ES2715949T3 - Animales con IL-15 humanizada - Google Patents
Animales con IL-15 humanizada Download PDFInfo
- Publication number
- ES2715949T3 ES2715949T3 ES16192440T ES16192440T ES2715949T3 ES 2715949 T3 ES2715949 T3 ES 2715949T3 ES 16192440 T ES16192440 T ES 16192440T ES 16192440 T ES16192440 T ES 16192440T ES 2715949 T3 ES2715949 T3 ES 2715949T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- human
- rodent
- gene
- humanized
- protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108090000172 Interleukin-15 Proteins 0.000 title claims abstract description 341
- 102000003812 Interleukin-15 Human genes 0.000 title claims abstract description 269
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 title description 28
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 claims abstract description 207
- 101001055157 Homo sapiens Interleukin-15 Proteins 0.000 claims abstract description 144
- 102000056003 human IL15 Human genes 0.000 claims abstract description 144
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 claims abstract description 59
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 48
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims abstract description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 24
- 101100179540 Homo sapiens IL15 gene Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 41
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 36
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 29
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 28
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 26
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 23
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 16
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 claims description 16
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 14
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 claims description 10
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 claims description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 7
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 98
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 68
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 57
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 38
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 29
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 28
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 27
- 101001055166 Mus musculus Interleukin-15 Proteins 0.000 description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 20
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 19
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 19
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 16
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 16
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 15
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 15
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 15
- 108020005345 3' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 14
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 14
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 13
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 13
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 12
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 108091036414 Polyinosinic:polycytidylic acid Proteins 0.000 description 11
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 11
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 description 10
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 10
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 10
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 9
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 9
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 9
- 231100000753 hepatic injury Toxicity 0.000 description 9
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 8
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 8
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 8
- 206010062049 Lymphocytic infiltration Diseases 0.000 description 8
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 8
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 8
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 8
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 8
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 8
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 8
- 230000001185 psoriatic effect Effects 0.000 description 8
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 8
- 201000004595 synovitis Diseases 0.000 description 8
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 7
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 7
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 7
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 6
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 6
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 5
- 102000004556 Interleukin-15 Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010017535 Interleukin-15 Receptors Proteins 0.000 description 5
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 5
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 5
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 5
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 5
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 101100179545 Mus musculus Il15 gene Proteins 0.000 description 4
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 4
- 210000004436 artificial bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 210000001842 enterocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 4
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000012552 review Methods 0.000 description 4
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 108020003589 5' Untranslated Regions Proteins 0.000 description 3
- 101100193633 Danio rerio rag2 gene Proteins 0.000 description 3
- 241000699729 Muridae Species 0.000 description 3
- 101100193635 Mus musculus Rag2 gene Proteins 0.000 description 3
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 3
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 3
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 102000008616 interleukin-15 receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 108040002039 interleukin-15 receptor activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000009386 Experimental Arthritis Diseases 0.000 description 2
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 2
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 241000398750 Muroidea Species 0.000 description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 description 2
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 2
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000012447 xenograft mouse model Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 238000011714 129 mouse Methods 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000272878 Apodiformes Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 1
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 1
- 241001330002 Bambuseae Species 0.000 description 1
- 241000398949 Calomyscidae Species 0.000 description 1
- 241000700193 Calomyscus Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 241000398985 Cricetidae Species 0.000 description 1
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101001109501 Homo sapiens NKG2-D type II integral membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108020003285 Isocitrate lyase Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 241000234435 Lilium Species 0.000 description 1
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 1
- 241001046461 Lophiomys imhausi Species 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 102100030301 MHC class I polypeptide-related sequence A Human genes 0.000 description 1
- 241000282560 Macaca mulatta Species 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699669 Mus saxicola Species 0.000 description 1
- 241000282341 Mustela putorius furo Species 0.000 description 1
- 102100022680 NKG2-D type II integral membrane protein Human genes 0.000 description 1
- 241000398990 Nesomyidae Species 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 241000009328 Perro Species 0.000 description 1
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 1
- 241001338313 Platacanthomyidae Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 241000121210 Sigmodontinae Species 0.000 description 1
- 241000398956 Spalacidae Species 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000006786 activation induced cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000001042 autoregulative effect Effects 0.000 description 1
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 210000002459 blastocyst Anatomy 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 210000001339 epidermal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000004129 fatty acid metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000011577 humanized mouse model Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000005550 inflammation mediator Substances 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 241001515942 marmosets Species 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000010445 mica Substances 0.000 description 1
- 229910052618 mica group Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000472 morula Anatomy 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 230000029279 positive regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000011435 rock Substances 0.000 description 1
- 201000000306 sarcoidosis Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005313 thymus development Effects 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
- A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/5443—IL-15
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
- A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
- A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
- A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
- C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Un roedor modificado genéticamente cuyo genoma comprende: una sustitución en un locus endógeno de IL-15 de roedor de un fragmento genómico de roedor que codifica para el polipéptido maduro de IL-15 de roedor con un fragmento genómico del gen de IL-15 humana que codifica para el polipéptido maduro de IL-15 humana para formar un gen de IL-15 humanizada, en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones no codificantes de proteína IL-15 de roedor y regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína del gen de IL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
Description
DESCRIPCIÓN
Animales con IL-15 humanizada
Campo de la invención
Animales no humanos que comprenden en su línea germinal un locus endógeno humanizado de IL-15 no humana. Animales no humanos que comprenden en su línea germinal una secuencia que codifica una IL-15 humanizada bajo el control de elementos reguladores no humanos endógenos. Animales no humanos (por ejemplo, mamíferos, por ejemplo, roedores tales como ratones, ratas, y hámsteres) que comprenden una modificación genética; dicha modificación genética comprende una sustitución, en un locus endógeno, de una secuencia génica de IL-15 no humana con una secuencia génica de IL-15 humana o humanizada. Roedores y otros animales no humanos que expresan IL-15 humana o humanizada a partir de un locus endógeno modificado de IL-15 no humana. Animales no humanos que expresan IL-15 humana o humanizada bajo el control de un promotor y/o secuencias reguladoras de IL-15 no humana.
Antecedentes de la invención
En la técnica se conocen ratones transgénicos con transgenes insertados aleatoriamente que contienen una secuencia de IL-15 humana. Sin embargo, los ratones transgénicos que expresan IL-15 humana a partir de transgenes integrados aleatoriamente no son óptimos en un aspecto u otro. Por ejemplo, la mayoría de los ratones transgénicos para la IL-15 humana exhiben niveles y/o relaciones anormales de ciertas células, que incluyen linfocitos (por ejemplo, células T), debido, probablemente, a una desregulación de la función de las células inmunológicas. Tales ratones exhiben, además, una panoplia de patologías, debido, presumiblemente, en última instancia a una desregulación de la IL-15 transgénica. Esta desregulación puede ser el resultado, por ejemplo, de la ausencia de elementos de control endógenos, y/o la colocación de la secuencia de IL-15 humana lejos del locus endógeno de IL-15.
En la técnica aún existe la necesidad de animales no humanos que comprendan secuencias que codifican IL-15 humana, en donde las secuencias que codifican IL-15 humana se encuentren en un locus endógeno de IL-15 no humano, y/o estén bajo el control regulador de elementos endógenos de IL-15 no humana (por ejemplo, regiones no codificantes corriente arriba y/o corriente abajo). En la técnica existe la necesidad de animales no humanos que expresen IL-15 humana bajo el control de elementos reguladores no humanos endógenos. En la técnica existe la necesidad de animales no humanos que expresen IL-15 humana de una manera que sea relevante fisiológicamente en el animal no humano. En la técnica existe la necesidad de animales no humanos que expresen una IL-15 humana, en donde los animales no humanos carecen de una anomalía significativa en poblaciones de linfocitos, por ejemplo, en poblaciones de células T. Además, en la técnica existe la necesidad de animales no humanos que expresen IL-15 humana o humanizada, y que carezcan de una o más de las patologías que exhiben los animales no humanos que son transgénicos para la IL-15 humana. Marks-Konczalik y otros (PNAS 97(21): 11445-11450 (2000)) describe que la muerte celular inducida por la activación que se induce por IL-2 se encuentra inhibida en ratones transgénicos para IL-15. El documento WO01/58914 describe haplotipos del gen de IL-5. Devoy y otros (Nat. Rev. Genetics, 13: 14-20 (2012)) describe ratones genómicamente humanizados. Bamford y otros (J. Immunol. 160(9): 4418-4426 (1998) describe que la región 5' no traducida, péptido señal, y la secuencia codificante del extremo carboxi de IL-15 participa en su control traduccional multifacético.
Sumario
La invención proporciona un roedor modificado genéticamente cuyo genoma comprende: una sustitución en un locus de IL-15 endógeno de roedor de un fragmento genómico de roedor que codifica para el polipéptido de IL-15 maduro de roedor con un fragmento genómico del gen de IL-15 humana que codifica para el polipéptido de IL-15 maduro humano para formar un gen de IL-15 humanizada, en donde el gen de IL-15 humanizada comprende todos los exones no codificantes de proteína IL-15 de roedor y regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína del gen de IL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
La invención además proporciona un método para producir un roedor modificado genéticamente, que comprende: modificar el genoma de un roedor mediante la sustitución de un fragmento genómico de roedor que codifica para el polipéptido maduro de IL-15 de roedor en el locus endógeno de IL-15 de roedor con un fragmento genómico del gen de IL-15 humana que codifica para el polipéptido maduro de IL-15 humana, para formar un gen de IL-15 humanizada, en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones no codificantes de proteína IL-15 de roedor y regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína de un gen de IL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
La invención además proporciona un roedor modificado genéticamente cuyo genoma comprende un gen de IL-15 humanizada, en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones de IL-15 humana que codifican proteína
madura que codifican una proteína que comprende la secuencia del polipéptido maduro de IL-15 humana, y en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones no codificantes de proteína IL-15 de roedor y regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína de un gen de IL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
La invención además proporciona un método para producir un roedor modificado genéticamente, que comprende introducir un gen de IL-15 humanizada en un genoma de roedor, en donde el gen de IL-15 humanizada comprende exones de IL-15 humanas que codifican proteínas maduras, en donde el gen de IL-15 humanizada codifica una proteína que comprende la secuencia del polipéptido maduro de IL-15 humana, y en donde el gen de IL-15 humanizada comprende todos los exones que no codifican la proteína IL-15 de roedor y las regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína del gen de iL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
La invención además proporciona un método para identificar un agente que es un antagonista de IL-15 humana, que comprende determinar un efecto del agente en una función mediada por IL-15 humana cuando se administra a un roedor modificado genéticamente como se define en la invención, e identificar el agente como un antagonista de IL-15 si antagoniza la función de IL-15 humana en el roedor modificado genéticamente.
La invención además proporciona un método para determinar si un agente reduce el desarrollo de linfocitos mediado por IL-15, que comprende medir el número de linfocitos de un roedor en uno o más puntos de tiempo seguido de la administración del agente al roedor, y determinar si el agente reduce la población de linfocitos, en donde dicho roedor es un roedor modificado genéticamente como se define en la invención.
La invención además proporciona un método para determinar si un agente reduce la infiltración de linfocitos mediada por IL-15 de un tejido o articulación, que comprende medir la infiltración de linfocitos del tejido o la articulación en uno o más puntos de tiempo seguido de la administración del agente a un roedor modificado genéticamente como se define en la invención en un período de tiempo, y determinar si el agente reduce la infiltración de linfocitos del tejido o la articulación.
La invención además proporciona un método para determinar si un agente reduce progresión artrítica mediada por IL-15, que comprende determinar si el agente afecta la progresión artrítica cuando se administra durante un período de tiempo a un roedor modificado genéticamente como se define en la invención y que comprende además una artritis inducida, en donde dicha determinación comprende medir la progresión artrítica en el roedor modificado genéticamente.
