CN113429486A

CN113429486A - 基因修饰非人动物的构建方法及应用

Info

Publication number: CN113429486A
Application number: CN202110679947.XA
Authority: CN
Inventors: 沈月雷; 姚佳维; 郭雅南; 白阳; 尚诚彰
Original assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Current assignee: Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd; Beijing Biocytogen Co Ltd
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2021-06-18
Publication date: 2021-09-24
Also published as: US20230227531A1; WO2021254491A1

Abstract

本发明提供了一种体内包含B2M和FcRn的嵌合基因的免疫缺陷非人动物的构建方法，利用基因编辑的方式将编码非人动物B2M蛋白的核苷酸序列导入免疫缺陷非人动物FcRn基因座，从而构建出包含B2M和FcRn的嵌合基因的非人动物，该动物体内能正常表达包含B2M和FcRn的蛋白复合物，可以作为FcRn信号机理研究、免疫系统研究、免疫相关新药研发具有重要的应用价值。

Description

基因修饰非人动物的构建方法及应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种基因修饰的免疫缺陷非人动物，其表达一种B2M和FcRn蛋白复合物动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

背景技术

β微球蛋白(beta-2-microglobulin)，又称B2M蛋白，是由淋巴细胞、血小板、多形核白细胞产生的一种小分子球蛋白，存在于除血红细胞外所有的有核细胞中，是FcRn维持人体血清中免疫球蛋白IgG稳态水平必不可少的组成部分。FcRn是由α链和β链(B2M)组成异源二聚体，其在酸性条件下(pH<6.5)会与IgG的Fc区结合，在中性或碱性条件(pH≥7.0)下与IgG解离，这种依赖于pH的结合特性使FcRn能够与酸性内小体内嵌的IgG结合，并将其运回细胞表面，在生理pH条件下释放到细胞表面。这种FcRn介导的循环途径有助于延长IgG的半衰期，并维持其在循环中的稳态。FcRn的α链必须和B2M蛋白装配后才能发挥对于IgG的转运功能。

除了参与FcRn对于IgG的胞转功能外，B2M还是MHCⅠ类分子中的重要一员，通过与MHC I类分子的α链非共价结合，附着于保守的免疫球蛋白样区域。B2M虽然不直接参与MHCI类分子在免疫应答、免疫调节等过程中的抗原呈递，但它能促进内质网中新合成的MHC I类分子向细胞表面运输，并对MHC I类分子的结构稳定和在细胞表面的表达具有不可或缺的作用。研究表明，B2M缺失的情况下，在细胞表面几乎检测不到MHC I类分子的表达。因此，可以通过敲除B2M基因达到敲除MHC I类分子的目的。

实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。其中，免疫缺陷动物由于缺乏免疫力，容易接受异种细胞或组织，在组织或细胞人源化动物研究、肿瘤药物及其他疾病的治疗机理方面已经得到广泛应用。例如可以通过在免疫缺陷小鼠体内注射人外周血单核细胞(hPBMC)重建人的免疫系统，用于免疫系统发育研究、疫苗或肿瘤药物筛选等多项用途。但由于hPBMC的T细胞受体会非特异性识别小鼠的MHC，导致人T细胞(尤其是CD8+T细胞)在小鼠体内大量增殖，分泌大量的细胞因子，最终引起移植物抗宿主反应(GvHD)，5-6周内小鼠体重下降并死亡，留给研发人员的实验窗口期非常有限。而且，如果在这种免疫重建的小鼠体内接入肿瘤，由于大量活化T细胞和细胞因子的存在，将使肿瘤免疫药效试验的结果非常复杂，稳定性很差，虽然可以做一些定性试验，但很难精确比较不同抗体的药效和安全性。

为了克服上述现有实验动物模型存在的不足，兼顾B2M蛋白在免疫球蛋白胞转作用中的功能和避免异种移植物引起的GvHD，解决临床转化方面的需求，本发明旨在提供一种B2M基因敲除，但表达嵌合在FcRn基因中的B2M蛋白的免疫缺陷小鼠模型，为肿瘤、移植排斥、病原感染等发病机理、预防及防治药物筛选等提供稳定、高效的临床前实验动物模型。

发明内容

本发明的第一方面，提供了一种FcRn蛋白复合物，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M蛋白和FcRn蛋白。

其中，所述的B2M蛋白可以为B2M蛋白的全部或可以发挥B2M蛋白功能的某一部分或某几部分的组合。

其中，所述的FcRn蛋白可以为FcRn蛋白的全部或可以发挥FcRn蛋白功能的某一部分或某几部分的组合。

优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的信号肽、胞质区、跨膜区和/或胞外区。

进一步优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的胞质区、跨膜区和/或胞外区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的信号肽、胞质区、跨膜区和胞外区，以及B2M蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的胞质区、跨膜区和胞外区，以及B2M蛋白。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为FcRn蛋白的信号肽、B2M蛋白、FcRn蛋白的胞外区、FcRn蛋白的跨膜区和FcRn蛋白的胞质区，优选不包含B2M蛋白信号肽。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为B2M蛋白、FcRn蛋白的胞外区、FcRn蛋白的跨膜区和FcRn蛋白的胞质区，优选不包含B2M蛋白信号肽。

优选的，B2M蛋白和FcRn蛋白的氨基酸序列之间直接或间接连接。更优选为间接连接。进一步优选采用柔性linker连接。更进一步优选柔性linker连接B2M蛋白与FcRn蛋白的胞外区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为FcRn蛋白的信号肽、B2M蛋白、柔性linker、FcRn蛋白的胞外区、FcRn蛋白的跨膜区和FcRn蛋白的胞质区，优选不含B2M蛋白信号肽。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为B2M蛋白、柔性linker、FcRn蛋白的胞外区、FcRn蛋白的跨膜区和FcRn蛋白的胞质区，优选不含B2M蛋白信号肽。

优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M基因的1号至3号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M基因的1号至3号外显子中的任一个、两个或三个外显子编码的氨基酸序列。更进一步优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分编码的氨基酸序列，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、70、100、110、118bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含7bp的核苷酸序列；1号外显子的部分不含编码信号肽的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、29bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含11bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。

优选的，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn基因的2号至7号外显子编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分编码的氨基酸序列，以及FcRn基因的2号至7号外显子编码的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列按照N端至C端的排列顺序为FcRn基因2号外显子编码的信号肽序列、B2M基因的1号至3号外显子编码的氨基酸序列、FcRn基因2号外显子至7号外显子编码的胞外区、跨膜区和胞质区，优选不含B2M信号肽。

优选的，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白分别独立来源于人或非人动物。

优选的，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白可以来源于相同物种。

优选的，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白可以均为内源或均为外源。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白均来源于人。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白均来源于非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白均为非人动物内源蛋白。

优选的，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白可以来源于不同物种。

优选的，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白可以分别来源于内源或外源。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M蛋白来源于人，所述的FcRn蛋白来源于非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M蛋白来源于非人动物，所述的FcRn蛋白来源于人。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M蛋白为内源，FcRn蛋白可以为外源的人或非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn蛋白为内源，B2M蛋白可以为外源的人或非人动物。

优选的，所述的FcRn蛋白复合物表达在非人动物中。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因修饰的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物背景是免疫缺陷的。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。

优选的，所述的非人动物体内MHC I类分子不表达、几乎不表达、功能下降或功能缺失。进一步优选的，所述的非人动物体内B2M蛋白表达降低或缺失。其中，表达降低或缺失的B2M蛋白为非人动物体内原始表达的B2M蛋白，并不是FcRn蛋白复合物中所述的B2M蛋白。

优选的，所述的非人动物CD132蛋白表达降低或缺失。

进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID、B-NDG小鼠或者裸鼠。

优选的，所述FcRn蛋白复合物包含的B2M蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：40所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：40所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

d)与SEQ ID NO：40所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述FcRn蛋白复合物包含的FcRn蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：41所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：41所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

d)与SEQ ID NO：41所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述FcRn蛋白复合物包含的信号肽的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：42所示氨基酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：42所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

d)与SEQ ID NO：42所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述FcRn蛋白复合物包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的全部或部分；

b)与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

d)与SEQ ID NO：6所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种嵌合基因，所述的嵌合基因包含B2M基因和FcRn基因。

其中，所述的B2M基因为编码B2M蛋白的全部或部分核苷酸序列。所述的部分可以为编码B2M蛋白的一段氨基酸或几段氨基酸的组合。

其中，所述的FcRn基因为编码FcRn蛋白的全部或部分核苷酸序列。所述的部分可以为编码FcRn蛋白的一段氨基酸或几段氨基酸的组合。

优选的，所述的嵌合基因包含B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的嵌合基因包含B2M基因的1号至3号外显子中的任一个、两个或三个外显子。更进一步优选的，所述的嵌合基因包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、70、100、110、118bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含7bp的核苷酸序列；1号外显子的部分不含编码信号肽的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、29bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含11bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因包含B2M基因的CDS序列，优选不含编码信号肽的CDS序列。

优选的，所述的嵌合基因包含FcRn的1号至7号外显子。

优选的，所述的嵌合基因包含编码B2M蛋白的核苷酸序列，优选不含编码B2M蛋白信号肽的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的嵌合基因包含编码FcRn蛋白信号肽、胞外区、跨膜区和胞质区的核苷酸序列。

进一步优选的，所述的嵌合基因包含编码FcRn蛋白胞外区、跨膜区和胞质区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因包含FcRn的1号至7号外显子，以及B2M基因的1号至3号外显子的核苷酸序列，优选不含编码B2M信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因的核苷酸序列按照从5’至3’的排列顺序为FcRn基因的1号至2号外显子编码信号肽的核苷酸序列、B2M基因的1号至3号外显子的核苷酸序列、FcRn基因的2号至7号外显子编码胞外区、跨膜区和胞质区的核苷酸序列，优选不含编码B2M信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因的核苷酸序列按照从5’至3’的排列顺序为B2M基因的1号至3号外显子的核苷酸序列、FcRn基因的2号至7号外显子编码胞外区、跨膜区和胞质区的核苷酸序列，优选不含编码B2M信号肽的核苷酸序列。

优选的，B2M基因与FcRn基因的核苷酸序列之间直接或间接连接。更优选为间接连接。进一步优选采用编码柔性linker的核苷酸序列连接。更进一步优选编码柔性linker的核苷酸序列连接B2M基因与FcRn基因的2号外显子之间。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因的核苷酸序列按照从5’至3’的排列顺序为FcRn基因的1号至2号外显子编码信号肽的核苷酸序列、B2M基因的1号至3号外显子的核苷酸序列、编码柔性linker的核苷酸序列、FcRn基因的2号至7号外显子的核苷酸序列，优选不含编码B2M信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因的核苷酸序列按照从5’至3’的排列顺序为B2M基因的1号至3号外显子的核苷酸序列、编码柔性linker的核苷酸序列、FcRn基因的2号至7号外显子的核苷酸序列，优选不含编码B2M信号肽的核苷酸序列。

优选的，所述的嵌合基因编码上述的FcRn蛋白复合物。

优选的，所述的B2M基因与FcRn基因分别独立来源于人或非人动物。

优选的，所述的B2M基因与FcRn基因可以来源于相同物种。

优选的，所述的B2M基因与FcRn基因可以均为内源或均为外源。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M基因与FcRn基因均来源于人。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M基因与FcRn基因均来源于非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M基因与FcRn基因均为非人动物内源基因。

优选的，所述的B2M基因与FcRn基因可以来源于不同物种。

优选的，所述的B2M基因与FcRn基因可以分别来源于内源或外源。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M基因来源于人，所述的FcRn基因来源于非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M基因来源于非人动物，所述的FcRn基因来源于人。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的B2M基因为内源，FcRn基因可以为外源的人或非人动物。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的FcRn基因为内源，B2M基因可以为外源的人或非人动物。

优选的，所述的嵌合基因包含的B2M的核苷酸序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的嵌合基因包含的FcRn转录的mRNA的核苷酸序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：43所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：43所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)与SEQ ID NO：43所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的嵌合基因包含的FcRn转录的核苷酸序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：44所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：44所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)与SEQ ID NO：44所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因的DNA序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：45所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：45所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)与SEQ ID NO：45所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的嵌合基因转录的mRNA序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)与SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的嵌合基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规诱导或阻遏的物质。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

本发明的第三方面，提供了一种上述的嵌合基因编码的FcRn蛋白复合物。

本发明的第四方面，提供了一种FcRn基因的靶向载体，所述的靶向载体包含B2M基因。

优选的，所述的靶向载体包含B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至3号外显子的核苷酸序列，进一步优选不含编码信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，包含B2M基因的CDS序列，进一步优选不含编码B2M信号肽的CDS序列。

在本发明的一个具体实施方式中，包含与SEQ ID NO：9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9所述核苷酸序列一致。

优选的，所述的靶向载体还包含编码柔性linker的核苷酸序列。进一步优选的，所述的编码柔性linker的核苷酸序列与SEQ ID NO：10具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或与SEQ ID NO：10所述核苷酸序列一致。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物FcRn基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：7至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：7所示。和/或，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物FcRn基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：8至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：8所示。

优选的，所述靶向载体的待改变的转换区位于非人动物FcRn基因座上。进一步优选的，位于非人动物FcRn基因的1号至7号外显子上。更进一步优选的，位于非人动物FcRn基因的1号至3号外显子上。再进一步优选的，位于非人动物FcRn基因的2号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述靶向载体的待改变的转换区位于非人动物FcRn基因的2号外显子编码信号肽的核苷酸序列与编码胞外区的核苷酸序列之间。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID、B-NDG小鼠或者裸鼠。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别连接在抗性基因的两侧。

本发明的第五方面，提供了一种sgRNA，所述的sgRNA靶向非人动物FcRn基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的FcRn基因上的靶序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于FcRn基因的1号至7号外显子序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于FcRn基因的1号至3号外显子序列上。

优选的，所述sgRNA的靶位点位于FcRn基因的2号外显子序列和第2-3内含子上。

优选的，所述靶序列如SEQ ID NO：11-18任一所示。进一步优选的，所述的靶序列如SEQ ID NO：16所示。

本发明的第六方面，提供了一种编码上述sgRNA的DNA分子。

优选的，所述的DNA分子的双链为sgRNA的上下游序列，或者加入酶切位点后的正向寡核苷酸序列或反向寡核苷酸序列。

进一步优选的，所述的DNA分子的双链序列分别如SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：22，或SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：23所示。

本发明的第七方面，提供了一种包含上述sgRNA的sgRNA载体。

本发明的第八方面，提供了一种构建所述sgRNA载体的方法，包括如下步骤：

(1)将序列如SEQ ID NO：11-18所示的任一项sgRNA靶序列，制备获得正向寡核苷酸序列和反向寡核苷酸序列；

优选的，所述sgRNA序列如SEQ ID NO：16所示，获得的正向寡核苷酸序列如SEQ IDNO：21所示；反向寡核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示；

(2)合成含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA，其中含有T7启动子及sgRNAscaffold的片段DNA如SEQ ID NO：24所示，将上述片段通过EcoRI和BamHI酶切连接至骨架载体上，经测序验证，获得pT7-sgRNA载体；

(3)分别合成步骤(1)中所述的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，优选为A组和B组中的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgRNA寡聚核苷酸变性、退火，形成可以连入步骤(2)所述的pT7-sgRNA载体的双链；

(4)将步骤(3)中退火的双链sgRNA寡聚核苷酸分别与pT7-sgRNA载体进行链接，筛选获得sgRNA载体。

本发明的第九方面，提供了一种包含上述靶向载体、sgRNA、DNA分子和/或sgRNA载体的细胞。

本发明的第十方面，提供了上述靶向载体、上述sgRNA、DNA分子、sgRNA载体和/或细胞在FcRn基因修饰中的应用。

优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第十一方面，提供了一种基因修饰的非人动物，所述的非人动物表达上述的FcRn蛋白复合物。

优选的，所述的非人动物体内FcRn基因座包含B2M基因。进一步优选的，所述的非人动物体内包含上述的嵌合基因。

优选的，所述非人动物体内B2M基因、FcRn基因或嵌合基因均由非人动物FcRn基因内源调控元件调控。

优选的，所述的B2M基因或嵌合基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。更优选的，所述的B2M基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物FcRn基因的内源调控元件。

优选的，所述的B2M基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物FcRn基因的编码信号肽的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物无法表达MHC I类分子。

优选的，所述的非人动物体内缺失B2M基因的全部或部分。更优选的，缺失B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分。其中，缺失的B2M基因为野生型非人动物原始存在的B2M基因，并不是基因修饰的非人动物体内FcRn基因座包含的B2M基因。

优选的，所述的非人动物缺失CD132基因的全部或部分。更优选的，缺失CD132基因的1号至2号外显子的全部或部分。进一步优选的，还可以缺失3号外显子至8号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，缺失CD132基因的1号外显子至8号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，小鼠B2M基因的mRNA序列如SEQ ID NO：1所示。

在本发明的一个具体实施方式中，小鼠B2M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在本发明的一个具体实施方式中，小鼠FcRn基因的mRNA序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明的一个具体实施方式中，小鼠FcRn蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的第十二方面，提供了一种上述非人动物的构建方法，所述的非人动物表达上述的FcRn蛋白复合物或包含上述的嵌合基因。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码B2M蛋白的核苷酸序列导入非人动物FcRn基因座。进一步优选的，包括用包含编码B2M蛋白的核苷酸序列导入非人动物FcRn基因座，优选不含编码B2M蛋白信号肽的核苷酸序列。更进一步优选的，包括用包含与编码SEQID NO：40具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者编码SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的核苷酸序列导入非人动物FcRn基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含B2M基因的核苷酸序列导入非人动物FcRn基因座。进一步优选的，包括用包含B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物FcRn基因座。更进一步优选的，包括用包含B2M基因的1号至3号外显子中的任一个、两个或三个外显子导入非人动物FcRn基因座。再进一步优选的，包括用包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分导入非人动物FcRn基因座，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，例如至少包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、70、100、110、118bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含7bp的核苷酸序列；1号外显子的部分不含编码信号肽的1号外显子的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列，例如至少包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、29bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含11bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码区的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，包括用包含B2M基因的CDS序列导入非人动物FcRn基因座，优选插入的序列不含编码B2M信号肽的核苷酸。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括用包含与SEQ ID NO：9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者SEQID NO：9所示核苷酸序列导入非人动物FcRn基因座。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换，所述的导入优选为插入。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码FcRn蛋白复合物的核苷酸序列替换至非人动物FcRn基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含嵌合基因的核苷酸序列替换至非人动物FcRn基因座。

优选的，所述插入的位点位于FcRn基因内源调控元件后。进一步优选位于FcRn基因起始密码子后。更进一步优选位于2号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，位于编码信号肽的核苷酸序列与编码胞外区的核苷酸序列之间。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码FcRn蛋白复合物的核苷酸序列替换至非人动物B2M基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含嵌合基因的核苷酸序列替换至非人动物B2M基因座。

优选的，所述的构建方法包括利用转基因技术将包含嵌合基因的核苷酸序列转入非人动物基因组中，同时敲除内源B2M基因和/或FcRn基因。

优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。

优选的，所述的非人动物的基因组中至少一个染色体上包含嵌合基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达FcRn蛋白复合物。

优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。

进一步优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含B2M基因。优选包含B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分。进一步优选包含1号至3号外显子的核苷酸序列，优选不含编码信号肽的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含B2M基因的CDS序列，其中，不含编码信号肽的CDS序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO：9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9所述核苷酸序列一致。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂(或5’臂同源)，其选自非人动物FcRn基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：7至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：7所示。和/或，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂(或3’同源臂)，其选自非人动物FcRn基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：8至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：8所示。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得基因修饰的非人动物。

优选的，为提高重组效率，还可以使用靶向FcRn基因的sgRNA与上述靶向载体一起进行非人动物的构建。其中，所述的sgRNA靶向非人动物FcRn基因，同时所述sgRNA的序列在待改变的FcRn基因上的靶序列上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体、靶向FcRn基因的sgRNA及Cas9导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为受精卵)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得FcRn基因修饰的非人动物。

优选的，所述的非人动物体内MHC I类分子不表达、几乎不表达、功能下降或功能缺失，进一步优选的，所述的非人动物体内缺失B2M基因的全部或部分。进一步优选的，缺失B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分。其中，缺失的B2M基因为野生型非人动物原始存在的B2M基因，并不是基因修饰的非人动物体内FcRn基因座包含的B2M基因。

优选的，所述的非人动物缺失CD132基因的全部或部分。进一步优选的，缺失CD132基因的1号至2号外显子的全部或部分。更进一步优选的，还可以缺失3号外显子至8号外显子的全部或部分。

优选的，所述非人动物内源B2M基因座不编码内源性B2M蛋白或编码的B2M蛋白没有功能。

优选的，所述非人动物体内的FcRn蛋白复合物在酸性pH(例如pH≤6.5)下与免疫球蛋白G(IgG)结合。

优选的，所述IgG是人IgG或内源性IgG。

优选的，所述的非人动物IgG的PK结果符合药代动力学特征。

本发明的第十三方面，提供了一种多基因修饰的非人动物，所述的非人动物为上述的非人动物或上述的构建方法获得的非人动物，且所述的非人动物的基因组中包含基因CSF1、CSF2、IL3、IL15、THPO或SIRPA中的一种或两种以上的组合的修饰。

本发明的第十四方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

(一)提供上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物；

(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因CSF1、CSF2、IL3、IL15、THPO或SIRPA中一种或两种以上的组合修饰的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因修饰非人动物、三基因修饰非人动物、四基因修饰非人动物、五基因修饰非人动物、六基因修饰非人动物、七基因修饰非人动物、八基因修饰非人动物或九基因修饰非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

本发明的第十五方面，提供了一种FcRn基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失FcRn基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物缺失FcRn基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的非人动物缺失FcRn基因的1号至3号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物缺失FcRn基因的2号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，采用上述sgRNA构建FcRn基因缺失的非人动物。

本发明的第十六方面，提供了一种动物模型，所述的动物模型来源于上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第十七方面，提供了一种动物模型的构建方法，所述的构建方法包括制备上述的非人动物或者上述的构建方法获得的非人动物的步骤。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第十八方面，提供了一种上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物在制备动物模型中的应用。优选的，所述的动物模型为荷瘤或炎症动物模型。

本发明的第十九方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。

本发明的第二十方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。

本发明的第二十一方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。

本发明的第二十二方面，提供了一种基因修饰的细胞，所述的细胞表达上述的FcRn蛋白复合物。

优选的，所述的细胞的基因组中包含上述的嵌合基因。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十三方面，提供了一种FcRn基因缺失的细胞，所述的细胞缺失FcRn基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的细胞缺失FcRn基因的1号至7号外显子的全部或部分。进一步优选的，所述的细胞缺失FcRn基因的1号至3号外显子的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的细胞缺失FcRn基因的2号外显子。

在本发明的一个具体实施方式中，采用上述sgRNA构建FcRn基因缺失的细胞。

优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十四方面，提供了一种表达上述的FcRn蛋白复合物的构建体。优选的，所述的构建体包含上述的嵌合基因。

本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十六方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。

本发明的第二十七方面，提供了来源于上述的FcRn蛋白复合物、上述的嵌合基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的动物模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究FcRn通路功能、人FcRn通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

优选的，所述应用包括使用人PBMC或人HSC进行免疫系统重建后，人单抗、双抗或联合用药的药效评价、药物筛选，或人CAR-T体内评估或筛选。

优选的，所述的用途为人造血干细胞的形成、功能研究和/或构建疾病模型。

优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。

本发明的第二十八方面，提供了一种人用药剂筛选或评价的方法，所述的方法包括将人肿瘤细胞移入已经人PBMC或人HSC免疫重建的个体体内，向移入人肿瘤细胞的个体施加候选药剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型。

优选的，所述的候选药剂选自CAR-T、药物。进一步优选的，所述的药物为抗体。

优选的，所述的候选药剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第二十九方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的动物模型。

优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第三十方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备免疫系统重建动物模型中的应用。

本发明的第三十一方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备人抗体中的用途。

本发明的第三十二方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的动物模型在制备治疗肿瘤或免疫相关疾病的药物中的用途。

本发明构建的基因修饰的非人动物，其免疫缺陷程度更高，解决了传统免疫缺陷动物胞吞功能受损的缺陷，且其PK结果符合药代动力学特征。同时，经过人hPBMC免疫系统重建后存活期达到了100％，可为后续的药物筛选和评价提供更长的实验窗口期。

本发明提供了一种非人动物，优选为小鼠，其体内可表达有功能的B2M和/或FcRn，小鼠体内FcRn介导的细胞内转运途径正常，并且其体内不表达或几乎不表达MHC I类分子。小鼠表达的有功能的B2M无法结合MHC I类分子的α链形成的MHC I类分子。同时，本申请制备非人动物表达的B2M与FCRN结合成二聚体，能跟IgG结合确保其转运，在抗体药物研发过程中，抗体不会被很快清除掉。而且MHC I类分子的缺失，小鼠的GVHD会降低，窗口期变长。

优选的，所述的非人动物表达的B2M蛋白与FcRn蛋白分别独立来源于人或非人动物。

优选的，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白可以来源于相同物种。

优选的，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白可以均为内源或均为外源。

优选的，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白可以来源于不同物种。

本发明的第三十三方面，提供了一种基因修饰的非人动物，所述的非人动物体内表达具有功能的B2M蛋白和FcRn蛋白。

优选的，所述的非人动物无法表达MHC I类分子。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、皮炎、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、脑癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、食道癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为宫颈癌、食道癌、肾癌、脑癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌。

本发明所述的“x号至xx号外显子”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，即x号外显子、x-xx号内含子和xx号外显子。例如1号至2号外显子包含1号外显子、1-2号内含子和2号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x号至xx号内含子”代表x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“1-2号内含子”表示1号外显子与2号外显子之间的内含子。

本发明所述的“和/或”涵盖由该术语连接的项目的所有组合，应视作各个组合已经单独地在本文列出。例如，“A和/或B”涵盖了“A”、“A和B”以及“B”。又例如，“A、B和/或C”涵盖“A”、“B”、“C”、“A和B”、“A和C”、“B和C”以及“A和B和C”。

本发明所述的“包含”一词在本文中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“FcRn基因座”表示FcRn基因1号至7号外显子上的任选一段的DNA片段、任选一个DNA或者任选2个DNA之间的位置。在本发明的一个具体实施方式中，被插入的FcRn基因座可以是FcRn基因2号外显子上的任选一段的DNA片段、任选一个DNA或者任选2个DNA之间的位置。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，Fritschand Maniatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。优选的，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠及NOD、NOD/SCID、B-NDG、NOD-Prkdc^scidIL-2rg^null背景的小鼠。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠B2M基因座和FcRn基因座示意图(非按比例)；

图2：嵌合FcRn基因座示意图(非按比例)；

图3：FcRn基因座打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图4：sgRNA1-sgRNA8活性检测结果，其中，Con为阴性对照，PC为阳性对照；

图5：BNDG-B2M/FcRn小鼠鼠尾PCR鉴定结果(F0)，其中，WT为野生型，PC为阳性对照，H₂O为水对照，F0-01、F0-02、F0-03、F0-04、F0-05、F0-06、F0-07、F0-08为小鼠编号；

图6：F1代BNDG-B2M/FcRn小鼠示例性PCR检测结果，其中，M为Marker，H₂O为水对照，WT为野生型对照，PC1、PC2为阳性对照，F1-01、F1-02、F1-03、F1-04为阳性小鼠编号；

图7：F1代BNDG-B2M/FcRn小鼠示例性Southern检测结果，其中，WT为野生型对照，F1-01、F1-02、F1-03、F1-04为阳性小鼠编号；

图8：流式细胞检测BNDG-B2M/FcRn小鼠、B-NDG小鼠、NOD SCID小鼠和野生型C57BL/6小鼠的脾脏和血液样本中T细胞、B细胞和NK细胞的缺失结果；

图9：流式细胞检测小鼠脾脏、血液和骨髓样本中巨噬细胞结果；

图10：流式细胞检测小鼠脾脏、血液和骨髓样本中DC细胞和单核细胞结果；

图11：流式细胞检测小鼠脾脏、血液和骨髓样本中MHC I类分子的结果；

图12：小鼠脾脏组织H&E染色结果；

图13：hIgG血药浓度-时间曲线；

图14：hPBMC免疫重建后小鼠体内白细胞(CD45+)检测结果；

图15：hPBMC免疫重建后小鼠体内T细胞(CD3+)检测结果；

图16：hPBMC免疫重建后小鼠体重情况；

图17：hPBMC免疫重建后小鼠生存率；

图18：人结肠癌细胞RKO植入BNDG-B2M/FcRn免疫重建小鼠体内，并利用抗人PD-1抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠体重情况；

图19：人结肠癌细胞RKO植入BNDG-B2M/FcRn免疫重建小鼠体内，并利用抗人PD-1抗体进行抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠肿瘤体积测量结果；

图20：BNDG-B2M/FcRn免疫重建小鼠CAR-T抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠肿瘤体积测量结果；

图21：BNDG-B2M/FcRn免疫重建小鼠CAR-T抗肿瘤药效试验，图为实验周期内小鼠体重情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

B-NDG小鼠来源于百奥赛图，货号110586；

BNDG-B2M-KO小鼠来源于百奥赛图，货号110589；

C57BL/6小鼠购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；

NODSCID小鼠购自北京华阜康生物科技股份有限公司；

流式细胞仪厂家Invitrogen，型号Attune NxT；

Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit(DMSO)购自Biolegend，货号423106；

UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号BCG-DX-001；

Ambion体外转录试剂盒购自Ambion，货号AM1354；

Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；

Purified anti-mouse CD16/32购自Biolegend，货号101302；

APC/Cy7 anti-mouse CD45购自Biolegend，货号103116；

Brilliant Violet 510^TM anti-human CD45购自Biolegend，货号304036；

PerCP anti-human CD3购自Biolegend，货号300428；

Brilliant Violet 421^TM anti-human CD4购自Biolegend，货号300532；

PE anti-human CD8a购自Biolegend，货号300908；

FITC mouse anti-human CD56购自BD Pharmingen，货号562794；

APC anti-human CD25购自Biolegend，货号302610；

Brilliant Violet 711^TM anti-human CD19购自Biolegend，货号302246；

Human TruStrain FcX购自Biolegend，货号422302；

PE/Cy7 anti-human CD69购自Biolegend，货号310912；

PerCP/Cy5.5 anti-mouse TCRβchain(mTCR-β)购自Biolegend，货号109228；

Brilliant Violet 605^TM anti-mouse CD19(mCD19)购自Biolegend，货号115540；

PE anti-mouse CD335(NKp46)(mNKp46)购自Biolegend，货号102812；

FITC anti-mouse F4/80(mF4-80+)购自Biolegend，货号123108；

Brilliant Violet 605^TManti-mouse/human CD11b购自Biolegend，货号101257；

PE/Cy^TM7anti-mouse CD11c(mCD11c)购自eBioscience，货号25011481；

APC anti-mouse Ly-6C(mLy6C)购自购自Biolegend，货号128016；

Brilliant Violet 421^TM anti-mouse I-A/I-E购自Biolegend，货号107632；

PE anti-mouse H-2Kd(mH-2kd-PE)购自Biolegend，货号116607；

AffiniPure Goat Anti-Human IgG(H+L)购自Jackson，货号109-005-088；

Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab’)2Fragment Goat Anti-HumanIgGFc购自Jackson，货号109-036-098；

NcoI、NdeI、BbsI酶购自NEB，货号分别为R0193M、R0111S、R0539S。

实施例1 FcRn和B2M嵌合免疫缺陷小鼠的制备

小鼠B2M基因(NCBI Gene ID：12010，Primary source：MGI:88127，UniProt ID：P01887，基于NM_009735.3→NP_033865.2的转录本，其mRNA序列如SEQ ID NO：1所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示)和FcRn基因(NCBI Gene ID：14132，Primary source：MGI：103017，UniProt ID：Q61559，基于NM_010189.3→NP_034319.2的转录本，其mRNA序列如SEQID NO：3所示，对应的蛋白序列如SEQ ID NO：4所示)基因座示意图如图1所示。

为实现本发明的目的，可用基因编辑技术对小鼠细胞进行修饰，在其FcRn基因座敲进编码小鼠B2M蛋白的核苷酸序列，期望得到的基因修饰小鼠体内可表达B2M和FcRn蛋白复合物，最终得到的经改造的嵌合FcRn基因座的示意图如图2所示，嵌合基因的DNA序列如SEQ ID NO：45所示。嵌合基因转录的mRNA序列如SEQ ID NO：5所示，其中，嵌合基因中包含的FcRn基因转录的mRNA分别如SEQ ID NO：43(编码除信号肽之外的FcRn mRNA)和SEQ IDNO：44(编码FcRn信号肽的mRNA)所示，得到的FcRn蛋白复合物的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，其中，FcRn蛋白复合物中包含的B2M蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：40所示，FcRn蛋白复合物中包含的FcRn蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示，FcRn蛋白复合物中包含的信号肽的氨基酸序列SEQ ID NO：42所示。鉴于小鼠FcRn和B2M具有多种亚型或转录本，本文所述的方法可应用于其它亚型或转录本。

引入CRISPR/Cas系统进行基因编辑，进一步设计如图3所示的打靶策略示意图，图中显示了靶向载体上含有小鼠FcRn基因上游和下游的同源臂序列，以及包含编码小鼠B2M蛋白的序列片段(简称A片段)。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：7)与NCBI登录号为NC_000073.6的第45103007-45104486位核苷酸序列具有99％的同源性，区别在于第45103046位的“C”替换为“G”，第45103052位的“C”替换为“A”；下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：8)与NCBI登录号为NC_000073.6的第45101562-45103006位核苷酸序列相同；A片段中小鼠B2M序列(SEQ ID NO：9)与NCBI登录号为NM_009735.3的第112-408位核苷酸序列具有99％的同源性，区别仅在于第345bp处的“C”替换为“T”；柔性接头为45bp的核苷酸编码的常用融合蛋白柔性linker——(GGGGS)3，其序列为：5’-GGAGGTGGCGGATCCGGCGGAGGCGGCTCGGGTGGCGGCGGCTCT-3’(SEQ ID NO：10)。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接、直接合成等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体用于后续实验。

靶序列决定了sgRNA的靶向特异性和诱导Cas9切割目的基因的效率。因此，高效特异的靶序列选择和设计是构建sgRNA表达载体的前提。设计并合成识别靶位点的sgRNA序列，靶位点位于B-NDG小鼠(CD132基因1号至8号外显子缺失的NOD/SCID鼠)FcRn基因的2号外显子和第2-3内含子上，各sgRNA在FcRn上的靶位点序列如下：

sgRNA1靶位点序列(SEQ ID NO：11)：5’-CGGGTCACCCTGTCGGAATGGGG-3’

sgRNA2靶位点序列(SEQ ID NO：12)：5’-CCCATTCCGACAGGGTGACCCGG-3’

sgRNA3靶位点序列(SEQ ID NO：13)：5’-AGTGGCATCCCCATTCCGACAGG-3’

sgRNA4靶位点序列(SEQ ID NO：14)：5’-CCATGATGTCCTAGCCTTCATGG-3’

sgRNA5靶位点序列(SEQ ID NO：15)：5’-CTGAGCCCCAGGTCTGAGGCAGG-3’

sgRNA6靶位点序列(SEQ ID NO：16)：5’-GGAGGACCAACAAGAGGCTGAGG-3’

sgRNA7靶位点序列(SEQ ID NO：17)：5’-GAGTGTGTCAGGAAGGGGACAGG-3’

sgRNA8靶位点序列(SEQ ID NO：18)：5’-TTACCTGAGCCCCAGGTCTGAGG-3’

利用UCA试剂盒检测多个sgRNA的活性，从结果可见sgRNA具有不同活性，检测结果见表1和图4。从中随机选择sgRNA6进行后续实验。在其5’端及互补链上分别加上酶切位点得到正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，序列见表2)，退火后将退火产物分别连接至pT7-sgRNA质粒(质粒先用BbsI线性化)，获得表达载体pT7-FcRn-6。

表1 UCA检测结果

Con.	1.00±0.08	PC	95.80±4.35
				sgRNA1	34.49±1.25	sgRNA5	2.25±0.32
sgRNA2	33.34±2.56	sgRNA6	46.32±4.61
				sgRNA3	——	sgRNA7	23.21±2.08
sgRNA4	1.88±0.10	sgRNA8	13.82±1.40

表2 sgRNA6序列列表

SEQ ID NO：20	上游：5’-GGAGGACCAACAAGAGGCTG-3’
		SEQ ID NO：21(正向寡核苷酸)	上游：5’-TAGGGGAGGACCAACAAGAGGCTG-3’
SEQ ID NO：22	下游：5’-CAGCCTCTTGTTGGTCCTCC-3’
		SEQ ID NO：23(反向寡核苷酸)	下游：5’-AAACCAGCCTCTTGTTGGTCCTCC-3’

pT7-sgRNA载体由质粒合成公司合成含有T7启动子及sgRNA scaffold的片段DNA(SEQ ID NO：24)并依次通过酶切(EcoRI及BamHI)连接至骨架载体(来源Takara，货号3299)上，经专业测序公司测序验证，结果表明获得了目的质粒。

取BNDG-B2M-KO小鼠(该小鼠体内内源B2M基因敲除)的原核期受精卵，利用显微注射仪将pT7-FcRn-6质粒的体外转录产物(使用Ambion体外转录试剂盒，按照说明书方法进行转录)、靶向载体与Cas9 mRNA预混好后注射至小鼠受精卵细胞质或细胞核中。按照《小鼠胚胎操作实验手册(第三版)》(安德拉斯·纳吉，化学工业出版社，2006)中的方法进行受精卵的显微注射，注射后的受精卵转移至培养液中短暂培养，然后移植至受体母鼠的输卵管中发育，将获得的小鼠(F0代)通过杂交和自交，扩大种群数量，建立稳定的B2M和FcRn基因嵌合免疫缺陷小鼠品系(以下简称为BNDG-B2M/FcRn小鼠)。

可通过常规检测方法(如PCR分析)鉴定F0代小鼠体细胞的基因型，部分F0代小鼠的鉴定结果见图5，图5中编号为F0-01到F0-08的8只小鼠为阳性小鼠。F0代PCR分析包括表3所述引物。

表3 F0代PCR分析所用引物

其中，引物L-GT-F位置位于5’同源臂左侧，R-GT-R位于3’同源臂右侧，L-GT-R和R-GT-F均位于B2M插入序列上。

将F0鉴定为阳性的BNDG-B2M/FcRn小鼠与B-NDG-B2M-KO小鼠交配得到F1代小鼠。可使用同样的PCR方法对F1代小鼠进行基因型鉴定，示例性F1代小鼠基因型鉴定结果如图6所示，图中编号为F1-01、F1-02、F1-03、F1-04的4只小鼠为阳性小鼠。

F1代PCR分析包括表4所述引物。

表4 F1代PCR分析所用引物

其中，引物L-GT-F1、R-GT-R1分别位于FcRn基因5’同源臂左侧和3’同源臂右侧，Mut-F1位于B2M插入序列上，R-MSD-F、R-MSD-R和L-MSD-F分别位于B2M基因第2-3内含子序列、3-4内含子序列和1号外显子左侧。

对这4只F1代PCR鉴定为阳性的小鼠进行Southern blot检测，确认是否存在随机插入。剪取鼠尾提取基因组DNA，选用NcoI酶或NdeI酶消化基因组，转膜，杂交。5’探针和3’探针分别位于5’同源臂外侧及3’同源臂上(见表5)。

表5 具体探针及目的片段的长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				NcoI	3’探针(3’Probe)	7.7kb	3.6kb
NdeI	5’探针(5’Probe)	5.7kb	3.1kb

探针合成引物如下：

3’Probe-F(SEQ ID NO：19)：5’-GTTTGAGGAAGGATAATGGGTCTGG-3’

3’Probe-R(SEQ ID NO：37)：5’-CATCCACAGATTAGCAACGATTTCC-3’

5’Probe-F(SEQ ID NO：38)：5’-GCTAGCATCAGAAGATCAGGACTCA-3’

5’Probe-R(SEQ ID NO：39)：5’-TAGAAAGTCAACCACTCCTACCTGC-3’

Southern blot检测结果见图7。综合5’探针、3’探针的结果表明，4只小鼠均无随机插入，证实这4只小鼠为阳性杂合小鼠且不存在随机插入。这表明使用本方法能构建出可稳定传代，且无随机插入的内源B2M基因敲除、但具有嵌合到FcRn基因座的B2M基因的基因工程小鼠(以下简称为BNDG-B2M/FcRn小鼠)。

实施例2 BNDG-B2M/FcRn小鼠免疫分型检测

将F1代小鼠相互交配可得到F2代BNDG-B2M/FcRn纯合子小鼠，为确认F2代小鼠体内B细胞、T细胞、NK细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞、单核细胞(Monocytes)的分化与B-NDG小鼠是否一致，以及与其它免疫缺陷小鼠(例如NOD SCID)或野生型C57BL/6小鼠之间的差异，可通过流式细胞术等常规方法分析小鼠的免疫细胞亚群。具体来说，分别选取6周龄BNDG-B2M/FcRn纯合子小鼠、B-NDG小鼠、NOD SCID小鼠和野生型C57BL/6小鼠(雌性)各5只，执行安乐死后，分别收集每只小鼠的骨髓(BM)、脾脏(Spleen)和血液(Blood)样本并分解重悬为单细胞悬液备用。经封闭抗体Purified anti-mouse CD16/32和死活细胞鉴定试剂盒Zombie NIR^TM Fixable Viability Kit(DMSO)处理单细胞悬液后，分别用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45(mCD45)、鼠源T细胞表面抗体PerCP/Cy5.5anti-mouse TCRβchain(mTCR-β)、B细胞标记抗体Brilliant Violet 605^TM anti-mouseCD19(mCD19)、NK细胞标记抗体PE anti-mouse CD335(NKp46)(mNKp46)、巨噬细胞标记抗体FITC anti-mouse F4/80(mF4/80)、树突状细胞(DC)标记抗体Brilliant Violet605^TManti-mouse/human CD11b(mCD11b)和PE/Cy^TM7anti-mouse CD11c(mCD11c)、单核细胞标记抗体APC anti-mouse Ly-6C(mLy6c)、Brilliant Violet 421^TM anti-mouse I-A/I-E(mIA/IE)、小鼠MHC I类分子标记抗体PE anti-mouse H-2Kd(mH-2Kd)进行流式检测。

BNDG-B2M/FcRn小鼠、B-NDG小鼠、NOD SCID小鼠和野生型C57BL/6小鼠的脾脏和血液样本中T细胞(特征为mCD45+mCD19-mTCR-β+或mCD45+mNKp46-mTCR-β+)、B细胞(特征为mCD45+mCD19+mTCR-β-)和NK细胞(特征为mCD45+mNKp46+mTCR-β-)检测结果如图8及表6所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠的血液和脾脏样本中均检测出T细胞(图8M、图8N、图8O、图8P)、B细胞(图8M、图8O)和NK细胞(图8N、图8P)；在NOD SCID小鼠体内没有检测到T细胞(图8I、图8J、图8K、图8L)和B细胞(图8I、图8K)，但检测到了NK细胞(图8J、图8L)；在BNDG-B2M/FcRn小鼠和B-NDG小鼠体内均没有检测出T细胞(图8A-8H)、B细胞(图8A、图8C、图8E、图8G)和NK细胞(图8B、图8D、图8F、图8H)。可见，相较于B-NDG小鼠，BNDG-B2M/FcRn小鼠没有降低其免疫缺陷程度；但与NOD SCID小鼠相比，BNDG-B2M/FcRn小鼠和B-NDG小鼠免疫缺陷程度更高。

表6 各小鼠血液样本中T细胞、B细胞和NK细胞比例

BNDG-B2M/FcRn小鼠、B-NDG小鼠、NOD SCID小鼠和野生型C57BL/6小鼠的脾脏、血液和骨髓样本中巨噬细胞(特征为mCD45+mCD11b+mF4/80+)检测结果如图9所示。从图中可以看出，在BNDG-B2M/FcRn小鼠、B-NDG小鼠和NOD SCID小鼠的血液、脾脏和骨髓样本中均检测出较野生型C57BL/6小鼠更少量的巨噬细胞(图9A-9L)。其中，相较于NOD SCID小鼠，BNDG-B2M/FcRn小鼠和B-NDG小鼠缺失巨噬细胞更多，免疫缺陷程度更高。BNDG-B2M/FcRn小鼠、B-NDG小鼠、NOD SCID小鼠和野生型C57BL/6小鼠的脾脏、血液和骨髓样本中DC(特征为mCD45+mTCR-β-mCD11c+)和单核细胞(特征为mCD45+mCD11b+mLy6c+)检测结果如图10及表7所示。从图10及表7中可以看出，在BNDG-B2M/FcRn小鼠、B-NDG小鼠、NOD SCID小鼠和野生型C57BL/6小鼠的血液、脾脏和骨髓样本中均检测出DC细胞和单核细胞(图10A-10I)，且BNDG-B2M/FcRn小鼠和B-NDG小鼠免疫缺陷程度接近。

表7 各小鼠脾脏、血液和骨髓样本中DC和单核细胞检测结果

BNDG-B2M/FcRn小鼠、B-NDG小鼠和NOD SCID小鼠的脾脏、血液和骨髓样本中MHC I类分子(特征为mCD45+mCD11b+mF4/80+mH-2Kd+)的检测结果如图11所示。从图11中可以看出，在B-NDG小鼠和NOD SCID小鼠的血液、脾脏和骨髓样本中均检测出MHC I类分子(图11D-11I)，在BNDG-B2M/FcRn小鼠的血液、脾脏和骨髓样本中均未检测出MHC I类分子(图11A、图11B、图11C)。可见，BNDG-B2M/FcRn小鼠体内游离B2M蛋白的缺失阻碍了MHC I类分子的表达，达到了本发明的目的。

实施例3 BNDG-B2M/FcRn小鼠组织病理学切片

分别对6周龄C57BL/6野生型小鼠、NOD SCID小鼠、B-NDG小鼠和BNDG-B2M/FcRn小鼠的脾脏组织进行石蜡包埋、制片和H&E染色，镜下观察各小鼠脾脏的基本组织学形态。

小鼠脾脏组织H&E染色结果如图12所示，从图中可以看出，C57BL/6野生型小鼠的脾脏结构正常，滤泡界限清晰(图12A)，胸腺叶结构也正常，皮质界限清晰(图12E)；NODSCID小鼠的脾脏表现出白髓发育不全(图12B)，胸腺叶发育不良，缺乏明确的皮层(图12F)；B-NDG和BNDG-B2M/FcRn小鼠的脾脏中滤泡结构完全丧失(图12C、图12D)；B-NDG小鼠胸腺叶发育不良，缺乏明确的皮质(图12G)；BNDG-B2M/FcRn小鼠在正常解剖位置未显示出胸腺叶(图12H)。

实施例4 BNDG-B2M/FcRn小鼠药代动力学(PK)实验

本实施例采用双抗夹心ELISA方法检测人免疫球蛋白(hIgG)在B-NDG小鼠、BNDG-B2M-KO小鼠、BNDG-B2M/FcRn小鼠和C57BL/6野生型小鼠的PK行为。

具体来说，分别选取6周龄BNDG-B2M/FcRn纯合子小鼠、BNDG-B2M-KO小鼠、B-NDG小鼠和C57BL/6野生型小鼠各5只，实验前禁食不禁水饲养12h，之后用10mg/kg的hIgG经尾静脉注射(i.v.)处理，并按照给药前3d、给药后15min、6h、24h、48h、96h、144h、192h、288h、384h的时间点对每只小鼠进行眼眶静脉窦采血60μL，离心取血清，冻存备用。具体分组及给药方案如表8所示。

表8 PK实验具体分组及给药方案

组别

动物

数量

药物

剂量(mg/kg)

给药方式

给药频率及次数

G1

B-NDG

5

hIgG

10

i.v.

单次给药

G2

BNDG-B2M-KO

5

hIgG

10

i.v.

单次给药

G3

BNDG-B2M/FcRn

5

hIgG

10

i.v.

单次给药

G4

C57BL/6

5

hIgG

10

i.v.

单次给药

双抗夹心ELISA方法检测各血清样本中的hIgG浓度，采用亲和纯化山羊抗人IgG捕获抗体AffiniPure Goat Anti-Human IgG(H+L)包被96孔ELISA板，用PBS洗涤液除去多余捕获抗体后加入血清样本，之后用辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体Peroxidase-conjugated AffiniPure F(ab’)2Fragment Goat Anti-HumanIgG Fc结合显色剂进行检测，并根据检测数据绘制血药浓度-时间曲线。4个组别中各时间点小鼠血清中hIgG浓度随时间变化曲线如图13所示。从图中可以看出，BNDG-B2M/FcRn小鼠和B-NDG小鼠的PK结果符合药代动力学特征，与C57BL/6野生型小鼠相比无显著差异；BNDG-B2M-KO小鼠在第2天之后的各个时间点均没有检测到hIgG的血药浓度，该小鼠体内B2M基因缺失，FcRn/B2M介导的抗体胞吞功能受损，导致抗体在小鼠体内快速清除。而实施例1制备的BNDG-B2M/FcRn小鼠，表达FcRn蛋白复合物完全解决了胞吞功能受损的缺陷，其PK结果符合药代动力学特征。

采用Phoenix Winnolin 8.0建立非房室模型(Non-Compartmental Analysis，NCA)计算PK参数：半衰期(T_1/2)、药峰浓度(C_max)、达峰时间(T_max)、0-24天的血药浓度-时间曲线下面积(AUC_0-24)、从给药开始到理论外推无穷远的时间的血药浓度-时间曲线下面积(AUC_0-inf.)、表观分布容积(V_z)、清除率(Cl)、稳态表观分布容积(V_ss)。hIgG在G1、G2、G3、G4四个组别小鼠体内的总体药代参数如表9所示。

表9 总体药代参数

从表9可以看出，hIgG在B-NDG小鼠、BNDG B2M-KO小鼠、BNDG-B2M/FcRn小鼠和野生型C57BL/6小鼠中的平均半衰期分别为11.19天、0.26天、5.37天和4.34天。由于无法进行免疫介导的hIgG清除，与野生型C57BL/6小鼠相比，B-NDG小鼠体内hIgG半衰期更长，为11.19天；BNDG-B2M-KO小鼠的半衰期较短的原因是因为B2M基因的敲除，当将B2M基因嵌合到FcRn基因座(BNDG-B2M/FcRn小鼠)后，hIgG的半衰期得到恢复，为5.37天。

实施例5 BNDG-B2M/FcRn小鼠免疫重建

使用本方法获得的BNDG-B2M/FcRn小鼠，在移植人外周血细胞(hPBMC)或人造血干细胞后，可在体内构建人免疫系统重建的小鼠模型。

以hPBMC重建为例，选取7周龄雌性B-NDG小鼠和BNDG-B2M/FcRn纯合子小鼠各12只，按体重分为4组(具体分组情况和接种细胞量如表10所示)，通过尾静脉注射5×10⁶来自2个供体(供体1和供体2)的hPBMC，2周后取血进行流式细胞检测，检测结果如图14所示，从图中可以看出，通过注射hPBMC，在24只B-NDG小鼠和BNDG-B2M/FcRn纯合子小鼠体内检测到表达人白细胞表面分子标记(CD45+)的细胞。

表10 hPBMC重建实验分组和细胞接种量

组别	动物	数量	细胞	接种细胞量	接种细胞体积
						G1	B-NDG	6	供体1	5×10<sup>6</sup>/只	0.2ml/只
G2	B-NDG	6	供体2	5×10<sup>6</sup>/只	0.2ml/只
						G3	BNDG-B2M/FcRn	6	供体1	5×10<sup>6</sup>/只	0.2ml/只
G4	BNDG-B2M/FcRn	6	供体2	5×10<sup>6</sup>/只	0.2ml/只

进一步分析发现，外周血细胞的重建以T细胞为主，4个组别的小鼠体内T细胞检测结果如图15所示。从图中可以看出，免疫重建后，小鼠体内T细胞的数量与供体来源有一定的相关性。与供体1相比，供体2的hPBMC免疫重建后，B-NDG小鼠和BNDG-B2M/FcRn小鼠体内T细胞数量均更高一些。

4个组别小鼠的体重变化情况如图16所示，从图16中可以看出，注射两种不同来源的hPBMC后，BNDG-B2M/FcRn小鼠的体重逐渐增加，整体呈上升趋势；B-NDG小鼠注射两种不同来源的hPBMC后，虽然体重表现出轻微波动，但整体呈现上升趋势。实验结果表明，hPBMC免疫重建几乎没有影响BNDG-B2M/FcRn小鼠和B-NDG小鼠的体重增长；而且，与B-NDG小鼠相比，BNDG-B2M/FcRn小鼠hPBMC免疫重建后体重增长更稳定，说明成功构建了hPBMC免疫重建的小鼠模型。

注射hPBMC后，各组别小鼠的生存率统计结果如图17所示，从图中可以看出，B-NDG小鼠和BNDG-B2M/FcRn小鼠的存活期均超过了80天，而且相较于B-NDG小鼠，BNDG-B2M/FcRn小鼠的存活率更高，达到了100％，可为后续的药物筛选和评价提供更长的实验窗口期。表明，BNDG-B2M/FcRn小鼠更适合进行hPBMC免疫重建。

实施例6 BNDG-B2M/FcRn免疫重建异种移植肿瘤模型药效验证实验一

重建后的BNDG-B2M/FcRn小鼠可用于建立异种移植肿瘤模型，这类模型可广泛应用于针对药物筛选、药效学研究等，提高药物临床转化率。具体来说，在15只BNDG-B2M/FcRn小鼠上进行hPBMC免疫重建，14天后，皮下接种人结肠癌细胞RKO，6天后(肿瘤体积约100mm³)，按瘤体积分为无治疗对照组(hPBMC+RKO，n＝7)或治疗组(hPBMC+RKO+Tx，n＝8)。治疗组用抗人PD-1单克隆抗体Pembrolizumab和Ipilimumab(使用常规方法免疫小鼠得到，参见Janeway's Immunobiology(9th Edition)，给药剂量为200μg/只/抗体。给药方式：腹腔注射，每周给药2次，共给药8次。每周测量肿瘤体积2次。实验周期内小鼠体重情况和肿瘤体积测量结果分别如图18、图19所示。

表11中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时和分组后第14天、第21天时的肿瘤体积、实验结束时(第28天)的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠的情况、肿瘤(体积)抑制率(Tumor Growth Inhibition value，TGI_TV)以及治疗组与对照组小鼠肿瘤体积的统计学差异(P值)。

表11 肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率

从表11可见，对照组和治疗组的所有小鼠在实验终点时均存活。对照组所有小鼠在试验过程中肿瘤持续生长，在实验终点时，对照组平均肿瘤体积为1464±260mm³，治疗组为595±64mm³，与对照组的肿瘤体积相比具有显著差异(P≤0.05)(图19)，TGI_TV达到64.46％。表明这种抗人PD-1单抗在抑制肿瘤生长方面具有一定作用。证明了本方法制备的BNDG-B2M/FcRn免疫重建异种移植肿瘤模型可用于筛选抗体及体内药效检测，可作为体内研究的活体替代模型，用于免疫调节剂的筛选、评估和治疗。

实施例7 BNDG-B2M/FcRn免疫重建异种移植肿瘤模型药效验证实验二

BNDG-B2M/FcRn免疫重建异种移植肿瘤模型同样可以用于CAR-T的药效验证。将人肺鳞癌细胞NCI-H226经皮下移植到hPBMC免疫重建成功的BNDG-B2M/FcRn小鼠体内，待肿瘤体积约150±50mm³时进行分组(对照组vehicle，治疗组CAR-T-1、CAR-T-2、CAR-T-3)，小鼠尾静脉接种0.5×10⁶的不同CAR-T产品，实验周期内小鼠体重情况和肿瘤体积测量结果分别如图20、图21所示。

整体来看，实验过程中各组动物健康状态良好。在实验终点时，各组动物体重稍有波动，但整体呈正常趋势，且所有治疗组与对照组相比，动物体重无明显差异(图21)，表明动物对所述抗体耐受良好。从肿瘤体积结果上看(图20)，与对照组相比，治疗组肿瘤体积呈现明显的缩小，表明三种CAR-T均具有不同的肿瘤细胞清除能力，其中，CAR-T-2肿瘤清除能力显著高于CAR-T-1和CAR-T-3。证明了本方法制备的BNDG-B2M/FcRn免疫重建异种移植肿瘤模型同样可用于CAR-T产品的药效检测，可作为体内研究的活体替代模型，用于免疫调节剂的筛选、评估和治疗。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> 基因修饰非人动物的构建方法及应用

<130> 1

<160> 45

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 858

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

tttcagtggc tgctactcgg cgcttcagtc gcggtcgctt cagtcgtcag catggctcgc 60

tcggtgaccc tggtctttct ggtgcttgtc tcactgaccg gcctgtatgc tatccagaaa 120

acccctcaaa ttcaagtata ctcacgccac ccaccggaga atgggaagcc gaacatactg 180

aactgctacg taacacagtt ccacccgcct cacattgaaa tccaaatgct gaagaacggg 240

aaaaaaattc ctaaagtaga gatgtcagat atgtccttca gcaaggactg gtctttctat 300

atcctggctc acactgaatt cacccccact gagactgata catacgcctg cagagttaag 360

catgccagta tggccgagcc caagaccgtc tactgggatc gagacatgtg atcaagcatc 420

atgatgctct gaagattcat ttgaacctgc ttaattacaa atccagtttc taatatgcta 480

tacaatttat gcacgcagaa agaaatagca atgtacacat caccttcttt atatcttact 540

ttaaatattt tatgcatgtt ttcaaaaaat tggaaatatc ctagatagct gagcaataaa 600

tcttcaataa gtattttgat cagaataata aatataattt taagaacaat agttgatcat 660

atgccaaacc ctctgtactt ctcattactt ggatgcagtt actcatcttt ggtctatcac 720

aacataagtg acatactttc cttttggtaa agcaaagagg cctaattgaa gtctgtcact 780

gtgcccaatg cttagcaatt ctcaccccca accctgtggc tacttctgct tttgttactt 840

ttactaaaaa taaaaaac 858

<210> 2

<211> 119

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 2

Met Ala Arg Ser Val Thr Leu Val Phe Leu Val Leu Val Ser Leu Thr

1 5 10 15

Gly Leu Tyr Ala Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg

20 25 30

His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val Thr

35 40 45

Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly Lys

50 55 60

Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp Trp

65 70 75 80

Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp

85 90 95

Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr

100 105 110

Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met

115

<210> 3

<211> 1738

<212> DNA/RNA

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 3

aggagctagt gggtggagtt ggatgccctc agagttctcc agtcctaact gtgtacagac 60

aggatgtaag agaagaactg gaggctctaa gcagaggatc catcggctgc aggcagaggg 120

aagagggcct ctgtgaggaa caggctgagc gtcagaggag gaggcccagg cctggttctc 180

tagctctgta attaattaac taaagtggat caaatgagaa ggtgaaagtt cacagaggaa 240

cactcctgtc tgtcgtcttg gactgggtct ccatcccacc atccagcgtc ctggtctacg 300

aagagtccac agggaccttg tgaagaatca acaaggcggg gtccagagga gtcacgtgtc 360

ccttccactc cgggtcaccc tgtcggaatg gggatgccac tgccctgggc cctcagcctc 420

ttgttggtcc tcctgcctca gacctggggc tcagagaccc gccccccact gatgtatcat 480

ctcacggctg tgtcaaaccc atctacgggg cttccctctt tctgggctac aggctggttg 540

ggtcctcagc agtatctgac ctacaacagc ctgcggcagg aagctgaccc ctgtggggcc 600

tggatgtggg aaaatcaggt gtcttggtat tgggagaagg agaccacaga cctcaaaagc 660

aaagaacagc tcttcttgga ggccctcaag accctggaga agatattaaa tgggacctac 720

acactgcagg gcctgctggg ctgtgaactg gcctcggata attcctcagt gcccacggct 780

gtgtttgccc tcaatggtga ggagtttatg aaattcaacc caagaatcgg caattggact 840

ggggagtggc ctgagacgga aatcgttgct aatctgtgga tgaagcagcc tgatgcggcc 900

aggaaggaga gcgagttcct gctaaactct tgtccggagc gactgctagg ccacctggag 960

aggggccgac ggaacctgga gtggaaggag ccgccgtcta tgcgcctgaa ggcccgtcct 1020

ggcaactctg gctcctccgt gctgacctgt gctgctttct ccttctaccc accggagctc 1080

aagttccgat tcctgcgcaa tgggctagcc tcaggctccg ggaattgcag cactggtccc 1140

aatggagatg gctctttcca cgcatggtca ttgctggagg tcaaacgtgg agatgagcac 1200

cattatcaat gtcaagtgga gcatgagggg ctggcacagc ctctcactgt ggacctagat 1260

tcatcagcca gatcttctgt gcctgtggtt ggaatcgttc ttggtttatt gctggtggta 1320

gtggccatcg caggcggtgt gctgttgtgg ggcaggatgc gcagcggtct gccagcccca 1380

tggctttctc tcagcggcga tgactctggt gacctgttgc ctggtgggaa cttgccccca 1440

gaagctgaac ctcaaggtgc aaatgccttt ccagccactt cctgatgcag actcgggccc 1500

cctgcccact gcagcctttc gggctgtgtg acctcctgaa ctgtctccga gcctcctgag 1560

ggagcctggg cccgatgtcc tcccatggat ccctgctttt gtggcctgct tcagtttccc 1620

ttcttaatgt acatggttgt tttccatctc cacataaatt tggccccaaa tctgtgtgtg 1680

catcgttatt ctcaagtttc aagcagctgg aataaattga acgcgtctgg gaaagatc 1738

<210> 4

<211> 365

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 4

Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Pro Gln Thr Trp Gly Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr His Leu

20 25 30

Thr Ala Val Ser Asn Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr

35 40 45

Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Gln

50 55 60

Glu Ala Asp Pro Cys Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp

65 70 75 80

Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe

85 90 95

Leu Glu Ala Leu Lys Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Thr Tyr Thr

100 105 110

Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn Ser Ser Val

115 120 125

Pro Thr Ala Val Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Lys Phe Asn

130 135 140

Pro Arg Ile Gly Asn Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr Glu Ile Val

145 150 155 160

Ala Asn Leu Trp Met Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu

165 170 175

Phe Leu Leu Asn Ser Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg

180 185 190

Gly Arg Arg Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys

195 200 205

Ala Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe

210 215 220

Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu

225 230 235 240

Ala Ser Gly Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser

245 250 255

Phe His Ala Trp Ser Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His

260 265 270

Tyr Gln Cys Gln Val Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val

275 280 285

Asp Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val

290 295 300

Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu

305 310 315 320

Trp Gly Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser

325 330 335

Gly Asp Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu

340 345 350

Ala Glu Pro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser

355 360 365

<210> 5

<211> 2080

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

aggagctagt gggtggagtt ggatgccctc agagttctcc agtcctaact gtgtacagac 60

aggatgtaag agaagaactg gaggctctaa gcagaggatc catcggctgc aggcagaggg 120

aagagggcct ctgtgaggaa caggctgagc gtcagaggag gaggcccagg cctggttctc 180

tagctctgta attaattaac taaagtggat caaatgagaa ggtgaaagtt cacagaggaa 240

cactcctgtc tgtcgtcttg gactgggtct ccatcccacc atccagcgtc ctggtctacg 300

aagagtccac agggaccttg tgaagaatca acaaggcggg gtccagagga gtcacgtgtc 360

ccttccactc cgggtcaccc tgtcggaatg gggatgccac tgccctgggc cctcagcctc 420

ttgttggtcc tcctgcctca gacctggggc atccagaaaa cccctcaaat tcaagtatac 480

tcacgccacc caccggagaa tgggaagccg aacatactga actgctacgt aacacagttc 540

cacccgcctc acattgaaat ccaaatgctg aagaacggga aaaaaattcc taaagtagag 600

atgtcagata tgtccttcag caaggactgg tctttctata tcctggctca cactgaattc 660

acccccactg agactgatac atacgcctgc agagttaagc atgccagtat ggccgagccc 720

aagaccgtct actgggatcg agacatggga ggtggcggat ccggcggagg cggctcgggt 780

ggcggcggct cttcagagac ccgcccccca ctgatgtatc atctcacggc tgtgtcaaac 840

ccatctacgg ggcttccctc tttctgggct acaggctggt tgggtcctca gcagtatctg 900

acctacaaca gcctgcggca ggaagctgac ccctgtgggg cctggatgtg ggaaaatcag 960

gtgtcttggt attgggagaa ggagaccaca gacctcaaaa gcaaagaaca gctcttcttg 1020

gaggccctca agaccctgga gaagatatta aatgggacct acacactgca gggcctgctg 1080

ggctgtgaac tggcctcgga taattcctca gtgcccacgg ctgtgtttgc cctcaatggt 1140

gaggagttta tgaaattcaa cccaagaatc ggcaattgga ctggggagtg gcctgagacg 1200

gaaatcgttg ctaatctgtg gatgaagcag cctgatgcgg ccaggaagga gagcgagttc 1260

ctgctaaact cttgtccgga gcgactgcta ggccacctgg agaggggccg acggaacctg 1320

gagtggaagg agccgccgtc tatgcgcctg aaggcccgtc ctggcaactc tggctcctcc 1380

gtgctgacct gtgctgcttt ctccttctac ccaccggagc tcaagttccg attcctgcgc 1440

aatgggctag cctcaggctc cgggaattgc agcactggtc ccaatggaga tggctctttc 1500

cacgcatggt cattgctgga ggtcaaacgt ggagatgagc accattatca atgtcaagtg 1560

gagcatgagg ggctggcaca gcctctcact gtggacctag attcatcagc cagatcttct 1620

gtgcctgtgg ttggaatcgt tcttggttta ttgctggtgg tagtggccat cgcaggcggt 1680

gtgctgttgt ggggcaggat gcgcagcggt ctgccagccc catggctttc tctcagcggc 1740

gatgactctg gtgacctgtt gcctggtggg aacttgcccc cagaagctga acctcaaggt 1800

gcaaatgcct ttccagccac ttcctgatgc agactcgggc cccctgccca ctgcagcctt 1860

tcgggctgtg tgacctcctg aactgtctcc gagcctcctg agggagcctg ggcccgatgt 1920

cctcccatgg atccctgctt ttgtggcctg cttcagtttc ccttcttaat gtacatggtt 1980

gttttccatc tccacataaa tttggcccca aatctgtgtg tgcatcgtta ttctcaagtt 2040

tcaagcagct ggaataaatt gaacgcgtct gggaaagatc 2080

<210> 6

<211> 479

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Pro Gln Thr Trp Gly Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser

20 25 30

Arg His Pro Pro Glu Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val

35 40 45

Thr Gln Phe His Pro Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly

50 55 60

Lys Lys Ile Pro Lys Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp

65 70 75 80

Trp Ser Phe Tyr Ile Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr

85 90 95

Asp Thr Tyr Ala Cys Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu Pro Lys

100 105 110

Thr Val Tyr Trp Asp Arg Asp Met Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr

130 135 140

His Leu Thr Ala Val Ser Asn Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp

145 150 155 160

Ala Thr Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu

165 170 175

Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln Val

180 185 190

Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln

195 200 205

Leu Phe Leu Glu Ala Leu Lys Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Thr

210 215 220

Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn Ser

225 230 235 240

Ser Val Pro Thr Ala Val Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Lys

245 250 255

Phe Asn Pro Arg Ile Gly Asn Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr Glu

260 265 270

Ile Val Ala Asn Leu Trp Met Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys Glu

275 280 285

Ser Glu Phe Leu Leu Asn Ser Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu

290 295 300

Glu Arg Gly Arg Arg Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg

305 310 315 320

Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala

325 330 335

Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn

340 345 350

Gly Leu Ala Ser Gly Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp

355 360 365

Gly Ser Phe His Ala Trp Ser Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu

370 375 380

His His Tyr Gln Cys Gln Val Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu

385 390 395 400

Thr Val Asp Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly

405 410 415

Ile Val Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val

420 425 430

Leu Leu Trp Gly Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Gly Asp Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro

450 455 460

Pro Glu Ala Glu Pro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser

465 470 475

<210> 7

<211> 1480

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggttttgccc atctacttca gcctgttggt ccatctgctg accaccagtc gaccactcac 60

ggctctgtca gtctccctct ctcggctgtt tatattccct gccgcccagg ccggccatga 120

acccctggcc tcccggcctc catccttagt gctggaatta caggcatgtg ctgccgccca 180

ccccctttct tctttgctgt ctatctaccc tgtcaaccta cctgtctgtc agtgtctctc 240

tgtgtgtctg tgtgtttttt ctggcaagat cttggggtgg gcagcagggt gggagacagg 300

ggccaaaggc aaaggctctc atcacagagt gtgtaggcag ggttggggcc acctcaagtg 360

ctggcacatg gaagaaatca gagcaggctt acagctggga gtgggctgct gccaaacctt 420

gtgtgttagg caaccatgcc atgaccaagc cacacccaca gcccacaaat cctggggtgt 480

cttaaagtca cattcagcgt gcaggccttt ccagggctgc gagtctactc caaaaatgct 540

ccaaacgagt aaacatagaa gctgttttgg gaggcaggcc taatgacgtt tgccccggga 600

ggcttccaac cagatacagc aggaacttca agagaggctg gacagaggcc caaggggtgt 660

gcttaggagc tagtgggtgg agttggatgc cctcagagtt ctccagtcct aactgtgtac 720

agacaggatg taagagaaga actggaggct ctaagcagag gatccatcgg ctgcaggcag 780

agggaagagg gcctctgtga ggaacaggct gagcgtcaga ggaggaggcc caggcctggt 840

tctctaggta tgagggacca gcaccccaag aggaaagagg gttggggcct ggagctccag 900

gtctgaggga ggagtgttat gacctgaggg ggagagagga ggctggggtc tgaggaagga 960

gagcaggacc ccgggcacct gagtctgagg gatgaagccg gagcctaggg ttttgggttt 1020

gaggaaagat cttggaactg gactcctgga tctgagggag gtggaactgg actcctggct 1080

tgggtttgag ggctcctgag gctgaaatct gagcccctgg gaatgaggga ggaggagaag 1140

gcctggatcc tctggtctga gggaggagaa aaaggaaata acagaagtct gagacaaatt 1200

ttggtctgtc tagctctgta attaattaac taaagtggat caaatgagaa ggtgaaagtt 1260

cacagaggaa cactcctgtc tgtcgtcttg gactgggtct ccatcccacc atccagcgtc 1320

ctggtctacg aagagtccac agggaccttg tgaagaatca acaaggcggg gtccagagga 1380

gtcacgtgtc ccttccactc cgggtcaccc tgtcggaatg gggatgccac tgccatgggc 1440

gctcagcctc ttgttggtcc tcctgcctca gacctggggc 1480

<210> 8

<211> 1445

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tcaggtaaga ggccaccagg acctggagtg tgtcaggaag gggacaggaa gaagagccaa 60

agagtggaag agggacaata agtccacttt ttccatgatg tcctagcctt catggaaatc 120

tcactgtggg taacttctct gtgcatctga gtcaaataca cttgacaatc tcaggctcgt 180

ctctgtgtcc gtctgtccgt cttgcttcct ttctgggtgt ctgtcccctt ctctctggag 240

gatcatggca cttcagatcg ggtccagttt tcattctgca cctctgtggg gcacggtgca 300

gtccgtgacc cgagactctc ctgtttgctc tgcagagacc cgccccccac tgatgtatca 360

tctcacggct gtgtcaaacc catctacggg gcttccctct ttctgggcta caggctggtt 420

gggtcctcag cagtatctga cctacaacag cctgcggcag gaagctgacc cctgtggggc 480

ctggatgtgg gaaaatcagg tgtcttggta ttgggagaag gagaccacag acctcaaaag 540

caaagaacag ctcttcttgg aggccctcaa gaccctggag aagatattaa atggtcagaa 600

gaggggtgag cttcagtagg ctgggtttga ggaaggataa tgggtctgga ttcctgggtc 660

aaggaaggag gctggagccc taggcctgaa gtgggaggat taggtctgaa ccctaggaat 720

aagggggaag gttgggatct ggacctcaag gtccgaggga ggagaagaga ggaaggctgg 780

cccttgctcc tgagtctgct tgcctgcgtg ttggcatcta gggacctaca cactgcaggg 840

cctgctgggc tgtgaactgg cctcggataa ttcctcagtg cccacggctg tgtttgccct 900

caatggtgag gagtttatga aattcaaccc aagaatcggc aattggactg gggagtggcc 960

tgagacggaa atcgttgcta atctgtggat gaagcagcct gatgcggcca ggaaggagag 1020

cgagttcctg ctaaactctt gtccggagcg actgctaggc cacctggaga ggggccgacg 1080

gaacctggag tggaagggtg agcccatctc ctgtccctcc tctagatctc cacagccatg 1140

ctcaaagccc acccagcatc agtacaaccc ctctcgccta tcccagtgga tcttctttaa 1200

gataaggtct catgtagccc aggctagctc tcacgtagct caagctagcc atgagctcat 1260

cgtgtagctg aggatggtct tggattcctg atcctcttag cccattccaa gtgctgattt 1320

gacttaagtg tgttgccaca cccagctaat tgttcttgtt tgtgagacag ggtctcaggc 1380

tgactttgaa ctcagagaga tctcttgagt gctgggacaa aaggagtgtg ctgctgtacc 1440

aggct 1445

<210> 9

<211> 297

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atccagaaaa cccctcaaat tcaagtatac tcacgccacc caccggagaa tgggaagccg 60

aacatactga actgctacgt aacacagttc cacccgcctc acattgaaat ccaaatgctg 120

aagaacggga aaaaaattcc taaagtagag atgtcagata tgtccttcag caaggactgg 180

tctttctata tcctggctca cactgaattc acccccactg agactgatac atatgcctgc 240

agagttaagc atgccagtat ggccgagccc aagaccgtct actgggatcg agacatg 297

<210> 10

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaggtggcg gatccggcgg aggcggctcg ggtggcggcg gctct 45

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

cgggtcaccc tgtcggaatg ggg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cccattccga cagggtgacc cgg 23

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agtggcatcc ccattccgac agg 23

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ccatgatgtc ctagccttca tgg 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgagcccca ggtctgaggc agg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ggaggaccaa caagaggctg agg 23

<210> 17

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gagtgtgtca ggaaggggac agg 23

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ttacctgagc cccaggtctg agg 23

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

gtttgaggaa ggataatggg tctgg 25

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ggaggaccaa caagaggctg 20

<210> 21

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

taggggagga ccaacaagag gctg 24

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagcctcttg ttggtcctcc 20

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

aaaccagcct cttgttggtc ctcc 24

<210> 24

<211> 132

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

gaattctaat acgactcact atagggggtc ttcgagaaga cctgttttag agctagaaat 60

agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct 120

tttaaaggat cc 132

<210> 25

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

gtagctgtct tcagacactc cagaa 25

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

tgcaggcata tgtatcagtc tcagt 25

<210> 27

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

aattcaagta tactcacgcc accca 25

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

taagttcaag tcccagcaac cacat 25

<210> 29

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ttgcttctgt ctttcaagtg tgtggg 26

<210> 30

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

attcaagtat actcacgcca cccacc 26

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

aggctgagac caagaggatg acaag 25

<210> 32

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

ctgcttccct ctttcctgag cttcc 25

<210> 33

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

aaacccatgc aggctgtgta actga 25

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gaataaatga aggcggtccc aggct 25

<210> 35

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

acgagcctga gattgtcaag tgtat 25

<210> 36

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

gtgaaagttc acagaggaac actcc 25

<210> 37

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

catccacaga ttagcaacga tttcc 25

<210> 38

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

gctagcatca gaagatcagg actca 25

<210> 39

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

tagaaagtca accactccta cctgc 25

<210> 40

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

Ile Gln Lys Thr Pro Gln Ile Gln Val Tyr Ser Arg His Pro Pro Glu

1 5 10 15

Asn Gly Lys Pro Asn Ile Leu Asn Cys Tyr Val Thr Gln Phe His Pro

20 25 30

Pro His Ile Glu Ile Gln Met Leu Lys Asn Gly Lys Lys Ile Pro Lys

35 40 45

Val Glu Met Ser Asp Met Ser Phe Ser Lys Asp Trp Ser Phe Tyr Ile

50 55 60

Leu Ala His Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Thr Asp Thr Tyr Ala Cys

65 70 75 80

Arg Val Lys His Ala Ser Met Ala Glu Pro Lys Thr Val Tyr Trp Asp

85 90 95

Arg Asp Met

<210> 41

<211> 344

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr His Leu Thr Ala Val Ser Asn

1 5 10 15

Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr Gly Trp Leu Gly Pro

20 25 30

Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Gln Glu Ala Asp Pro Cys

35 40 45

Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp Tyr Trp Glu Lys Glu

50 55 60

Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe Leu Glu Ala Leu Lys

65 70 75 80

Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Thr Tyr Thr Leu Gln Gly Leu Leu

85 90 95

Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn Ser Ser Val Pro Thr Ala Val Phe

100 105 110

Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Lys Phe Asn Pro Arg Ile Gly Asn

115 120 125

Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr Glu Ile Val Ala Asn Leu Trp Met

130 135 140

Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu Phe Leu Leu Asn Ser

145 150 155 160

Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg Gly Arg Arg Asn Leu

165 170 175

Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys Ala Arg Pro Gly Asn

180 185 190

Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe Ser Phe Tyr Pro Pro

195 200 205

Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu Ala Ser Gly Ser Gly

210 215 220

Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser Phe His Ala Trp Ser

225 230 235 240

Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His Tyr Gln Cys Gln Val

245 250 255

Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val Asp Leu Asp Ser Ser

260 265 270

Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val Leu Gly Leu Leu Leu

275 280 285

Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu Trp Gly Arg Met Arg

290 295 300

Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser Gly Asp Asp Ser Gly

305 310 315 320

Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu Ala Glu Pro Gln Gly

325 330 335

Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser

340

<210> 42

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu

1 5 10 15

Pro Gln Thr Trp Gly

20

<210> 43

<211> 1288

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

tcagagaccc gccccccact gatgtatcat ctcacggctg tgtcaaaccc atctacgggg 60

cttccctctt tctgggctac aggctggttg ggtcctcagc agtatctgac ctacaacagc 120

ctgcggcagg aagctgaccc ctgtggggcc tggatgtggg aaaatcaggt gtcttggtat 180

tgggagaagg agaccacaga cctcaaaagc aaagaacagc tcttcttgga ggccctcaag 240

accctggaga agatattaaa tgggacctac acactgcagg gcctgctggg ctgtgaactg 300

gcctcggata attcctcagt gcccacggct gtgtttgccc tcaatggtga ggagtttatg 360

aaattcaacc caagaatcgg caattggact ggggagtggc ctgagacgga aatcgttgct 420

aatctgtgga tgaagcagcc tgatgcggcc aggaaggaga gcgagttcct gctaaactct 480

tgtccggagc gactgctagg ccacctggag aggggccgac ggaacctgga gtggaaggag 540

ccgccgtcta tgcgcctgaa ggcccgtcct ggcaactctg gctcctccgt gctgacctgt 600

gctgctttct ccttctaccc accggagctc aagttccgat tcctgcgcaa tgggctagcc 660

tcaggctccg ggaattgcag cactggtccc aatggagatg gctctttcca cgcatggtca 720

ttgctggagg tcaaacgtgg agatgagcac cattatcaat gtcaagtgga gcatgagggg 780

ctggcacagc ctctcactgt ggacctagat tcatcagcca gatcttctgt gcctgtggtt 840

ggaatcgttc ttggtttatt gctggtggta gtggccatcg caggcggtgt gctgttgtgg 900

ggcaggatgc gcagcggtct gccagcccca tggctttctc tcagcggcga tgactctggt 960

gacctgttgc ctggtgggaa cttgccccca gaagctgaac ctcaaggtgc aaatgccttt 1020

ccagccactt cctgatgcag actcgggccc cctgcccact gcagcctttc gggctgtgtg 1080

acctcctgaa ctgtctccga gcctcctgag ggagcctggg cccgatgtcc tcccatggat 1140

ccctgctttt gtggcctgct tcagtttccc ttcttaatgt acatggttgt tttccatctc 1200

cacataaatt tggccccaaa tctgtgtgtg catcgttatt ctcaagtttc aagcagctgg 1260

aataaattga acgcgtctgg gaaagatc 1288

<210> 44

<211> 450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

aggagctagt gggtggagtt ggatgccctc agagttctcc agtcctaact gtgtacagac 60

aggatgtaag agaagaactg gaggctctaa gcagaggatc catcggctgc aggcagaggg 120

aagagggcct ctgtgaggaa caggctgagc gtcagaggag gaggcccagg cctggttctc 180

tagctctgta attaattaac taaagtggat caaatgagaa ggtgaaagtt cacagaggaa 240

cactcctgtc tgtcgtcttg gactgggtct ccatcccacc atccagcgtc ctggtctacg 300

aagagtccac agggaccttg tgaagaatca acaaggcggg gtccagagga gtcacgtgtc 360

ccttccactc cgggtcaccc tgtcggaatg gggatgccac tgccctgggc cctcagcctc 420

ttgttggtcc tcctgcctca gacctggggc 450

<210> 45

<211> 11197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gacagaggcc caaggggtgt gcttaggagc tagtgggtgg agttggatgc cctcagagtt 60

ctccagtcct aactgtgtac agacaggatg taagagaaga actggaggct ctaagcagag 120

gatccatcgg ctgcaggcag agggaagagg gcctctgtga ggaacaggct gagcgtcaga 180

ggaggaggcc caggcctggt tctctaggta tgagggacca gcaccccaag aggaaagagg 240

gttggggcct ggagctccag gtctgaggga ggagtgttat gacctgaggg ggagagagga 300

ggctggggtc tgaggaagga gagcaggacc ccgggcacct gagtctgagg gatgaagccg 360

gagcctaggg ttttgggttt gaggaaagat cttggaactg gactcctgga tctgagggag 420

gtggaactgg actcctggct tgggtttgag ggctcctgag gctgaaatct gagcccctgg 480

gaatgaggga ggaggagaag gcctggatcc tctggtctga gggaggagaa aaaggaaata 540

acagaagtct gagacaaatt ttggtctgtc tagctctgta attaattaac taaagtggat 600

caaatgagaa ggtgaaagtt cacagaggaa cactcctgtc tgtcgtcttg gactgggtct 660

ccatcccacc atccagcgtc ctggtctacg aagagtccac agggaccttg tgaagaatca 720

acaaggcggg gtccagagga gtcacgtgtc ccttccactc cgggtcaccc tgtcggaatg 780

gggatgccac tgccatgggc gctcagcctc ttgttggtcc tcctgcctca gacctggggc 840

atccagaaaa cccctcaaat tcaagtatac tcacgccacc caccggagaa tgggaagccg 900

aacatactga actgctacgt aacacagttc cacccgcctc acattgaaat ccaaatgctg 960

aagaacggga aaaaaattcc taaagtagag atgtcagata tgtccttcag caaggactgg 1020

tctttctata tcctggctca cactgaattc acccccactg agactgatac atatgcctgc 1080

agagttaagc atgccagtat ggccgagccc aagaccgtct actgggatcg agacatggga 1140

ggtggcggat ccggcggagg cggctcgggt ggcggcggct cttcaggtaa gaggccacca 1200

ggacctggag tgtgtcagga aggggacagg aagaagagcc aaagagtgga agagggacaa 1260

taagtccact ttttccatga tgtcctagcc ttcatggaaa tctcactgtg ggtaacttct 1320

ctgtgcatct gagtcaaata cacttgacaa tctcaggctc gtctctgtgt ccgtctgtcc 1380

gtcttgcttc ctttctgggt gtctgtcccc ttctctctgg aggatcatgg cacttcagat 1440

cgggtccagt tttcattctg cacctctgtg gggcacggtg cagtccgtga cccgagactc 1500

tcctgtttgc tctgcagaga cccgcccccc actgatgtat catctcacgg ctgtgtcaaa 1560

cccatctacg gggcttccct ctttctgggc tacaggctgg ttgggtcctc agcagtatct 1620

gacctacaac agcctgcggc aggaagctga cccctgtggg gcctggatgt gggaaaatca 1680

ggtgtcttgg tattgggaga aggagaccac agacctcaaa agcaaagaac agctcttctt 1740

ggaggccctc aagaccctgg agaagatatt aaatggtcag aagaggggtg agcttcagta 1800

ggctgggttt gaggaaggat aatgggtctg gattcctggg tcaaggaagg aggctggagc 1860

cctaggcctg aagtgggagg attaggtctg aaccctagga ataaggggga aggttgggat 1920

ctggacctca aggtccgagg gaggagaaga gaggaaggct ggcccttgct cctgagtctg 1980

cttgcctgcg tgttggcatc tagggaccta cacactgcag ggcctgctgg gctgtgaact 2040

ggcctcggat aattcctcag tgcccacggc tgtgtttgcc ctcaatggtg aggagtttat 2100

gaaattcaac ccaagaatcg gcaattggac tggggagtgg cctgagacgg aaatcgttgc 2160

taatctgtgg atgaagcagc ctgatgcggc caggaaggag agcgagttcc tgctaaactc 2220

ttgtccggag cgactgctag gccacctgga gaggggccga cggaacctgg agtggaaggg 2280

tgagcccatc tcctgtccct cctctagatc tccacagcca tgctcaaagc ccacccagca 2340

tcagtacaac ccctctcgcc tatcccagtg gatcttcttt aagataaggt ctcatgtagc 2400

ccaggctagc tctcacgtag ctcaagctag ccatgagctc atcgtgtagc tgaggatggt 2460

cttggattcc tgatcctctt agcccattcc aagtgctgat ttgacttaag tgtgttgcca 2520

cacccagcta attgttcttg tttgtgagac agggtctcag gctgactttg aactcagaga 2580

gatctcttga gtgctgggac aaaaggagtg tgctgctgta ccaggctgct ttttcttttt 2640

ctttttcttt ttttgttgtt gttatagtta gacagactct cccaatgtag accacgtgac 2700

ctcaaacttg tcatcctctt ggtctcagcc tcccaagtgc taggattttc catgtctttt 2760

tcttcttgtt aacgtctaag agttctttat atattgtgga cccaaatctt caccaaataa 2820

gtgtttcaaa cacactttcc ttgactgttt tcctttcatt cttttaaagt tatcttcaaa 2880

tctttttgtt ttgttttttc gagacagggt ttctctgtgt agccctggct gtcctggaac 2940

tcactttgta gaccaggctg gcttcgaact cagaaatccg cctgcctctg cctcctgagt 3000

gctgggatta aaggtgtgtg ccaccacgcc cggctttttt tttttttttt tttaagatta 3060

tttagttttg tatataagtg ttcggattgc atgtatgcct gctgcacacc agaagagggc 3120

atcagatccc atttcaggtg cttgtaagat gccatgtggt tgctgggact tgaacttagg 3180

acctctaaaa gagcagccag tgctcttgac tgctaagcca tctctccagt ccccagtcct 3240

cttttgaggg ctgtgttttt gttagtatat cttgcttgga ggtcatgccc agcccaggat 3300

gacctaggtc tctgtgtgta tttggaggag ttttatagct ttccattcta tgtatagatc 3360

ctcttgcttt tctgtctaac aaattgtatg tgaagaaggt ctgtcatttc tccatccaag 3420

tttcagcctg tctggatctg agttgtgtgt gtgctcatgt gggtggagac cagagcacag 3480

cctcgagtgt tgtatttatg acatcttttt ctgaaaaaca aatcttcagg ctggactcag 3540

ctcagtggtt gagagcacac agggatttta tatgtgcaca tgtatatttg tatgtgcacg 3600

tgagtgtcag aagagggcgt tccatcccct gtagctggag ttacagttag ttataacatg 3660

cccagtgtgg gtgctggaac tgaatttgag gcatctttaa gtagcagcaa gcccttagtc 3720

cctgagccac ctctccagcc ccagcccctg tgagattttt actctgtccc tctcacttag 3780

ttggctcagt ttgggattgc actcaggtcc tttctcttgc caagtaagag ctctgccact 3840

gagcaatctt taaggttggt ttttgatttt ggtttttggt ttttcgagac agggtttctc 3900

tgtgttggaa ctcaatctgt agaccaggct ggccttgacc tcaaagaccc atccatctct 3960

gcctcctaag ctctggagat cagaggcatg cgtcaccgcc gaccggctgg ccatgtttta 4020

ggttttaaaa cttaccttta cttatttatc tgtgatttag cgtgtgtgag tggtggtggt 4080

ggaggtggtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtt tcatatgtga 4140

tatatacctg tgctgtgtat ggggtgagca tctgtccaca tgctcagaag ccagagaagg 4200

tggctcctct gtctctttcc atcgtatgtt cttcacccag attctcttga tgagcctgaa 4260

gctacgcagg caaccagcca ggcccctact ggtcctcttt cctctgcccc tatcctcagc 4320

gccagggtta cagttatgaa gatatgttta agttttgaca taagtgctaa gaatttgaac 4380

ttgggtcctc atgcttgtgt aataaacact ttttcatgct gagccattcc cctaattatg 4440

gctaaatagt actccattct agaagcctgc atgctatctt cctttatctg ctgagggtgt 4500

ctacattgtt tctgtagttt ggctgttttt ttgtttgtta gagatttatt tatttattat 4560

atgtaagtat gctgtcttca gacactccag aagaaggcat cagatctcat tacggatggt 4620

tgtgagccac catgtggttg ctaggatttg aactcaggac ctttggaaaa gacgtcaatg 4680

ctcttaacca ctgagccatc tcttcagtcc tgtttggctg ttttgatgtt tctacaatgc 4740

aggatagtgg ccagtgtttc cctgaaattt tgttttgctt ttactatatt tactttattt 4800

ttttattttt ggttttttga gacagggttt ctctgaatag ctcaggctgt cctggaactc 4860

actctgtaga ccagtatggc cttgaactca gaaatctgtc tgcctctgcc tcccaagttc 4920

tgggattaaa ggcatgtgcc accactgccc atccctaaaa ttttgatacc aacttctgga 4980

taagtgtcca caaataggat agctaactcc attaaacaag aaaaaaaatt tttattatgt 5040

tttttgcttc catgtatgtc tgtgcaccat gtgcatgcag tactcacaga ggccagagga 5100

gggcgtcagg tcccctggtg ctggagttac agatggttag gagttgttca ccacatgggt 5160

gctctgactt gaacctgagt cctctggagg agctgccact cactacttga ctaattttac 5220

ccgctgagtc acttctctag ctctgagctc atttaccatg gaaaaccatg gtggcctgtg 5280

tggggataca tgtctttaat gctagcactc cggaggcagg gacaggtagt ctctgcacta 5340

cctgcactcc ccttgacaac cggtccaggt tccacgggta ctgactacag ttgctacatt 5400

gtgtctatgt gtgattttgt tcttcttaac aggcttctgg taccaggtgt taggttgtgt 5460

tactgtttcc ttccaaacat acaaacaagg caggggctct accactgagc cacgccccag 5520

cccttcactg gggaattcga ggctctaaca ttgagcatac cattgacgct catttgactt 5580

aaaatatttt taaggttaca cttattatta aggttactta cttgtgaatg agtgtgcata 5640

tgtgtgtgcg tgtgtgcgtg tgtgtgtgtg tgtgtgcgcg tgcgtgcgcg cgcgcgcgcg 5700

cgtgcgtgcg tgcgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgta gataggtcag agaacttggt 5760

gagttggatc tctccttttg ccatgtagat tctagggatg gaactcaggt catcaggctt 5820

gtccgcaggt gtctttacgt cacgtcacca gccctcttgt atttttctaa acctttttct 5880

gactatattt attttattgt taatttctgt ggatgtgtgt gtacatatat ggtgcaagtg 5940

accacagatg ccagaaggag gatcaggtcg tctgcagctg gagttagtta taggtggtta 6000

agtgtcgccc agttggtgct gagaattgag ctcagttctg tagagagaac agaaaacgct 6060

ctagcggcta agctgtgtct ctcgggcgct tcactggccc tcttttgact ttttcttttt 6120

tcttttttct tttctttttt tttttttttc tggagctgag gcccgaaccc agggccttgg 6180

gcttgctagg caagcactct accactgaac taaatcccca accccttgac tttttatttt 6240

gagacatggt ctcactaagt ttcccaagct aactcccagc tcaatctgtg gcttaactgg 6300

tgagcctgta gcacctctgc cttggccacc caggttacat ttctggggca aaggtgcttc 6360

cttttttttt tcttcttctt cttcttctgt taaacagaag ccaaggctgg gctgactctc 6420

cgaaccctca gggtcagaac tggaaaacag gagaaccgag ggtgtctctc agctacccac 6480

aggaagtcat cctcactgga aaacaatagc aagcacaagg caggacacag aagtgctgac 6540

tgaggtccgg tcctctgtgg cagagagccg gtgcctcagg tcttcctaga tgccagtgag 6600

gcccctcttt cggggaagct cgttagcttc ctcttcctaa gaagttgtca gcttattttc 6660

tgctgagaac cagagcagaa ccaagattgt gagacccacc ctagacagag ggaacgcctc 6720

tgccatgcac agcctttctg gggtctcaga tccccatgga cttcattttg tctaggggtt 6780

tattgctgtt gattcagggt cttgtgtagc ccaggctggc cccaaacttc ctatttcatc 6840

aaagtaacct tgaactcctg atcctctgac ctccagtctg gagtgctgag attacaggtg 6900

tacgccagca tgcatgacca atgtcagtgt gccggggatc aaacctagga acccaggact 6960

tcacaccgga aactgggcca catccccagc cataatatct ctctctctct ctctgtctct 7020

ctgtctctct gtctctctct ctctctgttt cttttttctg agacagggtt tctctgtata 7080

gccctggctg tcctggaact cactttgtag accaggctgg cctcgaactc agaaatccgc 7140

ctgcctctgc ctcccaagtg ctgggattaa aggcgtgcgc taccaccgcc cacttctttc 7200

tttctttctt tctttctttc tttctctctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc 7260

tctctctctc tctctttctt cctttctttc tttccttggt ctcactatgt cactatgtag 7320

ccttggctag cctggaactg ctatgtagac caggttgccc tggtatccac agagatcaac 7380

ttgcctctgc tccctgaatg ctgggattca agatgtacta cacaccccac ccacaggtct 7440

cagtttttgc aagagcatcc aactcatttg gaactcatga ttttccggca acagttcctc 7500

aggtgctggg atcacttgtg tgggcatgca ccatcccacc cagctaggac agtcatgtct 7560

ctttgctcta tatatacact aatgtgttcc cagggccacg aataggtcac ggcactagag 7620

agatgtgcac taagtctccg tttagaaaca ggtagatgga ggagttgggg ctcagctggt 7680

agaaagcttg cttaaatggg ctccaccact ggcactgcat aaaccagtat ggcggcacac 7740

acctgctgtc tctcagcttt tagcaagtgg aagaaggaaa atcaggaatt caaagtcatc 7800

tgtatctata taataagttc aagactggtc tgggctgaga gtgaaacaaa caaatgtgcg 7860

cgagaagagg cgctgtgagc gccgagtttg ctgtgatgaa gacctgggtt ctggtcccca 7920

ggtccccttg caaaggctgg gcgtactgct gcgtgtctgt agctgcaggg atgggtctgg 7980

cagagacgga gcctcaccag ccactggcat ggctgaaagg gaggacccca ggttcatgga 8040

gaggctctgt ctcaaaaaat aagtgagccc ggcgtggtgg cgcacgcctt taatcccagc 8100

acttgggagg cagacacagg cagatttctg agttcgaggc cagcctggtc tacaaagtga 8160

gttcctggac agccagggct acacagagaa accctgtctc gaaaaaacaa acaaacaaac 8220

aaacaaaacc ccaaaaaaca acaacaaaaa aaagtggatg tggggagaga tggctcagtg 8280

gttaggaaca ctccctgttc ttgcagagga ccaggattta attcctagct cccatagggt 8340

aactcaccac catctgtaac tccatttcca ggggctctga tgtcctcatc tggcctccac 8400

agacactgca tgcatgtggt gcagagacac acatgctaaa aagcacccag acacacagag 8460

tgaaaaatat ataaagggga aaaaatgcaa agagcgaaag aggaaggagc ctgcaattga 8520

cctgtggcct tgacccatgc acatgccaca cacaccaaaa taagggggtg cagtggtggg 8580

gtcagcaggg tggggtgtct gtcactctgg gaagccctcc aagtcagcac agtgctgata 8640

cagggaagtg gagtctgtcc atggcaagct tcacccaagc cttggtgggg gtggggtggg 8700

tgggtgaggt catagcctag cctaactgct ggcccatccc attgcctgtg tccctgcaga 8760

gccgccgtct atgcgcctga aggcccgtcc tggcaactct ggctcctccg tgctgacctg 8820

tgctgctttc tccttctacc caccggagct caagttccga ttcctgcgca atgggctagc 8880

ctcaggctcc gggaattgca gcactggtcc caatggagat ggctctttcc acgcatggtc 8940

attgctggag gtcaaacgtg gagatgagca ccattatcaa tgtcaagtgg agcatgaggg 9000

gctggcacag cctctcactg tggacctagg tgaggctgcc cctccagcct cagtgtcttc 9060

tttgtttttt tttgtttttt taaaagatgt atttatttat ttcatgtatg tgagtacact 9120

gtcgctgtct tcagacacac cagaagagag catcagatcc tattacagac agttgtgagc 9180

caccatgtgg ttgctgggaa ttgaattcag gacctctaga agagcaggcg gtgctcttaa 9240

ccgctgagcc atctctctct ccagccccat tgtcttcttt gtttctgctc ctggcttctg 9300

attctccatt agctctgtgg ccagttcccc ctgagtctga ccatgatgag tcttgctgct 9360

actggtcttc atggtgtttg accattcact tttgcctctg acagttcttg ccatggcttt 9420

ggtaaagcac caactttgtt gactgtcctg tgactgctcc gccttcctct gttgggttct 9480

cacctagttc tgtcacagtg tggctgtgtc ctctcagtat aggtctcctc ctcctcttcc 9540

tcctcctcct attccttttc tttctcctcc tccttccatc cctcctcctc cctcctactt 9600

cctccccctc tccccttcct cctcctcctc tccctccttc tcctcctcct cctccttctt 9660

cagatttata tctaagtgta tccatatgta tttaattttc ccactttctt tgtgtgagag 9720

gggagagcag aggtgagtct gtgccatggg atacttgtgg cgacagagga caacttgtgg 9780

ttgtcagcct tggggctcaa acttaggtca ccgggcttta tggcaaaggc aatgccttca 9840

ctccttgaac ctctgacagc ctagatttat ggagggtcgg gctcaggtct cctggaattc 9900

gacacgagtt ctgggaacca aactctggtc ctccggaaga gctgcaagcc gtctctccag 9960

cacagtggct gactcttttt ttctcttttt tctttctttt tgtttttgtt tttgagacag 10020

ggtttctctg tagagctctg gctgtcctgg aactcacaat gtagaggagt ctggcctcta 10080

acccatagat ctgtgtgcct ctgcctccca agtgctggga ttaagaggtg tgtcaccact 10140

gtgtggccgg ttcttatatt cagtgaggaa acacatgagg cccagggcct tttctccgca 10200

tacacccacc ctcaaataca tgcttccggg ggtctccgag aaatcatcaa ctcctttctt 10260

ccctgtcttc atgatacttt ctggctgcag attcatcagc cagatcttct gtgcctgtgg 10320

ttggaatcgt tcttggttta ttgctggtgg tagtggccat cgcaggcggt gtgctgttgt 10380

ggggcaggat gcgcagcggt ctgccaggta tatgcaggat gggggagggg cggggccgtg 10440

tgcaggattg ggtgggagtg gccttgtgca ggatgaggga ggggcggggc cgtgtgcagg 10500

attggggtgg ggcgtggccg tgtgcagaat gagggagggg cgtggccgtg tgcaggattg 10560

gggaggggag ggaaggggcc gtgtgcagga ttggggaggg gcgtagctgt gtgcaggatt 10620

ggggaaggga ggggccgtgt gcaggattgg gggtcgtggc aggaagtagc gactcagaaa 10680

gaaagagggg aggcagagag ataatagaga caaaagagtc cctgaccacc ctgggaaaag 10740

agatgggaac agagaccata gcgtgaccct gtcaggtgtg ttgggtgggt gagaccttag 10800

atacttgtgc tgacctctgt tcctctctct cagccccatg gctttctctc agcggcgatg 10860

actctggtga cctgttgcct ggtgggaact tgcccccaga agctgaacct caaggtgcaa 10920

atgcctttcc agccacttcc tgatgcagac tcgggccccc tgcccactgc agcctttcgg 10980

gctgtgtgac ctcctgaact gtctccgagc ctcctgaggg agcctgggcc cgatgtcctc 11040

ccatggatcc ctgcttttgt ggcctgcttc agtttccctt cttaatgtac atggttgttt 11100

tccatctcca cataaatttg gccccaaatc tgtgtgtgca tcgttattct caagtttcaa 11160

gcagctggaa taaattgaac gcgtctggga aagatca 11197

Claims

1.一种FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述的FcRn蛋白复合物包含B2M蛋白和FcRn蛋白。

2.根据权利要求1所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述的FcRn蛋白复合物包含FcRn蛋白的胞质区、跨膜区和/或胞外区，以及B2M蛋白，优选还包含FcRn蛋白的信号肽，优选不含B2M信号肽。

3.根据权利要求1-2任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，B2M蛋白和FcRn蛋白的氨基酸序列之间直接或间接连接；优选为间接连接，进一步优选采用柔性linker连接，更进一步优选柔性linker连接B2M蛋白与FcRn蛋白的胞外区。

4.根据权利要求1-3任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述的B2M蛋白与FcRn蛋白分别独立来源于人或非人动物，优选的，所述非人动物为啮齿类动物，优选为小鼠或大鼠。

5.根据权利要求1-4任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述的FcRn蛋白复合物表达在非人动物中，优选的，所述的非人动物体内MHC I类分子不表达、功能下降或功能缺失；优选的，所述的非人动物为免疫缺陷的非人动物。

6.根据权利要求1-5任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述FcRn蛋白复合物包含的B2M蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：40所示氨基酸序列的全部或部分；

7.根据权利要求1-6任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述FcRn蛋白复合物包含的FcRn蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：41所示氨基酸序列的全部或部分；

8.根据权利要求1-7任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述FcRn蛋白复合物包含的信号肽的氨基酸序列包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：42所示氨基酸序列的全部或部分；

9.根据权利要求1-8任一所述的FcRn蛋白复合物，其特征在于，所述FcRn蛋白复合物包含下列组中的一种：

a)SEQ ID NO：6所示氨基酸序列的全部或部分；

10.一种嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含B2M基因和FcRn基因。

11.根据权利要求10所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分；优选的，所述的嵌合基因包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列；

或者，所述的嵌合基因包含B2M基因的CDS序列，优选的，不含编码信号肽的CDS序列。

12.根据权利要求10或11所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含FcRn基因的全部或部分，优选的，所述的嵌合基因包含FcRn基因的1号至7号外显子。

13.根据权利要求10-12任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因包含编码FcRn蛋白胞外区、跨膜区和胞质区的核苷酸序列，优选的，所述的嵌合基因还包含编码FcRn蛋白信号肽的核苷酸序列。

14.根据权利要求10-13任一所述的嵌合基因，其特征在于，B2M基因与FcRn基因的核苷酸序列之间直接或间接连接；优选为间接连接，进一步优选采用编码柔性linker的核苷酸序列连接；更进一步优选编码柔性linker的核苷酸序列连接B2M基因与FcRn基因的2号外显子。

15.根据权利要求10-14任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因编码权利要求1-9任一所述的FcRn蛋白复合物。

16.根据权利要求10-15任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的B2M基因与FcRn基因分别独立来源于人或非人动物。

17.根据权利要求10-16任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因中B2M核苷酸序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；

18.根据权利要求10-17任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因的DNA序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：45所示核苷酸序列的全部或部分；

19.根据权利要求10-18任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因转录的mRNA序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

20.根据权利要求10-19任一所述的嵌合基因，其特征在于，所述的嵌合基因中FcRn基因转录的mRNA的核苷酸序列包含下列组中的一种：

(A)SEQ ID NO：43和/或44所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：43和/或44所示核苷酸序列的同一性至少为60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：43和/或44所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)与SEQ ID NO：43和/或44所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

21.一种权利要求10-20任一所述的嵌合基因编码的FcRn蛋白复合物。

22.一种FcRn基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分，优选包含1号至3号外显子的核苷酸序列，进一步优选不含编码信号肽的核苷酸序列，

或者，包含B2M基因的CDS序列，优选不含编码B2M信号肽的CDS序列，

优选的，包含与SEQ ID NO：9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或与SEQ ID NO：9所述核苷酸序列一致。

23.根据权利要求22所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含编码柔性linker的核苷酸序列，优选的，所述的编码柔性linker的核苷酸序列与SEQ ID NO：10具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或与SEQ IDNO：10所述核苷酸序列一致。

24.根据权利要求22或23所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂，其选自非人动物FcRn基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：7至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：7所示；和/或，所述的靶向载体还包含3’臂，其选自非人动物FcRn基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000073.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：8至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：8所示。

25.一种基因修饰非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含B2M基因的核苷酸序列导入至非人动物FcRn基因座，所述的非人动物表达权利要求1-9任一所述的FcRn蛋白复合物或包含权利要求10-20任一所述的嵌合基因。

26.根据权利要求25所述的构建方法，其特征在于，所述的B2M基因的核苷酸序列包含B2M基因的1号至3号外显子的全部或部分；优选的，包含B2M基因的1号外显子的部分、2号外显子的全部和3号外显子的部分，其中，1号外显子的部分至少包含1bp的核苷酸序列，3号外显子的部分至少包含5bp的核苷酸序列；

或者，所述的构建方法包括用包含B2M基因的CDS序列导入非人动物FcRn基因座，优选导入的序列不含编码B2M信号肽的核苷酸；

优选的，包括用包含与SEQ ID NO：9具有至少60％、65％、70％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者SEQ ID NO：9所示核苷酸序列导入非人动物FcRn基因座。

27.根据权利要求25-26任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求22-24任一所述的FcRn基因的靶向载体进行非人动物的构建。

28.根据权利要求25-27任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物内源B2M基因座不编码内源性B2M蛋白或编码的B2M蛋白没有功能。

29.根据权利要求25-28任一所述的构建方法，其特征在于，所述非人动物体内的FcRn蛋白复合物在pH＜6.5条件下与IgG结合。

30.根据权利要求29所述的构建方法，其特征在于，所述IgG是人IgG或内源性IgG。

31.根据权利要求25-30任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物IgG的PK结果符合药代动力学特征。

32.一种多基因修饰的非人动物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(一)提供权利要求25-31任一所述的构建方法获得的非人动物；

33.根据权利要求32所述的构建方法，其特征在于，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因CSF1、CSF2、IL3、IL15、THPO或SIRPA中一种或两种以上的组合修饰的非人动物。

34.根据权利要求1-9任一所述的FcRn蛋白复合物、权利要求10-20任一所述的嵌合基因、权利要求25-31和32-33任一所述的构建方法获得的非人动物，其特征在于，所述的非人动物体内MHC I类分子不表达、功能下降或功能缺失，优选的，所述的非人动物为免疫缺陷的非人动物；进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人动物为啮齿类动物；更优选为免疫缺陷的小鼠或大鼠。

35.一种基因修饰的细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求10-20任一所述的嵌合基因，所述的细胞、组织或者器官表达权利要求1-9任一所述的FcRn蛋白复合物。

36.来源于权利要求1-9任一所述的FcRn蛋白复合物、权利要求10-20任一所述的嵌合基因、权利要求25-31任一所述的构建方法获得的非人动物、权利要求35所述的细胞、组织或器官在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；或者在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在需要涉及人类细胞的免疫过程的生产和利用动物实验疾病模型，用于人源细胞移植、免疫系统重建、病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或者在筛选、验证、评价或研究FcRn通路功能、人FcRn通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。