CN111149767B - 一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型及其构建方法和应用。本发明构建的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型，利用疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞联合紫外线(UVB)刺激来进行构建。即裸鼠(T淋巴细胞缺陷)在经过疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞人源化处理后，予以适当剂量的UVB连续照射。本发明提供的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型较好的模拟了狼疮患者异常活化的免疫细胞在小鼠皮肤对UVB刺激下产生的免疫反应。该模型可用于探讨红斑狼疮疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发等研究，对加快推进科研临床转化方面意义重大。

Description

一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法和应用
技术领域
本发明属于动物实验模型及其制备技术领域，具体涉及人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法和应用。
背景技术
红斑狼疮(Lupus erythematosus,LE)是一种多因素参与的慢性自身免疫性疾病。大多数红斑狼疮患者存在皮肤受累，其中根据系统脏器受累情况可分为皮肤型红斑狼疮(cutaneous lupus erythematosus,CLE)和系统性红斑狼疮(systemic lupuserythematosus,SLE)两大类。CLE病变主要局限于皮肤，而SLE常急性发病，伴多系统受累，严重者可危及生命。红斑狼疮是一种持续性、进行性疾病。临床上，有近半数CLE患者在疾病发病后的几年内会出现白细胞减少、关节痛、尿蛋白异常等系统受累情况。目前，关于CLE与SLE的分子机制上的区别或导致CLE患者进展为SLE的机制，人们知之甚少，其中很大原因在于缺乏理想的CLE动物模型。
以人本身作为实验对象来进行疾病分子机制及药物靶向研究，不仅在时间和空间上都存在局限性，而且许多实验在道义上和方法上也受到限制。因此我们必须借助于动物模型的间接研究，在有意识地改变一些自然条件下不可能或不易排除的因素后，可更准确地观察模型的实验结果并与人类疾病进行比较研究，有助于有效地认识疾病的发生发展规律，在科研临床转化和疾病精准治疗的推进中起重要作用。然而，现有的多数红斑狼疮小鼠模型都是基于对SLE的研究需求而建立的，具有与SLE易感性相关的遗传背景，如NZB/W F1小鼠7、MRL/lpr小鼠8和BXSB/Yaa小鼠模型。这些小鼠模型主要症状是狼疮样肾炎和自身抗体的产生，皮损的发生并不稳定，一般在造模后期偶有面颈部皮肤的大面积溃烂结痂，故并不能用于CLE到SLE进展的发病机制探讨及靶向红斑狼疮皮损的药物研发。
截至目前，还没有任何的人源化CLE小鼠模型。考虑到小鼠与人免疫系统存在的实质性差异，构建人源化CLE小鼠模型能更全面地再现人CLE发病的复杂性。若能构建一种较理想的人源化CLE小鼠模型(存在类似人CLE的皮肤损伤，且无系统受累情况)，将使科研工作者及临床医生更好的了解红斑狼疮皮肤损伤的发病机制，有助于CLE向SLE发展的机制研究以及靶向红斑狼疮皮损免疫治疗的转化研究。本发明提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法。利用疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞(Peripheralblood mononuclear cell，PBMC)联合紫外线UVB刺激来进行构建。即裸鼠(T淋巴细胞缺陷)在经过疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞人源化处理后，予以适当剂量的UVB连续照射。本发明操作简单，造模时间短，较好的模拟了人CLE的皮损改变，可用于探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发等研究。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法。本发明可较好的模拟人CLE的皮损改变，填补了目前人源化CLE动物模型的空白，而且操作简单，造模时间短。
本发明的方法首次将来自系统性红斑狼疮患者的异常活化免疫细胞用于构建小鼠CLE疾病模型，并结合合适的紫外线(UVB)照射处理，构建出目前最佳模拟人CLE的皮损改变的动物模型。
一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法：将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞皮下注射裸鼠，联合UVB照射处理。
本发明尝试了两组不同疾病活动度的系统性红斑狼疮患者(活跃期：在规律接受激素及其它免疫抑制剂的治疗下其疾病活动性评分(SLEDAI评分)≥8)；非活跃期：在规律接受激素及其它免疫抑制剂的治疗下其疾病活动性评分(SLEDAI评分)≤4)外周血单个核细胞来进行模型构建，由于非活跃期的患者在规律接受激素及其它免疫抑制剂的治疗下，其外周血免疫细胞活性受抑制，故同样的UVB照射处理情况下，非活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞处理组未能诱发出CLE样皮损(见附图4a)。
进一步的，所述的构建方法，所述的皮下注射是注射在小鼠背部皮下脂肪层。用拇指和食指捻起3-5cm宽度的皮肤，把这块皮肤挤到一起使皮下形成空隙方便注射，确保所有的细胞注射到了脂肪层而不是其下面的肌肉里(本小鼠为无毛型免疫缺陷鼠，故注射前不需要做被毛处理)。
进一步的，所述的构建方法，疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的注射量不可少于1×107细胞数(细胞悬液体积为150-200ul)。
注射部位为小鼠背部中央区域，注射完成后可形成直径1cm左右隆起的皮丘。鉴于至今没有人外周血单个核细胞皮下注射来进行动物造模人源化的相关研究，本发明模型构建时对比了不同疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射量的造模效果(1×106、5×106、1×107)，同样的UVB照射处理情况下，1×106和5×106个细胞注射无法诱发CLE样皮损(见附图4b)。
进一步的，所述的构建方法，
采用每日总辐照剂量为200-500mJ/cm2高剂量UVB照射至造模小鼠出现持续性瘢痕样，优选每日总辐照剂量为250-350mJ/cm2，进一步优选300mJ/cm2；之后采用每日总辐照剂量为80-120mJ/cm2低剂量UVB照射维持皮损，优选每日总辐照剂量为100mJ/cm2，直至建模完成。
模型构建时设立了3组不同UVB剂量来诱发皮损(100mJ/cm2、300mJ/cm2、600mJ/cm2)，接受同样注射剂量的疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的情况下，不同剂量UVB连续照射3周后，100mJ/cm2处理组未能诱发出CLE样皮损，而600mJ/cm2处理组因紫外剂量过高，致使小鼠皮肤出现菜花样癌变(见附图4c)。故诱发CLE样皮损的理想紫外剂量优选为每日辐照总剂量300mJ/cm2。
在成功诱发出CLE样皮损后，需用低剂量UVB连续照射3周。这个方法的获得是基于造模尝试初期，我们设立了对照组(仅予以同样剂量紫外照射，未行人疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞的皮下注射)，对照组在予以连续3周高剂量UVB照射后，部分小鼠可出现红斑脱屑等皮肤损伤，系正常皮肤经较强UVB照射后产生的一种急性炎症反应，临床上，在接受UVB的光激发试验后，有20％左右的正常人可出现日光性皮炎。我们设立的对照组小鼠，在接受UVB照射后出现的皮肤损伤与人的反应类似。故在3周高剂量UVB照射后，需调低紫外剂量使这种非CLE皮损消退，以排除日光性皮炎的混合影响。此处我们予以调低紫外剂量而非停止紫外照射的原因为，本模型需尽可能模拟人日常紫外照射情况。鉴于临床上，常有狼疮患者因爬山或旅游等原因，较长时间暴露于紫外下(3-5小时)，从而导致皮损的发生或加重。而正常情况下(非户外工作者)人们每日紫外暴露时间为1-1.5小时左右，即紫外过度暴露时间近似为紫外日常暴露时间的3倍。故我们将维持期的UVB剂量设置优选为每日辐照总剂量100mJ/cm2。
进一步的，所述的构建方法，疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射前先用高剂量UVB照射2-4天，优选3天，然后将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射到裸鼠皮下部位，此后继续用此辐照剂量连续照射1周-3周；然后将低剂量UVB继续连续照射1-3周，停止UVB辐照。
此处模型构建要在细胞皮下注射前先用UVB连续照射3天的原因为：本模型模拟的是人CLE皮损的发生。大量研究表明红斑狼疮患者在紫外诱导下，凋亡的角质形成细胞增加了自身抗原的暴露，促使异常活化的免疫细胞的炎症级联反应，进而可能导致皮损的发生。基于此可能性，在人源细胞接种到小鼠皮下前，需先予以高剂量UVB照射处理，诱发凋亡并释放足量可引发人源免疫细胞反应的自身抗原，进而导致狼疮样皮肤损伤。
本发明的第二个目的是提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型，是由上述方法构建得到的，是目前最佳模拟人CLE的皮损改变的动物模型。
本发明的第三个目的是提供一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的应用。
具体包括人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型在探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发中的应用，具有重大的医学意义。
本发明的第四个目的是提供疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞和紫外线在制备构建人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型工具中的应用。
本发明所指的裸鼠为T淋巴细胞缺陷小鼠。
本发明在人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型构建中发现以下这些因素也会影响模型构建是否成功。
1、保证购入的裸鼠健康质检达标：
因裸鼠免疫机能的缺陷，易受微生物、病毒和寄生虫感染，特别是易受小鼠肝炎病毒的感染，一旦裸鼠在繁育时感染上小鼠肝炎，同窝裸鼠会于生后数月内相继死亡，无一幸免。病鼠肝脏发生大理石样变化，质较硬，呈黄色、粗造、结节样、边缘不齐，偶伴有脾肿大。在裸鼠的饲养中，常易发生所谓的“消耗性综合征”，即在饲养1-2月后，小鼠逐渐出现食欲不振，体形消瘦直至死亡，在死前1周体重下降明显，死后肝脏组织病理学检查可见泛发性凝固性坏死。这种消耗性综合征实与购入裸鼠存在病毒性肝炎感染有关。本小鼠模型构建中，第二批实验小鼠即出现此类症状，应与购入的裸鼠健康质检不达标有关，因此在选择订购的裸鼠饲养基地时，应慎重评估，一旦出现大批小鼠饲养过程中显著消瘦死亡的情况，及时更换订购方，确保造模的顺利进行。
2、采集外周血时，要严格筛选入组样本：
本模型构建的尝试中，曾因采集了经过激素冲击治疗的SLE患者的外周血(因此类患者病情较重，在收治之际即采取大剂量激素冲击治疗来快速稳定病情，故同非活跃患者一样，免疫细胞活性处于被抑制状态)，从而导致对应皮下注射小鼠皮损诱发失败的情况(见附图4a)。在模型构建时，需设置正常对照来对比验证CLE造模效果。故采集健康供血者的外周血时，需确保供血志愿者为20-45岁之间的健康女性。而采集患者外周血时，SLE患者必须符合以下条件：
i.处于疾病活跃期(初诊未治疗患者或复诊时现有治疗方案未能控制疾病活动情况，出现新增皮损、血液及肾脏受累情况)；
ii.为育龄期女性(20-45岁之间)；
iii.未合并其它慢性基础疾病(如糖尿病、甲亢等)。
目前，大多数红斑狼疮小鼠模型都是基于对SLE的研究需求而建立的，具有与SLE易感性相关的遗传背景，如NZB/W F1小鼠7、MRL/lpr小鼠8和BXSB/Yaa小鼠模型。这些小鼠模型主要症状是狼疮样肾炎和自身抗体的产生，但皮损的发生并不稳定，一般在造模后期偶有面颈部皮肤的大面积溃烂结痂，故并不能用于CLE到SLE进展的发病机制探讨及靶向红斑狼疮皮损的药物研发。为解决这一问题，本发明认为紫外线照射诱导角质形成细胞的凋亡增加，进而导致自身抗原的暴露，正常情况下，人体自身的免疫细胞可及时对这些凋亡的细胞进行清除，且不会针对暴露的自身抗原产生过激的免疫应答。而SLE患者的免疫细胞处于异常活化态，在足量的自身抗原的刺激下，可产生一系列炎症级联反应，进而可能导致皮损的发生。基于此可能性，在人源异常活化免疫细胞接种到小鼠皮下前，需先予以高剂量UVB照射处理，诱发凋亡并释放足量可引发人源免疫细胞反应的自身抗原，进而导致狼疮样皮肤损伤。
本发明构建的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型经过了人来源的免疫细胞体内成像及示踪、人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型实验验证。该模型构建成功后，小鼠表现为持久的片状红斑，表面覆有鳞屑；皮损真表皮交界处C3、IgG沉积为阳性；小鼠血清抗核抗体、抗双链DNA检测结果为阴性；小鼠尿蛋白定性检测持续阴性，肾脏C3、IgG检测为阴性；是理想的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型。
总之，本发明提供的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型较好的模拟了SLE患者异常活化的免疫细胞在小鼠皮肤对UVB刺激下产生的免疫反应。该模型可用于探讨红斑狼疮疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发等研究，对加快推进科研临床转化方面意义重大。
说明：本模型构建时，设置了两种对照来对比验证疾病诱发组小鼠的改变。故结果展示部分，附图中图片标示为LE的即本发明构建的皮肤型红斑狼疮小鼠模型，因皮下注射的PBMC细胞取自疾病活跃期系统性红斑狼疮患者的外周血，故用LE组来命名该组小鼠；图片标示为NC的小鼠为正常人对照组，用于对比验证本发明构建的皮肤型红斑狼疮小鼠模型的效果，因皮下注射的PBMC细胞取自正常人的外周血，故用NC组(Normal control)来命名该组小鼠；图片标示为Blank的小鼠为空白对照组，用于对比验证本发明构建的皮肤型红斑狼疮小鼠模型的效果，因该组未行皮下注射任何细胞，仅予以UVB照射处理，故用Blank组来命名该组小鼠。
附图说明
图1人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型中CLE皮损及其相应的免疫病理染色；
图1a为本发明构建的皮肤型红斑狼疮小鼠模型的皮损，表现为鲜红色或暗红色瘢痕样红斑，境界清楚，边缘略高起，上附灰白色粘着性鳞屑；
图1b为人源化实验小鼠皮损区域皮肤组织HE染色：角化过度，毛囊角栓，基底层细胞液化，呈空泡样变性，基底膜区增厚，真皮有大量淋巴细胞浸润；
图1c和图1d为皮肤组织C3和IgG染色结果，可见LE组皮肤基底膜带区域的C3和IgG阳性信号，而NC组及Blank组则未见C3和IgG沉积；
图1e为皮肤组织的免疫细胞荧光染色结果，可见LE组的B220阳性细胞(B细胞)显著增多。
图2人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型中肾脏受累情况评估；
图2a为小鼠每周的尿蛋白尿测定，LE组和NC组连续尿蛋白测定浓度始终低于3g/L，两组间无统计学差异，说明LE的尿蛋白始终在正常范围；
图2b为皮肤组织C3染色结果，取有肾脏损害的SLE小鼠模型(Lpr鼠)的肾脏组织作为狼疮样肾炎的阳性对照结果，可见C3阳性信号，沿肾小球内毛细血管壁沉积，而LE组和对照组均未见C3沉积。
图3人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型中自身抗体检测结果；
该图为小鼠血清自身抗体测定，第2周与第4周小鼠尾静脉取血，所得LE组的ANA和dsDNA滴度与对照组相比均统计学差异，说明造模期间小鼠ANA和dsDNA均为阴性。
图4模型构建前期，不同条件对比尝试结果；
图4a表明同样的UVB照射处理情况下，非活跃期狼疮患者(SLEDAI评分≤4)和接受了激素冲击治疗的患者，其SLE外周血单个核细胞处理组未能诱发出CLE样皮损；
图4b表明同样的UVB照射处理情况下，未注射细胞、以及1×106和5×106个细胞注射均无法诱发CLE样皮损；
图4c表明在接受同样注射剂量的疾病活跃期SLE狼疮患者外周血单个核细胞的情况下，不同剂量UVB连续照射3周后，100mJ/cm2处理组未能诱发出CLE样皮损，而600mJ/cm2处理组因紫外剂量过高，致使小鼠头部皮肤出现菜花样癌变。
图5人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型人来源的免疫细胞体内示踪及成像。
图5a为IVIS Acquisition Control Panel依次设置荧光透射成像参数进行断层扫描，设置与序列图像获取2D荧光透射成像数据，使用激光振镜投射FOV获取表面拓扑成像；
图5b为对获得数据进行信号源重建及分析，获取裸鼠(T淋巴细胞缺陷)体内人来源的免疫细胞荧光信号3D定位信息，包括信号深度、体积、荧光信号强度绝对定量。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有实施案例，都属于本发明保护的范围。
试剂的准备：
1)PBS溶液：1xPBS粉末，1000mL无菌去离子水；
2)PBST溶液：1xPBS粉末，5ul吐温20，1000mL无菌去离子水；
3)XenoLightDiR工作液：25mgDiR蓝色油状固体中加入1mLDMSO配制25ug/uL储存液，1uL储存液加入25uLDMSO配制XenoLightDiR工作液；
4)4％多聚甲醛：4g多聚甲醛加入100mLPBS溶液，磁力搅拌器加热搅拌，滴加NaOH调节pH值为7.4；
5)50％酒精：50mL无水酒精加入50mL无菌去离子水；
6)75％酒精：75mL无水酒精加入25mL无菌去离子水；
7)95％酒精：95mL无水酒精加入5mL无菌去离子水；
8)Harris苏木精液：2.5g苏木精，25mL无水酒精，50g钾明矾，500mL蒸馏水，1.25g氧化汞，20mL冰醋酸；
9)5％曙红酒精溶液：取1g伊红，溶于99mL70％酒精；
10)抗原修复液：
酸性修复液(pH6.0)：3g柠檬酸三钠，0.4g柠檬酸，20ul吐温20，1000ml灭菌去离子水；
碱性修复液(pH8.0)：1.8g EDTA，0.9g EDTA-2Na，1000ml灭菌去离子水，约8ml10％NaOH调pH值至8.0；
11)3％H2O2溶液：2mL30％H2O2溶液，8mL无菌水混匀；
12)血清封闭液：0.5g BSA粉末，10ml 1xPBS溶液，充分混匀，配置好后可4℃存放2周；
13)抗体稀释液：0.1g BSA粉末，10ml 1xPBS溶液，充分混匀，配置好后可4℃存放2周；
14)二抗溶液：1uL二抗原液(Abcam,ab205722)，2000ul抗体稀释液，充分混匀，配置好后可4℃存放2周；
15)TSA染液(购自PerkinElmer)，现配现用：
Opal520工作液：Opal520染色液原液与配套放大稀释液1:100稀释；
Opal540工作液：Opal520染色液原液与配套放大稀释液1:150稀释；
Opal620工作液：Opal620染色液原液与配套放大稀释液1:300稀释；
Opal650工作液：Opal650染色液原液与配套放大稀释液1:250稀释；
Opal690工作液：Opal690染色液原液与配套放大稀释液1:200稀释；
16)DAPI工作液：1uLDAPI染色液原液与100uL配套放大稀释液混匀；
17)Bradford溶液：0.25g考马斯亮蓝R250，45mL甲醇，10uL冰醋酸，45mL双蒸水；
18)EDTA溶液：4g乙二胺四乙酸二钠盐，加入1000mL无菌水加热溶解。
实施例1：人外周血免疫活性细胞(PBMC)的制备
该实施例适用于实施例2及3中，模型构建中，所有皮下注射细胞的制备均应严格按照实施例1来执行。
1)于医院门诊及病房收集SLE患者信息，详细追踪SLE患者病史，并收集患者实验室检查资料，如血常规、尿常规及尿沉渣、抗dsDNA抗体、补体C3及C4等，同时结合患者临床症状进行SLEDAI评分，SLE患者纳入标准：①符合美国风湿病学会制定的SLE诊断标准；②处于疾病活动期，SLEDAI评分≥8分，且有新发皮损或近期出现蛋白尿；③无任何其他自身免疫性疾病；
2)严格按照纳入标准收集符合要求的SLE患者外周血20mL于抗凝管中，选取同期体检中心体检的年龄与性别匹配，并排除免疫相关疾病及家族史健康对照者外周血20mL，所有研究对象均签署知情同意书并符合伦理委员会规定；
3)在细胞超净台内无菌环境中，将外周血转移至对应的已编号的离心管中，加入等体积已灭菌的1xPBS缓冲液混匀；用移液管将稀释后的外周血沿着管壁轻轻转移至淋巴细胞分离液上层，动作轻缓，防止界面混浊；
4)配平后置于温度为18℃低速离心机内，2000rpm离心30min，离心加速度及减速度均调至0档；
5)离心后可见离心管内容物分为三层，上层为血浆，中间层为淋巴细胞分离液，底层为红细胞和多核白细胞，在上、中层液体界面处可见乳白色似云雾状的混浊层，即单个核细胞所在位置，在无菌环境中用移液管吸取云雾层至新的离心管内；
6)加入大于5倍体积的已灭菌的1xPBS缓冲液，再次离心，4℃1500rpm离心10min，离心加速度调为8档，减速度调为9档；
7)弃去上清液后，于已灭菌的1xPBS缓冲液中重悬PBMC，台盼蓝染液染色后在显微镜下计数，细胞计数后每管分成约1×107细胞，再重复步骤6)，弃去上清后于细胞培养液RPMI-1640中重悬；
8)再次离心沉淀，4℃1500rpm离心10min，离心加速度为8，减速度为9，重悬于200uLRPMI-1640，置于冰盒内带入屏障环境中；
实施例2：实验动物人来源的免疫细胞体内成像及示踪技术
该实施例目的是为了证实皮下注射的人外周血单个核细胞在小鼠皮下人源化成功。
1)严格按照纳入标准收集符合要求的SLE患者外周血20mL于抗凝管中，按实施例1中方法制备单个核细胞和细胞计数；
2)使用细胞膜表面嵌合型荧光染料XenoLightDiR工作液(PerkinElmer)标记来源于SLE患者单个核细胞，避光下以每1×106细胞数加入10uLXenoLightDiR工作液比例荧光标记细胞；
3)轻轻混匀细胞及荧光染料后置于37℃、5％CO2、95％湿度培养箱中，孵育30min后取出，加入大于5倍体积RPMI-1640后，于低速离心机中4℃、1500rpm离心10min；
4)小心弃去上清，将离心后沉淀中荧光标记免疫细胞重悬于200uLRPMI-1640；
5)使用1mL无菌注射器吸取荧光标记免疫细胞，注射于裸鼠(T淋巴细胞缺陷)背部中央皮下组织；
6)对完成皮下注射的小鼠，进行为期2周的人来源的免疫细胞体内成像及示踪观察(皮下注射0天、1天、3天、5天、7天、10天、14天)，每次体内成像及示踪观察的操作步骤如下：
i.使用Matrx气体麻醉系统雾化异氟烷并麻醉小鼠，氧流量为2.0L/min，诱导麻醉输出浓度刻度为1.5通气5分钟后，以输出刻度为1的气体浓度的维持麻醉；
ii.启动
Figure GDA0003051268220000111
Spectrum小动物成像仪及Living Imaging软件程序，麻醉后的裸鼠以俯卧位摆放在液相冷凝拍照系统下的载物台上；
iii.IVIS Acquisition Control Panel选择荧光成像模式，设置自动曝光及自动背景扣除，依次设置成像基本参数，选择荧光激发和发射滤光片后点击Aquire获取成像图片,使用ROI Tools对成像结果进行圈选和分析，获取ROI圈选区域荧光信号值；
iv.IVIS Acquisition Control Panel依次设置荧光透射成像参数进行断层扫描，设置与序列图像获取2D荧光透射成像数据，使用激光振镜投射FOV获取表面拓扑成像；
v.对获得数据进行信号源重建及分析，获取裸鼠(T淋巴细胞缺陷)体内人来源的免疫细胞荧光信号3D定位信息，包括信号深度、体积、荧光信号强度绝对定量。
实施例3：人源化实验动物模型的构建方法
1)订购来源于正规正产单位、具有动物质量证明的SPF级雌性裸鼠(T淋巴细胞缺陷)，周龄为8W，保持外包装完整并喷洒消毒液喷雾，在紫外传递门内经紫外灭菌30min后进入SPF级屏障环境，此后该实验裸鼠(T淋巴细胞缺陷)所涉及的实验操作均在此屏障环境内进行；
2)将所有裸鼠称重并记录后按体重从小到大排列，用随机数表法将裸鼠(T淋巴细胞缺陷)随机分成LE(红斑狼疮)组、NC(正常对照)组，Blank(空白对照)组，LE组皮下注射的PBMC细胞取自疾病活跃期SLE患者的外周血，NC组皮下注射的PBMC细胞取自正常人的外周血，Blank组未行皮下注射任何细胞，仅予以等剂量UVB照射处理，各组小鼠依次编号标记，装入已标记的IVC独立通风笼具中饲养，准备好实验动物配合饲料及充足的水，每周两次定期更换垫料，不定期补充饲料及饮水；
3)使用紫外线辐照仪器的UVB灯管(290-320nm),紫外辐照计监测紫外强度，将小鼠饲养笼的笼盖移开，并使UVB紫外灯的灯管位于笼子的正上方，确保小鼠背部充分暴露在紫外灯的辐照下，小鼠饲养笼高20cm，在每次辐照时紫外灯管距离笼子底部高度不变的前提下，小鼠每次接受的紫外强度均在10×100uW/cm2左右，故小鼠在行外周血单个核细胞皮下注射之前，每日紫外辐照时间300s，(即每日总辐照剂量均在300mJ/cm2左右)，连续UVB照射3天后，将刚分离的1×107细胞数的PBMC注射到裸鼠(T淋巴细胞缺陷)背部皮下部位；
4)此后继续使裸鼠(T淋巴细胞缺陷)每日接受10×100uW/cm2强度UVB辐照300s，持续观察并记录裸鼠(T淋巴细胞缺陷)背部皮肤改变并每周监测尿蛋白及每两周取尾静脉血清；
5)按以上强度和时间进行UVB辐照直至全体裸鼠(T淋巴细胞缺陷)均出现持续性瘢痕样红斑(3周左右)，以100×100uW/cm2强度UVB辐照100s维持皮损形态3周，即建立稳定的人源化实验动物模型。
实施例4人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型验证实验
4.1人源化实验小鼠皮肤和肾脏组织石蜡切片制备
1)对人源化实验小鼠施行安乐死，用锐利的刀片剪取小块皮损组织，整个肾脏从冠状面中间切开，预冷生理盐水漂洗后，迅速将皮肤组织和肾脏组织放入4％多聚甲醛中室温固定24小时；
2)使用流水对固定好的皮损组织冲洗；
3)将冲洗后的标本经50％酒精→75％酒精→95％酒精(Ⅰ)→95％酒精(II)→无水酒精(Ⅰ)→无水酒精(II)，各浓度酒精依次浸泡脱水2小时；
4)脱水后的皮肤组织经1:1无水酒精与二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(II)，依次浸泡1小时，可见组织呈现透明状态；
5)将装有58℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化，并使熔蜡箱的温度保持恒定(约58℃)，然后将已透明的标本放入蜡杯(Ⅰ)→蜡杯(II)→蜡杯(Ⅲ)，依次浸泡1小时；
6)在每孔大小为1×1×1cm的固定板的孔中加入已熔化的石蜡，随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中，切面朝下，位置放正，然后速将固定板半浸于冷水中，待石蜡表面凝结后，将固定板全部浸入水中冷却。石蜡全部凝固后，取出蜡块即完成皮肤组织包埋；
7)将蜡块于固定在切片机底座容器上，装在切片机固定器上，以待切片；
8)在旋转式切片机上将蜡块切成5um厚的薄片。切下的薄片和蜡带，用毛笔轻轻取下蜡带，放在蜡带盒内备用；
9)将蜡带按要求切成适当长度的蜡片，用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上，再把载玻片放在展片台上(温度为45℃左右)，蜡片受热后即慢慢展平；
10)待蜡片完全展平后，用解剖针将切片位置拨正，倾去载玻片上的余水；
11)将其放在烤片盒中，置于50℃恒温箱内烤干。
4.2人源化实验小鼠皮肤HE染色
1)选取人源化实验小鼠皮肤组织石蜡切片，70℃烤片2小时；依次放入二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(II)中，各浸泡5min，然后依次在95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟；
2)将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中5min，使细胞核着色；
3)用自来水洗去切片上残余的染液；
4)用1％盐酸酒精分色5min，使细胞核着色清晰，随时用显微镜检查切片，使分色适度；
5)放入1％氨水浸洗，可见组织蓝化，并在蒸馏水中浸泡5min；
6)切片放入50％酒精→75％酒精→95％酒精各2min；
7)放入0.5％曙红酒精溶液中染色5min；
8)切片依次入95％酒精(Ⅰ)→95％酒精(II)→无水酒精(Ⅰ)→无水酒精(II)，依次浸泡5min；
9)切片入1:1无水酒精、二甲苯→二甲苯(Ⅰ)→二甲苯(II)，依次浸泡5min；
10)将切片从二甲苯(II)中取出，用纸或布擦去材料组织周围的二甲苯，用无色指甲油封住切片边缘，用镊子加盖盖玻片，于室温内封存，需要读片时随时取出在显微镜下观察；
4.3人源化实验动物皮肤免疫复合物C3沉积
1)选取人源化实验小鼠皮损区域皮肤组织石蜡切片，70℃烤片2小时；2小时后取出并放入预热的松节油中浸泡15分钟，然后依次在95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟；
2)配制碱性抗原修复液(pH8.0)200ml，将步骤(1)中的切片浸泡于碱性抗原修复液中，将其置于微波炉中保持高火2分钟，转低火20分钟，抗原修复结束后，冷却至室温，用灭菌水浸泡洗涤2分钟；
3)擦干切片组织周围液体，用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域，每个样本区域滴加高碘酸溶液于石蜡切片上形成液滴，使其完全覆盖组织，湿盒内室温孵育10min；
4)PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
5)取3％H2O2溶液滴加于石蜡切片组织上，液滴覆盖组织，置于湿盒内室温孵育10min；
6)PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
7)将血清封闭液滴加于组织上，湿盒内室温孵育30min，配制Anti-Mouse C3抗体工作液：1ul Anti-Mouse C3抗体原液(Abcam，Ab200999)，1ul胎牛血清，98ul抗体稀释液；
8)血清封闭液孵育结束后，弃去切片上的封闭液，滴加配制好的Anti-Mouse C3抗体工作液，使其充分覆盖组织，4℃孵育13小时后，置于室温中缓慢复温1小时；
9)PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
10)避光下滴加荧光二抗溶液(Abcam，ab150080，Alexa
Figure GDA0003051268220000141
594)，暗室中室温孵育1小时；
11)PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
12)滴加已配制的DAPI工作液(Vector Laboratories),室温下湿盒内避光孵育20min后于多光谱显微镜(PerkinElmer Vectra)拍照分析。
4.4人源化实验小鼠皮肤免疫复合物IgG沉积
1)选取人源化实验小鼠皮损区域皮肤组织石蜡切片，70℃烤片2小时；2小时后取出并放入预热的松节油中浸泡15分钟，然后依次在95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟；
2)配制碱性抗原修复液(pH8.0)200ml，将步骤(1)中的切片浸泡于碱性抗原修复液中，将其置于微波炉中保持高火2分钟，转低火20分钟，抗原修复结束后，冷却至室温，用灭菌水浸泡洗涤2分钟；
3)擦干切片组织周围液体，用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域，每个样本区域滴加高碘酸溶液于石蜡切片上形成液滴，使其完全覆盖组织，湿盒内室温孵育10min；
4)PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
5)取3％H2O2溶液滴加于石蜡切片组织上，液滴覆盖组织，置于湿盒内室温孵育10min；
6)PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
7)将血清封闭液滴加于组织上，湿盒内室温孵育30min，配制Anti-Mouse IgG抗体工作液：0.1ul Anti-Mouse IgG抗体原液(Abcam，Ab205724)，2ul胎牛血清，198ul抗体稀释液；
8)血清封闭液孵育结束后，弃去切片上的封闭液，滴加配制好的Anti-MouseIgG抗体工作液，使其充分覆盖组织，4℃孵育13小时后，置于室温中缓慢复温1小时；
9)PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
10)滴加配制好的Opal540染液，室温保湿孵育25分钟；
11)PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
12)滴加已配制的DAPI工作液(Vector Laboratories),室温下湿盒内避光孵育20min后于多光谱显微镜(PerkinElmer Vectra)拍照分析。
4.5人源化实验小鼠皮肤免疫细胞原位标记免疫荧光
1)选取人源化实验小鼠皮损区域皮肤组织石蜡切片，70℃烤片2小时；2小时后取出并放入预热的松节油中浸泡15分钟，然后依次在95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟；
2)配制碱性抗原修复液(pH9.0)200ml，将步骤(1)中的切片浸泡于碱性抗原修复液中，将其置于微波炉中保持高火2分钟，转低火20分钟，抗原修复结束后，冷却至室温，用灭菌水浸泡洗涤2分钟；
3)擦干切片组织周围液体，用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域，每个样本区域滴加高碘酸溶液于石蜡切片上形成液滴，使其完全覆盖组织，湿盒内室温孵育10min，再用PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
4)取3％H2O2溶液滴加于石蜡切片组织上，液滴覆盖组织，置于湿盒内室温孵育10min，再用PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
5)将血清封闭液滴加于组织上，湿盒内室温孵育30min，配制Anti-Mouse CD4抗体工作液：0.1ul Anti-Mouse CD4抗体原液(Abcam，Ab183685)，1ul胎牛血清，99ul抗体稀释液；
6)血清封闭液孵育结束后，弃去切片上的封闭液，滴加配制好的Anti-Mouse CD4抗体工作液，使其充分覆盖组织，室温孵育1小时，再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
7)滴加二抗溶液(Abcam，ab205722)，室温孵育15min，再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
8)滴加配制好的Opal520染液，室温保湿孵育20分钟，再用PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
9)取碱性修复液(pH8.0)200ml，放入抗原修复盒中，然后放入已完成CD4染色的切片，确保修复液已完全浸没切片的组织区域；
10)将抗原修复盒放入高压锅中(高压锅预先盛有500ml自来水)，设定高压锅加热功率为1000W，待高压锅上汽后，继续修复7min；
11)修复结束后，关闭高压锅，使抗原修复液及切片自然冷却至室温，灭菌去离子水浸泡洗涤切片2min；
12)擦干切片组织周围液体，用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域，每个样本区域滴加配制好的血清封闭液使其完全覆盖组织，湿盒内室温孵育30min；
13)配制Anti-Mouse B220抗体工作液：0.1ul Anti-Mouse B220抗体原液(Abcam，Ab10558)，2ul胎牛血清，198ul抗体稀释液；
14)血清封闭液孵育结束后，弃去切片上的封闭液，滴加配制好的Anti-MouseB220抗体工作液，使其充分覆盖组织，室温孵育1小时，再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
15)滴加二抗溶液(Abcam，ab205722)，室温孵育15分钟；
16)滴加配制好的Opal620染液，室温保湿孵育20分钟；
17)PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
18)滴加已配制的DAPI工作液(Vector Laboratories),室温下湿盒内避光孵育20min后于多光谱显微镜(PerkinElmer Vectra)拍照分析。
4.6人源化实验小鼠尿蛋白测定
1)在SPF级屏障环境中准备无菌Ep管，清晨从IVC独立笼具中取出人源化实验小鼠，沿尿道方向轻轻按摩膀胱并用无菌Ep管收集小鼠晨尿；
2)在半小时内收集完毕，并依次将收集的晨尿于4℃保存；
3)配制BSA蛋白标准品，浓度依次为2.0、1.5、1.0、0.75、0.5、0.25、0.125、0.025ug/uL；
4)96孔板中加入200μL Bradford溶液，孔中依次加入20uL待测实验小鼠晨尿，及20uLBSA蛋白标准品；
5)混匀后室温放置5分钟,使用酶标仪测定595nm处的吸光值；
6)以蛋白质浓度为横坐标，595nm处吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算待测晨尿蛋白浓度；
4.7人源化实验小鼠肾脏免疫复合物C3染色
1)选取人源化实验小鼠肾脏组织石蜡切片，70℃烤片2小时；2小时后取出并放入预热的松节油中浸泡15分钟，然后依次在95％乙醇、75％乙醇、50％乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟；
2)配制碱性抗原修复液(pH8.0)200ml，将步骤(1)中的切片浸泡于碱性抗原修复液中，放入高压锅中(高压锅预先盛有500ml自来水)，调节高压锅功率在1000W，待高压锅上汽后，继续修复7min，
3)抗原修复结束后，冷却至室温，用灭菌水浸泡洗涤2分钟；
4)擦干切片组织周围液体，用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域，每个样本区域滴加高碘酸溶液于石蜡切片上形成液滴，使其完全覆盖组织，湿盒内室温孵育20min，再用PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
5)取3％H2O2溶液滴加于石蜡切片组织上，液滴覆盖组织，置于湿盒内室温孵育20min；
6)PBST溶液浸泡洗涤切片5min；
7)将血清封闭液滴加于组织上，湿盒内室温孵育30min，配制Anti-Mouse C3抗体工作液：1ul Anti-Mouse C3抗体原液(Abcam，Ab200999)，1ul胎牛血清，98ul抗体稀释液；
8)血清封闭液孵育结束后，弃去切片上的封闭液，滴加配制好的Anti-Mouse C3抗体工作液，使其充分覆盖组织，4℃孵育13小时后，置于室温中缓慢复温1小时；
9)PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
10)滴加二抗溶液(Abcam，ab205722)，室温孵育10min；
11)PBST溶液浸泡洗涤切片3次，每次5min；
12)滴加配制好的Opal690染液，室温保湿孵育10分钟；
13)滴加已配制的DAPI工作液(Vector Laboratories),室温下湿盒内避光孵育20min后于多光谱显微镜(PerkinElmer Vectra)拍照分析。
4.8人源化实验小鼠血清自身抗体检测
1)在SPF级屏障环境中，从IVC独立笼具中取出人源化实验小鼠，用毛细吸管吸取EDTA，使管内充盈1/5体积，再从人源化实验小鼠尾静脉断端吸取外周血，动作轻柔、速度稍快，并尽量避免尾静脉血接触小鼠毛发；
2)重复毛细吸管操作，100uLEDTA吸取300uL尾静脉血；
3)收集的尾静脉血在1小时内于低速离心机离心，1800rpm，10min；
4)底面包埋有Anti-Mouse ANA/ENAIg抗体(包含IgA，IgG，IgM)96孔板和底面包埋有Anti-Mouse dsDNAIg抗体(包含IgA，IgG，IgM)96孔板中均依次加入100uL浓度标准品、样品及对照组；
5)轻轻敲击孔板，混合反应物并室温孵育60min；
6)PBST溶液洗涤孔板4次，并在干净吸水纸巾上拍打，吸干孔内溶液；
7)每孔加入100uLAnti-Mouse Ig HRP稀释液，室温孵育30min；
8)PBST溶液洗涤孔板5次，并在干净吸水纸巾上拍打，吸干孔内溶液；
9)每孔加入100uLTMB反应物，每孔溶液开始转为蓝色，暗室中室温孵育15min；
10)每孔加入100uL终止反应液，轻轻混匀，可见每孔溶液开始转为黄色；
11)加入终止反应液30min内使用酶标仪测定450nm处的吸光值以及测定630nm处背景孔吸光值；
12)以血清自身抗体浓度为横坐标，450nm处吸光值与背景孔吸光度值差值为纵坐标，绘制标准曲线，并计算待测血清中自身抗体浓度；
验证人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的评价标准
1)人源化实验小鼠背部出现持续性皮肤损伤，表现为鲜红色或暗红色瘢痕样红斑，境界清楚，边缘略高起，上附灰白色粘着性鳞屑(见附图1a)；
2)人源化实验小鼠皮损区域皮肤组织HE染色：角化过度，毛囊角栓，基底层细胞液化，呈空泡样变性，基底膜区增厚，真皮有大量淋巴细胞浸润(见附图1b)；
3)人源化实验小鼠皮损区域皮肤组织C3染色：皮肤基底膜带区域可见C3带状阳性信号，为免疫复合物C3补体沉积(见附图1c)；
4)人源化实验小鼠皮损区域皮肤组织IgG染色：皮肤基底膜带区域可见IgG带状阳性信号，为免疫复合物IgG沉积(见附图1d)；
5)人源化实验小鼠皮损区域皮肤组织免疫细胞原位标记免疫荧光：只见个别CD4阳性细胞，但B220阳性细胞呈团状聚集分布(见附图1e)；
6)人源化实验小鼠蛋白尿测定：尿液蛋白质浓度始终低于3g/L(见附图2a)；
7)人源化实验小鼠肾脏组织病理染色：HE染色肾小球无系膜细胞增生，无系膜基质增宽，无毛细血管拌狭窄或破坏，无基底膜增厚，无球囊粘连；C3染色取肾脏损害的SLE小鼠模型(Lpr鼠)的肾脏组织作为狼疮样肾炎的阳性对照结果，可见C3阳性信号，沿肾小球内毛细血管壁沉积，而人源化实验小鼠肾脏组织肾小球未见C3阳性信号(见附图2b)；
8)人源化实验小鼠血清自身抗体测定：ANA和dsDNA均为阴性(见附图3)；人源化实验小鼠符合以上8条特征即为理想的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠。

Claims (7)

1.一种人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法，其特征在于，将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞皮下注射裸鼠，联合UVB照射处理；皮下注射的细胞个数至少1×10 7 个；
采用每日总辐照剂量为200-500mJ/cm 2 高剂量UVB照射至造模小鼠出现持续性瘢痕样；之后采用每日总辐照剂量为80-120mJ/cm 2 低剂量UVB照射维持皮损，直至建模完成；
疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射前先用高剂量UVB照射2-4天，然后将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射到裸鼠皮下部位，此后继续用此辐照剂量连续照射1周-3周；然后将低剂量UVB继续连续照射1-3周，停止UVB辐照。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，
采用每日总辐照剂量为250-350mJ/cm 2 高剂量UVB照射至造模小鼠出现持续性瘢痕样；之后采用每日总辐照剂量为100mJ/cm 2 低剂量UVB照射维持皮损，直至建模完成；
疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射前先用高剂量UVB照射3天，然后将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射到裸鼠皮下部位，此后继续用此辐照剂量连续照射1周-3周；然后将低剂量UVB继续连续照射1-3周，停止UVB辐照。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，
采用每日总辐照剂量为300mJ/cm 2 高剂量UVB照射至造模小鼠出现持续性瘢痕样；之后采用每日总辐照剂量为100mJ/cm 2 低剂量UVB照射维持皮损，直至建模完成。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的皮下注射部位为背部。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，小鼠在行疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞皮下注射之前，按照每日10×100uW/cm 2 强度UVB照射300s，连续UVB照射3天后，将刚分离的1×10 7 细胞数的疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞注射到裸鼠背部皮下部位；此后继续予小鼠每日相同强度和时间紫外辐照处理，直至造模裸鼠存在持续性瘢痕样红斑，然后每日予以10×100uW/cm 2 强度UVB照射100s照射连续1-3周，以维持皮损形态，即建立稳定的模型。
6.权利要求1-5任一项所述的方法构建的所述的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型在探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发中的应用。
7.疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞和紫外线在制备构建权利要求1-5任一项所述的方法构建的人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型中的应用。
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