Se describen organismos no humanos modificados genéticamente que comprenden un locus de IL-15 humanizada. Se describen organismos no humanos que comprenden un gen de IL-15 humanizada, en donde el gen de IL-15 humanizada está bajo el control de uno o más elementos reguladores no humanos endógenos. Se describen organismos no humanos que comprenden un gen de IL-15 humanizada en un locus endógeno de IL-15 no humano. Se describen organismos no humanos que comprenden un locus endógeno de IL-15 humanizada que es capaz de transferirse a través de la línea germinal de los organismos. Se describen animales no humanos, por ejemplo, mamíferos (por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas) que expresan IL-15 humana a partir de un locus endógeno de IL-15 modificado, en donde la lL-15 expresada es completamente o parcialmente humana.
Se describen animales, embriones, células, tejidos, y ácidos nucleicos no humanos modificados genéticamente, que comprenden una secuencia genómica de IL-15 humana regulada por un control regulador de IL-15 no humana. Los animales no humanos expresan una proteína IL-15 humanizada, o una proteína IL-15 completamente humana (por ejemplo, una proteína IL-15 madura completamente humana), y no exhiben una o más de las patologías de los animales no humanos transgénicos para la IL-15 humana que se conocen en la técnica. Los animales no humanos pueden ser mamíferos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, etcétera. El mamífero puede ser un roedor; el roedor puede ser un ratón o una rata.
Se describen animales, embriones, células, tejidos, y ácidos nucleicos no humanos modificados genéticamente, que comprenden una secuencia genómica de IL-15 humana en un locus endógeno de IL-15 no humano. Los animales no humanos expresan una proteína IL-15 humanizada, o una proteína IL-15 completamente humana (por ejemplo, una proteína IL-15 madura completamente humana), a partir de un locus no humano endógeno modificado regulado por una o más secuencias reguladoras no humanas endógenas del locus endógeno de IL-15 modificado, y no exhiben una o más de las patologías de los animales no humanos transgénicos para la IL-15 humana que se conocen en la técnica. Los animales no humanos pueden ser mamíferos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones, ratas, hámsteres, etcétera. El mamífero puede ser un roedor; el roedor puede ser un ratón o una rata.
Los animales no humanos pueden comprender un locus de IL-15 modificado en el genoma del animal no humano de manera que el locus de IL-15 modificado es capaz de transferirse a través de la línea germinal, en donde el locus endógeno de IL-15 modificado comprende una humanización de al menos una porción codificante de proteína madura
del locus endógeno de IL-15. Los animales no humanos pueden ser mamíferos. Los mamíferos pueden ser roedores, y los roedores son heterocigotos u homocigotos con respecto al locus de IL-15 modificado. Los roedores pueden seleccionarse de ratones y ratas. Los ratones y ratas pueden ser homocigotos para el locus de IL-15 modificado, y son incapaces de expresar una proteína IL-15 endógena que sea completamente de ratón o completamente de rata, y los ratones y ratas expresan una proteína IL-15 humana madura.
Se describe un animal no humano que comprende un primer alelo de IL-15 silvestre endógeno, y una humanización de un segundo alelo de IL-15 endógeno.
Se describe un animal no humano que comprende una carencia de un primer alelo de IL-15 endógeno y una humanización de un segundo alelo de IL-15 endógeno.
Se describe un animal no humano que comprende una carencia de un alelo de IL-15 endógeno funcional, y comprende al menos una copia de un alelo de iL-15 humanizada bajo el control de elementos reguladores no humanos endógenos. La al menos una copia de un alelo de IL-15 humanizada puede estar en un locus endógeno de IL-15.
La humanización puede ser de uno o más exones y/o intrones en el locus endógeno de IL-15 no humano. Se describen animales no humanos que tienen un locus de IL-15 modificado en donde una región 5' no traducida endógena no humana o una región 3' no traducida endógena no humana, o ambas, se conservan en el animal no humano modificado.
La humanización del locus endógeno de IL-15 no humano puede ser con una región codificante (o fragmento de esta) que es un fragmento genómico de un locus de IL-15 humana que comprende al menos un exón codificante de la proteína IL-15 humana.
La humanización del locus endógeno de IL-15 no humano puede ser con una región codificante que es un fragmento genómico de un locus de IL-15 humana que comprende cada exón codificante de la proteína IL-15 humana, pero no comprende un exón codificante de la proteína IL-15 no humana.
El locus de IL-15 que comprende el fragmento genómico humano puede dar como resultado la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana. La humanización del locus endógeno de IL-15 no humano puede ser con un ADNc que codifica una proteína IL-15 humana, de manera que tras el procesamiento en el animal no humano la proteína IL-15 madura producida por el locus humanizado es completamente humana.
Se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende un locus endógeno de IL-15 humanizada en su totalidad o en parte, en donde el locus de IL-15 humanizada comprende un gen que codifica IL-15 humanizada que está bajo el control de elementos reguladores no humanos endógenos. Los elementos reguladores no humanos endógenos pueden comprender todos los elementos reguladores endógenos de IL-15 corriente arriba (con respecto a la dirección transcripcional del gen de IL-15) de la primera región codificante de proteína o exón del gen de IL-15 humanizada. Los elementos reguladores no humanos endógenos pueden comprender todos los elementos reguladores endógenos de IL-15 corriente abajo (con respecto a la dirección transcripcional del gen de IL-15) de la última región codificante de proteína o exón en el gen de IL-15 humanizada. El gen que codifica IL-15 humanizada puede comprender una región 3'UTR humana.
Se describe un roedor modificado genéticamente que comprende una sustitución en un locus endógeno de IL-15 de roedor de una secuencia genómica endógena de lL-15 de roedor con una secuencia genómica de IL-15 humana. La modificación genética puede ser en la línea germinal del animal no humano.
El roedor modificado genéticamente puede comprender una primera secuencia reguladora de roedor corriente arriba (con respecto a la dirección de la transcripción del gen de IL-15) de la secuencia genómica de IL-15 humana y una segunda secuencia reguladora de roedor corriente abajo de la secuencia genómica de IL-15 humana. La primera secuencia reguladora de roedor puede comprender un promotor y/o un potenciador de roedor, y la segunda secuencia reguladora de roedor puede comprender una región 3'-UTR.
Se describe un animal no humano modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada.
Se describe un ratón modificado genéticamente que comprende una sustitución en un locus endógeno de IL-15 de ratón de una secuencia genómica endógena de IL-15 de ratón (o fragmento de esta) con una secuencia genómica de IL-15 humana (o fragmento de esta) para formar un locus modificado, en donde la secuencia genómica de IL-15 humana comprende al menos un exón codificante de la proteína humana.
La sustitución puede comprender un fragmento genómico humano que comprende al menos dos exones codificantes de la proteína IL-15 humana. La sustitución puede comprender un fragmento genómico humano que comprende al menos tres exones codificantes de la proteína IL-15 humana. La sustitución puede comprender un fragmento genómico humano que comprende al menos cuatro exones codificantes de la proteína IL-15 humana. La sustitución puede comprender un fragmento genómico humano que comprende los exones 3, 4, 5 y 6 codificantes de la proteína IL-15
humana. La sustitución puede comprender menos que todos los exones de IL-15 humana, en donde los exones humanos de la sustitución consisten en los cuatro exones codificantes de proteína del gen de IL-15 humana ubicados más corriente abajo (con respecto a la dirección de la transcripción del gen de IL-15). La sustitución puede consistir esencialmente en un fragmento genómico humano que contiene no más de cuatro exones codificantes de la proteína IL-15 humana. Además, la sustitución puede consistir esencialmente en una secuencia intrónica humana corriente arriba del exón humano más cercano al extremo 5' y una secuencia humana no codificante de proteína corriente abajo del codón de parada humano y corriente abajo de la región 3'UTR humana.
Se describe un ratón modificado genéticamente que comprende un locus de IL-15 humanizada, en donde el locus de IL-15 humanizada comprende exones de ratón no codificantes de proteína, en donde cada exón de ratón codificante de proteína (madura) se sustituye con exones humanos codificantes de proteína (madura). El locus de IL-15 humanizada puede comprender una sustitución de un fragmento genómico de ratón que codifica secuencias de la proteína IL-15 de ratón madura (es decir, no preproteína) con un fragmento genómico humano que codifica secuencias de la proteína IL-15 humana madura (es decir, no preproteína).
Se describe un ratón modificado genéticamente que comprende una secuencia que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica, o es idéntica, a la SEQ ID NO: 5.
Se describe un ratón modificado genéticamente que comprende una secuencia que es al menos 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o 99 % idéntica, o es idéntica, a la SEQ ID NO: 5; en donde el ratón carece de una secuencia endógena que codifica los exones 3 a 6 de una proteína IL-15 de ratón como se representa en la presente descripción, y el ratón comprende una secuencia de ácido nucleico en un locus endógeno de IL-15 de ratón en donde la secuencia de ácido nucleico codifica los exones 3, 4, 5, y 6 de la IL-15 humana como se representa en la presente descripción.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada a partir de un locus endógeno de IL-15 de ratón que se modifica para comprender al menos un exón de IL-15 humana que codifica aminoácidos en una proteína IL-15 humana madura. En una modalidad, el locus endógeno de IL-15 de roedor comprende al menos dos exones de IL-15 humana que codifican aminoácidos en una proteína IL-15 humana madura. El locus endógeno de IL-15 de roedor puede comprender al menos tres exones de IL-15 humana que codifican aminoácidos en una proteína IL-15 humana madura. El locus endógeno de IL-15 de roedor puede comprender al menos cuatro exones de IL-15 humana que codifican aminoácidos en una proteína IL-15 humana madura. El roedor endógeno puede comprender los exones 3, 4, 5 y 6 de IL-15 humana que codifican aminoácidos en una proteína IL-15 humana madura. El locus endógeno de IL-15 de roedor puede comprender toda la secuencia de ácido nucleico humana que codifica aminoácidos en una proteína IL-15 humana madura.
La humanización puede comprender una región 3'UTR de IL-15 humana. El locus de roedor puede comprender al menos un exón que no codifica aminoácidos de una proteína IL-15 madura o al menos un exón que incluye una secuencia de nucleótidos que no codifica aminoácidos de una proteína IL-15 madura. El locus de roedor puede comprender al menos dos exones que no codifican aminoácidos de una proteína IL-15 madura. El locus de roedor puede comprender al menos tres exones que no codifican aminoácidos de una proteína IL-15 madura. El locus de roedor puede comprender cuatro exones que no codifican aminoácidos de una proteína IL-15 madura.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde la población de linfocitos del roedor se caracteriza por su población de células T que es aproximadamente igual en cantidad a una población de células T en un ratón silvestre de la misma edad. El roedor modificado puede caracterizarse por una población de células T maduras que es aproximadamente igual en cantidad a una población de células T maduras en un ratón silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde la población de linfocitos del roedor se caracteriza por una población de células T que es aproximadamente igual en cantidad a una población de células T en un ratón silvestre de la misma edad. El roedor modificado puede exhibir una población de células T maduras que es aproximadamente igual en cantidad a una población de células T maduras en un ratón silvestre de la misma edad. El roedor modificado puede exhibir una población de células T periféricas que es aproximadamente igual en cantidad a la población de células T periféricas en un ratón silvestre de la misma edad. La proteína IL-15 humanizada madura puede ser idéntica a una proteína IL-15 humana madura.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde la población de linfocitos del roedor se caracteriza por una población de células T que exhibe una relación CD4:CD8 que es aproximadamente igual a la relación CD4:CD8 en la población de células T de un ratón silvestre de la misma edad. La proteína IL-15 humanizada puede ser idéntica a una proteína IL-15 humana.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde la población de linfocitos del roedor se caracteriza por una población de células asesinas naturales (NK) que es aproximadamente igual en tamaño a una población de células n K de un ratón silvestre de la misma edad. La proteína iL-15 humanizada puede ser idéntica a una proteína IL-15 humana.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada, en donde la población de linfocitos del roedor se caracteriza por una población de células T y una población de células NK que son cada una de ellas aproximadamente iguales en tamaño a una población de células T y a una población de células NK en un ratón silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no desarrolla inflamación intestinal espontánea. El roedor puede no mostrar una tendencia a desarrollar inflamación intestinal más que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no desarrolla inflamación espontánea en la zona duodeno yeyunal. El roedor puede no mostrar una tendencia a desarrollar inflamación en la zona duodeno yeyunal más que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no exhibe una destrucción del epitelio intestinal mayor que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no exhibe enfermedad celíaca a una tasa o frecuencia mayor que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no exhibe una mayor resistencia a la adiposidad inducida por la dieta, y no exhibe una mayor sensibilidad a la insulina, que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde tras la infección con un patógeno el roedor no es más susceptible a la lesión hepática letal inducida por lipopolisacáridos que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no desarrolla lesiones psoriásicas a una tasa o frecuencia mayor que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no desarrolla artritis a una tasa o frecuencia mayor que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no desarrolla infiltración linfocitaria de las articulaciones a una tasa o frecuencia mayor que un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humanizada, en donde el roedor no desarrolla sinovitis inflamatoria a una tasa mayor que un roedor control silvestre de la misma edad.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada, en donde el roedor no desarrolla una o más patologías a una tasa o frecuencia mayor que la de un roedor silvestre de la misma edad, en donde la una o más patologías se seleccionan del grupo que consiste en artritis, infiltración linfocitaria de las articulaciones, sinovitis inflamatoria, lesiones psoriásicas, lesión hepática letal inducida por lipopolisacáridos asociada a patógenos, una resistencia a la insulina, una resistencia a la adiposidad inducida por la dieta, inflamación intestinal espontánea, inflamación espontánea en la zona duodeno yeyunal, destrucción del epitelio intestinal, enfermedad celíaca, y una combinación de estas.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada, en donde el roedor no desarrolla dos o más patologías a una tasa o frecuencia mayor que la de un roedor silvestre de la misma edad, en donde las dos o más patologías se seleccionan del grupo que consiste en artritis, infiltración linfocitaria de las articulaciones, sinovitis inflamatoria, lesiones psoriásicas, lesión hepática letal inducida por lipopolisacáridos asociada a patógenos, una resistencia a la insulina, una resistencia a la adiposidad inducida por la dieta, inflamación intestinal espontánea, inflamación espontánea en la zona duodeno yeyunal, destrucción del epitelio intestinal, y enfermedad celíaca.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada, en donde el roedor no desarrolla tres o más patologías a una tasa o frecuencia mayor que la de un roedor silvestre de la misma edad, en donde las tres o más patologías se seleccionan del grupo que consiste en artritis, infiltración linfocitaria de las articulaciones, sinovitis inflamatoria, lesiones psoriásicas, lesión hepática letal inducida por lipopolisacáridos asociada a patógenos, una resistencia a la insulina, una resistencia a la adiposidad inducida por la dieta, inflamación intestinal espontánea, inflamación espontánea en la zona duodeno yeyunal, destrucción del epitelio intestinal, y enfermedad celíaca.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada, en donde el roedor no desarrolla cuatro o más patologías a una tasa o frecuencia mayor que la de un roedor silvestre de la misma
edad, en donde las cuatro o más patologías se seleccionan del grupo que consiste en artritis, infiltración linfocitaria de las articulaciones, sinovitis inflamatoria, lesiones psoriásicas, lesión hepática letal inducida por lipopolisacáridos asociada a patógenos, una resistencia a la insulina, una resistencia a la adiposidad inducida por la dieta, inflamación intestinal espontánea, inflamación espontánea en la zona duodeno yeyunal, destrucción del epitelio intestinal, y enfermedad celíaca.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada, en donde el roedor no desarrolla cinco o más patologías a una tasa o frecuencia mayor que la de un roedor silvestre de la misma edad, en donde las cinco o más patologías se seleccionan del grupo que consiste en artritis, infiltración linfocitaria de las articulaciones, sinovitis inflamatoria, lesiones psoriásicas, lesión hepática letal inducida por lipopolisacáridos asociada a patógenos, una resistencia a la insulina, una resistencia a la adiposidad inducida por la dieta, inflamación intestinal espontánea, inflamación espontánea en la zona duodeno yeyunal, destrucción del epitelio intestinal, y enfermedad celíaca.
Se describe un roedor modificado genéticamente que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada, en donde el roedor no desarrolla seis o más patologías a una tasa o frecuencia mayor que la de un roedor silvestre de la misma edad, en donde las seis o más patologías se seleccionan del grupo que consiste en artritis, infiltración linfocitaria de las articulaciones, sinovitis inflamatoria, lesiones psoriásicas, lesión hepática letal inducida por lipopolisacáridos asociada a patógenos, una resistencia a la insulina, una resistencia a la adiposidad inducida por la dieta, inflamación intestinal espontánea, inflamación espontánea en la zona duodeno yeyunal, destrucción del epitelio intestinal, y enfermedad celíaca.
Se describe un animal no humano modificado genéticamente que comprende una humanización de un locus endógeno de IL-15, en donde el animal expresa una proteína IL-15 madura parcialmente o completamente humana, y en donde la proteína IL-15 madura parcialmente o completamente humana se expresa a niveles comparables y en los mismos tejidos que una proteína IL-15 endógena en un animal silvestre de la misma edad.
Se describe un vector de transformación grande (LTVEC) que comprende brazos de homología a un locus endógeno de IL-15 no humano, en donde el LTVEC comprende, dispuesto entre dichos brazos de homología, un fragmento genómico humano contiguo que comprende exones codificantes de proteína de un gen de IL-15 humana. El fragmento genómico humano contiguo puede no comprender exones no codificantes de proteína de un locus de IL-15 humana. El fragmento genómico humano contiguo puede comprender, además, una región 3'UTR humana de un gen de IL-15.
Se describe un constructo de ácido nucleico (por ejemplo, ADN), que comprende de 5' a 3' con respecto a la dirección de la transcripción, una secuencia de ácido nucleico homóloga a una secuencia no codificante en 5' de IL-15 de ratón, un fragmento genómico humano que comprende exones codificantes de la proteína IL-15 humana pero que no comprende una secuencia reguladora humana corriente arriba con respecto a la secuencia que codifica la proteína IL-15 humana, y una secuencia de ácido nucleico homóloga a una secuencia no codificante en 3' de IL-15 de ratón. El fragmento genómico humano puede comprender, además, una región 3'UTR de IL-15 humana.
Se describe un constructo de ácido nucleico (por ejemplo, ADN), que comprende de 5' a 3' con respecto a la dirección de la transcripción, una secuencia de ácido nucleico que comprende una región de homología a secuencias génicas de IL-15 de ratón corriente arriba del primer exón codificante de la proteína IL-15 de ratón, un fragmento genómico humano que codifica una proteína IL-15 humana pero que no comprende una secuencia reguladora humana corriente arriba de la secuencia que codifica la proteína IL-15 humana, y una secuencia de ácido nucleico homóloga a una secuencia no codificante en 3' de IL-15 de ratón. El fragmento genómico humano puede comprender, además, una región 3'UTR de IL-15 humana.
Se describe una célula no humana modificada genéticamente, en donde la célula no humana comprende una sustitución en un locus endógeno de IL-15 no humano de una secuencia génica que codifica una IL-15 no humana con una secuencia genómica humana que codifica una IL-15 humana.
La secuencia genómica humana puede comprender una secuencia de ácido nucleico humana contigua que abarca todos los exones codificantes de proteína del gen de IL-15 humana.
El roedor modificado genéticamente puede comprender un promotor de IL-15 no humano en el locus endógeno de IL-15 no humano.
El animal no humano modificado genéticamente puede comprender todos los exones no codificantes de proteína de roedor y las regiones reguladoras corriente arriba del primer exón codificante de proteína del gen de IL-15 de roedor.
La célula puede seleccionarse de una célula pluripotente, una célula pluripotente inducida, una célula totipotente, una célula ES, una célula somática, y un óvulo.
La célula puede expresar la proteína IL-15 humana.
El animal no humano puede ser un mamífero. El mamífero puede ser un roedor. El roedor puede seleccionarse de un ratón y una rata.
Se describe un embrión no humano, en donde el embrión comprende al menos una célula donante no humana (por ejemplo, una célula ES, una célula pluripotente, una célula totipotente, etcétera) que comprende una sustitución de una secuencia de ácido nucleico endógena que codifica IL-15 no humana con una secuencia de ácido nucleico que codifica IL-15 humana en un locus endógeno de IL-15 no humano. La célula donante puede ser una célula ES no humana y el embrión es un embrión de un animal no humano huésped que es una premórula, una mórula, o un blastocisto.
El embrión no humano puede ser un embrión de rata, y la al menos una célula donante no humana es una célula de rata. La célula ES no humana puede ser una célula ES de rata y el embrión huésped es un embrión de rata.
El embrión no humano puede ser un embrión de ratón, y la al menos una célula donante no humana es una célula de ratón. La célula ES no humana puede ser una célula ES de ratón y el embrión huésped es un embrión de ratón.
Se describe un tejido de roedor que comprende un gen de IL-15 humanizada en un locus endógeno de IL-15 de roedor. El tejido puede seleccionarse de tejido epitelial, tejido de la piel, y tejido muscular.
Se describe un roedor modificado genéticamente que comprende una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica una proteína IL-15 humana, en donde el roedor no expresa una IL-15 de roedor, y en donde el roedor exhibe una población de células NK que es aproximadamente igual en tamaño a una población de células NK de un roedor silvestre. El roedor puede ser una rata. El roedor puede ser un ratón.
El roedor puede exhibir una población de células T periféricas que es aproximadamente igual en tamaño a una población de células T periféricas de un roedor silvestre de la misma edad.
Se describe un método para producir un animal no humano que expresa una proteína IL-15 humana o humanizada; el método comprende modificar genéticamente un animal no humano como se describe en la presente descripción para formar una secuencia de ácido nucleico en el animal no humano que comprende una secuencia de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifica una proteína IL-15 humana o humanizada, en donde la secuencia de ácido nucleico está bajo el control de elementos reguladores endógenos no humanos corriente arriba y corriente abajo.
El animal no humano puede modificarse genéticamente mediante la sustitución de una secuencia genómica de IL-15 endógena (o fragmento de esta), en un locus endógeno de IL-15, con una secuencia genómica de IL-15 humana (o fragmento de esta) para formar un locus modificado, en donde la secuencia genómica de IL-15 humana comprende al menos un exón codificante de la proteína humana. La sustitución puede comprender un fragmento genómico humano que comprende al menos dos exones codificantes de la proteína IL-15 humana. La sustitución puede comprender un fragmento genómico humano que comprende al menos tres exones codificantes de la proteína IL-15 humana. La sustitución puede comprender un fragmento genómico humano que comprende al menos cuatro exones codificantes de la proteína IL-15 humana. En una modalidad específica, la sustitución comprende un fragmento genómico humano que comprende los exones 3, 4, 5 y 6 codificantes de la proteína IL-15 humana. La sustitución puede comprender, además, una secuencia no codificante de proteína humana corriente abajo del codón de parada humano (por ejemplo, la región 3'UTR humana).
El animal no humano puede producirse a partir de una célula pluripotente o totipotente (por ejemplo, una célula ES). El animal no humano puede producirse mediante el empleo de una etapa de inyección nuclear en donde un constructo de ácido nucleico que comprende el gen de IL-15 humanizada (opcionalmente con secuencias reguladoras no humanas endógenas corriente arriba y/o corriente abajo) se introduce por inyección pronuclear. El constructo de ácido nucleico puede comprender un fragmento genómico humano que comprende los exones 3, 4, 5 y 6 codificantes de la proteína IL-15 humana. El constructo de ácido nucleico puede comprender, además, una secuencia no codificante de proteína humana corriente abajo del codón de parada humano (por ejemplo, la región 3'UTR humana). El animal no humano puede producirse mediante el empleo de un fibroblasto no humano modificado genéticamente con un gen de IL-15 humana o humanizado y (opcionalmente) elementos reguladores de IL-15 no humana corriente arriba y/o corriente abajo.
Se describe un método para identificar un agente que es un antagonista de la IL-15 humana; el método comprende una etapa de administrar un agente a un roedor modificado genéticamente como se describe en la presente descripción, determinar un efecto del agente sobre una función mediada por la IL-15 humana en el roedor, e identificar el agente como un antagonista de IL-15 si este antagoniza la función de la IL-15 humana en el roedor modificado genéticamente.
El agente puede comprender un dominio variable de inmunoglobulina que se une a IL-15. El agente puede unirse específicamente a la IL-15 humana pero no a la IL-15 de roedor. El agente puede ser un anticuerpo.
Se describe un método para determinar si un agente reduce el desarrollo linfocitario mediado por IL-15; el método comprende una etapa de administrar a un roedor modificado genéticamente como se describe en la presente descripción un antagonista de IL-15 durante un período de tiempo, medir la cantidad de linfocitos del roedor en uno o más puntos de tiempo después de la administración, y determinar si el antagonista de IL-15 reduce la población de linfocitos.
Se describe un método para determinar si un agente reduce la infiltración linfocitaria mediada por IL-15 de un tejido o una articulación; el método comprende una etapa de administrar a un roedor modificado genéticamente como se describe en la presente descripción un antagonista de IL-15 durante un período de tiempo, medir la infiltración linfocitaria del tejido o la articulación en uno o más puntos de tiempo después de la administración, y determinar si el antagonista de IL-15 reduce la infiltración linfocitaria del tejido o la articulación.
Se describe un método para determinar si un agente reduce la progresión de la artritis mediada por IL-15; el método comprende una etapa de administrar a un roedor modificado genéticamente como se describe en la presente descripción, y que comprende, además, una artritis inducida, un antagonista de IL-15 durante un período de tiempo, medir la progresión de la artritis, y determinar si el antagonista de IL-15 afecta la progresión de la artritis en el roedor.
A menos que se indique de cualquier otra manera, o resulte evidente en el contexto, dos o más aspectos y/o modalidades pueden combinarse.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 representa (no a escala) un esquema de un locus génico de IL-15 de ratón silvestre (parte superior) y un locus endógeno humanizado de IL-15 de ratón (parte inferior). Los símbolos abiertos indican secuencia humana; los símbolos cerrados indican secuencia de ratón; los elementos punteados indican regiones no traducidas. Los exones no codificantes corriente arriba (a la izquierda en la figura) del gen de IL-15 de ratón no se muestran (y no se humanizaron). El constructo inferior representa una modalidad de un gen de IL-15 humanizada que comprende una región 3'UTR humanizada (punteada) y un casete para la selección con fármacos extraíble, que se extrae, opcionalmente, en el animal humanizado.
La Figura 2 es una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 1) que representa la unión corriente arriba (con respecto a la dirección de la transcripción del gen de IL-15) entre la secuencia de ratón y la secuencia humana; la secuencia mostrada comienza con una secuencia de ratón en mayúsculas, seguida de un sitio de restricción Asisl en minúsculas, seguido de la secuencia de ácido nucleico de IL-15 humana en mayúsculas. Los puntos suspensivos indican que la secuencia continúa corriente arriba y corriente abajo de la secuencia mostrada.
La Figura 3 es una modalidad de una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 2) que indica la secuencia codificante y no codificante de IL-15 humana corriente abajo en mayúsculas (región 3'UTR humana subrayada), seguida de un sitio Xhol en minúsculas, seguido de un sitio lox (mayúsculas, subrayado), seguido de una secuencia del casete de selección con Neo corriente abajo (mayúsculas), que se extiende 2.6 kb corriente abajo.
La Figura 4 es una secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 3) que representa la unión entre la porción corriente abajo del casete de selección con Neo (mayúsculas), con un sitio lox (mayúsculas y subrayado), seguido de un sitio Nhel (minúsculas), al que le sigue la secuencia de ratón corriente abajo de la humanización (mayúsculas); el 2.6 kb indica que el casete de selección se extiende aún más corriente arriba; los puntos suspensivos indican que la secuencia continúa.
La Figura 5 representa un alineamiento de las secuencias de proteína para la proteína precursora de IL-15 de ratón (parte superior, “mlL15_precursor”, SEQ ID NO: 4); la proteína precursora de IL-15 de ratón/humana híbrida (parte media, “Regn_Hybrid_m/h”, SEQ ID NO: 5) producida por una humanización del locus representado en la Figura 1; y la preproproteína de la isoforma 1 de la IL-15 humana conocida (parte inferior, “hIL15 isoforma 1”, SEQ ID NO: 6); la unión resultante de la humanización como se representa en la Figura 1 se indica mediante una flecha vertical que indica a C como el primer aminoácido de la sustitución; el inicio de la proteína IL-15h madura se indica mediante la flecha curvada en el primer aminoácido N.
La Figura 6 representa la IL-15 detectada en suero de ratones heterocigotos para IL-15h inyectados con poli I:C. El control indica que no se detectó IL-15h en esplenocitos cultivados a partir de ratones silvestres inyectados con poli I:C.
La Figura 7 representa que la IL-15 humana no reacciona con la IL-15 de ratón o poli I:C en un ensayo ELISA. La IL-15 de ratón estaba a 1000 pg/ml.
La Figura 8 representa BM-DC de ratones heterocigotos para IL-15 humana, con el uso de sobrenadantes de BM-DC concentrados 7 veces para ratones no tratados, ratones tratados con poli I:C, y ratones tratados con LPS.
La Figura 9 representa que las BM-DC de ratones heterocigotos para IL-15 humana producen el transcrito de IL-15 humana (datos de RT-PCR). Carril 1: ratones no tratados; Carril 2: ratones tratados con poli I:C; Carril 3: LPS solo; Carril 4: ratones silvestres no tratados; Carril 5: ratones silvestres tratados con poli I:C; Carril 6: ratones silvestres tratados con LPS; Carril 7: control sin ADNc (agua sola).
La Figura 10 representa que los ratones MAID 5218 heterocigotos produjeron IL-15 humana tras la inyección de poli I:C a un nivel comparable al de los ratones MAID 5217 heterocigotos.
Descripción detallada de la invención
Se describen organismos no humanos modificados genéticamente que comprenden un locus endógeno de IL-15 modificado que comprende una secuencia humana, por ejemplo, una sustitución de una o más secuencias no humanas con una o más secuencias humanas. Generalmente, los organismos son capaces de transferir la modificación a la progenie, es decir, a través de la transmisión de la línea germinal. Particularmente, se describen animales no humanos modificados genéticamente.
El animal no humano modificado genéticamente puede seleccionarse de un grupo que consiste en un ratón, rata, conejo, cerdo, bovino (por ejemplo, vaca, toro, búfalo), ciervo, oveja, cabra, pollo, gato, perro, hurón, primates (por ejemplo, tití, mono rhesus). Para los animales no humanos donde las células ES modificables genéticamente no están disponibles fácilmente, se emplean otros métodos para producir un animal no humano que comprende la modificación genética. Tales métodos incluyen, por ejemplo, modificar el genoma de una célula que no es ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear la transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito, y gestar la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrión.
El animal no humano puede ser un mamífero. El animal no humano puede ser un mamífero pequeño, por ejemplo, de la superfamilia Dipodoidea o Muroidea. En una modalidad, el animal modificado genéticamente es un roedor. El roedor puede seleccionarse de un ratón, una rata, y un hámster. El roedor puede seleccionarse de la superfamilia Muroidea. El animal modificado genéticamente puede ser de una familia seleccionada de Calomyscidae (por ejemplo, hámsteres similares a ratón), Cricetidae (por ejemplo, hámster, ratas y ratones del Nuevo Mundo, ratones campestres), Muridae (ratones y ratas verdaderos, jerbos, ratones espinosos, ratas crestadas), Nesomyidae (ratones trepadores, ratones de roca, ratas coliblancas, ratas y ratones de Madagascar), Platacanthomyidae (por ejemplo, lirones espinosos), y Spalacidae (por ejemplo, ratas topo, ratas de bambú, y zokor). El roedor modificado genéticamente puede seleccionarse de un ratón o una rata verdaderos (familia Muridae), un jerbo, un ratón espinoso, y una rata crestada. El ratón modificado genéticamente puede ser de un miembro de la familia Muridae. El animal puede ser un roedor. El roedor puede seleccionarse de un ratón y una rata. El animal no humano puede ser un ratón.
En una modalidad específica, el ratón es de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, y C57BL/Ola. En otra modalidad, el ratón es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por ejemplo, Festing y otros (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, ver además, Auerbach y otros (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En una modalidad específica, el ratón modificado genéticamente es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En otra modalidad específica, el ratón es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En una modalidad específica, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otra modalidad, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, una cepa BALB/c. Aún en otra modalidad, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente. Aún en otra modalidad, el ratón es de una línea híbrida (por ejemplo, 50 % BALB/c - 50 % 129S4/Sv; o 50 % C57BL/6 - 50 % 129; por ejemplo, células F1H4, ver, por ejemplo, Auerbach y otros (2000)).
El animal no humano puede ser una rata. La rata puede seleccionarse de una rata Wistar, una cepa LEA, una cepa Sprague Dawley, una cepa Fischer, F344, F6, y Dark Agouti. La cepa de rata puede ser una mezcla de dos o más cepas seleccionadas del grupo que consiste en Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6, y Dark Agouti.
El animal no humano puede tener una o más de otras modificaciones genéticas, y/u otras modificaciones, que son adecuadas para el propósito particular para el que se produce el ratón con IL-15 humanizada. Por ejemplo, los ratones adecuados para mantener un xenoinjerto (por ejemplo, un cáncer o tumor humano), pueden comprender una o más modificaciones que comprometen, inactivan, o destruyen completamente o en parte el sistema inmunológico del animal no humano. El compromiso, la inactivación, o la destrucción del sistema inmunológico del animal no humano pueden incluir, por ejemplo, la destrucción de células hematopoyéticas y/o células inmunológicas por medios químicos (por ejemplo, administración de una toxina), medios físicos (por ejemplo, irradiación del animal), y/o modificación genética (por ejemplo, desactivación de uno o más genes). Los ejemplos no limitantes de tales ratones pueden incluir, por ejemplo, ratones NOD, ratones SCID, ratones NON/SCID, ratones con desactivación de IL2Ry, ratones NOD/SCID/ycnulos (ver, por ejemplo, Ito, M. y otros (2002) NOD/SCID/ycnull mouse: an excellent recipient mouse model
for engraftment of human cells, Blood 100(9):3175-3182), ratones desnudos, y ratones con desactivación de Rag1 y/o Rag2. Opcionalmente, estos ratones pueden irradiarse, o tratarse de cualquier otra manera para destruir uno o más tipos de células inmunológicas. Por lo tanto, se describe un ratón modificado genéticamente que comprende una humanización de al menos una porción de un locus endógeno de IL-15 no humano, y que comprende, además, una modificación que compromete, inactiva, o destruye completamente o en parte, el sistema inmunológico (o uno o más tipos de células del sistema inmunológico) del animal no humano. La modificación se selecciona, por eiempl°, del grupo que consiste en una modificación que da como resultado un ratón NOD, un ratón SCID, un ratón NOD/SCID, un ratón con desactivación de IL-2Ry, un ratón NOD/SCID/ycnulo, un ratón desnudo, un ratón con desactivación de Rag1 y/o Rag2, y una combinación de estos. El ratón puede comprender una sustitución de toda la secuencia codificante de IL-15 madura con una secuencia codificante de IL-15 madura humana.
El ratón puede comprender una sustitución de toda la secuencia codificante de IL-15 madura con una secuencia codificante de IL-15 madura humana, y el ratón es un ratón NOD. El ratón puede comprender una sustitución de toda la secuencia codificante de IL-15 madura con una secuencia codificante de IL-15 madura humana, y el ratón es un ratón SCID. El ratón puede comprender una sustitución de toda la secuencia codificante de IL-15 madura con una secuencia codificante de IL-15 madura humana, y el ratón es un ratón NOD/SCID. El ratón puede comprender una sustitución de toda la secuencia codificante de IL-15 madura con una secuencia codificante de IL-15 madura humana, y el ratón comprende una desactivación de IL-2Ry. El ratón puede comprender una sustitución de toda la secuencia codificante de IL-15 madura con una secuencia codificante de IL-15 madura humana, y el ratón es un ratón NOD/SCID/YcnuN. El ratón puede comprender una sustitución de toda la secuencia codificante de IL-15 madura con una secuencia codificante de IL-15 madura humana, y el ratón es un ratón desnudo. El ratón puede comprender una sustitución de toda la secuencia codificante de IL-15 madura con una secuencia codificante de IL-15 madura humana, y el ratón comprende una desactivación de Rag1 y/o Rag2.
Se describen animales no humanos modificados genéticamente que comprenden una modificación de un locus endógeno de IL-15 no humano, en donde la modificación comprende una secuencia de ácido nucleico humana que codifica al menos una porción de una proteína IL-15 madura. Aunque también se describen células modificadas genéticamente que comprenden las modificaciones descritas en la presente descripción (por ejemplo, células ES, células somáticas), los animales no humanos modificados genéticamente pueden comprender la modificación del locus endógeno de IL-15 en la línea germinal del animal.
Se describen animales no humanos modificados genéticamente que comprenden una sustitución de una secuencia génica de IL-15 no humana con una secuencia génica de IL-15 humana. Un locus endógeno de IL-15 no humano puede modificarse completamente o en parte para comprender una secuencia de ácido nucleico humana que codifica al menos un exón codificante de proteína de una proteína IL-15 madura. La secuencia humana puede ser una secuencia genómica humana, por ejemplo, una secuencia genómica humana contigua que comprende uno o más exones que codifican una porción de una proteína IL-15 madura, o, por ejemplo, un ADNc que codifica al menos uno o más exones que codifican una porción de una proteína IL-15 madura. Todos los exones codificantes de la proteína IL-15 que codifican secuencias proteicas que aparecen en una proteína IL-15 humana madura pueden humanizarse. El locus de IL-15 humanizada puede estar bajo el control de secuencias reguladoras endógenas corriente arriba (por ejemplo, todas las secuencias endógenas corriente arriba de la humanización). La humanización puede comprender una región 3'UTR humana.
Los animales no humanos pueden ser mamíferos. Los mamíferos pueden ser roedores. Se describen roedores que comprenden una humanización de un gen de IL-15, en un locus endógeno de IL-15 de roedor. Se describen métodos para producir roedores, por ejemplo, ratones, que comprenden una sustitución de un gen endógeno de IL-15 o un fragmento de este (por ejemplo, un fragmento que comprende uno o más exones) con un gen de IL-15 humanizada, o un fragmento de este (por ejemplo, un fragmento que comprende uno o más exones), en el locus endógeno de IL-15. Se describen células, tejidos, y ratones que comprenden el gen humanizado, así como células, tejidos, y ratones que expresan IL-15 humana a partir de un locus endógeno de IL-15 no humano. Se describen, además, roedores que expresan una proteína IL-15 humana bajo el control de un promotor endógeno de roedor.
La IL-15 se descubrió como un factor de crecimiento de células T independiente de IL-2 que estimula la proliferación de células T y apoya el desarrollo del timo y el desarrollo de células asesinas naturales (NK) (Burton, J.D. y otros (1994) A lymphokine, provisionally designated interleukin T and produced by a human adult T-cell leukemia line, stimulates T-cell proliferation and the induction of lymphokine-activated killer cells, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4935-4939; Grabstein, K.H. y otros (1994) Cloning of a T Cell Growth Factor That Interacts with the p Chain of the lnterleukin-2 Receptor, Science 264:965-968). IL-2 e IL-15 comparten subunidades de los receptores. Sin embargo, la importancia independiente de la IL-15 en el mantenimiento de las poblaciones de células inmunológicas es indiscutible; los ratones con desactivación de IL-15/IL-15R exhiben pocas células T CD8+, pocas células T CD8+ de memoria, y pocas células NK, así como otros tipos de células (revisado en Steel, J.C. y otros (2012) Interleukin-15 biology and therapeutic implications in cancer, Trends in Pharmacological Sciences, 33(1):35-41).
Se conoce que la IL-15 se expresa en células endoteliales; la IL-15 derivada de células endoteliales estimula la migración transendotelial de células T (ver, Oppenheimer-Marks, N. (1998) Interleukin 15 is Produced by Endothelial Cells and Increases the Transendothelial Migration of T Cells in Vitro and in the SCID Mouse-Human Rheumatoid
Arthritis Model In Vivo, J. Clin. Invest. 101(6):1261-1272). Por lo tanto, los primeros trabajos establecieron una probabilidad de que el reclutamiento de células T a los sitios de inflamación esté mediado por IL-15 (Id.). Este hecho es significativo, debido a que la expresión desmedida o inadecuada de IL-15 puede conducir fácilmente a un fenotipo patológico - una situación que se aborda con animales no humanos transgénicos que expresan IL-15 desregulada. La regulación adecuada de IL-15 es importante, debido a que se considera que la IL-15 es una citocina proinflamatoria que se encuentra en el vértice de una cascada de citocinas proinflamatorias, que precede a la expresión de muchos mediadores de la inflamación (Mclnnes, I.B. y otros (1997) Interleukin-15 mediates T cell-dependent regulation of tumor necrosis factor-a production in rheumatoid arthritis, Nature Med. 3:189-195, citado en Waldmann, T.A. (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design, Nature Rev. Immunol.
6:595-601).
Los ratones transgénicos que expresan IL-15 humana bajo el control de un promotor específico de enterocitos (promotor T3b) para expresar IL-15 humana en células del epitelio intestinal desarrollan inflamación espontánea en la zona duodeno yeyunal (Yokoyama, S. y otros (2008) Antibody-mediated blockade of IL-15 reverses the autoimmune intestinal damage in transgenic mice that overexpress IL-15 in enterocytes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106(37)15849-15854; Ohta, N. y otros (2002) IL-15-dependent activation-induced cell death-resistant Th1 type CD8 alpha beta NK1.1+ T cells for the development of small intestinal inflammation, J. Immunol. 169:460-468). Ver, además, Nishimura, H. y otros (2005) A novel autoregulatory mechanism for transcriptional activation of the IL-15 gene by nonsecretable isoform of IL-15 generated by alternative splicing, FASEB J. 19:19-28 (ratones transgénicos con una variante del gen de IL-15m insertada aleatoriamente).
Se han preparado ratones transgénicos para una isoforma secretable de IL-15 bajo el control de un promotor de MHC clase I, pero estos sobreexpresan IL-15 (Yajima, T. y otros (2001) Memory phenotype CD8(+) T cells in IL-15 transgenic mice are involved in early protection against a primary infection with Listeria monocytogenes, Eur.J. Immunol.
31(3):757-766). La sobreexpresión de IL-15 se correlaciona con la destrucción del epitelio intestinal por linfocitos T citotóxicos activados por IL-15 en la enfermedad celíaca (Yokoyama, S. y otros (2011) Transgenic Mice that Overexpress Human IL-15 in Enterocytes Recapitulate Both B and T Cell-Mediated Pathologic Manifestations of Celiac Disease, J. Clin. Immunol. 31:1038-1044), presumiblemente debido a la estimulación de la proliferación de células T CD8+ dirigidas a enterocitos a través de un proceso mediado por NKG2D (asesina natural grupo 2, miembro D) que incluye receptores cognados tales como MICA/B (Id., en 1039). Parece claro hasta el momento que la expresión local de IL-15 provoca daño tisular mediado por células T en el intestino en la enfermedad celíaca (Id.).
Al menos un estudio de ratones transgénicos diseñados para sobreexpresar IL-15 en tejido muscular y en la circulación (con el empleo de un promotor de músculo esquelético) establece que la sobreexpresión de IL-15 afecta el metabolismo; tales ratones parecen emplear IL-15 como una mioquina que reduce la grasa corporal y proporciona resistencia a la adiposidad inducida por la dieta (Quinn, L.S. y otros (2009) Oversecretion of interleukin-15 from skeletal muscle reduce adiposity, Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296:E191-E202).
Se considera que la IL-15 también está implicada en la artritis reumatoide, quizás a través de una infiltración anormal de células T de las articulaciones (revisado en, por ejemplo, Fehninger T.A. y Caligiuri, M.A. (2001) Interleukin 15: biology and relevance to human disease, Blood 97(1):14-32). Los pacientes con sarcoidosis producen, además, macrófagos alveolares que expresan IL-15, los que pueden mediar la proliferación de células T en los pulmones (Id., en 23). La IL-15 puede mediar, además, el rechazo de órganos en aloinjertos por medio de la proliferación de células T (Id., en 24). La IL-15 puede estar implicada, además, en la leucemia de células T del adulto (por ejemplo, mediada por HTLV-1), en base al menos en parte a la activación de rutas mediadas por IL-15 en pacientes con leucemia de células T del adulto (Id.). El trabajo in vitro sugiere que la IL-15 activa la replicación del HIV, que también puede ser el caso en humanos (Id., en 25).
En ratones transgénicos que expresan IL-15 dirigida por un promotor de MHC clase I, infectados con el bacilo Mycobacterium bovis de Calmette-Guérin, la sobreproducción de IL-15 hizo a los ratones susceptibles a una lesión hepática letal inducida por LPS, un efecto que no se observó cuando se redujeron las células T CD8+ en los ratones (Yajima, T. (2004) Overexpression of Interleukin-15 Increases Susceptibility to Lipopolysaccharide-Induced Liver Injury in Mice Primed with Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin, Infection and Immunity 72(7):3855-3862), lo que sugiere un efecto mediado por la sobreproducción de IL-15.
Los ratones transgénicos que expresan IL-15 dirigida por un promotor de músculo esquelético exhibieron una mayor sensibilidad a la insulina y una resistencia a la obesidad inducida por la dieta, con estimulación aparente del metabolismo de ácidos grasos (Quinn, L.S. y otros (2011) Overexpression of interleukin-15 in mice promotes resistance to diet-induced obesity, increased insulin sensitivity, and markers of oxidative skeletal muscle metabolism, International Journal of Interferon, Cytokine and Mediator Research, 3:29-42).
Se ha estudiado el bloqueo selectivo de la IL-15 murina, que incluye un IL-15Ra soluble, que puede ser de beneficio clínico en el control de la artritis reumatoide (Id., en 27). Por lo tanto, los animales no humanos que expresan IL-15 humana o humanizada, que incluye la expresión de una manera relevante fisiológicamente, son útiles para evaluar o identificar bloqueadores selectivos de la IL-15 humana. De acuerdo con un revisor, “el desarrollo de agentes bloqueadores de IL-15 humana eficaces con actividad de bloqueo in vivo podría facilitar la traducción rápida de estos
enfoques a la clínica” (Id., en 27). Por lo tanto, los animales no humanos modificados genéticamente, por ejemplo, animales no humanos que comprenden un gen de IL-15 humana en su línea germinal, en donde los animales no humanos expresan IL-15 humana de una manera fisiológicamente adecuada, serían muy útiles.
La IL-15 es una citocina pleiotrópica necesaria para el desarrollo y función de células NK y la homeostasis de células T. Es particularmente importante para el compartimiento de las células T CD8+ de memoria. La IL-15 se produce principalmente en células dendríticas y macrófagos, y se transpresenta por medio del complejo IL-15/IL-15R a las células NK y células T. Se conoce que la IL-15 es, además, una citocina proinflamatoria que induce la producción de otras citocinas, recluta y activa células T y otras células inflamatorias, promueve el desarrollo y la supervivencia de células NK, y promueve la angiogénesis; y muchas de estas características se muestran en las lesiones psoriásicas (revisado e informado en Villadsen, L.S. (2003) Resolution of psoriasis upon blockade of IL-15 biological activity in a xenograft mouse model, J. Clin. Invest. 112(10):1571-1580). Se ha propuesto que la IL-15 es el vértice de la cascada de citocinas proinflamatorias, con diversas estrategias en marcha para modular la señalización de IL-15 para el tratamiento de enfermedades (revisado en Waldman (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design, Nature Reviews Immmunology, 6:595-601). En un modelo de xenoinjerto de ratón de psoriasis en ratones SCID, el bloqueo de IL-15 con el uso de un anticuerpo para IL-15R (o IL-15) dio como resultado la reducción de la gravedad de la psoriasis (Id.). Por lo tanto, los animales no humanos que expresan IL-15 de una manera relevante fisiológicamente son útiles (por ejemplo, tienen una utilidad bien establecida) en modelos para enfermedades humanas, que incluyen pero no se limitan a modelos en ratones inmunocomprometidos, tales como, por ejemplo, ratones SCId y otros ratones inmunocomprometidos. Por lo tanto, se describe un roedor (por ejemplo, un ratón) que comprende un gen de IL-15 humana o humanizado bajo el control de elementos reguladores no humanos endógenos (por ejemplo, una humanización del gen que codifica IL-15 en un roedor, por ejemplo, un ratón).
El gen de IL-15 se encuentra en el cromosoma 4q31 humano y en el cromosoma 8 de ratón. El gen humano contiene 8 exones (7 codificantes), y parece existir en dos isoformas tanto en humanos como en ratones (ver, por ejemplo, Fehninger T.A. y Caligiuri, M.A. (2001) Interleukin 15: biology and relevance to human disease, Blood 97(1):14-32). El ARNm de IL-15 se produce en una amplia variedad de tejidos y tipos de células, y la regulación del gen de IL-15 en humanos parece estar regulada negativamente por una región corriente arriba cuya deleción da como resultado un aumento drástico de la actividad del promotor de IL-15 (Id., en 17). Los ratones transgénicos que carecen de control postranscripcional de IL-15 exhiben una leucemia linfocítica fatal (Id.). La regulación de la expresión de IL-15 parece ser muy estricta, mediada al menos por tripletes AUG en la región no traducida en 5', elementos reguladores en 3', y un sitio regulador putativo en la región C terminal (revisado en Mclnnes, I.B. y Gracie, J.A. (2004) Interleukin-15: a new cytokine target for the treatment of inflammatory diseases, Current Opinion in Pharmacology 4:392-397). El gen de IL-15 humana tiene nueve exones y ocho intrones, lo que incluye un exón 4a que está presente en humanos pero no en ratones, aunque la proteína IL-15 madura sólo se codifica en los exones 5 al 8 (revisado en Budagian, V. y otros (2006) IL-15/IL-15 receptor biology: A guided tour through an expanding universe, Cytokine & Growth Factor Reviews 17:259-280). Existen dos productos de ARNm por corte y empalme alternativo que producen dos isoformas de IL-15, que sólo se diferencian en la longitud del péptido señal, lo que es válido tanto para la proteína de ratón como para la humana (ver, por ejemplo, Id.). La Figura 1, que representa una estrategia de humanización para un locus de IL-15 de ratón, omite las secuencias de ratón corriente arriba que no se humanizaron (que incluyen exones que no aparecen en la proteína madura) para la simplicidad, y presenta una modificación de la enumeración de los exones relevantes para la humanización mostrada.
La IL-15 se expresa en muchos tipos de células y tejidos, que incluyen monocitos, macrófagos, células dendríticas, queratinocitos, células epidérmicas, fibroblastos, y células epiteliales de nervio, riñón, placenta, pulmón, corazón, y músculo (Grabstein, K.H. y otros (1994) Cloning of a T Cell Growth Factor That Interacts with the p Chain of the lnterleukin-2 Receptor, Science 264:965-968).
Las secuencias codificantes de IL-15 de ratón se humanizaron como se representa en la Figura 1, que omite la representación de dos exones no codificantes (que no se humanizaron) que se encuentran alejados corriente arriba de los exones codificantes. 12299 nucleótidos de la secuencia de ratón se sustituyeron con 12896 nucleótidos de la secuencia humana para humanizar el gen de IL-15.
El locus de IL-15 humanizada puede carecer de una región 5'UTR de IL-15 humana. El locus de IL-15 humanizada puede comprender una región 5'UTR de roedor. El roedor puede ser un ratón, y el locus de IL-15 humanizada comprende una región 5'UTR de IL-15 de ratón.
Los roedores que expresan una proteína IL-15 humana o humanizada, por ejemplo, de una manera fisiológicamente adecuada, proporcionan una variedad de usos que incluyen, pero no se limitan a, el desarrollo de agentes terapéuticos para enfermedades y trastornos humanos. Los antagonistas de IL-15, tales como, por ejemplo, formas solubles del receptor de IL-15, pueden prevenir el desarrollo de artritis mediada por colágeno en un modelo animal (ver, Ruchatz, H. y otros, (1998) Soluble IL-15 receptor a-chain administración prevents murine collagen-artritis inducida: a role for IL-15 in development of antigen-induced immunopathology, J. Immunol. 160:5654-5660); anticuerpos anti-IL-15 han exhibido eficacia contra una variedad de enfermedades, que incluyen psoriasis y artritis reumatoide; en un modelo animal de artritis, un antagonista del receptor de IL-15 previene el desarrollo y la progresión de la artritis, así como
reduce la infiltración linfocitaria de las articulaciones (Ferrari-Lacraz, S. y otros (2004) Targeting IL-15 Receptor-Bearing Cells with an Antagonist Mutant IL-15/Fc Protein Prevents Disease Development and Progression in Murine Collagen-Induced Arthritis, J. Immunol. 173:5815-5826); la señalización mediada por IL-15 también se ha implicado en IBD, SLE, sinovitis inflamatoria, diabetes mellitus, y asma (revisado en Budagian, V. y otros (2006) IL-15/IL-15 receptor biology: A guided tour through an expanding universe, Cytokine & Growth Factor Reviews 17:259-280).
Estudios con ratones con desactivación de IL-15 establecen que la IL-15 es necesaria para el desarrollo de ciertas células inmunológicas, particularmente, las células NK (revisado en Lodolce, J.P. (2002) Regulation of lymphoid homeostasis by interleukin-15, Cytokine & Growth Factor Reviews, 13:429-439). De hecho, los ratones con desactivación de IL-15 no sobreviven mucho tiempo a la exposición a ciertos patógenos (por ejemplo, virus Vaccinia), presumiblemente debido a la carencia de células NK y T CD8+ (Id.). Por lo tanto, los efectos de los antagonistas de IL-15h sobre la función de las células NK humanas representan una aplicación importante de un animal con IL-15 humanizada.
Se describen animales modificados genéticamente que expresan IL-15 humana o humanizada, que son útiles para la evaluación de antagonistas de la IL-15 humana. Los animales modificados genéticamente pueden comprender, además, un modelo animal de una enfermedad humana, por ejemplo, la enfermedad se induce genéticamente (una activación o desactivación) o de cualquier otra manera. Los animales no humanos modificados genéticamente pueden comprender, además, un sistema inmunológico dañado, por ejemplo, un animal no humano modificado genéticamente para sostener o mantener un xenoinjerto humano, por ejemplo, un tumor sólido o un tumor de células de la sangre humano (por ejemplo, un tumor linfocitario, por ejemplo, un tumor de células B o T).
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Humanización del locus de IL-15 de ratón
Se modificaron células ES de ratón para sustituir ciertas secuencias del gen de IL-15 de ratón con ciertas secuencias del gen de IL-15 humana en el locus endógeno de IL-15 de ratón, bajo el control de elementos reguladores de IL-15 de ratón, con el uso de una tecnología de ingeniería genética VELOCIGENE®, para producir un locus humanizado como se muestra en la Figura 1. La Figura 1 no muestra corriente arriba (con respecto a la dirección de la transcripción del gen de IL-15) los exones 5' no traducidos del gen de ratón; el Ex1 de la Figura 1 muestra una pequeña región no traducida (vacía) corriente arriba del exón codificante. Como se muestra, en la humanización en la parte inferior de la Figura 1, los exones codificantes 1 y 2 de ratón se conservaron, mientras que los exones codificantes 3 a 6 de ratón se sustituyeron con los exones 3 a 6 humanos. En el extremo corriente abajo, el exón 6 humano va seguido de un codón de parada y una región 3'-UTR humana y, además, de una secuencia humana que se encuentra corriente abajo de la región 3'UTR humana. Con propósitos de selección, se incluyó un casete de selección (con flox para su extracción con Cre). El locus humanizado de la Figura 1 expresa una proteína IL-15 madura que es completamente humana.
Constructo de transformación. La recombinación homóloga en bacterias (BHR) se realiza para construir un vector de transformación grande (LTVEC) que contiene secuencias del gen de IL-15 humana para dirigirlas al locus de IL-15 de ratón con el uso de técnicas de BHR estándar (ver, por ejemplo, Valenzuela y otros (2003) High-throughput engineering of the mouse genoma coupled with high-resolution expresión analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659) and gap repair BHR. Los fragmentos lineales se generan mediante la ligación de cajas de homología generadas por PCR a casetes clonados seguido del aislamiento en gel de los productos de ligación y su electroporación en bacterias competentes para BHR que albergan el cromosoma artificial bacteriano (BAC) objetivo. El BAC PRCI23-203P7 de ratón se usa como la fuente de secuencia de ratón; el BAC RP11-103B12 humano se usa como la fuente de secuencia del gen de IL-15 humana. Después de una etapa de selección, los clones recombinados correctamente se identifican por PCR de las nuevas uniones, y por análisis de restricción. Se preparó un vector de transformación grande (LTVEC) que contiene brazos de homología y secuencias del gen de IL-15 humana. Células ES de ratón se sometieron a electroporación con los constructos LTVEC, se cultivaron en medio de selección, y se usaron como células ES donantes para producir ratones con IL-15 humanizada que comprenden una sustitución en el locus endógeno de IL-15 de ratón con una secuencia humana como se representa en la Figura 1.
El gen de IL-15 de ratón (núm. de identificación del gen de ratón: 103014; RefSeq del transcrito: NM_008357.2; eID de ensemble:16168) se modifica mediante el uso de las coordenadas genómicas para la deleción GRCM38: ch 8: 82331173-82343471 (cadena no codificante); coordenadas genómicas para la sustitución GRCh37: ch4: 142642924 142655819 (cadena codificante). 12299 nucleótidos de la secuencia de ratón se sustituyeron por 128996 nucleótidos de la secuencia humana. La sustitución de la secuencia de IL-15 de ratón como se describió anteriormente se representa gráficamente en la Figura 1.
El LTVEC que comprende el gen de IL-15 humanizada tenía aproximadamente 13 kb del brazo de transformación de ratón corriente arriba flanqueado corriente arriba con un sitio Mlul, y un brazo de transformación de ratón de 27 kb corriente abajo flanqueado corriente abajo con un sitio AscI. El LTVEc se linealizó con las enzimas Mlul y AscI para su electroporación.
Después de la construcción del LTVEC, la secuencia de nucleótidos del LTVEC a través de la unión ratón/humano en 5', y la unión humano/ratón en 3' es como se muestra en las Figuras 2-4.
Después de la electroporación de la célula ES, se realiza un ensayo de pérdida del alelo nativo (ver, por ejemplo, Valenzuela y otros (2003)) para detectar la pérdida de la secuencia endógena de IL-15 debido a la transformación.
Las células ES transformadas correctamente (MAID 5217) se sometieron, posteriormente, a electroporación con un vector para la expresión transitoria de Cre para extraer el casete para la selección con el fármaco Neo. Las células ES resultantes sin el casete se nombraron MAID 5218.
Ejemplo 2: Ratones con IL-15 humanizada
Generación de ratones con IL-15 humanizada. Las células ES donantes de ratón que comprenden un locus de IL-15 humanizada (por ejemplo, MAID 5217 o MAID 5218) se introducen en embriones de ratón en etapa temprana mediante el método VELOCim Ou SE® (Poueymirou y otros (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allowing immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91-99). Se obtienen ratones heterocigotos, y para obtener homocigotos con respecto a la IL-15 humanizada, los heterocigotos se cruzan.
Ejemplo 3: Fenotipificación de ratones con IL-15 humanizada
Ratones. Los ratones eran hembras Balb/c silvestres (WT) de 8-10 semanas de edad o hembras MAID 5217 (heterocigotas para el gen de IL-15 humana) de la misma edad. Alternativamente, los ratones eran ratones silvestres (WT) o ratones MAID 5217 o MAID 5218 de la misma edad (ambos heterocigotos para el gen de IL-15 humana).
Inyección de poli l:C in vivo. Los ratones Balb/c WT o MAID 5217 heterocigotos se inyectaron con 50 pg de poli l:C (Invivogen; Cat #tlrl-pic) por medio de la vena de la cola (inyección IV). Después de 24 horas, los ratones se sacrificaron y la sangre se extrajo por medio de una punción cardíaca y el suero se aisló. Además, se cosecharon los bazos y los esplenocitos se prepararon mediante la ruptura mecánica de los bazos a través de un filtro de malla de 70 pm seguido de tratamiento con tampón de lisis ACK (Invitrogen) para lisar los glóbulos rojos (RBC). Los esplenocitos aislados se cultivaron para su estimulación adicional (ver más adelante). El suero se analizó para detectar la IL-15 humana con el uso del estuche de IL-15 humana QUANTIKINE™ de R&D Systems. Los ratones WT o MAID 5218 heterocigotos se inyectaron con 50 pg de poli l:C (Invivogen; Cat #tlrl-pic) por vía IP. La sangre de los ratones se extrajo al día siguiente por medio de una punción cardíaca y el suero se analizó para detectar la IL-15 humana por ELISA (estuche de ELISA QUANTIKINE™ de R&D Systems).
Preparación de células dendrítcas derivadas de la médula ósea. La médula ósea se extrajo de la tibia de ratones no inyectados y los RBC se lisaron con tampón de lisis ACK. Las células se lavaron con medio RPMI completo (c/HEPES, gentamicina, piruvato de sodio, L-glutamina, y aminoácidos no esenciales) 10 % de suero bovino fetal (FBS) y se contaron. Se cultivaron 2 x 106 células por pocillo en una placa de 6 pocillos con 3 ml/pocillo de RPMI completo 10 % de FBS GM-CSF murino a 50 ng/ml IL-4 murina a 50 ng/ml. Las células se cultivaron a 37 °C /5 % de CO2 y se les proporcionó GM-CSF/IL-4 fresco en los días 2 y 4 de cultivo. En el día 5 de cultivo, las BM-DC no adherentes se cosecharon de los cultivos y los medios de cultivo respectivos se guardaron (medios acondicionados).
Cultivo de esplenocitos. Se cosecharon los bazos de los ratones respectivos y se prepararon los esplenocitos mediante la ruptura mecánica de los bazos a través de un filtro de malla de 70 pm seguido de tratamiento con tampón de lisis ACK (Invitrogen) para lisar los RBC. Los esplenocitos aislados se cultivaron en una placa de 48 pocillos a 2 x 106 esplenocitos/ml en 1 ml de RPMI completo 10 % de FBS. Las células se trataron con poli I:C a 1 pg/ml, PMA a 10 pg/ml o se dejaron sin tratar. Las células se cultivaron como tal durante la noche y al día siguiente el sobrenadante se cosechó y se concentró 8 veces con el uso de filtros Amicon de 2 ml con corte de peso molecular (MWCO) de 3 kD. Los sobrenadantes concentrados se analizaron para detectar la IL-15 humana con el uso del estuche de IL-15 humana QUANTIKINE™ de R&D Systems.
Cultivo de BM-DC. Se sembraron 2 x 106 BM-DC/ml en una placa de 24 pocillos en 0.5 ml de RPMI completo fresco 10 % de FBS y 0.5 ml de medios acondicionados. Las células se trataron con poli I:C a 25 pg/ml, LPS a 1 pg/ml o se dejaron sin tratar. Todas las condiciones se realizaron por duplicado. Las células se cultivaron como tal durante 36 h y después se cosechó el sobrenadante. Los sobrenadantes se concentraron 7 veces con el uso de filtros Amicon de 2 ml con MWCO de 3 kD. Los niveles de IL-15 humana en los sobrenadantes concentrados se analizaron con el uso del estuche de IL-15 humana QUANTIKINE™ de R&D Systems. El ARN de las células se aisló con el uso del estuche a escala minipreparativa RNAeasy™ de Qiagen para el análisis por RT-PCR de los niveles del transcrito de IL-15 humana.
ELISA. El estuche de IL-15 humana QUANTIKINE™ de R&D Systems se usó para medir la IL-15 humana en suero y en los sobrenadantes concentrados de esplenocitos o BM-DC. El estuche se usó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se realizaron controles adicionales para validar la especificidad de este estuche (sólo detecta IL-15 humana, no de ratón) y para confirmar que no reacciona con poli I:C. Por lo tanto, 1000 pg/ml de IL-15 murina se analizaron en el ELISA (nota: el estándar más alto para la IL-15 humana es 250 pg/ml) y poli I:C solo a 25 pg/ml y 12.5
Claims (14)
1. Un roedor modificado genéticamente cuyo genoma comprende:
una sustitución en un locus endógeno de IL-15 de roedor de un fragmento genómico de roedor que codifica para el polipéptido maduro de IL-15 de roedor con un fragmento genómico del gen de IL-15 humana que codifica para el polipéptido maduro de IL-15 humana para formar un gen de IL-15 humanizada,
en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones no codificantes de proteína IL-15 de roedor y regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína del gen de IL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y
en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
2. El roedor modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 1, que es un ratón o una rata.
3. Un método para producir un roedor modificado genéticamente, que comprende:
modificar el genoma de un roedor mediante la sustitución de un fragmento genómico de roedor que codifica para el polipéptido maduro de IL-15 de roedor en el locus endógeno de IL-15 de roedor con un fragmento genómico del gen de IL-15 humana que codifica para el polipéptido maduro de IL-15 humana, para formar un gen de IL-15 humanizada,
en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones no codificantes de proteína IL-15 de roedor y regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína de un gen de IL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y
en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el roedor modificado genéticamente es un ratón o una rata.
5. Un roedor modificado genéticamente cuyo genoma comprende un gen de IL-15 humanizada,
en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones de IL-15 humana que codifican proteína madura que codifican una proteína que comprende la secuencia del polipéptido maduro de IL-15 humana, y en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones no codificantes de proteína IL-15 de roedor y regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína de un gen de IL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y
en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
6. El roedor modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 5, en donde el gen de IL-15 humanizada se encuentra en una posición en el genoma del roedor que es distinta a la del locus endógeno de IL-15.
7. El roedor modificado genéticamente de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, que es un ratón o una rata.
8. Un método para producir un roedor modificado genéticamente, que comprende introducir un gen de IL-15 humanizada en un genoma de roedor,
en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones de IL-15 humana que codifican proteína madura, en donde el gen de IL-15 humanizada codifica una proteína que comprende la secuencia del polipéptido maduro de IL-15 humana, y
en donde el gen de IL-15 humanizada comprende los exones no codificantes de proteína IL-15 de roedor y regiones reguladoras corriente arriba del primer exón que codifica proteína del gen de IL-15 de roedor y la expresión del gen de IL-15 humanizada está bajo el control de dichas regiones reguladoras, y
en donde el gen de IL-15 humanizada resulta en la expresión de una proteína IL-15 que cuando madura es completamente humana.
9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde el gen de IL-15 humanizada se integra en el genoma del roedor en una posición que es distinta a la del locus endógeno de IL-15.
10. El método de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en donde el roedor modificado genéticamente es un ratón o una rata.
11. Un método para identificar un agente que es un antagonista de IL-15 humana; que comprende determinar un efecto del agente sobre una función mediada por IL-15 humana cuando se administra a un roedor modificado genéticamente como se define en la reivindicación 1 o 2, e identificar el agente como un antagonista de IL-15 si antagoniza la función de IL-15 humana en el roedor modificado genéticamente.
12. Un método para determinar si un agente reduce el desarrollo de linfocitos mediado por IL-15, que comprende medir el número de linfocitos de un roedor en uno o más puntos de tiempo seguido de la administración del agente al roedor, y
determinar si el agente reduce la población de linfocitos, en donde dicho roedor es un roedor modificado genéticamente como se define en la reivindicación 1 o 2.
13. Un método para determinar si un agente reduce la infiltración de linfocitos mediada por IL-15 de un tejido o articulación, que comprende
medir la infiltración de linfocitos del tejido o la articulación en uno o más puntos de tiempo seguido de la administración del agente a un roedor modificado genéticamente como se define en la reivindicación 1 o 2 en un período de tiempo, y determinar si el agente reduce la infiltración de linfocitos del tejido o la articulación.
14. Un método para determinar si un agente reduce la progresión artrítica mediada por IL-15, que comprende determinar si el agente afecta la progresión artrítica cuando se administra durante un período de tiempo a un roedor modificado genéticamente como se define en la reivindicación 1 o 2 y que comprende además un artritis inducida, en donde dicha determinación comprende medir la progresión artrítica en el roedor modificado genéticamente.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201361891013P | 2013-10-15 | 2013-10-15 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2715949T3 true ES2715949T3 (es) | 2019-06-07 |
Family
ID=51830649
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14790452.8T Active ES2613379T3 (es) | 2013-10-15 | 2014-10-15 | Animales con IL-15 humanizada |
| ES16192440T Active ES2715949T3 (es) | 2013-10-15 | 2014-10-15 | Animales con IL-15 humanizada |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES14790452.8T Active ES2613379T3 (es) | 2013-10-15 | 2014-10-15 | Animales con IL-15 humanizada |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US9155290B2 (es) |
| EP (3) | EP2908626B1 (es) |
| JP (3) | JP6492095B2 (es) |
| KR (1) | KR102376041B1 (es) |
| CN (2) | CN105744829B (es) |
| AU (2) | AU2014337526B2 (es) |
| BR (1) | BR112016008175A2 (es) |
| CA (1) | CA2926090C (es) |
| CY (2) | CY1118675T1 (es) |
| DK (2) | DK2908626T3 (es) |
| ES (2) | ES2613379T3 (es) |
| HK (1) | HK1210659A1 (es) |
| HR (2) | HRP20170380T1 (es) |
| HU (2) | HUE043969T2 (es) |
| IL (2) | IL244525B (es) |
| LT (2) | LT3138397T (es) |
| MX (1) | MX2016004781A (es) |
| NZ (1) | NZ718655A (es) |
| PL (2) | PL2908626T3 (es) |
| PT (2) | PT2908626T (es) |
| RS (2) | RS55472B1 (es) |
| RU (1) | RU2674910C2 (es) |
| SG (2) | SG11201601828XA (es) |
| SI (2) | SI2908626T1 (es) |
| SM (1) | SMT201700024B (es) |
| TR (1) | TR201904342T4 (es) |
| WO (1) | WO2015057758A1 (es) |
| ZA (1) | ZA201601676B (es) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT3056082T (pt) | 2009-10-06 | 2018-12-12 | Univ Yale | Ratinhos modificados geneticamente e enxerto |
| AU2012217836B2 (en) | 2011-02-15 | 2015-01-29 | Institute For Research In Biomedicine (Irb) | Humanized M-CSF mice |
| CN113897398A (zh) | 2012-09-07 | 2022-01-07 | 再生元制药公司 | 经遗传修饰的非人动物及其使用方法 |
| PT3939423T (pt) | 2012-11-05 | 2024-05-29 | Regeneron Pharma | Animais não humanos geneticamente modificados e métodos de utilização dos mesmos |
| CA2926090C (en) | 2013-10-15 | 2022-07-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized il-15 animals |
| WO2015171523A1 (en) | 2014-05-05 | 2015-11-12 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized c5 and c3 animals |
| NO2785538T3 (es) | 2014-05-07 | 2018-08-04 | ||
| MX2016014995A (es) | 2014-05-19 | 2017-03-31 | Regeneron Pharma | Animales no humanos geneticamente modificados que expresan eritropoyetina de humano. |
| EP4296278A3 (en) | 2014-12-05 | 2024-03-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene |
| SG10202103445QA (en) | 2015-04-13 | 2021-05-28 | Regeneron Pharma | Humanized sirpa-il15 knockin mice and methods of use thereof |
| CN108779159B (zh) | 2016-02-04 | 2022-12-30 | 瑞泽恩制药公司 | 具有经改造的angptl8基因的非人动物 |
| ES2886958T3 (es) | 2016-02-29 | 2021-12-21 | Regeneron Pharma | Roedores que tienen un gen TMPRSS humanizado |
| WO2018001241A1 (zh) | 2016-06-28 | 2018-01-04 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用 |
| CN107815468B (zh) | 2016-08-31 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN107815467B (zh) | 2016-08-31 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| WO2018041120A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | Genetically modified non-human animal with human or chimeric tigit |
| WO2018041121A1 (en) | 2016-08-31 | 2018-03-08 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | Genetically modified non-human animal with human or chimeric ctla-4 |
| US11317611B2 (en) | 2016-08-31 | 2022-05-03 | Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. | Genetically modified non-human animal with human or chimeric PD-L1 |
| WO2018086594A1 (en) | 2016-11-11 | 2018-05-17 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | Genetically modified non-human animal with human or chimeric tim-3 |
| CN108070613B (zh) | 2016-11-11 | 2020-03-13 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN108239659B (zh) | 2016-12-23 | 2020-03-03 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN108424928B (zh) | 2016-12-30 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN108467873B (zh) | 2017-03-17 | 2020-03-13 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用 |
| CN108588126B (zh) | 2017-03-31 | 2020-04-10 | 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 | Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用 |
| WO2018177441A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα |
| CN109136261B (zh) | 2017-06-19 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化cd28基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN109136275B (zh) | 2017-06-19 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化gitr基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN109136274B (zh) | 2017-06-19 | 2021-04-23 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 人源化cd40基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| WO2019032836A1 (en) * | 2017-08-09 | 2019-02-14 | The Jackson Laboratory | IMMUNODEFICIENT MOUSE EXPRESSING THE HUMAN INTERLEUKINE 15 |
| US20190098879A1 (en) | 2017-09-29 | 2019-04-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-Human Animals Comprising A Humanized TTR Locus And Methods Of Use |
| WO2019072241A1 (en) | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Beijing Biocytogen Co., Ltd | NON-HUMAN ANIMAL GENETICALLY MODIFIED WITH PD-1 HUMAN OR CHIMERIC |
| CN109913493B (zh) | 2017-12-12 | 2021-03-16 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 人源化cd3基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| AU2019308205A1 (en) | 2018-07-16 | 2020-11-19 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animal models of DITRA disease and uses thereof |
| CN111057721B (zh) | 2018-10-12 | 2021-03-16 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化IL-4和/或IL-4Rα改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN111304247B (zh) | 2018-12-20 | 2021-03-16 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 人源化lag-3基因改造动物模型的制备方法及应用 |
| CN111304248B (zh) | 2018-12-25 | 2021-08-24 | 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 | 人源化细胞因子il15基因改造非人动物的构建方法及应用 |
| CN114107385A (zh) * | 2019-01-17 | 2022-03-01 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | 人源化转基因动物 |
| KR102661779B1 (ko) | 2019-04-04 | 2024-04-30 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화 응고 인자 12 좌위를 포함하는 비-인간 동물 |
| CA3137761A1 (en) | 2019-06-04 | 2020-12-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals comprising a humanized ttr locus with a beta-slip mutation and methods of use |
| IL288606B1 (en) | 2019-06-07 | 2024-08-01 | Regeneron Pharma | Non-human animals containing a human albumin locus |
| US20220354097A1 (en) * | 2019-12-25 | 2022-11-10 | Gempharmatech Co., Ltd. | Il-15 humanized mouse model and use thereof |
| CN115175559A (zh) * | 2020-01-28 | 2022-10-11 | 瑞泽恩制药公司 | 包含人源化pnpla3基因座的非人动物及其使用方法 |
| CN111485001A (zh) * | 2020-04-14 | 2020-08-04 | 澎立生物医药技术（上海）有限公司 | 具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法 |
| CN112481303B (zh) * | 2021-02-09 | 2021-05-25 | 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 | Il15ra基因人源化非人动物及其构建方法和应用 |
Family Cites Families (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2001239750A1 (en) * | 2000-02-08 | 2001-08-20 | Genaissance Pharmaceuticals, Inc. | Haplotypes of the interleukin 15 gene |
| US7759541B2 (en) * | 2004-12-13 | 2010-07-20 | Iti Life Sciences | Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity |
| CA2608474C (en) * | 2005-05-17 | 2019-11-12 | University Of Connecticut | Compositions and methods for immunomodulation in an organism |
| KR20110029156A (ko) * | 2008-06-27 | 2011-03-22 | 메뤼스 베.페. | 항체 생산 비-인간 포유동물 |
| RU2425880C2 (ru) * | 2009-07-30 | 2011-08-10 | Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН | Способ получения трансгенных мышей |
| PT3056082T (pt) | 2009-10-06 | 2018-12-12 | Univ Yale | Ratinhos modificados geneticamente e enxerto |
| KR101862277B1 (ko) * | 2009-12-21 | 2018-06-01 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 인간화된 ＦｃγＲ 마우스 |
| AU2012217836B2 (en) | 2011-02-15 | 2015-01-29 | Institute For Research In Biomedicine (Irb) | Humanized M-CSF mice |
| PT3272214T (pt) * | 2011-10-28 | 2020-03-04 | Regeneron Pharma | Ratinhos geneticamente modificados que expressam moléculas quiméricas de complexo principal de histocompatibilidade (mhc) ii |
| DK2818478T3 (en) | 2011-10-28 | 2017-05-22 | Regeneron Pharma | HUMANIZED IL-6 AND IL-6 RECEPTOR |
| SI3262932T1 (sl) | 2011-10-28 | 2019-09-30 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetsko modificirani poglavitni histokompatibilnostni kompleks miši |
| US9043996B2 (en) * | 2011-10-28 | 2015-06-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetically modified major histocompatibility complex animals |
| US8962913B2 (en) | 2012-06-18 | 2015-02-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized IL-7 rodents |
| CN113897398A (zh) | 2012-09-07 | 2022-01-07 | 再生元制药公司 | 经遗传修饰的非人动物及其使用方法 |
| PT3939423T (pt) | 2012-11-05 | 2024-05-29 | Regeneron Pharma | Animais não humanos geneticamente modificados e métodos de utilização dos mesmos |
| EP3699190B9 (en) | 2013-02-22 | 2023-10-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Murine cell expressing humanized major histocompatibility complex |
| EP2922394B1 (en) | 2013-09-23 | 2017-02-22 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Non-human animals having a humanized signal-regulatory protein gene |
| CA2926090C (en) | 2013-10-15 | 2022-07-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Humanized il-15 animals |
-
2014
- 2014-10-15 CA CA2926090A patent/CA2926090C/en active Active
- 2014-10-15 ES ES14790452.8T patent/ES2613379T3/es active Active
- 2014-10-15 US US14/514,454 patent/US9155290B2/en active Active
- 2014-10-15 RS RS20161140A patent/RS55472B1/sr unknown
- 2014-10-15 TR TR2019/04342T patent/TR201904342T4/tr unknown
- 2014-10-15 DK DK14790452.8T patent/DK2908626T3/en active
- 2014-10-15 RU RU2016116847A patent/RU2674910C2/ru active
- 2014-10-15 EP EP14790452.8A patent/EP2908626B1/en active Active
- 2014-10-15 PL PL14790452T patent/PL2908626T3/pl unknown
- 2014-10-15 HU HUE16192440A patent/HUE043969T2/hu unknown
- 2014-10-15 DK DK16192440.2T patent/DK3138397T3/en active
- 2014-10-15 LT LTEP16192440.2T patent/LT3138397T/lt unknown
- 2014-10-15 MX MX2016004781A patent/MX2016004781A/es unknown
- 2014-10-15 CN CN201480056455.3A patent/CN105744829B/zh active Active
- 2014-10-15 SG SG11201601828XA patent/SG11201601828XA/en unknown
- 2014-10-15 SI SI201430109T patent/SI2908626T1/sl unknown
- 2014-10-15 KR KR1020167009228A patent/KR102376041B1/ko active IP Right Grant
- 2014-10-15 AU AU2014337526A patent/AU2014337526B2/en active Active
- 2014-10-15 RS RS20190349A patent/RS58465B1/sr unknown
- 2014-10-15 JP JP2016549191A patent/JP6492095B2/ja active Active
- 2014-10-15 LT LTEP14790452.8T patent/LT2908626T/lt unknown
- 2014-10-15 PT PT147904528T patent/PT2908626T/pt unknown
- 2014-10-15 PL PL16192440T patent/PL3138397T3/pl unknown
- 2014-10-15 HU HUE14790452A patent/HUE033272T2/en unknown
- 2014-10-15 NZ NZ718655A patent/NZ718655A/en unknown
- 2014-10-15 SG SG10201607768YA patent/SG10201607768YA/en unknown
- 2014-10-15 EP EP18206034.3A patent/EP3461331A1/en not_active Withdrawn
- 2014-10-15 PT PT16192440T patent/PT3138397T/pt unknown
- 2014-10-15 CN CN201810808707.3A patent/CN109090037B/zh active Active
- 2014-10-15 BR BR112016008175A patent/BR112016008175A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2014-10-15 SI SI201431130T patent/SI3138397T1/sl unknown
- 2014-10-15 ES ES16192440T patent/ES2715949T3/es active Active
- 2014-10-15 WO PCT/US2014/060568 patent/WO2015057758A1/en active Application Filing
- 2014-10-15 EP EP16192440.2A patent/EP3138397B1/en active Active
-
2015
- 2015-09-01 US US14/842,342 patent/US20150366175A1/en not_active Abandoned
- 2015-11-20 HK HK15111500.3A patent/HK1210659A1/xx unknown
-
2016
- 2016-03-10 IL IL24452516A patent/IL244525B/en active IP Right Grant
- 2016-03-10 ZA ZA2016/01676A patent/ZA201601676B/en unknown
-
2017
- 2017-01-04 CY CY20171100008T patent/CY1118675T1/el unknown
- 2017-01-16 SM SM201700024T patent/SMT201700024B/it unknown
- 2017-03-07 HR HRP20170380TT patent/HRP20170380T1/hr unknown
- 2017-12-06 US US15/832,976 patent/US10561125B2/en active Active
-
2018
- 2018-10-16 JP JP2018194898A patent/JP6600061B2/ja active Active
-
2019
- 2019-03-18 CY CY20191100323T patent/CY1121405T1/el unknown
- 2019-03-20 HR HRP20190542TT patent/HRP20190542T1/hr unknown
- 2019-10-03 JP JP2019182817A patent/JP2019216750A/ja active Pending
- 2019-10-10 IL IL269907A patent/IL269907B/en active IP Right Grant
-
2020
- 2020-01-02 US US16/732,400 patent/US11503813B2/en active Active
- 2020-12-08 AU AU2020286186A patent/AU2020286186B2/en active Active
-
2022
- 2022-10-17 US US18/047,014 patent/US20230189772A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2715949T3 (es) | Animales con IL-15 humanizada | |
| ES2887852T3 (es) | Animales con IL-4 e IL-4R alfa humanizadas | |
| ES2626965T3 (es) | Roedores con IL-7 humanizada | |
| ES2525368T3 (es) | IL-6 y receptor de IL-6 humanizados | |
| WO2020125639A1 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes | |
| WO2023046201A1 (en) | Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes |