ES2887852T3

ES2887852T3 - Animales con IL-4 e IL-4R alfa humanizadas

Info

Publication number: ES2887852T3
Application number: ES17193855T
Authority: ES
Inventors: Li-Hsien Wang; Yingzi Xue; Andrew J Murphy; Sean Stevens
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2014-05-07
Filing date: 2015-05-07
Publication date: 2021-12-28
Anticipated expiration: 2035-05-07
Also published as: NO2785538T3; KR102517112B1; JP6838131B2; IL248358A0; US20170311580A1; PH12016502058A1; DK3027015T3; IL304841B1; JP2024159985A; JP2017514501A; JP2021087434A; AU2021218060B2; EP3027015B1; RS62345B1; IL297105B2; SG11201608570YA; JP6640740B2; MX370672B; JP7145250B2; HRP20211455T1

Abstract

Un roedor, que comprende un reemplazo de un fragmento genómico de un gen de IL-4 de roedor en un locus de IL-4 endógeno de roedor con un fragmento genómico de un gen de IL-4 humano para formar un gen de IL-4 modificado, en donde el gen de IL-4 modificado codifica una proteína IL-4 humana y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano, en donde la expresión del gen de IL-4 modificado está bajo el control de elementos reguladores del locus de IL-4 endógeno de roedor.

Description

DESCRIPCIÓN

Animales con IL-4 e IL-4Ra humanizadas

Referencia cruzada a las solicitudes relacionadas

Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/989,757, presentada el 7 de mayo de 2014.

Campo de invención

En la presente descripción se describen animales no humanos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína IL-4 y/o IL-4Ra que comprende una secuencia humana. También se describen en la presente descripción animales transgénicos no humanos que comprenden un gen de IL-4 y/o IL-4Ra que es humano en su totalidad o en parte. Se describen animales no humanos que expresan las proteínas IL-4 y/o IL-4Ra humanas o humanizadas. Además, se describen métodos para producir y usar animales no humanos que comprenden secuencias de ácido nucleico de IL-4 y/o IL-4Ra humanas o humanizadas.

Antecedentes

La IL-4 e IL-4Ra son dianas terapéuticas para el tratamiento de una variedad de enfermedades, trastornos y afecciones humanas que están asociadas con células T cooperadoras de tipo-2 (Th2) anormales. La evaluación de la farmacocinética (PK) y la farmacodinámica (PD) de moléculas terapéuticas que se dirigen específicamente a las proteínas IL-4 humana o IL-4Ra humana se realizan de manera rutinaria en animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas. Sin embargo, la PD de dichas moléculas terapéuticas no puede determinarse adecuadamente en ciertos animales no humanos porque estas moléculas terapéuticas no se dirigen a las proteínas IL-4 o IL-4Ra endógenas.

Además, la evaluación de la eficacia terapéutica de los antagonistas de las proteínas IL-4 e IL-4Ra específicos para humanos mediante el uso de varios modelos animales no humanos de enfermedades asociadas con células Th2 anormales es problemática en animales no humanos en los que tales antagonistas específicos de especie no interactúan con las proteínas IL-4 o IL-4Ra endógenas.

En consecuencia, existe una necesidad de animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, animales murinos, por ejemplo, ratones o ratas, en los que los genes de IL-4 y/o IL-4Ra del animal no humano se humanizan en su totalidad o en parte o se reemplazan (por ejemplo, en los loci no humanos endógenos) con genes de IL-4 y/o IL-4Ra humanos que comprenden secuencias que codifican proteínas IL-4 y/o IL-4Ra humanas o humanizadas, respectivamente.

También existe la necesidad de animales no humanos que comprendan genes de IL-4 y/o IL-4Ra (por ejemplo, humanizados o humanos) en los que los genes de IL-4 y/o IL-4R estén bajo el control de elementos reguladores no humanos (por ejemplo, elementos reguladores endógenos).

También existe la necesidad de animales no humanos humanizados que expresen la proteína IL-4 humana o humanizada en sangre, plasma o suero a una concentración similar a la de la proteína IL-4 presente en sangre, plasma o suero de animal no humano de la misma edad que expresa la proteína IL-4 funcional, pero no comprende los genes de IL-4 humana o humanizada, y/o expresa la proteína IL-4Ra humana o humanizada en células inmunes, por ejemplo, células B y T, a un nivel similar al de la proteína IL-4Ra en células inmunes, por ejemplo, células B y T, de un animal no humano de la misma edad que expresa la proteína IL-4Ra funcional, pero no comprende el gen de IL-4Ra humano o humanizado.

El documento US2014/056920 se refiere a métodos para tratar o prevenir el asma por medio de la administración de un antagonista de IL-4R. El documento US2011/016543 se refiere a la edición del genoma de genes implicados en la inflamación.

Resumen

La invención proporciona un roedor, que comprende un reemplazo de un fragmento genómico de un gen de IL-4 de roedor en un locus de IL-4 endógeno de roedor con un fragmento genómico de un gen de IL-4 humano para formar un gen de IL-4 modificado, en donde el gen de IL-4 modificado codifica una proteína IL-4 humana y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano, en donde la expresión del gen de IL-4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de IL-4 endógeno de roedor.

La invención proporciona además una célula madre embrionaria (ES) de roedor, que comprende un reemplazo de un fragmento genómico de un gen de IL-4 de roedor en un locus de IL-4 endógeno de roedor con un fragmento genómico de un gen de IL-4 humano para formar un gen de IL-4 modificado, en donde el gen de IL-4 modificado codifica una proteína IL-4 humana y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano, en donde la expresión del gen de IL-4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de IL-4 endógeno de roedor.

La invención proporciona adicionalmente un método para producir un roedor, que comprende: (a) reemplazar un fragmento genómico de un gen de IL-4 de roedor en un locus de IL-4 endógeno de roedor en una célula ES de roedor con un fragmento genómico de una IL-4 humana gen para formar un gen de IL-4 humanizado, en donde el gen de IL-4 humanizado codifica una proteína IL-4 humana y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano, en donde la expresión del gen de IL-4 está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de IL-4 endógeno de roedor; y (b) generar un roedor a partir de la célula de la etapa (a).

En la presente descripción se describen animales no humanos que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican una proteína IL-4 y/o IL-4Ra que comprende una secuencia humana.

En la presente descripción se describen animales transgénicos no humanos que comprenden un gen de IL-4 y/o IL-4Ra que es humano en su totalidad o en parte.

En la presente descripción se describen animales no humanos que expresan las proteínas IL-4 y/o IL-4Ra humanas o humanizadas.

En la presente descripción se describen animales no humanos que tienen un reemplazo (en su totalidad o en parte) de los genes de IL-4 y/o IL-4Ra endógenos del animal no humano.

En la presente descripción se describen animales no humanos que comprenden una humanización de IL-4 y/o IL-4Ra (en su totalidad o en parte) en unos loci de IL-4 y/o IL-4Ra no humanos endógenos.

En la presente descripción se describen animales no humanos que tienen un gen de IL-4 humano o humanizado, en donde los animales no humanos no expresan la proteína IL-4 endógena y en donde los animales no humanos expresan la proteína IL-4 humana o humanizada en sangre, plasma o suero a una concentración similar a la de la proteína IL-4 presente en sangre, plasma o suero de un animal no humano de la misma edad que expresa la proteína IL-4 endógena funcional, pero que no comprende el gen de IL-4 humano o humanizado.

En la presente descripción se describen animales no humanos que tienen un gen de IL-4Ra humano o humanizado, en donde los animales no humanos no expresan la proteína IL-4Ra endógena y expresan la proteína IL-4Ra humana o humanizada en células inmunitarias, por ejemplo, células B y T, a un nivel similar al de la proteína IL-4Ra presente en las células inmunes, por ejemplo, células B y T, de un animal no humano de la misma edad que expresa la proteína IL-4Ra endógena funcional, pero que no comprende el gen de IL-4Ra humano o humanizado.

En un aspecto, en la presente descripción se describen animales no humanos que comprenden una secuencia de ácido nucleico de IL-4 y/o IL-4Ra humana o humanizada.

En un aspecto, en la presente descripción se describen animales no humanos genéticamente modificados que comprenden un reemplazo en un locus de IL-4 y/o IL-4Ra endógeno de un gen que codifica una IL-4 y/o IL-4Ra endógena con un gen que codifica una proteína IL-4 y/o IL-4Ra humana o humanizada. En la presente descripción, se proporcionan roedores, por ejemplo, ratones o ratas, que comprenden un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno, en un locus de IL-4 endógeno de roedor, con un gen de IL-4 humano, y/o comprenden un reemplazo de un gen endógeno de IL-4Ra, en un locus de IL-4Ra endógeno de roedor, con un gen de IL-4Ra humano. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, en la presente descripción se describen roedores genéticamente modificados, por ejemplo, ratones o ratas, que comprenden una humanización de un gen de IL-4 de endógeno de roedor, en donde la humanización comprende un reemplazo en el locus de IL-4 endógeno de roedor de un gen de roedor que codifica un exón de un gen de IL-4 con una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un exón de un gen de IL-4 humano para formar un gen de IL-4 modificado, en donde la expresión del gen de IL-4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de IL-4 endógeno de roedor.

En un aspecto, el roedor es un ratón o una rata. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, el gen de IL-4 modificado codifica la proteína IL-4 humana o humanizada y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano.

En un aspecto, el roedor es un ratón que es incapaz de expresar una proteína IL-4 de ratón.

En un aspecto, el roedor es un ratón que expresa una proteína IL-4Ra de ratón codificada por un gen endógeno de IL-4Ra de ratón.

En un aspecto, el roedor es un ratón que expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada.

En un aspecto, la proteína IL-4Ra humanizada comprende el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana.

En un aspecto, la proteína IL-4Ra humanizada comprende el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de una proteína IL-4Ra de ratón.

En un aspecto, el roedor es un ratón que comprende un reemplazo en un locus de IL-4Ra endógeno de ratón de un ácido nucleico de ratón que comprende al menos un exón de un gen de IL-4Ra de ratón con una secuencia de ácido nucleico que comprende al menos un exón de un gen de IL-4Ra humano para formar un gen de IL-4Ra modificado, en donde la expresión del gen de IL-4Ra modificado está bajo el control de elementos reguladores de ratón en el locus de IL-4Ra endógeno de ratón.

En un aspecto, el roedor es un ratón, en donde un fragmento genómico contiguo de la secuencia de IL-4 de ratón que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 de IL-4 de ratón se reemplaza con un fragmento genómico contiguo de la secuencia de IL-4 humana que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 de IL-4 humana.

En un aspecto, la expresión del gen de IL-4Ra humano que codifica la proteína IL-4Ra humana o humanizada está bajo el control de elementos reguladores de ratón en el locus de IL-4Ra endógeno de ratón.

Los roedores genéticamente modificados, por ejemplo, ratones o ratas, pueden comprender una humanización de un gen de IL-4Ra endógeno de roedor, en donde la humanización comprende un reemplazo en un locus de IL-4Ra endógeno de roedor de un ácido nucleico de roedor que comprende un exón del gen de IL-4Ra de roedor con una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un exón de un gen de IL-4Ra humano para formar un gen de IL-4Ra modificado (es decir, humanizado), en donde la expresión del gen de IL-4Ra humanizado modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de IL-4Ra endógeno de roedor.

En un aspecto, el gen de IL-4Ra modificado codifica la proteína IL-4Ra humana o humanizada y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 del gen de IL-4Ra humano.

En un aspecto, el roedor es un ratón que es incapaz de expresar una proteína IL-4Ra de ratón.

En un aspecto, el roedor es un ratón que expresa una proteína IL-4 de ratón codificada por un gen de IL-4 endógeno de ratón.

En un aspecto, el roedor es un ratón que expresa una proteína IL-4 humana o humanizada.

En un aspecto, el roedor es un ratón que comprende un reemplazo en un locus de IL-4 endógeno de ratón de un ácido nucleico de ratón que comprende un exón de un gen de IL-4 de ratón con una secuencia de ácido nucleico que codifica al menos un exón de un gen de IL-4 humana para formar un gen de IL-4 modificado, en donde la expresión del gen de IL-4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de ratón en el locus de IL-4 endógeno de ratón.

En un aspecto, el roedor es un ratón, y en donde un fragmento genómico contiguo de la secuencia de IL-4Ra de ratón que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 de IL-4Ra se reemplaza con un fragmento genómico contiguo de la secuencia de IL-4Ra humana que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 de IL-4Ra humana.

En un aspecto, en la presente descripción se describen roedores genéticamente modificados, por ejemplo, un ratón o una rata, que expresan una proteína IL-4 humana o humanizada, en donde el roedor que expresa una proteína IL-4 humana o humanizada comprende un sistema inmunológico normal, es decir, el número de células inmunitarias, por ejemplo, células B y T, en la sangre, plasma o suero del roedor que expresa la proteína IL-4 humana o humanizada son similares al número de células inmunitarias, por ejemplo, células B y T, en la sangre, plasma o suero de un roedor que expresa la proteína IL-4 endógena funcional. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

Los roedores genéticamente modificados, por ejemplo, un ratón o una rata, pueden expresar la proteína IL-4 de un gen de IL-4 humano o humanizado, en donde el roedor expresa la proteína ⁱL-4 humana o humanizada en su suero. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, el suero del roedor que expresa una proteína IL-4 humana o humanizada tiene aproximadamente el mismo nivel de proteína IL-4 que un roedor que expresa una proteína IL-4 endógena funcional, por ejemplo, un ratón o rata de tipo salvaje. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, el ratón expresa una proteína IL-4 humana o humanizada en el suero a una concentración de al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o 200 % del nivel de la proteína IL-4 presente en el suero de un ratón de la misma edad que expresa una proteína IL-4 endógena funcional, pero no comprende un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno, en un locus de IL-4 endógeno de ratón, con un gen de IL-4 humano.

En un aspecto, el ratón expresa una proteína IL-4 humana o humanizada en el suero a una concentración de entre aproximadamente 10 % y aproximadamente 200 %, entre aproximadamente 20 % y aproximadamente 150 %, o entre aproximadamente 30 % y aproximadamente 100 % del nivel de la proteína IL-4 de ratón presente en el suero de un ratón de la misma edad que expresa una proteína IL-4 endógena funcional, pero no comprende un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno, en un locus de IL-4 endógeno de ratón, con un gen de IL-4 humano.

Los roedores genéticamente modificados, por ejemplo, un ratón o una rata, pueden expresar una proteína IL-4Ra humana o humanizada, en donde el roedor expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada en células inmunitarias, por ejemplo, células B y T, a un nivel similar al de la proteína IL-4Ra presente en células inmunes, por ejemplo, células B y T, de un roedor de la misma edad que expresa la proteína IL-4Ra endógena funcional. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, en la presente descripción se describen roedores genéticamente modificados, por ejemplo, un ratón o una rata, que expresan la proteína IL-4Ra de un gen de IL-4Ra humano, en donde el roedor expresa la proteína IL-4Ra humana o humanizada en células inmunitarias, por ejemplo, B y células T. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, las células inmunitarias, por ejemplo, células B y T, del roedor que expresa una proteína IL-4Ra humana tienen aproximadamente el mismo nivel de proteína IL-4Ra que las células inmunitarias, por ejemplo, células B y T, de un roedor que expresa una proteína IL-4Ra endógena funcional, por ejemplo, un ratón o rata de tipo salvaje. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, el ratón expresa la proteína IL-4Ra humana o humanizada en las células inmunitarias, por ejemplo, células B y T, a un nivel de al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o 200 % de la cantidad de proteína IL-4Ra en las células inmunitarias, por ejemplo, células B y T, de un ratón de la misma edad que expresa la proteína IL-4Ra endógena funcional, pero que no comprende un reemplazo de un gen de IL-4Ra endógeno, en un locus de IL-4Ra endógeno de ratón, con un gen de IL-4Ra humano.

En un aspecto, el ratón expresa la proteína IL-4Ra humana o humanizada en células inmunes, por ejemplo, células B y T, en una cantidad entre aproximadamente el 10 % y aproximadamente el 200 %, entre aproximadamente el 20 % y aproximadamente el 150 %, o entre aproximadamente 30 % y aproximadamente 100 % de la cantidad de proteína IL-4Ra de ratón presente en células inmunes, por ejemplo, células B y T, de un ratón de la misma edad que expresa la proteína IL-4Ra endógena funcional, pero no comprende un reemplazo de una gen de IL-4Ra endógeno, en un locus de IL-4Ra endógeno de ratón, con un gen de IL-4Ra humano.

En un aspecto, un roedor genéticamente modificado comprende un gen de IL-4Ra humanizado que comprende un reemplazo de la secuencia que codifica el ectodominio de IL-4Ra de roedor por una secuencia que codifica el ectodominio de IL-4Ra humano, en donde el gen de IL-4Ra humanizado comprende la secuencia transmembrana de IL-4Ra de roedor y una secuencia citoplasmática de IL-4Ra de roedor, donde el gen de IL-4Ra humanizado está bajo el control de elementos reguladores de IL-4Ra endógeno de roedor en el locus de IL-4Ra endógeno, y donde el roedor comprende además un gen de IL-4 humanizado que codifica una proteína IL-4 humana o humanizada, en donde el gen de IL-4 humanizado está bajo el control de elementos reguladores de IL-4 endógeno de roedor en el locus de IL-4 endógeno.

En un aspecto, el ratón es incapaz de expresar una proteína IL-4 de ratón e incapaz de expresar una proteína IL-4Ra de ratón.

En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor en el locus de IL-4 endógeno de roedor y/o el locus de IL-4Ra de roedor son de un ratón o una rata.

En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor son secuencias o elementos reguladores endógenos de roedor en el locus de IL-4 de roedor y/o locus de IL-4Ra de roedor.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o una rata, que expresa proteínas IL-4 y/o IL-4Ra humanas o humanizadas, en donde el animal no humano expresa proteínas IL-4 y/o IL-4Ra humanas o humanizadas de un locus de IL-4Ra no humano endógeno y/o un locus de IL-4Ra no humano endógeno. En un aspecto, el animal no humano es un roedor. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

Un ratón genéticamente modificado puede expresar la proteína IL-4 humana o humanizada a partir de un locus de IL-4 endógeno de ratón, en donde el gen de lL-4 endógeno de ratón se ha reemplazado, en su totalidad o en parte, con un gen de IL-4 humano.

En un aspecto, un ácido nucleico genómico de ratón contiguo de aproximadamente 6,3 kb en un locus de IL-4 endógeno de ratón, incluido el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una porción de la región 3' región aguas abajo del exón 4, se elimina y se reemplaza con aproximadamente 8,8 kb de una secuencia de ácido nucleico de IL-4 humano que comprende el exón 1 comenzando desde el codón de iniciación ATG hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una porción de la región 3' región aguas abajo del exón 4 del gen de IL-4 humano. En un aspecto específico, la secuencia de ácido nucleico de IL-4 humano que reemplaza al ácido nucleico genómico de ratón comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 y una porción de la región 3' aguas abajo del exón 4 del gen de IL-4 humano BAC RP11-17K19. En un aspecto específico, el gen de IL-4 modificado comprende elementos reguladores 5' de IL-4 de ratón y el exón 1 de IL-4 humana partiendo del codón de iniciación ATG hasta el exón 4, es decir, las secuencias codificantes de la proteína IL-4.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un ratón genéticamente modificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína IL-4 humana o humanizada, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la proteína IL-4 humana o humanizada reemplaza, en su totalidad o en parte, una secuencia de nucleótidos endógena que codifica una proteína IL-4 endógena de ratón.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un ratón genéticamente modificado que expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada de un locus de IL-4Ra endógeno de ratón, en donde el gen de IL-4Ra endógeno de ratón se ha reemplazado, en su totalidad o en parte, con un gen de IL-4Ra humano.

En un aspecto, un ácido nucleico genómico de ratón contiguo de aproximadamente 7,1 kb en el locus de IL-4Ra endógeno de ratón, incluido el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 y una porción del intrón 5, se elimina y se reemplaza con aproximadamente 15,6 kb de la secuencia de ácido nucleico de IL-4Ra humana que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 y una porción del intrón 5 del gen de IL-4Ra humano. En un aspecto específico, el ácido nucleico de IL-4a humana que reemplaza al ácido nucleico genómico de ratón comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 y una porción del intrón 5 del gen de IL-4a humano BAC RP11-16E24. En un aspecto específico, el ácido nucleico de IL-4Ra humano que reemplaza al ácido nucleico genómico de ratón comprende la secuencia codificante del ectodominio de IL-4Ra humana completa.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para producir un roedor con IL-4 humanizada, que comprende reemplazar una secuencia del gen de IL-4 de roedor que codifica la proteína IL-4 de roedor por una secuencia de ácido nucleico de IL-4 humano que comprende uno o más exones de la secuencia del gen de IL-4 humanizado para formar un gen de IL-4 humanizado modificado que codifica la proteína IL-4 humana o humanizada, en donde el reemplazo es en un locus de IL-4 endógeno de roedor y la secuencia del gen de IL-4 humanizado que comprende uno o más exones de la secuencia del gen de IL-4 humana y que codifica la proteína IL-4 humana o humanizada está unida operativamente a secuencias o elementos reguladores de roedor (por ejemplo, elementos reguladores 5' y/o 3') en el locus de IL-4 endógeno de roedor.

En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor se derivan de un ratón. En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor se derivan de una rata.

En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor son secuencias o elementos reguladores endógenos de roedor en el locus de IL-4 de roedor. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de IL-4 humano que reemplaza la secuencia del gen de IL-4 de roedor comprende al menos un exón de la secuencia del gen de iL-4 humano. En otros aspectos, la secuencia de ácido nucleico de IL-4 humano que reemplaza la secuencia del gen de IL-4 de roedor comprende al menos 2 o al menos 3 exones de la secuencia del gen de IL-4 humana. En un aspecto, la secuencia del ácido nucleico de IL-4 humano que reemplaza la secuencia del gen de IL-4 de roedor comprende los 4 exones de la secuencia del gen de IL-4 humano. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de IL-4 humano que reemplaza la secuencia del gen de IL-4 de roedor codifica una proteína que es aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a una IL-4 humana (por ejemplo, la proteína IL-4 humana codificada por el ácido nucleico expuesto en el Núm. de acceso de GenBank NM_000589.3s).

En un aspecto, el reemplazo es en un locus de IL-4 endógeno de roedor y la secuencia del gen de IL-4 humanizado que comprende uno o más exones de la secuencia del gen de IL-4 humana y que codifica la proteína IL-4 humana o humanizada está unida operativamente a secuencias o elementos reguladores endógenos de roedor (por ejemplo, elementos reguladores 5' y/o 3') en el locus de IL-4 endógeno de roedor.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para producir un ratón con IL-4 humanizado, que comprende reemplazar una secuencia del gen de IL-4 de ratón que codifica la proteína IL-4 de ratón por una secuencia del gen de IL-4 humano para formar un gen de IL-4 humanizado modificado que codifica la proteína IL-4 humana o humanizada.

En un aspecto, el reemplazo es en un locus de IL-4 endógeno de ratón, y el gen de IL-4 humanizado resultante que codifica la proteína IL-4 humana o humanizada está unido operativamente a secuencias o elementos reguladores de ratón (por ejemplo, elementos reguladores 5' y/o 3') en el locus de IL-4 endógeno de ratón.

En un aspecto, el reemplazo es en un locus de IL-4 endógeno de ratón, y el gen de IL-4 humanizado que codifica la proteína IL-4 humana o humanizada está unido operativamente a secuencias o elementos reguladores endógenos de ratón (por ejemplo, elementos reguladores 5' y/o 3') en el locus de IL-4 endógeno de ratón.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para producir un roedor IL-4Ra humanizado, que comprende reemplazar una secuencia del gen de IL-4Ra de roedor que codifica la proteína IL-4Ra de roedor por una secuencia de ácido nucleico de IL-4Ra humano que comprende uno o más exones de la secuencia del gen de la proteína IL-4Ra humana para formar un gen de IL-4Ra humanizado modificado que codifica la proteína IL-4Ra humana o humanizada, en donde el reemplazo es en un locus de IL-4Ra endógeno de roedor y la secuencia del gen de IL-4Ra humanizado que comprende uno o más exones de la secuencia del gen de IL-4Ra humano y que codifica la proteína IL-4Ra humana o humanizada está unida operativamente a secuencias o elementos reguladores de roedor (por ejemplo, elementos reguladores 5' y/o 3') en el locus de IL-4Ra endógeno de roedor.

En un aspecto, las secuencias o elementos reguladores de roedor son secuencias o elementos reguladores endógenos de roedor en el locus de IL-4Ra de roedor. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico del IL-4Ra humano que reemplaza la secuencia del gen de IL-4Ra de roedor comprende al menos un exón de la secuencia del gen de IL-4Ra humano. En otros aspectos, la secuencia de nucleótidos de IL-4Ra humana que reemplaza la secuencia del gen de IL-4Ra de roedor comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 exones de la secuencia del gen de IL-4Ra humana. En un aspecto, la secuencia del gen de IL-4Ra humano que reemplaza la secuencia del gen de IL-4Ra de roedor comprende los 9 exones de la secuencia del gen de IL-4Ra humano. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, la secuencia de nucleótidos de IL-4Ra humana que reemplaza la secuencia del gen de IL-4Ra de roedor codifica una proteína que es aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a una IL-4Ra humana (por ejemplo, la proteína IL-4Ra humana codificada por el ácido nucleico expuesto en el Núm. de acceso de GenBank NM_000418.3).

En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de IL-4Ra humana que reemplaza la secuencia del gen de IL-4Ra de roedor comprende al menos un exón de la secuencia del gen de IL-4Ra humano que codifica el ectodominio de la proteína IL-4Ra humana. En otros aspectos, la secuencia de ácido nucleico de IL-4Ra humano que reemplaza la secuencia del gen de IL-4Ra de roedor comprende al menos 2, 3 o 4 exones de la secuencia del gen de IL-4Ra humano que codifica el ectodominio de la proteína IL-4Ra humana. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico de IL-4Ra humano que reemplaza la secuencia del gen de IL-4Ra de roedor comprende los 5 exones de la secuencia del gen de IL-4Ra humano que codifica el ectodominio de la proteína IL-4Ra humana. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, la secuencia del gen de IL-4Ra humano o humanizado que reemplaza la secuencia del gen de IL-4Ra de roedor codifica un ectodominio de la proteína IL-4Ra que es aproximadamente 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, o aproximadamente un 99 % idéntico al ectodominio de una proteína IL-4Ra humana (por ejemplo, la proteína IL-4Ra humana codificada por el ácido nucleico expuesto en el Núm. de acceso de GenBank NM_000418.3).

En un aspecto, el reemplazo es en un locus de IL-4Ra endógeno de roedor y la secuencia del gen de IL-4Ra humanizado que comprende uno o más exones de la secuencia del gen de IL-4Ra humano y que codifica la proteína IL-4Ra humana o humanizada está unida operativamente a secuencias o elementos reguladores endógenos de roedor (por ejemplo, elementos reguladores 5' y/o 3') en el locus de IL-4Ra endógeno de roedor.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un método para producir un ratón con IL-4Ra humanizada, que comprende reemplazar una secuencia del gen de IL-4Ra de ratón que codifica la proteína IL-4Ra de ratón con una secuencia de ácido nucleico de IL-4Ra humano para formar un gen de IL-4Ra humanizado que codifica la proteína IL-4Ra humana o humanizada.

En un aspecto, el reemplazo es en un locus de IL-4Ra endógeno de ratón, y el gen de IL-4Ra humanizado que codifica la proteína IL-4Ra humana o humanizada está unido operativamente a secuencias o elementos reguladores de ratón (por ejemplo, elementos reguladores 5' y/o 3') en el locus de IL-4Ra endógeno de ratón.

En un aspecto, el reemplazo es en un locus de IL-4Ra endógeno de ratón, y el gen de IL-4Ra humanizado que codifica la proteína IL-4Ra humana o humanizada está unido operativamente a secuencias o elementos reguladores endógenos de ratón (por ejemplo, elementos reguladores 5' y/o 3') en el locus de IL-4Ra endógeno de ratón.

En varios aspectos, los animales no humanos genéticamente modificados, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, descritos en la presente descripción, comprenden las modificaciones genéticas en su línea germinal. En un aspecto, un embrión de un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, un ratón o rata, comprende una modificación genética como se describe en la presente descripción.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un embrión huésped de un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo un ratón o rata, que comprende una célula donante que comprende una modificación genética como se describe en la presente descripción.

En un aspecto, una célula pluripotente o totipotente de un animal no humano, por ejemplo, un roedor, por ejemplo, ratón o rata, comprende una modificación genética como se describe en la presente descripción. En un aspecto, la célula es una célula de roedor. En un aspecto, la célula es una célula de ratón. En un aspecto, la célula es una célula ES de roedor. En un aspecto, la célula es una célula ES de ratón.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un óvulo de un animal no humano, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata, en donde el óvulo del animal no humano comprende un cromosoma ectópico del animal no humano, en donde el cromosoma ectópico del animal no humano comprende una modificación genética como se describe en la presente descripción. En un aspecto, el animal no humano es un roedor. En un aspecto, el roedor es un ratón. En un aspecto, el roedor es una rata.

En un aspecto, el embrión, óvulo, o célula de ratón que se modifica genéticamente para comprender un gen de IL-4 humano o un gen de IL-4Ra humano es de un ratón que es de una cepa C57BL seleccionada de C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr y C57BL/Ola. En otro aspecto, el ratón es una cepa 129 seleccionada del grupo que consiste en una cepa que es 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por ejemplo, 129S1/SV, 129S1/Svlm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por ejemplo, Festing y otros (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, ver además, Auerbach y otros (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). En un aspecto específico, el ratón genéticamente modificado es una mezcla de una cepa 129 mencionada anteriormente y una cepa C57BL/6 mencionada anteriormente. En otro aspecto específico, el ratón es una mezcla de las cepas 129 mencionadas anteriormente, o una mezcla de las cepas BL/6 mencionadas anteriormente. En un aspecto específico, la cepa 129 de la mezcla es una cepa 129S6 (129/SvEvTac). En otro aspecto, el ratón es una cepa BALB, por ejemplo, una cepa BALB/c. En aún otro aspecto, el ratón es una mezcla de una cepa BALB y otra cepa mencionada anteriormente. En un aspecto, el ratón es un ratón Swiss o Swiss Webster.

En varios aspectos, los animales no humanos que comprenden una secuencia de ácido nucleico de IL-4R y/o IL-4 humana o humanizada se seleccionan de mamíferos y aves. En un aspecto, los animales no humanos son mamíferos. En un aspecto, los mamíferos son murinos.

En un aspecto, en la presente descripción se describe un método de tamizaje de un antagonista de IL-4 o IL-4Ra específico para humanos. El método se usa para identificar candidatos terapéuticos y evaluar la eficacia terapéutica. El método comprende administrar un agente a un roedor genéticamente modificado que está doblemente humanizado para IL-4 e IL-4Ra como se describe en la presente descripción, determinando un efecto del agente sobre una función biológica mediada por la vía de señalización de IL-4/IL-4Ra, e identificar el agente como un antagonista de IL-4 o IL-4Ra específico para humanos si antagoniza la función mediada por la vía de señalización de IL-4/IL-4Ra en el roedor genéticamente modificado.

En un aspecto, el agente comprende un dominio variable de inmunoglobulina que se une a IL-4 o IL-4Ra. En un aspecto, el agente se une específicamente a IL-4 o IL-4Ra humana, pero no a IL-4 o IL-4Ra de roedor. En un aspecto, el agente es un anticuerpo. En un aspecto específico, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a IL-4Ra humano, pero no a IL-4Ra de roedor.

En un aspecto, el método de tamizaje usa un ratón doblemente humanizado que expresa una proteína IL-4 humana y una proteína IL-4Ra humanizada, en donde la proteína IL-4Ra humanizada incluye el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana, unida a la dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína IL-4Ra de ratón endógena, y en donde el ratón no expresa IL-4 murina o IL-4Ra murina.

En algunos aspectos, el método de tamizaje incluye las etapas de inducir en un roedor doblemente humanizado como se describe en la presente descripción una enfermedad asociada con la señalización de IL-4/IL-4Ra, administrar un agente al roedor, determinar si el agente mejora la enfermedad e identificar el agente como un antagonista de IL-4 o IL-4Ra específico para humanos adecuado para tratar la enfermedad si el agente mejora la enfermedad.

En algunos aspectos, la enfermedad asociada con la señalización de IL-4/IL-4Ra es la inflamación de las vías respiratorias, que puede inducirse en un roedor por medio de la administración intranasal de un alérgeno (por ejemplo, extracto de ácaro del polvo doméstico) en una o más dosis durante un período de tiempo. El efecto de un agente se puede determinar midiendo si la extensión de la inflamación de las vías respiratorias (reflejada, por ejemplo, por acumulación de moco, infiltración de células en el fluido de lavado broncoalveolar y/o niveles de IgE circulante total), se reduce como resultado de la administración del agente.

En algunos aspectos, la enfermedad asociada con la señalización de IL-4/IL-4Ra es la inflamación de la piel o la dermatitis atópica, que puede inducirse en un roedor al crear una lesión en la piel y exponer la piel lesionada a un alérgeno (por ejemplo, toxina bacteriana o extracto de ácaros de polvo doméstico) en una o más dosis durante un período de tiempo. El efecto de un agente se puede determinar midiendo si la inflamación de la piel se reduce como resultado de la administración del agente.

En un aspecto adicional, un animal no humano triplemente humanizado cuyos genes de IL-4, IL-4Ra e IL-33 se han humanizado como se describe en la presente descripción se usa para evaluar la farmacodinámica (PD) y la eficacia terapéutica de un compuesto o una combinación. de compuestos.

Es posible usar en conjunto cada uno de los aspectos y modalidades descritos en la presente descripción, a menos que se excluyan explícitamente o evidentemente a partir del contexto del aspecto o modalidad.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 proporciona una ilustración, no a escala, de los receptores para la transducción de señales de IL-4 e IL-13 y el mecanismo de acción de dupilumab, un anticuerpo monoclonal neutralizante completamente humano que se une específicamente a la cadena a del receptor de iL-4 humano ( IL-4Ra).

Las Figuras 2A-2B proporcionan una ilustración, no a escala, de las estrategias para la humanización del loci de IL-4 (Il4) e IL-4Ra (Il4ra). (2A) El gen de IL-4 de ratón (arriba) que abarca la región codificante desde el exón 1 comenzando en el codón de iniciación ATG hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una porción de la región 3' aguas abajo del exón 4 se eliminan y reemplazan por la región codificante del exón 1 que comienza en el codón ATG hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una porción de la región 3' aguas abajo del exón 4 del gen de IL-4 humano (parte inferior) junto con un casete de selección higro flanqueado por sitios loxP, como se indica. (2B) El gen de IL-4Ra de ratón (arriba) que abarca la región codificante del exón 1 comenzando desde el codón de iniciación ATG hasta el exón 5 y una porción del intrón 5 se eliminan y reemplazan por la región codificante del exón 1 comenzando desde el inicio ATG que codifica a través del exón 5 y una porción del intrón 5 del gen de IL-4Ra humano (parte inferior) y un casete de selección neo flanqueado por sitios loxP, como se indica.

La Figura 3 muestra la expresión de la proteína IL-4Ra humanizada en células B y T de IL-4/IL-4Ra doblemente humanizada (Il4hulhu/Il4rahulhu) de ratón.

La Figura 4 muestra las especificidades del ligando de IL-4 e IL-13 y las funcionalidades del receptor mediante el uso de células primarias derivadas de ratones IL4Ra humanizados (Il4rahulhu).

La Figura 5 muestra la producción de IgE dependiente de IL-4 in vivo en ratones de tipo salvaje pero no humanizados de IL4Ra (Il4rahulhu).

La Figura 6 muestra que la inducción de IL-4 dependiente de la dosis de la producción de mIgE ex vivo en células B de ratón (panel izquierdo) está bloqueada por dupilumab, de una manera dependiente de la dosis (panel derecho).

La Figura 7 muestra que dupilumab, previene las patologías pulmonares inducidas por IL-25 in vivo en ratones IL4Ra humanizados (Il4rahu/hu), de una manera dependiente de la dosis.

La Figura 8 muestra el diseño experimental para evaluar la eficacia terapéutica de dupilumab en un modelo de inflamación pulmonar inducida por extracto de ácaros de polvo doméstico (HDM) mediante el uso de ratones con doble humanización de IL-4 e IL-4Ra (IL-4) (hu/hu/|L-4Rhu/hu). "REGN668" se refiere a un anticuerpo monoclonal humano dirigido a IL-4Ra humana, también conocido como dupilumab. "REGN129" se refiere a un ratón sol IL-13Ra2-PK, que es una proteína de fusión entre el ectodominio de IL-13R2a de ratón y un Fc.

La Figura 9 muestra el diseño experimental para evaluar la eficacia terapéutica de dupilumab en un modelo de inflamación pulmonar inducida por HDM mediante el uso de ratones con doble humanización de IL-4 e IL-4Ra (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/htu) y un anticuerpo de control de isotipo.

Las Figuras 10A-10C ilustran las estrategias para la humanización del locus IL-33 de ratón. La Figura 10A ilustra que el gen de IL-33 de ratón (arriba) que abarca la región codificante del exón 2 que comienza en el codón de iniciación ATG hasta del codón de terminación en el exón 8 se elimina y se reemplaza por la región codificante del exón 2 que comienza en el codón ATG hasta exón 8 (que incluye la región no traducida 3') del gen de IL-33 humano (parte inferior). La Figura 10B muestra el alelo de IL-33 humanizado en el clon MAID 7060 de células de ratón ES, que contiene un casete de selección de neomicina loxP.

La Figura 10C muestra el alelo de IL-33 humanizado en el clon MAID 7061 de células de ratón ES, en donde se ha eliminado el casete de selección de neomicina, con loxP y los sitios de clonación (77 pb) restantes aguas abajo de la secuencia de IL-33 humana, y 3'UTR de ratón retenido aguas abajo del sitio loxP.

Descripción detallada

IL-4 e IL-4Ra como dianas terapéuticas

Los trastornos alérgicos son un espectro de enfermedades que ocurren a una velocidad creciente, especialmente en los países desarrollados. La dermatitis atópica, el asma y la rinitis alérgica son las afecciones inflamatorias más comunes entre los pacientes con alergias; estos pacientes a menudo sufren la aparición de múltiples síntomas clínicos. La patogenia de la alergia está relacionada con respuestas inmunes anormales contra antígenos exógenos (ver Mueller y otros, (2002) Structure, binding, and antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system, Biochim Biophys Acta 1592:237-250).

La sobreproducción de IgE específica de antígeno es un componente esencial para desencadenar la inflamación alérgica. La polarización anormal de las células T cooperadoras de tipo-2 (Th2) contribuye al aumento de las respuestas de IgE.

La interleucina-4 (IL-4) y la interleucina-13 (IL-13), originalmente identificadas a partir de células T activadas, son las principales citocinas Th2 que desempeñan un papel central en el inicio y mantenimiento de las reacciones inmunes e inflamatorias en las alergias.

La señalización de IL-4 e IL-13 es mediada por dos complejos de receptores distintos con una subunidad compartida, el receptor alfa de IL-4 (IL-4Ra), que puede contribuir a las respuestas biológicas solapadas entre estas dos citocinas. Ver la Figura 1.

Transducción de señales de los receptores de interleucina-4/13 y el mecanismo de acción de dupilumab. El IL-4Ra forma dos complejos de receptores heterodiméricos distintos para mediar en las funciones biológicas de IL-4 e IL-13 de una manera específica para tejido y respuesta. El receptor de tipo I compuesto por IL-4Ra y la cadena gamma del receptor de citocinas común (yC) es único para IL-4. El receptor de tipo II formado entre IL-4Ra e IL-13Ra1 es el receptor principal de IL-13, pero también es funcional para IL-4. Además, IL-13 se unirá a un segundo receptor de alta afinidad, IL-13Ra2, que generalmente se reconoce como un receptor señuelo o con un posible efecto profibrótico en la forma de longitud completa.

El Dupilumab es un anticuerpo monoclonal antagonista contra IL-4Ra humano que inhibe las actividades biológicas inducidas por IL-4 e IL-13. El Dupilumab bloquea la transducción de señales de IL-4 al evitar su unión a subunidades del receptor, mientras que el efecto inhibidor sobre la señalización de IL-13 probablemente esté mediado por la interferencia con la interacción del receptor dimérico.

El Dupilumab, un anticuerpo monoclonal completamente humano dirigido contra la subunidad compartida de IL-4Ra, fue desarrollado en Regeneron Pharmaceuticals, Inc. mediante el uso de ratones VelocImmune®. El Dupilumab se encuentra en ensayos clínicos para el tratamiento del asma de moderada a grave y para el tratamiento de la dermatitis atópica de moderada a grave.

La evaluación de la potencia de dupilumab en modelos murinos presenta múltiples desafíos: (a) el dupilumab no reconoce el receptor afín por IL-4 de ratón; y (b) hay una falta de interacción funcional entre la proteína IL-4 de ratón y el receptor de IL-4 humano.

Gen y proteína de IL-4

El gen de IL-4 codifica una proteína IL-4 secretada, que juega un papel importante en la activación de las células B, así como también de otros tipos de células (ver Figura 1).

IL-4 humana. ID del gen en NCBI: 3565; Fuente primaria: HGNC:6014; Transcrito en RefSeq: NM_000589.3; ID en UniProt: P05112; Ensamble genómico: GRCh37; Ubicación: chr5:132,009,743-132,018,576 hebra+.

El gen de IL-4 humano se encuentra en el cromosoma 5, en 5q31.1. El gen de IL-4 humano tiene 4 exones y codifica un polipéptido precursor de 153 aminoácidos de longitud, que incluye un péptido señal de 24 aminoácidos y una proteína IL-4 madura de 129 aminoácidos.

IL-4 de ratón. ID del gen en NCBI: 16189; Fuente primaria: MGI:96556; Transcrito en RefSeq: NM_021283.2; ID en UniProt: P07750; Ensamble genómico: GRCm38; Ubicación: chr11:53,612,350-53,618,606 hebra-.

El gen de IL-4 de ratón se ubica en el cromosoma 11, en 11 31.97 cM. El gen de IL-4 de ratón tiene 4 exones y codifica un polipéptido precursor de 140 aminoácidos de longitud, que incluye un péptido señal de 20 aminoácidos y una proteína IL-4 madura de 120 aminoácidos.

Gen y proteína IL-4Ra

El gen de IL-4Ra codifica el receptor transmembrana de la proteína IL-4Ra, que se expresa principalmente en las células B y T, es un receptor de las proteínas IL-4 e IL-13 (ver Figura 1).

lL-4Ra humana. ID del gen en NCBI: 3566; Fuente primaria: MGI:6015; transcrito en RefSeq: NM_000418.3; ID en UniProt: P24394; Ensamble genómico: GRCh37; Ubicación: chr16:27,351,525-27,367,111 hebra+.

El gen de IL-4Ra humano se ubica en el cromosoma 16 en 16p12.1-p11.2. El gen de IL-4Ra humano tiene 9 exones codificantes y codifica un polipéptido precursor de 825 aminoácidos, incluido un péptido señal de 25 aminoácidos y una proteína IL-4Ra madura de 800 aminoácidos, con los primeros 207 residuos de aminoácidos de la proteína madura que constituye el dominio extracelular. El dominio extracelular (es decir, ectodominio) de la proteína IL-4Ra humana está codificado por los exones codificantes 1 a 5 del gen de IL-4Ra humano.

IL-4Ra de ratón. ID del gen en NCBI: 16190; Fuente primaria: MGI: 105367; transcrito en RefSeq: NM_001008700.3; ID en UniProt: P16382; Ensamble genómico: GRCm38; Ubicación: chr11:125,565,655-125,572,745 hebra+.

El gen de IL-4Ra de ratón se ubica en el cromosoma 7, en 768.94 cM. El gen de IL-4Ra de ratón tiene 9 exones codificantes y codifica un polipéptido precursor de 810 aminoácidos, incluido un péptido señal de 25 aminoácidos y una proteína IL-4Ra madura de 785 aminoácidos, con los primeros 208 residuos de aminoácidos de la proteína madura que constituye el dominio extracelular. El dominio extracelular (es decir, ectodominio) de la proteína IL-4Ra humana está codificado por los exones codificantes 1 a 5 del gen de IL-4Ra de ratón.

Especificidad de especie de proteínas IL-4 e IL-4Ra

Como se muestra en la presente descripción, la IL-4 de ratón, pero no la humana, es funcional en ratones de tipo salvaje y, a la inversa, la IL-4 humana, pero no la de ratón, es funcional en ratones IL-4Ra humanizados (Il4rahu/hu). (ver también, por ejemplo, Andrews y otros, (2001) Reconstitution of a functional human type II IL-4/IL-13 receptor in mouse B cells: demonstration of species specificity, J Immunol. 166:1716-1722).

Especificidad de especie de los inhibidores de IL-4 y IL-4Ra humanas

Las moléculas terapéuticas candidatas que se dirigen a las proteínas IL-4 o IL-4Ra se evalúan típicamente en cuanto a farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) en animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas. Tales moléculas terapéuticas también se prueban para determinar la eficacia terapéutica in vivo en modelos de animales no humanos, por ejemplo, roedor, por ejemplo, ratón o rata, de enfermedades, trastornos y afecciones humanas asociadas con células Th2 anormales.

Sin embargo, las moléculas terapéuticas que son específicas para las proteínas IL-4 o IL-4Ra humanas, por ejemplo, inhibidores de IL-4 o IL-4Ra específicos para humanos, no pueden evaluarse adecuadamente en cuanto a la PD o la eficacia terapéutica in vivo en roedores, en particular ratones, porque faltan las dianas de estas moléculas terapéuticas. Este problema no se resuelve mediante el uso de animales transgénicos no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, que expresan proteínas IL-4 o IL-4Ra humanas debido a la especificidad de especie de la proteína IL-4 mencionada anteriormente.

En consecuencia, en varios aspectos, para evaluar la PD y la eficacia terapéutica in vivo de un antagonista o inhibidor de la proteína IL-4 o IL-4Ra específico para humanos en animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, es conveniente reemplazar las proteínas IL-4 y/o IL-4Ra endógenas por proteínas IL-4 y/o lL-4Ra humanas.

Además, en varios aspectos, con el fin de evitar problemas potenciales de expresión excesiva o insuficiente de las proteínas IL-4 y/o IL-4Ra humanas, es conveniente insertar los genes de IL-4 y/o IL-4Ra humanos en el genoma de los animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, en los loci de los genes de IL-4 y/o IL-4Ra endógenos, y expresar las proteínas IL-4 y/o IL-4Ra humanas en animales no humanos, por ejemplo, roedores, por ejemplo, ratones o ratas, bajo el control, al menos en parte, de los elementos reguladores endógenos de IL-4 y/o IL-4Ra.

Animales no humanos genéticamente modificados

En la presente descripción se describen animales no humanos genéticamente modificados cuyo gen de IL-4 endógeno y/o gen de IL-4Ra ha sido reemplazado en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4 endógeno y/o el locus de IL-4Ra, con un ácido nucleico de IL-4 y/o ácido nucleico de IL-4Ra humano para formar un gen de IL-4 modificado y/o un gen de IL-4Ra modificado que codifica una IL-4 humana o humanizada y/o una proteína IL-4Ra humana o humanizada.

La frase "animal no humano", como se usa en la presente se refiere a cualquier organismo vertebrado que no sea un ser humano. En algunos aspectos, un animal no humano es un mamífero. En aspectos específicos, el animal no humano es un roedor como una rata o un ratón.

En un aspecto, en la presente descripción se describen roedores genéticamente modificados, por ejemplo, ratones o ratas, cuyo gen de iL-4 endógeno de roedor se ha reemplazado en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4 endógeno, con un ácido nucleico de IL-4 humano.

el reemplazo implica el reemplazo de al menos un exón, es decir, uno o más exones, de un gen de IL-4 de roedor por un ácido nucleico humano que comprende al menos un exón de un gen de IL-4 humano. En algunos aspectos, un fragmento genómico de roedor contiguo que incluye el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 de un gen de IL-4 de roedor ha sido reemplazado por un fragmento genómico humano contiguo que incluye el exón 1 que comienza a partir del codón de inicio ATG hasta el exón 4 de un gen de IL-4 humano. En un aspecto específico, el roedor es un ratón y un fragmento genómico de ratón contiguo de aproximadamente 6,3 kb en un locus de IL-4 endógeno de ratón, incluido el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una porción de la región 3' aguas abajo del exón 4, se elimina y se reemplaza con aproximadamente 8,8 kb de una secuencia de ácido nucleico de IL-4 humano que comprende el exón 1 comenzando desde el codón de iniciación ATG hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una porción de la región 3' aguas abajo del exón 4 del gen de IL-4 humano.

En algunos aspectos, el reemplazo da como resultado un gen de IL-4 humanizado modificado en un locus del gen de IL-4 endógeno, en donde la expresión del gen de IL-4 modificado está bajo el control de los elementos reguladores endógenos en el locus de IL-4 endógeno. El término "elementos reguladores" como se usa en la presente se refiere a secuencias reguladoras transcripcionales, que incluyen tanto secuencias reguladoras transcripcionales 5' como elementos promotores, potenciadores y supresores, como secuencias reguladoras transcripcionales 3' como una secuencia de terminación transcripcional. En algunos aspectos, la expresión de un gen de IL-4 modificado está bajo el control de los elementos reguladores 5' endógenos. En otros aspectos, la expresión de un gen de IL-4 modificado está bajo el control de los elementos reguladores 3' endógenos. En ciertos aspectos, la expresión de un gen de IL-4 modificado está bajo el control de los elementos reguladores endógenos 5' y 3'.

El gen de IL-4 humanizado modificado formado en un locus de IL-4 endógeno codifica una proteína IL-4 humana o humanizada. El término "humanizado" se refiere a ácidos nucleicos o proteínas que incluyen porciones o secuencias de un gen o proteína que se encuentra en un animal no humano (por ejemplo, un roedor como un ratón o una rata), y también incluye porciones o secuencias que difieren de las que se encuentran en un animal no humano, sino que corresponden a (son idénticas a) porciones o secuencias del gen o proteína humanos homólogos. El gen de IL-4 humanizado modificado puede codificar una proteína IL-4 que sea al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica, o 100 % idéntica, con un proteína IL-4 humana (por ejemplo, la proteína IL-4 humana codificada por el ácido nucleico expuesto en el Núm. de acceso de GenBank NM_000589.3).

Un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo en su totalidad o en parte de un gen de IL-4 endógeno de roedor, en un locus de IL-4 endógeno, con un ácido nucleico de IL-4 humano, puede ser homocigótico o heterocigótico con respecto al reemplazo. En algunos aspectos, el roedor genéticamente modificado es heterocigótico con respecto al reemplazo, es decir, solo una de las dos copias del gen de IL-4 endógeno de roedor se ha reemplazado por un ácido nucleico de IL-4 humano. En otros aspectos, el roedor genéticamente modificado es homocigótico con respecto al reemplazo, es decir, ambas copias del gen de IL-4 endógeno de roedor se han reemplazado por un ácido nucleico de IL-4 humano.

El roedor genéticamente modificado expresa una proteína IL-4 humana o humanizada en el suero. En algunos aspectos, el roedor genéticamente modificado no expresa la proteína IL-4 de roedor endógena. En un aspecto, el suero del roedor que expresa una proteína IL-4 humana o humanizada tiene aproximadamente el mismo nivel de proteína IL-4 que un roedor que expresa una proteína IL-4 endógena funcional, por ejemplo, un roedor de tipo salvaje (por ejemplo, un roedor que expresa la proteína IL-4 endógena funcional, pero no comprende un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4 endógeno, con un ácido nucleico de IL-4 humano). Por "aproximadamente el mismo nivel" se entiende un nivel dentro de un 25 %, 20 %, 15 %, 10 %, 5 % o menos en cualquier dirección (es decir, mayor o menor que) del nivel de un roedor tipo salvaje. En otros aspectos, el roedor expresa una proteína IL-4 humana o humanizada en suero a una concentración de al menos aproximadamente 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o 200 % del nivel de proteína IL-4 presente en el suero de un roedor de la misma edad que expresa la proteína IL-4 endógena funcional, pero no comprende un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4 endógeno, con un ácido nucleico de IL-4 humano.

En algunos aspectos, un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno de roedor en su totalidad o en parte con un ácido nucleico de ⁱL-4 humano y que expresa una proteína IL-4 humana o humanizada en el suero tiene un sistema inmunológico normal, es decir, el número de células inmunes, por ejemplo, células B y T, en la sangre, plasma o suero del roedor que expresa la proteína IL-4 humana o humanizada es similar al número de células inmunes, por ejemplo, células B y T, en la sangre, plasma o suero de un roedor que expresa la proteína IL-4 endógena funcional y no tiene un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno de roedor en su totalidad o en parte por un ácido nucleico de IL-4 humano.

En aspectos adicionales, un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno de roedor en su totalidad o en parte con un ácido nucleico de IL-4 humano y que expresa una proteína IL-4 humana o humanizada, también incluye un reemplazo del gen de IL-4Ra endógeno de roedor en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4Ra endógeno, con un ácido nucleico de IL-4Ra humano y, como resultado, también expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada.

En otro aspecto, en la presente descripción se describen roedores genéticamente modificados, por ejemplo, ratones o ratas, cuyo gen de lL-4Ra endógeno de roedor se ha reemplazado en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4Ra endógeno, con un ácido nucleico de IL-4Ra humano.

El reemplazo implica el reemplazo de al menos un exón, es decir, uno o más exones, de un gen de IL-4Ra de roedor por un ácido nucleico humano que comprende al menos un exón de un gen de IL-4Ra humano. En algunos aspectos, el reemplazo implica el reemplazo de al menos uno de los exones de un gen de IL-4Ra de roedor que codifica el ectodominio de roedor por al menos uno de los exones del gen de IL-4Ra humano que codifica el ectodominio humano. En algunos aspectos, el reemplazo implica el reemplazo con un ácido nucleico humano que comprende al menos 2, 3 o 4 de los 5 exones que codifican el ectodominio de un gen de IL-4Ra humano. En otros aspectos, un fragmento genómico de roedor contiguo que incluye el exón 1 comenzando desde el codón de iniciación ATG hasta el exón 5 de un gen de IL-4Ra de roedor ha sido reemplazado por un fragmento genómico que incluye el exón 1 comenzando desde el codón de inicio ATG hasta el exón 5 de un gen de IL-4Ra humano. En aspectos específicos, el roedor es un ratón, y un fragmento genómico de ratón contiguo de aproximadamente 7,1 kb en un locus de IL-4Ra endógeno de ratón, incluido el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 y una porción del intrón 5, es eliminado y reemplazado con aproximadamente 15,6 kb de una secuencia de ácido nucleico de IL-4Ra humano que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 y una porción del intrón 5 del gen de IL-4Ra humano.

En algunos aspectos, el reemplazo da como resultado un gen de IL-4Ra humanizado modificado en un locus del gen de IL-4Ra endógeno, en donde la expresión del gen de IL-4Ra modificado está bajo el control de los elementos reguladores endógenos en el locus de IL-4Ra endógeno.

El gen de IL-4Ra humanizado modificado formado en un locus de IL-4Ra endógeno codifica una proteína IL-4Ra humana o humanizada. En algunos aspectos, el gen de IL-4Ra humanizado modificado codifica una proteína IL-4Ra que es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntica, o 100 % idéntica, con una proteína IL-4Ra humana (por ejemplo, la proteína IL-4 humana codificada por el ácido nucleico expuesto en el Núm. de acceso de GenBank NM_000418.3). En otros aspectos, el gen de IL-4Ra modificado codifica una proteína IL-4Ra humanizada que comprende un ectodominio que es al menos 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % idéntico, o es 100 % idéntico, con el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana (por ejemplo, la proteína IL-4 humana codificada por el ácido nucleico expuesto en el Núm. de acceso de GenBank NM_000418.3). En aspectos específicos, los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína IL-4Ra humanizada son idénticos a los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína IL-4Ra endógena de roedor.

Un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo de un gen de IL-4Ra endógeno de roedor en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4Ra endógeno, con un ácido nucleico de IL-4Ra humano, puede ser homocigótico o heterocigótico con respecto al reemplazo. En algunos aspectos, el roedor genéticamente modificado es heterocigótico con respecto al reemplazo, es decir, solo una de las dos copias del gen de IL-4Ra del roedor endógeno ha sido reemplazada por un ácido nucleico de IL-4Ra humano. En otros aspectos, un roedor genéticamente modificado es homocigótico con respecto al reemplazo, es decir, ambas copias del gen de IL-4Ra del roedor endógeno se han reemplazado por un ácido nucleico de lL-4Ra humano.

El roedor genéticamente modificado descrito en la presente descripción expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada en células inmunitarias, por ejemplo, células B y T. En algunos aspectos, el roedor genéticamente modificado no expresa la proteína IL-4Ra endógena de roedor. En un aspecto, las células inmunes del roedor que expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada tienen aproximadamente el mismo nivel de proteína IL-4Ra en células inmunes que un roedor que expresa una proteína IL-4Ra endógena funcional en células inmunes de un roedor de tipo salvaje que expresa una proteína IL-4Ra endógena funcional y no expresa la proteína IL-4Ra humana o humanizada. En otros aspectos, el roedor expresa proteína IL-4Ra humana o humanizada en células inmunes en una cantidad de al menos aproximadamente l0 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 % o 200 % de la cantidad de proteína IL-4Ra presente en las células inmunitarias de una edad similar al roedor que expresa la proteína IL-4Ra endógena funcional, pero no comprende un reemplazo de un gen de IL-4Ra endógeno en su totalidad o en parte por un ácido nucleico de IL-4Ra humano.

En algunos aspectos, un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo de un gen de IL-4Ra endógeno de roedor en su totalidad o en parte por un ácido nucleico de IL-4Ra humano y que expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada tiene un sistema inmunológico normal, es decir, el número de células inmunes, por ejemplo, células B y T, en la sangre, plasma o suero del roedor que expresa la proteína IL-4Ra humana o humanizada es similar al número de células inmunes, por ejemplo, células B y T, en la sangre, plasma o suero de un roedor de tipo salvaje (por ejemplo, un roedor que expresa la proteína IL-4Ra endógena funcional y no tiene un reemplazo de un gen de lL-4Ra endógeno de roedor en su totalidad o en parte con un ácido nucleico de IL-4Ra humano).

En algunos aspectos, un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo de un gen de IL-4Ra endógeno de roedor en su totalidad o en parte con un ácido nucleico de IL-4Ra humano y que expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada es capaz y funcional en la mediación de señalización dependiente de IL-4 y la señalización dependiente de IL-13. Por ejemplo, una proteína IL-4Ra humanizada que tiene el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana, expresada en células inmunes de un roedor genéticamente modificado, interactúa con IL-4 humana y media la señalización dependiente de IL-4 humana por medio de la formación del receptor de tipo I (ver Figura 1). Tal proteína IL-4Ra humanizada que tiene el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana también interactúa con IL-13 humana y de ratón, y media la señalización dependiente de IL-13 por medio de la formación del receptor de tipo II (ver Figura 1). La funcionalidad de una proteína IL-4Ra humanizada expresada en un roedor genéticamente modificado puede evaluarse en varios ensayos conocidos en la técnica, incluidos los descritos específicamente en los ejemplos a continuación, tales como un ensayo que mide el cambio de clase de IgE inducido por IL-4 mediante el uso de células B primarias derivadas de un roedor genéticamente modificado.

En aspectos adicionales, un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo de un gen de IL-4Ra endógeno de roedor en su totalidad o en parte con un ácido nucleico de IL-4Ra humano y que expresa una proteína IL-4Ra humana o humanizada, también incluye un reemplazo del gen de IL-4 endógena de roedor en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4 endógeno, con un ácido nucleico de IL-4 humano y, como resultado, también expresa una IL-4 humana o humanizada.

En un aspecto adicional, en la presente descripción se describen roedores doblemente humanizados, por ejemplo, ratones o ratas, cuyo gen de IL-4 endógeno de roedor se ha reemplazado en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4 endógeno, con un ácido nucleico de IL-4 humano, y cuyo gen de IL-4Ra endógeno de roedor también ha sido reemplazado en su totalidad o en parte, en un locus de IL-4Ra endógeno, con un ácido nucleico de IL-4Ra humana. Dichos roedores doblemente humanizados pueden ser homocigóticos o heterocigóticos con respecto a cada reemplazo de humanización. En un aspecto específico, el roedor doblemente humanizado es homocigótico con respecto a la IL-4 humanizada como al IL-4Ra humanizado.

La modificación genética de un gen de IL-4 endógeno de roedor en un roedor doblemente humanizado incluye las modificaciones o reemplazos descritos anteriormente para un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo de un gen de IL-4 endógeno de roedor en su totalidad o en parte por un ácido nucleico de IL-4 humano. De manera similar, la modificación genética de un gen de IL-4Ra endógeno de roedor en un roedor doblemente humanizado incluye las modificaciones o reemplazos descritos anteriormente para un roedor genéticamente modificado que tiene un reemplazo de un gen de IL-4Ra endógeno de roedor en su totalidad o en parte por un ácido nucleico de IL-4Ra humano. Por tanto, las características descritas anteriormente con respecto a la humanización del gen de IL-4 de roedor y con respecto a la humanización del gen de roedor, respectivamente, se incorporan en la presente descripción específicamente para un roedor doblemente humanizado.

En aspectos específicos, en la presente descripción se describe un roedor doblemente humanizado, por ejemplo, un ratón o una rata, que expresa una proteína IL-4 humana y una proteína IL-4Ra humanizada, en donde la proteína IL-4Ra humanizada incluye el ectodominio de la proteína IL-4Ra humana e incluye los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína IL-4Ra endógena de roedor. En aspectos particulares, la expresión de la proteína IL-4 humana y la proteína IL-4Ra humanizada están bajo el control de las secuencias reguladoras endógenas de roedores en el locus de IL-4 endógeno de roedor y el locus de IL-4Ra de roedor, respectivamente.

En algunos aspectos, un roedor doblemente humanizado tiene un sistema inmunológico normal (es decir, el número de células inmunes es aproximadamente el mismo que un roedor de tipo salvaje), tiene aproximadamente el mismo nivel de proteína IL-4 en el suero y expresa aproximadamente la misma cantidad de proteína IL-4Ra en células inmunes, que un roedor de tipo salvaje, siendo un roedor de tipo salvaje un roedor que expresa proteína IL-4 endógena funcional y proteína IL-4Ra y no expresa la proteína IL-4 humana o humanizada o la proteína IL-4Ra. En aspectos particulares, un roedor doblemente humanizado exhibe una vía de señalización de IL-4 funcional. Por "vía de señalización funcional de IL-4" se entiende que tanto una proteína IL-4 humana o humanizada como una proteína IL-4Ra humana o humanizada se expresan en un roedor doblemente humanizado e interactúan entre sí en el roedor doblemente humanizado para mediar eficazmente la transducción de señales aguas abajo y llevar a cabo las actividades biológicas de una vía de señalización de IL-4 normal. Las actividades biológicas de una vía de señalización normal de IL-4 se describieron anteriormente y se ilustran en la Figura 1, incluidas las mediadas a través del receptor de tipo I, como el inicio y el mantenimiento de la diferenciación Th2, la activación y el crecimiento de células B, el cambio de clase a IgE e IgG4 y las mediadas por la señalización del receptor de tipo II, como la hiperplasia de células caliciformes, la fibrosis subepitelial y la remodelación tisular. Por ejemplo, una vía de señalización funcional de IL-4 en un roedor doblemente humanizado se refleja en un fenotipo inflamatorio caracterizado por, por ejemplo, aumento de IgE en la circulación, inflamación de las vías respiratorias y/o células infiltrantes eosinófilas en respuesta a un desafío de ácaros del polvo doméstico, cuyo fenotipo también se observa en roedores de tipo salvaje sin la doble humanización.

Métodos para producir un animal no humano genéticamente modificado

Un animal no humano genéticamente modificado, como un roedor, puede producirse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se puede preparar un vector de transformación que contenga un ácido nucleico humano (tal como un gen de IL-4 o IL-4Ra humano, en su totalidad o en parte), flanqueado por regiones aguas arriba y aguas abajo homólogas de animales no humanos. La construcción de transformación también puede contener un casete de selección de fármacos (por ejemplo, un casete de selección higro flanqueado por sitios loxP, que puede eliminarse subsecuentemente por medio de un vector de expresión de Cre transitorio), que se coloca en 3' con respecto al ácido nucleico humano. El vector de transformación se puede introducir en el genoma de una célula animal no humana, por ejemplo, una célula madre embrionaria (ES) (tal como una célula ES de ratón) por medio de la electroporación, por ejemplo. A continuación, se pueden introducir clones de células madre embrionarias transformadas correctamente en un embrión en etapa temprana (por ejemplo, embrión de ratón en etapa de 8 células). Los animales no humanos derivados completamente de células madre embrionarias transformadas correctamente se identifican en base a, por ejemplo, el análisis de alelos. Por ejemplo, para los animales no humanos donde las células ES genéticamente modificables adecuadas no están fácilmente disponibles, pueden emplearse otros métodos para producir un animal no humano que comprende modificaciones genéticas como se describe en la presente descripción. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, modificar un genoma de células no ES (por ejemplo, un fibroblasto o una célula pluripotente inducida) y emplear transferencia nuclear para transferir el genoma modificado a una célula adecuada, por ejemplo, un ovocito, y gestar la célula modificada (por ejemplo, el ovocito modificado) en un animal no humano en condiciones adecuadas para formar un embrión.

Métodos para emplear un animal no humano genéticamente modificado

En un aspecto, los animales no humanos con IL-4 y/o IL-4Ra genéticamente modificados descritos en la presente descripción se usan para evaluar la farmacodinámica (PD) y la eficacia terapéutica de antagonistas de IL-4 y/o IL-4Ra específicos para humanos, por ejemplo, neutralizar anticuerpos anti-IL-4 y/o anti-IL-4Ra (por ejemplo, dupilumab) en varios modelos de enfermedad, como se ilustra adicionalmente en los ejemplos más abajo.

También se describe en la presente descripción un método de tamizaje de antagonistas de IL-4 o IL-4Ra específicos para humanos mediante el uso de ratones con doble humanización de IL-4 e IL-4Ra descritos en la presente descripción.

Por "antagonistas de IL-4 o IL-4Ra" se entiende moléculas (por ejemplo, anticuerpos) que bloquean, suprimen o inhiben una o más funciones biológicas mediadas por IL-4 o IL-4Ra. "Antagonistas de IL-4 o IL-4Ra específicos para humanos" se refieren a antagonistas que son específicos de IL-4 o IL-4Ra humanos, y sustancialmente no actúan sobre IL-4 o IL-4Ra de roedores.

En aspectos específicos, el método de tamizaje usa un ratón doblemente humanizado que expresa una proteína IL-4 humana y una proteína IL-4Ra humanizada, en donde la proteína IL-4Ra humanizada incluye el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana, ligada a los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína IL-4Ra de ratón endógena, y en donde el ratón no expresa IL-4 de ratón o IL-4Ra de ratón.

En algunos aspectos, el método de tamizaje de un antagonista de IL-4 o IL-4Ra específico para humanos comprende administrar un agente a un roedor genéticamente modificado que está doblemente humanizado para IL-4 e IL-4Ra como se describe en la presente descripción, determinando un efecto del agente en una función biológica mediada por la vía de señalización de IL-4/IL-4Ra, e identificando al agente como un antagonista de IL-4 o IL-4Ra específico para humanos si antagoniza la función mediada por la vía de señalización de IL-4/IL-4Ra en el roedor genéticamente modificado.

En un aspecto, el método de tamizaje usa un ratón doblemente humanizado que expresa una proteína IL-4 humana y una proteína IL-4Ra humanizada, en donde la proteína IL-4Ra humanizada incluye el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana, ligada a los dominios transmembrana y citoplasmático de la proteína IL-4Ra de ratón endógena, y en donde el ratón no expresa IL-4 murina o IL-4Ra murino.

Por "enfermedad asociada con la señalización de IL-4/IL-4Ra" se entiende una enfermedad en la que está implicada la función biológica mediada por la señalización de IL-4/IL-4Ra. Ejemplos de enfermedades asociadas con la señalización de IL-4/IL-4Ra incluyen, por ejemplo, enfermedades o trastornos inflamatorios, como asma, dermatitis atópica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (que puede resultar al menos en parte del humo del cigarrillo), enfermedad intestinal, esclerosis múltiple, artritis, rinitis alérgica, esofagitis eosinófila y psoriasis. El asma puede ser asma eosinófila o no eosinófila y asma sensible a los esteroides o resistente a los esteroides.

En algunos aspectos, la enfermedad asociada con la señalización de IL-4/IL-4Ra es la inflamación de las vías respiratorias, que puede inducirse en un roedor por medio de la administración intranasal de un alérgeno (por ejemplo, extracto de ácaro del polvo doméstico) en una o más dosis durante un período de tiempo. El efecto de un agente se puede determinar midiendo si el grado de inflamación de las vías respiratorias (reflejado, por ejemplo, por acumulación de moco, células infiltrantes eosinófilas en el fluido de lavado broncoalveolar, niveles de IgE circulante total y/o alteración en el perfil de expresión medible mediante análisis de expresión de micromatrices) se reduce como resultado de la administración del agente. El alérgeno usado para inducir la inflamación de las vías respiratorias y el agente que se está probando se pueden administrar simultáneamente o en diferentes momentos. En algunos aspectos, el alérgeno se administra al roedor en una o más dosis, y el agente que se está probando se administra al roedor después de que se le haya administrado al menos una dosis del alérgeno.

En un aspecto adicional, los animales no humanos triplemente humanizados, es decir, los animales no humanos cuyos genes IL-4, IL-4Ra e IL-33 han sido humanizados, se usan para evaluar la farmacodinámica (PD) y la eficacia terapéutica de compuestos candidatos tales como, por ejemplo, antagonistas de IL-4 y/o IL-4Ra específicos para humanos y antagonistas de IL-33 específicos para humanos.

Por "antagonistas de IL-33" se entiende moléculas (por ejemplo, anticuerpos) que bloquean, suprimen o inhiben una o más funciones biológicas o la señalización mediada por IL-33. "Antagonistas de IL-33 específicos para humanos" se refiere a antagonistas que son específicos para la IL-33 humana, y sustancialmente no actúan sobre la IL-33 de roedor. Se sabe que la IL-33 estimula la transducción de señales a través de ST2 e IL-1 RAcP, que disminuye en presencia de un antagonista, como un anticuerpo IL-33. La inhibición de la transducción de señales de IL-33 a través de ST2 e IL-1 RAcP se puede determinar analizando la transducción de señales de IL-33 en un ensayo in vitro o in vivo, como los descritos en la Solicitud Publicada de Estados Unidos 2014/0271658 A1. Por ejemplo, puede usarse un ensayo como el descrito en la Solicitud Publicada de Estados Unidos 2014/0271658 A1 para evaluar el efecto de un anticuerpo contra IL-33 sobre la inflamación pulmonar en animales sensibilizados a alérgenos que son homocigóticos para la expresión de IL-33 humana. Un anticuerpo de IL-33 que sea efectivo como antagonista de IL-33 debería demostrar una tendencia hacia la reducción de las células inflamatorias en el pulmón, así como también una tendencia hacia la reducción de citocinas como IL-4 e IL-5.

En aspectos específicos, un animal no humano triplemente humanizado se usa en la presente descripción para evaluar compuestos candidatos, en donde el animal triplemente humanizado es un ratón triplemente humanizado que expresa una proteína IL-4 humana, una proteína IL-4Ra humanizada que incluye el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana unida a los dominios transmembrana y citoplasmático de una proteína IL-4Ra de ratón y una proteína IL-33 humana, en donde el ratón no expresa IL-4 de ratón, IL-4Ra de ratón o IL-33 de ratón.

En algunos aspectos, se usa un animal no humano triplemente humanizado para evaluar la farmacodinámica (PD) y la eficacia terapéutica de un compuesto candidato, tal como, por ejemplo, un antagonista de IL-4 y/o IL-4Ra específico para humanos, o un antagonista de IL-33 específico para humanos. Por ejemplo, un anticuerpo IL-4 específico para humanos, un anticuerpo IL-4Ra específico para humanos y un anticuerpo IL-33 específico para humanos, se pueden probar individualmente en un animal triplemente humanizado (como un roedor, por ejemplo, ratón o rata), y se pueden evaluar y comparar sus perfiles de PD y su eficacia terapéutica.

En otros aspectos, se usa un animal no humano triplemente humanizado para evaluar la eficacia de una combinación de compuestos, por ejemplo, una combinación de un anticuerpo antagonista de IL-4 y/o IL-4Ra específico humano, con un anticuerpo antagonista especifico por IL-33 humana, en comparación con la eficacia de los compuestos cuando se usan individualmente para determinar, por ejemplo, si la combinación de compuestos exhibe un efecto terapéutico sinérgico. En aspectos específicos, se prueba una combinación de un anticuerpo IL-4 específico humano y un anticuerpo IL-33 específico humano en un animal no humano triplemente humanizado. En otros aspectos específicos, se prueba una combinación de un anticuerpo IL-4Ra específico humano y un anticuerpo IL-33 específico humano en un animal no humano triplemente humanizado.

Para evaluar un compuesto candidato o una combinación de compuestos, se puede inducir una enfermedad asociada con la señalización de IL-4/IL-4Ra y la señalización de IL-33 en el animal triplemente humanizado. Ejemplos de enfermedades asociadas con la señalización de IL-4/IL-4Ra y la señalización de IL-33 incluyen, por ejemplo, enfermedades o trastornos inflamatorios, como asma, dermatitis atópica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (que puede resultar al menos en parte del humo del cigarrillo), enfermedad inflamatoria intestinal, esclerosis múltiple, artritis, rinitis alérgica, esofagitis eosinófila y psoriasis. El asma puede ser asma eosinófila o no eosinófila y asma sensible a los esteroides o resistente a los esteroides. El efecto de un compuesto o una combinación de compuestos se puede evaluar de manera similar a un animal IL-4/IL-4Ra doblemente humanizado como se describió anteriormente.

La presente invención se ilustra adicionalmente por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Reemplazo del gen de IL-4 de ratón endógeno con un gen de IL-4 humano

El gen de IL-4 humano de 8,8 kb que contiene la porción codificante del exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una parte de la región 3' aguas abajo del exón 4 del gen de IL-4 humano reemplazó 6,3 kb del locus del gen de IL-4 murino que abarca la porción codificante del exón 1 comenzando desde el codón de iniciación ATG hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una porción de la región 3' aguas abajo del exón 4. Ver la Figura 2A.

Se construyó una construcción de transformación para reemplazar el gen de IL-4 de ratón con el humano en una sola etapa de transformación mediante el uso de la tecnología de ingeniería genética VelociGene® (ver Valenzuela y otros (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). El ADN de IL-4 de ratón y humano se obtuvo de los clones bMQ-41A12 y ^rP11-17K19 de cromosomas artificiales bacterianos (BAC), respectivamente. Brevemente, una construcción de transformación linealizada con Sbfl generada por clonación de reparación de brechas que contiene brazos de homología de IL-4 de ratón aguas arriba y aguas abajo que flanquean una secuencia de IL-4 humana de 8,8 kb que se extiende desde el codón ATG en el exón 1 hasta el exón 4 (incluida la región no traducida 3') y una porción de la región 3' aguas abajo del exón 4 (coordenadas genómicas: GRCh37: chr5: 132,009,743-132,018,576 (hebra+)) y un casete de selección higro flanqueado por sitios loxP, se electroporó en células madre embrionarias (ES) de ratón F1H4 (híbrido C57BL/6 x 129 F1). Las células ES transformadas correctamente (MAID 879) se sometieron a electroporación adicional con un vector de expresión transitoria de Cre para eliminar el casete de selección para fármacos. Se introdujeron clones de células ES transformadas sin casete de fármaco (MAID 1553) en un embrión de ratón SW en etapa de 8 células por medio del método VelociMouse® (véanse las patentes de Estados Unidos núm. 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442 y Poueymirou y otros (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). Los VelociMice® (ratones F0 derivados completamente de la célula ES donante) que portan el gen de IL-4 humanizado se identificaron mediante la genotipificación de la pérdida del alelo de ratón y la ganancia del alelo humano mediante el uso de un ensayo de modificación de alelos (ver, Valenzuela y otros (2003)).

Los clones de células ES transformadas correctamente se identificaron por medio de un ensayo de pérdida de alelo nativo (LONA) (Valenzuela y otros 2003) en el que el número de copias del gen de IL-4 nativo no modificado se determinó por medio de dos reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas (qPCR) TaqMan™ específicas para secuencias en el gen de IL-4 de ratón que fueron diana de la deleción. Los ensayos de qPCR comprendieron los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'): cebador directo aguas arriba, TCGCCACTGT GCCTAACATA G (SEQ ID NO:1); cebador inverso aguas arriba, CCGGGACTAA ACTGGAACAT TC (SEQ ID NO:2); sonda aguas arriba, FAM-TCAGTCAACT TCTTCTGGGT TGTTTCC-BHQ (SEQ ID NO:3); cebador directo aguas abajo, CAGCTCTGGT GGAGAACTAG AC (SEQ ID NO:4); cebador inverso aguas abajo, GGAGGTCCTC GGTCTTTAGA AG (SEQ ID NO:5); sonda aguas abajo, FAM-TCACACTTAG GCTTATAAAC CATTCCCGT-BHQ (SEQ ID NO: 6); en los cuales FAM se refiere a la sonda 5-carboxifluoresceína fluorescente y BHQ se refiere al atenuador de fluorescencia del tipo atenuador de agujero negro (Biosearch Technologies). El ADN purificado a partir de los clones de células ES que han incluido el vector de transformación y lo han incorporado en sus genomas se combinó con la mezcla maestra para la expresión de Genes TaqMan™ (Life Technologies) de acuerdo con las sugerencias del fabricante en una placa de PCR de 384 pocillos (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) y se llevaron a cabo los ciclos en un equipo Prism 7900HT de Applied Biosystems, que recoge los datos de fluorescencia durante el transcurso de las PCR y determina un ciclo umbral (Ct), el ciclo de PCR fraccionario en donde la fluorescencia acumulada alcanza un umbral preestablecido. Las qPCR específicas para las regiones aguas arriba y aguas abajo de IL-4 y las dos qPCR para los genes de referencia no transformados se ejecutaron para cada muestra de ADN. Se calcularon las diferencias en los valores de Ct (ACt) entre cada qPCR específica de IL-4 y cada gen de referencia qPCR, y después se calculó la diferencia entre cada ACt y el ACt promedio para todas las muestras analizadas para obtener los valores de AACt para cada muestra. El número de copias del gen de IL-4 en cada muestra se calculó con la siguiente fórmula: número de copias=2x2-AACt. Un clon transformado correctamente, que ha perdido una de sus copias nativas, tendrá un número de copias del gen de IL-4 igual a uno. La confirmación de que la secuencia del gen de IL-4 humana reemplazó a la secuencia del gen de IL-4 de ratón eliminada en el alelo humanizado fue confirmada por un ensayo de qPCR TaqMan™ que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'): cebador directo humano, GCCTGGACCA AGACTCTGT (SEQ ID NO: 7); cebador inverso humano, ACCGTGG^gA^cGGCTTCTTAC (SEQ ID NO. 8); sonda aguas arriba humana, FAM-CACCGAGTTG ACCGTAACAG ACATC-BHQ (SEQ ID NO: 9). La confirmación de que el casete de selección higro se insertó con la secuencia del gen de IL-4 humana en el alelo humanizado se confirmó por medio de un ensayo qPCR TaqMan™ que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'): cebador directo higro, Tg CGGCCGAT CtTAGCC (SEQ ID NO: 10); cebador inverso higro, TTGACCGATT CCTTGCGG (SEQ ID NO: 11); sonda higro, FAM-ACGAGCGGGT TCGGCCCATT C-BHQ (SEQ ID NO: 12).

El mismo ensayo LONA se usó para analizar el ADN purificado de las biopsias de la cola de los ratones derivados de las células madre embrionarias transformadas para determinar sus genotipos de IL-4 y confirmar que el alelo de IL-4 humanizado se había transmitido a través de la línea germinal. Dos crías heterocigóticas para el reemplazo se cruzan para generar un ratón que es homocigótico para el reemplazo del gen de IL-4 endógeno de ratón por el gen de IL-4 humano. Las crías que son homocigóticas para el reemplazo se usan para la fenotipificación.

La unión aguas arriba del locus de IL-4 murina y la secuencia que contiene el gen de IL-4 humano está diseñada para estar dentro de 5'-TGCTGATTGG CCCAGAATAA CTGACAATCT GGTGTAATAA AATTTTCCAA TGTAAACTCA TTTTCCCTTG GTTTCAGCAA CTTTAACTCT ATATTAGATGATCA TGGGTCTCAC CTCCCAACTG CTTCCCCCTC TGTTCTTCCT GCTAGCATGT GCCGGCAACT TTGTCCACGG ACACAAGTGC GATATCACCT TACAGGAGAT CATCAAAACT TTGAACAGCC TCACAGAGCA GAAG) GTGAGT ACCTATCTGG CACCATCTCT CCAGATGTTC TGGTGATGCT CTCAGTATTT CTAGGCATGA AAACGTTAACAGCTGCTAGA GAAGTTGGAA CTGGTGGTTG GTGGCAGTCCAGGGCACACA GCGAGGCTTC TCCCCTGC (SEQ ID NO: 13), en donde las secuencias de IL-4 humana están en cursiva y las secuencias codificantes de IL-4 están entre corchetes. La unión aguas abajo de la secuencia que contiene el gen de IL-4 humano y el casete de selección de higro flanqueado por sitios loxP está diseñada para estar dentro de 5'-TGTTTATTTT GcAG(AATTCC TGTCCTGTGA AGGAAGCCAA CCAGAGTACG TTGGAAAACT TCTTGGAAAG GCTAAAGACG ATCATGAGAG AGAAATATTC AAAGTGTTCG AGCTGA)ATAT TTTAATTTAT GAGTTTTTGA TAGCTTTATT TTTTAAGTAT TTATATATTTA TAACTCATC ATAAAATAAA GTATATATAG AATCTAACAG CAATGGCATT TAATGTATTG GCTATGTTTA CTTGACAAAT GAAATTATGG TTTGCAACTT TTAGGGAAAT CAATTTAGTT TACCAAGAGA CTATAAATGC TATGGGAGCA AAACAGGAAA GACCACTTCC CCCTCGAGGG GTTCCCTCTC GAGTTAGGGA CATAACACAC AAGATAATTA AAGAACACAA GGCCATACAA GATGCGGCCG CACCGGTATA ACTTCGTATA AGGTATCCTA TACGAAGTTA TATGCATGGC CTCCGCGCCG GGTTTTGGCG CCTCCCGCGG GCGCCCCCCT CCTCACGGCG AGCGCTGCCA CGTCAGACGA AGGGCGCAGC GAGCGTCCTG ATCCT (SEQ ID NO: 14), en donde las secuencias de IL-4 humana están en cursiva y las secuencias codificantes de IL-4 están entre corchetes. La unión aguas abajo de la secuencia del casete de selección higro flanqueado por sitios loxP y el locus de IL-4 murina está diseñada para estar dentro de 5'-TGCCAAGTTC TAATTCCATC AGACCTCGAC CTGCAGCCGG CGCGCCATAA CTTCGTATAA GGTATCCTAT ACGAAGTTAT CTCGAGAGGA GTTCCCACCC TTCTCAAGAG CATAATGCGC AGATCATTAA GGGACAGATG CAGGCTGGGG AGACGGTTCA GCAGTTAGGA GTACCTGTTG CTCTTCCAGA GGACCCAGGT TCAATTCCCG GCACTCACAT AGCAGCTTAA AACAATAACT CAAGTTCTGG GGGAGCTGAT GCTCTCCTCT GGCCTCCTGT GGAGGTACAC AGACCACATG CCTGTAGGCA AGACACCCAC ACACATAAAA ACAAAATAAA ATAAGGATAG AAAGGCCAGG GGGATGAATC CAGAGGTAGA AGAAAACTTA TTCCCTGGAA TTGTCCTCTG ACTCCCCTCC CAAAACCTCT AACACGCAT (SEQ ID NO: 15), en donde las secuencias de casete higro están en cursiva.

Ejemplo 2

Reemplazo de la secuencia del gen del ectodominio del IL-4Ra endógeno de ratón con el ectodominio del IL-4Ra humano

Secuencia de genes

El gen de IL-4Ra humano de 15,6 kb que contiene el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 5 y una porción del intrón 5 del gen de IL-4Ra humano reemplazó 7,1 kb del locus del gen de IL-4Ra murino que abarca el exón 1 que codifica a partir del codón de iniciación ATG hasta del exón 5 y una porción del intrón 5. Se conservaron los exones de ratón 6 a 9; sólo se humanizaron los exones 1 a 5 (es decir, el ectodominio). Ver la Figura 2B.

Se construyó una construcción de transformación para reemplazar el ratón con el gen de IL-4Ra humano en una sola etapa de transformación mediante el uso de la tecnología de ingeniería genética VelociGene® (ver Valenzuela y otros, (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659). El ADN de IL-4Ra de ratón y humano se obtuvo a partir de los clones RP23-136G14 y RP11-166E24 de cromosomas artificiales bacterianos (bAc ), respectivamente. Brevemente, una construcción de transformación linealizada con NotI generada por clonación de reparación de brechas que contiene brazos de homología del gen de IL-4Ra de ratón aguas arriba y aguas abajo que flanquean una secuencia de IL-4Ra humana de 15,6 kb que se extiende desde el codón ATG en el exón 1 hasta el exón 5 y una porción del intrón 5 (coordenadas genómicas: GRCh37: chr16: 27,351,525-27,367,111 (hebra+)) y un casete de selección neo flanqueado por sitios loxP, se electroporó en células madre embrionarias (ES) de ratón F1H4 (híbrido C57BL/6 x 129 F1). Las células ES transformadas correctamente (MAID 803) se sometieron a electroporación adicional con un vector de expresión transitoria de Cre para eliminar el casete de selección para fármacos. Se introdujeron clones de células ES transformadas sin casete de fármaco (MAID 1444) en un embrión de ratón SW en etapa de 8 células por medio del método VelociMouse® (véanse las patentes de Estados Unidos núm. 7,294,754, 7,576,259, 7,659,442 y Poueymirou y otros, (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses, Nature Biotech. 25(1):91-99). Se identificaron VelociMice® (ratones F0 totalmente derivados de la célula ES del donante) que portan el gen de IL-4Ra humanizado mediante la genotipificación de la pérdida del alelo del ratón y la ganancia del alelo humano mediante el uso de un ensayo de modificación de alelos (ver, Valenzuela y otros, (2003).

Los clones de células ES transformadas correctamente se identificaron por medio de un ensayo de pérdida de alelo nativo (LONA) (Valenzuela y otros, 2003) en el que el número de copias del gen de IL-4Ra nativo no modificado se determinó por medio de dos reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas TaqMan™ (qPCR) específicas para secuencias en el gen de IL-4Ra de ratón que fueron dianas para la deleción. Los ensayos de qPCR comprendieron los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5 'a 3'): cebador directo aguas arriba, CCGCTGGCAT GTGTATTGTG (SEQ ID NO: 16); cebador inverso aguas arriba, TGAGTGTGGG ACCCTCAAGA G (SEQ ID NO: 17); sonda aguas arriba, FAM-TGACCCAAGC CCTACATGGC CACT-BHQ (SEQ ID NO: 18); cebador directo aguas abajo, TGAGGAGAGC TCACGGGAAT C (SEQ ID NO: 19); cebador inverso aguas abajo, ACCCATCTCC TGCGTTTCTG (SEQ ID NO: 20); sonda aguas abajo, FAM-TTGACACGCC AGCTACACTG CTCCA-BHQ (SEQ ID NO: 21); en el que FAM se refiere a la sonda fluorescente de 5-carboxifluoresceína y BHQ se refiere al atenuador de fluorescencia del tipo atenuador de agujero negro (Biosearch Technologies). El ADN purificado a partir de clones de células ES que han incorporado el vector de transformación y se han incorporado a sus genomas se combinó con TaqMan™ Gene Expression Master Mix (Life Technologies) de acuerdo con las sugerencias del fabricante en una placa de PCR de 384 pocillos (MicroAmp™ Optical 384-Well Reaction Plate, Life Technologies) y se cicló en un Applied Biosystems Prism 7900HT, que recopila datos de fluorescencia durante el transcurso de las PCR y determina un ciclo de umbral (Ct), el ciclo de PCR fraccional en el que la fluorescencia acumulada alcanza un umbral preestablecido. Las qPCR específicas para IL-4Ra aguas arriba y aguas abajo y las dos qPCR para los genes de referencia no transformados se ejecutaron para cada muestra de ADN. Se calcularon las diferencias en los valores de Ct (ACt) entre cada qPCR específica para IL-4Ra y cada qPCR para los genes de referencia, y después se calculó la diferencia entre cada ACt y el ACt promedio para todas las muestras analizadas para obtener los valores de AACt para cada muestra. El número de copias del gen de IL-4Ra en cada muestra se calculó con la siguiente fórmula: número de copias=2x2-AACt. Un clon transformado correctamente, que ha perdido una de sus copias nativas, tendrá un número de copias del gen de IL-4Ra igual a uno. La confirmación de que la secuencia del gen de IL-4Ra humano reemplazó a la secuencia del gen de IL-4Ra de ratón eliminado en el alelo humanizado fue confirmada por un ensayo de qPCR TaqMan ™ que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'): cebador directo humano, ACCTGCGTCT CCGACTACAT G (SEQ ID NO: 22); cebador inverso humano, GAGCTCGGTG CTGCAATTG (SEQ ID NO: 23); sonda humana, FAM-TGGGACCATT CATCTTCCAC TCGCA-BHQ (SEQ ID NO: 24). La confirmación de que el casete de selección neo se insertó con la secuencia del gen de IL-4Ra humano en el alelo humanizado se confirmó por medio de un ensayo qPCR TaqMan™ que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'): cebador directo neo, GGTGGAGAGG CTATTCGGC (SEQ ID NO: 25); cebador inverso neo, GAACACGGCG GCATCAG (SEQ ID NO: 26); sonda neo, FAM-TGGGCACAAC AGACAATCGG CTG-BHQ (SEQ ID NO: 27).

El mismo ensayo LONA se usó para analizar el ADN purificado a partir de biopsias de la cola de ratones derivados de las células ES transformadas para determinar sus genotipos de IL-4Ra y confirmar que el alelo de IL-4Ra humanizado se trasmite a través de la línea germinal. Dos crías heterocigóticas para el reemplazo se cruzan para generar un ratón que es homocigótico para el reemplazo del gen endógeno IL-4Ra de ratón por el gen de IL-4Ra humano. Las crías que son homocigóticas para el reemplazo se usan para la fenotipificación.

La unión aguas arriba del locus de IL-4Ra murino y la secuencia que contiene el gen de IL-4Ra humano está diseñada para estar dentro de 5-TGGGGGAGGG AGGCCATGAC ACAAATGAAA TGGACCCCGC TGACCCAGGA TCAGCATCTG CCCACTCTTC TTTCTGCAGG CACCTTTTG GTCCCCA (ATG GGGTGGCTTT GCTCTGGGCT CCTGTTCCCT GTGAGCTGCC TGGTCCTGCT GCAGGTGGCA AGCTCTG) GTA AGTCACCACT TCTCAATCAT TCATTTGTTG GCTATTAATG GCGTGCCAGGGCCTGCAGG (SEQ ID NO: 28), en donde las secuencias de IL-4Ra humana están en cursiva y las secuencias codificantes de IL-4Ra están subrayadas. La unión aguas abajo de la secuencia que contiene el gen de IL-4Ra humano y el casete de selección neo flanqueado por sitios loxP están diseñados para estar dentro de 5'-GTCAGATCGT GGAGGGTCTC GGACGAGGG TCCTGACCCT GGGTCTCCAG TCCTGGGAAG TGGAGCCCAG GCTGTACCAT GGCTGACCTC AGCTCATGGC Tcccgggctc gataactata acggtcctaa ggtagcgact cgagataact tcgtataatg tatgctatac gaagttatat gcatggcctc cgcgccgggt tttggcgcct cccgcgggcg cccccctcct cacggcgagc gctg (SEQ ID NO:29), en donde las secuencias de IL-4Ra humana están en cursiva y las secuencias de casete están en minúsculas. La unión aguas abajo de la secuencia del casete de selección neo flanqueado por sitios loxP y el murino IL-4Ra locus están diseñados para estar dentro de 5'-tattgttttg ccaagttcta attccatcag acctcgacct gcagccccta gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatcctag gttggagctc TCTGTAGCCA GGTAACCAAG GGTCCCAGGG GAACCCCCAG TGTGGACGCG GACTGCACAT GACACAGGGC GGCCTCCCCA TTCATGACTG TTTTTCTCCT TGCAG (ACTTC CAGCTGCCCC TGATACAGCG CCTTCCACTG GGGGTCACCA TCTCCTGCCT CTGCATCCCG TTGTTTTGCC TGTTCTGTTA CTTCAGCATT ACCAA) GTGAG TTCCTGCTTT GGCTGGTGTC TCTGGCTGGC CCTTCAGCAG TGCTCTCAGA GGTCACAGTC ATTGTGCTGG CTGAGAAAAG (SEQ ID NO: 30), en donde las secuencias de codificación del ratón IL-4Ra están entre corchetes, y las secuencias de casete neo están en minúsculas.

Ejemplo 3

Generación de ratones IL-4/IL-4Ra doblemente humanizados

Los ratones IL-4/IL-4Ra doblemente humanizados (Il4hulhu/Il4rahulhu) se generaron como sigue. El clon de células ES MAID 803, que comprende el gen de IL-4Ra humanizado y el casete neo flanqueado por sitios loxP, se sometió a electroporación con un vector de expresión Cre para eliminar el casete neo flanqueado por sitios loxP para generar el clon MAID 1444 de células ES, que comprende el gen de IL-4Ra humanizado sin casete de selección por fármaco (ver el Ejemplo 2). La misma construcción de transformación que se usó para generar el clon MAID 879 de células ES, que comprende el gen de IL-4 humanizado y el casete higro flanqueado por sitios loxP (ver Ejemplo 1), se electroporó en el clon MAID 1444 de células ES para generar las células ES 879 Het/1444 Het (Il4+/h7Il4ra+/hu), que subsecuentemente se electroporaron con un vector de expresión Cre para eliminar el casete higro flanqueado por sitios loxP para generar un clon de células ES (MAID 1553/1444) que comprende genes de IL-4 e IL-4Ra humanizados. El clon de células ES MAID 1553/1444 sin casete de fármaco se introdujo en un embrión de ratón SW en etapa de 8 células para generar ratones IL-4/IL-4Ra doblemente humanizados.

Ejemplo 4

Evaluación de la eficacia de Dupilumab, un AcM anti IL-4Ra completamente humano, en ratones con genes reemplazados con IL-4 e IL4Ra humanos

Métodos

Se crearon ratones genéticamente modificados mediante el uso de la tecnología VelociGene® para reemplazar el locus de IL-4 de longitud completa del ratón con 8,8 kb de secuencias genómicas de IL-4 humana (ver Ejemplo 1 y Figura 2A) y el dominio extracelular (es decir, ectodominio) de IL-4Ra de ratón (CD124) con un fragmento de 15,6 kb del ADN genómico de IL-4Ra humano correspondiente (ver el Ejemplo 2 y la Figura 2B).

Los ratones con un gen de IL-4Ra humanizado homocigótico se validaron para la expresión y función del gen humano. Para determinar la expresión de IL-4Ra humano por ratones humanizados, se recolectaron y procesaron esplenocitos de ratones de tipo salvaje y humanizados para el análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) con anticuerpos marcados con fluorescencia contra CD3 de ratón, CD19 de ratón, CD124 humano y CD124 de ratón. (Ver, por ejemplo, Blaeser y otros, (2003) Targeted inactivation of the IL-4 receptor a chain I4R motif promotes allergic airway inflammation, J Exp Med 198(8):1189-1200).

Para demostrar las especificidades del ligando y las funcionalidades del receptor, se usaron células primarias derivadas de ratones IL-4Ra humanizados. Los macrófagos derivados de la médula ósea se cultivaron mediante el uso de células de la médula ósea femoral de ratones IL-4Ra de tipo salvaje y humanizados en DMEM que contiene suero fetal bovino al 10 % más medio acondicionado de células L al 20 % durante 7 días.

A continuación, las células se trataron individualmente con 20 ng/ml de IL-4 de ratón, IL-13 de ratón, IL-4 humana, IL-13 humana o vehículo diluido en medio de cultivo durante 20 horas. Se recolectaron muestras por cuadruplicado de cada condición para el análisis de expresión génica.

El ARN total de estas muestras se extrajo y amplificó en ARNc incorporando Cy3-CTP. A continuación, se hibridó el ARNc marcado con Cy3 de cada muestra con un arreglo de Agilent personalizado que comprende 43538 oligos de 60 mer que cubrían transcriptomas de ratón. Los datos se extrajeron del arreglo de imágenes de escaneadas mediante el uso del software Agilent Feature Extraction Software 9.5.

Los genes expresados diferencialmente entre grupos experimentales se identificaron mediante el uso de la prueba t de Student (p<0,05, razón de cambio > 1,5). Se generó un conglomerado de expresión de estos genes mediante el uso del algoritmo de agrupamiento de correlación de Pearson de GeneSpring GX7.3.

El efecto neutralizante de dupilumab contra IL-4 se evaluó mediante el uso de un ensayo de cambio de clase de IgE in vitro con células B primarias aisladas de IL-4Ra humanizado (Il4rahu/hu) ratones.

IL-4Ra de tipo salvaje (WT) y humanizado (Il4rahu/hu) los ratones recibieron un suministro de genes impulsado por alto volumen (hidrodinámico) de una solución de ADN plasmídico desnudo para la expresión de IL-25 de ratón in vivo. (ver, por ejemplo, Liu y otros, (1999) Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA, Gene Therapy 6: 1258-1266.) Se recogió sangre periférica 8 días después para medir los niveles de IgE murina en suero (mIgE) mediante el uso de un kit de ELISA comercial (R&D Systems, MN).

Se activaron células B primarias purificadas de esplenocitos de ratón humanizados con LPS bacteriano y se mezclaron con cantidades crecientes de IL-4 humana recombinante en un cultivo de 7 días para inducir el cambio de clase de inmunoglobulina. Para el experimento de bloqueo de anticuerpos, se incubaron células B purificadas con dosis crecientes de dupilumab durante 30 minutos antes de añadir IL-4 humana recombinante 0,167 nM y se cultivaron durante 7 días. La producción de IgE en ausencia de IL-4 o con AcM de control de isotipo se muestra en (e) y (n), respectivamente. Los niveles de IgE murina en los sobrenadantes de cultivo se midieron mediante el uso de un kit de ELISA comercial. (Ver, por ejemplo, Moon y otros, (1989) Regulation of IgG1 and IgE synthesis by interleukin 4 in mouse B cells, Scand I Immunol 30: 355-361.)

La interleucina-25 (IL-25) es una citocina producida por células Th2 cuyas principales actividades son mediadas por la producción de IL-4 e IL-13 para inducir patologías específicas de tejido, como aumento de la producción de moco pulmonar e hiperplasia de células caliciformes. (ver Fort y otros, (2001) IL-25 induces IL-4, IL-5, and IL-13 and Th2-associated pathologies in vivo, Immunity 15(6):985-995.)

La falta de IL-13 protege a los animales de patologías inducidas por IL-25 en el órgano diana. Por lo tanto, se usó un modelo de inflamación pulmonar impulsada por IL-25 para evaluar las propiedades farmacodinámicas (PD) de dupilumab in vivo en ratones que comprenden genes de IL-4 y/o IL-4Ra humanizados.

Las respuestas de PD de dupilumab en los receptores de tipo II se caracterizaron mediante el uso de un método de inflamación inducida por IL-25 midiendo la acumulación de moco pulmonar en ratones con IL-4Ra humanizado (Il4rahu/hu).

El día 0, los ratones WT e IL-4Ra humanizados (Il4rahu/hu) recibieron el suministro hidrodinámico del vector de expresión de IL-25 de ratón y seguido de una inyección de dupilumab o AcM de control de isotipo a las dosis indicadas. Se administraron dosis adicionales de anticuerpos cada dos días hasta un total de 4 dosis. El día 8, se recogieron tejidos pulmonares de ratones sacrificados y las secciones pulmonares procesadas se tiñeron con ácido peryódico-Schiff antes de puntuar a ciegas los cambios patológicos.

Resultados

Los ratones IL-4Ra humanizados se caracterizaron para mostrar: (a) expresión de IL-4Ra humano en células primarias de ratones IL-4/IL-4Ra doblemente humanizados (Il4Hulhu/Il4rahu/hu) (ver Figura 3); (b) el cambio de las especificidades del ligando de IL-4 en ratones IL-4Ra humanizados (Il4raHulhu) (ver Figura 4); y (c) la funcionalidad de la vía de IL-13 en ratones IL-4Ra humanizados (Il4rahu/hu) (ver Figura 4).

Como se muestra en la Figura 3, en la que se muestran perfiles marcados de IL-4Ra (CD124) en poblaciones de células B y T controladas y la distribución de la población de células no teñidas correspondiente se muestra en el área sombreada, los ratones IL-4Ra de tipo salvaje y humanizado (Il4raHulhu) expresan cantidades similares de proteína IL-4Ra en la superficie de B (CD19+, CD3-) y células T (CD19-, CD3+).

Como se muestra en la Figura 4 (lado izquierdo), de los ratones de tipo salvaje (Il4ra+l+) responden a la IL-4 de ratón, pero no a la humana, y responden tanto a la IL-13 de ratón como a la humana. Como se muestra en la Figura 4 (lado derecho), los ratones IL-4Ra humanizados (Il4rahu/hu) responden a la IL-4 humana, pero no a la de ratón, y responden tanto a la IL-13 de ratón como a la humana.

Estos datos muestran que IL-4, pero no IL-13, presenta especificidad de especie en ratones IL-4Ra de tipo salvaje y humanizado (Il4rahu/hu).

Como se muestra en la Figura 5, el papel de IL-4 como el factor principal que media el cambio de clase de IgE fue soportado por la falta de niveles elevados de IgE circulante después de la incorporación del gen de IL-25 de ratón en ratones IL-4Ra humanizados (Il4rahu/hu).

El anticuerpo monoclonal dupilumab se investigó in vitro e in vivo.

Como se muestra en la Figura 6, dupilumab previene la producción de IgE inducida por IL-4 humana en cultivos de células B primarias derivadas de ratones IL-4Ra humanizados (Il4rahu/hu).

Como se muestra en la Figura 7, el dupilumab redujo de manera dosis dependiente las patologías pulmonares inducidas por IL-25 a 10 mg/kg y por encima de 25 mg/kg redujeron la patología del moco

Conclusiones

Los resultados demuestran la actividad farmacológica de dupilumab, un anticuerpo monoclonal anti-IL-4Ra humano completamente humano, en un modelo de ratón genéticamente modificado con inflamación inducida por citocinas. La generación de ratones genéticamente modificados con reemplazos del gen de IL-4 y/o IL-4Ra humano proporciona una herramienta poderosa para evaluar la función de los ortólogos del gen y la eficacia in vivo de los anticuerpos candidatos con reactividad limitada entre especies.

Ejemplo 5

Modelo de inflamación pulmonar inducida por extracto de ácaros del polvo doméstico (HDM)

La inflamación crónica de las vías respiratorias en ratones IL-4 e IL-R4a doblemente humanizados se induce por medio de la exposición intranasal de extracto de ácaros del polvo doméstico (HDM) (laboratorios Greer). En breve, los ratones se sensibilizaron primero por medio de instilación intranasal de suspensión de HDM (20 ml a la concentración de 2,5 mg/ml) durante 10 días. Después de un intervalo de resolución de dos semanas, los ratones se volvieron a exponer a la aplicación intranasal de HDM 3 veces por semana entre la semana 5 y la 12. El tratamiento con dupilumab (anticuerpo anti-IL4Ra) se inició a partir de la 7ma semana con una frecuencia de dos veces por semana por medio de inyecciones subcutáneas hasta el final del experimento en la semana 12. Se recolectaron muestras de tejido para análisis adicionales. El diseño experimental se muestra en la Figura 8.

Demostración de la eficacia terapéutica de dupilumab en el modelo de inflamación de las vías respiratorias inducida por HDM mediante el uso de ratones con doble humanización de IL-4 e IL-4Ra

La enfermedad de las vías respiratorias se indujo en ratones con doble humanización de IL-4 e IL-4Ra (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) mediante el uso del protocolo descrito anteriormente. El análisis histológico del tejido pulmonar mostró que la instilación de HDM intranasal provocó un aumento de la producción de moco en las vías respiratorias. El tratamiento con dupilumab redujo la acumulación de moco en los ratones expuestos a HDM. El análisis de las células infiltrantes en el fluido de lavado broncoalveolar (BALF) indica que los recuentos de eosinófilos aumentaron con la instilación de HDM y se redujeron con el tratamiento con dupilumab. La IgE circulante total se elevó mediante el tratamiento de HDM en los ratones humanizados, lo que sugiere una vía de señalización de IL-4 competente. El uso de dupilumab fue capaz de reducir el nivel de IgE. Por el contrario, una molécula comparadora, IL13R2a-Fc, que antagoniza la IL-13 solo sin interferir en la transducción de la señal de IL-4, tenía actividades comparables en la reducción de la acumulación de moco y la prevención de la infiltración de eosinófilos. No obstante, se detectó un efecto diferencial en el nivel de IgE circulante entre dupilumab y el antagonista de IL-13, IL13R2a-Fc. El bloqueo de la vía de la IL-13 solo fue insuficiente para reducir el nivel de IgE inducido por HDM; mientras que dupilumab redujo la producción de IgE, el principal mediador patogénico de la alergia, al bloquear las vías de la IL-4 y la IL-13.

En un conjunto separado de experimentos, se indujo enfermedad de las vías respiratorias en ratones con doble humanización de IL-4 e IL-4Ra (IL-4hu/hu/IL-4Rhu/hu) mediante el uso del mismo protocolo descrito anteriormente, excepto que se usó un control diferente. En estos experimentos se usó un anticuerpo de control de isotipo del mismo isotipo IgG que dupilumab. El diseño experimental se representa en la Figura 9. Se purificó ARNm a partir de ARN total mediante el uso del kit de ARNm Dynabeads (Life Tech) y se preparó una biblioteca de ARN-Seq específica de hebra a partir de ARNm mediante el uso del equipo Scriptseq RNA Library Prep (Illumina). La biblioteca se secuenció mediante el uso de HiSeq 2000 (Illumina) con una longitud de lectura de 33 pb y los niveles de expresión génica se extrajeron de las lecturas sin procesar mediante el uso del flujo de trabajo para RNA-seq Clcbio (Qiagen). Los genes expresados diferencialmente entre grupos experimentales se identificaron mediante el uso de la prueba t de Student (p<0,05, razón de cambio > 1,5). Se generó un conglomerado de expresión de estos genes mediante el uso del algoritmo de agrupamiento de correlación de Pearson de GeneSpring GX7.3. Se encontró que la HDM inducía la alteración en la expresión génica en los pulmones de los ratones con doble humanización de IL-4 e IL-4Ra y que dupilumab bloqueó dicha alteración. Se recolectaron muestras de suero de ratones sacrificados al final del período de tratamiento. Los niveles séricos de IgE murina se midieron mediante el uso de un kit ELISA comercial (R&D Systems). El análisis estadístico se realizó mediante el uso del método ANOVA ordinario de una vía.

Ejemplo 6

Modelo de inflamación cutánea inducida por antígenos

La inflamación crónica de la piel en ratones con doble humanización de IL-4 e IL-4Ra puede inducirse mediante el siguiente procedimiento. El pelo de la espalda de los ratones humanizados se afeita con una maquinilla eléctrica y luego se quita con cinta adhesiva para crear lesiones menores y romper la barrera cutánea. Un parche de gasa empapado con una solución de alérgeno (como ovoalbúmina junto a una toxina bacteriana o extracto de ácaro de polvo doméstico) se adhiere a la piel durante una semana seguido de dos semanas de período de resolución. El procedimiento se repite tres veces durante un total de 7 semanas para inducir dermatitis atópica como lesiones cutáneas. Los ratones tratados tendrán niveles aumentados de IgE, prurito, engrosamiento de la epidermis, síntomas típicos de la dermatitis atópica.

Ejemplo 7

Caracterización de perfiles PK de anticuerpos anti IL-4Ra humano en ratones que expresan IL-4Ra humanizado Este ejemplo describe experimentos realizados para evaluar los perfiles de PK de REGN 668 (anticuerpo monoclonal humano dirigido a IL-4Ra humano, también conocido como "dupilumab") y el anticuerpo de control REGN646 (sustituto de mono, anticuerpo anti-mflL-4R de control sin unión).

Los ratones usados en estos experimentos fueron MAID 1444 (homocigóticos para IL-4Ra humanizado, o "IL-4Ra HumIn", en donde el ectodominio de IL-4Ra es humano y las regiones transmembrana y citoplasmática son de ratón) y ratones salvajes ("WT") de la misma cepa (75 %C57BL/6/25 % 129Sv) de 20-23 semanas. El grupo de estudio incluyó un total de 40 ratones, machos y hembras, con un tamaño de cohorte por fármaco/por dosis de 5 homocigóticos y 5 WT de la misma cepa. Los anticuerpos (en tampón PBS) se administraron a los ratones mediante inyección subcutánea a 10 mg/kg. Se tomaron muestras de sangre para su análisis el día de la inyección (punto de tiempo "0" o día 0), 6 horas después de la inyección y el día 1, día 3, día 7, día 10, día 14, día 21 y día 30, respectivamente.

Los niveles de fármaco circulante (es decir, REGN668 o REGN646) se determinaron por análisis de anticuerpos humanos totales mediante el uso de un inmunoensayo ELISA. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con un anticuerpo policlonal IgG antihumano de cabra (Jackson ImmunoResearch, #109-005-098) para capturar los anticuerpos humanos evaluados en el suero, y luego se detectaron los anticuerpos unidos a la placa mediante el uso de un anticuerpo de cabra anti-anticuerpo policlonal IgG humano conjugado a peroxidasa de rábano picante (Jackson ImmunoResearch, #109-035-098) y sustrato TMB (BD Pharmingen). Las muestras de suero estaban en diluciones seriadas de seis dosis por muestra que variaban de 1:100-1:243000 y los estándares de referencia de los anticuerpos respectivos estaban en diluciones seriadas de 12 dosis. Las concentraciones de anticuerpos fármaco en el suero se calcularon en base a la curva estándar de referencia generada mediante el uso del software Graphpad Prism.

Se encontró que la vida media de REGN 668 se acortó en ratones IL-4Ra HumIn en comparación con ratones de tipo salvaje con sólo proteína IL-4Ra de ratón. Esta diferencia en los perfiles de PK podría explicarse por la interacción mediada por la diana y el aclaramiento entre los anticuerpos monoclonales y el receptor de IL-4a humano. Por tanto, los ratones que expresan IL-4Ra humano o humanizados proporcionan una simulación adecuada para caracterizar las propiedades de PK de los anticuerpos anti-IL-4Ra humano (por ejemplo, dupilumab) en un modelo preclínico de ratón.

Usos de ratones IL-4 y/o IL-4Ra humanizados

Los ratones IL-4 y/o IL-4Ra humanizados son útiles para evaluar la farmacodinámica (PD) de antagonistas de IL-4 y/o IL-4Ra específicos para humanos, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes anti-IL-4 y/o anti-IL-4Ra, por ejemplo, dupilumab.

Los ensayos de farmacocinética (PK) y PD en roedores con IL-4 y/o IL-4Ra humanizados, por ejemplo, ratones o ratas, se realizan de acuerdo con procedimientos estándar conocidos en la técnica.

Los ratones IL-4 y/o IL-4Ra humanizados son útiles para probar la eficacia terapéutica in vivo de antagonistas de IL-4 y/o IL-4Ra específicos para humanos, por ejemplo, anticuerpos neutralizantes anti-IL-4 y/o IL-4Ra, por ejemplo, dupilumab, en una variedad de modelos de enfermedad conocidos en la técnica, por ejemplo, como se mostró anteriormente.

Ejemplo 8

Reemplazo del gen IL-33 de ratón endógeno con un gen IL-33 humano

El gen de IL-33 de ratón (ID del gen en NCBI: 77125, Fuente primaria: MGI:1924375; transcrito en RefSeq: NM_001164724.1; ID en UniProt: Q8BVZ5; Ensamble genómico: NCBI37/mm9; Ubicación: chr19:29,999,604-30,035,205 hebra ) tiene 8 exones y codifica para una proteína de 266 aminoácidos (Núm. acceso en GeneBank NP_001158196.1).

El gen de IL-33 humano (ID del gen en ID del gen en NCBI: 90865, Fuente primaria: HGNC: 16028; transcrito en RefSeq: NM_033439.3; ID en ID en UniProt: 095760; Ensamblaje genómico: GRCh37/hg19; Ubicación: chr9: 6,215,149-6,257,983 hebra ) también tiene 8 exones y codifica una proteína de 270 aminoácidos (Núm. acceso en GeneBank NP_254274.1).

Un segmento genómico humano de 16333 pb que contiene el exón 2 a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 8 (incluida la región no traducida 3') del gen IL-33 humano reemplazó 9381 pb del locus del gen IL-33 de ratón que abarca el exón 2 a partir del codón de iniciación ATG a través de la porción codificante del exón 8 que incluye el codón de terminación. Ver la Figura 10A.

Se construyó un construcción de transformación para reemplazar el gen de IL-33 de ratón con un segmento genómico de IL-33 humano en una sola etapa de direccionamiento mediante el uso de la tecnología de ingeniería genética VelociGene® (ver Valenzuela y otros, (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech, 21(6):652-659), similar al procedimiento descrito arriba en el Ejemplo 1 para reemplazar el gen de IL-4 de ratón con un segmento genómico de IL-4 humano, excepto que el ratón y el ADN de IL-33 humana se obtuvo a partir de clones de cromosomas artificiales bacterianos (BAC) bMQ-350I18 y CTD-3015M15, respectivamente, y que el vector de direccionamiento contenía un casete loxP de selección con neomicina (Figura 10B).

Los clones de células ES (MAID 7060) transformadas correctamente se identificaron mediante un ensayo de pérdida de alelos nativos (LONA) (Valenzuela y otros, 2003) en el cual el número de copias del gen de IL-33 nativo no modificado se determinó mediante dos reacciones en cadena de la polimerasa cuantitativas (qPCR) TaqMan™ específicas para las secuencias del gen de IL-33 de ratón que fueron marcadas para eliminación. Los ensayos de qPCR comprendieron los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'):

aguas arriba ("mTU"):

cebador directo, TTGGACTAGTAACAAGAAGGGTAGCA (SEQ ID NO: 31);

cebador inverso, CCTTTCCCATCACCCTCTAACTT (SEQ ID NO: 32);

sonda (MGB), AGCTCTGGTGGACAGA (SEQ ID NO: 33);

aguas abajo ("mTD"):

cebador directo, TCTCTGCCAAGCTGCTTATCC (SEQ ID NO: 34);

cebador inverso, GGCTGCATGGAAGAGGTGAA (SEQ ID NO: 35);

sonda (MGB), CTCTCCACAAATCG (SEQ ID NO: 36).

La confirmación de que la secuencia del gen de IL-33 humano reemplazó a la secuencia del gen de IL-33 de ratón en el alelo humanizado se confirmó mediante un ensayo de qPCR TaqMan™ que comprende los siguientes conjuntos de cebador-sonda (escritos de 5' a 3'):

aguas arriba ("hTU")

cebador directo, CAGGCAGGAATAGCTGAGATAATCT (SEQ ID NO: 37);

cebador inverso, TGTGGAGCAAAAAGTGGTTGAT (SEQ ID NO: 38);

sonda (MGB), CCTGTGAATAGTGATAAAC (SEQ ID NO: 39);

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un roedor, que comprende un reemplazo de un fragmento genómico de un gen de IL-4 de roedor en un locus de IL-4 endógeno de roedor con un fragmento genómico de un gen de IL-4 humano para formar un gen de IL-4 modificado, en donde el gen de IL-4 modificado codifica una proteína IL-4 humana y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano, en donde la expresión del gen de iL-4 modificado está bajo el control de elementos reguladores del locus de IL-4 endógeno de roedor.

2. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el roedor es un ratón o una rata.

3. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde el roedor no es capaz de expresar una proteína IL-4 de ratón.

4. El roedor de acuerdo con la reivindicación 1 o 3, en donde el roedor es un ratón, y en donde dicho reemplazo es un reemplazo de un fragmento genómico que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 de un gen de IL-4 de ratón con un fragmento genómico que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano.

5. El roedor de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el roedor expresa una proteína IL-4Ra humanizada que comprende el ectodominio de una proteína IL-4Ra humana.

6. El roedor de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la proteína IL-4Ra humanizada comprende el dominio transmembrana y el dominio citoplasmático de la proteína IL-4Ra endógena de roedor.

7. Una célula madre embrionaria (ES) de roedor, que comprende un reemplazo de un fragmento genómico de un gen de IL-4 de roedor en un locus de IL-4 endógeno de roedor con un fragmento genómico de un gen de IL-4 humano para formar un gen de IL-4 modificado, en donde el gen de IL-4 modificado codifica una proteína IL-4 humana y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano, en donde la expresión del gen de IL-4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor del locus de IL-4 endógeno de roedor.

8. La célula ES de roedor de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el roedor es un ratón o una rata.

9. La célula ES de roedor de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el roedor es un ratón y en donde dicho reemplazo es un reemplazo de un fragmento genómico que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 de un gen de IL-4 de ratón con un fragmento genómico que comprende exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano.

10. Un método para producir un roedor que comprende:

(a) reemplazar un fragmento genómico de un gen de IL-4 de roedor en un locus de IL-4 endógeno de roedor en una célula ES de roedor con un fragmento genómico de un gen de IL-4 humano para formar un gen de IL-4 humanizado, en donde el gen de IL-4 humanizado codifica una proteína IL-4 humana y comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano, en donde la expresión del gen de IL-4 modificado está bajo el control de elementos reguladores de roedor en el locus de IL-4 endógeno de roedor; y

(b) generar un roedor a partir de la célula ES de la etapa (a).

11. El método de la reivindicación 10, en donde el roedor es un ratón o una rata.

12. El método de la reivindicación 10, en donde el roedor es un ratón, y en donde dicho reemplazo es un reemplazo de un fragmento genómico que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 de un gen de IL-4 de ratón con un fragmento genómico que comprende el exón 1 que comienza a partir del codón de iniciación ATG hasta el exón 4 del gen de IL-4 humano.