分比显示出的一般性富集(数据未显示)。
评估了通过实施例5中所述的五种方法通过添加IL-2扩增的TIL，在电穿孔前第10天或第11天(相对于第0天的细胞数量)TIL的扩增倍数(图13)。在方法1、方法3、方法4、方法5和方法6中，包括两个前-REP失败的所有供体都显示出大于2600倍的扩增。在第18天或第23天，在所有方法中，SOCS1编辑的TIL显示出比嗅觉编辑和SOCS1+PTPN2编辑的TIL更大的平均倍数扩增(图14)。在第18天或第23天，与方法5相比，方法6显示出SOCS1编辑的TIL更大的平均倍数扩增。
实施例8：使用可溶性活化剂从肿瘤片段中扩增TIL的方法
肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)直接从来自原发性患者的冷冻黑色素瘤肿瘤片段中扩增。肿瘤片段获自2个供体：供体D4462和供体D7283。在第0天，将肿瘤片段解冻并放入含有TIL培养基(RPMI 1640和AIM V的1:1混合物，补充有5％人AB血清)的10cm2皿中。将片段称重，然后均匀地分成(按片段数)两个等分试样，并将每个等分试样置于24孔Grex板(WilsonWolf，目录号80192M)的孔中。向每个孔添加6mL的TIL培养基，所述每个孔含有在6000U/mLIL-2(Peprotech，目录号200-02)中的1:70稀释的GMP TransAct试剂(MACS GMP T CellTransact，目录号170-076-156)。细胞在37℃下培养。
在扩增的第2天，假设消耗，将36,000U重组人IL-2添加到每个孔中，得到最终浓度6,000U/mL。
在扩增的第6天，对于D7283，替换/交换50％的培养基。从每个孔中移除并弃去3mL细胞上清液，注意不要扰动孔底部的细胞。然后，假设消耗，随后添加3ml新鲜TIL培养基和36,000U的IL-2，得到最终浓度6,000U/ml。对于D4462，如实施例9中所述，使用CRISPR-Cas9对样品进行工程化。电穿孔后，将4×105个细胞转移到24孔Grex(Wilson Wolf)中的含有6,000U/mL IL-2的6mL TIL培养基内。
在扩增的第9天，替换/交换50％的培养基。从每个孔中移除并弃去3mL细胞上清液，注意不要扰动孔底部的细胞。随后，假设消耗，随后添加3mL新鲜TIL培养基和36,000U的IL-2，得到最终浓度6,000U/ml。
在扩增的第10天，对于D4462，从24孔Grex的每个孔中吸出3mL培养基。将剩余的3mL添加到含有100mL TIL培养基和6,000U/mL IL-2的6孔Grex(Wilson Wolf)中。对于D7283，如实施例9中所述，使用CRISPR-Cas9对样品进行工程化。电穿孔后，将4×105个细胞转移到24孔Grex(Wilson Wolf)中的含有6000U/ml的6mL TIL培养基内。
在扩增的第14天，收获D4462孔。D7283，从24孔Grex的每个孔中吸出3mL培养基。将剩余的3mL添加到含有100mL TIL培养基和6,000U/mL的IL-2的6孔Grex(Wilson Wolf)中。
在扩增的第17天，D7283，移除50mL TIL培养基并替换为50mL新鲜TIL培养基。添加6,000U/mL的IL-2用于消耗。
在扩增的第20天，收获D7283孔。
实施例9：使用CRISPR-Cas9对用可溶性活化剂进行的片段扩增的TIL进行遗传工程的方法
使用CRISPR-Cas9对使用实施例8中所述的方案扩增的TIL进行遗传工程化，以产生靶基因的功能性基因敲除。该遗传工程化在第6天或第10天进行。简而言之，在第6天或第10天，将1.2x106个扩增的TIL以300xg离心5分钟，并用20μl MaxCyte电穿孔缓冲剂(HyClone目录号EPB1)重悬。制备含有52pmol Cas9蛋白(Aldevron，目录号9212)和120pmol每种单个sgRNA的两种核糖核蛋白(RNP)主混合物。主混合物1含有OR1A2基因(O)(IDT,AGATGATGTCAACCAAGGAG SEQ ID NO:910)的sgRNA。主混合物2含有SOCS1基因(S)(IDT，GACGCCTGCGGATTCTACTG SEQ ID NO：61)的sgRNA。通过将10nmol冻干sgRNA与100μl无核酸酶双链体缓冲剂(IDT目录号1072570)重悬，制备100μM OR1A2 sgRNA溶液。试剂添加如下：
Figure BDA0003756012870003181
将全部5μL的RNP主混合物添加到20μL细胞悬浮液中。然后将25μL细胞悬浮液转移至OC25 X 3处理组件(MaxCyte，目录号OC-25x3)。使用“Optimization#9”程序在MaxCyteExPERT电穿孔仪上对细胞进行电穿孔。随后，将25μL TIL转移到96孔板中，每个小室用25μLTIL培养基洗涤两次并转移到96孔回收板中，然后在37℃下孵育20分钟。随后，对细胞进行计数，并然后将4x105个活细胞接种到含有补充有6,000U/ml的IL-2的6mL TIL培养基的24孔Grex板中。如实施例8中所述进行进一步的细胞操纵。在第14天和第20天，收获细胞并计数。冷冻细胞沉淀，并通过NGS测序测定编辑(图19)。
实施例10：用可溶性活化剂或aAPC进行的肿瘤片段扩增的TIL的表型表征
评估了第14天或第20天产生的T细胞的表型。特别地，通过流式细胞术测定被定义为中枢记忆T细胞表型(Tcm，具有标志物表型CD45RO+CCR7+CD45RA-)或效应记忆T细胞表型(Teff，具有标志物表型CD45RO+CCR7-CD45RA-)的细胞比例。取如实施例8中培养的细胞，并在第14或第20天用荧光标记的检测CD45RO、CCR7和CD45RA的抗体对细胞等分试样进行染色。所测试的所有条件主要显示Teff记忆表型。SOCS1编辑适度增加了Tcm表型(图18)。
评估了通过添加IL-2扩增的TIL在第14天或第20天通过可溶性活化剂肿瘤片段扩增方法产生的理论TIL细胞数。假设一克肿瘤片段样品来计算理论细胞计数。所测试的所有条件均显示20天后的平均扩增大于1x1010个TIL(图17)。
实施例11：冷冻肿瘤消化物的TIL扩增与冷冻肿瘤片段的TIL扩增
对利用TransACT活化剂在IL-2存在下的冷冻肿瘤消化物的TIL扩增与冷冻肿瘤片段的TIL扩增进行了比较。活化后，对嗅觉(O)和SOCS1(S)进行编辑，并与无电穿孔(无EP)对照进行比较。
本次评估使用的材料如下：
Figure BDA0003756012870003191
Figure BDA0003756012870003201
*完全培养基：50/50RPMI/AIM-V，5％人血清
黑色素瘤消化物接收自Conversant Bio，并且黑色素瘤肿瘤片段接收自iSpecimen。供体信息和参考文献如下：
·D3239(消化物)BTC1000_
·D6138(消化物)BTC1000
·D6755(消化物)BTC1000
·D4462(片段)黑色素瘤_
·D7283(片段)_黑色素瘤_
Figure BDA0003756012870003202
对于两种TIL扩增，在离散的时间间隔处遵循通用方案，如下所示：
在扩增的第0天，根据Discovery Life Sciences方案(Thawing Viable CellProducts-1.pdf)，使用每个供体的三个小瓶解冻细胞。每个TIL供体管在1mL完全培养基中重悬，并合并为总共3mL。按照制造商的建议，使用Nexelcom Cellometer对细胞进行计数。从每个供体中移除200μL用于FACS染色。按照WI-002ACT FACS DifferentiationPanel.docx工作指南进行染色。在最后的重悬步骤，添加100μL Accucheck珠溶液(储备浓度200,000珠/mL)，以获得总共20,000颗珠子。根据获得的珠子计算T细胞总数。然后，将来自2X工作溶液(1:35)的TransAct试剂配制成最终浓度为1:70。将2x106个细胞和3mL的2XTransAct试剂添加到24孔Grex的孔中，并将剩余的TIL培养基添加到细胞中以使总体积达到6mL。以6,000U/mL的最终浓度添加IL-2。将细胞在37℃下孵育。
仍旧在扩增的第0天，将肿瘤片段小瓶在37℃水浴中解冻。然后将片段倾入含有10mL TIL培养基的10cm2皿中。将10cm2皿置于测量垫上并对片段进行拍照。将片段分成两个相等的等分试样，并将每个等分试样置于含有1mL TIL培养基的1.5mL Eppendorf中。将片段以200g离心5分钟。吸出培养基并称重合并的片段。将3mL2X TransACT试剂和3mL TIL培养基添加到24孔Grex的孔中。将片段添加到24孔Grex的孔中。对于D4462，将8个片段与IL-2合并。对于D7283，将6个片段与IL-2合并。以6,000U/mL添加IL-2。将细胞在37℃下孵育。
在扩增的第2天，将IL-2添加到所有供体中。添加IL-2至6,000U/mL用于消耗。
在扩增的第4天，为所有供体交换培养基。从每个孔中弃去3mL培养基，并向每个孔中添加3mL TIL培养基。然后，添加IL-2至最终浓度为6,000U/mL。
在扩增的第6天，对D3239、D6138、D6755和D4462进行FACS染色和电穿孔。通过用100uL双链体缓冲剂重悬10nmol小瓶，将嗅觉sgRNA的浓度调整至100μM。SOCS1指导物已经处于必要的浓度。制备了总共15次测试的RNP溶液，体积如下：
Figure BDA0003756012870003221
MaxCyte仪器已准备好并设置为“optimization#9”OC25X3。从每个孔中吸出3mL培养基，记录体积并进行细胞计数。将100uL电穿孔前的细胞转移到96孔v底板中并根据WI-002ACT FACS Differentiation Panel.docx方案进行染色。对于每种条件，将1.2x106个细胞添加到1.5mL Eppendorf管中。将管以300g离心5分钟并移除上清液。将20uL MaxCyte电穿孔缓冲剂添加到1.5mL Eppendorf管中。将5uL的嗅觉或SOCS1 RNP溶液添加到对应的Eppendorf管中。转移最多25μL到OC25X3组件，并对细胞进行电穿孔。将25μL细胞从OC25X3的孔中转移到96孔回收板中。OC25X3孔用25μL TIL培养基冲洗两次，得到回收板孔中的最终体积为75μL。将细胞在37℃下孵育20分钟。通过以下进行细胞计数：从回收板添加5μL到计数孔中的45uL TIL培养基中(稀释10倍)；添加50μL AOPI并混合；转移到计数室；并进行细胞计数。然后将4x105个细胞转移到24孔Grex的孔中。孔在37℃下孵育。
在扩增的第9天，交换所有供体的培养基。从每个孔中弃去3mL培养基。向每个孔中添加3mL TIL培养基，并添加IL-2至最终浓度为6,000U/mL。
在扩增的第10天，对D7283进行FACS染色和电穿孔。如对第6天的样品所述制备样品。制备了足够的5个样品。
仍旧在扩增的第10天，将样品D3239、D6138、D6755和D4462转移到6孔Grex中。将100mL的TIL培养基添加到含有6,000U/mL的IL-2的6孔Grex中。从每个供体孔中弃去3mL培养基。进行细胞计数并记录体积。将3mL的供体细胞添加到6孔Grex中对应的孔中的含有100mL具有细胞因子的TIL培养基内。
在扩增的第14天，对D3239、D6183、D6755和D4462进行了取出测定。从6孔Grex的每个孔中吸出80mL，混合，并记录它们的体积。保存一个小瓶用于NGS处理：将100万个细胞转移到1.5mL Eppendorf管中，并将该管以300g离心5分钟。吸出上清液并将细胞储存在-80℃。进行了FACS分析：将每种条件下的100万个细胞转移到v底或u底96孔板中，分别用于分化和多功能面板(polyfunctional panel)。根据工作指导处理细胞。剩余的细胞被冷冻：制备了5000万个细胞沉淀；将细胞以300g离心5分钟；吸出上清液；添加了冷冻袋(cryostore)；将细胞重悬至5000万个细胞/mL；添加1mL到冷冻小管中并在-80℃的冰箱中放置过夜，然后转移到LN2。
在扩增的第14天，将D7283转移到6孔Grex中。将100mL的TIL培养基添加到含有6,000U/mL的IL-2的6孔Grex中。从每个供体孔中弃去3mL培养基。进行细胞计数并记录体积。将3mL的供体细胞添加到6孔Grex中对应的孔中的含有100mL具有细胞因子的TIL培养基内。
在扩增的第17天，对来自样品D7283的细胞进行计数，并进行50％的培养基交换。移除50mL培养基并进行细胞计数。为得到总共100mL，添加了50mL的TIL培养基。假设消耗，添加IL-2至6,000U/mL。
在扩增的第20天，对D7283进行了取出测定并继续扩增。从6孔Grex的每个孔中吸出70mL，混合并记录它们的体积。移除了500万个细胞以支持以下取出测定。保存一个小瓶用于NGS处理：将100万个细胞转移到1.5mL Eppendorf管中，并以300g离心5分钟；吸出上清液；并在-80℃储存。编辑效率在图20中绘示出。进行了FACS分析：将每种条件下的100万个细胞转移到v底96孔板中进行分化；并根据工作指导处理细胞。剩余的细胞被冷冻：制备了5000万个细胞沉淀；将细胞以300g离心5分钟；吸出上清液；添加冷冻袋并将细胞重悬至5000万个细胞/mL；并且添加1mL到冷冻小管中并在-80℃的冰箱中放置过夜，然后转移到LN2。为得到总共100mL，向孔中添加了70mL TIL培养基。假设消耗，添加IL-2至6,000U/mL。
在扩增的第23天，对D7283进行了取出测定，并将样品冷冻。从6孔Grex的每个孔中吸出70mL，混合，并记录它们的体积。移除了100万个细胞以支持以下取出测定。进行了FACS分析：将每种条件下的100万个细胞转移到u底96孔板中用于多功能面板；并根据工作指导“WI-008ACT FACS Polyfunctional Panel CD25 APC.docx”处理细胞。剩余的细胞被冷冻：制备了5000万个细胞沉淀；将细胞以300g离心5分钟；吸出上清液；添加冷冻袋并将细胞重悬至5000万个细胞/mL。添加1mL到冷冻小管中并在-80℃的冰箱中放置过夜，然后转移到LN2。到此过程的第14天，外推TIL产率超过1x109个细胞的片段样品和消化物样品两者(图22)的TIL被确定为高活力(图21)。
序列表
<110> KSQ治疗公司
<120> 用于活化和扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法
<130> 706299: KSQ022-WO01
<150> 62/940,035
<151> 2019-11-25
<150> 63/081,539
<151> 2020-09-22
<160> 910
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1766
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
ggcagctgca cggctcctgg ccccggagca tgcgcgagag ccgccccgga gcgccccgga 60
gccccccgcc gtcccgcccg cggcgtcccg cgccccgccg ccaggtgagc cgggccctgg 120
gcgaggaggc gggagggagg agggagggga gtccagggca gccaggagtc gggcgagcct 180
cgggggctgc agaatggggt cgcggccgcg atgcccctga ccctcgccgg ccccacccag 240
gccgcccccc gcgcgcgggg ctcccgcagc acagcctttc tccggcccta gcccaaatcg 300
cccagaccag gcgcggatcc cagcctggcc agcaggcggc gggcgcgggg cggcgagccg 360
gggccggacg gctggagcca gaaccggctg ctctccacgc ccccctctcg gtgctgcccg 420
gaggccggac tccgcctcca ccgagccccc acccgccggg aagagctccg cggagtacag 480
agcccatttt ctagctgtgt ccactgaggc tgaacggatc cgcgcggact tggtgctccg 540
tgctcgcccc ctagggccgg gtccgccggg agcgccgccc tccggagttg tccggccggc 600
gcacacctgc ccggccccgc agcgccccag ctcacctctt tgtctctccc gcagcgcacc 660
cccggacgct atggcccacc cctccggctg gccccttctg taggatggta gcacacaacc 720
aggtggcagc cgacaatgca gtctccacag cagcagagcc ccgacggcgg ccagaacctt 780
cctcctcttc ctcctcctcg cccgcggccc ccgcgcgccc gcggccgtgc cccgcggtcc 840
cggccccggc ccccggcgac acgcacttcc gcacattccg ttcgcacgcc gattaccggc 900
gcatcacgcg cgccagcgcg ctcctggacg cctgcggatt ctactggggg cccctgagcg 960
tgcacggggc gcacgagcgg ctgcgcgccg agcccgtggg caccttcctg gtgcgcgaca 1020
gccgccagcg gaactgcttt ttcgccctta gcgtgaagat ggcctcggga cccacgagca 1080
tccgcgtgca ctttcaggcc ggccgctttc acctggatgg cagccgcgag agcttcgact 1140
gcctcttcga gctgctggag cactacgtgg cggcgccgcg ccgcatgctg ggggccccgc 1200
tgcgccagcg ccgcgtgcgg ccgctgcagg agctgtgccg ccagcgcatc gtggccaccg 1260
tgggccgcga gaacctggct cgcatccccc tcaaccccgt cctccgcgac tacctgagct 1320
ccttcccctt ccagatttga ccggcagcgc ccgccgtgca cgcagcatta actgggatgc 1380
cgtgttattt tgttattact tgcctggaac catgtgggta ccctccccgg cctgggttgg 1440
agggagcgga tgggtgtagg ggcgaggcgc ctcccgccct cggctggaga cgaggccgca 1500
gaccccttct cacctcttga gggggtcctc cccctcctgg tgctccctct gggtccccct 1560
ggttgttgta gcagcttaac tgtatctgga gccaggacct gaactcgcac ctcctacctc 1620
ttcatgttta catataccca gtatctttgc acaaaccagg ggttggggga gggtctctgg 1680
ctttattttt ctgctgtgca gaatcctatt ttatattttt taaagtcagt ttaggtaata 1740
aactttatta tgaaagtttt tttttt 1766
<210> 2
<211> 1729
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 2
agcagagaga actgcggccg tggcagcggc acggctccca gccccggagc atgcgcgaca 60
gccgccccgg agcccccagc cgcggctccc cgcgtcctgc cgccaggtga gccaaggcag 120
ctgcgaggga gcaggcggga ggggatggga ggtgatggga gcagagcccg gcaggactaa 180
cctcgcagac tgtatggcag ggtcgaggat gccacgcctc tggcgccccc ccacccccgc 240
cccggctccc ccaggaggcc cctcgctcga gcggggcgcc gtcagcccct cctctccggc 300
cctgagccct gatcctccgc ccgggttcca gtccccggcg tggccagtag gcggcagccg 360
cgaggcgact agccaccagc ggggacggcc gggagtcggg cccctctcca cgcccccttc 420
tccacgcgcg cggggaggca gggctccacc gccagtctgg aagggttccg catacaggaa 480
cggcctactt cgcagatgag cccaccgagg ctcaagctcc gggcggattc tgcgtgccgc 540
tctcgctcct tggggtctgt tggccggcct gtgccacccg gacgcccggc tcactgcctc 600
tgtctccccc atcagcgcag ccccggacgc tatggcccac ccctccagct ggcccctcga 660
gtaggatggt agcacgcaac caggtggcag ccgacaatgc gatctccccg gcagcagagc 720
cccgacggcg gtcagagccc tcctcgtcct cgtcttcgtc ctcgccagcg gcccccgtgc 780
gtccccggcc ctgcccggcg gtcccagccc cagcccctgg cgacactcac ttccgcacct 840
tccgctccca ctccgattac cggcgcatca cgcggaccag cgcgctcctg gacgcctgcg 900
gcttctattg gggacccctg agcgtgcacg gggcgcacga gcggctgcgt gccgagcccg 960
tgggcacctt cttggtgcgc gacagtcgcc aacggaactg cttcttcgcg ctcagcgtga 1020
agatggcttc gggccccacg agcatccgcg tgcacttcca ggccggccgc ttccacttgg 1080
acggcagccg cgagaccttc gactgccttt tcgagctgct ggagcactac gtggcggcgc 1140
cgcgccgcat gttgggggcc ccgctgcgcc agcgccgcgt gcggccgctg caggagctgt 1200
gtcgccagcg catcgtggcc gccgtgggtc gcgagaacct ggcgcgcatc cctcttaacc 1260
cggtactccg tgactacctg agttccttcc ccttccagat ctgaccggct gccgctgtgc 1320
cgcagcatta agtgggggcg ccttattatt tcttattatt aattattatt atttttctgg 1380
aaccacgtgg gagccctccc cgcctgggtc ggagggagtg gttgtggagg gtgagatgcc 1440
tcccacttct ggctggagac ctcatcccac ctctcagggg tgggggtgct cccctcctgg 1500
tgctccctcc gggtcccccc tggttgtagc agcttgtgtc tggggccagg acctgaattc 1560
cactcctacc tctccatgtt tacatattcc cagtatcttt gcacaaacca ggggtcgggg 1620
agggtctctg gcttcatttt tctgctgtgc agaatatcct attttatatt tttacagcca 1680
gtttaggtaa taaactttat tatgaaagtt tttttttaaa agaaacaaa 1729
<210> 3
<211> 98858
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 3
gctcgggcgc cgagtctgcg cgctgacgtc cgacgctcca ggtactttcc ccacggccga 60
cagggcttgg cgtgggggcg gggcgcggcg cgcagcgcgc atgcgccgca gcgccagcgc 120
tctccccgga tcgtgcgggg cctgagcctc tccgccggcg caggctctgc tcgcgccagc 180
tcgctcccgc agccatgccc accaccatcg agcgggagtt cgaagagttg gatactcagc 240
gtcgctggca gccgctgtac ttggtgagtc gcggacccac gcggcagtcg ccgacctcct 300
ccgagacccg gactcgtgcc ctgtccgcag ggtccctccc gcctcccccg cctctcgcct 360
ctagcctctc gctcggggcg gaagtggcgg cgcggtccgc gtcaggggcg cgcctgcgct 420
gaccgctctc ttgctccttt tggtttaaaa aaaaaaaaaa aaaaagcata cttgagctga 480
gcagctcatg gttagcgcaa gcgcagttag ttctggaggg cggtgccaca gcggcttctt 540
ggggagcgcg tggatgcgcc accagcgttg cgcggcccgg gtctgggggt ccttgggaaa 600
gccgtggggg cgctcgggcg cgcgcccccg ggccgcagct tcgccgtagc tcccacgccg 660
ctgtgcttgg ttcttgctcg cggacagctc tttctctggc cgggtgtttt gtggccgggt 720
gggcagctgg cgtccccggg agcggtgagg gcgggggcgg gcgagccggg ccgcggcgtc 780
cgggtccagc tggcgcccgc gcaggacctg tgggagcagg ccgctctggg cgccgggccg 840
gccgccgcag ccctctgcga ggcgaagctc gctctcctgg cggagccgcg gtggttgggg 900
gtggctcgtg gcctctggcg agggcagcgc tctcgggacc ctccgtcttc attttccccc 960
gtggcccagc agcgcccagc gtgggttcgg cccccataga accttcccgg aacgaaagag 1020
gctttgcttg tgttcgtcca gtgatagcgt gtcattctct ttatagtttt ccttactgag 1080
gtatactttc cctacagtga aacgcagctt tcatgtgtgc tcccagacgg gtgtcacaaa 1140
tgaatcccct cttgcaagcc ccctcaaatc aaaatagcct ttccttgccc tgagaaagtg 1200
ccctcatccc ctccccgggg gcacggtgtt ccgatgccta tcgccctaat cgtgcctgtt 1260
cagctcacat agatgcaata tgtagtataa acacctgtga ttcgcttttt ttatgtcaac 1320
tagactacct tttaattcaa acaaaacttt atctctttta aaatgatgta actgctttcc 1380
ccttcgttta atccttgtcg tattattccc aagattgaat ttggtgacgg ttaagttaat 1440
gctgcttctg atgtttggtt ctctctgtgt aaagtaaaag acgggctttc ctgtaaatgg 1500
atgatcctgg gtttttcccc tttccattta attagatggc agtgaaaaat gtgttcagaa 1560
agtaacgttt tcttcttgaa cacattagtg ggaagtataa atattctgat tcccatgata 1620
cagagtatgt tagaataggg atctaagttt taaagaatgc tggtaaggac tcttccaatt 1680
atagacaatc tgaaacgcaa attctggtag gaatcttcat gtgagagagc ctgccagctg 1740
catcttctcc agttacattt gttttagcag aggctgctgt ctctctaagg gataggttat 1800
atatcgaaat agatttgaaa agagaaaagt gaatataact taattcagct taacattttg 1860
gtttaagaaa tttaattttc tttggtatca ttaatatcct tgaaaattca atgagaattg 1920
tgattcctct ttccagaaaa atgaacttaa ctcgcatcca ctggagattt cacatgcatt 1980
ttcaaaaaga taaggaaatc cttctataga ttcttaccga ggaatcctgt agtttccttg 2040
gttggtcaat gctcatatta ttttttccta gttgaaaaca agaccattag tttggtcagt 2100
agaaaccatg gcatgcacac tggtgttaca gtaaaagtag gtcacaaacc aagaaagtta 2160
gtaatggaaa gcaagtcagg aagtttgagc tatgtgttct cctgtggcct tagaacatcc 2220
attcagccat tccacaaata tgcccggacc cccagtggag ttgcagcttt tgctcctggc 2280
cttggggatt cagcagagaa tgctcctggc aagtttccta ccctcgaggt gctcactcta 2340
gggcttattc ttttggggcc tcattgtagt tccatatttt cattcattcg ttcataacat 2400
gcttgttatg tgctagtgtt agacactgag gattcttgtt aaaagacagg agtcccagtt 2460
tttaaggatg cagccctgta aataggtaag ctgatgaaaa cgttaaagtg atacatgtaa 2520
agctagcttg aagcacaggg tcttgtggag ttgagttacc taggagtcct gtatttccca 2580
aaaaggggta cacatgggag ttctggtgaa gcttctcgag ggagggagga cctcacctaa 2640
gtcttgaaag acattggcca ggggaagagg acaagggagg tgaagagaat tactgttcca 2700
gcaaggaggg agtgcacaaa ggcactgagg gaatgctgag agaaccaccc acagtttagc 2760
ctggagactg gtgtgaagtt gagatgctgg agagtaaggc agagcctaga tcagactaag 2820
gaatttgagc tgtttaatag gaactcattg tggaattgta agtctggaaa taccatgatc 2880
atatttgctt cttttttttt tgacagagtc ccgctctgtc gcccaggctg gagtgcagtg 2940
gtgcgacgtc agctcactgc aacctctgcc tcctgggttc aagtgattca cttacctcag 3000
cctcctgcgt agttgaaatt acaggcacac accaccatgc ccggttgatt tttttgtact 3060
tttagtagag acagggtttc gacatgttgg ccaggctggt ctcgaactcc tgacctcagg 3120
tgatccgcct gcctcggcct ctcaaagtgc tgggattaca ggcatgagcc actgctctgg 3180
gctgatcata tttacttgtt agcaagatcg ttctgactgc tagcagactg gatgaggaaa 3240
gtgtaggcac gcagcacagg gcagtagtcg gttggagtaa acctgaagag acatgatgag 3300
cttctgttag gcagtggcag gagggatgga ggggagatac agatttgaaa tgaaatggta 3360
aaggggtata cgttatgtac aagtttggtt ttgaaacttt aattctgttt gaggtacctg 3420
cgagacactg aaatgaagct agttgaatgt ataaatttgg agttcgggag agagggtctg 3480
agtaaatgtg attttggaaa tcatgaacac atgggtgata tttgaggtct tagacattga 3540
tgagatcatc tagggaagat acagagcgtt tggaaatatc aaaggccaag gacagaatct 3600
tgacagacaa catttaaaag gatgggtgga gaaagaggaa cttgcaaaaa agactggtga 3660
ggaacaacca cagaagtggg gaggaaagca gtggagggag ttgagggtga gcagggccac 3720
ctgacaggta agggccagcc tgagagggcc atgacattga gcagctagat taacagatac 3780
cttaaaggga gttgtgtcag cggactacac aagacagata cctggagttc aggagagaag 3840
gtaggaggaa atgcaaacta ccaagtgtac actgctcttt ttagaagccc aacttgaaga 3900
agtggggaga ggtagctaaa atgaagcaag attgtgtgac ttctcactta aacccttgaa 3960
cggctttccg ttgctcacag tgtaaattca gcccctcctc cggctcacaa gacctcatgg 4020
cctgtgtctc ttgcttgatt tcccctatca ctttcctccc tcttttccac tgtgttgtat 4080
tcttggaagt gtgtgtgtcc attctcccct tagggcgttt gtaaatgttg ttctctttgc 4140
cttggcacaa ctttcccccc ttctctttcc tttcttgctt aaactgcctc ctactcatcc 4200
ctgaagtctc acttccttgg caggccttct tgacctgccc atgctgggta tgagcccctg 4260
ttgcgtactt ctttagcatc ccaagacttc ccctttcata gcgggaattg gatgtcatac 4320
agcagcaaat gatttcggga acacaatttg cattaagcaa accactatct tgaaagtaac 4380
acagcttgag taggaaaaaa gtgtttaagg tggctttctg ctttgtttag cacagcagtg 4440
ggtgatgttt ctgataatgt ttttgaagag ttgtgctttt tttggtaatg ctcatggagc 4500
tgggaaaaga aaggctttgc tcttgagcaa aaactgagta caactaaaag ctggacttgc 4560
ttagtggtag gagaacttga taccttgttg aaattctagc gggaaaaatg aatttagtat 4620
tttgagtctg gaactctggt cccttattcc tttttgctcc ttttgaaaag tgtcttttat 4680
ttcatgagtt tgataatagg aggtttctta gaaatgaatt attgggttgg agcagaacag 4740
actctgttaa tctgagttta tattttttat tacttcttca gagtttcatg aaggcactgc 4800
cagtgctttg cacagtatca ggtgcttagt aagcacttga aaatatgtgc tgaatgaatg 4860
actttttacg aggaaagggc aacttgatat atttatgtga ttgcagggat gaacctaaag 4920
agagaggtgg aggttgaaat agaagggatg attgttggag ccagaaatct tagaaagcaa 4980
gagtcaatgg gaccaagagc acacaggtgg aagaattgat cgtgaaagag tgctggccag 5040
gcggtggctc atccctgtaa tcccagcgct ttgggaggct gaggtgggag gatcacttga 5100
ggtcaggagg ttagggctgc agtgagccat aattgtgcca ctgcactaca gactaggtga 5160
cagagtgaga tcctgtctct aaaacaagaa cagcaaaaca aagggtgcag ttggaaaagt 5220
ttaatttggt ctgattgtgt gaggttaatt ctgacttttt gagtaatgtt catgatccct 5280
ttttggcttt tccttttgtc actgctgatt gctgtcttca tcaggctgag ctttgagaaa 5340
ggcagagaga aggaatggag tctgtgtgcc tactgaggaa aagactaaaa ctggggaatc 5400
gcaaaagcta tgttatgggt tgtttctaag aagtgatggc tcagaaggaa tttggcttat 5460
ttatttttaa attcctttct tttttaaaga gttctcactc tgttgcccag tctggagtac 5520
aagtgcagtg gtgcaatcat agctcactgc aaccttaaac tcctgggctc aggtgagcct 5580
ctcacctcag cctcttggaa attggttgat taattagggt ttataaacaa tggaactcct 5640
gactgacttc atttttcttt ttttgaaacc aagtcttgct ctgtccccca ggctggagtg 5700
cagtagtgtg atctcagctc actgcaacct ctgctccccc caggttcaag cagttctact 5760
gcctcagcct cccgagtagc tgggattaca ggtgcccacc agcacgccca gctaattttt 5820
gtatttttag tagaaacggg gtttcaccat gtttgtcagg ctggtcttga actcctgacc 5880
tcaggtgatc cacctgcctc ggcctcccaa agtgctgctg ggattacagg tgtgagccac 5940
cacgcccagc cacatttttc tttttctttc tttttttcct ttttctttct ttttttttct 6000
ttttctttct tttctttttg agactgggtc tcactttgtc acccagtctg gagtgcagtg 6060
gcgtgatctc agctcactgc agtctcgacc tcttgggctt tagacatcct cctgcctcag 6120
tcccccacgt agctgggcct ggctaatttt tttgtatttt ttgtagagac agggtttaac 6180
tattttgccc aggctggtct tcaactcctg agttcaagca atctgtccac ctcagccttc 6240
caaaggctta ggattacaag catgagccac tgtgcctggc catttttctt ttttcttttt 6300
ctttttttga gacagtcttg ctctgttgcc caggctggag tgcagtggcg tcatctcggc 6360
tcgctgcaag ctctgcctcc caggttcacg ccattctcct gcctcagcct tctgagtagc 6420
tgggactaca ggcgcccgcc aacactacag gcgcccgcca ccacgccagg ctaatttttt 6480
gtatttttag tagagacggg gtttgaccgt gttagccagg atggtcttga tctcctgact 6540
ttgtgatcca cctgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt ataggcatga gccactgcgc 6600
ctggccgcca tttttcttta ttagaaattt gtagttcaaa tattgctaga gaacaatttt 6660
taccatttgt gagtcagcta atttttagaa gtcagatatc aagtgcacac tgttcttctc 6720
atacttacag cggggcagcc agttaggcag gtgaatcaaa gctgtcttat tctaaaacac 6780
ttcccttgcc tactagttac acattctcct gcctgctgtc taatctcagt gcttttacat 6840
ggttgcacaa actctgaatt cccttgaaga ttggctactc tctcacacct tggagtcttc 6900
atgtgttgga tatactccat gcctaccata tctatttggg aaacatcttc aagactagac 6960
cgtagtctcc ttgggcaaag ttaaatgctc ccccttctct catttcttag ttctctatat 7020
tcttttatta gaatatgaac cacattgttt tgtaactgtc tacttgtctg ttctgtgtag 7080
ctccttgagg gtggtctttt tttttctttg ttttcccacc acctacctac gggacctgaa 7140
acatgttaga tgctcagtaa atattcagta aacacaggaa aactgttccc ttttaaaatg 7200
tcagcacctt agtttattcc aaacccctca tttatggctg aggaaacact gggccaatac 7260
agtgttgtga cttatctgat gttacaatat ctgctagtgt cataactggg actcaaatcc 7320
agtccttctg attctcgttt cagcactgcc ctaatttacc catgtgacta cctgtagtgc 7380
tttcttctta tgatctattt gagatcagtg gcacagaggg aatcgtctta attttgatgg 7440
ctaggaggga gtggatgtgt tataataggt agggtcattt tgggacttga ggcctttaaa 7500
acagtgtctg ggatccaggg atcagacttg aaaggtattt gcaaatctcc tgaaactgct 7560
aaattttatg tacgtgtgtt cccaggtatt tcgtttctag gtgattctgt agcttttgtc 7620
agtttcttag tggatttgtc tgtgatccct caaaaggtaa agaccactgc ttgaagggaa 7680
agcagccttg ggatgggtgc cccaatgggg aatgtatacc tagaaatcat attgttttgc 7740
ctttgacatg tgtttataga ttactgatat ctataattac ggaaatccag atagttgcgt 7800
ttgtctccta gcttttctag ttgcctcttt tttgatttct tgattttaac cagaatcttc 7860
tttttttctt gagaaggggt ctcattccgt cacccaggct ggagtgcagt ggcacgatcg 7920
taggtcactg cagactcaaa actcctggct caagtggtcc tttgcctcag cctcccgaga 7980
agctgggact acaggcacac accaccacgc ctgacaaatt tcttcttctt cttcttcttt 8040
ttgttgttgt tcttgttggc caggctggtc tggtcttgaa ctcccggcct caagtggtct 8100
gctcaccttg gcttcccgaa gtggcgagat tacaggcatg agccaccatg cccagccctt 8160
aaccagaatt ttgttttgtt ttgttttttg agacagggtc tcactctgtc acccagactg 8220
gagtgcagtg atgagatcac ggctcactgc acagatgcac gccaccatgc ttggctaatt 8280
ttttatgttt tgtagagaca ggttctcacc atgttgtcca gactggtctc gaactcccgg 8340
gctaaagcga tcttccggct tcacccttcc ataatgctgg ggagccacag tgcttggcca 8400
accagaatct taaaagccct ttttactttt tccagatagt tactctgcag agaatttctg 8460
attcccagtt ggagaactgt tacagctctc tcagtcccct gctgttcttt tagctacctt 8520
gtctttgtcc tcttacctgt ccactctcta ctccccttct tccctttggt ctccaaatag 8580
tccagataaa ccagagagat ggacagataa ggtctgggta cgcgaaatta aaattaacat 8640
agtgtgctct tcactttctt gaataaacgt tacgtatgat ttgtttccct tggaaatcct 8700
catctagatt ctctactctc tattccttaa cttaatgccc cattaaggta gttttttctt 8760
aatggaaagc tgttgagagt cagaggatat ttaaaccaac taataaactg aacttttaat 8820
aataccaccc ttactttgga taagagtgat tagccatata ctaaatcctc aatcagttta 8880
gcatgtaaaa tttaagacat agcagctgat aactgaggaa gagatacatt tccacaggct 8940
aactttaaag aatataagct ctcactttcc tgagtagaag aaaactaaac ttttctgttc 9000
tatgcttttt ttttttttaa tttttatttt tattgatcat tcttgggtgt ttctcacaga 9060
gagggatttg gcagggtcat aggacaatag tgaagggaag gtcagcagat aaacaagtga 9120
acaaaggtct ctggttttcc taggcagagg accctgaggc cttccgcagt gtttgtgtcc 9180
ctgggtactt gagattaggg agtggtgatg actgttaacg agcatgctgc cttcaagcat 9240
ctgtttaaca aagcacatct tgcactgccc ttaatccatt taaccctgag tggacacagc 9300
acatgtttca gagagcacag ggttgggggg taaggtcaca gatcaacagg atcccaaggc 9360
agaagaattt ttcttagtac agaacaaaat gaaaagtctc ccatgtctac ttctttccac 9420
acagacacgg caaccatccg atttctcaat cttttcccca cctttccctg ctttctattc 9480
cacaaaacca ccattgtcat catggcctgt tctcaatgag ctgttgggca cacctcccag 9540
acagggtggt ggccgggcag aggggctcct cacttcccag taggggcggc cgggcagagg 9600
cgcccctcac ctcccgggtg gggcggctgg ccgggcgagg ggttgacccc cccacctccc 9660
tcccggacgg ggcggctggc cgggcggggg gctgaccccc ccacctccct cccggacggg 9720
gcggctggcc gggcgggggg ctgaaccccc cacctccctc ccggacgggg cggctggccg 9780
ggcggggagc tgaccccccc ccaccttcct cccggacggg gcggctggcc gggcagaggg 9840
gctcctcact tcccagtagg ggcggccggg cagaggcgcc cctcacctcc cggacgaggc 9900
ggcaggccgg gcgggggctg atccccccac ctccctcccg gaaggggctc ctcacttccc 9960
agtaggggcg gccgggcaga ggcgcccctc acctcccaga cggggcggct ggccaagcgg 10020
ggggctgacc cccccacctc cctcccggac ggggcggctg gccgggcggg gggctgaacc 10080
ccccacctcc ctcccggacg gggcggctgg ccgggcgggg ggctgacccc ccaacctccc 10140
tcccagatgg ggcggctcgc ctggcggggg ctgaccccca cctccctcct ggacggggcg 10200
gctgccaggt ggagacgctc ctcacttccc agacagggtg gctgccgggc ggaggggctc 10260
ctcacttctc agacggggcg gctgccgggc ggagggtctc ctcacttctc agacggggcg 10320
gttgccaggt ggagggtctc ctcccttctc agatggggcg gctgggcaga gacgctcctc 10380
acctcccaga cggggtcgcg accgggcaga ggcgctcctc acatcccaga cggggcggcg 10440
gggcaaaggc actccccaca tctcagacga tgggcagccg ggcagagacg ctcctcactt 10500
cctagatggg atggcggccg ggcagagatg ctcatcactt tccagactgg gcagccaggc 10560
agaggggctc ctaacatccc agacgatggg tggccaggca gagacgctcc tcacttccta 10620
gacggggtgg cggccaggca gaggctgcac tctgggcact ttgggaggcc aaggcaggcg 10680
gctgggaggt ggaggttgta gcgagccgag atcacgccac tgcactccag cctgggcacc 10740
attgagcact gagtgaacca gacaccgtct gcaatcccgg cacctccgga ggccgaggct 10800
ggcggatcac tcgcggttag gagctggagg ccagcccggc caacacagcg aaaccccgtc 10860
tcccccaaaa aaatacgaaa accagtcagg catggcggcg cgcacctgca ctcgcaggca 10920
ctctgcaggc tgaggcagga gaatcaggca gggaggttgc agtgagccga gatggcagca 10980
gtacagtcca gcttcggctc ggcatcagag ggagactgtg gaaagagagg gagagggaga 11040
ccgtggggag acggagaccg tggggagagg gagaggaggc agagggagag ggagaggctt 11100
tttttttttt ttcttgagac ggagtcttac tctgtcaacc aggctggagt gcagtggcac 11160
gatcttggct cactgcaacc tccacctccc tggttcaagt gattctcctg cctcagcctc 11220
ccaagtagca gggactacag gcatgcgcca ccacacccag ctaatttttg tatttttagt 11280
agagatgggg tttcgctgtg ttggctgggc cagtcttgaa ctcctgacct caggtgatcc 11340
acccaccttg gcctcccaaa ttgctgggat tacaggcgtg agccaccgcg tccagcctgt 11400
tacattctta attggaatag cattgccctg cagtgccatt atctgaaata gcttttaaga 11460
atgaatgtaa tgccatttta aatgtattta aatgttgtgc cgatttaatg ttctatgtac 11520
ggtacagtac tactaatggt tcaagaagtt gttttgactt aacagtgaaa tccttgcttt 11580
taaagatcat agataccttt agacaccttt aagatgaaac atgtttatga gaggaaatgt 11640
ccgcacaaat acaatccccc gcaaacttag catgtggttt tagtaggttc ataggcccac 11700
ctggtgatcc ctaggataag aaattgtggt caagaaactg atttcagggg ccgggctggt 11760
ggcttacacc tgtaatccca gcactgtttg tctcaaaaca aagaaactgg ctcaaggttg 11820
gatacttttc aaacgagagg aatggaggaa gggaatgcaa tgaataactt ttcaaatcca 11880
gtatgtctga tttaatatgc cgtttgctct gtcagtttca tttggttcgt gtcactgatc 11940
atttataacc ttttttcaaa ctgctttcat tcccctaagg aaaatctgat actgaattat 12000
tttatttctt ctttcactat atttgaacgg ttttatagtc tgaaagctat caatttctca 12060
ttacagttta cttcatagta cttctaggaa ttcttcctgt ggtttgaggt aaggctacag 12120
gattcctaga gtttgtaccc ctctagtccc agtaaaggac ctggtacatc aatcagggta 12180
gccctagaaa gttggagtaa cttcgtaaca gtgggaactg cttctgttct atgttttttg 12240
tgggtttttt atttgttttt gtttttttgt ttttttgttt tttttttgag acagagtctt 12300
gctctgtggc cccaggctgg aatgctacgg cacgatctcg gcttactgca acctctgcat 12360
gctgagttca agcgattctc ctgcctcagc ctcctcagta gctgggatta caggcgtgca 12420
ccaccacgcc cagctaattg ttgtattttt agtagagaca gggtttcccc atgttggcca 12480
ggctggtctt gaactcctga cttcaagtga tcagcccacc tctcagagag ctgggattat 12540
acatgtgagc caacatgcct gccctgcctc attctttata ctacagtaaa gtcccggttg 12600
ggcaataatc taaacataaa agaaatgaaa ccataaaatt atataagaaa acaatggaga 12660
aaattttttg taatcaacag agtgaaaaag gattttttaa tgccatgtca cagaaaccta 12720
gagaaaaaag gtttaagttt gatttcataa aaatttaaat ttttgacata aataccataa 12780
aggtcaaaag ataaaaaatt ttaaatattt tcaatatata acaaaaacta aactttctta 12840
atatgtaaag aactacatat caaaaagaga gcggaaatac agatggcttt taaaaacagg 12900
taaagctgtt caccttcaca ataataacaa tttcaaatta tgactataat aataccattt 12960
ttcacctatc agacaaagat gaaaaagttc attaatataa ttgtgtaggt gaagctcagg 13020
cactttctta tattattggt gacagtatac attgatatag cttctttgaa aggttattca 13080
tagcagcatt atttataaca gctaaaacct agaaataacc tatgtgtccc attatagatg 13140
actggctaag tgatgaatac tattaaattg ttaaaaagaa ctcattatct atatggaagt 13200
acttttaata tatactaagt gaaaaatcaa agtgcaaaac agtatgctaa tatctgtttt 13260
gtgagggtgg gatggatact tggatggagg aagacagaca ggcagtctgg cttatatatg 13320
gatagaatgt ctcggaaaat atacaaggca ctggttacag ttatcaccta agggaaagga 13380
ttgagggaga ggagaatgtg acttaacttt ttcactatat acccttttgt acggtttaat 13440
ttttgccaag tccatgtaat ccatgtatac atagggagca tatgtatata aatatatgta 13500
aatataagta aaaaaatatg tatgtgctgc cgggcgcggt ggctcactcc tgtaatctca 13560
gcactttggg aggccgaggt gggcggatca tgaggtcagg agatcgagac catcctggct 13620
aacacggtga aaccccgtct ctactaaaaa cacaaaaaaa gtagccgggc gtggttgcgg 13680
gcgcctgtag tcccagctgc tcgggaggct gaggcaggag aatggtgtaa acctgggagg 13740
tggagcttgc agtaagccaa gatcgcgcca ctgcactcca gcctgggcaa cagagtgaaa 13800
ctctgtctca aaaaaaaaaa aaaaacaaca cgcttttctc tctctctctc tctctctctc 13860
tctctctctc tctatatata tatatatata tatacacata tatatatacg tatatatata 13920
catatatata cgtgtatata tacatatata cgtatatata tgtatatata cacatatata 13980
tacacatata tatgtatata tatacatata tatacacata tatatgtata tatacacata 14040
tatatgtata tgtatatata tacatatata tatatatgct aaagttaagt actggattcc 14100
tatctgtatc tgctacctaa ctgcagtata aatcttggaa gttgagtctg ttttctcatt 14160
tgtaaccacc tcttagataa cacacataaa agcacatagc acatgcctga cacacagtag 14220
ggttcagtga cagtgagctg ttttagtctc taaactctct tcctcaaaga gagcttctca 14280
aagaaaaaaa aatgtagtga agaaaagaac ttactccacc agggatcttc tctccccagc 14340
cagtggcagg catattaagg gctataagta agtggttatt ttaccatcct aaagtaatgg 14400
tgtttcaaag tatgcaagat tcttcatact tcactgtgtc cttttctgag catctttgta 14460
gagagtatat gcacaaacat ctgactaaca aagggaacac ttttcatcat ataatttagg 14520
attcacttag agacctaaag tataaagaaa gaaacttagg tatgttagcc cataaggaga 14580
aactcattat caatttggga ttatcttaag gtcctacctt ataaaattaa aatttaacag 14640
aagattattc tttttcaatt tcctaagttc ttatttgcta ctacatcgta gcagttcgag 14700
ggagaatttg gtctaacgat gtaatgtttt ctgtatgcca tacatagaac aaagctatgt 14760
acgaaatact aaaaatatta tttgacatta tttaataaaa tattataact atttcacccc 14820
gataatgatg gaaattaagt tgcagtaata tagattttta aaataaaaac ttcaaaacca 14880
ggcgccatgg ctcacgcctg tgataccagc gctttggaag gccgaggcag gcagattgct 14940
tgagaccagg agtttgagac cagtctaagc aacatagcaa ataaaaataa aaaattagcc 15000
aggcatggtg gtgtgcctgc agtcccacct acttgggagg ctgaggtggg gggatcactt 15060
gagcccctga agtcaaagct gcagtgagct gtgatcacac cactgcattc cagcctgagt 15120
gacaaggcaa gactttgtct caaaaatata agtaaaataa aattaaaatt ttacttgttt 15180
atttttttga gacggcgtct ctctttttcc caggctgggg tgtagtggtg tgttctcggc 15240
tcaccgtaac ctctgcctcc ggagttcaag cgattctcct gcctcagcct cccgagtagc 15300
tgggattaca ggtacgtgcc actatgccca gctagttttt gtacttttag tagagacagg 15360
gttttgccat gttggcaagg ctggtctcaa actcctaatg tcaagtgatc cgcctgcctg 15420
ggccccgcaa agtgttggga ttacaggcgt gagccaccgc acccagcctt aaaactttaa 15480
aattcagaat atgagccttt gttttatagc ttcacttgtt aaaacaaatc aggagctggg 15540
tgtggtagct cacgcctgta atcccagcac ttggggaggc tgaagcgggc agatcacctg 15600
gtctcaatct ccctgaactc gtgatccgcc cgcctcagcc tcccaaagtg ctggaattac 15660
aaacgtgagc caccacgccc ggcctgaagt ttgaagtttt taaaaagaaa gagttgttag 15720
gcataattgt gtaaatagag gtaaaaattg acagcaagaa aggcagtaga aaactatgac 15780
aaatgaaggt gatggctcac gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccaa ggcgggcgga 15840
tcacctgagg tcagtagttc aagacaagcc tggctaacat ggtgagaccc tgtctctact 15900
aaaaaataca aaaattagcc aggcatggtg atgtgcacct gttatcccag tcacttggga 15960
ggctgaggca ggagaattca cttgaacccg ggaggcggag gttacagtga gctgagatgg 16020
cgccacttca ctccagtctc tccagtcagt ccagacagag tgagactcaa tctcaaaaaa 16080
aaacaaaaaa caaaaaacaa caactatgac aaataagtgt aatttcccag gactattaag 16140
gtcttgtaat cccatgcact ggaagctttt gttgttgttt tctgatttat cattgaagtg 16200
accaaagcgc agtggtaaga acaagccttt gtgattactt cacactagag aagggtcttt 16260
cccacatatt tgagacttaa ggagttgata gtgaacagtg taagcggcca cacaggtgtg 16320
ggttaagaac tgatgtgtgt attcactttc tgtaaagatg accaaacata tgttgttaga 16380
caaacgaaaa attcacccca agatcattga gggcatgcaa aatagtatga ggtagaggca 16440
gctgtaattc aggtgtccaa atacaagagc aggtggagaa aagaaaagaa actgagaaca 16500
gtaaagagtt tttaaagtta taacacacaa ttgttaaaat agaatgttca gtaccaagta 16560
gcagagtaga taatgcagaa cactgaggtg gcttgagaaa aatctctcag aactcaggaa 16620
agaggtgtgc gaaatgagcg ttaggagaga gcacttcccc aagtctgtga tagaaattcc 16680
tgaaagggaa cagaggagac tgaagcgaaa ctctattaag cgacaaggaa gactcaaatg 16740
gagaagctaa cccagttccg atgaagactt ggcacatatc tataatgtat tttttttgaa 16800
gtcagccaaa agaaagttta aatttgaggt acatctgaaa gagtaagcaa tacagaaaaa 16860
tcttgacaac atctgaggac aaaaaaaaaa gtactgatac tgttgagtgt gaggcaaaac 16920
ctcactttca gtctttcttg agaaatattg gcaaaatatg cccttaatac aggagttcca 16980
tttttatttc atttatttat ttatttattt atttattgag acaggttctc actttgtcac 17040
ccaggctgga gtgcagtggt acagtcactg ctcactgcag ccttgacctc ctgggctcaa 17100
gtgatcctcc cagctttgcc tcccaagtag ctgggactgc aggcacgcat cactacgctt 17160
ggctttattt ttatttatta tgtgtttatt tttattttta ttttttgtag atacgtggtt 17220
tcaccatgtt gcccaggctg gtcttgaact cctggcctca aatgatcctc ctgccttggc 17280
ccagagtgtt tttgtttttt ttttttgttt gtttgttttt tgttttttgg agacaatctt 17340
gctctgtcac ccaggctgga atgcagtgag tggcgcgatc tcggctcact gcaaccaccg 17400
ccttctgggt tcaagcaatt ctcctgcctc agtgtcccga gtagctggga ctacaggtgc 17460
ccaccaccat ggccagctaa ttttttgtat tttttagtag agatggagtt tcaccatgtt 17520
agccaggatg gtctcgatct cctgacctcg tgatttgcct cggcctccca aagtgctggg 17580
attacaggca tgagccacca cgcccggccg agatatattt cacataccat aaaattcacc 17640
taaaaggtac agtttagtgg tttttagtat attcacagct gtggaactaa atcttaattt 17700
cagaatattt tcaacacccc aaggagagac tgggtacata cagttattct ccattctcac 17760
ccacatccca acccctgaca accactaatc tactttctgt ctccagattt ccctgtcctg 17820
gtctcatacc atgtgtagtc ttttgtatct gtttttttgt tttgttttgt tttgttttgt 17880
tttgttttgt tttgtttttg agaggagtct ggctctgtcg cctaggctgg agtgcagtgg 17940
tgcaatcttg gctcactgca agccccgcct cctgggttca cgccattctc ctgcctcagc 18000
ctccccagta gctgggacta caggcgcccg ccaccacacc cggctaattt tttgtatttt 18060
tagtagagat ggggtttcac tgtgttagcc aggatggtct cgatctcctg acctcgtgat 18120
ccacctgcct cggcctccca aagtgctagg gttacaggcg tgagccaccg cgcccggctg 18180
gtttctttaa cttagcataa tgttttaaag tttcatctgt gttgtatgta tcattacttt 18240
gtttcttctt ctaagttagt aagattccat tatatagata tataccattt tgtttatcca 18300
ttcaccagtt gatggacaaa tgattgtttt agctattatt aaaagtgcta ccatgaacat 18360
atgtgtccaa gtttttgtgt gaatgtatgt attcgtttct cttgggtatg tgccttggag 18420
tagaatagct agttcatatg ttaactcttt gttcagcatt tgtttttcta aagtggctac 18480
atcattttaa cctttagttt tttgtttttt ggtttttttt ttgggagtgg ggtggggctg 18540
gagtgcagtg gcgttatctc ggctcactgc aacctccgcc tcctgggttc aagcaattct 18600
cgttcctcag ccttccgagt agctgggact acagacacat gccatgacgc ccagctcact 18660
ctttttgccc agctcactct ttttatttta gtagagacag ggtttcacca tgttgcccag 18720
gctggtctca aactcctgag ctcaggcaat ctgcccacct cagcagggtt tcaccgtgtt 18780
gaccaggctg gtctcaaact cttgacctca ggcgatccac ccacctcagc cttccaaagt 18840
gctaggatta caggcatgag ccactgtgcc ccgcctctct cttttttttt tttttttaat 18900
aaagacagag tcttgctctg ttgtccaggc tggcatgcag tggcgtgatc acggcttact 18960
gcagctttga cctcctgagc tcaagtgatc ctcccacttc tgcctcccaa gtagctggga 19020
ccacagatgt gtaccaccat gccttgctaa ttttaaaatt ttttaataga gatgggggtc 19080
tgtctgtgtt gcccagactg gtctcaagtg attctcccac ctcagcctcc caaagtattg 19140
ggattgcagg catgactcac agcgcctggc ctcagtttct ttcaagacca tcctataaca 19200
ccaagttagt ttgaggattc tatgaatgtc tgcttaaaga tatccttctg aattctgtga 19260
ttctcttgaa aggcttgttg caatgaaaaa caaagtataa tgatgacttt atgtgaagta 19320
tacttttgga atttcttaag cagaagtcct gagacttttg agagtccctg tatttaaaca 19380
gtaccattta ggcacagtta ctgcttatga aatgaagagt agctagatga atataaaaaa 19440
tcttactctt acatttcaac ccagcattat ttgaacccag caaaattatt tctatagtag 19500
aatcaattta gttccttatt ttaagccatg catatatatc tcaaagcaaa tttcaagagg 19560
gattaaatgt tattatgtga aaatattagg aggtgaaata ataggagaaa gtaaacacat 19620
tgaaagtagg tatgttcagg ccaggcgcgg tggcttatgc ctgtaatccc agcactttgg 19680
gaggctgagg cgggcagatc acgaggtcag gagatcgaga ccatcctggc taacacggtg 19740
aaaccccgtc tctactaaaa atacaaaaaa aaattagccg ggcgtggtgg cgggcatttg 19800
tggtcccagc tactcgggag gctgaggcag gagaatcgat ttaaccctgg aggctgaggt 19860
tgcagtgagc cgagattgca ccactgcacc ctagcctggc aacagagcaa gactctgtct 19920
caaaaaaaaa aaaggaaagt aggtatgttt acaatttaaa atctttgggc atggagataa 19980
gctataaggc cattgatcag aatggaccat ttcataatgt tccaaaaatt agactacttt 20040
ggaaaaaggt ggtgtgtggt cttaatgtag gcaatgcaca tgtgtgttta agtttcaaat 20100
acagctaagg agctaagtgg aatttttttt tttttttttt accaaatagc gtgtattaat 20160
aatagctcag ttccatttac tgatttgttt ttcctttgtt tatgtcatat attatctttc 20220
caagagattg tgagtttatg ctactgccaa tttggtatga gggcctgttt ttaaaagagc 20280
tgcatgatat tcacttggat gtaccacgat ttattcaacc agtcttttct ttgtcattag 20340
acatttagtt tatttaaagc ctttcaacat tataagtaac tgtgaaagat atctttgtgc 20400
tatgagttgc ctacattttg gatcattgcc actaagaaag aaattaacta gtgactcaat 20460
tattccttgc tttttttgag caaaaatcat attaaaaata attagattta aaatttttgg 20520
ttaaattata ctttaaagca aagatccttg ccatttagat ctagtttggt attaaatgag 20580
aacggtggtt ctctactgtg ttggtggggg atatgttcat gatggatttt gctgtggaag 20640
gacatttggc aatgcctgga gagagttttg gttgttacag atgcagggag gggtgccact 20700
gacatctaat gggtagaggc cagggatgct gctgctaaac atcctgcaat acacaagaca 20760
gtccccactt gccccccccc ccccaaaaaa aattagctag cctaaaatgt cagtagtgct 20820
gaggctgaga aaccttggat taacaggttt cactgctgat gggaaacttt ttttttttta 20880
acagggcctt actctgttgc ccaggctaga gtgcagtagc aggatgctag ctcactgcag 20940
tcttgaactc ctgagttcaa gcaatcctcc tgtctctgcc tcccaagaag ctggaactac 21000
acatgcacac caccatcccc agctaattaa aaaaattttt tggcagagct ggtgtcttac 21060
tgtgttgccc aggctggtct caaactccta ccctcaagtg atccttccag ctgggcctcc 21120
caaagcacca ggattgcagg tgtgagccac tgtgcccaga ggaaacattc ggaatctgtg 21180
atagaagggg aaggttttag ctccagaaca caagtagagc tggctttgcc ttatgtgata 21240
gacctagtga atagctcagc tgtctgcttt cctaatgcca tttagacaga tactgtatat 21300
tttattgctt atgcaatgtg cttataaaat tgtttatttt tgtgtcttgg gtattcctga 21360
aaatgcctca tcagtgtcag atctagttgc tgttgagatt tggttttgct gcgtatatta 21420
cagacctgat ttagctacat gggaaagaaa attaatcaat agctgattta acaaccagga 21480
gtttatgttt ctcatgtgat atgaattctg gagagagact taagggctgt tactgtggct 21540
tcttgatgtc acccatgact caatgctggt atttctgctt acctttctta ggaatgtgca 21600
ttttaccttg ctgtcacagg atggctcctg cctgttccca cccctcaccc ccggcagcaa 21660
aacctatgtt ccaggcaggc agcagtgagg acaaaggtac ctggagccag tcctctttgt 21720
cagcgttttc ctgcagcccc aacccagtgg tttctgctta ttcccattgg ccagactgtc 21780
acaggacctt agaggctggg acaaatagtt ttcagctggg ctcattgtgg tctgaaaaca 21840
aaagcagtta cctttagtaa gaaagaaagg atattggggc tgggtgcagt ggctcacgcc 21900
tgtaattcca gcactttggg aggctgaggc gggcggatca cttaaggtca ggaattcaag 21960
accagcctgg ccaacatagt gaaactccgt ccctactaga aatacaaaaa ttagccaggc 22020
atggtggcgc atgcctgtaa tcccagctac tcaagaggct gagacaggag aatctcttga 22080
acccgggagg tggaggttgc agtgagctga gattgcacca ctgcactcca gcctgggcaa 22140
cagagtaaga ctctgcctca aaaaacaaaa aaaaaaaaag aaagagaaag aggatattgg 22200
aataaacgct aatatgcacc tttgggagct gctttttgaa atattggttc ttgtaagttc 22260
actgaaattt tttttataaa gtagaacaat attggagatt tgaaagaatg gactcaatgc 22320
aagagatctt attagctgag aaaatgtatt tatgttatga atgtatttct taaccccaag 22380
aacttggctg ttgtattgtg ttttgtaaat tttaaatctc cctactacta tactgggggc 22440
cttaccctct tttgtatagt gcacacaaag aagtgtgttt ctctgggcta aaaatagaaa 22500
tctgcacctg acagatggcc ttaagtgtgg aaaatgggtg tgtgtgtatc acagaagtgg 22560
aagaagtgga gggagtcctg ctctgcctgt tgttttaagc ctcccctccc tgcaaatcta 22620
tatctttcct atacactagt aatggtcaat aggtttttgt tgttgttgtt gttttaatcc 22680
catttacagt agcgacaaaa cttatcaggt atctaagaat aaacctttat tatacattta 22740
tgctaacctt tagcatacct ttatgaagaa aactacaaaa ttaattaaaa tatcatgaac 22800
ggcaatgcaa atggggagaa taaatagggg acaacttgcc ttccagatgc attgattaca 22860
aagctgtagt aactaaaatt tgatactgtc tcaagggcaa gcaaatgctt ctgtgaagta 22920
gaatgaggat ctagaaacag actcctgcgt gtgctgaaac ttggtttatg atagagcagg 22980
tgttactgat aaatgcagaa accaataaat ggtattaagt caattaactt tccatttgga 23040
agggataaaa ttaaatttct cttccacgtg caggctaata acagtgtctt atatcttgca 23100
aaagtactta ccagtccatt cacttccaga aaaatggaga agtttcatat tagaaatttg 23160
tgcatcatgt ttcataaata aaaacttcag atactcggct gatggtgttg gctcaaacct 23220
gtaatcctag cactttggga ggctgaggca ggtagatgac ttgagcccag gtgttcgaga 23280
acagcctggg caaaaagtga gaccctatgt ctataaaaac aaataaacaa aatggcacct 23340
aacttttaaa atgctttttc ttacatgtaa taatgtgagc aaaagcataa tttaattttt 23400
cctattaaaa tgcttttttt ttggtttctg ttacatttct gtatttactt gaattcttag 23460
aacactgttt cctgggagat caaacctggc cattctggat acatcagtag tgagagctta 23520
gtgcggacat agccttacag aatgtcttct atgttgaaat gcagagaacc cgaaggcgcc 23580
taggatgagc ctcaggcctg ctggttgttg cagtggcgca atctcagctc actgcagcct 23640
ccgcctcctg ggtttaagcg attctcatgc ctcagcctcc tgagtagctg ggattacagg 23700
cgctcgtcac caggcttggc taatttttgt tttgttttgc tttttccgcc tcactctgtc 23760
acccaggcta gagtacagtg gtacgacctc ggctcactgc aacctcagcc acccggtttc 23820
aagcgattct cctgcctcag cctcccgagt agctgggatt acaggtgcct gccatcgcgc 23880
ctggctaatt tttgtagttt cagtagagac gaggtttcac catcctggcc aggctggtct 23940
tgaactcctg acctcgtgat ccacccacct cggcctccca aagtgctggg attacaggca 24000
tgagccaccg cgcacagcct aatttttgta tttttttggg gttttttttt atagagtctc 24060
actctgtcgc ccagactgga gtgcaatggc acgatcttgg ctcactgtaa cctccacctc 24120
ccgggttcaa gcaattcttc tgcctcagcc tcccgagtag ctgggattac aggcacccat 24180
caccacgcct agctgatttt ttgtatattt agtagagacg gggtttcgct ttgttggcca 24240
ggttggtctc aaactcctga cctcaggtga ttccccgcct cggcctccca aagcgctggt 24300
attacaggtg tgagccacca cacctggcca aatttttgta tttttaatag agctgggttt 24360
tcacaatgtt ggccaggctc gtctcaaact cctgacctca gggaatccgc ctgcctcggc 24420
ctcccaaagt gttgggatta caggcgttag ccactgcgcc aggcttgttg ctgaacattt 24480
atggctctag aaataatttt ttttttaagg agaagtaatg acaaacatga tagaaataaa 24540
atttgaggat atttctgggt tcaaaataaa gtaacagtta aatagcgtga acatgaagaa 24600
ataaatattt tcaggtagaa actccaaaat ttaggtagat gctgtgagtt ttagtcagaa 24660
tttgaatatg atgtggctga ccatagatac ctccattgca ttaattctgc ttcataaagt 24720
gtttgatgct tgcttgtagg tgttgaatag agcctaatta gcagtaagta aacagatcta 24780
gagcacagac tttggcatct gaaggacctt ggttcaatgc tgggactgcc acttactagc 24840
tatgggatct ttggtggatt tttaaccttt gaaagccttt catccctcac agatataatg 24900
gggaagaaaa tcgtttccat tagtattgtg aggattaaat gattaattga tgtaaacaat 24960
gtgctttcca tagtacttgg catatcataa gtgcttcatg ttattttacg ctggctggga 25020
agataagttt tgctgtggag aatttaagag ggatattaaa atatattttt gttattttaa 25080
ggaaattcga aatgagtccc atgactatcc tcatagagtg gccaagtttc cagaaaacag 25140
aaatcgaaac agatacagag atgtaagccc atgtaagtac ttgtgggttt gtgtgcatgt 25200
gtattttttg gtttgtttta ggaggcagga tgtagtgaaa aggagggctt ggggtcagtg 25260
ttgataaata cagtaatttt tttcctattt acgtaagaca cgttctttaa gaatttaaag 25320
gtgtagaata gtggaaggaa aaataattac ccataattat ttcatccttc aaacataggc 25380
accattattt tggtgtattt cccacaacct gtttttctta tgcacagttt tcctttcttt 25440
aaaataattg taattataga tgtctatata atatccatat gtatttcctt ttcatatcat 25500
tccatcccct ttgtaagttt tgcttaaaat agttattggt gtagtttggt ttttttcctt 25560
ccccaagtta taagagtagt atgtactcgc tgtagaaaac ttagaaaaca gagaagagta 25620
taaggaacaa acttatttaa aaataaataa taacttgggt ttatattctt tggagttttt 25680
aaaaataaac atgtacttta aacggaaaat tagaatcttg ccacatactc atttgtagct 25740
cttttcttag cagtacattg taaacttttt tttattataa acaattttta attgctttga 25800
cagtggcttt ggatatacca ctcttttgca taagttccct gttgttggac atttagatta 25860
tgatgtatac acacacagac gcacacaatt gtgtgaacaa ttataatact agagttcttt 25920
ggtgtattca tcatcatgcg gtgattttat tttttgttct gattcatgca gcttattcag 25980
atattaaatt gggcctcctt cgtgcttcag catatttccc tatgtttgac tttagtgggc 26040
taaacatagg ttttctcttt agggctccct gttggtaggg acttgaaaaa cagtatcaga 26100
ttgatcacat tctggttttt gcttgttact gattgttcgc ctgttgacta gggtatggtg 26160
ctgcctgcta agatctcctg tgtaggttga accatttcac tgttcaagga cacagactgt 26220
atacctttat atacattgta gtcattggtt atagataaga tatttagggt ctggatgtac 26280
cactgaaaaa tccatcagtt actggaaaaa aatccttatt tttattctta catgaataga 26340
atgtttttct tatgttgacc aaatacattt ccaagaaggg tgtattggct gattttgggc 26400
aaatcaaatg agaagcagtc tctgaaaatc tttcatgttt gttataaatt actattaaat 26460
actatgtttc tcttaatgct tttttcttta ctaccagtta gaagtgttct taaagacaag 26520
tagctagaag agtggttttc cattttcttc agttgcagca cacttgaaga tttgacccac 26580
ttcctctgaa acaggtggct catcacggtg gcagttccag tgtgggtgtg cgttcaggga 26640
atagcgggtg tgggcagtaa ttctgatact taggtgccct tcccctgcct ccaaatctct 26700
gattgagaat cactgagcta cagagaataa ttctctaatg ttaccatgag ttttgaagac 26760
agtattttcc agttgtacac cttgctttga tgcctttaat tttttaaaaa cttttgattt 26820
tgaaaattgt agatttggat gcagttgaga aataatacag aaagatcgag tatacccctc 26880
acctagtttc ccccagtggt aacatcttgc ataactacag tccaatatca cacctgggaa 26940
cctgaaacaa tacagtccat ccaggtttca ccagttttac atgcactcat ttgtgtgtgc 27000
gtgtaagttc tgtgcagttt tatcacgtgt agattcctgg aatcaccacc acagtctaga 27060
tgcaaaccag tggagcattc ccatcacagg gtcacttgca ctgcctttct ggggccacag 27120
tctccttgct tggatcctcc ttccctaacc tggtgttgcc tttaattttt atatatttgt 27180
tgtaattgca attattggat gcactacact acatttgagt cccctaatta gttttatcga 27240
attgatctaa atgggatttt tttttttttt tttttgagat ggtgtctcac tctgttaccc 27300
aggctggagt gcagtggcgt gatcttggct tactgcaaac ccctgcctcc tggattcaag 27360
cgattctcct gcctcagcct cccaagtagc tgggattaca ggtgtgcacc accatgcccg 27420
gcttattttt gtatttttag tagagatgga gttgcaccat gttggccagg ctggtcttga 27480
actccttacc tcaagtgatc cgcctgcttc agtctcccaa agtgctggga ttacagtcat 27540
gagccaccat gcccagctga taattttatt ttaactggaa ttgagatgtt ttattttaaa 27600
gtaaaaacat ttgcaactta agttatcctc aagtatatac atcaataaaa cttatgattt 27660
ttctcctcag cttttagact tatgttgtat acctgcagtt gaaggctgca gggagactct 27720
ttaaaatatg cgttatcagg cctccctcca tcatcattgg gaccaggctc ttcctgtatg 27780
ccttctcatt gaaaagcact tagccttgag agaaccaagc ttccctcctg cggaccatgc 27840
agtggttgtc ctctggagct gtgctctgct gggagcagcc cccagtgcat gttctcctta 27900
ctcttcttct tctttgcccc ctccctcccc acacatgcct ccctagtaag ccatgttctc 27960
ctgatctctc agaaagagac tgctcattct tgcttctcac gtagccacag gattttctag 28020
tctgagccaa tatgcttcag cctgcaaatg gaaatgatct cttccaaggc ttgtgctggc 28080
cagcacatcc ccacaccgcc ttggcacctc tcctctcctg acttcagtca ttcactgtct 28140
ttctccttac cctctccttc ccaccttcct catcctgggt gacttcatgt ctctgggaaa 28200
gaactacggc tcattgcgct agagttccta gacctgttca gctccgctga cattgacctt 28260
tagtcatctt cacctctgaa atctgaaact ctgctgcctt gagggctact ttctgtcatt 28320
ccagctttca cttgcttact cccactgtac ctgctctttg acttcagcag gatctttagt 28380
tgactttttc atgtattgtg aagttggaaa tgtattgaat tgaaatttcg attaaaaaat 28440
gtagtgaagc atattacttt gtcctctaac ctaactatta ataactttct tgttgttttt 28500
atatttaaaa aataactctg gattttttaa ttccaccatt ttgtgaagct ccaacttagg 28560
aaaaatcagt cattcatcct ctctgcactt tgggcaaatg agcgtgtgcc ttgggtggac 28620
tccagtgtta ggtgggcttg gggttgcctt gctgtcctca tgccctcgtc tgccccactg 28680
ccaccgtgtt ccagctctgc accgagtaaa ttatctctca gagctcctca ccatgctcag 28740
gatatcgtcc tgctttcaat tctacagata aaaattgtaa aaatcaggaa acaccacctt 28800
agcttcatgt tctatcacct ggaaactcac tttcttttgc ccctatcctt ccctaaagtc 28860
ccaggagaga agcctcccct ccctctgtcc tagccgaatc cttcgtcccc atcctcctca 28920
tgggccctgc tcttcatcat cactgctttt tgtgtgtttt cagcctcttt ctatctcata 28980
acttcttctc ttttgtataa atatggttcg ctctcttttg tctcaaccct tatatcctac 29040
cccagccccc acttcctttc ttacctacat ggatggacat ttcttacctg tacacaggct 29100
taaaagaatc aatgtgccat ttgtctctcc accctcccca ccatgcacac ttcagcccat 29160
gcttcttctc cagcctcccc actgaaactt attctaaaag cactgtagct gtagttgtca 29220
aatgcaatga gagactttcc actggtttcc ttctctgtga cttttgacat tattctcctg 29280
cttcagcctc ccgagtagct gggattacag gcacgagcca tgacgcctgg ctaatttttg 29340
taattttagt agaaacaggg tttcaccatg ttggctgggc tggtctcgaa ctcctgatct 29400
caagtgattg gcccacctcg gcctctcaaa gtactaggat tacaagtgtg agccactgtg 29460
cccagccgac cgtgcctttt ttcctaaccc cgtaattttt ctgattttcc tctttggccc 29520
ctcccctatt ttcagggtgt ctcctcctca ctttgccttt atttcttcag gagtctgttt 29580
ctctctcctt ctcactgtaa cacttggatg aatgatctca tctgctgtgg gcctagtttc 29640
catctctgct tataacccca aatctcatct gcagtcgtgg acttttctgt ctacaggtct 29700
gtgtatccaa gtcatcatct ctgtctgggt gtcctgtagc cacctcagac tcagtataca 29760
ctgagtgagt gttcctccct gacacacttc actggcctta gccccacacc tgccttttct 29820
ccttttcccc atgtttataa gtggtgccgt tatttacaca ttttctgaag ccagaaacag 29880
attcttccct cattcatttc ccacgtcact aatactaatt tccatttcca tgatgtattc 29940
ctatttcttt ttcttttttc tttttttttt tttttcaaga cagggtctgg ctctgtcact 30000
caggctggag tgcagtggca ccgtctcggc tcactgcaac ctccgcctcc caggctcagg 30060
tgatcctccc acctcagcct cctgagtagc tgggactaca ggtgcatgcc accatgctga 30120
gctagttttt tagatttttt gtagagatgg ggtttcgtca tgttgcccag gctggtctca 30180
aactcctgga ctcatgtagt ccacctgcct cgacctcctg atgtgttggg attacaggtg 30240
tgaggcaccg tgctcagcct ccgtaatgta tttcaaatct gttttcttct ctgttcacat 30300
tggcttggtt caggccctac tacgcttttc ctcgtcatta cagtagcctc caaacccatc 30360
tccttgtttc ccttctgttc ccacttcagt ccattttcat ggtatctgga gtaatctttg 30420
tataatgcaa gtgtgttttc cactctcctc tctaatagtg ctgcacaatt tttatgaaaa 30480
agttaaactt ctttagcatt atcatactgg gctttttgga gattgacccc tttacacacc 30540
tctctaaatc ttttctaccc attttcctag aaattattca tttcagtaaa actgaatcac 30600
ttggagttct tctagcgtga ctggttttta atacctcagt ggcttcaaat atgtcattcc 30660
ctttttgaaa tattcttccc ctcctctctc tgacccatct caatcaaagt tctccttctg 30720
caaataccag ctcaacaacc tctttcccgt gagtggtatt ctcatccagt ggaggtggtg 30780
gttctcgttc actaagtcca gaggggctca ggaatgtgta ttttttaaaa gctgggatgg 30840
tgttgctgta ccttttccaa ctgatagtca ttatgtaatt taaaaatgtg tttctggctg 30900
ggtgctgtgg ctcatgctta taatcccaac actttggaaa gctgaggtag gaggattgct 30960
taaggccagg agtttgagac cagcctgggc aacatctcta cacagaactt ttttttaatt 31020
agctgggacg tggtgatgca tgcctgtagt cccagctatt tgggaggctg gggcaggagg 31080
atcacttgag accactaatt caaagctgca gtgagttgca atggcaccag tgcactccag 31140
cttgggtgac agagcaagac tgtctctaaa aaatttttta aatgcatttc tatacatagt 31200
acttgacagt tgctgatttg gttcagaaaa catttgttga aaaccagcta catgtttgat 31260
actatgctat gtatcgaata atttatggta tacttgagga gattaacaca taagcatgtt 31320
acagatattg taagatatga cagtgcattg atggagctga gaagaggctc tgcccaagga 31380
ggcagggatg gcttttaaga aaaagaatgg tagcctgaac taggtaaata aaggggaatg 31440
gaaaaagaat tttttaaaaa ttcagagtcc cagatctttc ttttctagat ttggattcag 31500
ccggtctgga aatgtttatt tttaaacaat cttaacatga ttcttttaca ctcactatgg 31560
caccactcct cagactgaca tatggaaact acatttggag ttctgaatac gagaaacata 31620
aaggaaaaag gatattttaa attaggaaga atttgggctg ggtgcagcag ctcatgattg 31680
tagtcccaac gctttgggag gccgaggagg gaggatcgct tgagcccagg aatttgagac 31740
tacagtgagc tgtgattgtg ccactgcact ccagcctgag caatgtgaga ccttgtctca 31800
aaaaaggaag aaaattgaaa ggatttgaag aggtccataa tctgctacaa cctagagatg 31860
cctcagttgt ctcagttaac tgtgagacat tgtagaagag atggacaaga acttcgttgt 31920
ttgaaaagag agtagcttgt aatggttact ttgggaaacg tctttatact attagagact 31980
accaccaaat tttgagatct tcctatttgc agtacaggta gaaatcccag tttactattt 32040
ggtctaaaag ggagtgccag caattgagtc aactgtcatg tcttttcact ggccatgaaa 32100
caatctgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gtgttaaaaa cccataccat 32160
aaatttcttg taggtgtata ttaacagtat tgttaactgt atgcacattg ttgtacaata 32220
gatttctgga acttttccat cttgtataac tgaaactcta aatccattga aaaactccct 32280
atcttcctct tcccccagcc cctggcagcc agcattctgc tttctgtttc tatgagtttg 32340
attactttag acactaaata tatgtgtaat catgcagtat ttgtctttct gcgactggtt 32400
tatttcattt gacatactgt cttcaaggtt catccatgtg aaacagtcag attttaaagg 32460
aaattaacac agagactcat gattctggta gtgtcaggtt acatagtcca tggtttgttg 32520
ctctacaaaa caaaaagatt ctcaaataaa catacttttt aaatgagtta ctagaggggg 32580
aagaaggaag ggaaaacttc tatgctttcg gcacgctccc tgcatgatct tagcaaatgg 32640
cataactact ttgaatgcag atgtcagtat cagctctgag atttgtatgc agctaataaa 32700
gtagccccaa gatgtattaa gcaaaaatga atagaatttt ggggagaaat tgacaaatcc 32760
atgttcatgg gcttcttaat aagacaagat atttgtaaag aaatagattt atataatatt 32820
attctttttt cttttttttt tttttttttt gagacggagt ctcgctctgt cgcccaggcc 32880
ggactgcgga ctgcagtggc gcaatctcgg ctcactgcaa gctccgcctc ccgggttcac 32940
gccattctcc tgcctcagcc tcccgagtag ctgggactac aggcgcccgc caccgcgccc 33000
ggctaatttt ttgtattttt agtagagacg gggtttcacc ttgttagcca ggatggtctc 33060
gatctcctga cctcatgatc cacccgcctc ggcctcccaa agtgctggga ttacaggcgt 33120
gagccaccgc gcccggccta tataatatta ttaaccttaa tataagaaga aaaatacata 33180
gaaccctata tccagcaatt agaaaatgca catttttcta ggactgacat ggtctatttg 33240
taaaaaatgg accattgact aggctgtcaa gtaaatctta aaatttaaga atgcctggct 33300
gggcgctgtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga ggcctaggtg ggtggatcac 33360
ctgaggtcgg gagtttgaga ccagcctgac caacatggag aaacctcgtc tctactaaaa 33420
atacaaagat tagccaggca tagtggtgca tgcctgtaat ctcagctact caggaggctg 33480
aggcaggaga attgcttgaa tccgggaggc agaggttgcg gtgagccaag attgtgccac 33540
tgcactccag cctgggcaac gagagcgaaa ctctgtctca aaaaaaaaaa attcctatct 33600
tatagctcat aattttttat cttaatgcaa ttaaaatata ggttattaat aaaaagataa 33660
acatttccat aaatttggaa gttttaacat ttctaaatcg tgggtcaaga caaaattata 33720
atggaaactt aaaaataaac aatatataaa atactgctta tcaaaacttg tgtaaaggag 33780
ctaaaacagt actgcaatga aaatatattg tcttaaatat ttatattata ttttatttat 33840
tattttttag atggagtctt gctctgttgc ctaggctgga gtgcaggggt gtgatctcag 33900
ctcactgcag cctctgcctc tcgagttcaa gcaattctcc tgcctcagcc cctcgagtag 33960
ctgggagtac aggcacgtgc caccaggcct ggctaatttt gtgtttttta gtagagacag 34020
tttcactgtg ttggccaggc tggtctcaaa ctcctgacct taagtgatct gcctgcctcg 34080
gccttccaaa gtgctaggat tacaggcatg agccactgtg cctagcccag tattttaaga 34140
tgaaagttaa aattaatgtg ctgtctaacc taatttagag taaaaataag agaatgagaa 34200
aaaaaaagca gaaagaagta acaacaacaa aggagcagaa atagaaatca cagttacagc 34260
acaagggacc aactaaacta aatgttagcc tcggtaagac tgatcaactc tgtcaagatc 34320
gagcacgatc aatcaaacaa gaaagaaaga aggtgcatat aaacaatatc aggagaaaga 34380
gtgggcacat aaatacaggt atacaaagaa agcgtgaatt gaatactgcc aacaatttta 34440
tggcagtaaa tatgattttt tagaaaaaat ggaacagatt cctagaaaaa cataatttac 34500
caaaactgac tcaagcagaa gtagagtctg aagagtccac ttaaagacat taataaacaa 34560
aatccacaaa gaaaacactg ggccagctgg ttttaccggt atgtttcata ataatgcaag 34620
tgaatataga tgtagaaatc ctaacaaagg attagcaaac tgaatatagc aatgtattaa 34680
aaagataata cattatgttc acattaagtt tatttcagga atgtaagggt agctaacatt 34740
agaatacctt ttttattttt tatttattta ttttttgaga cagggtttcg ctcttgttgc 34800
ttaggctgga gtgcggtggc acgatcttgg ctcactgcaa cctccacctc ccgggttcaa 34860
gcaattctcc tgcctcagcc tcccaagtag tttgtattac aggcgttagc cgccatgtct 34920
ggctaatttt tgtattttca gtagagatgg ggtttcacca tgtttgtcag gctggtctcg 34980
agctcctgac ctcaggtgat ccatctgcct cggcctccca aagtgctggg attacaggcg 35040
tgagcttctg cacccggcct agattatttt ataattcacc acagtaacaa aggagaaaga 35100
gccatatgat tatctcaata agtgtggaaa gattatttaa agtccttgct gaggattaaa 35160
aatgacacat agcaagctag aaatagaagg gaacttctaa gatttctaag agataactgc 35220
aacaacatca ctcataatga tgacatgatg aaagcattgt tttaaaaaaa tattgggaac 35280
aaggtaagtg tgttcattct taccacttat acttaacatt atacttctgt ctccctgacc 35340
ttatactcta ggtcctagtt agtacagtaa gcaagaatga gaaataaaag ccataaggat 35400
tggaaagaaa taaattaact gtcttttaat ctgtttatga ggccactata gaactttcat 35460
agccaaagca ggaaggttca gtaagaggaa taaaagtata aaagttttat ctgttgctat 35520
ataacaaacc accccaaaac agtggcttaa aacaatagga gacatttatt atgttcacaa 35580
atctaggggt tgactaaccc cacataggtg attcttgctc aaggtctttt gtgtaattgc 35640
atttcaaatg ggggctgggg ctggagtcac cttgaagaag caacttcttt actcttgttg 35700
actgtgacct caactgggct gtcaccagga acacctacac aaggcatctc tatgagacct 35760
ggactttatc acaaggcaac tgagtttcaa gagtgagcat tcttagagag caaggcagaa 35820
gcttcattgc cttttgtgac ctagccttag aagtcacata caacttccac aacattccgt 35880
ttgagaagta actcactaag gccatgcatg ttcaaggaga gggtacttaa tactcttatt 35940
agtttgatgg aggaagtatc agtgaattgt ggacatattt taaaaccatc accactatag 36000
atgatacgaa ttgcttcgta gataacccct ctagaaatgt gcagacaagt caaagaatta 36060
ttaagaaaca ttttgatagt cttagaatta taagatgata gaccttcaaa tcattaaaaa 36120
gaaaccttta aacttaccag aaagtgcttg tcatctttct tagtaatagc agatttagat 36180
aaaaacttag ttctataata ataatccgaa taagtataga tttaagttaa attttatggt 36240
aactattatg taaatatttg ctaacatttt ttcttatccc attaaagttt gaaaataaag 36300
accagatgtc agtgtagtgc tttaccttct caaaatccgt tgttgacagc ttttttacta 36360
aaagattttc tcactcactg ttagggtctt tagttctatc ttcaattttt tttttttttt 36420
tttaaatatt cagttttggc ctagtgcagt ggcttatgcc tgtaatccca gcactttagg 36480
aggcagaggt gggtggatca cctgaggtca acatggtgaa accccgtctc tactaaaaat 36540
acaaaattag ttgggcgtgg tggctggcat ctgtaatccc agctacttgg gaggctgagg 36600
caggagaatt gtttgaacct gggaggtgga ggtgacagtg agccgagatt gcgccattgc 36660
attccagcct gggcaacaag agcgaaaaaa aactccctct caaaaaaaaa aaaaaaaatc 36720
tttaatttta atcaaagcca aatcaaagct atttatgatg ttaataattt attcctgcgg 36780
gctattgatg cactggagtg gttccaagga agaagaacta gaactcttag agaagaagct 36840
agcattgatt agacagggaa agagaaaacc taaacagagc agcatgatag ctgactttag 36900
atacctgaac ttttacatgg aaaaaagagt tctttatcct gtgttaagcc caaaatatag 36960
aactagggtt catgagcgaa taatagcact ggtgaatatc aggttagcat tagctcttaa 37020
gagctgtttt aaacctacaa acgaaccctc tgaactagta cacttgttat tggaggtatt 37080
cacgcagagg gtggatcttc tcactgtcag atcttctaga gaatatttgt gaatgaatta 37140
tagagggttg cattagatta ctttggtcta tttcttgtat gcttcatttc ttgcccctgt 37200
tcatctcttt ctcaccaatt tcccgcattc acctttctgt cctattacat tgtgaattcc 37260
ttaacagatg aaactttttt tttttttgga ctgacaaaaa tcttgtacat agttttgtca 37320
tagggtagta aagagagtat taaagatatc attaagtttc tctttctctg tccctgaata 37380
attaaatcta taaagcactt ggggttgggc ccacatgtgg aaggcatgtg agtaaaggtg 37440
gtaatgtcct tgaaaaagaa gcctgtaata ttgggttagc attgctgtat ccaggtatga 37500
atgcatggtt ttcagtgagt atagatacac agataaatat gaacataggt atgtgtatat 37560
acctatattt cttatccctg tccactggga aatcttgaga gcagcgatag ctgatgagcc 37620
attgggcatg cttagctttt gataccaaat tttattctcc actaggagga gaatagagct 37680
ttggagaaat ggctggttcc acgtctgcga cagggaaagt gtaagaatag cctggaatgt 37740
cttgtagtga cagaacataa agacatgccc aaaaaatgat gaagacatat cagaaggatg 37800
tagaagccaa gctgagtcca ctggccaaac ctgggataat ctgagcatga aaataaataa 37860
tggttacaac ctattgaata aaataggaat taatgtgtct atactgatgt aaagaaacaa 37920
atgaatacat aaatgaggga tagggaaagt tctacctttg tataggttgc caactaataa 37980
atattgaaat ggatactaaa gttggtgggt gaaaatttgg tgaagaacaa ggtatttaca 38040
taatcttgaa gtatcccttt acaaaatact tattaaatat aagaagagga atagtacctc 38100
tacactggag aagtctggcc aacaccagcc ttaaatatgt ggtcatgacc agtcatgaga 38160
tataccatgt cagaatcctg aaccacccga taagatgcag tgaatactta gcatctttct 38220
gagatgaaca tgccaaaaat atacaaactg aactcatcta tagggaaata gatatctgac 38280
aactcaaatg gaggaacact ataaaacaac tgacttacag tttcaaaagg ttaaaaaata 38340
ccgtgaaaga acagattgta tccttttgtt taaaggacat tattgggaca gttggtagaa 38400
cttgaatggt gtctgggtta gtaaagtatc actgttaatt ttataatttc gatggctata 38460
ctatgagtaa gtaggattat gtcattgtag aagataaaaa aatggaataa tcaggtatgt 38520
ttgcaacttg ctgtcatgac ttgggaagaa aattctttgt gcttggaatt tttctgtaag 38580
ttttaaaatt atttaaacat acaaattaaa aatacatata aacttgaggt actgaatcct 38640
agccagtaca tgaagtcaag aaaaggaaat aaaaggcata caggttggaa gggaagaaat 38700
aaaaatgacc ttattagcag atgacatgta gaagattgca aagaatctac ccaacaatgt 38760
cctagaacta ataagtgagt taaacgaggt tgtgggatac aaggtcagca tacagaagcc 38820
aattgtattc ctgtatatta acaacaaaca cgtggaaacc aagattaaaa acacattgtt 38880
gtttacagtt gctctaagaa aatggaatat gttggaataa atctaacaaa atacatatag 38940
gatctgtatg ttgaaagcac caaacacatg gataaaagaa atcaaaagat gacctaaata 39000
aatgaaaaag gcctaccatg ttcatggatt ggaagactta gcatagtgaa tcagtcctcc 39060
ccaaattgtt ctatagatct atagtgactc atagtgtcaa attgttccta aagatctaac 39120
acaatttctg tcagaatttc aggaagtttt tttgtagata aaaacaagct tattctttta 39180
tgtggaaagg caaaggaact aaaataaaat ggctaaaatg atcttggaaa ataaaaacta 39240
gaagaatcac tctacctagt tttaaaactt aatgcataac cacagtaatc aaaacagtgt 39300
ggtagtggca gagggataaa tacataagtc agtggaacat aatctagaaa tagacttgta 39360
aaaatatggt gaactgattt tttgacaaag gtgcaaagca atttaaaatg aaatctcaca 39420
ccttacacaa aagttaactg aagatagatc atagatggat cataatgtaa aagctttcat 39480
aagaaaatgg gagaaaattc aggatgtaag gctagatgaa gagttcttag ctatgacacc 39540
tagagcacaa ttcatttaaa atatcaataa tttatactaa atcgaaataa aaaacttctg 39600
ctcctcaaaa caccctgtta agaggacaaa aagatgagta cagacttgga gaaaatgtaa 39660
accacatatc tgacaaagaa cttagatctg gactatatat agaactctca aaatgtaaca 39720
gtaaaaagaa acaaaaaccc cagttaggaa atgggcaaaa gatatgacac agatggcaga 39780
taagcctatg aacatataaa aaacttcatt agccattagg aaaatgcaaa ttaaaatcat 39840
ggtggtggga tgtcactaga cgcctactaa aacagctaaa gtaaagagat cacaataccc 39900
taaaaatgca gagaagctgg atctcatata tgggtggtgg gaatgtaaac tggtatagcc 39960
actctggaaa atagtttggc agtttcttaa aaagctgaac gtatacttag cttatatgac 40020
ccagcacttg cactcctggg catttatccc agagaaatgc agtcataatg tccacacaaa 40080
agtgtgtgca tgaatattca cagcagcttt atctgtagta gccccagatt cgaaacaacc 40140
cacatgtcct tcagtgggta agtggttaac tatggtatat tcataacaca gaatactact 40200
cagcaataaa aaggaagaaa cttgacgtaa caacatgggt agctctcaga ggacttacgc 40260
tgggtgaaaa caatccagtt tccaatgatg acatagtaca tgattccatt tatataacat 40320
tcttgaaatg atgagaattc tcgagaggga gagcagatcg gtggttaggg gtggaatggg 40380
gaagagtgtg cctgccaagg ggcacacaga acctttgtgc tgatggaata ggtatgtgtt 40440
gttttggtca tgtgaatttg tttgtggtaa aatggcatag aactgagcac acacaaatga 40500
gtgcctgtag aactggagaa atcaaaataa ggtctgtgga ttgtagcagt gtcttttcat 40560
gcttctgagt ttgatggcct tctggaacta ggccctggac agcgcattgc taggagtggg 40620
gctctgtggt gagtctgaca gcgtccctgg ctgcaaagag cttaactgtg gcaagaaggc 40680
tgctactggg tgcctgggtg ctcctgctgc cctccaccag cggagctgat cagaatcttg 40740
ccctaagagg cccctcttaa aagccacagc accttgggtg ggctggtctg ccctagagca 40800
cttacgctgg gtggagggag ctgtggaagc gtgcagtggg ggagtgctgg agtccaggac 40860
agtcagctgt actcgggatt ggggtgaggg tgtggttgtt tctagattaa aatacagata 40920
catgatcaag tagaattctg aaattccttt aaatgtttaa ggtaaaatag gaattaccaa 40980
ggaattttgt actttaatac cctcttaggg tattaaggag ggtttgtcag tgaaaataat 41040
caagaaggac tggtccattc gagccactga ttttgacaga caagaaaaca gacccctgag 41100
tgccccttat cataggactg tcggcgactg ggatgctgat agtgtttctc aagtagtagt 41160
cacccttttc tgggaaatca tgactacgtc tggaatcatg taggttggta gagccaaaag 41220
agagatcaga atccacatct ttagatccct caaactcccc tcacccatgt ttttcatctg 41280
cgtcgcaaaa ttccaggtac ctgtactaag aagtcctgaa ggtttctgcg cttttccttt 41340
ctgccgaatt agtttacgct taagaaagtc agttaacgtc atttcatttc ctgcttatgg 41400
ttcagaatgg gttgatagtg atttgtcatt ctaacaaaat tctagcaggt gtaggaattt 41460
gaatatgtga aaatcttctg gaattcatca tataaacaat gtttgaatac ttgctgactt 41520
aaattgttat gacactctac taggtaggcc cgctgagaaa atggaagtag cagtcctttt 41580
tccctgacag tcaaatttag gagaaatgaa tcagtacagg atttcttgac tctccgaacc 41640
taaactgcag actgctcctc tccgctttgt ccccgtggct ccagccacat tcttcatgtc 41700
cctcagacat gttaggtatg taccacctta agtcattcgc cgttctctgt gcttggaaca 41760
ctgttaacta aaatatccgt gagactgacc ccttccacat ctgtgcttac atgtgaccca 41820
cctgggtggt cagccacaag gcccatcctg accaccctgt ttagaattgc aacctgcccc 41880
tctccccagc gctgtgagtc ccgttactct tttttcttag catttattac tcatatactt 41940
tacttagtta tgcttattgc tatatcacca atatagatat ttggtccgca ttgtttgcat 42000
ggtgtctcat gggcctttgg atgtgatgaa agttaaatct tttcccctaa gtccctccac 42060
cttcaatttg tttaggctct aactctccta gaagcggaga gtctgagttt caaagaaaat 42120
ggtgcaatac tgctgagcgc cgtggctcac tcctgtaatc ccaacacttt gggaggccga 42180
ggcaggtgga tcacctgagg tcgagagttc aagaccagcc tgaccaacat ggagaaaccc 42240
cgtctctgct aaaaatacaa aattagctgg gcgtggtggc acatgcctgt aatcccagct 42300
actcaggagg ctgaggcagg agaattgctt gaacccagga ggtggaggtt gtggtgaact 42360
gagatcgcac cattgcactc cagcctgggc aacaagagcg aaactccatc tcaaaaaaaa 42420
aaaaaaatgg tgagatactt actgattatt ttaaagtgaa gattagtatg tcttatttta 42480
tacaagctac caaagaggaa aaatgtctgt tttccaaact aatgaatttt acctattttg 42540
taaagacatt tctcaggtat tcttttcatt gcagactctt ggggacagat taaagaggac 42600
tttttcaatt aggagatttg tggaatcaga atttaattag tgacattgtc ctgtcaagtt 42660
taggatcttg aaatcatgat gggttgaaag acgctgatga tttcaaggac agtaaactat 42720
tgtttggaaa aggttgaact taccaaatgt ttcctaaaca atgtatactt tattagcaaa 42780
gctgtgatgg tgctaccttg gaaatactct ttacattccc accgccacta cttgattcag 42840
gcctcatcac cttttgatta cgctttcagt gtattggtgt atgaagttgc cttcttcttg 42900
gttcagtcca tcttctatgc tgctgagagt tattttcatg aaaatcaaat gtgtttatac 42960
cagtccttta aagaacttca ctggggccct gtccagagcc tgtgcctgta gcacggccca 43020
cgtgcccttc agggtccgcc cttaatgtgt ctggggagcc ctctctagcc agctcgccag 43080
cctttctgaa tctgccagtc ctgccgctac accattccct ttcattcctc tttatgatgt 43140
gccctctgct ggaatttccc cttcctgctg atctcactag gcctattcag gtagcaacta 43200
ctcaagctcc ttcccacaat attttatgca ataaagtatc agtactcaga gtcacggctt 43260
aatataattt cttttttcct ttttaaaagc ttcaaacaaa taatgtctta cctttagatc 43320
cctataggtt aaaatatgtt tgttgactaa aaattgtgta tgattgctga aagtattcaa 43380
tgcagggaac agaccagttc atcatggagg cattccatca gagcgtctag ttagagaaga 43440
tatgtcatgg actgcatcgg cacagaagtg gggtttatgt gagagaggag ttggaagtca 43500
cacctgagtg gagagcaacg tgaaaaggtg atgtcagcaa gaatttagga tgtatggaaa 43560
ggatggtaaa ggcaccaact ggatggatca gggagacatg gaatgcagaa tgcaggaaat 43620
aggtaatctc ttaaattgca caaatctagg tttcattttt gtgctctagt gtgttacact 43680
tgtgatgact tgacttccct gagtgacagt gcgatgggtg tgatccatat tcatatgcac 43740
ttcatagggc tgtgaggact gagagaggtg acccagtgac gagtgtcaca caaacctgac 43800
atgtcgtagg caccaaatgg ttctagacag tggttctggt tggttttgtg gtcaattgga 43860
aacctttcat caagtagaat tttctttgca gagcaaacaa ttgaaatgtt aatattctat 43920
gtgtactaaa gtttgtattc tccattaata tgggggagta tatggtgacc tggtgtttag 43980
tgccagcttt gtttttggtt cattgctcga tttatgagag agaatgcata atatttgttg 44040
ttcgactatt ttacttgcag gattgaagag agttgacaaa tctagaaaat gctttgagtt 44100
cttggacatc actgtttgaa aacgtactga ttacccttag ttgagaatgg gaaaatctaa 44160
aggggaaaag tcactggttc acgctgtact attagaattg gtcatcttct tgcctgactt 44220
gtaagttaag gatgcttgat ctttgctgtg atttaacctg ttcaggatga attgtaacca 44280
gttacaatga atacaaattc tcctttctgt ttgacctgga aaactttcca aaaggagatg 44340
tctttacaat aatgatatat ttggtgaaag ctgtgggttg tttttttttt tttaaagctt 44400
atgatgacag tattgaaaga ggaaactaat ctgtattgtc agcacagcca cagctagcac 44460
tagtcatttc ttgagaggtg gagctgtttc tcagaaaaca tgctgtttga gggtaggagg 44520
tgaagggact ccttgtcaga aattggctta attttaatcc aagttataaa ccacagttct 44580
gtttgggtat tgcatttctt catttactca gtgacaagaa ttaaggcaga tgatgcctgt 44640
agaaaaaaaa gtgtatgttc ttgatagttc tgctactagt gctagtagag gttgagaaat 44700
aagatttcct gtgaagtgtg gtttggttgc ttttgtggta tcccatgcaa aagagtttga 44760
actatcttca tttttctccc tttactggat cctttaaaag aggaaagggt gagataacca 44820
gacttacaag gatggtaaag tatagtgggc tttggggctt acttatacag cccaaaggtt 44880
atgggatgct gctgttatga taatctcatg tcagaggttc ctatggaaga ggagaaagga 44940
tgtacctttc tgtgtgttct cattcagaag tcaaaagttt gttttttaat gattagttta 45000
cagatttggg gctgactgat agtatctggg cagggaaaag agacctgtga ctcaggttgt 45060
taagggaacc tgtgtatatg ctctcacaaa ctcgaaaccg tgtgttgtga tccttaattg 45120
gagaagaggt agtgcccttc tttgttatca tcactaaaga gtataaatta taaagtcaca 45180
gtttctcata aagaggcttt gatagtttca cttcctgaaa tgtgtatatt cacaatcttt 45240
tgcaatagtt attttaaggt gatgtgtttt atttttttct ctactgcctc ttcgaaatca 45300
aaaagttata tatacttttt attttatatt aatctttttc aatttttgtt tttataattt 45360
taatgtattt taaatttatt ttaaagtttt atttctcctt tttgctttaa tatttcttcc 45420
tttttaaatt gtttttcatt tttcctttgt atgtgttttt cttaaaagaa cagaagaatt 45480
aaaataatat ctagtgatgt aggtatttca gttttgtttt taatcagcct tgagaagaaa 45540
atacaggctc aaataacatt tgtagtcagt tctaaatagc tatagagttt tcccaaggat 45600
tacctttctt ttttagtatt atctgataac aaaataaaaa aaaattttcc tgagaaaatt 45660
caccgttcct ttgcttttgt tgactctgta tattaatgtt aaacaggaag cgaggccact 45720
gccaggggct gagccctgca gacccagtgc cctgcaggta gtgccctcct ccctactgcc 45780
tcccaggact ggatctgggc ttttctggtg tgtggttact gtgcttatag agcattgagg 45840
taacacctcg tgcatatttt acagatagaa ggaaaatagc agtgaatttt agttcagagt 45900
cctgagggtg aggtatcaaa tactctggct gaaggtcttt ctctaggttt acttcctgca 45960
tagctgggca agggtgtggg gtggtgccat gtggggtaac cagattccca gcaccctgtg 46020
aggtggacct tcccgggttt tatggattcc taccgcatgt tagctaaatg gctgttttca 46080
gttgtgcaat agatatgagt agcctttggt tagtgttctt tctgtgatta caacatgagg 46140
aaatacattc ctttggtgtg atattttagt ggaactttaa ttttaaaatc atgtagtttt 46200
ctaaaaccag gctttctttt tttggtatgt tgtctaggag atatgtggtc tttattttaa 46260
ttaagttgct gaccttttta ctattttaca taatataaca gttaaagggt gattaaactg 46320
ttttttaaaa aagtgatttt taaaaaaaag tgcttgttga catcatcttt ctgagaacac 46380
tagtatatgt gatttactat aacaagatct tagtttttcc tgttggcaaa tgacatgtaa 46440
tatttacaga ggtcttgggt tcagtccagc agaaacatct cagataaatt gatgtgtgaa 46500
actaaagcca ttttacattt tctttcatat ggagataata taaacagttt tttcatttaa 46560
aagtaaggag agactggcta tttagtatgg atttctttga gagggacaac ttgtaatagt 46620
atgcattctc tagagttaaa catcaaacac catgttttta gttttataat tcagtgatat 46680
gcatccggca gttgtgtgtt gaggattctg agttaattca tgggcttttt ctcctggtgt 46740
catgcttctc ttgctttccc atctaaatgt ataaggtcac attttgtatt tcacatattt 46800
aaattagcat aaattctcaa tctatgagat ttttactttt aaaaactaga aatatctcta 46860
aactgttaac agagtctaag tagtgaagta tcttcagtgg tcttttaaag aatacagttg 46920
gaatattcca actgtcttta aatattttca gcatttaacc taaacacagt tcagtgctaa 46980
aatttattta aatatagtgg aattcttatc tgttgagaaa tgaagaggtt gaaatatagt 47040
aacctcggaa atctagtctc atctatttga gaccagttat cgttttgtag gtagaccaat 47100
caattcttag gtaccaagaa tctgaatgat ccttttactt ttaggaaggt aagtacttta 47160
ttcatttaac tatgtttact cctggtcgat ttttcaagtc acaatggcta atgtgctaca 47220
aacagaagtg cttcctttcc agcactatag taataaacaa gattgcattt tatactcctt 47280
acaaaaaaag tagagaatag tttaggattt gtctcaactc tattatgatg ctaattcatt 47340
tttcttattt cttctgtctt tttataaata cctagaatat taatatgaag ataaaaacag 47400
taattttgaa atgacagttg tggtttatca ttctctattt tcagatgatc acagtcgtgt 47460
taaactgcaa aatgctgaga atgattatat taatgccagt ttagttgaca tagaagaggc 47520
acaaaggagt tacatcttaa cacaggcaag taatacgata ccacgcaaat gtctgaaaat 47580
gatgtgtttg tgcttgttct gctttaaatc ataggtaaaa gtatatcttg acttcttttg 47640
gaaatgaaat ggtatttcag tttttttctg acgatgtaat gaattatgga cattataagg 47700
ttttgaagct ttgagtattt aagataaaag gcaagttatt tttgatatta cacgttctgt 47760
gaaggaaaat tcttaggaaa tggcttaggc cagttctttg gcagattgtg ttccttacat 47820
tatatctgac acagagtgct gcttatgctt cttagtgtct tcttttctct tcccataccc 47880
tgtggcaaaa ccagaggccc tggacagctc ttctgtagct ccccctgcct cgcatatatc 47940
ttcagagagt acaccaagcc ctggatggtg tctggtcgtc ttcaaggacc tgagcgggtg 48000
ctgagaccag gtgctccaga ggcccagcca caaggccttg tgctccctgt ggccttctgc 48060
ccagttgcct ctgagcgcat cagccacacc tgtgtgcaag catgattctt ccttccattc 48120
tgagatagta ggagagattt ttgtgtatcc acagctactc tttattcatc aagtaataaa 48180
gacttgatta tcaacagggc tgtctttccc cctaaagatt tttaaatatt caaaagatat 48240
accataatat ttgagatttt tgaaaacata acttaaatca gaatgactta tttgaaagag 48300
aaaaatattt gataagtaaa aagatatgca gattaatgta actatgagct attatactac 48360
gtcaattcac aggaaactaa aatgcatttt ttacttgagg tagtacagct cctgcaagtc 48420
aaaaagaaaa aaaacagccc atggaaaaaa ctggcaaagg acataaactc ctagttcaaa 48480
gaatcaaagg tggacacttt gcacatgaag aaatgctcca ttcagtaacc agggaatggg 48540
cctttcacct gtcagaaaag gagagatttc aaagtgtata atactcagtg ttcaaatact 48600
ctgaccgacc aagaaagtct acttagagaa atacagtcag acataaagat atatgtgatc 48660
ggccaggcgc ggaggctcac acctgtaatc ccagcacttt gggaggctga ggcagatgga 48720
tcacctgaga tcaggagttt gagaccagcc tggccaacac ggtgaaaccc catctctact 48780
aaaaatacaa aaattagctg ggcatggtgg cgggtaccta taatcccagc tacccaggag 48840
tctgaggcag gagaatcgct tgaacccggg aggtggaggt ggcagtgagg caagatagtg 48900
ccactgcact ccagcctgag cgaaagagca aaactgtcca aaaaaaaaaa aaagacatat 48960
gtgatcatgt tcattgcagt cttattttaa cgcatcagac tcaagcaatc tgtaagggac 49020
tggttaaata agttaatcat acatatacca ttagtaataa tttgtggagc ttgggaatag 49080
agactttaat tttccatttt attcctttct gtaatattgg aagttttttt tatgtgcatt 49140
tgtattttaa actactattt agagttaaaa attttatttt ctgtttgaaa tacctatagt 49200
tgacccttga accatccagg gttgaactgt actagtccac ttacaggcaa atttttttca 49260
accaaaaacg ggtcggaaat acggtattca tgggatgtga aatccatgca tacagagggc 49320
tgactctttg tatctgcagg ttctacaggg ccaccagtgg ggcttggaca tgtgtggatt 49380
ttggtatact gcagtgggtg gggggcaggt tgggtcctgg agccagtccc ttgtgtatat 49440
tgagggacaa ctaattacat taaaaaatag agaagaatta ccaccctaga tcccttatca 49500
caaccctttc tccctctgta ctgttcttct ccattatcac ttactggttt tttgttctct 49560
tcttagttct taaaaacata ggtcttaaga ttctaaatta gctttttttt ttctcctcca 49620
gtctgcacta cagcccttta agaccatggt tttcaacctt tgtaacctaa gatagggtag 49680
actactgtca tggtacctgt gctggaatct tggtgccagc atttcactgg gtattcactc 49740
acccagcaaa gacttactga gacctactct gtggcaggca ttgtttaaat aaaacagact 49800
ttcataaaaa ccctattatg aattttatga attttacatt ataataggaa ataataacag 49860
ttaaaaattt tgtaatggtg tttttacatg ctttgtataa tttaaacctt aggacaaccc 49920
tctgtggtaa atagtattac ctttatttta tacacgagga atctaaggag atccagagac 49980
attaaataac tttctttttt tttttttttg agatggagtc tcactctgtt gcccagcctg 50040
gagtgcagtg atgcaatctc agctcactac aacctcctcc tcccgggttc aagtgattct 50100
cgtgcttcag cctcccaagt agctgggatt acaggtgctc accaccactc ccagctaatt 50160
tctgtatttt tagtagagac aaggtttcac catgttgctc aggctggtct caaactcctg 50220
gcctcagatg atccacctgt cttggcctcc caaagtgctg ggattacagg ggtgagccac 50280
cgtgcccagc ctcctagtaa ttgtttttga acttcttgtc gctgtgtgtg tcctgaagga 50340
gccctgccca tttaatgcga gaactcagaa gcctgtgtct ggctttttct tctctcctga 50400
attcctctct atgtttttca ggtctctatt ggatattttt actggatttc aaagtctgca 50460
tgttctctgt cttttttacc aaggtagctg ccttcctatt tttctcattg ggattgagac 50520
tgtcctcatt gtctgccaag ttctttctga tcttctattg cccctcgctt ttttcagagc 50580
tctcttcaat tacacctgtc ctgttgcagc agctttttaa ggtctcccct tggcaccatc 50640
cctgtcactc tagtggtgta gtcaccaact acatccctcc acttctacct cactgatcta 50700
tttgtctttt cccaaatatg ccctaaactt tcatgcactt tgccttatgc ttggagggcc 50760
tggagtggac cctaactccc tcccattctt ctgcattccc tctctgtatt aggacctttt 50820
tcgaggctct tctgtagttt ccttcccagc ctttcctgct ccctaagacc tgatggttta 50880
atttgcccat actcttgtac tacttaactg tgtccattag tcatacaagt acttctcctt 50940
ctacctttgc aagctcttaa agagccaaga ctgcatctca gtctagctct tggccttgca 51000
tctagcaggt tgtttggaat ggaggataca gaaaactaga gatgcagtaa cccagctctt 51060
ctgattgtcc tttgtagatt gttacttcag tcatcttttt cttctgagtt ttatgaatta 51120
gtattttttt aaaagtcacc tccttggtgt attatgtctg ttttgcagat gaagaacatt 51180
ggtagcattg ctggtaaatg gaagagctga gatgtgaatc tctgttcctc tgatttaaaa 51240
acctatggct gggcgtagtg gctcaacgcc tgtaatccca gcacttgggg aggctgaggc 51300
aggcagatca cctgaggtca ggagtttgag accagcctgg ccaacatggt aaaaccccgt 51360
ctctactaaa aatacaaaaa tcagcctggc atggtggtgc acgcctgtaa tcccaactac 51420
tcaggaggct gagggaggga gaattgcttg aatccaggag gcagaggttg cagtgagccg 51480
aggtcgtgcc attgcactcc agcctgggca acagagcaag actccagctg tgttcctgtt 51540
tattatttag tctttagaat caccagtgga atggcatggg ttgtgattgt gtgtatacac 51600
taaggagtaa cctcactggc aaattgctac atccattttt tttttcctaa ttaaagaaaa 51660
aggtattcat tttactgggg atttcctcat tgctgttttt acctttagac tgtgttttgt 51720
tttagaagta gatcaagtaa tagaaaaata agttgagtga ggaaaacgcc actctcaaat 51780
attaggttgt agtttgtcag gatcctcagt agacttctag catttttaca acttaacctt 51840
ggtttattca tttaagtaat atttattgag tatctgctac ataccaagga gtacaccagg 51900
cctaaagatg cttttagtca gctgggcacc atggctgata cctgtaatcc cagcactttg 51960
ggaggctgag gcaggtggat cacttgaggt caggagttcg agaccaacct ggccaacatg 52020
gtgaaaccct gtctctacta aaaatccaaa atttagccag gtgtggtggc gggtgcctat 52080
aattccagct ccgtgggagg cttaggcagg agaatctctt gaacctggga agtggaggtt 52140
gcagtgagct gagatcgtga cactgcactc tagcccgggt gacagagaca ccatctcaaa 52200
aaataaaaaa tgcttttagt ctagaaccac tttaaccccc ttgttgtatg tgggtctgaa 52260
gctctgggca gccctagccc ccactcctga ctctgcccct aactcatacc actctgctac 52320
attccatgtg agttgaatgc atgttcatag ttattttagg tgtagcaaaa ctacatctca 52380
ttttaacctt ctcatttaaa actcgttaaa atttgtacat aggcttttca tctcttatta 52440
gatcttcctt ttgccctatg ctatcattaa aatgtgaaag caattggaaa tacatgaaat 52500
attttgcttt tatccccatg gcattgttgt aacatggact gttgcccctt tttaactctg 52560
cccaatactc ttccattgag gccgtacata ctgtgcattt gtagattaac agtttcattg 52620
tggttcaggt actttaatga ttcctacttt ttctagaaat ctttttgtag ttgacttgag 52680
ttggttggct ggccagtgat ggtacagact tttttctcat ggattttcta tgatgtgtgg 52740
gaggcacatc ctcttggctg tagaagatga agaggacaga aatttccttg gtctaccttc 52800
tttgcagcta gaacatgatc agtcagatac tcctactcgt gattttgtct ctgatttgcc 52860
tatagattgt acatgaatac tatagccacc ttcatatggc agtgccagca aaagcaagga 52920
gatagtagtg acggtatcaa gagcagcatc ccaggttgac tttctttggg gcaggacctt 52980
gcttgtgtct taacccttgg ttcctaccca agtttgtctc tctagtcctc aactctgaaa 53040
gccacttgat atcttacaca attccttttt tgcctgagaa aataaaagtc agttttgatc 53100
atttacaacc aaaaatccta actaacacag acctgttttt gaaatcaggt agattggaag 53160
tcttggttta cttcttataa gcccgtccgc tgtctgtctt gtaacatccc aggagcagac 53220
ttaacaaggc cttcctggag ccttgctctt tctgtctgct tccctcatct gctctctctc 53280
ctctctcttc acagggtcca cttcctaaca catgctgcca tttctggctt atggtttggc 53340
agcagaagac caaagcagtt gtcatgctga accgcattgt ggagaaagaa tcggtgagta 53400
atatttaata tttacaactt agtatactgt atgtgatcat tagcatataa agattttcat 53460
tttggggcca atattcattc cttagttttg gcctttaatt gctaaaggct agcggtcaaa 53520
gtgtttctgt ccggaaaaac tcatgtatcc ttttcctttc ttaagtattt ttataacaat 53580
tgcagacctt tcatctccaa gatagaaata caatggaata aatatggact agcagtgaca 53640
tatagatctt tggaatccct aggaatcctt attgacctat tgtcaataag tcctcttcca 53700
gctttaagat cttgtactgt tctacttcag atttcttact ttattctaca tttcataatt 53760
gctggttttt aatgatgatg aaaatttcct aatccacttc taattagatg tggcaatgac 53820
atgccagaat ttccagcagt atcagcatag tcatttacag gggtttttcc tgatcttcaa 53880
tatcatttaa aaattaagga ttaggccagg cacggtgcct caaacctgta atcccagcac 53940
tttgggaggc cgaggcaggc agatcacttg aggtcaggag tttgagacca gcctggccaa 54000
catggtgaaa ccccgtctct actaaaaata caaaattagc caggtgtaat gctagctact 54060
tgggaggctg aggcaggaga accgcttgaa cctaggaggt ggaggttgca gtgagccgag 54120
attgtgccac tgcacctcaa cctggatgat agaatgagac tccatctcaa aacccactgc 54180
actgcagcct gggcggtaga gtgagactcc atctcaaaaa agaaaaaaaa aaaaatcaag 54240
gattatgaca ttgtcagttt gagcaccatt gtagactaca tgatttgcaa attttatttc 54300
tctcattttg gagtataatt actgtattaa taagataaca ctgccaccag aatttagaaa 54360
tcatgtttat ggtggttgaa cctagatggt taacaagagt caggtttaat tattttgggg 54420
aagattactt cagaggtggt gggtaatgtg ttattcatca agagacccat aatgtctgat 54480
tattgttctt tttatttcat taatagccat tattggtcag tgttcagctt cttaattcat 54540
tatgggttac aaatgatgat aatccaattc tgtcattact tctcttaaaa gcagttttcc 54600
aaaaaaaagt tgattcccta ttgaggtcat ctgttctcaa cagatgacca attaggagtt 54660
tttctggtgg agagtggcag gagaggttga attattatgg gtttggacat actggattaa 54720
ttttactcct ttgcagttat tttccttatt tttgatcaaa ttaccctgtc attggctagc 54780
agcaatgtct ttaggttggg tcctgagtcc tctttttttt tttttttttt tggagacaga 54840
gtctcgcctg ttgcccaggc tggagtgcag tggcatgatt tcagctcact gcagcctcca 54900
cttcccgggt tcaagagatt ctcccgtctc agcctcccga gcaactggga ttacaagcac 54960
ccaccaccat gcccagctag tttttgtaga gatggtttta ccatgttggc caggctggtc 55020
tcaagttcct gacctcaagt gatacgccca cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag 55080
gcgtgagcca cctcacccag ctctgagtcc tttttaacaa acctttaata gtttccttgg 55140
ctgggtgcag tggctcacac ctgtaatctc agcactttgg ggagctgagt tgggtggatc 55200
gcttgagccc aggagtttga gaccagcctg ggcaacatgg tgaaactctg tctctacaaa 55260
aaatacaaaa attagctggg tgtggtggcg catgcctgta gtcccagcta cctggggtac 55320
tgaggcagga ggatcacttg aggccaggaa gtcaaggcta cagttagcta tggtcgtgcc 55380
actgcactcc agcctgggga cagagcgaga ccctgtctca aaaaaaaaaa attttttttg 55440
ctgtctgtaa tgactgcatc tcaggctcat ctcaaactct tgctgcccag acctggaacc 55500
agccatttct ctaaggagtt ttggtttctt ttaatgggca gcagtatttc aagatcacag 55560
caaaaataag gatatatatt gcaactggac tggtcattgt ttttagggct tttcagtgga 55620
caaaagctaa ggaacaatat gcatatgtta agataacata cttcaagagt tcataatgat 55680
attcccagtt caaatttgga actataagtg ttgcttagcc ccttccatct tacatctgct 55740
atttcctttt tcataccaag aatcctggtt ctcaaagata tgagagatgt aaactatctt 55800
gtaatgactc atttccttct tcccatatca tatacaatat ataaccataa tcatgatatc 55860
atctgctacc aaaataatta ctgaaaatgg tttacaattt ttaatatttt tttcattctc 55920
ttcctggtgt ttctgagttg tactttacaa actgtagtct ctcccttaca tctcttgtag 55980
actcttagtt ctacaagcaa gcattattta atattcatca acagtctttg ctgatgtctc 56040
tccagtcatt ctgactaaag ctcattctct agtggctcct aaggagggac ttgtgagcat 56100
tatagtctga tttttttaca tgtcagtgat ggttcatctg ctgtcttaat atctgaaagt 56160
cagtttggcg ggatataaaa tccttggctc atgtgctatt ctttgaacaa cttttttttt 56220
ccatttcctt ctggtattcc accaaagtct aatggacatc ttatttcctt tataagtctc 56280
ttgttctttt tatctgcact acccaaagaa ttcttttttt ctttttcttc agatattatt 56340
agttttacca aaaatatgtc ttagtaattg gccattctgg gtcagttttt acaggtacat 56400
gatgtgttct tgagagtttg acttcaagta ctttttaaaa ttttttaaat actttttgtt 56460
aaagaaatat ttgttgaatt acagtcctta gtatttgttc tgctcccttg cttgctttaa 56520
tgttcttctt tgggtcttcc tattatacgt atgttggatt ttctttgcct acctttttta 56580
tttgtcacgt tctctttaat cctgtttatc tctttatttc tattttactt aaaaaaaatt 56640
tttttttttc tggccaggtt ggagggctta cacctataat cccagcactt tgggaggctg 56700
aggcaggagg gtcacttgag cccaggaatt caaaaccagc ctcgacaaca aagtgagacc 56760
ctgcctctac aaaaaataca aaaagtagcc aggtgtggtg gcacgcacct ggagtcccag 56820
ctggggttgg gggattgctt gagcccagaa gattgaggct gaagtgagcc aagttcaccc 56880
cagtgcactc cagcctgggc tactacagag caagacactg tctcttaaaa aaaaaaaaaa 56940
ttatttattt tcctcttaag gcattattat tattattatt tttttttttt tttgagacgg 57000
agtctcgctc tgtcgcccag gctggagtgc agtgctgcta tctcgactca ctgcaagctc 57060
cgcctcccag gttcacgcca ttcttctgcc tcagcctccc aaatagctga ggctacaggc 57120
gtccaccacc acacccggct aatttgttgt atttttagta gagacggggt ttcactgtgt 57180
tagccaggat ggtctcgatc tcctgacctc atgatccgcc tgcctcagcc tcccaaagtg 57240
ctgggattac aggcgtgagc caccgcgctt ggccagcaac atttattttg aagataaaat 57300
tattgcaaga gtttgataat tttagaaaca taaagtgaat gtcccatgac gttaaaatat 57360
aggtaatcat gctttaagaa tgataaattt atttttattt tatgaatatg atacctatgg 57420
cttttttagt ttataagtta caggaacact taaaaaatac cttataagac cggacatggt 57480
ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg aggctgaggt tggtggttca cttgaggtca 57540
ggagttcaag accagcctgg ccaacatggc aaaaccctgt ctctactaaa aatacaaaaa 57600
ttagctgggt gtggtggcag acgcctgtaa tcccagctgc tcagaaggct gaggcaggag 57660
aattgcttga acccaggagg cagaggttgc agtgagccaa catcacgcca ctgcattcca 57720
gcctgggcga cagagcaaga ctccagctca aaagaaaaga aaagcctatg gagacagaaa 57780
atggatcagt gcttgcctgt ggcttggagt gggaatagga cacaagggga tttctgagtc 57840
tgagagaaat gttctaaaac tggcttacag tgatgactgc acacacataa aaaatgcttt 57900
ataaaatttc aatctctacc cgccctgctc cccgagatgg agtcttgctc tgtcacccag 57960
actggagtgc agtggaatga tcttggctca ctgcaacctc cacctcctgg gttcaagcga 58020
ttctcctgcc tcactctcac aagtagctgg gattacaggc gcccgccatc gcgcctagct 58080
agtttttgta tttttagtag agacagggtt tcaccatatt agccaggttg gtctcgaact 58140
cctgatctca ggtgatcctc ccgcctcagc ctcccaaatt gttgggatta caggcgtgag 58200
tcaccgcgcc cggctataaa atttcaatct tactaaaata cattaagcgt agaatatagt 58260
agtgacttct tagttttggg tacttgaaaa aatatagcat gtatatatct ggtttgtttt 58320
cattttttaa ctttatggtt tcatgatgtc tataaactaa aaaaaaatca tatacatatt 58380
tctaaattta ggttaaatgt gcacagtact ggccaacaga tgaccaagag atgctgttta 58440
aagaaacagg attcagtgtg aagctcttgt cagaagatgt gaagtcgtat tatacagtac 58500
atctactaca attagaaaat atcaatgtaa gacctttctt gcccgaaatt gtggacttta 58560
tatgatggtt taaagaatta ttctttatta ttagatttga agtttgataa gcacatgcat 58620
ttggataatt cctatagtat ctagccataa tcacgtgttt ttagattgtg tgtctgcatc 58680
tagtagcttt ctgaggactc tgaagaaaca gtagaaacta agaatttcaa agttcagttt 58740
gatatttggg gattaaaaat taattaatag aaatacatga ggattaatag agagggcttt 58800
agaatcaggc aaacctggat tcagatccag ctctgctgct tagtagagct gtactttaga 58860
cttgttcccc accctcactg atcccttcct catctgtaaa atggaggtta ccacgccttc 58920
cctccggggc tgtcctgaag gtcaaatgag gatgtgtatg cagagcacct gaccttagta 58980
aatgcccagc aagcaatagc tcccaggacc tgtgactgcc aagaatagca aaatagtcaa 59040
gaaaataact tacaaagcta ttgttaagtg attcacaaca caaaaatttg tccctattga 59100
gttggaaaaa aaatggtgtt ttatatatat atgtaacacg cacacataca tacatacata 59160
cacacacatg tataaatgtg gcatgtggtc tcaagaacat ttacttgggt gtttgtttgg 59220
ttggttggtt ggttggttga ttggtttttt gagacagtct tgctttgcca cccaggctgg 59280
agtacagtgg cataatcaca gctctcaatg aggcctccaa ctcctggcct caagaaatcc 59340
tcccacttca gcctcctgag tatctgggat tacaggcatg agccaccata cctaattttc 59400
ttattttttt ttaatagaga tggggtcttg ccttgttatc caggctggtc tcaaactcct 59460
gagctcaagc gatcctccca ccttggcctc ccaaagtgtt gaggttacag tcatgagcca 59520
ccatgccagg ccttacttgc atttttcttc cccagaaaca tatgaactgt tccttgggcc 59580
ttggttgagg tacatacaca tagtgggtta tgaacctgct gttgccaggg tgatgattga 59640
ggcatttctc cccctttcgc catttacctc ttttgccctc tttgtgttgt aatagaataa 59700
actagaaaat aatgaaatga gagtaattct gagatgctaa tagaaactgt gatagcttga 59760
aaataggaga atgtttagcc tcatatgact ttaggaatgt atgtagtcta taagtgaaat 59820
actgttttag ttaaccatta agtaaattaa gtgatcacta acaatacaaa aaaaccttaa 59880
agagaaggga gatatataca tgctttttag atgtgtggca gtccctttta tggtggatcc 59940
cttgaaacac ttgtgttttt tgctgcattg agtaagcaca ggtgcatgct ctgtgcgtga 60000
ggcctaggtt ctggttttcc ttctgtccag cttcccgtga catccgtact aagcttatta 60060
tacagtctct tgagtcacct aaaaaggctc aaaattacga atgataatgc ttagatttat 60120
ttatacattc ccattactat atttattttg tcccaactct ttccatttac atgtgtctta 60180
aactgcattg agatacatca ataactcttt gatactggac tgagctgtac attgttcatt 60240
cccagaaaca gaactgtatt tccacaaggt tctgaaagtt ctctgaatca tcttctcttg 60300
gtatttatcc caggtaatta ctcatttgct tatggcatta aaattgattt agatgaaggg 60360
catagatgtg tttccctgtt tctgaaacag tccttattga gaattgatta taccttaagt 60420
aacaataaaa tagaatgatt tttgtgtttt gtttatcaga ttccaaaatg ctttcacata 60480
tatatcatct gaccagtagt cttcagttag tgtagatagt gtaaatattc ttattatccc 60540
cgtattttat attataaaaa ataatagtta aaatccatta ggttatagga atttttccat 60600
cgattactta gctaataagt gacagactga tctcattagt tctcctggtc ccctattttt 60660
taagacaaag tctcattctg ttgcccaggc tggagtgcag tggcatgatc ttggctcatt 60720
gcagcctcca cctcctggat tcaagtgatt ctcctgtcct agcctcccga gtagctggga 60780
atacaggtgt gcaccaccac gcctggctaa ttttttgtat ttttagtaga gatggggttt 60840
cgctgtgttg gccagactga tcttgaactc ctgacttcag gtgatctgcc cgcctcagcc 60900
tcccaaagtg ctgggattac aggtgtgagc caacacgccc ggccatctcc taacttttga 60960
catggggata agtccttttg aaaagatgct aattgttgta aagagagatt attgattctg 61020
aagcatcttt ctggagttga ggccatcatg tgagttggcc agccactctg ttttagttgc 61080
tagcaactgt gtggtataat gacatgatca ctggattttt tattggcctg ggtttagaac 61140
ataccacaat ataatagcaa gaatttgttt gtgttctact ttataatttt taattagaac 61200
tagggattct ttattcttta gaaggataaa gtagcatttc agtatgagag gcagaattac 61260
atttgcctaa gtagataacc tctagaatca gatagcccaa gtttaaatcc tgactctgcc 61320
attcttgctg agtgacttgg gtcacattac tttactatag atgataaaca gtacctgttt 61380
tatcatctat aaaatgaggg tgataacgta cctacttcat aggattgctc taaggatcaa 61440
gtgagttaat atcatgatgg tgcgggagcc acaattacct ttttagttga tcagtttcct 61500
ttttgtaaca gtaatgaatt ggaagggaca acaggaaccg ggagtagttg aaaaggatac 61560
tagcaagaaa gaaagaacca atgggagtga gaaaaagtga tgatggagta gggggctgat 61620
agccaatctc aacacgcaga tctctgtctt tattggagtc gctggggtgc agagatccag 61680
tttgcatcta agggagtctg acacgtatct attaacaagt ccaaaggtaa agctgttgtc 61740
taagcaagcc ctgcgcctcc tccagtctaa tggaacagca aaatgacata ccaggagccc 61800
tttagtgact tacttaaagc taaaagtttg aactcttgcc cctgaagaag agattgcatc 61860
tcggctttca gtgtggcctg tggcttaagc tatggagata attttgaggg attttaaaaa 61920
tataaggtca tctagagtac ttgtctttca gttttttctt tttagttgcc cttcactatt 61980
tctgtaatgt tggcccgctt tacgtttagt gagttccagg aatactgtta taatgctgac 62040
tgtcttctat ttccctgtcc ctaaagattt agcaagatga gagtctctaa ttattatgat 62100
gcttagctgg gatttggttc aaaatagttt aaacagttta ttctacctag aatgtcctct 62160
ctcttctctg cacgtcctta gtaacccctg tggcccactt cttacttagg tctctcctaa 62220
catgtatcta tgacacattg atccctaaca gctatgattc ttcttatact ttttcagtaa 62280
tttaaatttt atcattctac tgcttgttca atacatctct ctatgtaaat cttgactcca 62340
taatgaggtt tttaacttcg aaggggttgg aagttatctg ctgccttggt acccccccgc 62400
cattacacaa gagtacattt taagcacatt acacctgagt gattgttgta aaacacagat 62460
gcaatctttc caccatcctc taagaattct tctgtggctt ccattggtta ccaaaaaaag 62520
tctgtgtcca gtgcacaaga ccatgaccca gctcagcctg gtccttgcct ccttgtctaa 62580
ctccctctcc ttcgggtatc caggatttgt tcgtgctaac agacagactt ctctaatagg 62640
tgaattcctt ggtgggggtg ggtggcatgc ctttgcatat tgctttctct ctgctgagaa 62700
tgcaagcctg tccctagccg tttctgccac tcctcctgat ctggtgagtt tgatctgcct 62760
ttcacaatga atcccagtca gtaaatattt atcactgaca tgctgaccct ggcaaaaatt 62820
gatgagagac tcaactaagg cagtgatagt gaaggtacag atttgacatc tggttaggac 62880
atagggttga caaactttgt cactctttag gtgtagagga aatacccaat gaagaggttg 62940
aaaatgtgtt gagttttaca attgactgga gctttctagg ggccacaata aaggcaattg 63000
gtgagtatag ttgttttaaa aatatccagt atctgttaag catttaccat gtgcagggat 63060
atggcaggca cttcacatta attgttttat ttattcctta acaacagttt tgtaaggtaa 63120
gtagtattat taaccctatt tacagatgac agaactgggg cttagtgaaa gtcttttaga 63180
aacaaaatct tggtaccttc catatatacc taaagtgtga aagtaattgg gcctggggtc 63240
atagagctgt atagattttt tatgataatt ggaaaatgta taatcttatt atatatttat 63300
gatgattatt aacttgcatt tgaaggctgt gaacagggca tatgcttaaa ttgctgtggc 63360
ctaacaattc ctgttgttac acttgctcaa ctcacaggtt attttcctgg cttcatatat 63420
gcaagtttga cattgctgtt caaagacttt aaatttagaa ttctctttta aaaatgtaaa 63480
tgggattttg ccttagaaca gcaagccact gacattttgt gcagaatgta gtatacataa 63540
tgcagagttt tacacagaaa acttggcagg catgtgtgga acggctgcag acagggacag 63600
cctataattg tgggtgcaac ccgcgtgtgt gtagggaggg gggtgaagca gcgagaaggg 63660
tggagggcag cagctgggga ccagaggaga agtagtgtga ctcggtgacc aaggagaaga 63720
aaagggtgct tccacagttt tgaaaataag gagtttgcca aaaattgtaa agtctaaatg 63780
cagaccttgt ttggaataaa gatgaatttc gttttagctc tgtatccttt ggcaaccctt 63840
tttttcccct ctcatttttt ttcctgcgtg aaaaagaggg aaaggggtcc atccagtcat 63900
gcatatgaat gtttctatac cagagtagta aatatatgca tcttatgcct tcgtgtggtc 63960
ctttgtaact gtgaattatg attttggaaa gctgtgtttt tttaatcttg tttctgtaag 64020
gataaattaa tcaaagttaa cctctcaaaa aagtcctggt tctgtagggg ggaaaaaaaa 64080
caacaactga ttttcaaaaa tctattagtg gggaagacta tattatacaa atagtcatga 64140
gcatttctgg gaactggctt ccaatatccc agacagcgtg acctgaatgt gaaaaaagtt 64200
gagaccacta gttttgagcc aaaatcatac aagcaaagag aaagcaagct gttgcccaag 64260
attgtggggt aaccatatgt ttgagccagg acttgatgaa gtaattgtgc gcaggacccc 64320
gtaggggtac tgggccgtag cccacagagc actgcaggcc cctgctcaaa gcagaccaca 64380
tgaaggccca cacagactga gtctggtcct gctggtggcc gcagcaagta agaaacaaag 64440
tgggttatta acatccactg gaatcttaac ctcatttaaa ggaaaacttg actttgagtt 64500
aactgtatcc cccccacccc ccgctgtcaa gaacccacct ctctagctca ttcctgtgtc 64560
agtgttgccg tattaactgc ccacctgctg ctttgtaaaa ggagactaga gtttaccctt 64620
cttattttag aatgttttga attctctttt ttaatgcaat aaatttaatt tacctttttt 64680
ttttaaccta caataagatt gattcctttt ggtgtacagt cgtgttgtga cttttgacag 64740
tgcattcagt catgtaacca ctgcccataa cagaaacata gatcggttct gtcacctctc 64800
ccctgcccca gatgttcttg tgttgcttgt gtacagtcag tcctgtcctc tacccccagc 64860
cagaaaccag taatctggtt tctgtttctg tttttctgcc ttttccagaa tgtcataaaa 64920
atggaatagt atagtatata gcctttagtc tggctttgtt cacttaccat aattaattta 64980
aaaataaatg tcttaaagcg tagaaaccat gatcatttta atttgtaatg gagaaatttt 65040
ttattgcttt tagtatattg agaacttgtg gatcacactg tatttgaaat tattaatgct 65100
ggatgttaaa aggtcactaa aagtatgtac tttttagaaa atttatttca ctgtatttta 65160
ttagtattat accttatata ctgagtctgg gacatagaag tcttaatttc tactgcaaaa 65220
tggatttttt tttttttttt tgagatggag tttcgctctc gttgtccagg ctggagtaca 65280
atggcacgat ctcggctcac cacaacctcc gcctcccggg ttcaagcgat tctcccacct 65340
cagcctccca agtagctggg attacaggca tgcacctcta tgcccagata aggtttgtat 65400
ttttagtaga gacggggttt ctctatgttg gtcaggttgg tctcgaactc ctgacctcag 65460
gtgatccacc cgcctcagcc tcccaaagtg ctgggattat aggtgtgagc cactgcgccc 65520
ggccgaaaat ttatattttt aaagcgaaag ctaacttcta attttgaaaa tttttattgg 65580
gagcaggata ttataataat aatctttagt tgttaaacca ttaaacatca aggtttttta 65640
cattgtttct atgcctcctc cctcaaaaaa aaaaaacctc ctacaataaa actgaaaaat 65700
tgcacaaaga catattagtg gaagaccact gcttcgttta cacaaatgaa gagtataaag 65760
cagagaagtg ctccttgggg caaaaggcaa ttggcaaaaa gctaaggaac attttcataa 65820
tgagttagaa atacagatca tcaggaatat ccaggaagcg atagtgaata ccaggcaggc 65880
ttaagagaca ggaaacattt agcatgttgg taaaccactt tagcacatca gcaaaagcat 65940
ataaacagct ttaggattgg aaattattgc catggggaaa ggcaacaatt tagaggagca 66000
attccaatta aaaatataaa gatcgtttct ttagattaat tcttgagttg ctcccctatg 66060
cctgtgtagc agaatctaaa agataatcat gtgaacggga gattatattt aaaaaataaa 66120
ctttgaaatt cataaaaagg aaaatgttaa agaatgtaaa attatactgg tagaaaaaaa 66180
attttttttt ttgaagatgg agtttcactc ttgttgccca agctggcgtg caatggcacg 66240
atctctgctc actgcaacct ccacctccca ggttcaagca attctcctgc ctcagcctcc 66300
caagtagctg agattacagg cacgcgccac cacgcctggc taattttttg tatttttagt 66360
agaaacgggg tttcaccatg ttggccaggc tggtctcgaa ctcctgacct caagtgatct 66420
gcccacctcg gcctcccaaa gtgctgggat tacaggcatg agccattgca cccggcagaa 66480
attttttaaa atagaaaaaa atagcccatt catgatacat gaattaaaga aaatattggt 66540
aacatgtatg gtaacagatt agtagctgag aacccaaagg ctgccccagg ttgcttcaaa 66600
tcctggttct gccatgttcc agctgtgtga ccttgggcaa actatcttac cctttgtttc 66660
agtttcctca tcaggaaaat gggctttaat aggattattg tgtggattga gttaataagt 66720
aaagtgctta gaacaggcct ccaaaatagt aagtgttgta tgcgttagct attattaata 66780
catcacaaat ttccactaaa gaaaatcttc cctagtttgt atatgggatt gtcagaaaac 66840
aaatggaaaa atcatagtat aaacagccta tatggcttta aagaattata taaaacacat 66900
gatctttctg aagtagtttt ttaaaagaaa aaagttagaa ctaacttctc ccttgatttt 66960
cactttttag agtggtgaaa ccagaacaat atctcacttt cattatacta cctggccaga 67020
ttttggagtc cctgaatcac cagcttcatt tctcaatttc ttgtttaaag tgagagaatc 67080
tggctccttg aaccctgacc atgggcctgc ggtgatccac tgtagtgcag gcattgggcg 67140
ctctggcacc ttctctctgg tagacacttg tcttgttttg gtaagtgctt cttacgatct 67200
cattttaatc tcattgattt ttttttttaa attgcttcca ctggcagtga ataaactctg 67260
atgctgtatc ccagaactga ggtttttcaa cttaaacttc tacttttgga aaaacctaaa 67320
aatctcattt ccaccgttgc aactgcctct tattcatgac tggtaggaat gtatccatga 67380
tgattttaga gatccctaag aaggtgtttt tcttcctggt agctttatat tacagaaata 67440
ataggtctct cccccacatt ttttcaaata taaattcata tgtaatattg aattccttcc 67500
tcctcagaca gatactttat ctcatttttt aaatttaaaa actagggata atgatagaca 67560
tacttcacag ggttcctgtg agaattcaat gaattaatac attaaggaga cttagaagag 67620
tccctgatgt tttctgagca ttccataaat gtcagtatta ctgttactcc cctgaggttc 67680
ctgtctgtgc ccccaacggc taattctttc tccaccagtc attcccagtc ccagcctgta 67740
tacagcctag atcttttctt ctctttttag gacctttatt ttttcgttac ttgggataca 67800
tgaaacttct gtttgccctt atacttctcc taacttctgt ctttacttct tcctcttatt 67860
ataggatcaa acccaacaat aatactgtct gctttgattt ccatgccatc tactccttca 67920
gtagtccctg cagcttagtt tctgctttct gagcgtgttc taagattatc aataacctaa 67980
gcagtttagc ttgtcctggt attcagtctg gtggggattt tgtttttgtc tttgtttaga 68040
cagagtcttg ccctgtcacc caggctggag tacaatggtg caatcactgc tcactgcagc 68100
ctcaacctcc tggactcaag tgatcctccc acctcagcct cccaagtagc tgcctgcacc 68160
accacaccca actagttttt gcttttttat ttttagtaga gacaaggcct cactatcttg 68220
gccaggctag tctcaaattc ctgggctcaa gtgatcttct tgcctcagcc tgccaaaatg 68280
ctgggattac aggtttgagc caccacgctt gacacaagac tggtgttctt aaccttgact 68340
ttaaggccct gtattagtct cttcgatgtt tctgtaaaac gtagctatgc ttcattgcag 68400
ttatgtcagc attcttatgc tttccaccat gactgccagc acaaagtaga ttcccaggtg 68460
aattaatatg atgatgcttt tcattgtaaa cacacacaca aggagcttga tcaatggagt 68520
gatactcttg gaaggagtga tactcttgga agaacatttc agacgttgca tctctaatga 68580
aagctaggaa ttgggaacgg ttgagtctta actaaacatc tgtattactt taccactctg 68640
cgtatatata gtatacttca atcaaaatta gattgttaca tcaaagtttt aaaactctgg 68700
tgattatttt gttaatgaca cctgttccct gccaactata acttcaacaa ttttttttct 68760
tttatttttg gtgagcctgg gtgtggggat tctaacacta ggtcagtagt ccagagcagt 68820
gctgtagctc agcagtgtta tcgtggatct gggcttttgc tgtcttttcc accgtctttc 68880
ttcattttat tttattattc tatttattta tttatttatt tatttgagac gaagtttcgc 68940
tctgttgcca gggtggagtg cagtggtgca atctcagctc actgcaacct ccgcctcccg 69000
ggttcaagag attctcctgc ctcagcctcc cgagtagctg ggactacaag tgcgtaccac 69060
catgcccagc taatttttgt atttttagta gagacggggt tttaccatgt tgtccaggaa 69120
ggtctcaatc tcttgacctc ataatctgcc caccttggcc tcccaaagtg ctgggattac 69180
aggtgtgacc caccacattt ttatttattt atttatttat ttatttattt atttatttat 69240
ttatttattt ttgagatgga gtctcgctct gtcgcccagg ctggagtata gtggcactat 69300
ctgacctcac tgcaaccgcc gcctcctggg ttcaggcgat tctccagcct cagcctccaa 69360
tgtagctggg attacagaca tgcgccgcca cacccagcta atttttgtat ttttagtaga 69420
gatggcattt cgcgatgttg gccaggctgg tctctagctc ctggcctcaa gtgatttggc 69480
ctcccaaagt gttgggatta caggcatgag ccatcatgcc tggcctcttt tccaccattg 69540
ttagatgggt gctgtatatc cagacatcgt gtctgtagtg cagacatgaa ggaggcggaa 69600
ggggaatgag cagaaaggtt gactcctgcc atgactttta aaaaaaaaaa tagtccttat 69660
actagccaga actggttata aatccttcct ttaaccaatg actggccaga aggaatgaga 69720
ttactatgat tggtttggaa tcagttgtga atcagctaaa gaatcaaagt cctccaacta 69780
cttgaggggt tgagatgtgg ggagggatga gtaggctggg atagttgttg tgtacataac 69840
agttatagct ggagggttaa attatcgttg ttctttcaga ggagaaaatg catagcaaaa 69900
atcttagcaa tgatcttgca ttgattctgt ttcctgggtt ccaataacaa gacttgtctc 69960
attttttgcc tttcttgcag atggaaaaag gagatgatat taacataaaa caagtgttac 70020
tgaacatgag aaaataccga atgggtctta ttcagacccc agatcaactg agattctcat 70080
acatggctat aatagaagga gcaaaatgta taaagggaga ttctagtata caggtaaact 70140
tcatacaggt tttaaatcat atctatttgt taaatacaca tagcatcaaa taactgcact 70200
ccacttgagc ccttgtcttt gtttcaaaga gtgtatttga atttttgtgg taaatccagc 70260
tggctgtctt aaaattgtaa aattttagct agcttcctca tatatactca gcctcaggtt 70320
aaatcctgtg tgttacttaa aagcccttgt agaaacaaga tttcattaaa gaaactgaat 70380
ttttcatttt gggggtggtt aatcttttaa ttattaaagt aactggaaac ttgagatact 70440
tttgccttca ttaaacactg atacttggtt tatgtgatat ttgactttat aacaacaagc 70500
aacttgaata tttatggcag atataatgaa attccagcaa aatgttatat tcttctggtt 70560
ggtggcttta ttctcattaa gctattttta ctgcatattt gtagaaccta agttcaaaga 70620
ctgatcagaa acttgtgtta tgtactaagt taaaatgtaa aatagaaaca accacagact 70680
ccattttttg tctggtttaa tcacatagta ttggacataa gcagatactg taagttgatg 70740
cataatataa gaagatcgac tgtcttttca ttatgtttct catgtgtgaa catatttact 70800
agcactttca tttctctgat tactagccaa tataagaatg taaattagat cggaccattg 70860
gtgtcagaat aaaggtttat ttaaaaagat tttttccaaa tctttaaata gcattaaaat 70920
attcttaatg cacagaaaca ttagggcact cagagccaaa atacgcaatg tttgggaaac 70980
tcagcccatt agaacatgtc ctgcttcaga cgccagactt tgggaacact ggatttgcca 71040
gggtcacttt ggcagtgatc agtgatttag gtgaagtaaa agttatttca gatgtttaag 71100
attaggaaaa tttccctttc taatcacagt gagctttcac caacttaaat ctggagttca 71160
aaaagaaaag tagttcaatc agatttcccc atgccttcac agcctgcatg ccgccttccc 71220
tgcctgcttc ctggctgtga tgagacgggt aactgggagg gaaatgtatt gtcctttgga 71280
ttgtgtcttt cctaccactg cttttttttt ttttaagttt tgtgtcttta gttttagaat 71340
acatacttta tctgagggtg gatctttttt tatcacagag atgagttttt ctggacacac 71400
ttttttgtgg agtctttgac agtgcagttt gtggctagga aggatttttt ttctgttaat 71460
ttatctggtg tgatattgtc ctcaggctct caattctaag gcattttctg cccctattcc 71520
agataggata ttggaaacat ctttatcctt caggtactca ggatcagaaa agcatgctgc 71580
ccattccaag gggttaattt ctgcagaaat ggtcttggca ttctgagaat cttttttaat 71640
tggtgcattt agaccatcgg catatgaagt gattactgat aaagttggat taataaatac 71700
ataccacaca tgctactggt ttttttttct ttttttgaga cgcagttttg ctcttgttgc 71760
ccagactgga gtgcaatggc acaatctcgg ttcactgcag cctctgcctc ccaggttcaa 71820
gtggttctcc ccactcagcc ttccgagtag ttgggattac aggtgcctgc caccactcct 71880
ggctaatttt gcatttttag tagagatggg gtttcacagt gttgaccagg ctggtctcga 71940
actcctgacc tcaagtgatc gcccacctcg gcgtcccaaa gtgctgagat tacaggcgtg 72000
agccaccgca cccagcccaa agtgattgta tcttaagtct gtaaatatgt gtaattataa 72060
tcttaaagca tgtattcatt tacagaaaac ttccaatgac tttgacattc ctatagacat 72120
ataggctatt tgcaattgcc tttcagcaca aggtcaggca taaatactta agctggttgc 72180
tggtattacc acatatttat tagcatattc ccagtattga tgatgacagt taacccccca 72240
gagtaaatat ctagtttggc aattcagaac taatgttgta agatctctag ctggtaattt 72300
gatattacta ataaagtatt aaatgtaaat gataaacttt taacaaatta cagaggattt 72360
gaagtttaat tgcattgctt aaagctttct tcagtgagag aaatgggtag agctagggtt 72420
ctaggcattg tgtggggggc atggctccta gtggcagtga ctcatgggtt ggtgcaacgt 72480
gagcacagaa ttagaaagaa agatgaaaca gtaccaggcc tcaaaatgag agctcctttg 72540
aggttatagt ttagtgaaat gtaattcctt ggcttcacca gtcagcatta atgacctgag 72600
gcaggtgact caggagtgct ggctcccttg tgtgtcacag ggaggacaga gacgagtgag 72660
tttgctgaac ctatataggc atgagtgagt ttgctgaaca taggcacgag tgagtctgct 72720
gatcatagcc atgaatgagt ctgtcgaaca tagccatgag tgagtttgct gaacatagcc 72780
atggcaaaat gacattgttg ggtttgtggg gtttttttaa ttcactagca ttaaatatct 72840
cttttatttc tctctctgcc gagtgctttc cttgttgacg tattctgaat ttgttgcata 72900
ttctgggaag tggtccagtg agacttgatt tttggtgtca tcttatttgt tgacattgtt 72960
gagtgttgtc cagctataag gccaagttac ataactaggt ctcagtcaag agtggaaact 73020
tcaaaaattg accagtgtaa attctggaga caatttaaca tttttgtggg gtactttgtt 73080
gaacacacat ctttataagg ggtcacagca tagtcaaccc agacttgcct aggttaaaat 73140
tctgtctcta ctatttgtta ggtgcatatc cttgggcgag ttacctaatt attctcccca 73200
catcttccgt aaaaagggtg taataatggt aatattagta ttagtgctta tctcctaagg 73260
ttattgtgag gattaagagc tagcacattt gaagtgttag aatatggcat ggagagtagc 73320
aagtactcca tgtcttcact ataaaagatt tggattgagt aacaaaacaa acaagggaac 73380
aaagaaaata gacagtcatc taagtgaaga catccttaat tactcctgtg ttccattata 73440
ttgtagtttc ttgattgttg gcacagtatt ctttcgggga catggtttgc gccctcttag 73500
ggctcaggat tttcagttct accccactac tcatgaagtc cagagacctc tttcccggag 73560
gtctatttcc tttccagcct catctctcct actcaagctt tgcgtgtttt ccatcctcta 73620
gacaaattgt accaaactgt actactaact gttctccaaa cacaacaaac tgtagaattt 73680
cacattttct aaatcttctg taaatcaact attataaaac aaaaaagcca gccgtggtag 73740
ttctctccta tagtcccagc tactcaggaa tctgagacag gaggactgct tgagcccagg 73800
agtttgaggc tacagtgagc tgtgatcaca ccattgcatt ctggcctggg caacagagta 73860
agaccccatc tctaaaaaaa ttaaaaacat aaaaagaggt acattgatta tgcagctaag 73920
taaaatagcc atatctggga acggtgaagt gtggaaaatg cttttttttt tgaaacagag 73980
tttcactgtt gttgcccagg ctggattgca gtggcgtgat ctcggctcac tgcaacctcc 74040
gcctcccaga ttcatgcaat tctcctgcct cagcctccca agtagctggg attacaggct 74100
tgcaccacca tgcctggcta attttgtatt tttagtagag acagggtttc tccatgacac 74160
cgagtctcat ctttcaccca ggctagagta cagtggcaca atctcagctc actacaacct 74220
cggcctcccg ggttcaagca attcttctac ctcagcctcc caagtaactg ggattacagg 74280
catgtgccac cacacccagc taatttttgt atttttggta gagatggggt ttcaccatgt 74340
tgcccaggct ggtctcaaac tcctgacctc aagtgatctg cccacctcag cctcccaaag 74400
tgctgagatt acaggcatga gccactgtgc caggcgtgcc tttttctttt taatacctct 74460
ggtacatgat gacaatgaga caaattagaa actagtttat ccattgtatg aatggatttc 74520
ccagagattt tttaaagatc tgaatacaag cattgctttt aacagtacca tattgcacaa 74580
gagtaactcc agggaatgaa tattccataa gttctaaaaa actttaagtt gcaatgttac 74640
atctctgtcc aaaatcatta gactcctcgg gcaataagta gagtattcct tatttattag 74700
atccaagact ccttgcgtcc ttgataggat cttcaaagaa ggccatccct gtccatacca 74760
agtcatttgg gccagtgtca gtcataggta atcaaaacca ttggctccca ctgcttctgc 74820
ctctaccact tgccactggc agatacatag atggggatca tgtttcatcc tttcaaggac 74880
ttgagagact atagtcccag tgcataggtt atatatgcgt ttttcttctc tggcatgtac 74940
aattgtcact gctttcatct gcaggggccc agatacactc ttcttcctct acctttgtcc 75000
ctaggaatgg tgacaagtga gagcacagga aacatatttt ctagacatga tgctgggcgc 75060
ttcacatgcc atctcattaa tcacaactgt ctcccagggt agatgatgac atcctctttc 75120
atagaagaaa ctgaaatttg tcttcatctt ggtccgaatc ctggtttgtg ttgccatcta 75180
ctcctgaagg ccatgctaga ggcatgctgg agggtgtttc tctagcccag tggtgggcta 75240
gccagctgcc tggagctgct agcgtacctg atagacacaa ccaaattaaa gtcctttagc 75300
atcacaagga ccagcttgga gatctcaccg ttagttctcc cctagactga acagtggcaa 75360
ggagcaagaa ggttccagat cacattcaag caccactgtg gtgactactc cagtgttaca 75420
tacctctgga ttagaagtgg attaagattc aagcaaaatc taccttggct gaaatctttt 75480
taaaaatttt tgtgtttttt gtgcagtgct actttatttt ttattttgtt tttttgtctg 75540
ttggttggtt ggttcttttg agacggagtc tcgctctgtc gcccaggagt gcagtggtgt 75600
gatctcagct cactgcaacc tccgcctcct ggggtcaagt gattctccta cctcagcctc 75660
ccgagtagct gggactatag gcgtgtgcca ccacacccag ctaattattt tgtattttta 75720
gtagagatgg ggtttcacca tgttagctag gatggtctcg atctcctgac ctcttgatcc 75780
acctgcctca gcctcccaaa gtgttgggat tacaggcgtg agccaccgca tgccccggcc 75840
tttgttttta attgacactt agtaattgta catatttatg gggttcagtg tgatattttg 75900
atacatttat gtaatgacca aattagacta gcacgtctat cacctcatac atttatcttt 75960
tctttgtggt gaaaacgttc aaaatcctct cttccagcta ttttgaaatc tctatttaat 76020
tatatattat tatgtgctaa tatatttcat agtacttgaa atatatataa gtatatataa 76080
gtatttcgaa atagccagaa gagaggattt tatgtgtata taaaatgtgt atgtatataa 76140
atttttttcg agatagggtc tcattctctt gttcatgctg gtgtacagtg gcacgatcat 76200
ggctcgctca ctgtagcctc cgcctcctgg gctcaagtga tcctcctgcc ctagtctctt 76260
aagtaattgg gactgcaggc gcgtgccacc acatatggct aatttttaaa tttttgtaga 76320
gactgggtct caccatgttg cccaggctga tctcaaactc ctgggctcaa gcgatctgcc 76380
cgccctagcc tcccaaactg ctagaattgc aggcatgagc caccacaccc tgtctgaaat 76440
attaaatatt attaaccata gtcattctgt gcagtaaaac accagaactc atccccctgt 76500
tgaactgttg ttcagtttct cactatgccc cctcttccct actctgcgaa gcctccagta 76560
ggtactattc tactctctgc ttctatgaga ttaacatttt tagattccac atatgagtga 76620
gaacatacag tatttgtctt tgtgtacttg gcttaatgtc ctccagtttc atccattttg 76680
ccacaaaaga caggatttct ttttttttta atggccaaat agtattatat tatatatata 76740
tatatatatt tttttttttt tttttttcca cattttcttt ctccctccat tcattgatgg 76800
acatttaggt tgattccgta tcttgactac tgtgaatagt gctgcaataa gcacaggagt 76860
gccgatatgc ctttgaaatc ctaatttcat ttcctttgga taaataccca gtagtgggat 76920
tgctggatca tatgatagtt ctatttttaa tcttttaagg aacctttatg ctgttttcca 76980
agatggctgt actaatttac attccaccag ccgtgtacaa gagttcccct ttctccacat 77040
tcatgccagc atttattttt tgtctttttg ataatagtca ttctaattgg ggtgtggtga 77100
tatctcagtg tggtattgat ttgcattatt ctgatgatta gtgatattga ccattttctc 77160
atgtatctgt tggctctttg tatgtctttt aagaaatggc tattcaggtc ttttacctat 77220
ttttaattgg attacttgtg ttttctgcta ttgaattttg tttgagtttc ttatatattc 77280
tggatattaa tccctgtcaa atgtatagtt tgcagatatt ttcttccatt ctgtagattg 77340
tctcttcagt ctatcgattg cttcctttgc tatacagaag ctttttagtt tgatgtaatc 77400
ccatttgtct gtttttgctt ttgaggtctt atacaaaaga cccttccctt gcccagacca 77460
atgtcctgaa gtgtttccct atcttttctt ctagtatgta tatttgtttg gggtctcata 77520
tttaagtctt tagtccattt tgagttgatt ttttaatatg gtgagagata ggggtctagt 77580
ttcattcttg ggcatctaga tatccagtgt tcccaacacc atttatcaaa gagactgtcc 77640
ttcaccagtg tatattcttg gcatctttgt caaaaataaa ttggctgtaa atacgtagat 77700
ttatttccat gctctgtctt ctgttttatt ggtctttata cctgttctta tgatagtagc 77760
atgctatttt ggttactata gctttgtagt atattttgag gtcaggtagt gtgatgcccc 77820
cagctttttg ctcaaaattg ctttggcttt tggggtcttt tatgatttca tacaaatttt 77880
aggattattt attctgtttc tgtgaagaat atcattggta ttttcattga attgcattga 77940
atctgtagat cactttatgt agtatggaca ttttaacagt attaatttta atccatgaac 78000
ataggctatc tttccatttg tgtcctcttc aactttttcc attaatgttt tataattttc 78060
attatagaga tctttcacct ccttggttaa atttattcct aggtaatttt tttgaaaatg 78120
gaattgcttt cttgatttct tttttcagat agtttgttag tgatgtataa aattctactg 78180
atttttattt gttgattttg tatcctgcaa ctttactgat tttttttatt agttataaca 78240
gttttttggt agagtctata gggttttcta tacataagat tatgtcttct gcaaacagag 78300
acaatttgac ttcctccttt ccaatttgaa taccctttct cttagctaat tgctctggct 78360
aggacttaca gtattatgct gaataaaagt gttgaaagtg ggcatcctag cccggtgcgg 78420
tggctcatgc ctgtaatccc agcactttgg ggggctgaga tgggcagatc atgaggtcaa 78480
gagattgaga ccaccctggc caacatggtg aaactctgcc tctactaaaa atacaaaaat 78540
tagctgggta tgctggcacg cgcctgtagt cccagctact cgggaggctg aggcaggaga 78600
atcgcttgaa cctgggaggc agaggttgca gatcatgcca ctgcactcca gcctggtgac 78660
agagcaagac tccatctcaa aaaaaaaaaa aaaaaagaaa ggaggcatct ttgtcttgtt 78720
ccagatctta agaggaaaag ctttcaactt tttcatgttc agtatgatat taactatggg 78780
tttgtcataa cgtggctttg tgttgaggca caatttcctc catacttaat ttgttgagag 78840
tttttatcat gaaggtatgt tgaatttttt tttttttttg agacagagtc ttgctctgtt 78900
gcccaggctg gagtgcagtg gtgcaatctc ggctcactgc tacctccgcc ttctgggttc 78960
aagcgattct catgcctcag ccacctgagt ggctgggatt acaggcatgc accaccacac 79020
ccagctattt tttgtattta tagtagagat ggggtttcac catgttggcc agaccagtcc 79080
caaacgcctg acctcaagtg attcacccac ctcagcctcc caaagtgctg ggattacagg 79140
catgaaccac cacgcccagc cgctatgttg aattttatca aatggttttt ctgcatctgt 79200
tgaaatgatc atatggttct tgtccttgat tctgttgatt tttgagagat catgtttatt 79260
gatttacata tgttgaacca tcctttcatc ccttggatga atcccacttg gtcatggtaa 79320
atgatgtttt taatatactg ttgaattcaa tttgctatta tttcattcag gatttttgca 79380
tccatattca tcaaggatat tggcctgtag ttttcttttt tgttgtgtcc ttgtctggtt 79440
ttggtatcag ggtaatgctg gccttacaga atgattttgg aagatttccc tcttcagttt 79500
tttgaatagt gtgaaaggaa ttagtattat ttaaatgttt gttagaattc agccatgaag 79560
ccatcaagtc cgggcttttc tttgatggga gactttttat tactgattta atctcactct 79620
ttattggtca gttcaggttt tctatgtctt catggttccg ttttgatagt tcgtgtgtgt 79680
ctaagaattt agccatttcc tctaggcttt tcaatttgtt ggcatacagt tgtttataat 79740
agtctcttac aatactttgt ttatggtatt agttgtaata tctccttttt catctctgat 79800
ttgagtcttt tttttttctt agtctgctat aggtttgttg attttgtttg ccttttcaaa 79860
aaaatgatcc ttggttttgt tgatctttcg tttctttttt ttggtcactt tatttccatt 79920
cttctggtct ttattatttt ctttgttctg ctaattttgg gtttagttta ttattttcta 79980
gttccttgag gtacatcagg ttgtttattt gagaactttc tttttctttt tttttttttt 80040
ttttttgaga cagtttcact ctgaccccta gactggagtg cagtggcatg attttggctc 80100
agtgcaacct ccgcctcccg ggttcaagtg attcttatgc ctcagcttcc caaatacttg 80160
gaattacagg tgcccaccac cactcctggc taatttatgg tagagatggc atttcaccat 80220
gttggccagg ctggtctcaa actcctcacc tcaggtgatc ctccagcctc tacctcccaa 80280
agttcttggg tgtgagccac ccacctggcc tgattgtgat ttttttcttt ttttaatttg 80340
ttgagacttg tttttgtggc ctaacatatg gtccatcatg gagaatgttc catgtgctga 80400
tgagaaaaat gtgtattctg tggctgttgg agggaatgtt ctgtaaatgt gtgttaggtc 80460
catttggcct agagtgcagt ttaaatccaa tgtttttttg ttgattttat gtctggatga 80520
tctgtccatt gctgaaagtg ggatgtagcg ttctcctgct attattgtat tgcagtctat 80580
gtctcccttt agatgtaata atacttgctt tatatatttg tgtgcaccag tgttgtgtgc 80640
atagatattt aaaatcatta catcctcctg ctgaactgac ccctttgacc tttgtttctt 80700
tttacaattt ttgacctaaa gtctatttta tcaaaatata gctactcctc ttctcttttt 80760
ggttttaatt tgcatggagt atcatttctc atcccttcac tttcagtctt agtgtgtcct 80820
tacaggtgaa gtgagtgtct tgtaggcaac atagagttgg attttgtttt ttgttttttc 80880
atccattcag ccactgtatc ttttcattga agtatttaat ctatttacat tcaagggtat 80940
tattgataga taaggactta cacctgccat tttgttaatt gttttctgtt tgcttttcat 81000
attctttatt cctttctttc tctcttattg tttacctttg tggtttggtg attttctata 81060
gtgataagct ttgatttatt tctctttctc atttgtgtgt ctgctgtagt tacttttttt 81120
ctttgtggtt actctggggc ttacattaaa catcttagag tgttttaagc tgataataac 81180
ttaaccttgg tctcataaaa tatttttggc ttttaccctc cccccacaac ttataatttt 81240
gttgcttaat ttacatcttt ttatattgtg tggtccttaa caacttgtag ctgtagttac 81300
cattaaccat tttttacttt taaccttcat aatggagatt tgaaagatta tattccacag 81360
ttacagcaat ggagttttct gaatttggta attaatttac ctctgtcagt gagattatat 81420
tttcatatat tttcatgata gtaattatac ttttgcttcc agtcaaagca gctcccttaa 81480
gcatttcttg taaggctagt ctagtggtaa taaattcttg cagcttttgc ttgtctggga 81540
aagactccat ttttctttca tttctgaaag atagctttgc tagtagttgt tatctttcag 81600
cactttgaat atattatccc attctctaca gtctgttctt tcttggcgtg tacaggtttt 81660
ctgagaaatc tgttaatagc aacctgccag gttcccttac atgtgacttg atccttttct 81720
cttgctgctt ttagaattct ctatgtctga cttttgatgg ctttattata atgtaccttg 81780
gagagaggac ctctttgcat tgaatgtgtt cagtgtgctg tcgagtttca tggatctggc 81840
taccaatatt aaaattatat tactgtgact aatagttgag tgtggtccca gtatagtttg 81900
tctcaaatag gtaaaagtcc acaagatttt attaagatta ttatattcaa ctatatactc 81960
atgtacataa atactaaatg ctttattata aaattttgaa attaaaataa gcatagttgt 82020
tacaagctac agtatggcaa aatgcctttt tctttttcac tcatctttta gcatcattgg 82080
gttttcttaa cttgaatata ggattttaat tcataaattt ttttatttaa ggaaaataaa 82140
tttttaatgt ttgcatttgt ttttcatttc tcttccctac ctagaaacga tggaaagaac 82200
tttctaagga agacttatct cctgcctttg atcattcacc aaacaaaata atgactgaaa 82260
aatacaatgg gaacagaata ggtctagaag aagaaaaact gacaggtgac cgatgtacag 82320
gactttcctc taaaatgcaa gatacaatgg aggagaacag tgagaggtaa gctttctata 82380
actacaggct gaaagatgag gcttttttat tttaaaaata aattttatgg gaccaggtgc 82440
cataggattt caggtatgta atttttatat taggaaaata caatcacgcc tgtaatctca 82500
acactttggg aggccaagga gggaagatca cttgagtcta ggagtttgaa accagcctgg 82560
gcaacatagt gagaccttat ctctacagaa aataaacaaa attagccagg tgtggtgatg 82620
cgagcctgtg gtcccagcca ctcgggagac tgaagtggga ggatcacttg agctggggag 82680
gtcgaggttg cagtgagctg acataccacc actgcactcc cacctgggtg acaaagcaag 82740
accctgtctc ataaataata ataataaata aataattatg tggatatgat atatgaaata 82800
atataggccc ttttttttat tgaattaata taaccttttt ttttctctgt cacccaggct 82860
agagtgcggt ggcacaacct tagctgctcc acctcctggg ttcaagcaat tctcctgcct 82920
cagccctccc atgtagctgg gattacaggc gcccaccacc atgtccagct aatttttgta 82980
tttttagtag agagagggtt tcaccatgtt aacaaggctg gtcttgaact cctgacctca 83040
ggtcatccac ccgcctcagc ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag ccaccgtgcc 83100
cagccaaatt aatataacct ttatttctta cctgagggta tttagtatat gatgacaaag 83160
gtgttcttaa ggagctttca gccaatactt agaaaccagt tcaaaaatcc tttaaaacaa 83220
taatgattga gtgtaaaagt taatataatt gggtgctaaa atatatggta tggtacagaa 83280
aataagtagt atgaatacct gccatttgta ctataattat aatgtaactg ataatatgcc 83340
tttaataaaa catttaaaca tgtaagctta attgcattac tggagaaaga aaaaggcgtt 83400
ttttaaaaat ccatatgaat gtggcatcta ttcagaattt taaattacaa ttacatttct 83460
aagactgtct ctcacagatt aggaagctga taacctggta taagtcacat agcaaagtga 83520
atgaggtttt tctttcctct ctcctgcatc tctgaataac ttttcttctt ctctttttgc 83580
caaatatact tcttatcatg gggaatttta tcttgtggtt atatttgtta gattggaatg 83640
aaaatagtcg aagtctgcca tacattatag ctttactgct gtattttcct aatataaaaa 83700
ttaaatacct gaaattttat aaatgctaac atattccaat atataataca tgtattatta 83760
tatattatag tggaagagtt tattatgatt tagtaatgtt attcccaatt tttgacttca 83820
gtagttttag actgcaagag aaagcataat ttttttggtt ccttttttca tcttaaatag 83880
aatatcttta aatcaggaaa taatagtttt aagttacctt agctttttca ataataaggc 83940
tttcagattc ctagtgttac tgctttttcc ccccttttat ctagtactat ctgcagaatt 84000
aaatgaaaaa caggcttgat gactgaaatg gcattcttag tatttcagaa gtgttgagtt 84060
ttaatctaca aagattcaga acaaccatgt taatcctagt gagttaaatc actcatacaa 84120
gcttgcaaat acagaggaga ctactaaaac cactctagag tctataactc taaggagtta 84180
tagagtgatt gcagaagact gttttatggg gtctgtgtgt gtgtttatgt gcctgtacat 84240
gttttcgcat gtggtggcgg tgttttcttc tttccctttt ttccttccct gtctgataaa 84300
tgagactggt gcatgtttga aagcagagag tcccaacaga aaagtcagaa ttctaagcgg 84360
agaagtctga ttacaaaaac aaggttacag aaatgaaaaa gaggaggccg ggcgtggtgg 84420
ctcacgcttg taatctcagt gctgtgggag gtcaaggcag gtggatcact tgaggtcagg 84480
agtttgagac cagcctggcc aacatggtga aaccccgtct ctgctgaaaa tacaaaaatt 84540
aaccaggcac tgagagtgag aaacaacttg gacatacgaa ttttaaaata caaaaattaa 84600
agaggcatta acgcctgttg tcccagcttc ttgggaggct gaggtgggag aattgcttga 84660
acccaggagg ttgcagtgag ccgagatcat aacactgcac tccagactgg gcaacagagc 84720
aagactctta tctcaaaaaa aaaaaaatgt aaaagaagag cataggatca gggtgtgaag 84780
taaaggttac tctgaacagt tttatttttt aatcagtccc agtaattttt aatacctata 84840
gatagctttg cattaaagat cctcataaaa gtcttatcaa aagaatttca agtttctttt 84900
ttttcttttt ttttttcctg agacggagtc ttgctctgtc acccaggctg aagtgcagtg 84960
gcgcagtctt ggctcactgc aacctccacc tcccgggttc aagcaattct cctgccttag 85020
cctcccaagt agctgggatt acaggccccc gccactacac ccagctaatt tttgtatttt 85080
tagtagaggc agggtttcac catgttggcc aggctggtct cgaactcctg accttgtgat 85140
cctcccgcct cagcctccca aagtgctggg attacagaca tgagccacca cacctggcca 85200
gaatttcaac tttcaaaaga aatagaacac agtactttct tgtattcatt ttcattgtat 85260
tcatttggag gatattcatc ctccaaagca gtgtttttca aattgaaggt caaatcacat 85320
agtcgtgaag tttattggat tataaacatt ttttaaagaa gaaaatagaa taaaatagaa 85380
attatcagca tatcacaaat aataacatga atttaacaga tgctggcgag gttgtggaga 85440
aaaaggaatg cttaaacact gttggtggga gtataaatta gttcaactat tgtggaagac 85500
agtgtggtga ttcctcaaag acctaaaaac agaaatacca ttcaacccag caatcccatt 85560
actgggtata cacccaaaag aatataaatc attgtactgt aaagatgtaa acacacgcgt 85620
atgttgattg cagcactatt caccatagaa aagacatgga atcaatctaa atgcctatca 85680
atgatagact gcataaagaa aatgtacata tacagcatgg aatactatgc atccataata 85740
aagaatgaga tcatgtcctt tgtaggggct tggatggagc tggaggccat tatccttagc 85800
aaaactaatg gaggaacaga aaaccaaata ccccatgttc ttactaacaa ttgagagcta 85860
aatgatgaga acacatggac acatagaggg gaacaacact gggggcctgt cggaggatgg 85920
agggtgggag gagggggaca atcaggaaaa ataactaatg ggtactaggc ttaatacctg 85980
ggtgatgaaa taatctgtac aacaaaactt gttgtacatg tcacggagat gacacaagtt 86040
tcaagcttat gtaacaagcc tgcacatgga cgtacccctg aacttgaatt ttaacctgtt 86100
tttatatatg tatgtgtgat gtataaattc catatattta catatacatt gtgtacctat 86160
gtaagtgtgt gtgtgaggtt actctgttgt gatgctattt cttactgtag gttgcagtct 86220
gaatttgaaa ggcagtattc tcaattacag ttcaacccag aaacccagat cactgagagt 86280
gagaaacaac ttggacatac gaaaagtctg gagcaggcag agtggctcat gcctgtaatc 86340
ccaacactcg gggaggctga ggcgggtgga tcacttgagc ctagcagttc aagaccagcc 86400
tgcgcaacat ggcaaaccct gtctctacaa aaaatacaaa aatccgccaa atgtggtggg 86460
acctgcctgt agtcttaagg gaggctgagg tgggaggatt gcttgagccc aagaggttga 86520
ggctacaggg agctatgatc acgccacatg atcttccctg ggcaagggtc cacaggaggc 86580
attcccattg gttaatatcc taaattgcat aaatatacgg gaaaacctgg gcaggtccca 86640
tttggcaagt cattacacag acataatttc tttaggcccc actaaggaag aaaagatttt 86700
atcacaaatc gagagtagtc ttgtcattct ctggaattgt gttcttaaat tagatacagg 86760
catgccttgg tatttgtctc tagtccattc ctgaattata tagtgcactt ttggaaagca 86820
aaaacctctg ttccattctt ttaaatgaga aaaatagtgt gttgtcagcc caaccagaaa 86880
gcataaccag ttcccccaaa tatagtacaa aaccttttaa actcctatgt agcatttaaa 86940
gcactaatta tgtaatcata taacacttaa gggactcatt attgggcttg tatggtaaat 87000
gacaaaatac tagatacaaa ttataattgc cttctatacc gcaatgaaaa taaaaaatga 87060
aataatacgt taaagattat atctaaattg gaaccttgtt aacgataccc ccaggctcct 87120
ggcaaaagct aataaagggc ccatgggagg ctaaccccct ctctgttttt atacatattt 87180
tgcctacact tgaacacaaa tgttttcact aacaggtaca tgcatatttg tgatagtgaa 87240
ttttcaattc agagagtgaa ttctgagtaa gaatttttgc aagtcattat agcagatatt 87300
cagatggagt tcagacagcc agggatacct gtatatatga taacaaaaag tgaaaaagac 87360
atgagaaagc accataagat gaacaaagat agcaaaaccc agtctgtcct caagttgcag 87420
aatatgtgat gaagataaaa caagtaccca agttagcaca ttattagtaa attataaatt 87480
acttcaaatt aaatgccgta agaatagaag ggctagaggg ggtggagcaa gataattgaa 87540
gagtagaact gaaatgagag gacaggagag aagggaaggt ttctatttta gtggggaaca 87600
aatttggaga acagcaaaaa aacggcaaga acaaagttct gcatagcagg agaatattgg 87660
caagcgtttg catggacatg tgttctcagt tctcttgggt acatatctag gagtggaatt 87720
gctaggtcat atggtaactc tatgtttaac tttttgagga gctgtcaaac tgttttctgt 87780
ggcagctgaa ccattttaca ttcccactaa caatctcttg gggagagaag gttccagtac 87840
accaaagaag tgtaacattg attaaaatat tctaatacat agttcaattc agatttctct 87900
tgtctgaaag attcaccata tagctttttt aataaagttt tatggaaata taatttatat 87960
agcataaagt ttactcattt aaagtataca attcagtgac ttttaatata tttaccaaat 88020
tgtgtagctg gcaccacgat ctaattttag aacattttcc tgatcccaac ttctgtagct 88080
gtttaaaaaa tatttcaaga ttaatcaaag attgatacta tatttagttg atgtgattct 88140
ttggtctcct ttaatctgga actgttccct gcctttttct tccttgcttg acatttgtat 88200
ttttgaagct tctaggccag atatctttta gaatgcccca tacaatgcat ttctttaatc 88260
attatttatc atagttaaat tcaggttaaa cgtcttggcc aggaaaaagg tagtctcaat 88320
gtaggagaca ttgaagaggc atttgagatt tttaagcacc atcgtgcact aggcccggta 88380
acgaaaaaaa aaaaaaaaga ttttaaatca agctacgtgt ccaggggtat gctctagaaa 88440
aattaccatg gcaataatat ttaatttgag ggcagggaag ctggttaggc ctttgctgta 88500
atacagaaaa gtgaaaagag ggaatggaag aaatagtaac ctatatgttg ccattggccg 88560
tttttttgtt tttgtgggtg tgcttttata gagaggcaag acttgctata ttgcacaagc 88620
tggacttgaa ttcctgggct taagccgtcc tcctgagtag ctggatggca ttattattta 88680
tatagaacca gaactaagta tcttgagagt cagagacctt ccactgaaac aaaatttctg 88740
agaccggaca cagtggctca tgcctgtaat cccagcactt tgggaggctg aggtgggcgg 88800
atcacttgag atcaggagtt caagaccagc ctggctaaca tggtgaaaca tcatctcact 88860
aaaaatacaa aaaaattagc caggcgtggt ggtgcacgtc tgtaatccca gctacttggg 88920
aggctgaggc agaagaattg cttgaacccg gaaggcgggg gttgcagtga gccaagatcg 88980
tgccactgca ctcccgcctg ggcaacagaa caagactcca tccaccccgc ctcccccacc 89040
accccaaaaa aatttctgta ttgactatga aaatgggagg tagaaatgtg tatggtcaaa 89100
taaaagaata agtgctccca caacagaata ttcatggaaa tattaaatag ctagctttta 89160
taagagcctt aaccatcaaa cgtgaccagg aaatgggatc agatgcaagt ggtaccccct 89220
tgtcttccca ctcctgctcc tgctgactag ttaacaagga aggaaagaaa actaacagtc 89280
atcaattcac gtgtcaagaa agtaccttgc ttattttcag gtcccactaa aagcagttat 89340
caatataaaa ctgtaccagg aatggttgtc aaggtacatc tctgaatcat taaagaatat 89400
tgaggctttt cttggccggg cgccgtggct cacacctgta atctcaggac tttgggaggc 89460
caaggcgggt gaattgcttg aggtcaggag ttcaagacca gcctggccaa catggcaaaa 89520
ccctgtctct actaaaaata caaaaaatta gctgggcata gtggtgcacg cctgcagtct 89580
cagttacttg ggaggctgag gcacgagaat cacttgagcg tgggaggcag aggttgcagt 89640
gaaccaagat tgtaccactg cactccaggc tgggtgacag agcaagacgc tgtctcaaaa 89700
gaatattgag gcttttcccc tcattattcc agtgttcaaa tagggtgaaa actatgtgga 89760
tggttttatt tgcgcctagg tcctctgtgt tagagtactc aagtcctgct ctgtgtgcac 89820
ttcctttcac ttgtttttat ttcctcatag tgctctacgg aaacgtattc gagaggacag 89880
aaaggccacc acagctcaga aggtgcagca gatgaaacag aggctaaatg agaatgaacg 89940
aaaaagaaaa aggtggttat attggcaacc tattctcact aagatggggt ttatgtcagt 90000
cattttggtt ggcgcttttg ttggctggac actgtttttt cagcaaaatg ccctataaac 90060
aattaatttt gcccagcaag cttctgcact agtaactgac agtgctacat taatcatagg 90120
ggtttgtctg cagcaaacgc ctcatatccc aaaaacggtg cagtagaata gacatcaacc 90180
agataagtga tatttacagt cacaagccca acatctcagg actcttgact gcaggttcct 90240
ctgaacccca aactgtaaat ggctgtctaa aataaagaca ttcatgtttg ttaaaaactg 90300
gtaaattttg caactgtatt catacatgtc aaacacagta tttcacctga ccaacattga 90360
gatatccttt atcacaggat ttgtttttgg aggctatctg gattttaacc tgcacttgat 90420
ataagcaata aatattgtgg ttttatctac gttattggaa agaaaatgac atttaaataa 90480
tgtgtgtaat gtataatgta ctattgacat gggcatcaac acttttattc ttaagcattt 90540
cagggtaaat atattttata agtatctatt taatcttttg tagttaactg tactttttaa 90600
gagctcaatt tgaaaaatct gttactaaaa aaataaattg tatgtcgatt gaattgtact 90660
ggatacattt tccatttttc taaagagaag tttgatatga gcagttagaa gttggaataa 90720
gcaatttcta ctatatattg catttctttt atgttttaca gttttcccca ttttaaaaag 90780
aaaagcaaac aaagaaacaa aagtttttcc taaaaatatc tttgaaggaa aattctcctt 90840
actgggatag tcaggtaaac agttggtcaa gactttgtaa agaaattggt ttctgtaaat 90900
cccattattg atatgtttat ttttcatgaa aatttcaatg tagttggggt agattatgat 90960
ttaggaagca aaagtaagaa gcagcatttt atgattcata atttcagttt actagactga 91020
agttttgaag taaacacttt tcagtttctt tctacttcaa taaatagtat gattatatgc 91080
aaaccttaca ttgtcatttt aacttaatga atatttttta aagcaaactg tttaatgaat 91140
ttaactgctc atttgaatgc tagctttcct cagatttcaa cattccattc agtgtttaat 91200
ttgtcttact taaacttgaa attgttgtta caaatttaat tgctaggagg catggatagc 91260
atacattatt atggatagca taccttattt cagtggtttt caaactatgc tcattggatg 91320
tccaggtggg tcaagaggtt actttcaacc acagcatctc tgccttgtct ctttatatgc 91380
cacataagat ttctgcataa ggcttaagta ttttaaaggg ggcagttatc atttaaaaac 91440
agtttggtcg ggcgcggtgg ctcatgcctg taatcccagc actttgggag gctgaagtgg 91500
gcagatcacc tgaggtcagg agttcaagac cagcctggcc aacgtggtga aacaccatct 91560
ctactaaaaa tgcaaaaatt agctgggcat ggtggagggc acctgtaatc tcagctactc 91620
aggaggctga ggtaggagaa ttgcttgaac ccaggagatg gaggttgcag tgagctgaga 91680
tcacgtcact gcactccagc cagggcgaca gagcgagact ccatctcaaa agaaacaaac 91740
aaaaaaaaca gtttgggccg ggtgtggtgg ctcacgcttg taatcccagc acttcggaag 91800
gccaaggcgg gcggatcacg aggtcaagag atggagactg tcctggccaa catggtgaaa 91860
tcccttcttt actaaaaata caaaaattat ctgggcgtgg tggtgcatgc ctgtagtccc 91920
agctccttgg gaggctaagg caggagaatc acttgaaccc gggaggcaga ggttgcagtg 91980
agccgagatt gcaccactgc actccagcct ggcaacagag caagacttcg tctcaaaaaa 92040
aaaaaaaaaa aaagtttgaa aaccattggt atagatagat attttgaatt gatttgcata 92100
gtctccttga atgtgttaaa ttatgttgaa agtatgaaag caggatgtag gtggtactac 92160
atattaaata agatttatat aacatgtgcc tgtgtcctga ttcagtatta ctgtgtcctg 92220
taaccttgaa atggagagga ggtaagaggg acattttttt atgtctgtct gcattaaacc 92280
tgtgttgagg catccaagac ccttacattt caggttgtta ttggtttaaa acctctttcc 92340
agtttgcatt ggtttgtctt tgctaaatgc agtatgttta tgttactctg caagtcacat 92400
acaggtagac cttatgacat ttccagttga aactaggctt gctttcggta cacaggtgaa 92460
gacttgagga agccagtgcc agagaggacg tgcctcaccc ctcagctggc tgaatgcgct 92520
tcattggctt acgctttgct ttctgtatgc tttctgtcct tctgggtggt gtcgcatata 92580
tttttaaaac cacattcagt gtgatgaaca cttgttggta cacttctaag gttagtcatc 92640
tttccttctc tgagcagatc cttgagaagg gcattgacag tggatgcttt aaatagtgtt 92700
cagtttttac cagtaataat attttttggt ggatgtcatg aaaacacatg acatcgtgtt 92760
gtgcccatga taaaaagtcc tgacttttta ttgaatgagg tgtgctggtc aaagagacag 92820
acgtggctgc cttctctggt aacagccaga ggaaaaagtt agcaattcta gatgggttct 92880
acagctttaa aaaacttgtt gtatccttag gtcctcataa tattaaatat tttctaattt 92940
taacagattt taagagtcag atatatactt tgacttgaat gatgtagtgt tgcttaagga 93000
agaaaaaatt ataaaaaaaa tgtttctttt attttcagga gtttttaatt catatctagt 93060
tcatttccac tcatatctat ttctgctaat agattgacag caacctttgg tttaatgctg 93120
tgttctctag ctacaccaac aagttatata ttcctttcca atattaacca agtatttatt 93180
ttatgttagc ctatgactga gttttatcta tgcttgcaca tatatagaat gtaaaaatat 93240
aattctccat gtttaatgta tccatataaa aatgaaaata cccattttct gcattcttaa 93300
agggttaaga aaagtaacat gtaataagca catggaggac tttagaccat ttcttgtgtt 93360
agaggagact ttatacattt gtgaggtttt ctgtcttttg gtccttttat gttcttagtc 93420
catttcatta ttgttttaat atttctacca aggaatgacc aagaaaagag aaaggaagaa 93480
aaaaaatgtg ttaatcattt tcttttaatg gtatgtcagc agaaggggtt ctgactgtaa 93540
gctaatgtgc acttgtgcct gtcctctttg tcttaaacta aagttggtgg tatgaatcga 93600
aaaatgtgta ttggtttaaa aagcagttta tgatatgaaa cagtcttcca gtttttatat 93660
caactccttt gctttcaaca gtcagttcaa agcaccattt attgatggtt tactgtatgc 93720
cagacactgt attttttctt tacgtattac cctacttaat cctcaacaca attttatgaa 93780
gtagttattg ttagcctgaa actggcattt ctccatcctt ttatggtgct gtctttgaaa 93840
agtctcagat gtgtaacatg tcctagaagt agataattat caaaggaaga ctgcaactgc 93900
aactcacttc cctctgagaa aaaatatccc tgactagatt acatatctag ttccagacca 93960
gaacctggtg gtattaaaag tgttttggtt gactattgta taccataatg agtacctaca 94020
ttcccaaatt gcctgcctgg ttgttgtaca gacttaaaaa tctagcctgc cttgattttt 94080
acttttcaga tacacatgtt taaagagatc tttgctggtc acagtagctc acacctgtat 94140
tcccagaact ttgggaggcc aaggtgggag gattgcttga gcccaggagt ttgttcaaga 94200
tcagcctggg tctctactta aaaaaaaaag aaaaatttag ctgggtatgt tggcacgtgc 94260
ctgtagtccc agctactcaa gaggctgagg caggaggatc acataagcac agaagtttga 94320
ggctgcagtg aactatgatg gagccattgc actccagcct gggcagtaga ggagacttgt 94380
ctctctctgt atatttgtct ctctctccct ctctctctct gtctctcata atacatatat 94440
acatacatat atatatacac acacacacac acacatacag agagatatat aaaatagata 94500
taaaaataaa gatattttaa agattattta taaatatatg ttttttaaaa atgtagtcta 94560
ttataagcca aatgtcatta ggcatgtagt ccatttcttt ctgtgttcag gcaggagttc 94620
cagttctata aacattggtt tatctgtttt tctagcaggt gcacacatgg gttctcagtg 94680
atgtgtagcc ggggcataga ttgctctcag tctgttgcac cctgcagggg agatgtctga 94740
ggtcctccct cgcctggctg tgctggacgc acagtgcata gcagaactaa ctgcacagca 94800
gaaatgcctg ttctgcgttc ccattgatac accaacagct aatgaagtct cttttacttt 94860
taagaaaccc ttatttggct ttggcatatt tacatggtag aggcctagaa ttttataaat 94920
aaaattttga agaatagaaa tgtatttttt cacgatttaa aaaccacctg tatggtttac 94980
tctggagttg acctgttcca ctcatccttc tccccagttc atttgtttcg tttcaattcc 95040
actttccctt atagctatct tcaaagcagt gtctatggga cagcattgcc aagagccctg 95100
actgggcctg gcttggtaac tcactcctgt aatcccacct gcccctagaa gtgcagatat 95160
actagaaaat acagctgtct ttgttccagt gaatatgtat aaggggtgac atgccttggt 95220
ggaaagcagc tcagattgtg tggactcctc aatccctgct ctaccaagag ctctccagtt 95280
ccaaaactgt acactcagtg gctatgttct gtgtgcctgc tcccaataca gccattatgt 95340
tgttcatcca gatttgagaa tttaagcttt tcactcctct ttgggtagta ttatttaagt 95400
aagaacttct aggaaaatag tatgagtttg gttatttttc cctcggcagc aggaattttc 95460
tgaatattta gcacattcag attgctccaa gaacagcatt gagcaatgct gtacatgtgc 95520
tttctcctaa ggctgtctcc cctgtctact gggttctgga aagactcatt gtccttcagg 95580
gaagggagca tttttcctca ctgccattgc tgagcctttt ctcctgttgt atactattta 95640
gcccagcatg aagccatcgc cgactgtaag gagtgatgga tagaagtgtt tacttggttt 95700
gtgaggcctt gtctctaaag ggtaacagtc tgacaaggaa aacatttcaa agagccctga 95760
ccaggcctgg cttggtaact cactcctgta atcccagtac tttgggaggc cgaggctgga 95820
gaatcatttg agcccagggg ttcgagacca gcctgggcaa cacggtgaaa ccccactcta 95880
tttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaagccctga tccccctctc tgggcgatcc attgggagaa 95940
tttgaaaagt tcaaactttt gaactcttcc tactttattt ttttaaattt agaatggaag 96000
gtgggaatta tgcaatttgg tgaagatgtt acagaaactg cttcacgact ttctggtttt 96060
acgttataca gtatgttttg aggagctcca agaattgcac aggaattttt ttctttatac 96120
agaccatttt ttaaagacgc atcaagttat tctttattgt ggctctaatt tggcatattt 96180
ttcagacaca ggttgctctt gatacatcaa atttctgctg ttaaaaactt cagttatttt 96240
gagtttagtt aattcaggag cgggaaccta ggtaagtcat ctgtagagca tctttgcacc 96300
ttaagagaag tttctgatta gcctcaattc agtttagtag aatattagtg tggatatctg 96360
gtggcaaaac ctattcttgg tgcaatttgg cttttcgtgg cctcaggcat agagctgact 96420
tggtagtgga ccctctgtcc acacccaccc ggcccttgcg cctttctagc ataaagtggt 96480
gtgtcagagc cactgtctcc acagaaagca ccacgtttgt ttcatttgac ttatttgaac 96540
ccgtttctcc tgcctttgcc tttttaaata aaaatagcaa aaattgattc aagtgaatct 96600
attagaattt tctaaaatgg agcccatttg tcttttcagt cttgcaagta aagtctttaa 96660
aacaattaag cctcccaatg atttaaccgt attttcttac ccccccaccc tgaataatat 96720
ttacaaagaa ataataacgt gaatttttaa aaaccccgtc cttcagttgt tataaatgat 96780
agttcattct tggtaagtat atctgtaaca aaatactggg gaaggacatg aggtatggtg 96840
aacacttaaa attctgccag ccagcttaaa tacataatct aaatttaacc cacgtaacac 96900
ctcttctagg taaacagcat tctccctata ttcagatgag aaaactgagt caaagaataa 96960
gtaacttgcc caagattgca cagctagtac atgacagaac tgagattcac tctgcagtct 97020
gtagacttcc agtaactcca aacctcatac tttttctttt atgttacacg gactctgttt 97080
ttaatggaat atttaaatga gatatttaag tgggaaagta atagacaacc actcttacct 97140
gttaaaatcc aaagtaattc tctagttttt aaatggagca catttaaaaa actttgtgca 97200
ccagtttgaa ctaccactgc aacagagaaa tactagaaca tcagagtatt ctctaaacca 97260
gatcattact tcattcactt tgattgaatt gagttgctta ttttaaaaag acttctggat 97320
gcatggaaaa catatatatt ttgcagcact cagaatcaat acaaagtacc ttcagccact 97380
ttggttcaca ttctgaagat tcatgtaata aacacccata gtagttgtgg gctcacatta 97440
tctaatgaga atgttttctt gatgacttga catttctccg tcactgttgg ataatcagag 97500
aaaaaaagga cgttcagaac accaaggtgc ttggtacaat tatgccaagt gccctgtctt 97560
taaagggagt agcctaattc tcagcatttg ggagtttttg actaaatgtg tggatatgat 97620
ttgtatttcc tatttcttaa tatatatgtg aagatacaat actgacaagt acttagattt 97680
ggaggttttg cggtactgag gggagttggg ggaagaatgg aaataccatt gacctcctaa 97740
aaagttgtta cttgcaaagt ttgggaggtg acatcaaaaa ctcaactgcc cttacaatag 97800
tcattccatc catctgttgc ttatttgaat tctcatttat ttttacttta tggcattaaa 97860
atacaataaa tctgtcaatt atgtatttta tattagtagt agcttaagat tgggtcactt 97920
catttcggta gatataattg ttagtattat ccttcaggac aaaaagcatc tgctaacaac 97980
ctgtggttta aaaatatagg ccaactttat gttcaaacat tatgttgata atatttttag 98040
cagtattaca cagtggaggt ccaaattgga ttagactttt gcattgaatt ccaaagtatt 98100
ggtaagtcta gcacatagta taaagtcttg ctaaattctt gtgggtacat tatttttaaa 98160
acctgtctgt ctgtcggtat cacacagagg tcacttcttg agtaaaataa gatgacctta 98220
agaattcaca taattcttga agaagaatat aagtcacgat gcttccacat gaggccgcgt 98280
cacaccacca tcgtttggaa atccagcacc ccagccgttt taccctaaga taacagtgca 98340
gcacttagtg tggttgaatg tgtcatgtgg gaatgatttt tggtcacctt ttcagttcat 98400
tgttagtcct tttatgtttg tgtgcatcta tgttcgtctg tgtgtttggt aaatatgaat 98460
tgaatagatg acttcttatt ttatgtttta ggccaagatt gacagacacc taatattcat 98520
gacttgagaa tattctgcag ctataaattt tgaaccattg atgtgcaaag caagacctga 98580
agcccactcc ggaaactaaa gtgaggctcg ctaaccctct agattgcctc acagttgttt 98640
gtttacaaag taaactttac atccagggga tgaagagcac ccaccagcag aagactttgc 98700
agaaccttta attggatgtg ttaagtgttt ttaatgagtg tatgaaatgt agaaagatgt 98760
acaagaaata aattagggga gattactttg tattgtactg ccattcctac tgtattttta 98820
tactttttgg cagcattaaa tatttttgtt aaatagtc 98858
<210> 4
<211> 59258
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 4
acctgggcag tctctggacc acgcccccgc ctgccccgcc tcctccacga cgtccgaccc 60
acgcggcgcc caggcagcgc gctgacgtcc gacgttccag gtactttccc caaggccggc 120
ttggctcaac gtgggggggc ggggcggggc gcggagcgcg catgcgccac agtgccagcg 180
ctctccccgg atagagcggg gcccgagcct gtccgctgtg gtagttccgc tcgcgctgcc 240
ccgccgccat gtcggcaacc atcgagcggg agttcgagga actggatgct cagtgtcgct 300
ggcagccgtt atacttggtg agtcttaggc ccgcgcggcg tcccggggct tccgagggtc 360
ggagctcgcg cctgccggct ccgtgtcacc tcccccgtct cccgctcggg cggaagtggc 420
gagcgcgggc cgcgtcaggg gcgcgcctgc gcggacagtc ctcaccgctg tgaggcttag 480
acctgaagca ccgaggtgcc ggtcgcctgt tggttctgaa ggcggcgcca cagcggcgcc 540
tgctggcggc ccggccggcc tcggcgtgtg gtgcgccggg cggagggtcg aggggcaccc 600
ggcgcggggt gggacgggct ccggcttcct cgctgaccgt gttcttgtcg gccgaatgtt 660
cggtggccga gcgcgctggt agcgggagca gcgagaaggg cgagagagcc ctctaggatc 720
ggggccagcg aaggcaaagc ggggtcccac ggagtctcgg tcatttgcgg gtgtcccggg 780
ggcctgtggc cggagctcta taccagagcc ggagctgaag cggcggccta agctcctgag 840
ggatcgggga tcgccagtct tttcattggc cactttctct gggagagcgg gtcatcttct 900
gcttagagct ccccggaaca acaggggctt tggttgtatt accattgatt aaagtagcgt 960
cctctttaga atttcctttg cttaggcata ctttatagat gtatatatag tacaccacag 1020
gaatttatat gagccttgca gttggttgca tttcccaaat gagtgcactg gtcgtcgtag 1080
cactcaaaag taacccaaca atctttcggt ccaaaagagg ccacatgtct ataggccgcc 1140
gctgtgctct gtcaccagag aataacctta cctattcagc tcattctaaa gtattctttc 1200
ctatgaacgc ttgtgactac ctttttacag cgtgtgggct accttttaat ccaggcaaaa 1260
cttttctccc cttaaaaatg attcattgct aatcattaac gtctatccca gatcagattt 1320
agtgattggt gtctccttat gttttggctt gttactacag tacagaaaga agctagaaag 1380
ctttctttta gctctggatg actctgggtt ttcaccattt catttaatta gatggcagta 1440
aaaattcgct ttgtttagga cttatttctc ccatcctcct ttgagataag gtctcacagt 1500
ctataacttt tgctggctca gaacttgctt tgtagacctg cctgaccttg aactcctagg 1560
ctggctttga agtcctagtc ttctaactac cagtgtcaaa gttctggaaa gaagttgtag 1620
aaaatcttaa atgcaaattc tagtggattt gtgtgtgtga acttgcaggt ctgtgggtac 1680
attagattta gcagagtgcc gcctcaaaaa tgccaatgac aaaaggggta ctaaatcaag 1740
gaagattgct gggtggtaca tgcctataac cccaaagttt aagaggcaga gggaggtctg 1800
tgaagtgatt ttattttatt tatgtagcct tggctgacct tgaactcaga ttgtcctgcc 1860
tccccagtgc tgggactaaa gccgtgcacc tccatgtcca gcacagctct gagtttaggc 1920
tagcctggtc tgcatagttc cagaccagcc agggctacat agtaagatca agtatgcatg 1980
atcttatata catacataca tacatacata catacataca tacatagagg tgggaggggg 2040
actagagaga tggctttcat ttaagagaac ttgttcttcc aggttgattc ctagcaccca 2100
caagcagctc acaactgttt ctagctcctg ttattgggaa tccgaagcac tcctctggcc 2160
ttcagggatg ccagttatgc acatggtgcc taggcagaca aaatgccata cactcagaat 2220
caagggggaa aagtaaaata ataataataa ttactattgt tactactact attattttaa 2280
aaacaagggt tcatactagc aacttaattt agcctaattt attttctgag accaggtctt 2340
gcttagtatc acaaactggc ctataattta ccactaggtt tggatttgtg acagtccttt 2400
tgccttagtc ccccaattgc taggattata gggaagagcc accacatgtg gcttaattgg 2460
gtacatacat gtaagtcatt aatgtctgag aagtaagtga aagttgtgat cccacttaac 2520
agggaaaaaa agcacttatg ctggatggtg gctcagcctg taacctgtca attaggctga 2580
agcaggagga ttgttgtgag tttaagacta gcctgcagct gggctttggt ggccaagcct 2640
ttaatcccag cagagtcagg ttgatcttca gtgttcagcc agcctaggct gcatggtgag 2700
ttctatgcta cccaggacta aggaatacat tcttgtgttg gaataaaaaa tttctaaaca 2760
aaagccagtc atagtggcat ggtttttttg ggaggggggc atgtttcgag acagggtttt 2820
tctgtgtagc cctggctgtc ctagaactca ctctgtagac caggctggcc ttgaactcag 2880
aaattaaagg tgtgtgccac tacagcctgg ggtggcatgt tttttaatcc tagcaccgag 2940
gaagtggctc cagaaagtat ctggagtttt aaaggtcatc tccagctatc cgtggagtta 3000
tgggtcagcc tgggataatc gagactcggt ttaaaagtaa aaatcttgct ggcaaggttg 3060
ctctgtgggt taacagttgc ccagcctgaa aacttgagtt cagtcctgtg attcacaagg 3120
agggagagaa ccacctttct ttcacagatc ttcgtatata cctgcctttt tgtgtgcagc 3180
cacaatagcg aagttaaaat gtaattgtaa acaattggat gttcagggag atggcttatt 3240
tgtttagtgt ttgctgtgaa agcatgaaga cctgtattta gatcttcccc atttccataa 3300
aaagccaggt gtagctctaa tcttttgtgc tggggaggtg aagacctgca aatctctgga 3360
gctcactggt cagcgggcct ccctgaagca gtgagctcca ggtttaatga gagacccagt 3420
ttcaaaagat aagggtttgg gggctgcaga gatggctcag gggttaggag cccttgctac 3480
tcttgcagag gacactagtt cagttcccag tgtccacatc aggtatctca gaactgcctg 3540
taagttcagt gccagaggat ctgacatctt ctgtcctcta tggggagtgc aatcctgtgc 3600
acaaacacat gtttacacat aactaagagt aaagataaaa acttttttta aaaaaaggta 3660
tagaactgtc aatggcaaga agattcagag catatgtgtc acctcccaag cctgacagtt 3720
tgtttgatcc ttggtaccca catgatggaa gaagataact gattcctaca agttgtttcc 3780
tgatctccac atgcatgcat agcctttata agtaaatgtc agaaaaaata aatacaggca 3840
aatacactta acttgtgttc actgaaaatt tctttttcag aaaccctcca tagacaagtg 3900
cacaagatct ttaagcaaaa tagtagttct gtgctggcac tttttttttc aagcccaaga 3960
gcattaaaac catgctatgt acattggtgt tacagtaaaa gcaagccagg agccactgaa 4020
gctaataatg acaagcaagt ccggaagagt ttggacttaa tgctttctta gtatcctgga 4080
gcatccatct cacattccac agagatggct gctaccaaca tctgtgctgt caaggctcta 4140
attctgtgag tcttgaggac ctctttggaa ggtcatactt tgctttcttt cttttttttt 4200
ttgagacagg gtttctctgt atagccctgg ctgtcctgga actcactttg aagaccaggc 4260
tggcctagaa ctcagaaatc cacctgcctc tgcctcccga gtactgggat taaaggcatg 4320
cgccaccaca cccggctaat tgagttactt ttaagatatt agaataactg gccaggcgga 4380
gaagtagctc aagcgaagca gttatttctc tccttcagct ctgtactcac tgttttccca 4440
gtgcccacat gtaaaattca gctcttctgc ctcaatacca ctggggctgc ctctgtgtgg 4500
ctttatttcc tatgtcattt ttctccccct cctgcactat tgtggtctgt tcttggaaat 4560
gtgtgtatcc acttatcccc gtgagcctct agaatgaaat ttcctttgca caactgctct 4620
cctgttgctt ctttcccctg ttgcttaaca cctttgctca tgtctgacgc tggactaatt 4680
tgggaagctt cctaacctac cagtccatgc tggatatgtg caaatctttg acagtagggt 4740
tgaagaaatg cagaggttct gtgtgtgttc ccagcaccca catggcagct cacaaatgtt 4800
tgtaactcct gtttaagtga gcattcttcc ttattacaag taagtgacgc tagtaataat 4860
gttttatgag ttctgctttt tctgaaatgc taaaggagct aggagaagaa aggattgctc 4920
tcaagggtaa atcaagatcc tcagctttta gctgcttgat ggacatgaga atgtttactt 4980
cgtattttat ttcagttttt gtacttacga ataaattgag tatttttggt tgaggttctg 5040
gcctcctcgt cttttttatt ccctatagac agttgcttta gagcatcact tttggaaata 5100
ggtgtcgtag ctcatactga tactagcact tgagatactt cagggtggag gatcttagag 5160
gtcagtctga gcagcgtatc taatttcaag ttaattcatg taatttagca tcatcctatt 5220
tttaaataaa agaaaacaaa cctaaaaagc catgatttag taataggaag agtttcttgg 5280
ttggttggtt ggttggtagg tttttttttt tttgagacaa aaaactcact ctagccttgt 5340
ctgacttaga attcacaatg taacccggtt gggctccaac tagcaatcca tcttcttctg 5400
cttcttcagt gctaggataa agtcaagcac caccatgccc tacttttgtt tttttgttgt 5460
tttttgtttt ttgttttttt gagatagagt ttcaatctat atagctctgt tactttggaa 5520
ctcactgttt agccttgaac caatgctgat cctcctgcat cagtttctga gtactgggat 5580
tagagacatg ggtcatcacg cctggtgaat gttgctggat ttgtgttttt gttttctggg 5640
ggataccagt catcaagtct gtggtttcac aatgccagtc agatgctcta ccactgagcc 5700
agagccacag ttacctctct tctctcccca cacaatttct gagctaggtc tctgtaattt 5760
gctagccttg aacatgatat ctttctcctt tagcctacaa gttgttgggt acaggcctgg 5820
gccaccagga tgggcaaggc gaaagttctc gatttataga aagaaagaaa aacaaaatgc 5880
tgcagttgct aaaatctata ttaaggccaa atcttcagtc tgaggaattg gaaggataaa 5940
gaaatttgct ggttttgctg ctgtggtgtg tgtaagtgtg ctaatatgga aaaggactta 6000
aattgcagag ctgagtatta ttatctggtg ttctacattc actgggagct aggaatgaac 6060
tcccacagat aagtctcttg gactatttta catatttata cacatctgta gatttttttt 6120
cttttttttt tcttagatat tttcttcatt tagatttcaa atgctatccc caaaacctcc 6180
tatccccccc cccccccccc cccccgttcc ccaacacacc caactcccgc ttcctggccc 6240
tggcattccc ctgtactggg gcatatgatc ttcaaaatac caagggcctc tcctctaatt 6300
gatggccgac taggctgtcc tttgctatgc atgcaactag agacacagct acacagctct 6360
gggggtgggg ggtggggtac tagttagttc atatcgttgt tccttcaata gggttgcaga 6420
cccctttagc tccttgggta ctttctctag ctccttcatt aggggcccat cccaatagat 6480
gactgtgagc atccacttct gtatttgcca ggcattggca tagactcaca agagagctat 6540
gtcagggtcc tgtcagcaaa atcttcctgg catatgcaat agtgtctggg tttggtggtt 6600
atatatggga tggattcctg ggtggggcag tctctggatg atctttcctt ccatcttagc 6660
tcagaacttt gtctctgtaa ctctttcttt tctttttttt ttttttttaa acctttaact 6720
tatttctttt ttttttttaa attaggtatt ttcctcgatt acatttccaa tgctatccca 6780
aaagtccccc ataccccccc ccatccccta cccatccact cccccttttt ggccctggtg 6840
tttccctgta ctggggcata taaagtttgc aagtccaaag ggcctctctt tccagcgatg 6900
gctgactagg ccatcttttg atacatatgt agctagagac aagagctctg gggtactggt 6960
tagttcatat tgttgttcca catatagggt tgcagttccc tttagctcct tgggtacttt 7020
cttgggggcc gtgtgatctg taactctttc catgggtatt ttgtccccca ttgtagagtt 7080
atttttaaaa ttatctttgt gatgtatagt gtgatgacat actattaatt tttacttttg 7140
ctgatgtata gagtcctaaa ttcttgtaat gaatatgtat taatttatta aaggtgcaaa 7200
tttctttttc tctccaataa aatcacagat aaaaacccaa agtaaggcta ggtatagtgt 7260
ggtgcatgcc tctaatccca gcccttagga ggcagaggct attagatttc tcagtttcat 7320
aggaggcaga gcaacataaa tgagacccta tctcaaaaaa caagagtaag attctttggc 7380
cacttggtag cctggttctc ctgagattac tggtacaccc tcatattgga acagggtctc 7440
aagtagccca aactgacttc taactactta actgagactg gctttgaata tataatcctg 7500
ttgcctctac tccaaagtgt tgcaaccaca aacttattac caccatgctc agaatatttt 7560
gtattttaaa ggtaagcatt ggttattaaa acaaaacact agtaagctag gtatggtgtg 7620
tatgcatgta atcccagaat ttagaagact gagattaggt ttgccatgaa tttgaggcca 7680
gcaagggcta caaagtaaga ccctatttaa aaacaaacaa acaaacaaaa aaaaaacaaa 7740
atccaaacaa agtaaaaccc tgcaggagat cttagaattt atttttctac attgtatcaa 7800
cacagtaagg ttttttgtta tgtgtgtagt aagtacagcc tgttcatgcc atacgtgtat 7860
agagggtcac ctaaaacttc tgggagtagt tttctcctcc tcagcaagct cctgcgatca 7920
aactgaggtc atcaatttgt gtggtgctag cccttttatc tgctgagcca tctcaacagc 7980
ctgagactta agattttttt atacatacat acttttaaaa ttaaaaggtt gtttcaatat 8040
gtaacccaac agaaagattt taactaaaaa catttgctta tctcaattcc aataactgca 8100
ctgaaataaa ttccttcctc cctcaaattt gtatttagac caggtatcac ttacttcaag 8160
ttaattataa aagctatctc cagaatatat gtacaggtac acacacacac cacttacttc 8220
aaagtaattt tgaattatcc ccaaaacata catgtacaca ccattaacat ctgtctgtct 8280
atctatccat tcatccatcc atccatcccc ccacccatcc atccacacac gtaaaaatag 8340
tgcttggtct tgtattcaga tctcacctac caccaccatc tagttttttt tttttttttt 8400
tgagataagc tcttttttgt ttgtttgttt gttttttgtt tttcgagaca gggtttattt 8460
gtatagccct ggctatcctg gaactcactt tgtagaccag gctagcctcg aactcagaaa 8520
tccacctgcc tctgtctccc tagtgctggg attaaaggtg tgtcccagca cgcctggctt 8580
gtggctgttt ctttaatgat cgtcttataa caaattgttt taaggatttt ataaatatct 8640
acttaggagg atcttctcaa ttctgtgatc tgtgtaaaag aattatttta tggtctggtt 8700
tgttgcagtt aaaaaaaccc tgaaaatatg gtagtgactg taatgtagac ttcagtgatt 8760
tcttcagcat aagtgtgcca tcgggtacca ttcttcacct agtaatgtag aagcatagtt 8820
atggcttctt tctgctgcag acggggaaac ttttagcacc agaatgcaca tcagttgttt 8880
ttgcaacatg gccttggtgg tagctcagct gttggccttc cttgtctctt tttgagaaac 8940
actttgtatt tcattaacta tactaaaaga tcggatacat gcagggaagt ggggtatctg 9000
ggggcctgcc aggctgtgcc gttaaaaatt acgccatgta acaggtttat tgggagagta 9060
gggagactga aatgcctccc tagactggga cattagagag agatagacag acagacagac 9120
acacacacac acacacacac acacacaaag atagataatg aaggagagag aggagtaatt 9180
gaagagagaa acaagagagt gatctggggt ggggtggagt taggaggggg ttacacactg 9240
tgtgcacctg ccacacctgt ccccctgttg gctggggtgg aaggtgacat aagccacctt 9300
tatattcctg agggctaaca ctaaatgctc ataaaagtta catcttgggt attgctcccc 9360
ccccccccca aaaaaaaaaa gaaaagaaaa gaaagctgta cagtgtcaga tggtagtttg 9420
tgatgagttt tggttataca ctgtcttagg gtttttgtta ctgtgatgaa acaccatgac 9480
caaaaccaag ttagggagga aagagtttat ttgccttaca cttcctgttt gaaggaagtc 9540
aaaccggtca ggaaactgga ggcaggagct gatgtagagg ccatggaggg gtgctactta 9600
ttggcttgct ccttaaggct gctcaggacc accaatccag gggcaacacc acccaccatg 9660
agctggaccc tctcctattg atcactcatt aagaaaatgt ttacagttga atcttatgga 9720
acacttgggg ttccttccta tcagctaact gtagcttgtg tcaagttgtc ataaaactag 9780
ccagcacatt ctcattattt agacatctga tttagctgca taggaaggaa aataaagcag 9840
taattgacaa taggtttgtg gtttttgttt ggtgagagtt ctgaagctag ggctgctgtt 9900
gtgactccct agtgccactg atggtagcct ttaatttctg tgtagctttt tttttttttt 9960
ttttttttta agcctagtga tcacaggagg ttcctgccta ctcccatccc ttactcctgg 10020
tggtcaaaac agaagagagg gcaagagttt gctgaggcag tttttcttta ttattgaggt 10080
ttcatttttg aggcaggatc tcgtcttaag tgttgccctt ggccaagcat ggtggcacac 10140
gcctttaatc ccagtactcg ggaggcagag gcaggaggat ttctgagttc gaggccagcc 10200
tggtctacaa agtgagttcc aggacagcca gggctataca gaggaaccct gtctcaaaaa 10260
acaaaaaaac aaaacaaaac aaaacaaaaa aaaaaaagtg ttgctcttga tcactattct 10320
tgggttcagg tggtcttccc acctcagccg aggagctgct actgcccagc agcttatcca 10380
gtgtgtgcag gccactcagc tggcacagat agcaggataa acctttctct acaaccaagc 10440
ccagtgctgc tgcttattcc attggccacc ttttgtcaca agccttttaa aatttgagac 10500
agggtcttat tccctatgta ggtgaggctg ctttcataga gatccacctg gctgtgcctc 10560
cctagtgctg ggattgaaga ctgtgcacca cccatgcctg gctcatagac atcaagctct 10620
tgtaaactag aaaatcaaat tagaaacctt cagttaggaa gaagggaaag tgggattggc 10680
tgttggtgtg tgtgtctctg gaactggtct ttataaagca ttgggatttc ttatcttaca 10740
ctggccagag ttaaaaacag aaaacaagtg gaagattgaa ggtctgaaag aataaattca 10800
ctaagggttt ttttgtattc ttagctaaca aaagaaagta agtatggctc tattttttta 10860
gggctgaata tttggattgg ggtgtatata tggcattgtt ttgtaactct taagtcctta 10920
ttgctgtact agctcctgcc atcttttatt tatctaataa tgcatcttaa ttaattcttt 10980
gagaacttgt atcttgatca tattaatatg cccctcccct gctttttccc tgaaactctt 11040
gccaggtcca tccacttctt atctccccat cacattatgc cttttttatt taaccttttt 11100
atggatttat tacttttaat tttatgtgtg ttttgccttc atgtatattt gtgtcatgtg 11160
agtttagtgc ctacagcggt aagaagaggg ggtcagatcc cctggaactg aaattataca 11220
tgttagccac catgtgggtg ctgggaattg aatctgtgta ctctgaaaga acaatcagtg 11280
ttcttgactg ctgagccatc tctctggccc ctatgtttag tattttaaga gatgcctgga 11340
gagatggctt agctcttaag agcactggct gcggagctgg agagatggct cagtggttaa 11400
gagcaccaac tgctcttccg aaggtcctga gttcaaatcc cagcaaccac atggtggctc 11460
acaaccatct atagtgtggt ctgatgccct cttctgggat gcagatgcac atgcaaatag 11520
agcacttgta tacataaaat aaataaatct tggggggaaa tccttaagaa gagaccgtct 11580
agctgggtgg tggtggtgca ggtggtgcat taattcaatg agaggcagag acaggtgagt 11640
ctctgagttc gaagttagcc tggtctgcag attgttgcag tatcctgtct tctgactcaa 11700
tctttgttct ttcttcgtag atttttccct aaacccctag gtatgtagga agtatgttgt 11760
ggatttagtg gctggctaac ccctggttag ctccctgcat tttgacaagt tgtgaatggt 11820
ttctgtgtta catgaagttt ctttaataag cagcctgtcc tacacttatc tatggatata 11880
agatgaatag taggagtggg attgagagct atactttgtt ggtttttgtt tgttttgttt 11940
ctctgtataa cagaggccta gctgtcttgt agaccatact ggccttgaat tcaaagaaat 12000
acacctgcct ctgactccca agcactgggg ttaaaggtgt gtgccaccag gcctagccct 12060
tttttcccac caacatcagt aattattata gtgtatacat agaattttgt ctagactgaa 12120
aaataagaac tagcaactaa tagacaatca ctgaggaaga taggattata caacagaaca 12180
gttgaagatt cttgtacagg tttcatggag ggaacctctg ctgaccagta aatttccttt 12240
ccttgtctgt ctgtccgcct gttcgttcgt ctgttcatcc atccagctat ccatccatcc 12300
atctattgag tctggcctag aactctacct ctagctcttg agtgttgaga ttaaagacat 12360
gtgccaccac acccagccac cagtagtttt ttaaaaatct catttataat tgcattagag 12420
ttaataagat tactcagatg aaactgttag catattattt ttgaagaaaa ataaattaaa 12480
atatgagctg taacacaaaa gaggtgaata aatagaaaca aagcaacttt tatttccata 12540
tatttagact ttactattta gcattagtaa ctaaaattta attatcttga tgataaatga 12600
aattttgaaa tagaattaca ctttgaaaga acaagtgtaa ctggtgaatg taaaaattaa 12660
taaatggcat ggatcatttc tgttagcatt gtgaggtttg atatgatata aacatttctt 12720
tgtagagtac ttaaagtaag tgcttaatgt tgtcctatat tgcctgggag aatatatgtt 12780
gctgtataaa atttaagagg gatattaaat atatattttt gttattttaa ggaaattcga 12840
aatgaatccc atgactatcc tcatagagtg gccaagtttc cagaaaacag aaaccgaaac 12900
agatacagag atgtaagccc atgtaagtac tgtaagatac agagatgtaa gcccatgtaa 12960
gtactgtgag atacagagat gtaagcccat gtaagtactg tgggtttatg tgcatgtgtg 13020
tgttcttcag cttgtttcag gagacccgat gcagtgacag tctttgggta aagattgatt 13080
agtatagcaa tttttaaact tttatatact tttgttttga gacaggcttt cactctgtag 13140
tcccactgtt ctggaaatta ccatgtagca caggctgacc tcaaatttgc agcagtcgtc 13200
ttgtctcagc ctccagaata ttgggattat taagtgtcag ccaccacacg aggtttaatg 13260
tatacatttt ctcatgtgtt tgtacacacg catgtggaag gttgaggttg atggtcagat 13320
gtcttcctga attgctcttt accctagaga tctgttccag ctagtctggc tggccatctt 13380
gttctgttag aacttgtcct gggattacag tcaggctgcc acacccacct ggccttccat 13440
gcgggttcta gggatccagt ctccacccct tacatttact tagtcatctc cccatccctc 13500
tggtttgagg aacatctgat tagctcttct aagctctggt agaattcagc acttaattgt 13560
ctgttgcact caggtggagg atgttcctat aacagctcag catttcctat cctcatccag 13620
ggttctgcag tctgccagtg aactgaccct cacaaaggct ctccttccct gttgtacagc 13680
ttttttctcc aggtgtcaga gccacttact gtgtgtcgtg tcatccccct cttcagcaca 13740
ttcatcctgg tgtcctgata tctgagtaaa cactatgaaa caccagcctt agagtaccta 13800
ggccttttca gcactctttg atcttgtgcc cacaaagaaa gcagggaggg attttttaaa 13860
attttgtggc agggctccct gcatctgcta tactgtcttc caactgtgac ttcctgatca 13920
gtctcctaag tgctggaatt acaggcctgt gcaccacacc cagctttcac cctgcacctt 13980
gaaggtcact ttctgtgtgt cactactgct tttgttgttt atttttttgt tttgctttgt 14040
tttatttttg tttgtttttg aatatttcac ttagaatgta tatggttttt cctggcattg 14100
ggttctttaa tactttgagt tttagattac tcaagtgttg ctatatcctt cagtttgttt 14160
gttcgttgag acagggtttt tctatatagc cctggttgtc ctggaactca ctctgtagac 14220
caggctggcc tcacactcag aaatccacct tcctctgcct ccaagtgctg ggattaaaag 14280
cgtgcaccac cactgcccag ctgctatatc cttccttaac cagtctgttt ctcatatcta 14340
tttagctgtt ttattttaaa atatctttga ccttaattct ccaatttatg aagccccatt 14400
ttggaagact ttattcttta ttcccttaga gagtttaaaa actcaagaac ttagagtcaa 14460
gaaacaacac ttaagctgta atgtgacacc ggggaagtgc ctcagcttat gcacatccct 14520
gaagtcccag ggcttctgtt tctctattcc tttgtacata catcccttcc ttctttcctc 14580
ctcctggtct gccttgctat cttcagcctc tttgtccctg cttttccttc ttattacata 14640
aataggatgt agaatgcttt tccctttccc tcccaccccc aagttatttc ctaggtagat 14700
ctatgcatct acacaacagg ggtttttgtt tttgtttttg tttttgtttt ttgagacagg 14760
atttctttgt gtagccttga ctatcctgga actcactctg tagactagac tggcctcaag 14820
ctcacagata tccacctgcc tctgcctcca agtgctggga ttaaaggcat ataccaccat 14880
cgctgctatc atcactgccc tgctgaacat aacagtttaa aaagaatata ttctgggact 14940
ggagaaatgg cttagaggtt aggagcactg gctactcttt tagaggacac gggtttaatt 15000
cctagcaccc aaatgcatct gtaactatag ttctagggaa tctgatgtcc tctcctagct 15060
agcctctgta ggcactgggc acacaagtgt aggtacatag gtatacatgt aggcaaaaca 15120
cccatataca taaaatttaa aaaaaaaaac aaacccaaaa caaacaaaaa ggccaggtgg 15180
tggtggcata cacacaatct tgactggggg tggggggggg tgggaagaaa gaaacaaaaa 15240
gatcagttag ttctcctttc tgtctgtcct gatcacctgt gctctcttca tgaaccccca 15300
tgcagctacc acaccctcct cactggaact tagttacctt gctagctttc agatgcaatc 15360
aatgactttc ccttggtttc ccttcttatc cttctgtgtc ttgtgagatt gccgactctg 15420
tcttccttct caaggactta tttacttttt ctgtctgctc tcccattttt agagccgtcc 15480
atcctcaatt tatctttatt tttttcaagg gtcttttcct ctcctcacta ttttttctta 15540
atctatgagt gatctcattt tcttgggggc caattgccat gcttattttc atgacttcac 15600
atttgatctg cagtcttggt cttaactcca aacagatgtt tgcaagttgt catgtgccaa 15660
cctgacatga agttagtcaa agaaccatag aaccatagaa agcttataga accaatggtt 15720
gggtattccc tacattgctt tattccttct atttgtaact ggtaccacca tttacatatt 15780
gactaatact ggaaacagac tccttattca tctgccacat ctaattagta actaaatagt 15840
ttactgtgag tgtgatctat ttaaaatgtt ttcttatgta catactagct tttttgtgat 15900
ttattatagt aacttctaaa cttttgggac tatatagatg gctcaggagt taagggccaa 15960
atactgcttt tgtagaggac ttgggttcgt ttcttagtat ccatctggtg gctcacaaaa 16020
cacctgtaac ttcaacacat ccaacaggca tgcagccccc cttctctctc tctctctctc 16080
tctctctctc tctctttctc tctctctctc tctctctcac acacacacac acacacacac 16140
acacactaaa ataacctcta tagctccatt ctattactgc tttcttcctt tctcttacta 16200
tccaagttgt tttcccgccc cattaaggca gaaatttaag tttgtcatca ttatcattct 16260
agacttttta tataccttta tgacccttta tacacatcta gattttactt atagctattt 16320
tcctacaaat tattcatttg agtaagagtg gattacttag cattctccca ttatgactag 16380
tttctaacat actgtgttct caaatatggt gctcactcat ttctttcttc tctttaatga 16440
cagtgacggt cttctccctg cagtgccaaa tcagccgcgc cttccgccgg ctggtctttt 16500
caccatggag aggatattat ggaagcaggg ttttgtgtgt gagcatgcat tttaatgttt 16560
tttgagacag ggtcttctgt ctattatgta gctctggctg tcctggaact tactctttat 16620
acctggctgg cctctaactc acagagatct gcctgtatct gctgtcagga gatagagaca 16680
gtggagtcac tgtgagtgtg aggccaacct gatctacata gtgagttcca aacctgctaa 16740
gaccatatac aaagaccctg cttcataaaa acaaataaat aaaagctgca cagatttatg 16800
attctattag tatggcttac ctataatcat agtccattgt agctacagaa caagaatatt 16860
ctcagtaaat atgtgtataa atgagttgat acatggagag aaaataacaa aaagttagag 16920
acttatcttc ctcctccagt gaaatgacat tgtgctcttt tggagagagg gtctcagtat 16980
gtagccttgg ctggcctgaa gttttacata catcaggctg gctttgaatt catagacatc 17040
aaccttcccg gcctcccctt tgctaggatt aaaggtatat attaccacat ctggggacaa 17100
gtctgtgctc ataggctttt aaaatttatt tatttttgta ttttatgtat atgaaggttt 17160
cttctgcatg taattctgta ccacatgtgt atgtggtaac tgaggaggct aggagaatgt 17220
ggatccctgg gacttgttat ccaagtaaca gatggctgtg agctgccatg tgggttctgg 17280
aaattaaaac tagtcttccg gaagatcagg aaataattct tttttgtttt gttttgtttt 17340
gttttgtttt gttttgtttt tttcaagaca gggtttctct atgtagtctt ggctgccatg 17400
gaactcactt tgtagaccag gctggcctca aaactcagaa atccacctgc ctctgcctcc 17460
aagtgctggg attaaaggtg tgcgccacca ccgcccatca gcagataatt cttaactgca 17520
taagcatgat gtctccagca atggaccttt ttttttcttt tcctccaatt ttttattaga 17580
tattttcttc atttatattt caaatgctat ctggaaagta tcccataccc cctcccccac 17640
tcccctaccc acccactccc acttcttggc gctggaattc ccctgtactg aggcacataa 17700
agtttgcagg accaaggggc ctctcttccc aatgatggcc gactaggcca tcttctgata 17760
catatgcagc tagagacacg agctctgggg tactggttag ttcataatgt tgttccacct 17820
acagggttgc agaccccttc agctccttgg gtactttctc taactcctcc attgggggct 17880
ctgtgttcca tccaatagtt gactgtgagc atccacttct gtatttgcca ggcattggca 17940
tagcctcaca cgagacagct atgtcagggt cctgtcaaca aaggactttt tttgtgataa 18000
atttcatact gtaccctaag ctgacctcag ttgtggcaac tcttcctgcc tcagcttccc 18060
aaatgctggg gttacagttg taagccacca cagctagcct tatttttggc tttttgagaa 18120
aagggtctcc ccaagttggc cttgatcctc ctccttctgc ctccaaagtg ctaagaccct 18180
gtgtgctcat ggtggacaca gtattataaa gaagttgatt tatctcttgc ctatcactga 18240
atctcatgag gagcagaagt gtgaatttat tcaagataag gcttcttact taaccctcct 18300
atgaaggtat tgctgctgga agtgtactaa acattaattc tgcattgcca gaggtgctga 18360
agattgccct tatcctagca aaatggattg acacagtagt agcatgccta tccttatgtg 18420
tgactcatcc acctgtgatg tgtgtcaggt ttgctgagca cagaatgagc ctcattaggg 18480
gtgatgatta gaagctaggg aagtgagtaa gcctctgcag gaccaaccaa aagggaaaaa 18540
cttggctaag tgctaacttg tactcgtgtc atgattaagg atgataccaa agaattctca 18600
gattagcgat gtcattgatg aacacttcaa atgcaagaaa tgaaaaatag aagcttttgg 18660
gggagagatg gctcagtgtg taagagtgtg tgctcttgca gaggacctgg gctcaattcc 18720
cagcatttac aggttgctca taaactgtct cttaactcta gttccagggg atctgatgcc 18780
ctcttctgat atccattggt accagacaca cacatggcat acataacata catgcagtca 18840
aaatagtcat acacctaaaa ataagatcca tatgtttata aaaagttttt tattttcctt 18900
atcaaaatga aactttaaaa atactgatga aattttagtt tagtgtttta agttctcaag 18960
tcattgtttg ttttgttttg ttttaaagac agggtttctc tgtatagtcc tggctgtctt 19020
agaactatct ctgtagacta ggctggcctc gaactcagaa atccgcctgc ctctgcctcc 19080
cgagtgctgg gattaaaggt gtgtgccacc acgcccagct tggattctag ttttatagac 19140
agtgaactgt tcccactacg ttctttactg tgtttattca tgcagagtgc agattccttg 19200
caggtacttt ctagagaaca tttctaagta catggaaagc ttcaacagag acctggaaac 19260
agctggttta tgcttttttg ttttggggga ttgaagcaaa gactaggtgc atgttagaca 19320
aatgctaacc atgctcttac acctctatcc ctctgtacta tttctctttt gagacagcgt 19380
actgctcagt tgcataggct ggctcttgag ccagcatgta ggcctaggca agaaacaggt 19440
cttaaccttt agataatctt gcctcaacct cctaagtgac tgggaagtac aggtctacct 19500
cattgtatct caccgttatt tgcctccatt tgtttcaaaa acccctctcc cgtgccccct 19560
ttatctcttg attctttatc aagtgcagcc ttcctcctca cccttcccag actgaagttt 19620
ccattcccca gtaaggagct gtttgggttc tgttttgttt gtttgggtgc caggtgtcaa 19680
atactgggct gatgacttct aagttggttt catttcctag ctgttgtgaa tagttcatag 19740
tagtatacat ggatgtgcaa ctgtctgtgg catgttggca tagatttctt tgcccacgct 19800
tttggaaagt tgtgggaatc ttttcttgtt cttttggtat ttgttaacta tttcattaaa 19860
aatttataca ttagcttcca ttttttttca ttcatagcta gggtattcca attttctttt 19920
gctatttatg gatagtagaa taaaaaaggg agtaattgcc gggcgcagtg gcgcacacct 19980
ttaataccat cactcgggag gcagaggcag gcggatttct gagtttgtgg ccagcctggt 20040
ctacaaagtg agttccagga cagccagggc tccacagaga aaccctgtct cgaaaaacca 20100
aaaaaaaaaa aaaagggggg ggggagtaat tgaaaacact attacactgc catgatatta 20160
tgcctttaat cccagtactc aggaggaaga ggcaggtaga tcttttgagt tcagggctct 20220
gtgagttcaa agctagcctg gtctacagca ggttccagga cagccagaga tagacacaaa 20280
gagaccttgt ctcaaaaacc aaccaagcaa aaaaaccctt actatactta cacttctcac 20340
tcactgaata attcaatctg acagcccttg gggtgggggt gatggtctta aaagtcatgt 20400
aaaggtgata atgtcctaaa aggaaagacc ttgtgtggca attgagctaa gagtgagccc 20460
tgtattgtta gattaggatt gctgtgttct tgtatgttag gacctggttt tcagtgagta 20520
ctgatatgta gaaaaggctg ggaatgtata gttcagaggt tgagtgcttt cccagttata 20580
aagacatgtt tgaattttgg cagccatatt catatgttta ttagcctttt ttattgagac 20640
ttttattttt taacattttt acttttatat atatgtgcat gcatttgtgt tgggatggcc 20700
gggcatgtgt acatatgggt aagcatcttt ggagccagag ggttgatgca tctgaggcta 20760
gagttatagg ctgtggtaag ctgcccaatg tggatactgg gaatcaaatt catgttccct 20820
gcaagaggac atgttcttaa ccactgagcc atgtctccaa cataattgag aagtcttaag 20880
agcaattatg ttctcttgtc accgggcata cttagcttta gttgttcaag ttcattcttt 20940
acaacaagga aacatggttc cttggatgag tggctgatct ctgggaatgg aacaatatgt 21000
aatcccttag gtagatgtag tgacaaaagc ttgtgttccc agcactcagg agtcaaaagc 21060
agaattgtga gctgaacagc agcttgaaca acactgccag attctggctc atagaaaagg 21120
ggctggatat gatggcacat gcctttaatc acagctctaa ggagacagac gggcagatgt 21180
caaaggctag ccagagctac agagtaagac cctgtctcca aaacaaaaca aataaaagga 21240
agaaagaagg gggagtttag aatgtctcaa atttctagaa agtacagatt ttattaccga 21300
ttgaataaat aaatacttaa atacaaaggg gagatagtaa ttgtccagaa gaaatgaaca 21360
ggaaaaaatt tagtattgaa ggctgttgaa gatgtcttgg gaagacacca aaagcataag 21420
ttatatacag tttctaaaat tagtgaattg taatagatgt ttgtgtgtgt ctcctactta 21480
taattctagt acttgggaga ccagggcagg agaaggctgt gagtcctaga ttcatctggg 21540
cttcagagag aaagactttg ttcagaaaaa taaagctgag ttactgaatg gtaatgtgtg 21600
ctttcaattc aactcttggg cagctagggc aggggaatgc tatgagttcg cagccagcct 21660
gattacacag ggagttccag acaagctgca aatacatagt gagacctcct cttaaaataa 21720
aaggcataaa tgaacatttt aaagttttgg agaataagat caacagattg actagggaat 21780
atatatttga aataggcaga ctagaaaatg gacagaaggt atgaatacaa aaggcagata 21840
aatgtgaacg tgaaaaacat cattagctat tagaaatatt agtatgtact tactaaacag 21900
agggcatact acctcagggc tgcagaggag cttgatagag gctaatcaag ctgatagcaa 21960
tggtgtagct gtatccccaa aatctcccaa gtcaggggtt ctctttgtag gctaagctgg 22020
ccttgaactc agaggtttgc ctgcctctgc ctcccaatag ctgggattaa aagcatatgg 22080
caccatacgg tgatacgact atttttcaca aacctgaatt tacacttctg tgacctagca 22140
aaatagattt tttagcatct tagagaaatg aaaatcctat tcttacacag ctgtgtaagt 22200
gaatgttcat aacagcttta tttggaattt aagctcaagt gatcttaaat tgggaacaac 22260
ccaaatgcct ttcagtaata ggtgattagt aaatttatat tgttggatat tgctaaacaa 22320
accattgatg cacacacaca caaacacaca cacttgggta gatctcaaag aatttagatt 22380
gagagtatca ggagattaca taactatatt tttatatata atttaaaagc ttttattatt 22440
gcctgtggat ttatatatgt catggcacaa caatggaagt caaaggacaa attttgggac 22500
ttggttctgt aaactcaggc tgtcaggctt ccatggtgaa cactttaaat agtagctatt 22560
taccagcctc tatttaactt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttaaagattt 22620
atttatttat tatatgtaag tacactgtag ctgtcctcag acactccaga agagggcgtc 22680
agatcttgtt acagatggtt gtgagccacc atgtggttgc tgggatttga actctggacc 22740
ttcggaagag cagtcgggtg ctcttaccca ctgagccatc tcaccagccc aacttttttt 22800
tcaaggcagg gtttctctgt gtagccctaa aactcactct gtagacctga ctggcatcaa 22860
actcggagat ccacctgtct gtgcctctgc agtgctggga ttaaaggcct gtgtccagct 22920
gacttttttt tttcttcttc tagatggttg gttgtcctag aacttgctgt gtgatcacca 22980
gcctggctca tagagattga cctgactctg tccttcaagt gctaggacta taggtgtgtg 23040
ctactgcgcc cagcctatgc cattcctgaa gtaatacagt gtcagtagtg gagactgtgt 23100
ttagtgatgc agttagaggt aggggtgaga ggaatgggac tcagtgtgaa atagcacaca 23160
gtacctttgg tgatgtaata gttctatact acaccatagt tacatacata tataaagaat 23220
acacagaaat gaatgcctgt aaaaatggga gaattccagt aaggtgtgaa ttggaccaat 23280
atctttccat ggttttttaa tttaatagcc cgttgaagtt ggtcctgggt agcataatcc 23340
aggcgaggtg ggagtcagtg aggaacataa tggttctgat taccaagagc ttcatcttaa 23400
aaggcaaatc ataatgagtt cagggcctga gggaatgttc cttccttgct aagtgactga 23460
gaatcttgtc ctacggtagc attttgagca ggcccgtgta gaagccgcag ttcattgtct 23520
ggaagctctg ctggagaacg tgtactggat ggtgcagcca cagtgcacgt ggagagaact 23580
ctgagtgggg atgcatgggg tgccctccag aactacctgt atttagaact tgggggaaga 23640
tgaatgaagc agaagtttca aactactaaa atcttttaga taaaatagga atgtcagaga 23700
atttgtagtt gtcattggaa tgtttaaggc tgagtctttc tgagtagtca agccgctcca 23760
tctgtcgttt ccttcatatg ctgttttctt ttgcaacact ctgcttaaca tggggtgtga 23820
ttgcaagtat gtggcctcta agagaggaac ctagtattac attgaaccta gtattaaatt 23880
aattggacat gattttgttt aatacaaaca catagactgc aacaattgtg ggtttaagac 23940
agagtctcac attggttagg agttgctgag gctgggatga ttttgaactt gtggtatttt 24000
tgctgggatg acaggcctat ctgttaccat cctggttagg agggactagg aagttaaagc 24060
tctggtgttc taggccagca ctctatcttt tgagctacat cctaagcact aggactctag 24120
ctcagaataa tggaattgcc ttatttatag gccctagtga ggtcaaagtc ctccttagtc 24180
aatacatgga attagggtgc taatgattga acatgacctt atggaaactc ttatctagaa 24240
cttccttatt cctcttctaa gtctgatcac acagtgtgat tggggttgtt cagtagtctg 24300
tagctgtgaa ctgttctgtg tgattgaaat ccttcagttt aagtccctct agtctgaaaa 24360
gaatgatgac tttctacctg atggcagcaa aaagggcatg atagtttacc atctgcttta 24420
taaggttatg aggattgagg cggtgaccgc ctagtaagat gcgtctggca tatcataatc 24480
actaaacagt gctttctgct agttcaagtt gattgtatgg tcagtgagaa gctatttata 24540
ggtttgtttg tttttttttt aaattgtaag taagcaggtg aagtgttcag acttccatat 24600
gtgctaagat ttatatttct tcattaaaat gatagtggtt atgggactta gatttagttc 24660
tgtctttgtg taggactcct tgctcagttt atgaaaaaaa ttatatttat tttatcagtt 24720
tttggagttg aacagtgttg acatagttat aagatgtgct gagttcttat caggaaagta 24780
ccccaagtag agattaggaa aatgtaagga ggaaaaataa ccagtaatgc tatcttaata 24840
gaattgtcct gtatttgctc aacttgtgag ttcataattg gcttctgcca tgatgaacat 24900
gaaccttgcc ctctgtttga catgtgacac tctgcagtag cagaggcgtt tacgacagtg 24960
atcaatgggg gaatatcctc tgctcttgtt cttttcagtt tattgtgaat gttgaaagag 25020
gaagcttctg tgtgcgttag ccacaggctg agcaagtcat ttcttgagag ctgagacaat 25080
ttcccagaag acactgagag tgggaggcag agagacttcg tcagaagtgg gtgggcataa 25140
tttttaatcc aatgttttag ttacagtatt gttagatatt aaatttcata attcactaat 25200
tcactcaatg ataacaatta agaacaaata atatcctaca gaataataaa ctgtgttcct 25260
tacagtgctg ctgctgctgg tactgttaga agtggagaag tgtgattcct gtgaaaaagt 25320
ggtttcttac cttccccttc ctttaccttt taaaagatgg gtgggcaggg gctcaggaag 25380
gtgcgggaga atatgaatga gccacagaag gctgagcaag tactgtgagc tcaggtgcct 25440
ttggtgatct cactttagag aggctggagg gaaaaggtgg aagagcacaa agcatgtgat 25500
tttctgacct ttttaaattg taactgtgga gtcaaatgtt tccttgttag aaataaacaa 25560
gtcagggctc caaagagcag gaagggaaag gactcaagtt cctggcatct acatctgtca 25620
gcttacaggg aagccctttt tggcctttaa aagcacccac acactcatgg ctcacacacc 25680
cacatacata tatgtagtga aaaaaataaa tctttaaaag aaaattcaag ccgggcgtgg 25740
tggcgcacgc ctttaatccc agcactcggg aggcagaggc aggaggattt ctgagttcga 25800
ggccagcctg gtctacaaag tgagttccag gacagccagg gctacacaga gaaaccctgt 25860
ctcgaaaaac caaaaaaaaa aataataatt caaacagttc acagatttgg gatcagctaa 25920
cactactgga ccagggaaag gaagcagtta actcccgggt tgggagggaa cctgcatgtt 25980
tattcagact gagcatgtgt aagtgattcc tgcctgctta gtgaatgcca gggtcctttg 26040
tttttgttga gaattggaag ttgtgaagtc acagtttcgc aaggttttgg tgggaatttc 26100
acttcctgaa atgtatatat gtgtgctctt tgttagatat ttcagggtgg tgtatattaa 26160
ttaacaccaa aaactgtcta tggttttctt tttagaatct cttttgaata aaagtttgtg 26220
tgtgtgtgtt gatacagggt cttatgtatc aaaggcctgg aattcactat ttagaccagg 26280
ctggcctaga catagacact gacagtgtta acagtgtgtg caccatgctc tgttctcaca 26340
gtctttttca tagaactaaa taatgacatt gctgtgtatc tgagagtttg atttcctgat 26400
aagaacatat aaattggggc tggtgagatg gctcagtggg taagagcacc cgactgctct 26460
tccgaaggtc aggagttcaa atcccagcaa ccacatggtg gctcacaacc atccgtaaca 26520
agatctgact ccctcttctg gagtgtctga agacagctac agtgtactta catataatca 26580
ataaataaat cttttaaaaa aaaaaaaaga acatataaat ttagtcacca gctgtgctta 26640
attctaaaaa cctattatgt tttcctaaag attacttact gttttctatt ttcgtctgcc 26700
aacaaaactt taaaacttgt tttctaaacc ccatagaatg cagttttcct ttgctgactt 26760
gataacttgt taggaagtga tgcaaagccc tgtagttgca caggaccttg ggtgactttc 26820
acgtagtagc cagtgcactg cactgtgctt ttagtcattg ggtatgatta ctgcaaagtt 26880
ttgggttaaa gactgaaaga acatatctga attccaggaa cagagaccac tgcttaagct 26940
gctagctttt ttctagtctt agcgtctaaa ccctgccttg gtctgggaag gcattatgta 27000
ggcaaactga attcctagca ccctgtgtgg ggccttaaca tcttgaggtg tgttggtcaa 27060
aagactgtat gatttgtgtg tgttttggtt tgtattcttc ctgtgattgc aacatgaggg 27120
aatgcatccc tttgcaggat actgttgtgg aatttacatt tttgtggttg tattgctttc 27180
tctaagagct tacattcttc tgttggtgtg ctatccagga aacataatgg tctttattct 27240
gttaagtagg aagctgtcca gtatcttgta cagtgtgtca attataagat gactaagctg 27300
ttaagaaaac aacaattaaa aaaaaacttt ttaaaaagtg cttgctgaca tcatctttcc 27360
ccaaagacta attaatatat gtgtttacta tagcaagatc atagttgttc tgttgtcaag 27420
tgacatgtag tatttacaga ggccttctgt tcagtccaac aggagcagct gagatagatt 27480
catacggaaa ctaaagatat ttaacatttt tattcatatg aagaatagtg tctttgggtc 27540
ttattgctgt ggagacacat catgaccatg gcaaggcaac tcttataatg gaaaatgttg 27600
aattggggca gccttacagt ttcagaggct tagtctgtta tcatcatggt gggaaagaaa 27660
catggtggca tgcaggcaga cttggtgctg gtgaagaagc tgagagttct acatcttgat 27720
ccatagcagc agaaggtgac tgtatgccat actgattgtc accttcctcc aacaaggcca 27780
cacctactgc agccttctaa tagggccaat ccctgtgggc ctagggggac cagttacctt 27840
cagactatca taaatagttt agacagtttg gggttttgtt ttgttatagt tgtctggatt 27900
ttggtttaaa agtggttgct caaaagctag ttaaaatagc acacaccttt aatcccagca 27960
ttccaggagg cagagtcagg cagacctatg agtttgaggc cagcttggtc taccacaaaa 28020
aggtgtgggg aagagggaga aagaaaaaaa aaagggagtg agtggtgagg ttaggagtag 28080
cctaaactgg ggagaggtag tggtaagaag attaggattt taagatcatt ctttgctgca 28140
tattcagttg tgggccagcc tgggctacat gaggccctag cttaaaaaag aaaaagccaa 28200
gagacagtgg aaagagagtg actatttagt atagatttct ttgaaaggag tagtttatca 28260
caaactatat tctctgaagt tgaacattat acattctgtt agtaacttag tttatgcttg 28320
tgtctttttt tttttatgtt tacgattctt aattaaagtt catcttgggg ataagtgctt 28380
acatgctcct catctttttt tttttctcat ctaaatgata caagatgttg tattttagat 28440
gttgaaatta gcataaattc taaatccgaa aattttattt ttaaaatgta gaaatgtgtc 28500
taacctgtta acataatcgt aagtaatgaa gtgtttccag tactcttgta aagaatacag 28560
tttgggtgat ccagttattt tagcttttcc gtgttaagaa ttatttaaat atacttgtat 28620
gcatgctacc gggaaatgat aagtctgttc tcagtttgag cccagttatg gttttgcagt 28680
tatggttttc ctcagtccct gggcactgag acttgagatg gcgtttcact tctgggaagg 28740
taagtgtctt cttcacttta ctgcacttta ctgctgggca gtgtctcagg ttactgtaga 28800
tagagtgcaa acagaagcac tttttttcca acacccagta acaggattat agtctcactt 28860
ccttattcta aaaatagaaa taggtaattt aggacatgtc tcaactctcc tttggtatta 28920
atttatgttt tctttatttc tcctatcatc tataactacc ttaaaatatt aaaatcaaat 28980
aaaaagtatg aaaagttgaa atgacagtta tgatttatca ttctctactt tcagatgatc 29040
acagtcgtgt taaactgcaa agtactgaaa atgattatat taatgccagc ttagttgaca 29100
tagaagaggc acaaagaagt tacatcttaa cacaggcaag tggtatggtg ctgagcagag 29160
gtggaggggc tgctgtgttt cagacacggc taaacatggg tctggacatc tgcaaatgac 29220
atgctatctt ttagttttct gattctgaaa tcagttttgc aaatgccata gttttcagat 29280
ttcgaatata ttgataaaaa gtaaaattgt tcctaatgtt actattttca atggagggaa 29340
gttttttgaa atgtcttggt gcagttctct tcaggtaaat tgactgtatc taacatggct 29400
tggagttctt gtcccctaac ttgtgatgaa gaactagaga ggccctggaa gcccttttct 29460
atccttctct cccctatgaa tatactttca gagagtatag tcatggatgc tgaggatagg 29520
gtctgaccat ctgcagagcc tagacatttg tacactgctg ctctgctgcc ttttctcctc 29580
cccagtggct cctcacagca acctccacag tgcaggaact aggaacttct gagatcatag 29640
cttactcttt atccagtaag aggctaaaca gcaaccagca ctgtcacatt tcccagtcaa 29700
agatgttcag aaatgtaact taaaatattt gagagtttta aattgtattt gattattatg 29760
tgtctctgtg tgtatattta tatatacatg tgcacagggt gtccacagag gacaaaaaga 29820
agtggccctt agcactgaaa ttacaggctg ttgtgagctg tacaacatgg gtgctaggaa 29880
tcgaactctg gacctctgga agagaagaaa ttgtccttaa ctctatctat agtaccatgt 29940
ttgaggtttt taaaaagcca agaggttaat gcaacctgct atttgaagga ctgagaaaag 30000
tgtgaagtaa ttgttttttt aagttcagcc taatgtacct gtgagccatt agaattttct 30060
ctgctacaga aacattgttt cacttgaagt ttcctatgac taaaaggaag gagaaacagt 30120
caggtgtaaa ccttgttaag gatattaatt cacaattcat aggacaaaag aaagctagag 30180
aatagggctg gagagatggc tcaaggttta agagcactga ttgctcttcc agaggtcctg 30240
agttcaattc ccaggaacca catggtgact cataaccatc tgtaatgaga tctggtgccc 30300
tcttctggtg tgtctgaaga cagctatagt gtactcatat aaataaaaat aaataaaaaa 30360
tttttaaaag aaagctagag aatatacatt tgcaaagatg ctatgtttgt acatagcata 30420
aagtgggccc agtcactgag cctccaccaa ggactcagct gctttcccct caggccgcct 30480
ctctttcctc tcctcagatc ttgtcctgcc cttgccccct aaccttcctt ctatagtcac 30540
tttctgaagg tagtttacac ctaggagaag gagtgtttgt gagtcctttg agaactttta 30600
ctctgttgac tcctttgctc atccaaataa gagtgatgag ttgcttcctg ctaggcacac 30660
acttgagatc aacagaatta gcaggaatat cccaaccgcc actctgggat tgctagtgtc 30720
catgcagcta ggtgtagcat tatgaaatag atttgcctgc agtggtaatt cagctatact 30780
gagactaatt cctgaagaga caatagtagt tcattgcagg gagagtatat aatactcagt 30840
ggtcacaatg tgcttgagaa actgacctga gaaattctac atgtgtttat tccaacctca 30900
gtttcacaag agggctggca tgggttgaat gatgaatcat acacatacct tttagtagcc 30960
gtctttaatg cgaatgggga gcataaactt taatttgctg ttttatagtg agtgaaattt 31020
atcttatgta tagtcataat catttaggat ttcaaaaaaa ttcaagaaat ctatattcag 31080
aactgaaaat ggactttgta ctgagaatga gtgtgggcat gtggaaaggc atgtgtgaag 31140
ttaggctctc gttgctatga caaatacgga aaggaaaact gaaaaggaaa aatcatttat 31200
ttggcctcaa atttccagag atatgactca aggtcagctt taaggctaag gtgaggcaga 31260
atattgtggc agtgtggacg aagagagaaa gagctacatg acaagggcat tcctgtgacc 31320
tgcttccccc tcttaggtac cacctcctag tcctggtaca ctaatctacc aacagattaa 31380
cctttgatta ggccagagcc ctcccaagca tccatgagat gacatcaggc ctgcagcact 31440
cgagccccag gtggagcctt tcccacctaa accgtaatac agctattcct tctcctgccc 31500
tttccctcca gatcattgtt cttctttttc cttttactca gttcctacag acaggtctgt 31560
ctgtcttttt ttttcttttt tttttttcct cttttttggt tctccaagac agggtttctc 31620
tgtgtaactc tagctgtctt ggaacttgtt ctgtagatca gaccggcctc caactcagag 31680
atctgcctgc ctctgtttct ctgagtccag agattaaagt cataggccgc cacctgggct 31740
aatgattgtt ttataagcat ctatatctca tatgaaaaaa ttcctgatga acaattccat 31800
ggtttttaac tcagttatcc ctgttggact gttctcatga atcctgatag acaggactct 31860
acacactagg agtgtgagaa tatagcagct tgtctctaga tttttttgtt tatttgtttg 31920
tttgtttttt tgttgttgtt gctttggttt ttgttttttt cctgatttcc tttctgtatt 31980
ctggtgtact tttcccagtt ttctaccctg gccttatgag ttgctcagtt ccacacacat 32040
cagtgcagca ttctaagatg tttccttgca accagctctt cagacatggt tcgctactgt 32100
gatactccca catctaccat gtgccctggt tctttgtgtg cctcaccttc tgcttaggac 32160
atgcagagtg accataacta cccatgtcct gcctatcacc tctctgccag acttgccttc 32220
ctttggctag actgtaaatc ctcaggtttt cttacaacat aaggcctgag gattgagcat 32280
ttggtggtag tgatgctcct ctgtgcacct tgtagggctg agactacatc tcagttgtac 32340
ttgtgcatag catgttactt ggtcacagag aaaacctgca acatttagtg tttgttaact 32400
acagtggtag tccttgttgc ttattaatta gattagcttt ctttcccctg agttttagga 32460
tttcttttcc taaccaaccc cttggtatat catgtccatt gtacagttta aaaaattggt 32520
agcattgcta gtttttgaaa gaactgatac acgaaaaaat tcttgtcttc ttaaaatcct 32580
ttattcttta tactgtaaca gctgttgcat gtttattggt tagtctttaa aagcagtatt 32640
agaaatgatg tattcatgtg cacacagagg acttcactcc tgagttgctt catgattttt 32700
tttaaagttt tatttattta ttttaataca gatggttgtg agccttcatg tggttgttgg 32760
gaattgtttt taggacctct gctcgctccg gtcaactctg ctcaactctg cttgctcagt 32820
ccctgctcac tctggcccaa agatttacta cactgtgtac acagtacact gtagctgtct 32880
tcagatgcac aagaagaggg catcagatcc cattacggat ggttgtgagc caccatgtgg 32940
ttgctgggat ttgaactcag gacctttgga agaggagtca gtgctctttt ccactgagcc 33000
atctcgtcag ccctcatgat ttttttttaa agtgtacttt attttcatat ctgtatataa 33060
attcccaatg aggccagaag agagagatct ggagctagag atatgagtaa ctgtgagcca 33120
caccgtggtg tcctttgaaa gagcagcaag tgcccctaac aaccaagcca tctttctagt 33180
cctgcttcat gattgttgtt tttgagacaa gatctcactg tgtagcccta agtggcctag 33240
aactcactga gtagacaggc tggccttgag ctacagagat cctcactctt ctgggattaa 33300
aagagctcaa ctgggcccat gcgccaggcg tggtggtgca cgcctttaat tccagcactc 33360
gggaggcaga ggcaggcaga tttctgagtt caagaccagc ctggtctaca aagtgagttc 33420
caggacagcc agggctacac agagaaaccc tgtctcggga aaaaaacaaa aaaacaaaac 33480
aaaacaaaaa agcctaaaaa acccaactgg gcccatgatt ttttttttaa ttttttttct 33540
taaaaagaac taattatttt attcaatacg agtacactgt agctgtcttc agacacaccg 33600
gaagagggca tcagatctca ttacagatgg ttgtgatcca ccatgtggtt gctgggattt 33660
gaactcagga tctctggaag agcagtcagt gctcttaacc acagagccat ctctccagcc 33720
tccccataat ttttttttaa gatgaaagaa aaaggcattt atgttactgg gggttttctc 33780
agtgttcttt ttggtagaga agatgatgtt ggttcacctc actgtatgct ttatattgta 33840
agtagatagt gtacattgga tggagagaat agtatccttt aatgtaaggg ggtcgtttct 33900
cagattacta gctttttaca ggtcaacccg agagtttatc catctaagtg attggctaga 33960
caccaagaaa taatctgccc taaagatgat ttaccttcta attggggtgg ggtgtagctc 34020
tggtattgta ttctctgcca catgacactg gtagttggtt acatgttaca gttactttag 34080
gcacagtgga acttagttct atttcagcct tcactcagaa ttattaagga ttctgtctta 34140
gtcagggttt ctattcctgc acagacatca tgaccaagaa gcaagttggg gaggaaaggg 34200
tttattcagc ttacacttcc acattgctgt tcatcaccaa aggaaatcag gactggaact 34260
cacacaggca ggaacctggg ggcaggagct gatgcagagg ccatggaagt gagctgctta 34320
ctgccttgct cagcttgctt tcttagaaac ccaggaccac cagctcaggg atgacaccac 34380
ccacaatggg ccctcccaac cttgatcact aattgagaaa atgccttaca gctggatctc 34440
atggaggctc ctttctctgt gataacttca gctgtgtcaa gttaacaaac aaaaccagcc 34500
agtgcagatg aaggtcggtt gttagagtat ctacctagct tgtgtgaggc cctccgttac 34560
atctccagcc ccacataaag gaggaaagga agtgacggtt ggacattctt tttcatctca 34620
tggcttggtt tttttgtttt tgtttttgtt ttttttttgg ggggggtggt ggaggttgtt 34680
tttgtttttg gagacagggt ttctctgtgt agccctggct gccctggaac tcactctgta 34740
gtccaggctg gcctcgaact cagaaatcca cctgcccctg cttcccaagt gctggggatt 34800
aaaggcgtgc gccaccatgc ccggttcatc tcatgttttt tattttttgt tttttatttt 34860
tttttgtttt ttcgagacag ggtttttctg tagccctggc tgtcctggaa ctcactctgt 34920
agaccaggct ggcctcgaac tcagaaatcc gcctgcctct gcctcccaag tgctgggatt 34980
aaaggcgtgc gccaccacgc ccggctctct catgtttttt aaaaaacccc tatgctatca 35040
ttaatcgaaa tgtaaaagta attggaagta atatatttga tttttcctcc tccattgcat 35100
tttgtaatat gaactattat tcacttttaa ttctgccaga tgatactagg cataacaaac 35160
caatatgcag gtactttcat ggttattttt ttttttcctg caaattcttt tgtattgact 35220
tggggttgtt ggttggttag taatgaaata aacttcccta ttttccacag ttccctgatg 35280
tttgtgtgag atatcacctg cctgttacag aaactgaaag agacagattt ccttttctaa 35340
cagccttttt agctagaata cgaacagcca ggtggtgtta tactgtaggc acctttggta 35400
ataacagcaa agccatatgt aataagacag tgaactgtgt aataataact atataataag 35460
actaatgaac aaggctggct ctgtttcgga cagaaatctt agctgtattt tatagttgtt 35520
atttgaacct agttatccag ctcttcccat aagccctata tggttctttt cctgccaagg 35580
taaagaaaat gtctttacat ggaggtaaag ttttattgaa tgcacactat attttggatt 35640
taagtgcatt tgaagtctta atttactcat caggccccaa tgcactggtt ataacagtgt 35700
gttccagtag catccttgca gccttgtcct tccccagccc ctctctcatg tggtcttctg 35760
tcgttacagg gcccacttcc gaacacatgc tgccatttct ggctcatggt gtggcagcaa 35820
aagaccaaag cagttgtcat gctaaaccga actgtagaaa aagaatcggt gagtattctt 35880
ctcttctctt ctcttctctt ctctcctctc ctctcctctc ctctcctctc ctctcctctc 35940
ctctcctctt ctcttcttct atcttgtttg tgtgtttgtt ttgttttgtt tttttggaga 36000
cagggtttct cagtataacc agccctggct gtcttcactc actgtgtaga ccaggctggc 36060
ctcaaagtca cagagctctg cttgtctctg cctccttagt gctaggatcc aaggcgtgct 36120
ccaccatgcc tggctggtga gtcatattca acattagtgg ttgaatatgc cgcgtgtgtg 36180
atgtgtgatc gttatcttac acatttcttt tattttggtg aatgcttgtg gtggctaaca 36240
gctagtggcc aggttatttc tttctttttt tttttttggt ttttcgagac agggtttctc 36300
ttttatagcc ctggctgtcc tggaactcac tttgtagacc aggctggcct cgaactcaga 36360
aatccacctg cctctgcctc ccgagtgctg ggattaaagg cgtgcaccac caccgcccgg 36420
cagccaggtt atttctgacc aggactaatg gatactttgc tttcctttca tttctttaca 36480
gttttttaaa aatgcatttt atagatttat agtaatacat atcttattct gctacataag 36540
cacatttttt ataagtatag gtgatatgtt gggagtattc cctactttca gccctccttt 36600
ctcccactct cctattatct tttttgtact ccccgacagt tctactactg cttttgtgtc 36660
tgtctcctag attttgtata ggtaggtacc ttaaagcaca cacacacaca cacacacaca 36720
cacacacacc acttctcttt gtgagattgc catatttcat ttggtacatt tatcttagtt 36780
gcatctatag ttctgcaaat gacataactt tgctgttttt ggttaaaagt tttcattctg 36840
taaatatacc acattttctt catttttctg ctgttaggca agtgtattgg attctcaatt 36900
taggttttgt gagtagtgcc ttggtaaatg tcaataaagt ataaatctct ctgtgataga 36960
cctaccttgg acttggagtc ctgtggttag atactcagaa gtgatatagc tgggtcatat 37020
tgtaggtcta tttcactttt gtgtagaacc tctgtacaga tttccatagc tgctggacca 37080
gtttacattt tgaatagcag tgtgtagcgg ctcccttttg gtcacatctt tgccagtgtt 37140
ttgggtttgg ttttggtttg tttagtggta gtggtgtcac tgttgaggtt ttcctttatt 37200
ttgtgtagcc ctggctgtcc tggaactccc tgtgtaggcc agactggcat cacagaaacc 37260
tacctccttc tgcctcctga gtgcccgaat taaaggtgtg gattgctgtg tccaacagtt 37320
ctttcttttc tacagtcatc ctgactagag ggagatggaa atgtctgtgc ggtttcaatt 37380
tgcatttctc tgatagccag ctagactgaa aactttttat gtatgtaatg acatttgtgt 37440
ctcattttgt ctgttcatta gcccatttac tgattgggtt gtttgtcttt ttgtttaatt 37500
ttttcagttc tttatatatt ctagctatta actgtctgtc agataaatta ggtagcaaag 37560
atttttctcc tatttggtag attctgttca tttaactact tgcttttcta tgcagaaact 37620
tcttaatttc atgaggtttc ttttgtcatc tgtttgcata tttttcttaa gtgagtagag 37680
tcctgttaaa agtcattgcc tgggctgggg agatggctca gcagttatga gcactgactg 37740
ctctccagaa ggtcctgagt tcaattccca gcaaccacat ggtggctcac aaccatctgt 37800
aatgagatca gacgccctct tctcgtgtgt ctgaagacat ctacagtgta cttagatata 37860
taataaacaa atcttaaaaa aaaaagaaaa agtcattgcc tagggtgtct gtctgtatgc 37920
gtgtgcccac gctaggggga gcagagttta ttcttcagtg ctttctgctt tatattttga 37980
gaccttcttg ggtcctgttt tgactggact ggttgtgagc cctcaggatc tgcttttatg 38040
aacccaccca ctcctcccca gtgacatctg catcagaaac cacatggatg aagctgcctt 38100
ggcttctctc tgggttctct ttctcttggg ttggtttgtg gacctgctgc ttttgttact 38160
atgactgtgt ggtatgcctt gaaatcatgt ctgattagac ctctagtctt tatgtttgtt 38220
ttcttttctc aggcttgcat tgcccttccc cccaggcctt tagagctttt gtaagagcag 38280
tgctgggatc aaaggtgtgt accaccactg ccaggctaag cgctttaaga tttttctgag 38340
atgtactttc aaatagcatt ggaattttga tggggattgc actgaatctg tagattgctt 38400
tggatagtat agccggtttt acaatattaa ccagtctaca tacttttctt cctttcttct 38460
ttctgtttgt caatattggg gactggacct cagcctttat gcctgctaag caagaatttt 38520
cccagctaag ccatagttcc tgtgggcaga gaaagtcttc agggttttgt ctcccccccc 38580
ccctattgtt gtagcttttg tagagatttt tctttaccta ggtttattac atggtattcc 38640
ttaatgcagt tagaatgagc ttctatcctt catgcgttgt gagcatgttt gttattgaga 38700
taatagaaag acttctgatt ttatatatta tatattaatt tctatcttga tgcaaagact 38760
tctcattaat cctgaatttt cttttgcagt ctttaggatc ttttaaaatg gaatgatttt 38820
atctgtaaag aaggatacat aggcgtcttc ctttcctgtt tgtacctcac tcattttctt 38880
ctcttgcttt acttatgatt gagacttcaa gtgtcatgtt gaataagggt agagaaagat 38940
gagaactttt gtctttctcc tgatttagcc aacatgtttc agatttttct ttggtgtgat 39000
gctggctttt gggttgtcat ttatagcctt tattgtgttg aaatatgttc ttcctattcc 39060
tagcctcctt aggactttta ttatgaaggg atgttgtttt aaatatcacg tatgcaattt 39120
ctccttgagt cattttacgt agtgaattat gattggtgat ttgcatatgt tgaaccaccc 39180
ttgtatctct gggatgaagc caacttgatc atgatgaatg atctcttatg tcttgaattc 39240
cattactgat acttattata gtgagaactt tgcagttttg ttatttgtgt gttggtcttt 39300
gtccgacatt attattagag tgatgctggc ttcataaagt gaatttgcta gcatttgttt 39360
tgctgattct tagtattgtt tctttagttt ccatttcatt cacttctgcg caggtgttaa 39420
ttcttaccat cccctacttt gggatgtgcg cgcatgtcca gtttccatag ctagcctatc 39480
tgagatctct ctgatttatt tacttacttg acacttagag ctataaacat tcttttgaga 39540
actgctttgt atccagagag tttggaatgt tgtgcaattc tatatatttt tctgtttcca 39600
gcggctcata tttctttcag tggtgtgttt tcttttttgt ttcctttttg cttggtgtgt 39660
tgttttcagt ctgtaaatct gcatggtttc tgtagtttct cctgttgttt tgtagttttg 39720
ttcctttgat tttctataag attgtgtgtg aatgtttcct gaggcacaca tctgctagct 39780
ccaggtaggg catcagtgat agaaacaaag tgtagtttgg caagctaatg aatggatagg 39840
tgtgagatta tttttagaaa cattgggaat taagtggctc tactactacc aaagaaaaac 39900
aactctctgt gagactagta atttttggag gcattgtacg gccttggctt tttatatttc 39960
ctttgtttct cttttgtata tatgtatctg aggttaggct gttttttgtt ttttttgttt 40020
gtttgtttgc ttgttttcga aataagtttg tagtgttcag taagatctgg gttgtagtag 40080
tgttgaagtg tttttatctg ttgggctctt tttcagaaca ccagactcaa tatccagtaa 40140
ctcttgacag aagtattaca cctttataaa caatcactaa ttaagagtaa acccattata 40200
aatatataga aataatcaag tagcactcag tcgccactta caccccaagc atttcagaaa 40260
gtaaaggaag ccttatagaa tcaagccttg tttactgagc tgctagttac tgtgagtgtg 40320
actacaagaa aaataccaga gtgcctcaca gttggtatta ggttaataga gaaaatctcg 40380
aggatgagat tagatgagag tcagcaaggc caagtagaag ggtgagtcag ttttgcctaa 40440
aggtaggatg gaaagggaga gctaaagaaa tggtttcagg ggttaagagc aaacactgct 40500
cttgcaggag cccctagttc agttcccaca cctatgtggt agctcacaac catgttattt 40560
cagcttcagg gggactcagt gtcctttctg agttcaccag acactgtatt cacatgcaca 40620
ccccctgcac cacacacaca aacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacaca 40680
cacacgcttt aaagtatgtt tttaaaaaga aaaagggcca ggtgcagtgg tgcatgtttt 40740
ttatctcttc attcaggaaa cagaagcagg aagatccctg tgagttccag gccagataag 40800
taagaccatg tcttaaaaga aaggaggagg gctggagaga tggctcagtg gttaagagtt 40860
ccgacagctc ttccagagga cctgagttca aatcccagac aaccacatgg tggctcacaa 40920
ccattaaatc agacgccctc ttctggggtg tctgaagata gctacagtgt acttacatat 40980
attaaattaa taaaaagaaa gaaagaagga agaggagtgg aggatgttat cagaaaaccc 41040
aatatctata atattttgcc agttcaaatt ataactaaga tttatgtgtc tttagactct 41100
ttttctgtca aaattagaaa gtcttgactc ttaagattat ttccagttta aatataccac 41160
acacacacac actcacatgc tttaaagtat gtttttaaat ctgttctatg acagatttct 41220
ggttcttaat tcttcctaaa ttaatagtta ctgggttttg atgataatgt gtatcatgac 41280
attggcctaa cagaatttcc aataattgcc atctgtagtt gttttccgtc ctctcccact 41340
aatctagaga ttcaggggtg gggcatagtt ttgtttgttt gaatgtgttg caaactagat 41400
gatttgtaaa tttcatccct ctcacgtcaa agtagattca ctttttttaa gattcatttc 41460
ttttatgtgt attattttgc ctgaatgtat atatgtgcac cacataagta cctggtactc 41520
ccagaggcta aaggaagaca tcagatcctc tggaactggg ttaaggcata gtgtaagaca 41580
ccatgtaggt tctgagacct gtgtaggagg aacaagtact cttaactgct gagccattcc 41640
tttagtccct tgtgggcatt ttaatctctg gttccttttt tttttttttt tttttttttt 41700
gttgttgttg ttggtggggg tggttttttg agacagggtt tctctgtata ctcctggctg 41760
ttctagaact cactctgtag accaggctgg ccttgaactc agaaatccgc ctgcctctgc 41820
ctcccgagtg ctgggattaa aggtgtgcgc caccatgcct ggcccttaat ctctggtttc 41880
ttaagtgtca gtgaaagtgc atctgctctt ttagtactta aacgtcattt tggcagggta 41940
taaaaaactt agctcttgct tttacttgaa tttaaataca ttcttttcat tttagtgttt 42000
tagattactg tccaagtcaa atggatgtca tttttttttc ttgtacctat attacgctgg 42060
ggttttctcc ctttttattt atttttttaa attttatgtt tatgaatggt ttgattgcat 42120
atatatatgc taccatgtgt gtgcctgttg gatcccctag aacaaggttt atgggtggtt 42180
ttgtcccatc atatgggtgc tgggactcaa acccaggtct tttgcaagaa caagaagtac 42240
tcttaacaac taagccgtct ccctacctag ccaggctctc tttctcttta acattaactt 42300
ttgaaactgt atcttaccac ttgattggct ttttgcaagt aaatagtttt gtcctttaaa 42360
tagttgcaaa tgcttttttt tgtgtgtgaa aaataaaaag attattaaat tatatttggg 42420
atttgttctg ttcctgtttg tcattgctgg tgtttttgag gggtgtgtgt gtgtattttc 42480
tttgtatttg tcctgctctt gttaatcctg tttctatttc tctctattta ctgtaaaatg 42540
tccttcttgt cctcttaagc tttatccatt acacttatcc tgcactacag ttctaggtgt 42600
caaaacaaac caaaaggctt attcttctga ttggctgtcc tggaactcgc tctgtagacc 42660
aggctagctt tgaacctaga ggaaagccgc ctgcctctgc caaacaagtg ctgggattaa 42720
aggtgtgcgc caccaccgtt cagggtgaca gaaagcctct ttagtgctct ctgaaataac 42780
attcttgcaa gagcttgata cttctagaaa ctcaaactga atatgttaaa gtgtaattat 42840
gctttaagaa cagcacactt ttgggttggg catggtaaca catgccttta aatccagcat 42900
gtgggggctg aagccagctt gatgttcata ctgaattcca ggacagccaa ggctatataa 42960
agagattctg tctcaaaata aagaagagca tattttaatg aatattttat gtttatggct 43020
ttttaaatgg aaaggaaaca ttttatggag ctactttaca gaatattctc attaaaatac 43080
ttaagatatt cttaggtttc agtacttgga gaagtatagt atgtatgtgt gagatttgtt 43140
tttatggttt tataatatgt ctaaactatt cttaaattta ggttaaatgt gcacagtact 43200
ggccaacgga tgacagagaa atggtgttta aggaaacggg attcagtgtg aagctcttat 43260
ctgaagatgt aaaatcatat tatacagtac atctactaca gttagaaaat atcaatgtaa 43320
ggcttttctt gtttcaaagt ttcagtttta tctgatggtc ttaagaattc ttgggggttg 43380
atactatact tacttgcctt tggatatttg taataatatc taggtataag catgttttta 43440
gagtatttct atataaagta actctttatg cattctgaag aattctaaaa acaacaaaga 43500
attacaatgt tcaggttaat attaatattt aagaattgaa aattaactat tggagctgga 43560
aggctggctg tagtgttctt gtagaaggcc caggttcagt tcccagtacc catgtcacga 43620
ggcttaccac tgcctgtaac tcctgctctg ggaaatcctt gtataagaaa aatgctagaa 43680
ctaacttctc cttgattttt acatttcaga ctggtgaaac cagaaccata tctcacttcc 43740
attataccac ctggccagat tttggggttc cagagtcacc agcttcattt ctaaacttct 43800
tgtttaaagt tagagaatct ggttgtttga cccctgacca tggacctgca gtgatccatt 43860
gcagtgcggg catcgggcgc tctggcacct tctctcttgt agatacctgt cttgttctgg 43920
taagtgtcat gcgatctcat tggtgttttg tgcttctctg ttttgtttta tcattttata 43980
atgttgatga taaaaagata aataattttg catgactggt gcctgaggag gttagaagaa 44040
agcattgagt ccctgaaact ggagttgcag atagtaagac cctataactc gtgggtggga 44100
accaaaccct gatccccttt aagagcagcc agtgctctta accactctgc ctgttaattt 44160
gtttttaact gtttctatag gcagcagtaa attttgaagt aatatcccaa aactctaggg 44220
tttttttttt ttaaacactt tacttctata gtttaaattg actctagctc ctgcaggtac 44280
atgtgtgtcc atgacaatta taaagattcc ctagaaagtc tcaaccaggc ttggctcgta 44340
cctttcatcc caacactaag taagttgggg cagaaaattt gctccaagtt tgaggttagc 44400
ctgggctacg gagttagacc ctatccaaaa taaaaaagga agaaatgaag aatacagtaa 44460
agtctccctc ctaaaaggga gaaatgacaa aggaaagcaa tcctgaaaga gtgactcatg 44520
cctgttgtct gcacgtctga gccagccggg gttacctagt gagattcacc tcaaaaaaga 44580
agagaatgcc aacgaactgg ggccatggca agcatgagca ctgactccta gtgcatgggt 44640
aaaagatgag cagagtagca catgtctgtg accccagaac gtggtgaagg gcagttaggt 44700
gggtttaata tagtttactg accaccagct tatccaagtc attagctcca ggtccagtaa 44760
aaaacactgt ctcaaaaatg gcttgaattc taccctagac cctactgggt aggagaaaac 44820
tacctccaat aagttgttga ctttaaagat ttttaagcca ctgtgctggt acctgtctgt 44880
aaccccttgc ttgatagagg caagagaagc aagtccatag agagtttgag caagtctgag 44940
caacatgaga atttgtttca ataccccctt tctttctggt actttgtata cagaattaaa 45000
agcttctacc ttcagcaata aatttttaaa tttaaaaatg tgattttttt tccttcttgg 45060
ataagtacat catctcttat ttataaacca aggctaaaaa gtacttccca gggttactgt 45120
gataattctg tatattaatg atattttctg tcctggttaa cgtcagctaa caacttgaca 45180
cagcccagag tcatctgaga ggagtgcctc aattaaagaa agacttttta agatcagatt 45240
ggtgttattt gtagggaact aattgataca ggacagccca gcccactgtg agattatctg 45300
tagagagaat gtcttgtata ttttatggat acaccaccca tcaattaaaa agcctatggc 45360
ttaggcagga agtaggaggt gggacatcgg ggaggcagaa agagttctgg gatagagcca 45420
ggcacgggag gatttgccca ggaagatgtg aagagatgga tgtggggtac ctgaacacag 45480
gtaaccagcc gcgtgtcaga atgtaaatta aaataaatgg gttatgggct ggagaggtgg 45540
ctcagcgggt aagagcactg actgctcttt cgaaggtcct gagtttaaat cccagaaacc 45600
acatggtggc tcacaaccag ccataatgag atctgatgcc ctcttctggt gtatctgaag 45660
acagctactt tattgttatt attattgttg ttgttgttgt tattagatat aataaaaaat 45720
aaatctttgg gacggagcga gcagaggttc tgaattcaat tcccagcaac cacatgatgt 45780
ttcataacca tctgtacagc tacagtgtgc tcacatacat taaataaata attttttttt 45840
tttttttttt tttttttttg gtttttcgag acagagtttc tctgtgtagc cctggctatc 45900
ctggaactca ctttgtagac caggctggcc ttgaactcag aaatctgcct gcctctgccc 45960
cctaagtgct gggattaaag gcatgtgcca ccatgcctgg caataaataa atctttaaaa 46020
aaataaataa attattatgc ttaaacaaac cctaatgggc tactttaaca ttttgcctag 46080
acaagttata gtttcaatca aaacttgaat tgttagagct gagaggtggc tcagtgatga 46140
aggacagttg ctgctcttta gaaaactaat gttcggttct agcacccaca gtgggtgact 46200
cacagccctc tccagctcca gggatcacat gctgtcttct ggccgctgtg tgcatctcta 46260
cacacttggc atgcacacat acacatgcac tcacaaatct ttaaaaaaca aaaaactcat 46320
ttactaataa aattaacctt ttgcttaaag gcagtagatt ctgttaatga tcaatattaa 46380
aactgggtta tgagaaccgg cggtctttgg cagagtgttt gcctagcatt taagggttca 46440
tgagtttcaa actgcattgg atgttcatac ctgctctcta ccaactgtgc cttgctcatc 46500
cttccttctc ttcagtttat ggtttgtttc taaaaccaga tcagtagtcc agagctcaga 46560
ggtaattttg taggtcaagg ctttcctatt tcctgccatc ttttaagtgt ctgctgtaca 46620
tccacaaagc atgtctttgt ccagatttga gatggggaag ggcactgagc agcaaacttt 46680
atctctgaca aaaccatttt ttaaaactat ataaataatc ctaatcatat ctgggtgtct 46740
gtgtgcatat ttctcacccc cccccccatg tgtgtgtgtt aaattatcct tcttttaaga 46800
aggaacctgt tcacagctaa ggtctgagca gtgagtggcc ttatattgct tttttttttt 46860
ttcaactcaa acaacttggt tttacctttc ttgcagatgg aaaaaggaga ggatgttaat 46920
gtgaaacaat tattactgaa tatgagaaag tatcgaatgg gacttattca gacaccggac 46980
caactcagat tctcctacat ggccataata gaaggagcaa agtacacaaa aggagattca 47040
aatatacagg taaactcagt atcattagtg tcaaataacc atgttccatc taaatcctca 47100
gccttcccct acttcatttg gtagatccag ctgactgtct agaattcata aaactttcca 47160
cagttcaaga ggcaaagatg aaagctagtc accaagagtt caagaccagc ctggtctata 47220
cagtgagatc ctgacttaat tttttttttt cttcaagatt tatttattat tatatctaag 47280
tacactgtag ttgtcttcag atgcaccaga agagggcgtc agatctcatt actaatggtt 47340
gtgagccacc atgtggttgc tgggatttga actcaggacc tttggaagag cagtcggtgc 47400
tcttaaccac tgagccatct ctccagcccc caattttttt ttttatatgt atataagaca 47460
catatataca tatatacttg tttcctcagt ggaaacaaga ttcaattaaa ataatttttt 47520
tcatatgaga agatttcagc atttaattat tgaaagaaaa aaaaacccag aaaacataag 47580
tacttttatc ttagtaaaaa cttactgtag aggcctgagg agatggctaa gtggtcacag 47640
gttacaagca cttactgctc ttccagagca cccaagtgtg tttttaagaa ctcatgtcgg 47700
gcagctccag gggatccagc atctctggcc tctcatggca cttacagtca tatgcacata 47760
cctaaatgca cacacacaga actaaaaatg aaggaaatag ccgggtgtgg tggtgcacgc 47820
ctttaatccc agcacttggg aggcagaggc aggcggattt ctgagttcga ggccagcctg 47880
gtctacaaag tgagttccag gacaaccaag gctatacaga gaaaccctgt ctcggggggg 47940
aaaaaaaagg tggaaataaa aattttaaac ccttcatgtg ggagtaaaga ctatttctat 48000
ataggtactt tatagctgaa taacttcagt tcttactaca gacataaagt gctaggagta 48060
aactttacaa actttacatg tctgatggtg acattctcag gtggtgtctt tttttttttt 48120
ttggtttttt gagacagggt ttctctgtgt agccctggct gacctggaac tcactctgta 48180
gaccaggctg gcctgaactc agaaattcac ctgcctctgc ctccccagtg ctgggattaa 48240
aggcgtgcgc caccacaccc agctctcagg tggtttttat tgtatattta tagaccgtaa 48300
gctcaaagag tatcagaact tagtttcatg tgataaggaa aagtgtaagg tagaaagaga 48360
aataacagta tatccttccc tgcatcgtct gcataataaa gacataccta gatcgaaacc 48420
aacaatctta atccactact ctttgactat ctatttataa atatctgctt taaaatagaa 48480
tatatctttt agggggctag agagatggct cagcagttaa gagcattgac tgctcttcct 48540
aaggtcttga gttcaaatca cagtaatcac attgtggctc acaaccatcc gtaatgagat 48600
ctgatggcct cttctgatgt gtctgaggac agctacagtg tacttaaata taataaataa 48660
atttaaataa atagaataca tcttttaaat caattctatg tgattatttt aaatgtctat 48720
gaatgtgttt gtgtttgtgg gcaagtgctg ggataaaagt taatgtcaag tttacctgtc 48780
tgttccctgc ctcatattga gtaattgcaa tttgtagatt gtgatttaaa gaaaacaaat 48840
tttattgttt tttatttctg ttctatacct agaaacggtg gaaagaactt tctaaagaag 48900
atttatctcc tatttgtgat cattcacaga acagagtgat ggttgagaag tacaatggga 48960
agagaatagg ttcagaagat gaaaagttaa cagggcttcc ttctaaggtg caggatactg 49020
tggaggagag cagtgagagg tatgtgccat atatgtgcta gcctaccgag atatgcgggt 49080
agtcactaca ctcagggagt ctgcgacagg accaccctgt gttcagacag ttaatgctcc 49140
ttttacttgt gtcagagtgt ttaggtggta tgtgatgaca taaatatctt cagagagttt 49200
tccgtcatca taagaaagcc ggtacagggc ggggcagtgg tggtgcatgc ctttaatccc 49260
agttggtggc ttactaccaa cttaactcca gcttttttgg gatccaaggt ccttatggtg 49320
gtttgagtgt gcttagtcca tgggaagtgg cactattatt ggccttgaag tggctttttt 49380
ttttttttta agtttattta ttgtatgtat gtgagtacac tgtagctgca cagatagttg 49440
ttgggaattg aacaagggct cactctggtc agccctgctc cctctggtca actctgcacg 49500
cttgctcagt ccctgcttgc acctctaatg gcacatacct aaatggacac acatagaact 49560
aaaaatgttg gaaataaaat gttaaaaccc ttcacgtggg agtaaagact atttacagtg 49620
tacataagta cactgtagct gacttcagac acgccagaaa aggtcatcag atctcattac 49680
aggtggttgt gagccaccat gttgttgctg ggatttgaac tcagggcctt ctgaagagca 49740
gtcagtgctc ttcccgctga gccatctcgc cagccctgga gtggctttgt tggaggaaat 49800
caatcattgt ggggatgggc tttttgcggt cttgtgctcg agccccaccc atggttgaag 49860
agattaggct ccaggctgcc tggagaagac agtcttctgg tggcctttgg ttcaagatgt 49920
agagctctca gctcctccag caccatgtct gcctgcccac tgccatgctt cccatcatga 49980
ggagaatgga ctgaacctct gaaactgtga gccagcccca gttacatgtt ttgtttttat 50040
aagagttgcc atgatcatgg tgtctcctca caacaataga aaccctaaga caagcctcct 50100
taggcttttg gttttttatt tttatttaga tttatttaat ttacatgtat gagtttttgg 50160
ctgcatgtac accacatgtg tgcctgatac acacagaggc cagaagaggg tgtcaggtcc 50220
tttaaactga tcattcagac agtgaactat caagtgaata ctgggaattt tccctggctc 50280
atttgcaaga acaagtgttc ttaaccactg atccatttct ccagcccaag aaatcaaaat 50340
ttgaaaacat agtaatgata aatttaaaag ctattgttta gagacaacaa aaactccaat 50400
actgctcata tacagaagtt agtgtaatta ggtgataaaa ataaatagta taatacagaa 50460
gatgagttgt ataaaaatac ctaattggcc gggcagtggt ggtgcatgcc tttaatccca 50520
gcacatggga ggcagagaca ggtggatatc tgagtttgag gccagcctgg tttacagagt 50580
gagttccagg acagccaggg ccacacagaa aaaccctgtc tcaaaaaaac aaaacaaaac 50640
aaaaatgccg gccagcaaat agaagcctaa tgacctaagt ttgttcactg agtcccactg 50700
tagaaggaag atacccaact tctcacagtg tcctctgacc tctacaggtt tatacctctc 50760
tttctcctcc tccctctccc tccctcccca cctctcatgc actcaagcag agtaattaaa 50820
taaaaagaga aattcagagc tgtatgccta tccccatgca cttaggaggc agaagcagga 50880
gaatctcaag ttcaaggata gcttacatac tgcgatcctg tctcaaagca aatcattaat 50940
cctatctata tctagtcaag gctcatgctt ggatctgaat gagacctgat gccttggtgt 51000
tcttagtcag aacagatccc ccactttttt ctcctctgtt tgaaagatga tcttttagca 51060
tgccttatag tttggatttc tctaataatt gttcttcttg gttagaatca agttaaatgt 51120
tttgactaga aaaggtcttg tgatctagta gacattgaag agccagtcaa gatttttttt 51180
ttaaatcaag ctgcatgttc aaagctgtga cttaaaaaat gactgccaag ccgggcatag 51240
tggcgcacgc ctttaatccc agcacttggg aggcagaggc aggtggattt ctgagtttga 51300
ggctagcctg gtctacagag tgagttccag gacagctagg gctacacaga gaaaccctgt 51360
ctggaaaaac caaaaaaaaa aaaaaaaaaa aagccaagac tgaagcactc acagtgagtg 51420
aaaagagatg ggttttgtga gatttttttt tttctagagg aagagagtaa atggctgaca 51480
tgttgacatt ggccattttt caatggatgt cagagaactt tcattgaaac aaaattctat 51540
gttggacagg aaaatgggtg ctagatgtac ggatggtcaa atagaagact gggtaacctc 51600
caaacacagc attcatagaa attgtcaaca gtatttgtca aaggacattg aattttcata 51660
tgctgtcacg caacaggacc agatgctgag aatctccagt ctgtctcctt cgtggtagag 51720
aggaaagcag agtgtgcaga aaacatgtct gtcttagctt caggtcctgt aaaagcgtta 51780
cttactgtag gcacagcaga cgtgaccctg aactgtggag cacaccactg gcctgtggag 51840
ccgcttgtcc ttccctttgt tactgcagta cactgaatga gatggaaagc atacaaatga 51900
gtgtccatgg tttgatggtg gcctgggccc cactgtcagt gtgatgaagg cctgcagtgc 51960
agacactcac ttgtttctgt ctattcacag cattctacgg aaacgtattc gagaggatag 52020
aaaggctacg acggctcaga aggtgcagca gatgaaacag aggctaaatg aaactgaacg 52080
aaaaagaaaa aggtggttat attggcaacc tattctcact aagatggggt ttgtgtcagt 52140
cattttggtt ggcgctttgg ttggctggac actgcttttt cactaaatgt tctataaatt 52200
aatagtttta cccagcacct ttctgcacta gtagctgacc gtggtgcatt aatctcaagg 52260
gtttgttagc aatgcctcat acccagaaac actgcgctag agtagacatc agccagataa 52320
gggatattac agtcacaagc ccagcatctc aggactcatc actgcaggtt cctctgagac 52380
ccagactgtc aatggctcac aataaagaca agcatgcttg ttggatactg ttacttctta 52440
cagctgcgtt cacaccagtg tattgagaaa tcctttatcc caaggattgg cttttggagg 52500
ccttctggat tttaacctgc acttgatata agcaataaac attgtggttt ttttctacat 52560
tattaatgga aagaaaatat cctttaaaca atgtatgtaa tatgtaatgt actgttgaaa 52620
tgggcattac aactttatat aaccatttta gggtaaatat attttataag tacctattta 52680
atcttacttt tgtagttaaa tgtacttttt aaaggttcaa tctgaaagtc tgttatcata 52740
gaaaaataaa ttgtatgttg actcagttgt atactgaata cattttccct ttcctaagca 52800
gacgtttgat agaggcagtt gaaactataa gcaagctaag actactacac attcttattt 52860
cctttctatt tatgctttat cttattttaa aaagaaaaac aaaaattttc taaacatgtc 52920
attgaaggaa attgtttttt tctgcgatag ttaagaagtg acagttggtc aaaatatagt 52980
tgaaaacaaa caaaaacttg gtttctgcag gatgtggtag cacacacagt gctcaggaag 53040
ctaaaacaag aggctcaatg gtttgaagcc agccaaaact acatagcaag gtcctatctt 53100
taaagataag agaaaaatag aggtggtgga ggagagatca gacaacacca agaataagaa 53160
atcgattctt agccatattt aatggacaaa cctgtcatct cagcttttgg gagatagagg 53220
cagaaggctc acaagttcaa ggccagcttc aactacatag ctagccccag agtttggggc 53280
cagtcaggac tgcaagaaac actgtctcag aaactgaagt ggtttaaaaa cattttgatt 53340
tctgtaaagt aaagcccatg catgactaca ctgttaattt tttgtgaaaa tgtaaatgta 53400
attacccaga cgggataaat tatggttagt aagttaaagg aaccagtgtt ttatactttt 53460
gatttcagtt cactagactg aaattttgaa gtaaaaaaaa atttaatttc tttacaagtt 53520
caataaatag tacaatggtg tacaaactta cattgtccct tacctttgta atgagtattt 53580
ttaaagcata accactaatt gggttttggt ggtttcaaac cctgcttggt ggaaaggttc 53640
caaaccatta ggacagcatt gctgcttcat ctcttttata tatcacgtaa aagtgcgtgg 53700
taaatcttaa ttagtttaaa tgagacagtt aatttcttaa tgcagtttga accccatagg 53760
tgtagttaga aattgtgaat ggccttgaaa agcatctcac aaagcgtatg atgtatgtgt 53820
gtgtcctgac tcagcatagc tgtcctaagg ctttgaaatg gagagcaggt aagaaggatg 53880
tttcctcttg tctgtttaat ctctgtttaa gcggaggcct tagaattaga tggctatggg 53940
ttttgagctt tctaacactt actggtttgt ttttccaaaa tgtagtatgt tatcctacta 54000
gaccttatta aaacttacag tccaagccaa taaggtggcg tacaccttta atctcaacac 54060
taagaacacc aagacagaca gatccctgtg agttcaaggc tagtctggtc cacataataa 54120
gttcccaggc agccagaaat agacattgag atcctgtctt gaaagaaagc aaaccaactg 54180
aagatagcct gagcttaaac aacttcccac aagaaaaact gataaggctg agaccagtcc 54240
ttccttggac gatatgcttt ctagagatag cattgagcac cactctttct gcctcttggt 54300
gtgtatttta tgtttgtgag gattcctttg gcatacggaa ccctcagtgc tcctccccgg 54360
agcccgtctt tctcccctga acacatcttt aaggatgagt tttaacagga gaacctttaa 54420
gtcacactgt catgttgctt actaaaggta catggcctgt ggtgacagtg tcactggcat 54480
catcctgagc ctgtatgaga tgtgctgtgc tgatgagaga agggtgctgg gcagagaagg 54540
gatactagca gtttctgatg ggttcacggc tttaaacaca gtgtgcgtca gtctcggtag 54600
cagcttattt taactaattt aggaataata gtttgtcttg gatcaaattc tgttttttgt 54660
ttgtttgttt gttttttgtt tttggtgttt ggtttttttt taatttgggg aaaaaatagg 54720
ctttttaaag gggattattg tttactggaa agaatcctca cttcctgttt cctcccacct 54780
tgctgtaatg tcagtggtca caagattcac caggtactgt gttatctcag cctcctgatt 54840
tctatccatg ctcaaaccta aagtgtaaaa gtacacattc ctttttaaaa atacgcatat 54900
gcatcatttc tacgttcagc agaatctaca catttgtcaa gttttccaca gttctcagtt 54960
ctttttatcc attccgttat gtgtcacctc atgtatcaaa cagtgaacat aaaaagatat 55020
gaagacctgt attaattagt ttttgtccaa acagctgtgc tctgaagctg cgtcagagga 55080
aaggtcctaa tttctgagct cagcttccat gcactcggct cggccctttg tcttaaagta 55140
aagctagtgc tgtgagttta gaactgtggc ccacgtttca agttatgaca cagaacagcc 55200
ctctctggtt gtcatttcat ttccttgttt gcttttagca ccagtcccag ggtgctggct 55260
cccattttct gccaggcaca gaaaggctac agctgactgc tttaaaaata gctctgcgta 55320
gattctgcag agaagctgga acctaatggt agtaaaagta cttttttttg gccattgtat 55380
acaatctact taacaagttt acatttctgt caagacattg cagactgaag atctacattg 55440
ccttaatttg ttacttactg atacaaatct ttatttgtag ttgttgtttt ggataggttt 55500
gtatattctt tttttttttt tttttttttt ttgtatgtgt gttgagatag taccttgcca 55560
ttgcccaagc ctggccttaa actcagctca aacgactttc ctacctcagc ctgttgagta 55620
actaacacca caggtacaca ctgtgcacac agctttcaag tataaatctt aaagagatta 55680
ttttaaaact gtagataaga tttcaggccc ttagtcaagc gtggtgcata ccttctctga 55740
gtagggccat ctctgggtcc tggtgagtag tgtctatgtc tgtgggaagg aagggctgct 55800
cggggccttc atctggctga gctcgattca tctgttcata gcatgggaca aaataccaac 55860
agaaatgtcc attctattta catgccaaca cctaacaaag tctcttattt ttaaaactcc 55920
tttatatggc tttgccatag aatcttgtat atactttttt ttttttttca aaatagaaat 55980
gatttttttt ctcattaaat ttgtcatctt attacttgaa acgtgggcct ttgttattgg 56040
cagtggcttg ctcccgagga ggcctgttct gtccaccctg tcccagaacg cactcatttg 56100
agtcagatgc cacagttctt cctcacactg gtctttggtt tataccatgc agcaccatac 56160
ctagagtcac agctgtctct aattgtcccc tgaatatgga atgagagact caggctgtgc 56220
cctcattcac tgctgctctg cactggagcc tgtccccaat cagagaactt gcctcgtggc 56280
cagcagtctt ccttcctggg tcctgagcag cttcaagcct tctgcattag tgctttctct 56340
tagccgtggc tgttgggaag aagacccact gttctccaca ggttgggttg tttttttttt 56400
ttttcctggc tgtccttgtc ccagcacagt gccatcagcc attgtgagca gtgcttaaag 56460
tggaaagcta caccagccta agaggctttg tgtaagctga cgtttaggat ttaaagagcc 56520
tggaccatct gagttctgac tctgaagctc tgcttggttg taaagttcca gttgattctg 56580
agcagtgagg tgtgaggcca ctgtcaccgg tagggtctgc ttggatgccg cctgctttac 56640
ttggatctgt tttgttgggg actgctgcaa ggagaattgc atgggaattt tcttcttttt 56700
ctttacagag acttataagc atcgagttat tctttgtagt cactcattag gcatagtttt 56760
ttttttttaa gacccatgat gctgttgcta ttcccccccc cctttttttt ttggtttttt 56820
gagacagggt ttctctgtat aactctggct gtcctggaac tcactttgta gacctcaaac 56880
tcagaaatcc ccctgccttt gcctcctgag tgctgggatt aaaggcatgc gccaccacgg 56940
cccggctgct gttgatattt taaatgacta ttttaaaaag tcgttcagtg tggaaagttg 57000
aggagaggaa gcctaggtaa gttcctttaa agcatgcttg gctcacctcg gttagtcctg 57060
atcaatctca gtcggatgct aatgtaaatg tcgtgtggca aaacaacttt taatgcagtc 57120
tgactttccc tctaacacgg gcaaggaaga agacaccagc atttgcctct gcagcacaga 57180
ggcagccccc aggataccca cgtagctcat tgcttggttt gctcgcccat tttacttttg 57240
ccttattaaa aataaaatgg tgaagatcca ttcaagtgaa tataatagaa ttatctcaaa 57300
agccatttat cttaatagtc ttacaaataa agtcatttct tagaagctat tccattgatt 57360
tcctcttatt ttgctacccc taaacactat ttgaaaagaa gtaatgagtt tcaaaaacca 57420
cagcgtgtct gttaaatggc aaatttatta ttcttggtaa atgtgtattt aacaaacact 57480
aggaaaggat atctcgtgtg tatgtgagag agaaagagag agtgcttcac aacactttaa 57540
ataatgccag ccatattttc agataagaaa cccagtggag gtgtgactca cgccttattt 57600
tccagcctgt gcagatagag ctgagatgca gactccaggc tgtggtttca gtccctccaa 57660
ggctcaggct cattgtgcta ctccactgtg tatttactta aaccagatgt ttaagcgggg 57720
aaatagtaga caccccacta gtggaggggt ggaatccctt ttacaatgct tcactgacta 57780
tggcggacca gaacgtttct gtgccaaagc cccacttcat tcctttctgt tctgttccac 57840
attctgccag agtcagaacc agccgtttgg tcccaggtcc tgcgacccat tgctatctaa 57900
agagtatggt tccctaatga gaacactgca gagaatcact gttgggaaat caaacaagac 57960
tttgtagacc accacagggg cttggtagat ctgcctgcct atggagaaag aagccagtag 58020
acaggaagaa gcttcattct catggttggg gaggagccta agtggtggag atctagtgta 58080
ttgcctgttt atacagtgat aaagtcaagt attttcatgg gtagagagcg agggtggagg 58140
aagggagggg ctgcgatcgg tgcaaaaatg gaaatacctt taatctccca aaagctttga 58200
ccactggcaa acaattgaaa tatcagcaaa gactactgct cttaatggtc acaccctctt 58260
gtttaaatgg cgtccccctc ccaagcatta aattgcgctg aactatcaca gttttactta 58320
gttctagtag ttataatcat tagcattctc cttcaggaga aaatctaaat gctggaaatc 58380
taattcagag ataacaagcc aactttatgt gcaaacttta tatttaaact gtttctagca 58440
gtgttacagt gattgtccaa actggattag acttttgcgt tgaaatcaaa gtatgggtaa 58500
gtctagcaca tgtaataaaa ccttgctgtt tcttgtggct acattttttt ttttaacttg 58560
tctgtctctt agcctaccat gtagaggtca tttcttgagt taagatggga tggcctaaaa 58620
gattcagtgt gtagttactg aagaagtaag tcccggcgcc tcagagcagt ctgtctcaca 58680
gccccgcttc catttggaaa cctgccattc tggaaggaag cacttggtgt tcttggaatg 58740
ttcatgttgg aatgattttt gttgttgttg ttgttgttga ctttttagtt cagtcttagt 58800
tcttttgtgt ttgtatctat ctatgtacat ctgtgtgtgt ggtggccatg gattgaatag 58860
atgacttctt attttatgtt ttaggccaag attgacagac acctaaatgt tcatgacttg 58920
agactattct gcagctataa aatttgaacc tttgatgtgc aaagcaagac ctgaagccca 58980
ctccggaaac taaagtgagg cttgctaacc ctgtagattg cctcacaagt tgtctgttta 59040
caaagtaagc tttccatcca ggggatgaag aacgccacca gcagaagact tgcaaaccct 59100
ttaatttgat gtattgtttt ttaacatgtg tatgaaatgt agaaagatgt aaaggaaata 59160
aattaggagc gactactttg tattgtactg ccattcctaa tgtattttta tactttttgg 59220
cagcattaaa tatttttatt aaatagacta tgttggtt 59258
<210> 5
<211> 9860
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 5
agtgcctcac caccacctgc ccgcgcgccg ccccatataa aggcgccgcc gtccttaccc 60
ccaggactcg gccccatgga gacgccgccg gccgccgctg gcgcatggcg gggtgaggcg 120
cggcggggag ggtgcgggcc tcggcgggga agcggcaggg agcgctccgg cggggtccga 180
gccgagccga ggggagggga cgggagggga cgggaggggt ggagagggga ggggacggaa 240
gggtcggggt cctgttcccc ggcccgccgg gcctcaggac ccctccaact ttgcccaagt 300
tgggagagcc ggggaagagc accaggttcc tgatcgggat cgcgggccga gcaagcgcgg 360
gtctcgggcc gggacagcct cggcgtcacc agctcccggc agccaaccaa agttttccag 420
caacttttct ccccacgggt caccccagaa acttgccctc cccggctccg ggagtccggc 480
catgggcctt gcgctgcctg ggcctgagct ctgagtgccg gacgggtggg cgaaagtggt 540
ggcctcagtg gggaagcctt gggccccgca acgcacttcc agccccagga ttccatctga 600
gagccccgtc cctgccttct gggtcccctg ggttggcgtg ggggttcgag gctttacagc 660
tggggtagtt ccagtcttag ttcagactaa gttccgatct tcgagccacc agctaacagc 720
tggatgacct tgagcacgtt tttaatgtct gtgcctcagt ttctcccttt atagaatggg 780
aatgggaatg cctagctggg agagcttttg agaggacaac ctgaactaat aacacgatgc 840
agtgtgtagt gccaccaatc cctcatcctg ctggatgtgg ttttgggagg gaggttagga 900
gagagcgcta ttcaccgtcc ctaaccctgt tggttgttca gtaggagctg tggcgcgggg 960
ccttccagga gtctgagcta tgagtggccc ctgtggagag aagcctgtcc tggaagccag 1020
ccccaccatg agtctgtggg aatttgagga cagccacagc cgtcagggca ccccaaggcc 1080
gggtcaagag ctggccgctg aggaggcctc ggccctggaa ctgcagatga aggtggactt 1140
cttccggaag ctgggctatt catccacgga gatccacagc gtcctgcaga agctgggcgt 1200
ccaggcagac accaacacgg tgctgggtga gctggtgaaa cacgggacag ccaccgagcg 1260
ggagcgccag acctcaccgg acccctgccc tcagctccct ctagtcccgc ggggtggtgg 1320
cacccctaag gctcccaacc tggagcctcc actcccagaa gaggaaaagg agggcagcga 1380
cctgagacca gtggtcatcg atgggagcaa cgtggccatg aggtaagtgt cacttctgtg 1440
gccaggacac atgaggttcg catctctcct gtggccagga cacatggaag gatgactgtc 1500
tctgcagctc tggtgggctg gaagaagtga cttccttctt agggactggt ctagagggag 1560
ggaaagcctt ttatgaggct agggtcgcgc tactggtaag tgacagaggc agggttccag 1620
cccaggtccc tctgtccgca gagcttacct tatgctgtgg gtccctccct gaggccagca 1680
ctgtgtctcc actcctctcc tgtaatgtga ggcagggctg taaaggggac cagcccgtgg 1740
gcagctgctc actcacccct cggaacctga tctcaggtgg gtgttgtgag gagggagtgt 1800
gcggatcccg gagaggagca agcgttcagg aaccatagta gtggtagtag gcagtggtag 1860
tagcagttgt tgttgttatt tcaggggctg ggcttctgag gccttcttgt ctcagacctg 1920
ggctcccacg aaaacaggtc cagtgactgt gtccaagagt gacctcaagg ctgggtccag 1980
ctttacatgg gttgtgggca ggtggcctga tgctctggcc tcaggcgagc tgcaacttgg 2040
atccctactg actcagctga agcagcctgg gctggaccag tctctggagg ttccccgggg 2100
ccagagccag gactcagccc ccagtgactc ccacccccat cccccagcac aggaatgggg 2160
tggggaggta ggggcagaga gggaagccag ggctgctgct gaccttggga aacccagact 2220
tctcccgtca atccaggctc caccctctgg ccccactttt ttcccagttc cctccaaggc 2280
aggctgatga gtcagtgctg ggtggatggc tcacagggaa aagttcctgt tggcatggac 2340
ggggagaccc cagacacagg gttgagaagg gatgattttc tggctgccct gagggagctc 2400
ctaggtgggc tgcccaaggc tggcatgaca tcagcctctg ccctccctaa tttgtggccc 2460
ctgtgggaca agttcactgt ccagctggcc ctggcccagc tcagcaggca tgcagctgag 2520
tgctcttccc tccttctgtc accttcaggc cagtcttcct ctctctgact tgggctgagc 2580
ctggatggga ggctgagaaa atccagtttc catgccaaga ggcagcaggt cacagcccat 2640
gcttcgagat tagaaggggt ccctctcagt gtccagcctc atgtagctgg gctaggagct 2700
aggttggatc tgtgtgactc cttcctctgg aggtatgggc caggagcggc tgagccctgg 2760
gagcagccat atgcagtatg tgtttgtatc cagaaggagg agggacatgg gaggaggggc 2820
tgtgatgagg ggtgctcaga ggagcctgct cctgagaagc agagccacgc acccacctcg 2880
ggggtttctg agctggggta gtggcaggag gggaattcca gcctcaaact tcctgtctca 2940
gctgctactc ggttcctgcc cggccacccc ccctccccag gggcaggcgg gctagccccc 3000
ccatcatatg caaatcatgg ggaaattcac ctctgtttcc ttctaaggga atttttttcc 3060
actcgccagg cccagcccag gcatatcttt tcacctgggg aggctggccc agccctgcct 3120
tctgtcctgg ggcaggagca gcctagctgg agtcttctac acacacatcc tatcagtgtc 3180
tgcttagccc ggctggggga ccctgacctt acaggcaaag agaactggaa tgggggcagg 3240
gatgtctggt tttcctgtgc cagcagcgct tcctccagtg cagtgaaaga gactaaagct 3300
agctgtaggg gggcactcca ggcctcatgt gctctaccag gaggagggct ctgatagcgc 3360
ccactgatca gtttttccat ctgctgaggg aatattcagg tgctagggct gctgagaacc 3420
gacttgtccc agccaagatt ttcagtgccc acaggcagtg cactgccctg agagccctgg 3480
catcccatta gttcccagtg ctccaagata ctagcctagg atcatgtgcc cggagggagg 3540
caggtgggcg gatacatgcg cacactgcat acctgagaca aggagccagg cctgggatga 3600
cccagctgcc atggttttga gaggcaggcc agaaggccca aggaaggggg gtgatgtgat 3660
gggggaagca ctgggcattg tgaagacaca gaccagggac ctgacctatt gtggcaggtc 3720
agggaaggct tctcagaggc agtgacatct cacaagggtt ctgaaggaag agcaggagtt 3780
tgccagcagc attgtttctc ccgttcgcca cctgtctctc ataacacact ttgttcaaac 3840
tcaattttgg gagctttgtt ctcccaaata aattctggat cttctgttag agacaggaag 3900
gcaaccgagt ggcccagacc tgggttcgag ttctgactgt ctcttaccac tagccaggtg 3960
accttccttt ccttcacggt agcaagccct ataagaatga agccatatat ctggccacca 4020
gcgggagctc agtgcctgcg aatccctgct cattccctgc gatcagggtc tgtgcctgcc 4080
ttcgtacctg cctgagcatt gacgtacagg gtagtgataa gcataggccc tgggcttgcg 4140
tctctcttcc accgttaact gctgtgtgac cctggtgact aagctgcctt ctctggacca 4200
cagttttcat ctgaaaaaca gggaaggagt tgatgatggt atagtgccct cctcacaagc 4260
ttgctgatga ttcagtgtta gacacttata acagggcctg gttcacagct ctcagcaaat 4320
gggaactttt attataagca ggctggcaga tgtggcagag ggaccgggaa ggatgagtgc 4380
tgccctgggc tggactttgt ctcccctaca atttagagac cttcagaccc tggtgcccca 4440
gtcttgcccc caaatagcct ccatggcccc cagctgcccc acctccctcc ctagcttctc 4500
ttagggctcc agctatcacc ccttacctcc cccactccca ttaaagacac ccacaggatg 4560
tggttggccc tggacttgcc tcttttgcgt aacatttatt ctgttttatt tgccaaatac 4620
gagagtctaa gctgttcact gagggggcag tgagacgtgg ggctgctggt cctaggagct 4680
cttccatgac acctagtgtt acctgggagc cccaagcccc agtcccccat ccctcaggaa 4740
atccagttgg aacccctact ttgcagggcc atctttggcc tgaagccacc aggaaagctg 4800
tcccactgac tgacccctct taaggaagct gcagactgct gggcccattt tcagatagag 4860
gaacggagag ctgcggcagc ccaggagccc tgccaggctt ccttctgggt gcagccacct 4920
gtgggtgggg cgcggcctcg tctgagacca aggcagggcc catgccttac tcagctgtcc 4980
ttgctaagag tcccctagca tcttcctgat ggtctttctg ccttggggtg aagaggcatt 5040
tgggggaatt gccatcttgg gaggaaaagc agtatccttt cactttcaga ctgaaaggct 5100
cctggggaac ttgcttcact ccggcgcttt ctgtcccatg ctgaaggctg gagtcgccag 5160
ccccttcccc tttgcctttc tcaggcccca gtccctgagg tgtgtgtgag gactgaactt 5220
taatccggaa caatctggtt tctcctcggt cagcccagcc ggtgcttccc ccgcccccac 5280
ccacgctgca agaggcgagg gaggggtggt gactcagtgt gcatgtgtac atctgtccct 5340
gtggtcccgg cagctcgccg ggtggggcag gaaccagaag tctcgcggca cctttccccc 5400
acccccaggt gtgttgcaag tggcctggcc ctcccccacc gtggggagca gtgctgccag 5460
cttcctgggc gcttcctcac tttcaggaga tggagcctca gggaaagtcc cagcggggcc 5520
tggccatcct ggagctgtgg gaactggcac tgggaatgga ggccttggcc ttgggcccca 5580
cctgcagagg gccagggcct gagccctggg gaaaggggaa ggggctggtg actccaaagg 5640
ggaagggact gctcactacc accaccaaag ccagggcagg ggtggggtgt gaccacctcc 5700
ctcctcctgc tcaggcctag ggggtggcag gctggccatc agtgtgggct aaccctgtcc 5760
tctccctccc agccatggga acaaggaggt cttctcctgc cggggcatcc tgctggcagt 5820
gaactggttt ctggagcggg gccacacaga catcacagtg tttgtgccat cctggaggaa 5880
ggagcagcct cggcccgacg tgcccatcac aggtgagtgg tgcctctgga ggtgggatgg 5940
tcttactgcc ccagcagccc tggttctccc caagagagac cctctgggag tgacctacaa 6000
cttctagaac tcaagcaggg accagcattt cttttctcag ttttttctgt ccttagcaac 6060
ctgctctgaa tggtggtcat tggaggtcac cttgtccagt cttctgcctc agatctggag 6120
cccctccctc atcctactgg tgggcaggtc gctctttcaa catccccagt ggcagaagcg 6180
cagtatcaca tagtggttaa gcctgtgggc tctgagtcga gacagccaga gttggaatcc 6240
tggctctgtc ccctcttggc gccctggcct ggacagggac ccctcttagc cctgctctga 6300
gccacatgct cctcatctga aacatggggt cggtgtcagc agggggtgtt gacagcattg 6360
ccttcctcgt gaggtcatat aagttaacac acggtaagtg ctgagaagag tacctggcac 6420
atggtagatg ctcagtgtat gttagctgtt accactgttc ttgcaagagc ccccagcctt 6480
tggaggtaaa aactgaatca gtttctctag aagtcttgag atctgggggc agcctgtctg 6540
ggactgtagg ctccaggaag aggggccctt tccacttgca cacttctgtg tccctgtggt 6600
cccagcagct ccccaggtgg ggcatggtga gtggcctgac cttttcccac catgggattt 6660
agcgaccttg tcctggcaat gcaagggaca gagccaagat acttctccca ccccagagca 6720
agctgcggct cattcacgga cccctcagaa caggctggat gaaagccaaa gccaagacca 6780
catctggctt gaacaggcct gatgtccaga aggagaaaag gaacaaggcc agctctgtgc 6840
ttggagcctc tgccatgcag gccctgccgc ctgtgttcag atgttcttgg tcttcaggca 6900
gcaaactgtg ccacgccaag ggaggggctg gggcatggaa gaggcctcag cagagttagt 6960
tcttgccccg gtgaccttgg cgttaaccac tcctgtgtgt ggccatcagc aggttaggga 7020
gccctgtagg cctggctcta ggtcccgctg ggccctgacc tgtgtgcacc cgtcacctcc 7080
cagaccagca catcctgcgg gaactggaga agaagaagat cctggtgttc acaccatcac 7140
gacgcgtggg tggcaagcgg gtggtgtgct atgacgacag attcattgtg aagctggcct 7200
acgagtctga cgggatcgtg gtttccaacg acacataccg tgacctccaa ggcgagcggc 7260
aggagtggaa gcgcttcatc gaggagcggc tgctcatgta ctccttcgtc aatgacaagt 7320
atgttccctc ccagaggccc tgacagactt ggggtccaca ggggaagcca gaggtgccct 7380
tggcaagggt ggagctgggg gctgggctct gcggggccct gtggccatgg gaggttgcgg 7440
gtcttggctc caggcagctt tgagagtgag acggatagct caccacatag gagaaatcag 7500
accgggacca ggcaggctgt ggggtggaga gagtggctaa tttgggagat agagccgtag 7560
cacttatgag gggatgtatg tggttgatgg ttccaggtgg cctctctacg aaccaacatg 7620
gcatctctcg agcagaggcc atgggccagt gggtgcgggc tgccatcccc cgacgacctc 7680
agagagggag ttcccctaaa ggtgcccatg ggctgtggcc ctctagaccg gggatccctt 7740
tctcctccct tggtatgatc ccacccatag agcagttttg cggggtcctg gacaggcccc 7800
agttttaggt gtcactctcc tattcttccc agcaaggctt gccatcggcc ccttctcagc 7860
aattagaagt ccctgcatgg ctcccacctc cagagagttc tttgcaccct ctgcaggttt 7920
atgccccctg atgacccact gggccggcac gggcccagcc tggacaactt cctgcgtaag 7980
aagccactca ctttggagca caggaagcag ccgtgtccct atggtatgga acccagcctg 8040
ccctccccgg ccctcctcac tcctgccctt cctctcacct gtctgcctgt gccctgtttt 8100
cctcttgggg acctccacca ttggaccacc caaccccgtt tcctgtgcca ccccttccct 8160
gctctcatcc ctggttctga agtgcccctg cttagagtcc ctcttgattc ctcttccagg 8220
aaggaaatgc acctatggga tcaagtgccg attcttccac ccagagcggc caagctgccc 8280
ccagcgctct gtggcagatg agctccgtgc caatgctctc ctctcacccc ccagagcccc 8340
aagcaaggac aaaaatggcc ggcggccttc accttcatcc cagtccagct ctctgctaac 8400
agagagtgag cagtgcagcc tggatgggaa gaagctgggg gcccaggcat ccccagggtc 8460
ccgccaagag ggtctaacac agacctatgc cccatcaggc aggagcctcg cacctagcgg 8520
gggcagtggc agcagctttg ggcccacaga ctggctccca cagacgctgg actcactccc 8580
gtacgtctcc caggattgcc tggactcggg cattggctcc ctggagagcc agatgtcgga 8640
actttggggg gttcgaggag gaggccctgg tgagccgggc ccaccccgag ccccttacac 8700
gggctacagt ccctatggat ctgagctccc agccaccgca gccttctctg cctttggccg 8760
ggccatgggt gctggccact tcagtgtccc tgccgactac ccacccgcgc cccctgcctt 8820
tccacctcga gagtactggt ctgaaccata cccactgccc ccacccacat cagtccttca 8880
ggagccccca gtgcagagcc caggggctgg caggagcccg tggggcaggg caggcagcct 8940
ggccaaggag caggccagcg tgtatactaa gctgtgtggt gtgtttcccc cgcacctggt 9000
ggaggctgtg atggggcgct tcccacagct cctggacccc cagcagctgg ctgccgagat 9060
cctctcctac aagtcccagc accccagtga gtaagctgcc tgtggctggc aagggcagca 9120
cccccagcct ccaagggccg tcaggctggg ctttgggcca ttgagcagcc cattcccagc 9180
cctgaggccc accccagagg ctggacagag ggaggattca agtcgggaag gaaacccaca 9240
aaccaaagat actgtaggat tggttctggc ccatgcagca cctctagctg tctgcctcag 9300
tgggtcagaa gcgatcaccc tgttgataca cattgtatct ctgtagttta aggagacgct 9360
gccggtaacg gcgtcggtcc gtggctgagg cccaaaccgt cttttctctc agagggtggg 9420
gagggaggtg ggggcagcag aggcctgggc tgggtgccct gtgcacgcca ccccacttcc 9480
gccctacccc tgggacgttg gccttggctg gctagttggg caccgtgtgc ctgccctcca 9540
agggcctcct ctacgccaat gaggcctcat ctgtgctctc gctgggcacg tggcttcatg 9600
tcagtaagca agatgcttct taataaccca ccttctgccc cactctattc cttatcctgc 9660
tgcccctgta ggggtcaagg gccctccgtc tacaccctct tcttctcctc catcctttat 9720
tcagagtcat ctcgcccttc cccatgggtg ggggaacctg tgtttgtttg tgtgcacatg 9780
taaattttaa atattttaag cagaaagtcc ttacctcctg taacacatca ataaagtaca 9840
atcattgtga gccctttcaa 9860
<210> 6
<211> 9468
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 6
ttccgcgtca ttgcccttaa agcacctgcc cgcctgtcgc ggctacgaag gtgccgtcag 60
agcccgagac tcggctccat ggacacctta cagacgacgt ccggcgctca gcggggtgag 120
tgctaccggg tggaacgggt gctgcgctgc gttgggtctg actccgggag ggtcgcgcgc 180
gggcagtgtc tccatcgctg ggaccccgct gagttcaccc tggtgcgtgg aacggggtgt 240
cttggggcac ccggcgttct ccgggctcta gccaggacct cctcgcgtca ccgggcccgg 300
tagccaacca gagtcgccca gcaacttttc tctccgtggg tcaccccgga aacttgtcct 360
tcccagaata gaactctgtc cctgagccga agtatgagac tcggagacga aggcggtggc 420
cacaatgggg aagcccctgg gtcccctgcg cacttccagc cccagtttcc ttctgagagc 480
cccgcccctg cctcttgggt cccttgggtt ggcatggaac agaacggggt ttgggggtgg 540
agtcagacca agttcaaatg tttgtatcac aaactttgag ttgatgatct tgagtaaacg 600
cttactgcct gtgcctcggt ctccctcttg taaaaataac taatgctgag agctctttga 660
gagcacagcg tgggctgaca cgtgagaatg gctttgaata gcgtcttctc agttcgtgtt 720
gccccattct gtggaagaga gtctgaaaga gacctatatt gggcattgct tgcccttaac 780
cctgtggtct ggtcaatagg agctgtgatg gacacattcc aagaatgtga aatatgagtg 840
acccttgtgg aacgaagcct gtccaagaat ccaaccccac catgagtctg tggagtcttg 900
aggacagaca cagcagccag ggtcgacctc agccagacca ggatcctgtg gctaaagagg 960
cccctacttc cgagctgcag atgaaggtgg actttttccg taaactgggg tactcgtcct 1020
ctgagatcca cagtgtcctg cagaagctgg gagtccaagc agacaccaac acggtgctag 1080
gggaattggt gaagcatggc tcagctactg aacgagaatg ccaggccctg acggccccca 1140
gcccccagcc ccctctggtg ccccggggtg gaagcacccc caagccttcc actctagaac 1200
cctcactccc agaggaggac agagagggca gcgacctgag acctgtggtc atcgacggaa 1260
gcaatgtggc catgaggtat gtgtggagac ctgtggaata gtgtctgtag ctcttccttt 1320
gggaaggggg cttggctttt ctcttggact ggtgaaggaa cacaaaagct gtctgtgaga 1380
tcccaccatg tgccagaagg aaccccttaa gccttaaaga cttcctcagg gctgtttctc 1440
caatgctata agaaggaaaa cagctcaaat ccttgccaag agtcacactt cttgataaat 1500
gagaagcaaa gattcaaacc cagccttctt tgcctggagt gtaccttgtg ccatggtcta 1560
tccttgccta cggcatgagg caggacagta taagggatta acccgtgggc cagtcactta 1620
gccagttggg ctttttcttc tcctgtcaaa ctttccactc aggtggcccc tgtggggaga 1680
aaattcatag aacgtggaga gttacaagta ctcagtggag ccgggcgtgg tggcacacac 1740
ctttaatccc agcacttggg aggcagaaca ggcagatttc tgagttcaag gccagcctgg 1800
tctacagagt gagttccagg atagccaggt tctatacaga gaaaccctgt ctcaaaaaag 1860
aagaagtact cagtggacag atgttattcc atgacttgag tcttctggga tctccttgtc 1920
cccgactcga gctcccactg aagcaaggct cattagttat tcagagcttc ctagccctaa 1980
ccagctgtga ccttttggtc agatctggca tcttcagatg cgtgtgtacg ggtagcctga 2040
tgctctgggc tcaggtgtgc tgtaatgaga atctatactc cctgaagccg ctcaggctgg 2100
cctgacctct gggggttccc agatctcctg ccgcctttgc atatctctca aggaatgggg 2160
tggggtggag gcagaatggg agccaggctg cctctgacct taaggagccc tgatttctcc 2220
cttctatcca ggccgcaccc tccagctctg ctttctccca gctccctgca cagcgggctg 2280
gtgagtcagg actgggtgga taaagtacaa ggaaaagatc ctgttggcag ggaccagggg 2340
agaccccagc aaaagaacag gaagaggaga agtctccttt ctagatcccc tgagggctct 2400
cccaagagga ctgcccaact tgttatgatg tcagcttctt cgccacctgg ctcctggtcc 2460
tacctactcc cagcccagct gggtcaagtg agctgtccag ctggtcctgg ccctacttag 2520
ctggttcatg gaggcagccc ttctctacca cctttgggtc tgttgtcaca tctttaaaat 2580
gggccgatcc tgggctggaa ggctgagaaa tgctggcttc tctgccagag ggcagaaggg 2640
tcaactggtt accttccgag tctcgagttc tctctgaggt cctgaattag gaggggggtc 2700
tgacttcccc tgagagtcct aggctgggtg ttaggagtct tgtgggcagc catgtgctct 2760
gggtatttgt ttctgggcag gaggaggagg ggcctgggtg ggaggagggg cagtagtgga 2820
ggggttcaag agagctgata ccaaagagac agacagccac tgtctgccct cttgcctgcc 2880
tgcctatctg ctgggggttt ctgagctagg gtggccacgg aaggggaatt ccagcctcac 2940
acttcctgtc tcagcagctg cttggttcct accctgctgc tacacacaca cacacacaca 3000
cacacacaca cagacacaca caagggcagg ccggctaacc cccaccatat gcaaatcgtg 3060
gggaaattca cctctgtttc cttctaaggg aattttcctc cacaggagtt aggcccagcc 3120
caggttgttc tctccacctg gggaggctag ccctgccttg tccttgggca ggaatgggag 3180
ctttccagag tcacggccct gtcagggtgg ggggccctga actgtggacc agcaggactc 3240
tgtgggtggg aggaagttgg ttttcctagg ccaaccaggc ttcctgcatt gcagtgagct 3300
gaatgagctg tccaggcggt ctgggcctca ggcctcaagg gctctccctg ccaagaatag 3360
ggctctgact acctgctgag ggaactgtcc cagtgccagc actgctgagg gcagacgtgt 3420
ccccaacctg ggttttaaat gcccacaggc ggtatacagc ctaagcaccc tggcgtcttg 3480
agatcctcca acttgtcttt gctggtccag ggagggctcg tgagtccaca tgtggacact 3540
gcacgctcag gacagcgagc catggggcag atgcttacct cacacctgag cgaggcagtg 3600
tgatgggaca gcagtgggca ttgtgaagcc ccagactggg ccctgccctg gcaggtgcgg 3660
aggtggggtg gggtggagtg gggaggggtt ctcggaggtt ttgacatatc acttggcttc 3720
cagaaagaag agaagaattg gcagcaaatg gctcatcatt tctctgtctg tggggcgggg 3780
aggcatctcc ctctccatat gcagaacaca caccatcatt gataattgag ttcagaaact 3840
gctcttctcc cacatgaact ttgggtcttc tgtaagggac agccagcgct ccaaccagta 3900
gccccactcc ctggttcagt tttcaccact tggcagtagc cagggaactt gtccaagtga 3960
cggaagtctt cctttctaga cagagtgatg gtcaaggtgg actccgtgcc tttcccacct 4020
atcagggctg ttggtaccta agcaacaaca gggtagttct gatcactggc tactgtgtga 4080
ccctagtgac tactaagtta ccctctctgg accacaggag cggaggcagt gtacttctgg 4140
ttttgcttgc tgatgattcc gtgtagagcg cggaatggcc aggtttgcag ctccctgtga 4200
atgttaaccg acttatgagc aagccgcctg ggaccaggag ggcgcgaggg ctcccttggg 4260
gtgggctttc ttcctctcca actcagagac ctctagctag accttggagc cttgccctga 4320
gatagtgtcc attcccactc tgttctcttg gggctcaagc tatcgctccc ccaaagccac 4380
ccacaggatg tggtctgcca tggacttgcc tcttttgcgt aacatgtatt ctgttttatt 4440
tgccaaatat gagtctgagt cgctcactct ccccagagta acaagaggca gggctttctg 4500
gggagggagc cccaagctcc agtcctcctt cagcactccc agaaaatcca ccttgccagc 4560
gcctctggcc tcaagcctta gggagctctg tgtccctggg gtgaaagagc ttgtctgcaa 4620
aagctgtcca ccaagcttgt gggcagagac acagaccagg gcaagcagct aggctgcttc 4680
cgaggaaagc cgtgtttaga tagaacaagg ccagggcctg atgccccagc cctcctgtga 4740
gcagagttcc ccagtaattt cctgcccatc atctgccagg ggtcacgccc tccctggggc 4800
ggggggtagg ggagggcagg gaggggcagg gcagtctttg cagggaacag gcctcttaag 4860
aggaaaagag gtggcctttc actttcacac ggaaaagctc ctggtgctgt tatttcctga 4920
ccccttgtgg aaggacgctc cccgtgcccc tgagacctca tgcagactga actttaatcc 4980
tcaacagtct ggtttctcct gcttaacatg gccggtgcct ccctcccccg cctcccttgc 5040
tggtgcctcc ttgctgtgta gtgttgaggg aaagaggtga ctcagcctgc atgtgcacat 5100
ccacgtcccc gtggtccctg cagcttgggt ggggcaggat ccccaagtct cccatcactt 5160
ttccccaccc ccaggtatgt tgcaaatggc ccgaccctcc ccctctacgt ggggagccag 5220
tgtggctaga ttcctgggtg gatccacgct tttaggagat ggaatcttag ggaaagtccc 5280
ttccaggggc tggccatcag gcactgtggg aaccggccca gggacaagac cttaggccct 5340
actggcagag ggccatgggc tgagtcctac agttgcccag caaggccaag cagggctaga 5400
ttgtggctcc cttcttactt ttgctctgac cggactgact acatacagac tggctactct 5460
gtgagctaac ctttccctcc tctgccagcc atgggaacaa ggaagtcttc tcttgccggg 5520
gcattctgct ggctgtgaac tggtttctgg agcgaggcca cacagatatt accgtgtttg 5580
tgccatcttg gaggaaggaa cagcctcgac cagatgtgcc tatcacaggt atgtatgccc 5640
tctggaagta ggatagcctc actctactag ggaccctggt gcttccccaa agggtcctta 5700
aatagggtca gcaccttcta aactgtaatg aggaccagcc tgtctttttc aattcttgtt 5760
gctttcagca gcccagttca ggcaggaaat ggctggaagt caccttgtgt cgctttggga 5820
tgccttcctg atcctattgg agtggggtgt cccttcttca acatccccgg tggcagaggg 5880
acagtgtagc ttcatatttg aaattgtggg tgctgggcca agaagacagg gtaaagggct 5940
tggccctaag ttactcaggt aagggcttca agtagacatt agctgtgggc tcttccatct 6000
gtgaaatggg acagggtaga ggtggcatcc tccaaacact gctgaaggag cagttgagaa 6060
tggtacagaa gtgcttaact cagtgcagtg tgaaagctcg gcatagtgtg aatgcccagc 6120
tgcgaccatt gctctcatga aagcccccac cttgaggagg agggagtgac aagaggcagc 6180
tttttaagaa gtctgcatag gctggagaga tggctcagtg gttaagaaca ctgactgccc 6240
ttccagaggt cctgagttca aatcccagga actacacggt ggctgacaac catctgtaat 6300
gggatctgat gccctcttct ggtgtgtctg agctacagag tactctaaat aaattattaa 6360
gaaaaaaaaa taaggttggc ttagataaaa accatagact acattttaaa aaaaaaataa 6420
agaagtctgc aaatcagggc catgctaggg gcttctaggc cttttctgaa cagagctggg 6480
agtgttgttt tgagtgtgta gaggacaggg ccaagacact tcttcctgga cccctgtggt 6540
acaggcaagg cacacaggtc ggaggggaag taggaagagc cactcttggc tccgcactct 6600
tgctgaatgt gatggccctg catagagatg cacttggttt tcacacagct ggtttccgtc 6660
ctcttggaac tggtgtgaac agcctctcat cccggccact gtgagccatg ggaccctgtg 6720
ggtccatctt agggtctcca atgggccctg acctgcagct ctgctcatcc cccagaccag 6780
cacatccttc gggaactaga gaaaaagaag atcttggtgt tcacgccatc caggcgggtc 6840
ggcggcaagc gcgtggtgtg ctatgatgac cgcttcattg tgaagctggc cttcgaatcc 6900
gacggagtgg tggtctccaa tgacacgtac cgagacctcc aaggcgagag gcaggagtgg 6960
aaacgcttca tcgaggagcg gctgctcatg tactccttcg tcaatgacaa gtacgttact 7020
gctggggact ggctctgctg ggcccacagg ctgggctgca gctttcgggg tgacatgagt 7080
tgcagggaga aggctaggga cagtggaact ttttgatagg gagcctggga gttgaagctg 7140
gcccgagaca gaaccaattc gttcctaggt ggctctctca agaaggtcta tggccacaca 7200
catcccaaga tacacttagc cttcctgata gcctcatagt tcccagccta gggagtgccc 7260
cgaaggcgac cctggcctat accctctgga ctgagggatc ccctcctcct ctggggtgac 7320
ccaactgcaa actcagaaga ctttaggggc atcctgcaga caagcatctt gggagctggc 7380
tatctaaccc tttccttggt tcctcttcac gacttctgtt tcctgagcgt tctgcttcac 7440
ctaccacagg ttcatgcccc ctgacgaccc tttaggacgg catgggccta gcctggacaa 7500
cttccttcgt aagaaaccac tgccttctga gcacaggaag cagccatgcc cctatggtga 7560
gacccagctc tgtcctcaat agtcttactt accctacctt tcctcttgcc tgtcccatcc 7620
cacttaggcc cgcccgtggc ttccttgtgg ggaccccctg ttctagacca cctgaatccc 7680
aagtctgtgc ctcgtcctcg ctctgacccc atttagacac cctctctgtt cttgcaggga 7740
agaaatgtac gtatggaatc aagtgccgat ttttccaccc tgagcggcca agccgtcccc 7800
agcgctctgt ggccgatgag ctccgtgcca acgctctcct ctcacctccc aggactccag 7860
tcaaggacaa aagtagccag aggccttccc ctgcctctca gtccagctct gtgtccctag 7920
aggctgaacc aggcagcctg gatgggaaaa agctgggtgc caggtcatct ccgggtcccc 7980
accgagaagg ctcaccgcag acctgtgctc cagctggcag gagcctccct gttagtgggg 8040
gcagctttgg gcccacagag tggcttgcac acacccagga ctcactccca tacacctccc 8100
aggagtgcct tgattcaggc attggttccc tggagagcca gatgtcagaa ttatggggcg 8160
tgcgaggagg cagccctggg gagtcgggcc ccactcgggg cccctatgca ggttatcaca 8220
gctatggatc caaggtccca gcagcacctt ccttttctcc ttttagacca gccatgggtg 8280
ctggccactt cagtgtcccc accgactatg tgcccccgcc acccacctac ccatccagag 8340
agtactggtc tgagccgtac ccattacccc cacccactcc tgtccttcag gagccccaga 8400
gacccagccc cggggctggt gggggcccct ggggcagggt gggtgacctg gccaaagaaa 8460
gggctggtgt atataccaag ctgtgtggtg tcttcccccc acacctggta gaagctgtaa 8520
tgagacgctt cccacagctg ctggatccgc agcagctggc cgcagagatc ctgtcttaca 8580
agtcccagca cctcagtgag taagccagaa ggtggcgcaa ggggctgtcg ggcatcacag 8640
atagcggtcc ccagcccctg cctggcctac cctggaagct ggacagaagg acaagtgaag 8700
caggcaaggg aatcctcaaa ccaaagatac cataggattg gttctggccc cgcggcaccc 8760
caacccgtcc cgcacaggtc agaagtgatc accctgttga tacacattgt atctctgtca 8820
tttaaggaga cgctgccggt caggccgtcc atccgtggct gatgcccaaa ccctcttttt 8880
tttttctcag agggccgggt gggaggcatg ggggagcaga ggcctgagct ggaccccacc 8940
ttccaccctg tccctgggac gccggcacca ccggctagtt aggcaccatg tgcctgctct 9000
ctgaggcccc ctcaagccaa tgcggcctca tccctgttca cagggcatga ggcttcatgt 9060
tagtaagcaa gatgcttctt taagcccctc ccctgcccgc tctgtccacc tacacacccc 9120
ccccccaacc agggctccaa ggccctctgt ttccacacct cccatgggtg ggaggacaca 9180
tgtatgctgt gtacagaggc gagatttaaa tattttaaat gaaaaaggtt gacaaaataa 9240
aggctattgc caggcaggct ggagagatgg ctcagtggtt aagagcaccg actgctcttc 9300
tgaaggtcct gagttcaaat gtcagcaacc acatggtggc tcacaaacat ctgtgatgag 9360
atctggtgcc ctcttctggg gtgtctgaag acagctacag tgtacttaca tacaataata 9420
aatcttttaa aaaagagaga aatttaaaag aaaaaaaaag ctattgcc 9468
<210> 7
<211> 2949
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
atggcaaact caatgaatgg cagaaaccct ggtggtcgag gaggaaatcc ccgaaaaggt 60
cgaattttgg gtattattga tgctattcag gatgcagttg gaccccctaa gcaagctgcc 120
gcagatcgca ggaccgtgga gaagacttgg aagctcatgg acaaagtggt aagactgtgc 180
caaaatccca aacttcagtt gaaaaatagc ccaccatata tacttgatat tttgcctgat 240
acatatcagc atttacgact tatattgagt aaatatgatg acaaccagaa acttgcccaa 300
ctcagtgaga atgagtactt taaaatctac attgatagcc ttatgaaaaa gtcaaaacgg 360
gcaataagac tctttaaaga aggcaaggag agaatgtatg aagaacagtc acaggacaga 420
cgaaatctca caaaactgtc ccttatcttc agtcacatgc tggcagaaat caaagcaatc 480
tttcccaatg gtcaattcca gggagataac tttcgtatca caaaagcaga tgctgctgaa 540
ttctggagaa agttttttgg agacaaaact atcgtaccat ggaaagtatt cagacagtgc 600
cttcatgagg tccaccagat tagctctagc ctggaagcaa tggctctaaa atcaacaatt 660
gatttaactt gcaatgatta catttcagtt tttgaatttg atatttttac caggctgttt 720
cagccttggg gctctatttt gcggaattgg aatttcttag ctgtgacaca tccaggttac 780
atggcatttc tcacatatga tgaagttaaa gcacgactac agaaatatag caccaaaccc 840
ggaagctata ttttccggtt aagttgcact cgattgggac agtgggccat tggctatgtg 900
actggggatg ggaatatctt acagaccata cctcataaca agcccttatt tcaagccctg 960
attgatggca gcagggaagg attttatctt tatcctgatg ggaggagtta taatcctgat 1020
ttaactggat tatgtgaacc tacacctcat gaccatataa aagttacaca ggaacaatat 1080
gaattatatt gtgaaatggg ctccactttt cagctctgta agatttgtgc agagaatgac 1140
aaagatgtca agattgagcc ttgtgggcat ttgatgtgca cctcttgcct tacggcatgg 1200
caggagtcgg atggtcaggg ctgccctttc tgtcgttgtg aaataaaagg aactgagccc 1260
ataatcgtgg acccctttga tccaagagat gaaggctcca ggtgttgcag catcattgac 1320
ccctttggca tgccgatgct agacttggac gacgatgatg atcgtgagga gtccttgatg 1380
atgaatcggt tggcaaacgt ccgaaagtgc actgacaggc agaactcacc agtcacatca 1440
ccaggatcct ctccccttgc ccagagaaga aagccacagc ctgacccact ccagatccca 1500
catctaagcc tgccacccgt gcctcctcgc ctggatctaa ttcagaaagg catagttaga 1560
tctccctgtg gcagcccaac aggttcacca aagtcttctc cttgcatggt gagaaaacaa 1620
gataaaccac tcccagcacc acctcctccc ttaagagatc ctcctccacc gccacctgaa 1680
agacctccac caatcccacc agacaataga ctgagtagac acatccatca tgtggaaagc 1740
gtgccttcca gagacccgcc aatgcctctt gaagcatggt gccctcggga tgtgtttggg 1800
actaatcagc ttgtgggatg tcgactccta ggggagggct ctccaaaacc tggaatcaca 1860
gcgagttcaa atgtcaatgg aaggcacagt agagtgggct ctgacccagt gcttatgcgg 1920
aaacacagac gccatgattt gcctttagaa ggagctaagg tcttttccaa tggtcacctt 1980
ggaagtgaag aatatgatgt tcctccccgg ctttctcctc ctcctccagt taccaccctc 2040
ctccctagca taaagtgtac tggtccgtta gcaaattctc tttcagagaa aacaagagac 2100
ccagtagagg aagatgatga tgaatacaag attccttcat cccaccctgt ttccctgaat 2160
tcacaaccat ctcattgtca taatgtaaaa cctcctgttc ggtcctgtga taatggtcac 2220
tgtatgctga atggaacaca tggtccatct tcagagaaga aatcaaacat ccctgactta 2280
agcatatatt taaagggaga tgtttttgat tcagcctctg atcccgtgcc attaccacct 2340
gccaggcctc caactcggga caatccaaag catggttctt cactcaacag gacgccctct 2400
gattatgatc ttctcatccc tccattaggt gaagatgctt ttgatgccct ccctccatct 2460
ctcccacctc ccccacctcc tgcaaggcat agtctcattg aacattcaaa acctcctggc 2520
tccagtagcc ggccatcctc aggacaggat ctttttcttc ttccttcaga tccctttgtt 2580
gatctagcaa gtggccaagt tcctttgcct cctgctagaa ggttaccagg tgaaaatgtc 2640
aaaactaaca gaacatcaca ggactatgat cagcttcctt catgttcaga tggttcacag 2700
gcaccagcca gaccccctaa accacgaccg cgcaggactg caccagaaat tcaccacaga 2760
aaaccccatg ggcctgaggc ggcattggaa aatgtcgatg caaaaattgc aaaactcatg 2820
ggagagggtt atgcctttga agaggtgaag agagccttag agatagccca gaataatgtc 2880
gaagttgccc ggagcatcct ccgagaattt gccttccctc ctccagtatc cccacgtcta 2940
aatctatag 2949
<210> 8
<211> 2949
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 8
atggcaaatt ctatgaatgg cagaaatcct ggtggtcgag gaggaaaccc ccgcaaaggt 60
cgcattttgg ggattattga tgctattcag gatgcagtcg gacccccaaa gcaagctgca 120
gctgaccgca ggactgtgga gaagacttgg aaactcatgg acaaagtggt aagactgtgc 180
caaaatccca agcttcagtt gaaaaacagc ccaccgtata tacttgatat tttacctgat 240
acgtatcagc acttgagact tatattgagt aaatatgatg acaaccagaa gctggctcaa 300
ctgagcgaga atgagtactt taaaatctac atcgatagtc tcatgaagaa gtcgaagcga 360
gcgatccggc tctttaaaga aggcaaggaa aggatgtacg aagagcagtc gcaggacaga 420
cggaatctca caaagctgtc ccttatcttc agtcacatgc tggcagaaat caaggcgatc 480
tttcccaatg gccagttcca gggagataac ttccggatca ccaaagcaga tgctgctgag 540
ttctggagga agttttttgg agacaaaact attgtaccat ggaaagtctt cagacagtgc 600
ctgcatgagg tccatcagat cagctctggc ctggaagcaa tggctctgaa gtcaaccatt 660
gatttaactt gcaatgatta catctcagtg tttgaatttg atatttttac caggctattt 720
cagccctggg gctctatttt acggaattgg aacttcttgg ctgtgactca cccgggatac 780
atggcatttc tcacgtatga tgaagttaaa gctcggctac agaaatacag caccaagcct 840
ggaagttaca ttttccggtt aagctgcact cggctgggac aatgggccat tggctatgtg 900
actggggacg gcaatatcct acagaccata cctcataaca agcccctgtt ccaagccctg 960
attgatggta gcagggaagg cttttatctt tatcctgatg ggcggagcta taaccctgat 1020
ttaaccggat tatgtgaacc tacacctcac gatcatataa aagttacaca ggagcagtat 1080
gaactgtatt gtgaaatggg ctccactttt cagctctgca agatctgtgc agagaatgac 1140
aaagatgtca agattgagcc ttgcgggcat ctgatgtgca cttcgtgcct taccgcgtgg 1200
caggagtctg atggccaagg ctgccccttc tgtcgctgtg agataaaagg aacggagccc 1260
atcattgtgg accccttcga ccccagagat gaaggctcca ggtgctgcag catcattgac 1320
cctttcagca tccccatgct tgacttggac gatgacgatg atcgagagga gtctttgatg 1380
atgaacaggc tggcgagtgt tcgaaagtgc acggacaggc agaactcacc agtcacatcg 1440
ccaggctcct caccccttgc ccagagaaga aagcctcagc cagaccctct ccagatcccc 1500
cacctcagcc tgccaccagt gcctccccgc ctagatctca ttcagaaagg catcgtgcgc 1560
tctccgtgtg gcagccccac aggctcgcca aagtcttctc catgcatggt tagaaaacaa 1620
gacaaaccac tcccggcacc ccctcctccc ttgagagatc cacctcctcc accagagagg 1680
cctcccccca tcccacctga caatagactg agcagacact tccaccatgg agagagtgtg 1740
ccttcccggg accagcccat gcccctcgaa gcctggtgcc ctcgggatgc cttcgggact 1800
aaccaggtga tgggatgtcg catcctcggg gatggctctc caaagcctgg cgtcaccgca 1860
aactccagct taaatgggag gcacagtaga atgggctccg agcaggttct tatgaggaaa 1920
cacagacgcc atgatttgcc ttcagaagga gccaaggtct tttccaatgg ccaccttgcc 1980
actgaagaat acgatgtccc tcctcggctt tcccctccgc ctccagtcac cacccttctc 2040
ccaagcataa agtgtactgg tccattagca aattgtctct cagagaaaac tagagacacg 2100
gtagaagatg atgacgatga atacaagatt ccttcatccc atcctgtgtc cctgaattca 2160
caaccatctc attgccataa tgtcaaagct cctgttcggt cttgtgataa tggtcattgt 2220
atattgaatg gaactcatgg tgcgccttca gagatgaaga aatcgaacat cccagattta 2280
ggcatctatt tgaagggagg tggttctgac tcagcctctg atccagtacc gttaccacct 2340
gccaggcctc caccccggga cagcccaaag cacggctctt cagtcaacag gacgccctct 2400
gactatgatc tgctcatccc tccattaggt gaggacgcct ttgatgctct ccctccatcc 2460
ctccctcctc ccccacctcc tgcaagacac agtctcatcg aacattcaaa acctccaggc 2520
tccagtagcc ggccttcctc agggcaggac cttttccttc ttccttcaga tccctttttt 2580
gacccaacaa gtggccaagt tccattgcct cctgccagga gagcagcagg agacagcggc 2640
aaagccaaca gagcctcgca ggactatgac cagctccctt catcttccga tggttcgcaa 2700
gcaccagcta gaccccccaa accacgaccc cgaaggactg caccagaaat tcatcacaga 2760
aagccccatg ggcccgaagc ggcgttggaa aatgtcgatg caaaaattgc aaaactcatg 2820
ggagaggggt atgcctttga agaggtgaag agagccttag agattgccca gaataacgtg 2880
gaagtggcca ggagcatact tcgagaattt gccttccccc ctcctgtctc cccacgtctg 2940
aatctatag 2949
<210> 9
<211> 11102
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 9
ctttttttca aagattttga ttccagtgga atctttgctt tagatttgtg tgtgtgtttg 60
tgttcgtgaa ttgtaactcc agaagcaatg cctgtacaag ctccacaatg gacggatttc 120
ctctcctgcc caatttgcac tcagactttc gacgaaacaa ttcgaaagcc catcagtttg 180
ggttgtggcc atactgtctg caagatgtgc ctgaataaac tccaccgcaa ggcttgccca 240
tttgaccaga ccactatcaa tacagacatt gagctcctcc ctgtgaactc agcattgctg 300
cagctcgtgg gtgctcaggt ccctgagcag cagcctatta ctttgtgtag tggggttgaa 360
gacacaaagc attatgagga agccaagaaa tgtgtagaag aattagcatt gtacttaaaa 420
ccgctcagca gtgctagagg agtgggtctg aacagcacta ctcagagtgt tctgagtcgc 480
ccaatgcaga ggaagcttgt gactctagtc cactgtcaac tagtagaaga agaaggcagg 540
attcgtgcca tgagggcagc tcgatcttta ggtgaacgaa cagttacaga gctcattctc 600
cagcaccaga atcctcagca actctcttcc aatctttggg cagcagtaag ggctagggga 660
tgccagttcc ttggaccagc aatgcaggag gaagctttaa agttggttct gctggcctta 720
gaagatggtt ctgctttgtc aagaaaagta ttggttctgt ttgtggtgca aagattggag 780
ccacggtttc ctcaagcctc taaaactagc attgggcatg ttgttcagct cctttataga 840
gcctcctgtt tcaaggtcac caaacgtgat gaagactctt ctttgatgca gctgaaagaa 900
gaatttagaa cctatgaagc tctgcggcga gaacatgact cccagatagt gcagattgct 960
atggaagcag gcttacgaat tgcaccggac cagtggtcct ctttgcttta tggagaccag 1020
tctcacaaat ctcatatgca gtccattatt gacaagttgc agactccagc ctcttttgca 1080
cagagtgttc aggaactaac aattgctctc cagcgaactg gagacccagc aaacttgaac 1140
cgactaagac cccatttgga gctgttagca aacattgacc ctagtccaga tgctcctcct 1200
cctacttggg aacagctgga aaatgggctg gttgctgtgc gtacagtggt acatgggctg 1260
gttgattata tccagaacca cagcaaaaaa ggagcagatc agcagcagcc tccacagcat 1320
agcaaataca aaacatacat gtgtcgagat atgaagcaga gaggaggatg ccctcgtggg 1380
gccagctgta catttgcaca ctcacaggag gaactggaaa aatttcgtaa aatgaataag 1440
cgcctggttc cgagaagacc cttgagtgcc tctttgggtc aacttaatga ggtgggcctg 1500
ccttcagcag ctatccttcc agatgaaggt gcagtggatc tccctagcag aaaacctcct 1560
gctctgccaa atggaattgt atcaacaggg aatacagtaa cacagcttat tccgcgaggg 1620
acagacccca gctatgattc tagtctgaaa ccaggaaaaa tagatcatct gagcagtagt 1680
gctcctggat cccctcctga cctgctagaa tctgttccta agagtatttc tgccttacct 1740
gtgaatccac attctatacc tccaaggggg ccagcagatc tgcctccaat gcctgttacc 1800
aaaccacttc agatggtacc tcgaggttct cagttatatc cagcacaaca gacggatgtt 1860
tattatcagg atcctcgagg agcagctccg ccatttgaac cagcacctta tcagcagggt 1920
atgtattata ctccaccacc acaatgtgtg tcccgctttg tccgacctcc accatctgct 1980
cctgaacctg ctcctcccta cttggatcat tatccaccct acctccaaga acgtgttgta 2040
aactctcagt atggcacaca gccacagcag tacccaccta tatacccatc tcactatgat 2100
ggccgtcgag tgtaccctgc tccgtcttac acaagagaag agatattccg agaaagccct 2160
atacccattg agattccacc tgcagcagta ccatcgtatg taccagaatc cagagaaaga 2220
taccaacaga tcgagagtta ctatccagtg gctcctcatc caactcagat cagaccttcg 2280
tacctcagag aacctcctta tagccggctt cctcctcctc cccagcctca tcctagtcta 2340
gatgaactac atcgccgacg aaaggaaata atggcccagc tagaggaaag aaaggttatc 2400
tctccacctc cttttgcacc ttcaccaacc ttgcctccta cctttcatcc ggaagaattt 2460
ttggatgaag acttgaaggt agctgggaaa tacaaaggaa atgattatag ccaatactct 2520
ccctggtcat gtgacaccat cggctcctac attggaacca aagatgcaaa acccaaagat 2580
gttgtggcag cagggagtgt ggaaatgatg aatgtggaga gtaaaggaat gagggaccag 2640
cgattagatc ttcagagaag agcagcagaa accagtgatg atgacctcat cccatttgga 2700
gaccgaccaa cagtgtctcg gtttggtgcc atctcacgaa cttccaaaac tatatatcag 2760
ggtgctggtc caatgcaggc tatggcacct cagggagctc ctacaaaatc tattaacatt 2820
tcagattata gtccatatgg aacccacggt ggctggggag cttctccata ttcacctcat 2880
caaaacatac cttctcaggg acacttcagt gagagggaga gaatatctat gtcagaagtg 2940
gccagtcatg gaaaacccct tccatctgct gagagagaac agctacgact agaattgcag 3000
caattgaacc atcagattag ccagcagacc cagctacgtg gactagagag ggaggcaaac 3060
accctggcag gccagtcaca gcccccacca ccgccacctc caaaatggcc tgggatgatc 3120
tcaagtgagc agttgagctt ggaactgcac caggtggaaa gggaaatcgg gaagagaaca 3180
cgggaactga gtatggaaaa ccagtgttct ctggacatga aaagcaaact gaatacaagt 3240
aaacaagcag aaaatggaca accagaacca caaaacaagg ttccggctga ggaccttaca 3300
ttgacattca gcagtgatgt accaaatgga tcagccttga cacaagagaa tatcagcctc 3360
ctatcaaaca agaccagctc tctgaacctg tcagaggacc ctgagggagg aggggataat 3420
aatgactccc agagatcagg agttactccc agttctgctc cttaaaatat gaggagtcct 3480
acttttatct tctgctccta atcagtttgt cgggcatagg ggtaggagaa cgcataactt 3540
ctaaactttt tctcttaaga gcggtcagag aaatccagga aattcaccag aggcaatgtg 3600
cacaaacacc actactaaaa acaaaccctg cacatagttc acattaatgc atttttttaa 3660
tttaaagaaa aagaaaatta gcagtatctg caagcaattc agattaaatt tgtttttgtt 3720
ctgtgaatga actttatttt aataactttg gacgccttgg atccagggct ttaaaaaaaa 3780
aagatattat atatacactc tgtttgatta attgtatgat cttaatgaag taggttttct 3840
tgtattttgg tattacatac ccagtgtata atttgtataa ttcctcaccc ccaatcctta 3900
tcaattctca ccaccccata aacttaaaac agaccaaaaa tgtcagcttt cagagaattc 3960
tgtggtgctt gagaaacaga cagtactaga ctgagttatt agaaaatgtg cagcaaacca 4020
acttttccca gagctgttat ttggaattct ttatcccttt ctagatcact agcttcattg 4080
gatacgtata tttttcttga cattgaagct ttttgtttgt ttgggagggt tttatttctt 4140
gtttttattt tcaacttttc aaatagaatt accaattttg aagtcctcat tttcatatta 4200
aggatcattt gcattctctt aatataatca gaaagctgat tcagtgttta attagattta 4260
aatgttgatc aagaattaac tgtaacttac tagcactgaa aatacatgtt tggtgtttcg 4320
cctgcgttca gctcatggtt ggaaatttga agcagtgctt ttcaaattaa acttttgctg 4380
acatcatagg atgctaaaaa acaaggacaa tcaactatgt tttaaaactg caacatttga 4440
tttgaactta aaatgaatag agccacatta ttttaatgga tgttttgttt tacttgtgaa 4500
ctgattgagt cttaaggata gtttatgaat tgatcacttg ttgctcagaa tcattagtat 4560
aagtaggtag gaaatagttt gaagtcattt ttcatagact taactgtcca atgttgcaaa 4620
tgtttcttca tgaaaatatt gaaaagagta aggttttttt tttttttaat tctgctgcac 4680
atattctgat gccatgtgtc tgtgcttaat taactaagac cctataaaac gtgtttagtg 4740
gggactgttt gatatagttg ccctctccat tcctctattt gcctgatttt tttcagtttc 4800
cctttctgta ttttactact aaattagaaa gcactggtta tgtaataagt tactacattg 4860
ctttggttga gtaaaaacaa gagtttatat ttttcttgtt tcttattttc ttaaccctta 4920
actcctgctg aggtcataac aacctcagtc taagctctgt gtccatcata ctgttaactt 4980
aaacaaatgg gtggtggggg tgggaagggt aatacagtcc tgccattgcc taccagtagg 5040
agagtccaaa cagaacactc ttttgagtag caattattta atttgcccag tcaaggcacc 5100
gtgtttatat actatttcac attgaatttg attatgccct acagacctgg ctggtcaagg 5160
atttgatata cacatattgg cttgggattc gagctttctt ttttatttaa ataaaaattt 5220
atatatatat tatatatata catatataca tagctatatc tgtatatata ttgggtatgt 5280
tttaaggatt ttttcgcatg agcgcagctg ttgcgataaa ttgaccgatt gggaggtggt 5340
agaagcactg aatgaaggtg aggctttttt tttttccagt tttcttatac atttgtcttc 5400
tttttttaaa aaaaaaaaaa aaaatatata tatatatata tatatatata tatatgtatg 5460
ctttttcttt tttttttggc ttttgtttgc tttttgactt ttacttaaaa cccttttaca 5520
tttccacttt aaatgcctat tgtttattgg gagaaggaaa gaaacttttg tatgtctgac 5580
agagtcccaa gatttttcat ttctctgcat aacagtaaaa ggcaacatta ttggcctcca 5640
accttctttt tttttttttt tttttttttt tggagaggga gtctgcttct gttgcccagg 5700
ctggagtgca gtgggttgat ctcggctcgc tacaacctcc acctcccggg ttcaagcgat 5760
tctcctgcct cagcctcctg agtagctggg actacaggca cgcgccacca cgtccagcta 5820
atttttgtac tacaaccttc ttataagcag atttggactg atcttctcct ttgggtatgt 5880
cagatcatcc taaattttag aagcagttga ttcactttgg aattcagaat gattcttgta 5940
ttagaagata atttgtgggt attaattttt gtttaagttt aaaataaaag taaagattca 6000
ttttggatat cagttgaaac cccttagtaa ctcagtttct gttattcttg ttctcatttc 6060
ctttaaatac acttgttctt ggcttttgcc attttgattc tgtgaagtag gcaggagcag 6120
ggattaattt atacagtatt cctgttctga acaaaaccag aaaagtcact gtataaactt 6180
gacttaaaat agtatctttc tcttttcatg tattttcatt tgggggaaaa aaaatctctt 6240
taattgtaac ctgaattcaa gctgtacccc tccatggtcc tacactctag agctaatctg 6300
gttgggcaga aaggcagaag gatggtatat tgtcccattg tgcctataat gtattttaaa 6360
ttggtcattc caccttacct aatggaaatt cttgcagctt tcctagtgct catcagcggt 6420
tttaggaatt cactaacacc cccaaaattt gttttttgtt ttttgctttt tttccttttc 6480
cttttctctg tgatatcatg agcctgtaag gacaaatggc atatttgggc ataactgctt 6540
gactctgtaa ctactttttt aaaatcaaaa ttgaaaaggt attaattgct tctggctttt 6600
taattttttt ttttagagac aaagatgaaa ccagatagga aatacagttt ttatgttttc 6660
tacttactaa aatattagtt tcttctaaat attactttat ttgtatttca ctaaattcca 6720
aagcaaaaat cagatatctg agatgaacaa ttttgaatgg gttaaggtag gagtaataag 6780
cattgtgttc actcatacat aggtgaggga attttattta tagcgagaaa tataaaagta 6840
ttttgactta ctcttttttc aaggagtcgc taggaaaggg tagaagaact gagaataaga 6900
catctagatt ccatttctgg tttatatgta gctcttttgc ctaatttata tataattttg 6960
tcataagata agtccagtaa ctgtcctgtc ttagataacg tacagaggct gaagtgacca 7020
aagatccatt ccttattact tttctaatta aaagaagagt tagctagatt tctagtagta 7080
gtattctaga tattgataag acattattcc taatgccaac tacaaatatt caactactca 7140
gaatgtattt aaaaaattgt ttggtacagc attaatgttg gtgattcctt tctcccatct 7200
tatttccctt cccttctatt ctttcccatg tatttctttt gcctaaaaga atattggtat 7260
gattctcatt tgctactttg agtatataac tccatcagac tttccagagt tcttcaggga 7320
tggagctcaa agtttacatt tttccatata tgtctttttt tttcttgacc tttttccacc 7380
ctgtaatttc cccttgactt acccactgcc ctccccaatc tgcaacagtg acagtttgct 7440
gcctcaaaac agagcattca aatgaattcg cttagccaat aacttctgtg aagttgcctt 7500
ttctaatggt gttattactc agtgatgcac aaatgtggta tttgccctac tggtaggcaa 7560
acaaaggtct ggttaagaat ggtaacctgc tgttttcttt aaaggagagc caaagacttg 7620
tgctttactc tgttttggtt ttgggggaag tagtagccat tttgatcatg aaacctttta 7680
gtatttgtga gttgattgta ctgtgtaagt agatttatct aaagttaact gttaaagtta 7740
gctagcctta taaaatgtaa aagtaatgaa aattcatcag tttctctaag ccagtgaatg 7800
tcgtcttttg taatattgtg tataagcatt tgtgcccacc ccagcttctg ctatcactgt 7860
ggtcaagtca tgggtctgag taaaagaatt cttgagtatg tgactggtga gaaataacta 7920
actatagtca gtacatgtac agattgttaa aattcaagac aaaatacttt cactaaaaaa 7980
aaggattcgt ctcagtaaag aagtattcag ttgctgtcac ttacatacaa atggtggtgg 8040
gtagcagtct caccattttt ctactctctt tttgctcgtt ttaaataatt gagtaaaggt 8100
tttatttgta aaatctatct gtaaaaagca cctgtaacga tttatatgtc attgaaagga 8160
atggcccagt tactttttag gagagattaa taacctacct ggaaattaac tgcagtgttt 8220
acttagattt tttcccccta ataagagtct aagtgtgtta aatttttaac tgatgatatg 8280
gttacagtgt tgcaaggtga tctcttcccc tgaaaaatct gcctatcctt ttaagaaaaa 8340
ttagacctac taaactaaag caaattttac tttcatcatt agcacctaaa caagcaagca 8400
gtctactact gtcatcattt tacctgagtg cccattttgc tgatccacat tcataccttt 8460
ctaccttgga cagctatgat ttttatattt atttgttgct tcagctcagg tttatgaaat 8520
tttcctgctg aaatgactta ttgggagttg taggttgatt atagttacta ttaaacattt 8580
tctcaattta gcttttctga gccacttcaa gaagaaagct gtttttgtca aaaggtacta 8640
ttaattgtag caagtaaatc ttaagatttg aatttttaag attttatttc tgtgttcact 8700
aaagatcttt ccacaagtaa tagattataa ttgataagta atactagcta tagtgttaat 8760
aaagagtaag actatcacca ccaggaataa gtaacacctt ttaataataa atctattcct 8820
aataggtatg ttttcaatac tgcactgaac aaagtgggta aagagccctt tgaaatctta 8880
ttgtaataaa gggacttacc tcaccactgg aatccttgtt ttcagagcct ctggattttc 8940
agccaaacac tgaatttctc ctaaacttta tccctgaaac atccctagag aacgaacttt 9000
attttcacaa gaaaataagg cacaataagg gggaagaact taaacctcaa cataatatcg 9060
tgtccaaaaa tgtgtattta gaaaaataaa atcctgtgga gtttgttatc ctaatgttta 9120
ttttatacta gataaggtga cttgttttct tgtattgagg tcttactgtt tcagatttgt 9180
ttttgtttct gttctaactc taagcagaca gagctcacaa gtctttggca tccattttag 9240
gttgtacact cagagtcatc ttataactgg aaactgtcag gtggtccccc accccagtga 9300
gtgtatgaaa gagtcaagaa aaagattgga aacaaactat tgggtgaata attggttgct 9360
ctattattat tattattatt atttgccttt ttttaatcac catttatttg tgtaatcttt 9420
ctccattgat tggctgtcat tcttataata tctgaactac cccataaaat aattctctga 9480
cttaaaggca tttagctttt gcttatcgtt tttacatcct ctattcaact aagacactgt 9540
cttgagagtt attttttcca gatggatcgt tggcctaaat tttcacactt ctcccctgtt 9600
catccttttt cctcttccct gcttcctggg aataaaagga acttttttaa aaaaattaat 9660
tagtccacag gtctcattat ctttctttat gattaatcta tgactttttg gtacaagaac 9720
aatggaaaaa gtgaattaag gtaatgaaca aaacctttca cccacttaaa cattttccag 9780
ttttgagatt cctcttcgtg tttgtggtgt cttccccttg ttaccccttc tgcccttttt 9840
ctctgactat ggtaatttgg tctttaggct catatcagtc tccccgagac attctgcagt 9900
cattatcacc tttttgggtg gattttattt tgttttattt tgtttttttt aaaaaaataa 9960
ctttttaaca ttggtgcata tttgcttggg atagagcttg tgtaatttac caatcgtatt 10020
gattgtaagt gattgtgccc tgcagaggta tatttaacaa gacaaaaata atcttggtta 10080
ataaaggagc ccatgagatt tgagtcaggt tgtaagtgaa atcacttaca cttttggata 10140
gaatttatac tcctgctctt ataaatcagt ggtagactta ccatttttta aagttttctt 10200
gcattttttt gtttttttat tgccacagct ccctattctt tcttgcctgc ctccaccccc 10260
ctgttcagga aaaaaaaaaa ttgagcctta aagtgacagc tgatttttta attgctgaat 10320
tttgtgaaat tttacttttt ccaagtgttt ccaactttaa aaagagaagt gaagacaaat 10380
aggttggaat ggtgaagaca aatggattgg aatttcacag gctgtgaata attccttagg 10440
atctggcaaa ccgtgaagtc ttatttgaag accttatctc ctgagagttc ttttggagta 10500
ggaaaaagaa ccctatttga aatagaccgt ttttctcttg tttttaatct gtttaatatt 10560
tctgattttt aagcagcttt caaaacaagt gtggtggaaa aaaagaaata gtagtaggaa 10620
gatgtttagg gcagcagaac tctgggtcta aataagtaca tgttcccact tgttgccgat 10680
ttttgagagt actagggcca tctttctcaa ttttgtatta tttgtgtgca tgtttatatc 10740
aaagatgccc attttgttaa aatgctattt cctttattac cttggaaact gactcagcct 10800
catgttgctc ctaattagtg tttaaggctc ccatgagttg cagataaaat gatttatttt 10860
aacaagtaga aggaggtgat tcaccttttg gattgtaaat atatgaaaat gtctacaagg 10920
tctttatctg ctttctgtca gcatttatat taaatgataa attaatgagg aacgtgtgta 10980
ttttgtaaat gagtgtgtgc catcttattc taatcttgag attactttct tacacgtttt 11040
taatggaggg ggctttttta ggtgaaaaat aaagaaatgg ctaatctgca tgagcaaaca 11100
ca 11102
<210> 10
<211> 3610
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 10
gctcggacca gagcggttat atttcacact atgtgctgac tgtatctaca gaagatattt 60
aaaaaaaaga taaacttttt tccaagattt tgattccagt ggaatctttg ctttagattt 120
tttgtgtgtg tgtgcgtgtt agtgaattgt aactccagaa gcaatgcctg tacaagctcc 180
acaatggacg gatttccttt cctgcccaat ttgcactcag actttcgacg aaacaattcg 240
aaagcccatc agtttgggct gtggccatac tgtctgcaaa atgtgcctga ataaactcca 300
ccgtaaggct tgcccatttg accagaccac tatcaatacg gacattgagc ttcttcctgt 360
gaactcagca ttactgcagc tagtgggtgc tcagatccct gagcaacagc ccattacttt 420
gtgtagtggg gttgaagata caaagcatta tgaggaagcc aagaaatgtg tagaagaatt 480
agcattgtac ctgaagccac tcagcagtgc gagaggtgtg ggtctaaata gcactactca 540
gagtgttctg agtcgcccaa tgcagaggaa acttgtgact ctggttcatt gccagctagt 600
ggaagaagaa ggcaggatcc gtgctatgag ggctgctcga tctttaggtg aacgcacagt 660
tacagagctc attctccagc accagaatcc tcagcaactc tcttctaatc tctgggcagc 720
agtcagagct aggggctgcc agttccttgg accagcgatg caggaggaag ctctgaagct 780
ggtcttgctg gccttagaag atggttctgc attgtctcgg aaagtgttgg ttctcttcgt 840
ggtgcaaaga ctggagccac gttttcctca agcctctaaa accagcattg ggcatgttgt 900
tcagctcctc tacagagcct cctgcttcaa ggtcaccaaa cgtgatgaag actcttcttt 960
gatgcaactg aaagaagaat ttaggactta cgaagctctg aggagagaac atgactccca 1020
gatagtgcaa attgctatgg aagctggctt aaggattgca ccagaccagt ggtcctcttt 1080
gctttatggg gatcagtctc acaaatctca tatgcagtct attattgaca agttacagac 1140
ccctgcctca tttgcacaga gtgttcagga gctaacaatt gctctccagc ggactggaga 1200
cccagcgaat ttgaaccgac taagacccca tttggagtta ctcgcaaaca ttgaccctag 1260
tccagatgct cctcctccaa catgggaaca gctagaaaat gggctggttg ctgtacgtac 1320
ggtagtgcat ggattggttg attatatcca gaaccacagc aaaaaaggag cagatcaaca 1380
acagcctcca cagcatagca aatacaaaac atacatgtgt cgagatatga agcaaagggg 1440
aggatgccct cgtggtgcca gctgtacgtt tgcacattca caggaagaac tggaaaagtt 1500
tcgtaaaatg aacaaacgtc tggttcccag aagacccttg agtgcctctt tgggtcaact 1560
taatgaggtg ggcctgcctt cagcacctat actttctgat gaaagtgcag tggacttgtc 1620
caacagaaaa cctcctgcac tcccaaatgg aattgcatcg tcagggagca cagtgacaca 1680
actgattcca cgtgggacag accccagctt tgattcttct ctgaaaccag taaagctaga 1740
ccacctgagc agtagtgctc cggggtcccc tcctgacctg ctggaatctg cccctaagag 1800
tatttctgcc ttacctgtga atccacatcc tgtacctcca aggggaccaa cagatctgcc 1860
tcccatgcct gtcaccaaac caattcagat ggtacctcga ggttctcagc tatatccagc 1920
acaacaagca gatgtttatt atcaggatcc tcgaggaagt gccccagctt ttgagacagc 1980
accttaccag cagggtatgt actatactcc accaccatgt gtgtcccgct ttgtccgacc 2040
tccaccatct gctcctgaac ctggtcctcc atacttggat cattattcac cctacctcca 2100
agatcgtgtc ataaactctc agtatggcac acagccacaa cagtacccac ctatgtaccc 2160
agctcactac gatggccgcc gtgtataccc tgctcagtct tacacaagag aggagatgtt 2220
ccgggaaagc cctataccca ttgacattcc atctgcagca gtgccgtcct atgtacctga 2280
gtccagagaa cggtaccaac aggtagaggg ttactacccg gtggctcctc atccagctca 2340
gatcagacct tcatacccca gggatcctcc ttatagtcgg cttcctcctc cccaacccca 2400
tcctagtctg gatgagctac atcgaaggcg gaaggaaata atggcccagc tagaggaaag 2460
aaaagtcatc tctccacctc cttttgcacc gtcaccaaca ttgcctcctg cattccatcc 2520
agaggaattt ttggatgaag acttgaaggt agccggaaaa tacaaagcaa atgattatag 2580
ccagtattct ccttggtcat gtgataccat cggctcctac attggaacca aagatgcaaa 2640
acccaaagat gttgtggcag cggggagtgt ggaaatgatg aatgtagaaa gtaaaggaac 2700
gagagagcag aggttggacc ttcagagaag agcagtggag acgagcgatg atgacctcat 2760
cccgtttgga gaccgaccaa cagtctctcg attcggtgcc atctctcgaa catccaaaac 2820
actgtatcag ggtgctggcc cactgcaagc tatagcacct cagggagcac ccacaaaatc 2880
tattaacatt tccgattaca gtgcatatgg agctcatggt ggctggggag attctccata 2940
ctcacctcat gcaaacatac ctcctcaggg acacttcatt gagagggaga aaatgtccat 3000
ggcagaagtg gccagtcatg gaaaacccct tctatctgct gaaagagaac aattacggct 3060
agaattgcag cagctgaacc atcagatcag ccagcagacc cagctacgag gactagaggc 3120
tgttagtaac cggctggtgt tacagaggga ggtgaacacc ctggcaagcc agccacagcc 3180
ccctcagctg cctccaaaat ggcctggaat gatctcaagt gagcagctca gcttggaact 3240
gcatcaggtg gaaagagaaa ttgggaagag gacccgggaa ttgagtatgg agaaccagtg 3300
ttctgtagac atgaaaagca aactgggtac aagcaagcaa gcagaaaatg gccagcccga 3360
gccccaaaac aagatccgca ctgaggacct tacattgaca ttcagtgatg taccaaatgg 3420
atcagccttg acacaagaga atctcagcct cctatcaaac aagaccagct ctttgaatct 3480
gtcagaagac tctgagggag gaggagataa caatgattcc cagagatcag gagttgtttc 3540
caattctgct ccctagaata tgggcacctg cttctacctt ctgctcctaa tcagttcatg 3600
gggcataggg 3610
<210> 11
<211> 1559
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 11
acagcagtcc gtgccgccgt cccgcccgcc agcgccccag cgaggaagca gcgcgcagcc 60
cgcggcccag cgcacccgca gcagcgcccg cagctcgtcc gcgccatgtt ccaggcggcc 120
gagcgccccc aggagtgggc catggagggc ccccgcgacg ggctgaagaa ggagcggcta 180
ctggacgacc gccacgacag cggcctggac tccatgaaag acgaggagta cgagcagatg 240
gtcaaggagc tgcaggagat ccgcctcgag ccgcaggagg tgccgcgcgg ctcggagccc 300
tggaagcagc agctcaccga ggacggggac tcgttcctgc acttggccat catccatgaa 360
gaaaaggcac tgaccatgga agtgatccgc caggtgaagg gagacctggc cttcctcaac 420
ttccagaaca acctgcagca gactccactc cacttggctg tgatcaccaa ccagccagaa 480
attgctgagg cacttctggg agctggctgt gatcctgagc tccgagactt tcgaggaaat 540
acccccctac accttgcctg tgagcagggc tgcctggcca gcgtgggagt cctgactcag 600
tcctgcacca ccccgcacct ccactccatc ctgaaggcta ccaactacaa tggccacacg 660
tgtctacact tagcctctat ccatggctac ctgggcatcg tggagctttt ggtgtccttg 720
ggtgctgatg tcaatgctca ggagccctgt aatggccgga ctgcccttca cctcgcagtg 780
gacctgcaaa atcctgacct ggtgtcactc ctgttgaagt gtggggctga tgtcaacaga 840
gttacctacc agggctattc tccctaccag ctcacctggg gccgcccaag cacccggata 900
cagcagcagc tgggccagct gacactagaa aaccttcaga tgctgccaga gagtgaggat 960
gaggagagct atgacacaga gtcagagttc acggagttca cagaggacga gctgccctat 1020
gatgactgtg tgtttggagg ccagcgtctg acgttatgag cgcaaagggg ctgaaagaac 1080
atggacttgt atatttgtac aaaaaaaaag ttttattttt ctaaaaaaag aaaaaagaag 1140
aaaaaattta aagggtgtac ttatatccac actgcacact gcctggccca aaacgtctta 1200
ttgtggtagg atcagccctc attttgttgc ttttgtgaac tttttgtagg ggacgagaaa 1260
gatcattgaa attctgagaa aacttctttt aaacctcacc tttgtggggt ttttggagaa 1320
ggttatcaaa aatttcatgg aaggaccaca ttttatattt attgtgcttc gagtgactga 1380
ccccagtggt atcctgtgac atgtaacagc caggagtgtt aagcgttcag tgatgtgggg 1440
tgaaaagtta ctacctgtca aggtttgtgt taccctcctg taaatggtgt acataatgta 1500
ttgttggtaa ttattttggt acttttatga tgtatattta ttaaacagat ttttacaaa 1559
<210> 12
<211> 1083
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 12
cgccagccag ccgccagcag cctgcagcct gcacccgctc agccccgcac agccatgttt 60
cagccagctg ggcacggcca ggactgggcc atggagggcc cgcgggatgg cctcaagaag 120
gagcgcttgg tggacgatcg ccacgacagc ggcctggact ccatgaagga cgaggagtac 180
gagcaaatgg tgaaggagct gcgggagatc cgcctgcagc cgcaggaggc gccgctggcc 240
gccgagccct ggaagcagca gctcacggag gacggagact cgttcctgca cttggcaatc 300
atccacgaag agaagccgct gaccatggaa gtcattggtc aggtgaaggg agacctggcc 360
ttcctcaact tccagaacaa cctgcagcag actccactcc acttggctgt gatcaccaac 420
cagccaggaa ttgctgaggc acttctgaaa gctggctgtg atcctgagct ccgagacttt 480
cgaggaaata cccctctaca tcttgcctgt gagcagggct gcctggccag tgtagcagtc 540
ttgacgcaga cctgcacacc ccagcatctc cactccgtcc tgcaggccac caactacaat 600
ggccacacgt gtctgcacct agcctctatc cacggctacc tggccatcgt ggagcacttg 660
gtgactttgg gtgctgatgt caacgctcag gagccctgca atggccggac agccctccac 720
cttgcggtgg acctgcagaa tcctgacctg gtttcgctct tgttgaaatg tggggctgat 780
gtcaacaggg taacctacca aggctactcc ccctaccagc ttacctgggg ccgcccaagt 840
acccggatac agcagcagct gggccagctg accctggaaa atctccagat gctacccgag 900
agcgaggatg aggagagcta tgacacggag tcagaattca cagaggatga gctgccctat 960
gatgactgtg tgtttggagg ccagcgtctg acattataag tggaaagtgg caaaaagaat 1020
gtggacttgt atatttgtac aaatagagtt ttatttttct aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1080
aaa 1083
<210> 13
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 13
cgcacuuccg cacauuccgu ucg 23
<210> 14
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 14
ggggaggguc ucuggcuuua uuu 23
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
cagcauuaac ugggaugccg ugu 23
<210> 16
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 16
ccaggaccug aacucgcacc ucc 23
<210> 17
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 17
uacauauacc caguaucuuu gca 23
<210> 18
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 18
gccgacaaug cagucuccac agc 23
<210> 19
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 19
ccccugguug uuguagcagc uua 23
<210> 20
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 20
cugcugugca gaauccuauu uua 23
<210> 21
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 21
ugggaugccg uguuauuuug uua 23
<210> 22
<211> 23
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 22
ucgcaccucc uaccucuuca ugu 23
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
cacgcacttc cgcacattc 19
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 24
ttccgttcgc acgccgatt 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 25
gagcttcgac tgcctcttc 19
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 26
cgcacttccg cacattccgt tcg 23
<210> 27
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 27
ggggagggtc tctggcttta ttt 23
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 28
cagcattaac tgggatgccg tgt 23
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
ccaggacctg aactcgcacc tcc 23
<210> 30
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
tacatatacc cagtatcttt gca 23
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
gccgacaatg cagtctccac agc 23
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 32
cccctggttg ttgtagcagc tta 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 33
ctgctgtgca gaatcctatt tta 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 34
tgggatgccg tgttattttg tta 23
<210> 35
<211> 23
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 35
tcgcacctcc tacctcttca tgt 23
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
tttcgagctg ctggagcact a 21
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 37
tcgagctgct ggagcactac g 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 38
tcgccaacgg aactgcttct t 21
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 39
acttctggct ggagacctca t 21
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 40
gcgagacctt cgactgcctt t 21
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 41
cgacactcac ttccgcacct t 21
<210> 42
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 42
ctacctgagt tccttcccct t 21
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
ttccgctccc actccgatta c 21
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
taacccggta ctccgtgact a 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
tactccgtga ctacctgagt t 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
cttccgctcc cactccgatt a 21
<210> 47
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 47
gcgcgacagt cgccaacgga a 21
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 48
tggacgcctg cggcttctat t 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 49
cgcatccctc ttaacccggt a 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 50
tacatattcc cagtatcttt g 21
<210> 51
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 51
gcgccttatt atttcttatt a 21
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 52
ccgtgactac ctgagttcct t 21
<210> 53
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 53
ggagggtctc tggcttcatt t 21
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 54
ttcgcgctca gcgtgaagat g 21
<210> 55
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 55
atccctctta acccggtact c 21
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 56
gcggctgcgc gccgagcccg 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 57
ggacgcctgc ggattctact 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 58
ggctgccatc caggtgaaag 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 59
gcggctgtcg cgcaccagga 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 60
tggacgcctg cggattctac 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 61
gacgcctgcg gattctactg 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 62
agtgctccag cagctcgaag 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 63
gccggccgct ttcacctgga 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 64
agtagaatcc gcaggcgtcc 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 65
cgcaccagga aggtgcccac 20
<210> 66
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 66
ggccggcctg aaagtgcacg 20
<210> 67
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 67
tccgttcgca cgccgattac 20
<210> 68
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 68
agcgcgctcc tggacgcctg 20
<210> 69
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 69
cggctgcgcg ccgagcccgt 20
<210> 70
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 70
acgcctgcgg attctactgg 20
<210> 71
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 71
cgaggccatc ttcacgctaa 20
<210> 72
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 72
tcaggccggc cgctttcacc 20
<210> 73
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 73
cttagcgtga agatggcctc 20
<210> 74
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 74
gccggtaatc ggcgtgcgaa 20
<210> 75
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 75
ctgcattgtc ggctgccacc 20
<210> 76
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 76
gtgcgccccg tgcacgctca 20
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 77
gctgtgccgc cagcgcatcg 20
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 78
cacgcggcgc tggcgcagcg 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 79
gctcctgcag cggccgcacg 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 80
agctctcgcg gctgccatcc 20
<210> 81
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 81
tggtgcgcga cagccgccag 20
<210> 82
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 82
gatggtagca cacaaccagg 20
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 83
agaggcagtc gaagctctcg 20
<210> 84
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 84
gctggcggct gtcgcgcacc 20
<210> 85
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 85
ccgaggccat cttcacgcta 20
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 86
ggggccccca gcatgcggcg 20
<210> 87
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 87
gctgctggag cactacgtgg 20
<210> 88
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 88
cgagctgctg gagcactacg 20
<210> 89
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 89
cgaaaaagca gttccgctgg 20
<210> 90
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 90
gcaggcgtcc aggagcgcgc 20
<210> 91
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 91
ggggcccctg agcgtgcacg 20
<210> 92
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 92
gcggcgccgc gccgcatgct 20
<210> 93
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 93
gcacgcggcg ctggcgcagc 20
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
tgggggcccc tgagcgtgca 20
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
caggaaggtg cccacgggct 20
<210> 96
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
tgcgccccgt gcacgctcag 20
<210> 97
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
gccatccagg tgaaagcggc 20
<210> 98
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
cacgcgcgcc agcgcgctcc 20
<210> 99
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
gggcccccag tagaatccgc 20
<210> 100
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 100
atccgcgtgc actttcaggc 20
<210> 101
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 101
cgagcccgtg ggcaccttcc 20
<210> 102
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 102
ccacagcagc agagccccga 20
<210> 103
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 103
agccaggttc tcgcggccca 20
<210> 104
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 104
aaagtgcacg cggatgctcg 20
<210> 105
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 105
ctcttcctcc tcctcgcccg 20
<210> 106
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 106
gcgtgcacgg ggcgcacgag 20
<210> 107
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 107
aagtgcacgc ggatgctcgt 20
<210> 108
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 108
cgtgcgcccc gtgcacgctc 20
<210> 109
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 109
gcagcggccg cacgcggcgc 20
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 110
ccttagcgtg aagatggcct 20
<210> 111
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 111
caggttctcg cggcccacgg 20
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 112
gcgcaccagg aaggtgccca 20
<210> 113
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 113
gctgccggtc aaatctggaa 20
<210> 114
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 114
cggcgtgcga acggaatgtg 20
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 115
cagcagcaga gccccgacgg 20
<210> 116
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 116
gggcgaaaaa gcagttccgc 20
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 117
cgcacgcggc gctggcgcag 20
<210> 118
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 118
ggatgcgagc caggttctcg 20
<210> 119
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 119
tggcggcaca gctcctgcag 20
<210> 120
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 120
gcgcccgcgg ccgtgccccg 20
<210> 121
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 121
ggcgccgcgc cgcatgctgg 20
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 122
cggtggccac gatgcgctgg 20
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 123
tgctgtggag actgcattgt 20
<210> 124
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 124
taggatggta gcacacaacc 20
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 125
gcggccgtgc cccgcggtcc 20
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 126
gagcatccgc gtgcactttc 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 127
cgctgccggt caaatctgga 20
<210> 128
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 128
cagcgcatcg tggccaccgt 20
<210> 129
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 129
gcggatgctc gtgggtcccg 20
<210> 130
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 130
cggcgccgcg ccgcatgctg 20
<210> 131
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 131
cggtcaaatc tggaagggga 20
<210> 132
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 132
aggaaggttc tggccgccgt 20
<210> 133
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 133
ccacggtggc cacgatgcgc 20
<210> 134
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 134
cgctgcgcca gcgccgcgtg 20
<210> 135
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 135
aggagctcag gtagtcgcgg 20
<210> 136
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 136
gcagcggggc ccccagcatg 20
<210> 137
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 137
ggaaggagct caggtagtcg 20
<210> 138
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 138
tcgcggagga cggggttgag 20
<210> 139
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 139
cgactgcctc ttcgagctgc 20
<210> 140
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 140
gcgccgcgtg cggccgctgc 20
<210> 141
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 141
caccgtgggc cgcgagaacc 20
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 142
gtgccccgcg gtcccggccc 20
<210> 143
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 143
ctgccggtca aatctggaag 20
<210> 144
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 144
cttccccttc cagatttgac 20
<210> 145
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 145
ctcaggtagt cgcggaggac 20
<210> 146
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 146
cgggcgctgc cggtcaaatc 20
<210> 147
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 147
ggaaggttct ggccgccgtc 20
<210> 148
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 148
gctcaggtag tcgcggagga 20
<210> 149
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 149
gcggaagtgc gtgtcgccgg 20
<210> 150
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 150
ggaccgcggg gcacggccgc 20
<210> 151
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 151
gggaccgcgg ggcacggccg 20
<210> 152
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 152
gcgcgtgatg cgccggtaat 20
<210> 153
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 153
tcaggtagtc gcggaggacg 20
<210> 154
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 154
tgcggaagtg cgtgtcgccg 20
<210> 155
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 155
ggggccggga ccgcggggca 20
<210> 156
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 156
ccgtcggggc tctgctgctg 20
<210> 157
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 157
gaaggttctg gccgccgtcg 20
<210> 158
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 158
gtgtgctacc atcctacaga 20
<210> 159
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 159
gtcgcggagg acggggttga 20
<210> 160
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 160
cgctggcgcg cgtgatgcgc 20
<210> 161
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 161
gcgtgcacgg cgggcgctgc 20
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 162
tctggaaggg gaaggagctc 20
<210> 163
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 163
gtgcgtgtcg ccgggggccg 20
<210> 164
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 164
gggcacggcc gcgggcgcgc 20
<210> 165
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 165
gttaatgctg cgtgcacggc 20
<210> 166
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 166
gcacggccgc gggcgcgcgg 20
<210> 167
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 167
ggggcacggc cgcgggcgcg 20
<210> 168
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 168
gtgcggaagt gcgtgtcgcc 20
<210> 169
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 169
gaggaagagg aggaaggttc 20
<210> 170
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 170
ggctggcccc ttctgtagga 20
<210> 171
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 171
ggggccgggg ccgggaccgc 20
<210> 172
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 172
cgcggaggac ggggttgagg 20
<210> 173
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 173
tttcgccctt agcgtgaaga 20
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 174
ggcacggccg cgggcgcgcg 20
<210> 175
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 175
agtcgcggag gacggggttg 20
<210> 176
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 176
gggccggggc cgggaccgcg 20
<210> 177
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 177
aagtgcgtgt cgccgggggc 20
<210> 178
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 178
ctccggctgg ccccttctgt 20
<210> 179
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 179
ggcggcgccg cgccgcatgc 20
<210> 180
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 180
agtgcgtgtc gccgggggcc 20
<210> 181
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 181
tgtgcggaag tgcgtgtcgc 20
<210> 182
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 182
gtgtcgccgg gggccggggc 20
<210> 183
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 183
tgtcgccggg ggccggggcc 20
<210> 184
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 184
gcggtcccgg ccccggcccc 20
<210> 185
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 185
cgcgggggcc gcgggcgagg 20
<210> 186
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 186
cgcgggcgag gaggaggaag 20
<210> 187
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 187
gggcgaggag gaggaagagg 20
<210> 188
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 188
gaagtgcacg cggatgctcg 20
<210> 189
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 189
agtgctccag cagctcgaaa 20
<210> 190
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 190
gccggccgct tccacttgga 20
<210> 191
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 191
gctgtgtcgc cagcgcatcg 20
<210> 192
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 192
gcgactgtcg cgcaccaaga 20
<210> 193
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 193
gcgtgcacgg ggcgcacgag 20
<210> 194
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 194
tcacggagta ccgggttaag 20
<210> 195
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 195
ggacgcctgc ggcttctatt 20
<210> 196
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 196
gcgcgaagaa gcagttccgt 20
<210> 197
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 197
gctcagcgtg aagatggctt 20
<210> 198
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 198
cgagcccgtg ggcaccttct 20
<210> 199
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 199
atccgcgtgc acttccaggc 20
<210> 200
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 200
cgccaggttc tcgcgaccca 20
<210> 201
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 201
ccatgcccac caccatcgag 20
<210> 202
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 202
tctacggaaa cgtattcgag 20
<210> 203
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 203
tttagtatat tgagaacttg 20
<210> 204
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 204
gcactacagt ggatcaccgc 20
<210> 205
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 205
tgtcatgctg aaccgcattg 20
<210> 206
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 206
ggaaacttgg ccactctatg 20
<210> 207
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 207
gtatttgaaa ttattaatgc 20
<210> 208
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 208
cagtttagtt gacatagaag 20
<210> 209
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 209
gggtctgaat aagacccatt 20
<210> 210
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 210
ccatgactat cctcatagag 20
<210> 211
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 211
ccatgactat cctcatagag 20
<210> 212
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 212
ctcttcgaac tcccgctcga 20
<210> 213
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 213
gaaccctgac catgggcctg 20
<210> 214
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 214
gctccttgaa ccctgaccat 20
<210> 215
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 215
agttggatac tcagcgtcgc 20
<210> 216
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 216
ccgctcgatg gtggtgggca 20
<210> 217
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 217
cagaaatggc agcatgtgtt 20
<210> 218
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 218
gcactacagt ggatcaccgc 20
<210> 219
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 219
ggtagacact tgtcttgttt 20
<210> 220
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 220
tggcagcatg tgttaggaag 20
<210> 221
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 221
aggcccatgg tcagggttca 20
<210> 222
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 222
gttcagcatg acaactgctt 20
<210> 223
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 223
caatggagga gaacagtgag 20
<210> 224
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 224
ctcttctatg tcaactaaac 20
<210> 225
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 225
agtggatcac cgcaggccca 20
<210> 226
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 226
ctgacaggtg accgatgtac 20
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 227
aactcccgct cgatggtggt 20
<210> 228
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 228
gtctccctga tccatccagt 20
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 229
tagaggaaag tcctgtacat 20
<210> 230
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 230
atgtatggaa aggatggtaa 20
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 231
gcccaatgcc tgcactacag 20
<210> 232
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 232
cgagcgggag ttcgaagagt 20
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 233
tcaccgcagg cccatggtca 20
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 234
cagtttagtt gacatagaag 20
<210> 235
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 235
ccatgcccac caccatcgag 20
<210> 236
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 236
gccaaaccat aagccagaaa 20
<210> 237
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 237
ccgattcttt ctccacaatg 20
<210> 238
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 238
ttcgaactcc cgctcgatgg 20
<210> 239
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 239
agtgcaggca ttgggcgctc 20
<210> 240
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 240
ggaaacttgg ccactctatg 20
<210> 241
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 241
atccactgta gtgcaggcat 20
<210> 242
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 242
cactctatga ggatagtcat 20
<210> 243
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 243
ccactctatg aggatagtca 20
<210> 244
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 244
tccactgtag tgcaggcatt 20
<210> 245
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 245
aagttctttc catcgtttct 20
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 246
tcgctggcag ccgctgtact 20
<210> 247
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 247
gaactcccgc tcgatggtgg 20
<210> 248
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 248
aggatggtaa aggcaccaac 20
<210> 249
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 249
aaagggagat tctagtatac 20
<210> 250
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 250
agaatttagg atgtatggaa 20
<210> 251
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 251
gggtctgaat aagacccatt 20
<210> 252
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 252
ggcaccaact ggatggatca 20
<210> 253
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 253
ctctaaaatg caagatacaa 20
<210> 254
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 254
gtatttgaaa ttattaatgc 20
<210> 255
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 255
cctttcttgc agatggaaaa 20
<210> 256
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 256
ctgcaccttc tgagctgtgg 20
<210> 257
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 257
atgctgccat ttctggctta 20
<210> 258
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 258
tttctttaaa cagcatctct 20
<210> 259
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 259
agacatggaa tgcagaatgc 20
<210> 260
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 260
aggcaccaac tggatggatc 20
<210> 261
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 261
taatgactga aaaatacaat 20
<210> 262
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 262
gaatgcagaa tgcaggaaat 20
<210> 263
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 263
tttaggatgt atggaaagga 20
<210> 264
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 264
ctaacacatg ctgccatttc 20
<210> 265
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 265
tcatacatgg ctataataga 20
<210> 266
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 266
acgatggaaa gaactttcta 20
<210> 267
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 267
acgtattcga gaggacagaa 20
<210> 268
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 268
gcggtgatcc actgtagtgc 20
<210> 269
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 269
tattaatgct ggatgttaaa 20
<210> 270
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 270
gagatgctgt ttaaagaaac 20
<210> 271
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 271
cagcaagaat ttaggatgta 20
<210> 272
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 272
ttgacataga agaggcacaa 20
<210> 273
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 273
gattcaggga ctccaaaatc 20
<210> 274
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 274
ctcactttca ttatactacc 20
<210> 275
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 275
tttagtatat tgagaacttg 20
<210> 276
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 276
agggactcca aaatctggcc 20
<210> 277
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 277
aggttaaatg tgcacagtac 20
<210> 278
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 278
atcaccgcag gcccatggtc 20
<210> 279
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 279
agcatctctt ggtcatctgt 20
<210> 280
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 280
gaaggagcaa aatgtataaa 20
<210> 281
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 281
gccatttctg gcttatggtt 20
<210> 282
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 282
ctggatggat cagggagaca 20
<210> 283
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 283
aaatacaatg ggaacagaat 20
<210> 284
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 284
ataatgactg aaaaatacaa 20
<210> 285
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 285
catgcccacc accatcgagc 20
<210> 286
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 286
aacatgagaa aataccgaat 20
<210> 287
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 287
agaaatgaag ctggtgattc 20
<210> 288
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 288
ccgcattgtg gagaaagaat 20
<210> 289
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 289
gaaatgaagc tggtgattca 20
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 290
ttgtttaaag tgagagaatc 20
<210> 291
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 291
ccgcgactca ccaagtacag 20
<210> 292
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 292
gaacatgaga aaataccgaa 20
<210> 293
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 293
tatactacct ggccagattt 20
<210> 294
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 294
tatgagaatc tcagttgatc 20
<210> 295
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 295
tcaactgaga ttctcataca 20
<210> 296
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 296
tgagaatctc agttgatctg 20
<210> 297
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 297
atgagaatct cagttgatct 20
<210> 298
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 298
tggtaaaggc accaactgga 20
<210> 299
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 299
tgtcatgctg aaccgcattg 20
<210> 300
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 300
tttggtgaat gatcaaaggc 20
<210> 301
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 301
atgaaagtga gatattgttc 20
<210> 302
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 302
tatttcctca tagtgctcta 20
<210> 303
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 303
agaaggagca aaatgtataa 20
<210> 304
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 304
tttgtttggt gaatgatcaa 20
<210> 305
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 305
tctacggaaa cgtattcgag 20
<210> 306
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 306
aaaggccacc acagctcaga 20
<210> 307
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 307
aggtgcagca gatgaaacag 20
<210> 308
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 308
ggctccttga accctgacca 20
<210> 309
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 309
aaggagttac atcttaacac 20
<210> 310
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 310
taaaatgcaa gatacaatgg 20
<210> 311
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 311
acaagtgtct accagagaga 20
<210> 312
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 312
gcgctctggc accttctctc 20
<210> 313
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 313
ctgctgcacc ttctgagctg 20
<210> 314
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 314
tcttccctac ctagaaacga 20
<210> 315
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 315
aatctggcca ggtggtataa 20
<210> 316
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 316
aatatgagaa agtatcgaat 20
<210> 317
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 317
atcactgcag gtccatggtc 20
<210> 318
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 318
atgtgcacag tactggccaa 20
<210> 319
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 319
ggcagcatgt gttcggaagt 20
<210> 320
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 320
aagaagttta gaaatgaagc 20
<210> 321
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 321
gccacaccat gagccagaaa 20
<210> 322
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 322
cctttcttgc agatggaaaa 20
<210> 323
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 323
gtactttgct ccttctatta 20
<210> 324
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 324
agaaatgaag ctggtgactc 20
<210> 325
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 325
gtttagcatg acaactgctt 20
<210> 326
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 326
gcccgatgcc cgcactgcaa 20
<210> 327
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 327
tgacagagaa atggtgttta 20
<210> 328
<211> 25
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 328
ccuggacaac uuccuucgua agaaa 25
<210> 329
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 329
gugucccuau ggaaggaaa 19
<210> 330
<211> 19
<212> RNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 330
caacuuccuu cguaagaaa 19
<210> 331
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 331
agcgaggcca cacagatatt a 21
<210> 332
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 332
gctatgatga ccgcttcatt g 21
<210> 333
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 333
tggtctgagc cgtacccatt a 21
<210> 334
<211> 21
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 334
ctgtgtacag aggcgagatt t 21
<210> 335
<211> 25
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 335
cctggacaac ttccttcgta agaaa 25
<210> 336
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 336
gtgtccctat ggaaggaaa 19
<210> 337
<211> 19
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 337
caacttcctt cgtaagaaa 19
<210> 338
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 338
aagctggcct acgagtctga 20
<210> 339
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 339
gcgggactag agggagctga 20
<210> 340
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 340
cagctccctc tagtcccgcg 20
<210> 341
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 341
caggacgctg tggatctccg 20
<210> 342
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 342
aacatacttg tcattgacga 20
<210> 343
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 343
ctcacctgtg atgggcacgt 20
<210> 344
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 344
aacacgggac agccaccgag 20
<210> 345
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 345
cgacagattc attgtgaagc 20
<210> 346
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 346
acaccatcac gacgcgtggg 20
<210> 347
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 347
tcccagccat gggaacaagg 20
<210> 348
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 348
ggagtggaag cgcttcatcg 20
<210> 349
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 349
ttaggggtgc caccaccccg 20
<210> 350
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 350
gacacatacc gtgacctcca 20
<210> 351
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 351
ccggcccagt gggtcatcag 20
<210> 352
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 352
cctggaactg cagatgaagg 20
<210> 353
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 353
gtcctctccc tcccagccat 20
<210> 354
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 354
tccccagggt cccgccaaga 20
<210> 355
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 355
agtgagcagt gcagcctgga 20
<210> 356
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 356
tgtcctctcc ctcccagcca 20
<210> 357
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 357
ctggactggg atgaaggtga 20
<210> 358
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 358
ggggtgggcc cggctcacca 20
<210> 359
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 359
caccaccccg cgggactaga 20
<210> 360
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 360
ctgctgccac tgcccccgct 20
<210> 361
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 361
cggcccgacg tgcccatcac 20
<210> 362
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 362
cactgccccc gctaggtgcg 20
<210> 363
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 363
atacacgctg gcctgctcct 20
<210> 364
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 364
caaacactgt gatgtctgtg 20
<210> 365
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 365
gcgggaccct ggggatgcct 20
<210> 366
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 366
gcgggagcgc cagacctcac 20
<210> 367
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 367
aggacaggct tctctccaca 20
<210> 368
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 368
gcagacacca acacggtgct 20
<210> 369
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 369
ccaccacccc gcgggactag 20
<210> 370
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 370
atccccaggg tcccgccaag 20
<210> 371
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 371
cctggaggaa ggagcagcct 20
<210> 372
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 372
agagccagat gtcggaactt 20
<210> 373
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 373
atgacccact gggccggcac 20
<210> 374
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 374
gcagctttgg gcccacagac 20
<210> 375
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 375
actctctgtt agcagagagc 20
<210> 376
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 376
ccaggaagga aatgcaccta 20
<210> 377
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 377
aggcaccact cacctgtgat 20
<210> 378
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 378
ctgggcccgt gccggcccag 20
<210> 379
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 379
cagccagctg ctgggggtcc 20
<210> 380
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 380
tccactcctg ccgctcgcct 20
<210> 381
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 381
cgtccaggca gacaccaaca 20
<210> 382
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 382
cccacccaca tcagtccttc 20
<210> 383
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 383
gccagctctt gacccggcct 20
<210> 384
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 384
ctgccctcct tttcctcttc 20
<210> 385
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 385
ccagccccac catgagtctg 20
<210> 386
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 386
gccgattctt ccacccagag 20
<210> 387
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 387
ctcccagaag aggaaaagga 20
<210> 388
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 388
gtggggcagg gcaggcagcc 20
<210> 389
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 389
gggtcaagag ctggccgctg 20
<210> 390
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 390
atgccccctg atgacccact 20
<210> 391
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 391
agccttctct gcctttggcc 20
<210> 392
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 392
ctctgccttt ggccgggcca 20
<210> 393
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 393
ggaacccagc ctgccctccc 20
<210> 394
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 394
ggcaggagcc tcgcacctag 20
<210> 395
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 395
tcccagacca gcacatcctg 20
<210> 396
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 396
gtgagcagtg cagcctggat 20
<210> 397
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 397
gagccagatg tcggaacttt 20
<210> 398
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 398
ggccgatggc aagccttgct 20
<210> 399
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 399
aggagcctcg cacctagcgg 20
<210> 400
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 400
aggtccccaa gaggaaaaca 20
<210> 401
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 401
cgctgaggag gcctcggccc 20
<210> 402
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 402
gaggacagcc acagccgtca 20
<210> 403
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 403
cagccccacc atgagtctgt 20
<210> 404
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 404
accccccaga gccccaagca 20
<210> 405
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 405
gaggcaccac tcacctgtga 20
<210> 406
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 406
ccaagaggaa aacagggcac 20
<210> 407
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 407
gtacgtctcc caggattgcc 20
<210> 408
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 408
cacagcctcc accaggtgcg 20
<210> 409
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 409
gatctcggca gccagctgct 20
<210> 410
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 410
cagccttctc tgcctttggc 20
<210> 411
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 411
cagaagtgac acttacctca 20
<210> 412
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 412
gctggccgct gaggaggcct 20
<210> 413
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 413
cagctccctc tagtcccgcg 20
<210> 414
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 414
cggggtgggc ccggctcacc 20
<210> 415
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 415
gacacatacc gtgacctcca 20
<210> 416
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 416
caggaaggaa atgcacctat 20
<210> 417
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 417
agtggccagc acccatggcc 20
<210> 418
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 418
ctctcctatt cttcccagca 20
<210> 419
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 419
gcccgagtcc aggcaatcct 20
<210> 420
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 420
caccttcatc tgcagttcca 20
<210> 421
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 421
ggcacaggca gacaggtgag 20
<210> 422
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 422
agcacccatg gcccggccaa 20
<210> 423
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 423
ccacaggcag cttactcact 20
<210> 424
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 424
ttcctgtgct ccaaagtgag 20
<210> 425
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 425
accgcagcct tctctgcctt 20
<210> 426
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 426
gggagccaat gcccgagtcc 20
<210> 427
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 427
ttcccagcaa ggcttgccat 20
<210> 428
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 428
agccagatgt cggaactttg 20
<210> 429
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 429
tacacgggct acagtcccta 20
<210> 430
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 430
tctgtgttag accctcttgg 20
<210> 431
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 431
aagctgcccc cagcgctctg 20
<210> 432
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 432
ctttgggggg ttcgaggagg 20
<210> 433
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 433
gggccgatgg caagccttgc 20
<210> 434
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 434
cacaggcagc ttactcactg 20
<210> 435
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 435
cccagaccag cacatcctgc 20
<210> 436
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 436
aggctgggtt ccataccata 20
<210> 437
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 437
ggacttctaa ttgctgagaa 20
<210> 438
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 438
ctcaaattcc cacagactca 20
<210> 439
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 439
aaaacagggc acaggcagac 20
<210> 440
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 440
ccagatgtcg gaactttggg 20
<210> 441
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 441
ctccctctag tcccgcgggg 20
<210> 442
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 442
agcccccagt gcagagccca 20
<210> 443
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 443
cctggacgcc cagcttctgc 20
<210> 444
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 444
caggggctgg caggagcccg 20
<210> 445
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 445
ccttgttccc atggctggga 20
<210> 446
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 446
ctcatctgcc acagagcgct 20
<210> 447
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 447
ggcagacacc aacacggtgc 20
<210> 448
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 448
tccctcttga ttcctcttcc 20
<210> 449
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 449
ccctcccagc catgggaaca 20
<210> 450
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 450
gcgtaagaag ccactcactt 20
<210> 451
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 451
tgtgtttccc ccgcacctgg 20
<210> 452
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 452
ctgagaccag tggtcatcga 20
<210> 453
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 453
gggcagcgac ctgagaccag 20
<210> 454
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 454
agcaattaga agtccctgca 20
<210> 455
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 455
tgggtgagct ggtgaaacac 20
<210> 456
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 456
ctgttagcag agagctggac 20
<210> 457
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 457
cccctgatga cccactgggc 20
<210> 458
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 458
gttcacacca tcacgacgcg 20
<210> 459
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 459
tgtccaggct gggcccgtgc 20
<210> 460
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 460
acacagacct atgccccatc 20
<210> 461
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 461
ggctgcctgc cctgccccac 20
<210> 462
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 462
ccataggtgc atttccttcc 20
<210> 463
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 463
caggctgggt tccataccat 20
<210> 464
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 464
gccccatcac agcctccacc 20
<210> 465
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 465
tgccctcctt ttcctcttct 20
<210> 466
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 466
gccagatgtc ggaactttgg 20
<210> 467
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 467
caggcagaca ggtgagagga 20
<210> 468
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 468
ccaggagtct gagctatgag 20
<210> 469
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 469
gctccaggtt gggagcctta 20
<210> 470
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 470
ctcacctgtg atgggcacgt 20
<210> 471
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 471
agctggccta cgagtctgac 20
<210> 472
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 472
gtgggtgggg gcagtgggta 20
<210> 473
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 473
catctgcagt tccagggccg 20
<210> 474
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 474
gatgacccac tgggccggca 20
<210> 475
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 475
tgacctccaa ggcgagcggc 20
<210> 476
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 476
ggatctcggc agccagctgc 20
<210> 477
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 477
tccttttcct cttctgggag 20
<210> 478
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 478
cacgacgcgt gggtggcaag 20
<210> 479
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 479
ttcacaccat cacgacgcgt 20
<210> 480
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 480
gcaggagcct cgcacctagc 20
<210> 481
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 481
cacccctaag gctcccaacc 20
<210> 482
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 482
ttgtccttgc ttggggctct 20
<210> 483
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 483
caggacaggc ttctctccac 20
<210> 484
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 484
cacctggtgg aggctgtgat 20
<210> 485
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 485
cgtctgtggg agccagtctg 20
<210> 486
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 486
ccccccaaag ttccgacatc 20
<210> 487
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 487
aggcagcctg gccaaggagc 20
<210> 488
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 488
tctgcctttg gccgggccat 20
<210> 489
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 489
ggacaggctt ctctccacag 20
<210> 490
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 490
acgtgcccat cacaggtgag 20
<210> 491
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 491
agagagtgag cagtgcagcc 20
<210> 492
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 492
cgcaggaagt tgtccaggct 20
<210> 493
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 493
ggctgggagc tcagatccat 20
<210> 494
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 494
cagctcaccc agcaccgtgt 20
<210> 495
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 495
ccagcacatc ctgcgggaac 20
<210> 496
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 496
gacctccttg ttcccatggc 20
<210> 497
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 497
ggggttcgag gaggaggccc 20
<210> 498
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 498
cagagaaggc tgcggtggct 20
<210> 499
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 499
gggagtgagt ccagcgtctg 20
<210> 500
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 500
caggagcctc gcacctagcg 20
<210> 501
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 501
ggaggaggcc ctggtgagcc 20
<210> 502
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 502
caagcaagga caaaaatggc 20
<210> 503
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 503
cgtcagggca ccccaaggcc 20
<210> 504
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 504
gctggcagtg aactggtttc 20
<210> 505
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 505
acctccttgt tcccatggct 20
<210> 506
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 506
tcccgcagga tgtgctggtc 20
<210> 507
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 507
agggactgta gcccgtgtaa 20
<210> 508
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 508
ccagtactct cgaggtggaa 20
<210> 509
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 509
aattcccaca gactcatggt 20
<210> 510
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 510
cccaccccga gccccttaca 20
<210> 511
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 511
gtgcatttcc ttcctggaag 20
<210> 512
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 512
tcagcggcca gctcttgacc 20
<210> 513
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 513
ggcccggcca aaggcagaga 20
<210> 514
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 514
acagagcgct gggggcagct 20
<210> 515
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 515
tcttgattcc tcttccagga 20
<210> 516
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 516
gcaaggacaa aaatggccgg 20
<210> 517
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 517
cagggcaggc agcctggcca 20
<210> 518
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 518
atctcggcag ccagctgctg 20
<210> 519
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 519
cccgcaggat gtgctggtct 20
<210> 520
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 520
ggctccaggt tgggagcctt 20
<210> 521
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 521
caacacggtg ctgggtgagc 20
<210> 522
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 522
gcagccgtgt ccctatggta 20
<210> 523
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 523
tgtccttgct tggggctctg 20
<210> 524
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 524
tcatggtggg gctggcttcc 20
<210> 525
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 525
gaagctgggc tattcatcca 20
<210> 526
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 526
gaccctcttg gcgggaccct 20
<210> 527
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 527
ggaaaggcag ggggcgcggg 20
<210> 528
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 528
aggtctgtgt tagaccctct 20
<210> 529
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 529
ctcagctccc tctagtcccg 20
<210> 530
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 530
tagggactgt agcccgtgta 20
<210> 531
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 531
agggggcata aacctgcaga 20
<210> 532
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 532
ctcccaggat tgcctggact 20
<210> 533
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 533
gggatgaagg tgaaggccgc 20
<210> 534
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 534
tgcagagccc aggggctggc 20
<210> 535
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 535
gaatcggcac ttgatcccat 20
<210> 536
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 536
ccgaggctgc tccttcctcc 20
<210> 537
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 537
ccagcttctg caggacgctg 20
<210> 538
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 538
gggccggcac gggcccagcc 20
<210> 539
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 539
tgaggtctgg cgctcccgct 20
<210> 540
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 540
ttggggtgcc ctgacggctg 20
<210> 541
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 541
actagaggga gctgagggca 20
<210> 542
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 542
ccagttcccg caggatgtgc 20
<210> 543
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 543
tatgccccct gatgacccac 20
<210> 544
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 544
gtgagaggag agcattggca 20
<210> 545
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 545
agcttactca ctggggtgct 20
<210> 546
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 546
atcacagcct ccaccaggtg 20
<210> 547
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 547
actgaagtgg ccagcaccca 20
<210> 548
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 548
gccggcccag tgggtcatca 20
<210> 549
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 549
cctgcagaag ctgggcgtcc 20
<210> 550
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 550
gcaccgtgtt ggtgtctgcc 20
<210> 551
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 551
ggccctggaa ctgcagatga 20
<210> 552
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 552
gtccttgctt ggggctctgg 20
<210> 553
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 553
ctccctggag agccagatgt 20
<210> 554
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 554
aaattcccac agactcatgg 20
<210> 555
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 555
tcatctgcca cagagcgctg 20
<210> 556
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 556
agtcggcagg gacactgaag 20
<210> 557
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 557
actctcgagg tggaaaggca 20
<210> 558
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 558
cccagtgagt aagctgcctg 20
<210> 559
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 559
agagggtgca aagaactctc 20
<210> 560
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 560
cacgatcccg tcagactcgt 20
<210> 561
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 561
tctgcactgg gggctcctga 20
<210> 562
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 562
cagggggcat aaacctgcag 20
<210> 563
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 563
tgaggacagc cacagccgtc 20
<210> 564
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 564
gtttcccccg cacctggtgg 20
<210> 565
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 565
ttaggggtgc caccaccccg 20
<210> 566
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 566
actggggtgc tgggacttgt 20
<210> 567
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 567
ctcactcccg tacgtctccc 20
<210> 568
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 568
aggggctggc aggagcccgt 20
<210> 569
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 569
tccttgttcc catggctggg 20
<210> 570
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 570
gccaaaggca gagaaggctg 20
<210> 571
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 571
cacgggctcc tgccagcccc 20
<210> 572
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 572
ccacagcgtc ctgcagaagc 20
<210> 573
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 573
acgggctcct gccagcccct 20
<210> 574
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 574
atgggagcaa cgtggccatg 20
<210> 575
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 575
cccaaggccg ggtcaagagc 20
<210> 576
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 576
aattgctgag aaggggccga 20
<210> 577
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 577
gggcaggagt gaggagggcc 20
<210> 578
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 578
ggcgggaccc tggggatgcc 20
<210> 579
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 579
ggggctggca ggagcccgtg 20
<210> 580
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 580
ttccgacatc tggctctcca 20
<210> 581
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 581
gtgctgccct tgccagccac 20
<210> 582
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 582
actcctgccg ctcgccttgg 20
<210> 583
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 583
gtggacttct tccggaagct 20
<210> 584
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 584
ccagtgcaga gcccaggggc 20
<210> 585
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 585
ggggcagtgg cagcagcttt 20
<210> 586
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 586
gggactgtag cccgtgtaag 20
<210> 587
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 587
ccacagactc atggtggggc 20
<210> 588
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 588
aacacgggac agccaccgag 20
<210> 589
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 589
gcaaagaact ctctggaggt 20
<210> 590
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 590
tgggcccgtg ccggcccagt 20
<210> 591
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 591
ctcctgccgg ggcatcctgc 20
<210> 592
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 592
aggcagacag gtgagaggaa 20
<210> 593
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 593
aggcaatcct gggagacgta 20
<210> 594
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 594
tcagaccagt actctcgagg 20
<210> 595
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 595
aacatacttg tcattgacga 20
<210> 596
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 596
ggcagcttgg ccgctctggg 20
<210> 597
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 597
gagttctttg caccctctgc 20
<210> 598
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 598
gccacaggca gcttactcac 20
<210> 599
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 599
aggctgcctg ccctgcccca 20
<210> 600
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 600
ccggcccagt gggtcatcag 20
<210> 601
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 601
ctctcgaggt ggaaaggcag 20
<210> 602
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 602
gattgcctgg actcgggcat 20
<210> 603
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 603
tccttgcttg gggctctggg 20
<210> 604
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 604
gcagagaagg ctgcggtggc 20
<210> 605
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 605
accgtgacct ccaaggcgag 20
<210> 606
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 606
caggacgctg tggatctccg 20
<210> 607
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 607
aggaagcagc cgtgtcccta 20
<210> 608
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 608
acgcaggaag ttgtccaggc 20
<210> 609
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 609
gaggtcccca agaggaaaac 20
<210> 610
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 610
cccccagctt cttcccatcc 20
<210> 611
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 611
attcccacag actcatggtg 20
<210> 612
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 612
tccaaggcga gcggcaggag 20
<210> 613
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 613
gctgggagct cagatccata 20
<210> 614
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 614
tgggggccca ggcatcccca 20
<210> 615
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 615
gggtgcaaag aactctctgg 20
<210> 616
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 616
gcgggactag agggagctga 20
<210> 617
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 617
actggagaag aagaagatcc 20
<210> 618
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 618
ccagctcttg acccggcctt 20
<210> 619
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 619
gaactttggg gggttcgagg 20
<210> 620
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 620
gaaaccagtt cactgccagc 20
<210> 621
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 621
acagccgtca gggcacccca 20
<210> 622
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 622
ccaccccgag ccccttacac 20
<210> 623
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 623
tctcggcagc cagctgctgg 20
<210> 624
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 624
agagagctgg actgggatga 20
<210> 625
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 625
cctttccacc tcgagagtac 20
<210> 626
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 626
aagctggcct acgagtctga 20
<210> 627
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 627
gtctgtggga gccagtctgt 20
<210> 628
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 628
agacctatgc cccatcaggc 20
<210> 629
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 629
tgggaagaag ctgggggccc 20
<210> 630
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 630
ctgtggagag aagcctgtcc 20
<210> 631
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 631
gggacttcta attgctgaga 20
<210> 632
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 632
ggactcgggc attggctccc 20
<210> 633
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 633
catctgccac agagcgctgg 20
<210> 634
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 634
cttctgggag tggaggctcc 20
<210> 635
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 635
gcccccagtg cagagcccag 20
<210> 636
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 636
tttgtccttg cttggggctc 20
<210> 637
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 637
gtggggctgg cttccaggac 20
<210> 638
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 638
tcaagagctg gccgctgagg 20
<210> 639
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 639
cctctagtcc cgcggggtgg 20
<210> 640
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 640
gctcatctgc cacagagcgc 20
<210> 641
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 641
catgagtctg tgggaatttg 20
<210> 642
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 642
tgcgaggctc ctgcctgatg 20
<210> 643
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 643
ggagtgagtc cagcgtctgt 20
<210> 644
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 644
tgcaaagaac tctctggagg 20
<210> 645
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 645
cacagcgtcc tgcagaagct 20
<210> 646
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 646
cagcttactc actggggtgc 20
<210> 647
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 647
actgatgtgg gtgggggcag 20
<210> 648
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 648
gcaggatgtg ctggtctggg 20
<210> 649
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 649
tcacagtgtt tgtgccatcc 20
<210> 650
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 650
gtttgtgcca tcctggagga 20
<210> 651
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 651
tcctgaagga ctgatgtggg 20
<210> 652
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 652
tgttagcaga gagctggact 20
<210> 653
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 653
cagtgtttgt gccatcctgg 20
<210> 654
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 654
agtctgtcag ggcctctggg 20
<210> 655
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 655
tctcgaggtg gaaaggcagg 20
<210> 656
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 656
agactggctc ccacagacgc 20
<210> 657
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 657
agccactcac tttggagcac 20
<210> 658
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 658
tcccaggatt gcctggactc 20
<210> 659
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 659
cctggaactg cagatgaagg 20
<210> 660
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 660
ggggcgcttc ccacagctcc 20
<210> 661
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 661
cagcccctgg gctctgcact 20
<210> 662
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 662
gcgcgggtgg gtagtcggca 20
<210> 663
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 663
gccccaagca aggacaaaaa 20
<210> 664
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 664
agcctggatg ggaagaagct 20
<210> 665
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 665
cagctcttga cccggccttg 20
<210> 666
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 666
taggggtgcc accaccccgc 20
<210> 667
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 667
tccactccca gaagaggaaa 20
<210> 668
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 668
ggaagcgctt catcgaggag 20
<210> 669
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 669
gcatcctgct ggcagtgaac 20
<210> 670
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 670
tggatgaata gcccagcttc 20
<210> 671
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 671
acacgggaca gccaccgagc 20
<210> 672
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 672
gggctcctga aggactgatg 20
<210> 673
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 673
cagcctggat gggaagaagc 20
<210> 674
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 674
ttttcctctt ctgggagtgg 20
<210> 675
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 675
ctccaggttg ggagccttag 20
<210> 676
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 676
gggagctgag ggcaggggtc 20
<210> 677
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 677
agatgaaggt ggacttcttc 20
<210> 678
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 678
tttggccggg ccatgggtgc 20
<210> 679
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 679
ctcgcaccta gcgggggcag 20
<210> 680
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 680
cccgtgtaag gggctcgggg 20
<210> 681
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 681
tgccggccca gtgggtcatc 20
<210> 682
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 682
aaaggcagag aaggctgcgg 20
<210> 683
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 683
aggagcccgt ggggcagggc 20
<210> 684
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 684
taaggggctc ggggtgggcc 20
<210> 685
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 685
acaccatcac gacgcgtggg 20
<210> 686
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 686
ctggcaggag cccgtggggc 20
<210> 687
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 687
ccggccttgg ggtgccctga 20
<210> 688
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 688
ctgtgttaga ccctcttggc 20
<210> 689
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 689
gtgatgggca cgtcgggccg 20
<210> 690
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 690
gcccctgggc tctgcactgg 20
<210> 691
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 691
ctgggtgagc tggtgaaaca 20
<210> 692
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 692
ggctgctcct tcctccagga 20
<210> 693
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 693
acagcctcca ccaggtgcgg 20
<210> 694
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 694
tgcccgagtc caggcaatcc 20
<210> 695
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 695
aggtggaaag gcagggggcg 20
<210> 696
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 696
cgacagattc attgtgaagc 20
<210> 697
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 697
gcggggtggt ggcaccccta 20
<210> 698
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 698
ggcaatcctg ggagacgtac 20
<210> 699
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 699
gccgctcgcc ttggaggtca 20
<210> 700
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 700
tcactgccag caggatgccc 20
<210> 701
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 701
cctgaaggac tgatgtgggt 20
<210> 702
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 702
gtgcgaggct cctgcctgat 20
<210> 703
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 703
gcacctggtg gaggctgtga 20
<210> 704
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 704
tcacagcctc caccaggtgc 20
<210> 705
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 705
gccgctctgg gtggaagaat 20
<210> 706
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 706
gactagaggg agctgagggc 20
<210> 707
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 707
tcagctccct ctagtcccgc 20
<210> 708
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 708
ggagcctcca ctcccagaag 20
<210> 709
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 709
agaccctctt ggcgggaccc 20
<210> 710
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 710
ccaccttcat ctgcagttcc 20
<210> 711
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 711
gggagtggag gctccaggtt 20
<210> 712
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 712
cagtgaactg gtttctggag 20
<210> 713
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 713
tcacctgtga tgggcacgtc 20
<210> 714
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 714
tgccagcagg atgccccggc 20
<210> 715
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 715
accctcttgg cgggaccctg 20
<210> 716
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 716
tgggggcagc ttggccgctc 20
<210> 717
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 717
aggaggaggc cctggtgagc 20
<210> 718
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 718
ctggaggtgg gagccatgca 20
<210> 719
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 719
tctggaggtg ggagccatgc 20
<210> 720
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 720
cctggatggg aagaagctgg 20
<210> 721
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 721
ccagcccctg ggctctgcac 20
<210> 722
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 722
ggagtggaag cgcttcatcg 20
<210> 723
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 723
tgtagcccgt gtaaggggct 20
<210> 724
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 724
ggagtgagga gggccgggga 20
<210> 725
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 725
gaggtcacgg tatgtgtcgt 20
<210> 726
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 726
ctagagggag ctgagggcag 20
<210> 727
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 727
tggtgtgttt cccccgcacc 20
<210> 728
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 728
ctgatgtggg tgggggcagt 20
<210> 729
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 729
agggccgggg agggcaggct 20
<210> 730
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 730
tgagctatga gtggcccctg 20
<210> 731
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 731
tcttacgcag gaagttgtcc 20
<210> 732
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 732
gttccgacat ctggctctcc 20
<210> 733
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 733
agggggcgcg ggtgggtagt 20
<210> 734
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 734
cgctggcctg ctccttggcc 20
<210> 735
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 735
gaaaggcagg gggcgcgggt 20
<210> 736
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 736
tagcccgtgt aaggggctcg 20
<210> 737
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 737
ctgagggcag gggtccggtg 20
<210> 738
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 738
acacagctta gtatacacgc 20
<210> 739
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 739
ccgtcagggc accccaaggc 20
<210> 740
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 740
ggcaggggtc cggtgaggtc 20
<210> 741
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 741
ggacttgtag gagaggatct 20
<210> 742
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 742
tcccagccat gggaacaagg 20
<210> 743
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 743
gacttctaat tgctgagaag 20
<210> 744
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 744
ggctcctgaa ggactgatgt 20
<210> 745
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 745
tggcaggagc ccgtggggca 20
<210> 746
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 746
agacaggtga gaggaagggc 20
<210> 747
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 747
tcggaacttt ggggggttcg 20
<210> 748
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 748
gcctggatgg gaagaagctg 20
<210> 749
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 749
tgaaggactg atgtgggtgg 20
<210> 750
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 750
ctgggggccc aggcatcccc 20
<210> 751
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 751
gagcccccag tgcagagccc 20
<210> 752
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 752
ggcgcgggtg ggtagtcggc 20
<210> 753
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 753
ccgtgtaagg ggctcggggt 20
<210> 754
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 754
gtcgtgatgg tgtgaacacc 20
<210> 755
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 755
acgacgcgtg ggtggcaagc 20
<210> 756
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 756
gggggcagtg gcagcagctt 20
<210> 757
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 757
agcgtgtata ctaagctgtg 20
<210> 758
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 758
gctcctgcct gatggggcat 20
<210> 759
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 759
gtctgtcagg gcctctggga 20
<210> 760
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 760
gtagcccgtg taaggggctc 20
<210> 761
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 761
agcccctggg ctctgcactg 20
<210> 762
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 762
gtgaactggt ttctggagcg 20
<210> 763
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 763
ctacgagtct gacgggatcg 20
<210> 764
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 764
agtgaactgg tttctggagc 20
<210> 765
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 765
acgcgtgggt ggcaagcggg 20
<210> 766
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 766
cgcgggacta gagggagctg 20
<210> 767
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 767
ggcaggagtg aggagggccg 20
<210> 768
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 768
aagtgagtgg cttcttacgc 20
<210> 769
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 769
ctgaaggact gatgtgggtg 20
<210> 770
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 770
ttgccaccca cgcgtcgtga 20
<210> 771
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 771
agggcaggag tgaggagggc 20
<210> 772
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 772
tcttcttctc cagttcccgc 20
<210> 773
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 773
aggagtgagg agggccgggg 20
<210> 774
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 774
actcccagaa gaggaaaagg 20
<210> 775
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 775
tgaggagggc cggggagggc 20
<210> 776
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 776
acctggtgga ggctgtgatg 20
<210> 777
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 777
cagggccgag gcctcctcag 20
<210> 778
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 778
tactctcgag gtggaaaggc 20
<210> 779
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 779
ttggggctct ggggggtgag 20
<210> 780
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 780
gctcctggac ccccagcagc 20
<210> 781
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 781
ggggggtgag aggagagcat 20
<210> 782
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 782
cggcccagtg ggtcatcagg 20
<210> 783
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 783
aggaagggca ggagtgagga 20
<210> 784
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 784
gagggccggg gagggcaggc 20
<210> 785
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 785
tgctgggggt ccaggagctg 20
<210> 786
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 786
gctgggggtc caggagctgt 20
<210> 787
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 787
tgagaggaag ggcaggagtg 20
<210> 788
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 788
tgggagtgga ggctccaggt 20
<210> 789
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 789
gaggaagggc aggagtgagg 20
<210> 790
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 790
gctggctgtg aactggtttc 20
<210> 791
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 791
ctagttcccg aaggatgtgc 20
<210> 792
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 792
attggagacc accactccgt 20
<210> 793
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 793
ttccctcctc tgccagccat 20
<210> 794
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 794
cgaaggaagt tgtccaggct 20
<210> 795
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 795
atacctgtga taggcacatc 20
<210> 796
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 796
gacttccttg ttcccatggc 20
<210> 797
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 797
ggccttcgaa tccgacggag 20
<210> 798
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 798
ccttatgaaa aagtcaaaac 20
<210> 799
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 799
aaaatatcaa gtatatatgg 20
<210> 800
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 800
tctagcatcg gcatgccaaa 20
<210> 801
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 801
ttggaagctc atggacaaag 20
<210> 802
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 802
gatttcctcc tcgaccacca 20
<210> 803
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 803
cttcatctct tggatcaaag 20
<210> 804
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 804
aatgtatgaa gaacagtcac 20
<210> 805
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 805
taaacttacc tgaaacagcc 20
<210> 806
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 806
aagaatatga tgttcctccc 20
<210> 807
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 807
agcaagctgc cgcagatcgc 20
<210> 808
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 808
agtactcatt ctcactgagt 20
<210> 809
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 809
tctttgttgc aggagtctga 20
<210> 810
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 810
caggggcttg ttatgaggta 20
<210> 811
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 811
ctgattgatg gtagcaggga 20
<210> 812
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 812
ccttatcttc agtcacatgc 20
<210> 813
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 813
tcacatgctg gcagaaatca 20
<210> 814
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 814
ttctgtcgct gtgagataaa 20
<210> 815
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 815
acaaggcagt acctgccacg 20
<210> 816
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 816
tgtgactcac ccgggataca 20
<210> 817
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 817
gaggtccatc agatcagctc 20
<210> 818
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 818
atctccctgg aactggccat 20
<210> 819
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 819
tgcaaaaatt gcaaaactca 20
<210> 820
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 820
tgcacagaac tattgtacca 20
<210> 821
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 821
cagattagtg cttaccttcc 20
<210> 822
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 822
attccgtaaa atagagcccc 20
<210> 823
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 823
ctgcactcgg ctgggacaat 20
<210> 824
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 824
agtccatatg gaacccacgg 20
<210> 825
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 825
agtctgagtg caaattgggc 20
<210> 826
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 826
tacgaattgc accggaccag 20
<210> 827
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 827
ttagaggctt gaggaaaccg 20
<210> 828
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 828
ttagaaccta tgaagctctg 20
<210> 829
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 829
cctgaataaa ctccaccgca 20
<210> 830
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 830
aattcgaaag cccatcagtt 20
<210> 831
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 831
tggccacaac ccaaactgat 20
<210> 832
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 832
cagcatactc tgaggtacga 20
<210> 833
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 833
ttacctctag cactgctgag 20
<210> 834
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 834
tatgcagtcc attattgaca 20
<210> 835
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 835
gtaacacagc ttattccgcg 20
<210> 836
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 836
actttcccta gcaatgcagg 20
<210> 837
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 837
caaatgggca agccttacgg 20
<210> 838
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 838
ctcaatgtcc gtattgatag 20
<210> 839
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 839
agtctgagtg caaattgggc 20
<210> 840
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 840
ccagatagtg caaattgcta 20
<210> 841
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 841
tgatagtggt ctggtcaaat 20
<210> 842
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 842
aattcgaaag cccatcagtt 20
<210> 843
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 843
gcccattact ttgtgtagtg 20
<210> 844
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 844
tggccacagc ccaaactgat 20
<210> 845
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 845
cgtccgcgcc atgttccagg 20
<210> 846
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 846
tggtttcagg agccctgtaa 20
<210> 847
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 847
acccggatac agcagcagct 20
<210> 848
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 848
ttccagggct ccgagccgcg 20
<210> 849
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 849
ctgaaggcta ccaactacaa 20
<210> 850
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 850
gggtatttcc tcgaaagtct 20
<210> 851
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 851
gagccgcagg aggtgccgcg 20
<210> 852
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 852
ctgagtcagg actcccacgc 20
<210> 853
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 853
cacttacgag tccccgtcct 20
<210> 854
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 854
ctcaaattcc ttttggtttc 20
<210> 855
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 855
ggttggtgat cacagccaag 20
<210> 856
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 856
gcaggttgtt ctggaagttg 20
<210> 857
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 857
cctcgaaagt ctcggagctc 20
<210> 858
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 858
ctgcgtcaag actgctacac 20
<210> 859
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 859
tgctcacagg caagatgtag 20
<210> 860
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 860
ccggacagcc ctccaccttg 20
<210> 861
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 861
agacctacca ttgtagttgg 20
<210> 862
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 862
ccaagtgctc cacgatggcc 20
<210> 863
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 863
agcctctatc cacggctacc 20
<210> 864
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 864
gccccaggta agctggtagg 20
<210> 865
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 865
gcaagcagcg cacctgctgc 20
<210> 866
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 866
tcaagactgc tacactggcc 20
<210> 867
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 867
gcaggttgtt ctggaagttg 20
<210> 868
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 868
gggtgctgat gtcaacgctc 20
<210> 869
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 869
ccacgatggc caggtagccg 20
<210> 870
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 870
tggtcagcgg cttctcttcg 20
<210> 871
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 871
aatgtggggc tgatgtcaac 20
<210> 872
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 872
atttcaacaa gagcgaaacc 20
<210> 873
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 873
cacctgacca atgacttcca 20
<210> 874
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 874
gccctggaag cagcagctca 20
<210> 875
<211> 20
<212> DNA
<213> 小家鼠(Mus musculus)
<400> 875
gctcacaggc aagatgtaga 20
<210> 876
<211> 207
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 876
Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser
1 5 10 15
Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr
20 25 30
Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr
35 40 45
Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys
50 55 60
Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp
65 70 75 80
His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr
85 90 95
Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu
100 105 110
Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met
115 120 125
Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu
130 135 140
Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys
145 150 155 160
Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn
165 170 175
Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg
180 185 190
Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile
195 200 205
<210> 877
<211> 220
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 877
Met Leu Arg Leu Leu Leu Ala Leu Asn Leu Phe Pro Ser Ile Gln Val
1 5 10 15
Thr Gly Asn Lys Ile Leu Val Lys Gln Ser Pro Met Leu Val Ala Tyr
20 25 30
Asp Asn Ala Val Asn Leu Ser Cys Lys Tyr Ser Tyr Asn Leu Phe Ser
35 40 45
Arg Glu Phe Arg Ala Ser Leu His Lys Gly Leu Asp Ser Ala Val Glu
50 55 60
Val Cys Val Val Tyr Gly Asn Tyr Ser Gln Gln Leu Gln Val Tyr Ser
65 70 75 80
Lys Thr Gly Phe Asn Cys Asp Gly Lys Leu Gly Asn Glu Ser Val Thr
85 90 95
Phe Tyr Leu Gln Asn Leu Tyr Val Asn Gln Thr Asp Ile Tyr Phe Cys
100 105 110
Lys Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser
115 120 125
Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro
130 135 140
Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile
165 170 175
Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met
180 185 190
Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro
195 200 205
Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
210 215 220
<210> 878
<211> 351
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 878
Met Ser Phe Pro Cys Lys Phe Val Ala Ser Phe Leu Leu Ile Phe Asn
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gly Ala Val Ser Lys Glu Ile Thr Asn Ala Leu Glu
20 25 30
Thr Trp Gly Ala Leu Gly Gln Asp Ile Asn Leu Asp Ile Pro Ser Phe
35 40 45
Gln Met Ser Asp Asp Ile Asp Asp Ile Lys Trp Glu Lys Thr Ser Asp
50 55 60
Lys Lys Lys Ile Ala Gln Phe Arg Lys Glu Lys Glu Thr Phe Lys Glu
65 70 75 80
Lys Asp Thr Tyr Lys Leu Phe Lys Asn Gly Thr Leu Lys Ile Lys His
85 90 95
Leu Lys Thr Asp Asp Gln Asp Ile Tyr Lys Val Ser Ile Tyr Asp Thr
100 105 110
Lys Gly Lys Asn Val Leu Glu Lys Ile Phe Asp Leu Lys Ile Gln Glu
115 120 125
Arg Val Ser Lys Pro Lys Ile Ser Trp Thr Cys Ile Asn Thr Thr Leu
130 135 140
Thr Cys Glu Val Met Asn Gly Thr Asp Pro Glu Leu Asn Leu Tyr Gln
145 150 155 160
Asp Gly Lys His Leu Lys Leu Ser Gln Arg Val Ile Thr His Lys Trp
165 170 175
Thr Thr Ser Leu Ser Ala Lys Phe Lys Cys Thr Ala Gly Asn Lys Val
180 185 190
Ser Lys Glu Ser Ser Val Glu Pro Val Ser Cys Pro Glu Lys Gly Leu
195 200 205
Asp Ile Tyr Leu Ile Ile Gly Ile Cys Gly Gly Gly Ser Leu Leu Met
210 215 220
Val Phe Val Ala Leu Leu Val Phe Tyr Ile Thr Lys Arg Lys Lys Gln
225 230 235 240
Arg Ser Arg Arg Asn Asp Glu Glu Leu Glu Thr Arg Ala His Arg Val
245 250 255
Ala Thr Glu Glu Arg Gly Arg Lys Pro His Gln Ile Pro Ala Ser Thr
260 265 270
Pro Gln Asn Pro Ala Thr Ser Gln His Pro Pro Pro Pro Pro Gly His
275 280 285
Arg Ser Gln Ala Pro Ser His Arg Pro Pro Pro Pro Gly His Arg Val
290 295 300
Gln His Gln Pro Gln Lys Arg Pro Pro Ala Pro Ser Gly Thr Gln Val
305 310 315 320
His Gln Gln Lys Gly Pro Pro Leu Pro Arg Pro Arg Val Gln Pro Lys
325 330 335
Pro Pro His Gly Ala Ala Glu Asn Ser Leu Ser Pro Ser Ser Asn
340 345 350
<210> 879
<211> 153
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 879
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu
20 25 30
Gln Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile
35 40 45
Asn Asn Tyr Lys Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe
50 55 60
Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu
65 70 75 80
Glu Glu Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys
85 90 95
Asn Phe His Leu Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile
100 105 110
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala
115 120 125
Asp Glu Thr Ala Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe
130 135 140
Cys Gln Ser Ile Ile Ser Thr Leu Thr
145 150
<210> 880
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 880
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 881
<211> 254
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 881
Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro
1 5 10 15
Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val
20 25 30
Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe
35 40 45
Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser
50 55 60
Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp
65 70 75 80
Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val
85 90 95
Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp
100 105 110
Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu
115 120 125
Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe
130 135 140
Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser
145 150 155 160
Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala
165 170 175
Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala
180 185 190
Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala
195 200 205
Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His
210 215 220
Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val
225 230 235 240
Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu
245 250
<210> 882
<211> 142
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 882
Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
1 5 10 15
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
20 25 30
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
35 40 45
Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
50 55 60
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
65 70 75 80
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
85 90 95
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
100 105 110
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
115 120 125
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
130 135 140
<210> 883
<211> 178
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 883
Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser
1 5 10 15
Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala
20 25 30
Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly
35 40 45
Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu
50 55 60
Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg
65 70 75 80
Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln
85 90 95
Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg
100 105 110
Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala
115 120 125
Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala
130 135 140
Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val
145 150 155 160
Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser
165 170 175
Arg Gly
<210> 884
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 884
Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln Cys
1 5
<210> 885
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 885
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val
20 25 30
Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala
35 40 45
Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr
50 55 60
Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile
85 90 95
Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg
100 105 110
Pro Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser
115 120 125
Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 886
<211> 311
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 886
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 887
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 95LY_NyESO_TCRa
<400> 887
Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp
1 5 10 15
Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val
20 25 30
Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala
35 40 45
Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr
50 55 60
Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg
65 70 75 80
Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile
85 90 95
Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg
100 105 110
Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser
115 120 125
Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln
130 135 140
Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp
145 150 155 160
Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr
165 170 175
Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser
180 185 190
Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn
195 200 205
Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro
210 215 220
Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp
225 230 235 240
Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu
245 250 255
Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp
260 265 270
Ser Ser
<210> 888
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 95LY_NyESO_TCRb
<400> 888
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 889
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 889
Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val
1 5
<210> 890
<211> 268
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DMF4_MART_TCRa
<400> 890
Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp
1 5 10 15
Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln
20 25 30
Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn
35 40 45
Thr Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu
50 55 60
Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr
65 70 75 80
Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala
85 90 95
Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Thr Gly
100 105 110
Asn Gln Phe Tyr Phe Gly Thr Gly Thr Ser Leu Thr Val Ile Pro Asn
115 120 125
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
130 135 140
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
145 150 155 160
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
165 170 175
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
180 185 190
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
195 200 205
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
210 215 220
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
225 230 235 240
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
245 250 255
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265
<210> 891
<211> 311
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DMF4_MART_TCRb
<400> 891
Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Thr
1 5 10 15
Gly His Met Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Val Thr
20 25 30
Glu Thr Gly Thr Pro Val Thr Leu Arg Cys His Gln Thr Glu Asn His
35 40 45
Arg Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys Asp Thr Asp Lys Gly Glu Val Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asp Phe Leu Leu Thr
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Thr Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ile
100 105 110
Ser Glu Val Gly Val Gly Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 892
<211> 272
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DMF5_MART_TCRa
<400> 892
Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser
1 5 10 15
Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu
20 25 30
Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp
35 40 45
Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser
50 55 60
Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly
65 70 75 80
Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu
85 90 95
Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val
100 105 110
Asn Phe Gly Gly Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser
115 120 125
Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg
130 135 140
Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp
145 150 155 160
Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr
165 170 175
Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser
180 185 190
Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe
195 200 205
Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser
210 215 220
Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn
225 230 235 240
Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu
245 250 255
Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 893
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DMF5_MART_TCRb
<400> 893
Met Arg Ile Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu
20 25 30
Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His
35 40 45
Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Val Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 894
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 894
Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu
1 5
<210> 895
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DLT_WT1_TCRa
<400> 895
Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp
1 5 10 15
Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val
20 25 30
Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala
35 40 45
Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln
50 55 60
Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg
65 70 75 80
Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr
100 105 110
Glu Asp Leu Thr Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys
115 120 125
Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser
130 135 140
Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln
145 150 155 160
Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys
165 170 175
Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val
180 185 190
Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn
195 200 205
Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys
210 215 220
Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn
225 230 235 240
Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val
245 250 255
Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
260 265 270
<210> 896
<211> 310
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DLT_WT1_TCRb
<400> 896
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly
305 310
<210> 897
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> P2A_接头
<400> 897
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 898
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> IG4_NyESO_TCRa_TCR
<400> 898
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
305 310 315 320
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp Val Ser Ser
340 345 350
Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly
355 360 365
Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn
370 375 380
Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu
385 390 395 400
Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala
405 410 415
Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser
420 425 430
Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Thr Ser
435 440 445
Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val
450 455 460
His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
465 470 475 480
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
485 490 495
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
500 505 510
Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
515 520 525
Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn
530 535 540
Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
545 550 555 560
Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu
565 570 575
Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys
580 585 590
Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600 605
<210> 899
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 95LY_NyESO_TCRa_TCRb
<400> 899
Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu
20 25 30
Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His
35 40 45
Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg
85 90 95
Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg
115 120 125
Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
305 310 315 320
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr
325 330 335
Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp Val Ser Ser
340 345 350
Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly
355 360 365
Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn
370 375 380
Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu
385 390 395 400
Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala
405 410 415
Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser
420 425 430
Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Leu Tyr
435 440 445
Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val
450 455 460
His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp
465 470 475 480
Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser
485 490 495
Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp
500 505 510
Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala
515 520 525
Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn
530 535 540
Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser
545 550 555 560
Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu
565 570 575
Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys
580 585 590
Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600 605
<210> 900
<211> 601
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DMF4_MART_TCRa_TCRb
<400> 900
Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Thr
1 5 10 15
Gly His Met Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Val Thr
20 25 30
Glu Thr Gly Thr Pro Val Thr Leu Arg Cys His Gln Thr Glu Asn His
35 40 45
Arg Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys Asp Thr Asp Lys Gly Glu Val Ser
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asp Phe Leu Leu Thr
85 90 95
Leu Glu Ser Ala Thr Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ile
100 105 110
Ser Glu Val Gly Val Gly Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg
115 120 125
Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala
130 135 140
Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr
145 150 155 160
Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser
165 170 175
Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro
180 185 190
Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu
195 200 205
Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn
210 215 220
His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu
225 230 235 240
Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu
245 250 255
Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln
260 265 270
Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala
275 280 285
Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val
290 295 300
Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
305 310 315 320
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu
325 330 335
Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp Val Ser Gly
340 345 350
Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln Glu Gly Glu
355 360 365
Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn Thr Trp Leu
370 375 380
Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Ile Ala Leu
385 390 395 400
Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr Ala Gln Phe
405 410 415
Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala Ser Ile Pro
420 425 430
Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Thr Gly Asn Gln Phe
435 440 445
Tyr Phe Gly Thr Gly Thr Ser Leu Thr Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn
450 455 460
Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys
465 470 475 480
Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln
485 490 495
Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met
500 505 510
Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys
515 520 525
Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu
530 535 540
Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val
545 550 555 560
Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser
565 570 575
Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu
580 585 590
Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 901
<211> 604
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DMF5_MART_TCRa_TCRb
<400> 901
Met Arg Ile Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Ser Leu Leu Trp Ala
1 5 10 15
Gly Pro Val Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu
20 25 30
Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His
35 40 45
Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro
65 70 75 80
Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Val Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
305 310 315 320
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Lys Ser Leu
325 330 335
Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser Trp Val Trp Ser
340 345 350
Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu
355 360 365
Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln
370 375 380
Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile
385 390 395 400
Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala
405 410 415
Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser
420 425 430
Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Phe Gly Gly
435 440 445
Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser Val Lys Pro Asn
450 455 460
Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser
465 470 475 480
Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn
485 490 495
Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val
500 505 510
Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp
515 520 525
Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile
530 535 540
Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val
545 550 555 560
Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln
565 570 575
Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly
580 585 590
Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 902
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> DLT_WT1_TCRa_TCRb
<400> 902
Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala
1 5 10 15
Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg
20 25 30
Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His
35 40 45
Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu
50 55 60
Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala
65 70 75 80
Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr
85 90 95
Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser
100 105 110
Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu
115 120 125
Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val
130 135 140
Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu
145 150 155 160
Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp
165 170 175
Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln
180 185 190
Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser
195 200 205
Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His
210 215 220
Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp
225 230 235 240
Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala
245 250 255
Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly
260 265 270
Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr
275 280 285
Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys
290 295 300
Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu
305 310 315 320
Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Ser Ile
325 330 335
Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp Leu Val Asn Gly
340 345 350
Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val Gln Glu Gly Asp
355 360 365
Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala Ser Asn Tyr Phe
370 375 380
Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln Leu Ile Ile Asp
385 390 395 400
Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg Ile Ala Val Thr
405 410 415
Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile Thr Glu Thr Gln
420 425 430
Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Glu Asp Leu Thr
435 440 445
Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro Asp Ile Gln
450 455 460
Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp
465 470 475 480
Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser
485 490 495
Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp
500 505 510
Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn
515 520 525
Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro
530 535 540
Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu
545 550 555 560
Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu
565 570 575
Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn
580 585 590
Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser
595 600
<210> 903
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 903
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile
20 25 30
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly
50 55 60
Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser
85 90 95
Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln
100 105 110
Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
115 120 125
Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
165 170 175
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
195 200 205
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu
275 280 285
Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp
290 295 300
Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly
305 310 315 320
Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe
325 330 335
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
340 345 350
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
355 360 365
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
370 375 380
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
385 390 395 400
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
405 410 415
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
420 425 430
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440
<210> 904
<211> 1328
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 904
atgctcctcc tggttactag cttgcttttg tgcgaactgc cgcatcctgc cttccttctc 60
atcccagata tacttctgac acaatctccg gtaatacttt ccgtctcacc gggggagcga 120
gtgtcatttt catgccgggc gagtcaatcc atcgggacga atattcactg gtatcagcaa 180
aggactaacg gctcaccacg ccttctcatc aagtatgcca gtgagtccat aagtggcatt 240
ccctctagat tctcaggatc aggcagtggc acggacttca cattgtcaat taatagcgta 300
gaaagtgagg acatagcaga ttattattgc caacaaaaca ataactggcc taccacattc 360
ggtgcaggca ccaagcttga gttgaagggg ggtggtggtt ctggaggcgg tgggagcggt 420
ggtggtgggt cacaagtgca gcttaagcaa agcggaccag gtctggtcca acctagccag 480
tcactgtcaa tcacatgtac ggtatccggc tttagtctga caaattatgg cgtccactgg 540
gtaaggcaat cccctggaaa gggcctcgag tggttggggg tgatttggag cggaggaaac 600
accgactata ataccccttt cacctccaga ctgtccataa acaaggacaa ctctaaaagt 660
caggtattct tcaaaatgaa cagtctgcaa agtaatgaca cagcgatata ttattgcgcg 720
agagccctta catactacga ttacgagttc gcttattggg gacaaggaac gttggtgacg 780
gtgtctgcca caaccactcc tgctcccagg ccaccaacac cggcgcctac catagcgtca 840
cagccgctta gtctcaggcc ggaagcgtgt cgccccgcag ccggtggggc ggtccacaca 900
cgcgggctgg atttcgcatg cgatatatac atctgggcac cccttgccgg gacctgcggt 960
gttttgctct tgtctctcgt aatcacgctg tactgtcggg ttaagttttc aagatctgcg 1020
gatgccccgg cataccaaca agggcagaat cagttgtaca acgaactgaa cttgggcaga 1080
cgcgaggagt atgatgtctt ggacaagagg cgggggcgcg acccggaaat gggtggcaaa 1140
ccacggcgca agaacccaca agaggggctt tacaacgaat tgcagaaaga caagatggcc 1200
gaggcataca gcgagattgg catgaaagga gagaggagga ggggaaaggg gcatgatggc 1260
ctttatcagg gcctttctac tgccaccaag gacacatacg acgcactgca catgcaggca 1320
ttgccacc 1328
<210> 905
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 905
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly
50 55 60
Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val
65 70 75 80
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln
100 105 110
Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile
115 120 125
Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
145 150 155 160
Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr
165 170 175
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu
180 185 190
Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys
195 200 205
Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
210 215 220
Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
225 230 235 240
Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
245 250 255
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
260 265 270
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
275 280 285
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
290 295 300
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
305 310 315 320
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Arg Val
325 330 335
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
340 345 350
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
355 360 365
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
370 375 380
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
385 390 395 400
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
405 410 415
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
420 425 430
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
435 440 445
<210> 906
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 906
atgctccttc ttgtgacgtc actcctgctt tgtgagctgc cgcacccggc ctttctgctc 60
atacccgaca tacaaatgac acagacgaca agttcccttt ccgcctcctt gggcgaccga 120
gtgacaatca gttgccgagc ttcccaggac atatctaaat atttgaattg gtatcagcaa 180
aagccagatg gtacggttaa acttcttatc taccacacct ccaggctcca ttctggggtt 240
ccgagccgat tctctggatc tggctcaggg accgattatt ctttgactat ttccaatttg 300
gagcaggaag acatcgcaac ctatttctgc caacaaggaa atacgctgcc atacaccttc 360
ggcgggggca ccaaactcga gattactggg ggtgggggga gtggaggagg gggttccggt 420
ggaggtgggt cagaagtcaa gctgcaagag agtgggcccg ggttggttgc tcctagccaa 480
tccttgagtg taacatgcac cgttagcgga gtttcacttc ctgactacgg tgttagctgg 540
ataagacagc ccccgaggaa gggtctggaa tggctggggg tcatttgggg cagtgagacg 600
acatattaca acagtgcctt gaaatccagg cttacgatca taaaagacaa tagtaaaagc 660
caagtgttcc tcaagatgaa ctctcttcag accgacgaca cagccatcta ctattgcgca 720
aaacattatt attatggagg tagttacgct atggactatt ggggccaggg gacttcagtg 780
acggtgagta gtaccacgac tccggcaccg agaccaccaa caccagcccc aacaattgcc 840
tcacagccct tgagccttag acccgaggcc tgtaggcccg ccgcaggagg ggcagttcat 900
acgcgaggat tggactttgc atgtgacatc tatatctggg cgccacttgc gggaacttgc 960
ggtgtccttt tgctctcatt ggtcattacc ctctattgtt tgagagtaaa attttcccgc 1020
tccgctgatg cgcctgcata ccagcaaggt cagaaccaac tctacaatga gcttaacctc 1080
ggtagaagag aggaatatga cgtcttggat aagaggagag gccgagaccc agaaatgggg 1140
ggaaagccgc gccgcaagaa tccacaagaa ggtctttaca atgaactgca gaaggacaaa 1200
atggccgaag cgtatagcga gataggaatg aaaggcgaac ggagacgggg caaggggcat 1260
gacgggcttt accaaggact tagcacagcg acgaaggata catacgacgc actgcatatg 1320
caagcgctgc caccgcgc 1338
<210> 907
<211> 496
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 907
Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser
1 5 10 15
Val Ile Met Ser Arg Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys
20 25 30
Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly
35 40 45
Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Thr Cys Ala Gly Thr
50 55 60
Gly Cys Cys Thr Cys Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
65 70 75 80
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
85 90 95
Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
100 105 110
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val
115 120 125
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
130 135 140
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
145 150 155 160
His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
165 170 175
Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu
180 185 190
Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro
195 200 205
Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys
210 215 220
Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu
225 230 235 240
Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp
245 250 255
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr
260 265 270
Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr
275 280 285
Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp
290 295 300
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro
305 310 315 320
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
325 330 335
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
340 345 350
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
355 360 365
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu
370 375 380
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
385 390 395 400
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
405 410 415
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
420 425 430
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
435 440 445
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
450 455 460
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
465 470 475 480
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490 495
<210> 908
<211> 1488
<212> DNA
<213> 人工生物体(artificial organism)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 908
atggactttc aggtgcagat cttctcattc ctccttatca gtgcgagtgt aattatgtca 60
agaggtgcta caggcggtgc taccacgacg acatgcgcag ggggtaccgg ttgtgcagga 120
gcgaccacga ctacctgcgc aggttgtacc acctgttgta ctggatgtac tgctgcgaca 180
tgtgcgggga cgggttgttg cacttgtgcg gacatacaaa tgacgcaaag cccgtccagc 240
ctgtctgcat cagttgggga tagagtgacg attacatgta gagcaagcca ggatgttaac 300
accgccgtag cgtggtacca acaaaaacca ggtaaagccc cgaagctgct catatactcc 360
gccagctttc tgtattcagg cgttcccagt cggttcagcg gcagcagatc agggacggat 420
tttacgctca ctatctcttc ccttcagcct gaagattttg ctacctatta ttgtcagcag 480
cattacacga ctcccccaac ttttggtcag gggactaaag ttgaaatcaa acgaacgggc 540
tccacctcag gtagcggtaa gccaggcagc ggagaagggt ctgaagtcca gttggttgag 600
agtggaggcg gtcttgtgca acccggtggc agcttgcgac tgagctgtgc agcgtctggc 660
ttcaacataa aagatactta tattcattgg gtaagacagg ctcctggtaa agggctggaa 720
tgggtggcac gaatatatcc gactaacggt tataccagat acgccgattc tgttaagggc 780
aggttcacaa taagcgccga cacaagtaag aatacggcgt atctgcagat gaattcactt 840
cgagctgaag acacagcggt atactactgc tccaggtggg gtggggatgg tttttatgcg 900
atggacgttt ggggtcaagg aacactggta actgttagtt ctaccacgac acctgctcct 960
aggcccccca caccggcacc tacgatcgct tcccagccgc ttagcctccg cccggaggca 1020
tgccggcccg ctgcgggggg agcggtacat actcgcgggt tggacttcgc ttgcgacatc 1080
tacatttggg caccactggc aggcacatgt ggcgttctgt tgcttagtct ggttattaca 1140
ctgtattgcc tgcgagttaa attctcccgc agcgctgatg cgcccgccta tcagcaaggt 1200
caaaaccagc tgtataatga gcttaatttg ggacgccgag aagagtatga cgtccttgac 1260
aagaggcgcg ggcgcgatcc ggagatgggt ggtaaaccgc gccggaaaaa cccccaggaa 1320
ggcctttaca atgagctcca aaaagataaa atggcagagg catactctga aataggaatg 1380
aagggcgaga gacgccgggg taagggacac gatggccttt atcaagggct tagtacagcc 1440
acgaaggata cgtatgacgc tctgcacatg caggctcttc ccccgaga 1488
<210> 909
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 未知生物体
<400> 909
gagtttaagc cacaaataca 20
<210> 910
<211> 20
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 910
agatgatgtc aaccaaggag 20

Claims (105)

1.一种在分解的肿瘤样品中扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体的方法，所述方法包括在培养基中培养所述分解的肿瘤样品，其中使所述TIL与T细胞受体(TCR)激动剂、CD28激动剂和T细胞刺激性细胞因子接触。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述培养基以选自由以下组成的组的时间间隔补充T细胞刺激性细胞因子：1天、2天、3天、4天、5天和6天。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述T细胞刺激性细胞因子的最终浓度为10U/ml至7,000U/ml。
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述T细胞刺激性细胞因子是IL-2。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基以选自由以下组成的组的时间间隔进行更换：1天、2天、3天、4天、5天和6天。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中维持所述培养基的组分。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基的30％至99％以选自由以下组成的组的时间间隔进行更换：1天、2天、3天、4天、5天和6天。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品来自先前已提交肿瘤样品用于TIL扩增的受试者，其中所述先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自所述前-REP步骤的TIL数量小于1000个TIL。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述肿瘤样品来自先前已提交肿瘤样品用于TIL扩增的受试者，其中所述先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自所述前-REP步骤的TIL的扩增倍数小于5倍。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分解的肿瘤样品包含大小为0.5至4mm3的肿瘤片段。
11.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分解的肿瘤样品包含消化的肿瘤片段。
12.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述培养基包含饲养细胞。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述饲养细胞是外周血单核细胞或抗原呈递细胞。
14.如权利要求12或13所述的方法，其中所述饲养细胞表达TCR激动剂、CD28激动剂和/或4-1BB配体。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述TCR激动剂、所述CD28激动剂和/或所述4-1BB配体在所述饲养细胞的表面上表达。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述饲养细胞被遗传修饰以表达所述TCR激动剂、所述CD28激动剂和/或所述4-1BB配体。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述TCR激动剂是CD3激动剂。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述CD3激动剂是OKT3。
19.如权利要求16所述的方法，其中所述CD28激动剂是CD86。
20.如权利要求12-19中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞是抗原呈递细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括K562细胞。
22.如权利要求12至21中任一项所述的方法，其中所述饲养细胞被遗传修饰以表达所述T细胞刺激性细胞因子。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述T细胞刺激性细胞因子是IL-2。
24.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述培养基不包含饲养细胞。
25.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述CD28激动剂可溶于所述培养基。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TCR激动剂是CD3激动剂。
27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TCR激动剂和/或所述CD28激动剂连接到包含聚合物链基质的胶体悬浮液的纳米基质，其中每个纳米基质在其最大维度上的长度为1至500nm。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述TCR激动剂和所述CD28激动剂附接到相同的聚合物链。
29.如权利要求27所述的方法，其中所述TCR激动剂和所述CD28激动剂附接到不同的聚合物链。
30.如权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所述TCR激动剂以每mg纳米基质25μg附接到所述纳米基质。
31.如权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述TCR激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD3抗体。
32.如权利要求1至26和31中任一项所述的方法，其中所述CD28激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD28抗体。
33.如权利要求1至26、31和32中任一项所述的方法，其中所述培养基包含CD2激动剂。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述CD2激动剂包含可溶性单特异性复合物，所述复合物包含连接在一起的两个抗CD2抗体。
35.一种用于扩增肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)群体的方法，其包括使所述TIL群体与包含聚合物链基质的胶体悬浮液的纳米基质接触，其中所述基质附接到CD3激动剂和CD28激动剂，其中所述纳米基质向所述TIL群体提供活化信号，从而活化并诱导所述TIL群体增殖，其中每个基质在其最大维度上的长度为1至500nm，并且其中所述方法不包括在所述TIL群体的扩增期间使用饲养细胞。
36.如权利要求35所述的方法，其中与所述纳米基质接触的所述TIL群体还包含肿瘤细胞。
37.如权利要求35或36中任一项所述的方法，其中所述TIL群体分离自受试者并且与所述纳米基质接触，其中在使所述TIL群体与所述纳米基质接触之前没有另外的所述TIL群体的扩增过程。
38.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述CD3激动剂和所述CD28激动剂附接到相同的聚合物链。
39.如权利要求35至37中任一项所述的方法，其中所述CD3激动剂和所述CD28激动剂附接到不同的聚合物链。
40.如权利要求35至39中任一项所述的方法，其中所述CD3激动剂以每mg纳米基质25μg附接到所述纳米基质。
41.如权利要求27至30和35至40中任一项所述的方法，其中所述纳米基质还包含嵌入在所述聚合物链基质之间或之内的磁性、顺磁性或超顺磁性纳米晶体。
42.如权利要求27至30和35至41中任一项所述的方法，其中所述聚合物链基质包含葡聚糖聚合物。
43.如权利要求27至30和35至42中任一项所述的方法，其中所述聚合物链是胶体聚合物链。
44.如权利要求27至30和35至43中任一项所述的方法，其中纳米基质的体积与TIL的体积的比率大于或等于1:5。
45.如权利要求27至30和35至44中任一项所述的方法，其中基质的数量与TIL的数量的比率大于或等于1:500。
46.如权利要求27至30和35至44中任一项所述的方法，其中所述CD28激动剂以每mg纳米基质25μg附接到所述纳米基质。
47.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激动剂是重组激动剂。
48.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述激动剂是抗体。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述抗体是人源化抗体。
50.如权利要求27至30和35至49中任一项所述的方法，其中所述CD3激动剂是OKT3或UCHT1。
51.如权利要求35至50中任一项所述的方法，其中所述待扩增的TIL来自先前已提交TIL样品用于扩增的受试者，其中所述先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自所述前-REP步骤的TIL数量小于1000个TIL。
52.如权利要求35至50中任一项所述的方法，其中所述待扩增的TIL来自先前已提交TIL样品用于扩增的受试者，其中所述先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自所述前-REP步骤的TIL的扩增倍数小于5倍。
53.一种用于扩增TIL群体的方法，其包括使所述TIL群体与包含第一、第二和第三可溶性单特异性复合物的组合物接触，其中每个可溶性单特异性复合物包含连接在一起的两个抗体或其片段，其中每个可溶性单特异性复合物的每个抗体或其片段特异性结合至所述TIL群体上的相同抗原，其中所述第一可溶性单特异性复合物包含抗CD3抗体，其中所述第二可溶性单特异性复合物包含抗CD28抗体，并且其中所述第三可溶性单特异性复合物包含抗CD2抗体，并且所述方法不包括在所述TIL群体的扩增期间使用饲养细胞。
54.如权利要求53所述的方法，其中与所述组合物接触的所述TIL群体还包含肿瘤细胞。
55.如权利要求53或54中任一项所述的方法，其中所述TIL群体分离自受试者并且与所述组合物接触，其中在使所述TIL群体与所述组合物接触之前没有另外的所述TIL群体的扩增过程。
56.如权利要求53至55中任一项所述的方法，其中所述可溶性单特异性复合物的浓度为0.2-25μl/ml。
57.如权利要求53至56中任一项所述的方法，其中所述可溶性单特异性复合物是四聚体抗体复合物(TAC)。
58.如权利要求57所述的方法，其中每个TAC包含来自第一动物物种的两个抗体，所述两个抗体由来自第二物种的两个抗体分子结合，所述来自第二物种的两个抗体分子特异性结合至来自所述第一动物物种的抗体的Fc部分。
59.如权利要求53至58中任一项所述的方法，其中所述抗CD3抗体是OKT3或UCHT1。
60.如权利要求53至59中任一项所述的方法，其中所述待扩增的TIL来自先前已提交TIL样品用于扩增的受试者，其中所述先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自所述前-REP步骤的TIL数量小于1000个TIL。
61.如权利要求53至59中任一项所述的方法，其中所述待扩增的TIL来自先前已提交TIL样品用于扩增的受试者，其中所述先前的TIL扩增包括前-REP步骤并且其中分离自所述前-REP步骤的TIL的扩增倍数小于5倍。
62.如权利要求35至40和53至59中任一项所述的方法，其还包括使所述TIL群体与所述细胞因子IL-2接触。
63.如权利要求62所述的方法，其中使所述TIL与所述细胞因子IL-2以选自由以下组成的组的时间间隔接触：1天、2天、3天、4天、5天和6天。
64.如权利要求62或63所述的方法，其中所述细胞因子IL-2的最终浓度为100U/ml至7,000U/ml。
65.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIL扩增长达9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天或25天。
66.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIL扩增9-25天、9-21天或9-14天。
67.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIL扩增500至500,000倍。
68.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIL群体扩增自100至100,000个TIL的初始TIL群体。
69.如权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述TIL群体在扩增的第14天扩增至少1,500倍。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述TIL群体在扩增的第14天扩增至多100,000倍。
71.如权利要求65至68中任一项所述的方法，其中所述TIL群体在扩增的第21天扩增至少15,000倍。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述TIL群体在扩增的第21天扩增至多500,000倍。
73.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIL群体的成员被遗传修饰。
74.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述TIL群体的成员通过基因调控系统进行修饰。
75.如权利要求74所述的方法，其中所述TIL群体的成员使用RNA干扰进行修饰。
76.如权利要求74所述的方法，其中所述TIL群体的成员使用转录激活物样效应子核酸酶(TALEN)进行修饰。
77.如权利要求74所述的方法，其中所述TIL群体的成员使用锌指核酸酶进行修饰。
78.如权利要求74所述的方法，其中所述TIL群体的成员使用RNA引导的核酸酶进行修饰。
79.如权利要求74所述的方法，其中所述TIL群体的成员使用Cas酶和至少一种指导RNA进行修饰。
80.如权利要求79所述的方法，其中所述Cas酶是Cas9。
81.如权利要求74-80中任一项所述的方法，其中所述TIL群体的成员在选自由以下组成的组的一个或多个基因处被修饰：ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。
82.如权利要求81所述的方法，其中所述在一个或多个基因处的修饰是一个或多个核酸的插入、缺失或突变。
83.如权利要求81或82中任一项所述的方法，其中所述在一个或多个基因处的修饰导致所述基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
84.如权利要求74所述的方法，其中所述TIL群体的成员被表观遗传修饰。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述表观遗传修饰是组蛋白修饰。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述TIL群体的成员在选自由以下组成的组的一个或多个基因处被修饰：ANKRD11、BCL2L11、BCL3、BCOR、CALM2、CBLB、CHIC2、CTLA4、DHODH、E2F8、EGR2、FLI1、FOXP3、GATA3、GNAS、HAVCR2、IKZF1、IKZF2、IKZF3、LAG3、MAP4K、NFKBIA、NR4A3、NRP1、PBRM1、PCBP1、PDCD1、PELI1、PIK3CD、PPP2R2D、PTPN1、PTPN2、PTPN22、PTPN6、RBM39、RC3H1、SEMA7A、SERPINA3、SETD5、SH2B3、SH2D1A、SMAD2、SOCS1、TANK、TGFBR1、TGFBR2、TIGIT、TNFAIP3、TNIP1、TRAF6、UMPS、WDR6和ZC3H12A。
87.如权利要求86所述的方法，其中所述在一个或多个基因处的修饰是一个或多个核酸的甲基化。
88.如权利要求86或87中任一项所述的方法，其中所述在一个或多个基因处的修饰导致所述基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
89.如权利要求86至88中任一项所述的方法，其中所述TIL群体的成员在SOCS1基因处被修饰。
90.如权利要求89所述的方法，其中所述SOCS1基因的修饰导致所述基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
91.如权利要求74至90中任一项所述的方法，其中所述TIL群体的成员在多于一个基因处被修饰。
92.如权利要求91所述的方法，其中所述TIL群体的成员在SOCS1基因以及选自由PTPN2、ZC3H12A、CBLB、RC3H1、NFKBIA组成的组的一个或多个另外的基因处被修饰。
93.如权利要求91所述的方法，其中所述TIL群体的成员在SOCS1和ZC3H12A基因处被修饰。
94.如权利要求93所述的方法，其中所述SOCS1和ZC3H12A基因的修饰导致所述基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
95.如权利要求91所述的方法，其中所述TIL群体的成员在SOCS1和CBLB基因处被修饰。
96.如权利要求93所述的方法，其中所述SOCS1和CBLB基因的修饰导致基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
97.如权利要求91所述的方法，其中所述TIL群体的成员在SOCS1和RC3H1基因处被修饰。
98.如权利要求93所述的方法，其中所述SOCS1和RC3H1基因的修饰导致基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
99.如权利要求91所述的方法，其中所述TIL群体的成员在SOCS1和NFKBIA基因处被修饰。
100.如权利要求93所述的方法，其中所述SOCS1和NFKBIA基因的修饰导致基因的表达和/或由所述基因编码的蛋白质的功能的降低或抑制。
101.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增所述TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少10％的所述扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。
102.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中扩增所述TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中至少15％的所述扩增群体具有中枢记忆T细胞表型。
103.如权利要求1至100中任一项所述的方法，其中扩增所述TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中5％至50％的所述扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。
104.如权利要求1至100中任一项所述的方法，其中扩增所述TIL群体以产生扩增的TIL群体，其中10％至25％的所述扩增群体在扩增的第14天具有中枢记忆T细胞表型。
105.一种组合物，其包含通过如前述权利要求中任一项所述的方法产生的扩增的TIL群体。
CN202080093941.8A 2019-11-25 2020-11-24 用于活化和扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法 Pending CN115003387A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962940035P 2019-11-25 2019-11-25
US62/940,035 2019-11-25
US202063081539P 2020-09-22 2020-09-22
US63/081,539 2020-09-22
PCT/US2020/062094 WO2021108455A1 (en) 2019-11-25 2020-11-24 Methods for activation and expansion of tumor infiltrating lymphocytes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115003387A true CN115003387A (zh) 2022-09-02

Family

ID=76128945

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202080093941.8A Pending CN115003387A (zh) 2019-11-25 2020-11-24 用于活化和扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法

Country Status (7)

Country Link
EP (1) EP4065233A4 (zh)
JP (1) JP2023502780A (zh)
KR (1) KR20220119038A (zh)
CN (1) CN115003387A (zh)
AU (1) AU2020392094A1 (zh)
CA (1) CA3162272A1 (zh)
WO (1) WO2021108455A1 (zh)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4165171A1 (en) 2020-06-12 2023-04-19 Nkarta, Inc. Genetically modified natural killer cells for cd70-directed cancer immunotherapy
TW202237822A (zh) 2020-11-19 2022-10-01 大陸商蘇州沙礫生物科技有限公司 腫瘤浸潤淋巴細胞的培養方法及其用途
WO2023011433A1 (zh) * 2021-08-03 2023-02-09 苏州沙砾生物科技有限公司 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
KR20240052771A (ko) * 2021-09-08 2024-04-23 케이에스큐 세러퓨틱스 인코포레이티드 림프구 효력 검정
WO2023125772A1 (zh) * 2021-12-30 2023-07-06 苏州沙砾生物科技有限公司 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
CN118525084A (zh) * 2022-01-19 2024-08-20 苏州沙砾生物科技有限公司 肿瘤浸润淋巴细胞在疾病治疗中的用途
WO2023172879A2 (en) * 2022-03-07 2023-09-14 Nkarta, Inc. Multiplex gene edited cells for cd70-directed cancer immunotherapy

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140087462A1 (en) * 2012-09-25 2014-03-27 Miltenyi Biotec Gmbh Method for polyclonal stimulation of t cells by flexible nanomatrices
US20160068811A1 (en) * 2014-09-04 2016-03-10 Stemcell Technologies Inc. Soluble Antibody Complexes For T Cell or NK Cell Activation and Expansion
US20160185861A1 (en) * 2014-12-29 2016-06-30 Felipe Bedoya Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells
CN108473957A (zh) * 2015-04-17 2018-08-31 诺华股份有限公司 改善嵌合抗原受体表达细胞的功效和扩增的方法
US20180250338A1 (en) * 2015-11-18 2018-09-06 Duke University Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer
WO2019178421A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108753718A (zh) * 2018-06-20 2018-11-06 淮安诺康生物科技有限公司 肿瘤浸润淋巴细胞til的体外扩增方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140087462A1 (en) * 2012-09-25 2014-03-27 Miltenyi Biotec Gmbh Method for polyclonal stimulation of t cells by flexible nanomatrices
US20160068811A1 (en) * 2014-09-04 2016-03-10 Stemcell Technologies Inc. Soluble Antibody Complexes For T Cell or NK Cell Activation and Expansion
US20160185861A1 (en) * 2014-12-29 2016-06-30 Felipe Bedoya Methods of making chimeric antigen receptor -expressing cells
CN108473957A (zh) * 2015-04-17 2018-08-31 诺华股份有限公司 改善嵌合抗原受体表达细胞的功效和扩增的方法
US20180250338A1 (en) * 2015-11-18 2018-09-06 Duke University Tumor infiltrating lymphocytes for treatment of cancer
WO2019178421A1 (en) * 2018-03-15 2019-09-19 KSQ Therapeutics, Inc. Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy

Also Published As

Publication number Publication date
AU2020392094A1 (en) 2022-06-23
WO2021108455A1 (en) 2021-06-03
EP4065233A4 (en) 2024-07-10
CA3162272A1 (en) 2021-06-03
EP4065233A1 (en) 2022-10-05
JP2023502780A (ja) 2023-01-25
KR20220119038A (ko) 2022-08-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020270508B2 (en) C/EBP alpha short activating RNA compositions and methods of use
CN114176043B (zh) 用于治疗疾病的遗传修饰的细胞、组织和器官
KR102656470B1 (ko) 질환을 치료하기 위한 유전적으로 변형된 세포, 조직 및 장기
KR102301464B1 (ko) 종양 세포에 의한 면역 억제를 감소시키기 위한 방법 및 조성물
ES2744098T3 (es) Composiciones y sus usos dirigidos a la huntingtina
CN115003387A (zh) 用于活化和扩增肿瘤浸润淋巴细胞的方法
KR20210138587A (ko) 개선된 면역요법을 위한 조합 유전자 표적
AU2016364667A1 (en) Materials and methods for treatment of Alpha-1 antitrypsin deficiency
WO2018071824A1 (en) Compositions and methods for predicting response and resistance to ctla4 blockade in melanoma using a gene expression signature
CN107250373A (zh) 通过微流体递送实现的基因编辑
KR20180128993A (ko) 면역자극성 수지상 세포를 얻는 방법
KR20200106217A (ko) 면역억제성 수지상 세포를 얻는 방법
KR102362647B1 (ko) 전반적으로 활성화된 단핵구를 수득하는 방법
KR20230034198A (ko) 종양 침윤 림프구의 활성화 및 확장 방법
KR20150092739A (ko) 예측변수 인자들을 이용하여 동정된 환자 부분모집단에서 암 치료를 위한 마시티닙의 용도
KR20220012230A (ko) 스플라이싱 및 번역을 조절하기 위한 방법 및 조성물
KR20140072035A (ko) 상피세포 성장 인자 수용체 유전자에서의 돌연변이
KR20200094230A (ko) B형 간염 감염을 치료하기 위한 PAPD5 및 PAPD7 mRNA의 감소용 핵산 분자
KR20220160053A (ko) 다발성 골수종에서의 면역요법 표적 및 그의 식별 방법
CN111630184A (zh) 用于确定恶性疾病对免疫治疗的反应的方法
KR20190126812A (ko) 질환 진단용 바이오마커
US20220265798A1 (en) Cancer vaccine compositions and methods for using same to prevent and/or treat cancer
KR20220118096A (ko) 항암제에 대한 내성 진단용 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination