CN110656085B

CN110656085B - Skh-1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤模型制备中应用

Info

Publication number: CN110656085B
Application number: CN201810693753.3A
Authority: CN
Inventors: 王秀丽; 王宏伟; 吉杰
Original assignee: SHANGHAI DERMATOLOGY HOSPITAL
Current assignee: SHANGHAI DERMATOLOGY HOSPITAL
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2018-06-29
Publication date: 2021-06-08
Anticipated expiration: 2038-06-29
Also published as: CN110656085A

Abstract

本发明公开了SKH‑1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤模型制备中应用，命名为XL50，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号是CCTCC No：C201827。本发明内容包括UV诱导小鼠构建SCC模型；原代培养小鼠皮肤鳞癌细胞XL50；小鼠皮肤鳞癌细胞XL50成瘤性试验；构建SKH‑1小鼠移植性皮肤鳞癌模型。本发明的细胞生长良好并能连续传代，稳定增殖，其培养条件、传代及冻存方法均为常规细胞培养技术，便于操作。细胞的细胞增殖较快，细胞恶性度较高。制备出的细胞株能很好的应用于构建具有免疫原性的移植性瘤模型，既弥补了原有的小鼠SCC模型建模周期过长和肿瘤的大小的局限性，又弥补了裸鼠移植性肿瘤免疫功能缺乏的不足，为今后SCC相关免疫机制的研究提供了一个很好的模型。

Description

SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤模型制备中应用

技术领域

本发明涉及一种SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤模型中应用。

背景技术

皮肤鳞状细胞癌(Squamous Cell Carcinoma，SCC)作为人类常见的皮肤恶性肿瘤之一，约占非黑素性皮肤肿瘤的20％。SCC的发生与紫外线(Ultraviolet，UV)密切相关，并且近年来随着全球环境破坏导致臭氧层受损加重，SCC的发病率也逐年上升。由于SCC发展较快并可发生转移，预后较差，已成为威胁人类健康的主要皮肤肿瘤，越来越受到人们的重视。SCC主要与过度UV暴露导致的DNA损伤相关，但其具体发生、发展机制尚未完全阐明。传统的治疗方法，包括手术、激光、冷冻和放疗等，虽然可以直接去除或破坏肿瘤组织，但仍存在较高复发率，如何有效防治SCC并降低其复发率是当前亟需解决的临床难题。

人类肿瘤的发生、发展机制和防治等相关的基础研究，均需要与人肿瘤发生相似的动物模型和细胞系。体外分离和培养肿瘤细胞并建立相关肿瘤细胞系，是研究肿瘤的重要资源和手段，有利于促进肿瘤相关的分子细胞学机制和治疗药物疗效的研究。体外培养肿瘤细胞应用研究具有许多优点：1)可免受机体内环境影响避免个体差异对实验结果造成的影响，有利于分析各种外界因素对肿瘤细胞的作用；2)一方面可从细胞水平观察、研究肿瘤细胞的结构及功能，另一方面也能在基因及分子水平分析癌变机理；3)有利于快速耐药机理的研究，便于筛选抗癌药物；4)可缩短研究周期，更加经济。因此，建立与人SCC发生相似的肿瘤细胞系和构建合适的动物模型是研究SCC癌变机理和防治的重要方法。

目前，UV诱导和二甲基苯蒽(7,2-dimethyl-1,2-benz[a]anthracene,DMBA)化学诱导的小鼠SCC模型是国际上公认的经典小鼠SCC动物模型，已广泛用于SCC发生、发展机制的相关研究。

现有技术有采用SKH-1无毛小鼠，通过日光紫外线模拟器照射成功构建了UV诱发的小鼠SCC模型。但该造模方法存在建模时间长，UV所致肿瘤大小不一，肿瘤数量无法控制等问题，因此构建一个成瘤周期短，可有效控制瘤体体积和数量的的移植性SCC模型非常必要。

有关皮肤SCC细胞系建立的研究可追溯到1975年。1975年Moore成功分离并建立了人SCC细胞株COLO16，随后逐渐建立了HSC-I和HSC-Ib，HSC-5，SCL-1，SCC-1CB等人SCC细胞系，这些细胞系的建立大大促进了SCC相关分子机制研究领域的发展。目前运用最多的鳞癌细胞系为SCL-1细胞。与口腔、食道、膀胱和肺鳞状细胞癌细胞系的建立相比，有关人皮肤鳞状细胞癌细胞系建立的报道较少，而且很少有与人皮肤鳞状细胞系相匹配的直接从小鼠SCC动物模型的SCC组织中分离而建立的细胞系。2010年Hsieh等报道了从DMBA/TPA二阶段法诱导的骨桥蛋白(Osteopontin，OPN)缺乏小鼠SCC组织中成功分离OPN缺陷小鼠皮肤鳞细胞系，并通过皮下接种成功构建了具有健全免疫力的小鼠SCC种植瘤模型。

OPN是一种磷酸化糖蛋白，最早因其从骨基质中分离而得名。OPN与恶性肿瘤细胞的增殖，侵袭及转移等多种病理过程相关。来源于OPN缺陷的SCC组织的细胞系和移植性模型，具有一定的局限性，限制了其在SCC生物学特性和癌变机理的研究中的应用。因此，建立与人SCC发生相似的小鼠SCC细胞系和构建具有健全免疫力的小鼠SCC移植性模型是非常必要的。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系及其在移植性瘤模型中应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系，命名为XL50，属于小鼠皮肤鳞癌细胞，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCC No：C201827，保藏日期为2017年12月28日，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心。

本发明在已建立的UV诱导SKH-1无毛小鼠SCC模型基础上，通过分离和体外培养，得到SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系，并对其生物学特性进行了鉴定。

所述的SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的获得方法，包括以下步骤：

(1)UV诱导小鼠，构建小鼠SCC模型；

(2)小鼠SCC细胞株的原代培养：取UV诱导的SCC荷瘤小鼠的瘤块进行原代培养；

(3)原代培养细胞的纯化：采用酶消化法联合差速贴壁法去除成纤维细胞，纯化SCC细胞，即得到SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系。

在本发明一个实施方式中，步骤(1)所述UV诱导小鼠，构建小鼠SCC模型的方法为：

从美国JAKSON实验室引进的免疫功能正常的SKH-1无毛小鼠，在上海市公共卫生中心繁殖，选取6-8周龄、雌性SKH-1无毛小鼠，采用接近太阳光谱的日光紫外线模拟器对小鼠背部皮肤进行照射，日光紫外线模拟器照射距离为30cm，照射至小鼠皮肤的实际输出功率为UVB 3.0mW/cm²，UVA 27mW/cm²，照射剂量为最小红斑量MED，每周连续照射5天，照射24周，至小鼠出现米粒大小丘疹，即可停止照射，得到小鼠SCC模型，荷瘤小鼠的瘤体体积逐渐增大，数目也逐渐增多。组织学符合鳞状细胞癌病理诊断。免疫组化CK蛋白及Vim蛋白染色阳性。

在本发明一个实施方式中，步骤(2)所述小鼠SCC细胞株的原代培养的方法为：

劲椎脱臼法处死UV诱导28周后的SCC荷瘤小鼠。将小鼠放入盛有75％酒精的换药碗中浸泡消毒10分钟，剪取UV诱导的SCC荷瘤小鼠的瘤块，剔除肿瘤表明痂皮和坏死组织，用含有2％双抗(200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素)的PBS冲洗3次，洗去血渍；将清洗干净的瘤块，置于盛有高糖DMEM培养基的换药碗中，用眼科剪剪除结缔组织和黏膜下血管后将瘤体剪碎至肉末状，约1～2mm³大小，收集至含有1％双抗的PBS 15ml离心管中，1000rpm/min，5min，离心清洗3次，直至液体澄清；弃上清，根据肿瘤大小加入与肿瘤组织块体积相等的0.25％胰蛋白酶-EDTA分次消化，用10％FBS DMEM培养液等体积中和终止消化，每次消化8～10min，1000rpm，5min离心，弃上清，再次消化，直至组织溶解为黏稠状；加入0.2％Ⅰ型胶原酶振荡消化30min左右，至组织完全溶解，1000rpm/min，离心5min，收集细胞；无血清高糖DMEM清洗3遍，加入含20％FBS、2％双抗(200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素)和10ug/ml双性霉素B的高糖DMEM培养液，充分吹打后制成单细胞悬液，接种于25cm²培养瓶中培养，接种细胞量为每瓶约1×10^6个细胞；于37℃5％CO₂培养箱中培养。

在本发明一个实施方式中，步骤(3)所述原代培养细胞的纯化的方法为：

当细胞达到80％～90％汇合时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA胰酶消化细胞，SCC细胞5代之内培养液为含20％FBS、2％双抗(200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素)和10ug/ml双性霉素B的DMEM培养液，1：2传代，SCC细胞10代后培养液更改为10％FBS、1％双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，按1:3传代，得到SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系。

本发明还对小鼠皮肤鳞癌细胞XL50进行了生物学特性鉴定：采用CCK8法绘制SCC细胞生长曲线。SCC细胞生长曲线呈典型的S型，分为潜伏期、对数期生长期和平台期三个时期。SCC细胞的群体倍增时间为27.01h。流式细胞仪检测SCC细胞周期，结果显示G1期占67.81±3.54％，G2期占15.05±2.56％，S期占17.14±3.54％，G2/G1比值为1.65。平板克隆形成实验结果显示三瓶细胞平均有145个大于50个细胞的克隆集落形成，集落/克隆形成率：146/500×100％＝29.2％。细胞爬片免疫组化染色结果显示培养细胞CK呈阳性表达，Vim抗原表达阳性，胞浆呈棕黄色，说明培养细胞为上皮组织来源。

本发明还提供所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系在种植瘤模型制备中的应用。

在本发明一个实施方式中，BALB/c裸鼠皮下注射权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液，形成肿瘤。

具体实施方式可以为：10只BALB/c裸鼠皮下注射小鼠皮肤鳞癌细胞XL50细胞悬液(约5×10⁶个细胞)，即刻在注射部位形成皮丘，至第7天，表现为黄豆大小结节，质中，与皮色一致，肿瘤体积逐渐增大，第20天肿物开始侵袭皮肤，质硬，开始出现新生血管，至30天，肿瘤生长更加迅速，表面乳头状生长或中央糜烂、溃疡、结痂，基底部有浸润，触之有坚实感，肿瘤周围往往充血。组织病理学结果显示细胞排列紊乱，异型性明显，核大深染，可见角化不良细胞，鳞状窝及角化珠。免疫组化结果显示CK及Vim蛋白表达阳性，与UV诱导SKH-1无毛小鼠SCC结果一致。

在本发明一个实施方式中，SKH-1小鼠皮下注射权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液，形成肿瘤。

具体实施方式可以为：在10只SKH-1小鼠皮下注射小鼠皮肤鳞癌细胞XL50细胞悬液(约5×10⁶个细胞)，均可形成不消退的肿物，并逐渐增大，最终出现破溃。病理结果检测显示细胞异型性明显，核大深染，可见角化不良细胞，鳞状窝及角化珠。组织免疫组化染色示CK蛋白阳性，Vimentin蛋白阳性，与紫外线所致SKH-1小鼠SCC一致。成功构建了SKH-1小鼠SCC种植瘤模型。

本发明还提供一种SKH-1小鼠移植性皮肤鳞癌模型的构建方法，将所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液注射SKH-1小鼠皮下，得到SKH-1小鼠移植性皮肤鳞癌模型。

与现有技术相比，本发明的细胞(XL50)生长良好并能连续传代，稳定增殖，细胞(XL50)的培养条件、传代及冻存方法均为常规细胞培养技术，便于操作。本发明的细胞(XL50)的增殖较快且恶性度较高，符合皮肤鳞癌的特征。经典SCC的动物模型包括UV和二甲基苯蒽化学诱导的小鼠皮肤鳞癌模型，两者共同的缺陷都是造模时间较长，且形成的肿瘤大小不一，也因此严重限制了它们的实用性。我们进一步将该细胞接种于同种SKH-1无毛小鼠皮下，成功建成了具有免疫原性的移植性瘤模型，既弥补了UV和二甲基苯蒽化学诱导的小鼠SCC模型中建模周期过长和肿瘤的大小的局限性，又弥补了裸鼠移植性肿瘤免疫功能缺乏的不足，为今后SCC相关免疫机制的研究提供了一个很好的模型。

附图说明

图1为UV诱导的SKH-1小鼠皮肤鳞癌模型。

(A)紫外线照射18周诱发SKH-1无毛小鼠形成SCC；(B)(×40)、(C)(×200)为紫外线所致小鼠SCC组织病理学表现HE染色。(D、E)紫外线所致小鼠SCC组织CK和Vimentin阳性(×100)。

图2为细胞XL50形态学特性。

(A)示原代培养的SCC细胞(×200)；(B)示成纤维细胞包裹SCC细胞(×200)；(C)示第二代SCC细胞形态(×200)；(D)示SCC细胞爬片的HE染色结果(×400)。

图3为细胞XL50表面标志的鉴定。

SCC细胞免疫组化显示CK表达阳性(A)，Vimentin表达阳性(B)×400。

图4为细胞XL50生物特征。

(A)细胞的生长曲线；(B)细胞周期的G1,G2,S期分布；(C)细胞平板克隆实验。

图5为XL50细胞BALB/c小鼠体内成瘤性试验。

(A)示BALB/c裸鼠种植性SCC形成过程；(B)BALB/c裸鼠皮下接种SCC细胞的肿瘤体积生长曲线；(C)示BALB/c裸鼠种植性SCC组织病理；SCC细胞接种的BALB/c裸鼠肿瘤组织CK表达阳性(D)，Vimentin表达阳性(E)×200。

图6为构建SKH-1小鼠SCC种植瘤模型。

(A)示SKH-1小鼠种植性SCC形成过程；(B)示SKH-1小鼠种植性SCC组织病理；接种SCC的BALB/c裸鼠肿瘤组织CK表达阳性(C)，Vimentin表达阳性(D)×200。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

以下实施例中用到的实验动物：

(1)SKH-1小鼠：SKH-1小鼠为全身无毛或少毛的免疫系统健全的小鼠，从美国JAKSON实验室引进，由上海市公共卫生中心动物中心在清洁级动物室进行繁育和饲养，饲养环境为室内温度20～24℃，湿度55％左右，普通饲料和水饲养。本研究选择体重25～30g，6～8周龄的雌性SKH-1无毛小鼠进行实验。实验前需适应环境一周。

(2)BALB/c裸鼠：清洁级实验用6-8周龄，雌性BALB/c裸鼠6只(购自上海斯莱克实验动物有限公司)，于清洁级动物室24小时光暗循环条件下进行饲养，室内温度20～24℃，湿度55％左右。

以下实施例中用到的试剂和仪器：

(1)主要实验试剂：

DMEM高糖培养基(美国HyClone公司)

磷酸盐缓冲液(美国HyClone公司)

青霉素-链霉素(美国HyClone公司)

胎牛血清(美国Gibco公司)

双性霉素B(上海威奥生物科技有限公司)

0.25％胰蛋白酶-EDTA(美国Gibco公司)

二甲基亚砜制剂(上海威奥生物科技有限公司)

EDTA修复液(上海威奥生物科技有限公司)

4％多聚甲醛(上海威奥生物科技有限公司)

鼠抗小鼠CK抗体(武汉博士德生物公司)

鼠抗小鼠Vimentin抗体(美国Abcam公司)

即用型SABC二抗试剂盒(武汉博士德生物公司)

免疫组化使用普通耗材无水乙醇、二甲苯等(武汉博士德生物公司)

CCK8试剂(上海威奥生物科技有限公司)

细胞周期快速检测试剂(北京达科维生物技术有限公司)

快速姬姆萨染液(南京建成科技有限公司)

双蒸水(实验室自制)

7％水合氯醛(实验室自制)

(2)主要实验仪器：

SUVl000型日光紫外线模拟器(上海希格玛高技术公司)

超净工作台(型号SW-CJ-2FD，中国苏净安泰)

高速离心机(美国Thermo公司)

细胞培养箱(美国Thermo公司)

倒置式相差显微镜(Nikon eclipse TS 100，日本Nikon公司)

细胞培养瓶(美国Corning公司)

细胞培养皿(美国Corning公司)

Poly-lysine防脱玻片(上海太阳生物技术有限公司)

离心管(美国Corning公司)

冻存管(美国Corning公司)

恒温箱(型号DHP60，上海实验仪器有限公司)

石蜡切片机(RM2235，瑞士LEICA公司)

光学显微镜(型号CX21，日本OLMPUS公司)

显微镜照相系统(型号ECLIPSE E200，日本Nikon公司)

微量移液器(法国Gilson公司)

电子游标卡尺(上海麦思德有限公司)

佳能照相机(Canon G16)

酶标仪(芬兰Thermo公司)

流式细胞仪(美国Beckman公司)

实施例1

UV诱导小鼠SCC模型的建立。

选取6-8周龄、雌性SKH-1无毛小鼠10只，采用接近太阳光谱的日光紫外线模拟器对小鼠背部皮肤进行照射，构建小鼠皮肤鳞模型。日光紫外线模拟器照射距离为30cm，照射至小鼠皮肤的实际输出功率为UVB 3.0mW/cm²，UVA 27mW/cm²，照射剂量为最小红斑量MED，每周连续照射5天，连续照射18周以后，小鼠背部可出现>1mm且伴有破溃的新生物。环钻切取新生物，福尔马林浸泡固定后，行病理诊断。

小鼠首次照射后24～48h，背部出现红斑、细屑，偶伴轻微水肿。继续照光，上述皮肤反应会逐渐加重，局部皮肤增厚，水肿明显。随着实验进展小鼠皮肤厚度逐渐增加，对紫外线照射的耐受性随之增加，照光第6～8周呈现明显光老化，表现为粗深皱纹，表面干燥，弹性差。照光9周皮肤明显增厚粗糙。连续照光至第11周后，2只(2/10)小鼠先后出现帽针尖至粟粒大小的丘疹，继续照光至第15周，3只(3/10)小鼠在质地较硬的斑块基础上出现丘疹，丘疹生长迅速，角化明显，逐渐形成菜花样瘤体。照光至第18周，剩余5只小鼠中每只都至少产生一个肿瘤直径4mm左右，厚度约2mm。当小鼠出现米粒大小丘疹时，即可停止照射，余下小鼠可继续照射，随着实验继续，荷瘤小鼠的瘤体体积逐渐增大，数目也逐渐增多。瘤体出现部位仅限暴露于紫外线的区域，即背部、头颈部(图1A)。

组织病理学表现为，瘤团呈浸润性生长趋势，大量异型性细胞，核大深染，可见病理性核分裂像、角化不良细胞、细胞间桥、鳞状窝及角化珠(图1B，C)。

免疫组化CK蛋白及Vim蛋白染色阳性。符合鳞状细胞癌病理诊断。

实施例2

小鼠SCC细胞株的原代培养。

颈椎脱臼法处死UV诱导28周后的SCC荷瘤小鼠。将小鼠放入盛有75％酒精的换药碗中浸泡消毒10分钟，剪取出UV诱导的SCC荷瘤小鼠的瘤块，剔除肿瘤表面痂皮和坏死组织，用含有2％双抗(200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素)的PBS冲洗3次，洗去血渍；将清洗干净的瘤块，置于盛有高糖DMEM培养基的换药碗中，用眼科剪剪除结缔组织和黏膜下血管后将瘤体剪碎至肉末状，约2mm³大小，收集至含有1％双抗的PBS 15ml离心管中，1000rpm/min，5min，离心清洗3次，直至液体澄清；弃上清，根据肿瘤大小加入与肿瘤组织块体积相等的0.25％胰蛋白酶-EDTA分次消化，用10％FBS DMEM培养液等体积中和终止消化，每次消化10min，1000rpm，5min离心，弃上清，再次消化，直至组织溶解为黏稠状；加入0.2％Ⅰ型胶原酶振荡消化30min左右，至组织完全溶解，1000rpm/min，离心5min，收集细胞；无血清高糖DMEM清洗3遍，加入含20％FBS、2％双抗(200U/ml青霉素和200μg/ml链霉素)和10ug/ml双性霉素B的高糖DMEM培养液，充分吹打后制成单细胞悬液，接种于25cm²培养瓶中培养，接种细胞量为每瓶约1×10^6个细胞；于37℃、5％CO₂培养箱中培养，依据培养液pH变化更换培养液。

原代培养的细胞为SCC细胞和成纤维细胞混杂生长。其中，原代SCC呈不规则三角形，胞质可见少许颗粒，由于SCC分裂增殖，可观察到细胞集落形成，呈“铺路石”状(图2A)；成纤维细胞体积较大，轮廓清楚，呈多突的纺锤形或星形，有时可见成纤维细胞包裹SCC细胞(图2B)。

实施例3

新分离细胞系的纯化与传代。

采用酶消化法联合差速贴壁法去除成纤维细胞，纯化SCC细胞；当细胞达到80％～90％汇合时，用0.25％胰蛋白酶-EDTA胰酶消化细胞，10％FBS的DMEM完全培养基终止消化后离心收集细胞，接种至25cm²的培养瓶中，接种细胞密度为3×10⁵/ml。SCC细胞5代之内培养液为含20％FBS、2％双抗(200U/ml青青霉素和200μg/ml链霉素)和10ug/ml双性霉素B的DMEM培养液，1:2传代，约每3天传代一次。SCC细胞5代以后培养液更换为10％FBS、1％双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)和10ug/ml双性霉素B的DMEM培养液，按1:3传代。SCC细胞10代后培养液更改为10％FBS、1％双抗(100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素)，按1:3传代。于倒置显微镜下观察细胞生长情况和形态。

培养过程中采用酶消化法去除成纤维，纯化SCC细胞。当细胞铺满瓶底70％～80％时，予以首次消化传代，此后3～5天传代1次。由于成纤维细胞对胰酶较敏感，加入胰酶5min后，可见成纤维细胞收缩，而SCC细胞未见明显改变。去除成纤维细胞后，再次加入胰酶消化15～20min,可见SCC细胞变圆，收集SCC细胞，进行传代。

从第2代细胞开始细胞生长良好，呈不规则三角形，细胞紧密相连镶嵌排列生长(图2C)，生长迅速而增殖活跃，12h可贴壁，72～96h后细胞融合可达80％。

SCC细胞HE染色后，观察细胞形态，细胞大小不一，细胞主要呈不规则多角形，胞核较大，核浆比例增大，核仁明显，可见双核或多核瘤巨细胞(图2D)。

实施例4

新分离细胞系的冻存与复苏。

(1)新分离细胞系的冻存

当SCC细胞生长至90％左右汇合时，用吸管弃掉培养液，PBS清洗两次，加入1～1.5ml左右0.25％胰蛋白酶-EDTA液，37℃孵箱中消化5min；加入5ml含10％PBS的DMEM完全培养液于消化完全的培养瓶中终止消化；收集细胞于15ml离心管，1000rpm/min离心5min，弃上清；加入1～1.5ml含40％胎牛血清、10％DMSO的DMEM细胞冻存液于15ml离心管中，充分吹制单细胞悬液，后移入冻存管中，封口膜封闭；于4℃冰箱放置20分钟后，移入-20℃放置20分钟，转至-80℃超低温冰箱过夜，最后放入液氮罐中长期保存。

(2)新分离细胞系的复苏

将从液氮罐中取出的含有冻存细胞的冻存管，迅速放入37℃水浴中迅速摇曳，使其于2分钟内完全融化；将融化的细胞悬液移入盛有5ml 10％FBS的DMEM高糖完全培养基的15ml无菌离心管中，1000rpm/min离心5min，弃上清，加入10％FBS的DMEM高糖完全培养液重悬细胞，以1×10⁶个/ml的细胞浓度接种至25cm²的培养瓶中；37℃的5％CO₂培养箱中培养，观察生长状况。24h后换液，细胞生长至80％～90％汇合时进行细胞传代。

实施例5

新分离细胞系的标志物检测。

取SCC细胞第10代细胞爬片对SCC相关分子标志物进行检测鉴定。当SCC细胞生长达到80％～90％汇合时，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA液消化收集细胞，调整细胞浓度至5×10⁵个/ml，滴加至高压处理过的置于12孔板中的玻片上，24h细胞贴壁后加入10％FBS的DMEM高糖培养液培养；待细胞生长至40％～60％汇合时，弃上清，PBS 3min清洗3遍；4％多聚甲醛固定15min，PBS 5min清洗3遍，30％H₂O₂和纯甲醇1：50混合，室温浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，EDTA修复液微波修复5min，自然冷却至室温，修复3次。PBS洗15min×2次，滴加5％BSA封闭液，室温30min，甩去多余液体，不洗，滴加一抗鼠抗小鼠角蛋白(cytokeratin，CK)(1∶100)或鼠抗小鼠波形蛋白(Vimentin，Vim)(1∶300)，4℃孵育过夜，PBS洗15min×4次，滴加生物素化兔抗小鼠IgG，37℃反应20min，PBS洗2min×3次，滴加SABC，37℃反应20min，PBS洗5min×4次，DAB快速反应工作液显色。使用DAB显色试剂盒，临用前配制(A液：B液：C液：蒸馏水＝1:1:1:20)，混匀后滴加至玻片，室温显色，镜下控制反应时间，出现黄色颗粒，约5～10min，用蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染3min，自来水洗去表面残余的苏木素，室温下干燥、将中性树脂封片剂滴加于载玻片上，每片2ul，倒扣玻璃片于载玻片上，显微镜下观察。设PBS代替一抗为阴性对照。

新分离的细胞需鉴定其肿瘤组织来源，采用CK和vim对其来源进行鉴定。细胞爬片免疫组化染色结果显示培养细胞CK呈阳性表达(图4)，Vim抗原表达阳性，胞浆呈棕黄色，说明培养细胞为上皮组织来源。

实施例6

CCK8绘制细胞生长曲线。

实验前一夜将培养至70％～80％的细胞提前换液，调整细胞状态，使细胞处于对数增长期，加入0.25％胰蛋白酶-EDTA液消化收集细胞，于8块96孔板中接种1000个细胞悬液100ul，每3天换液1次，接种后第二天每隔24h，取一块96孔板，弃上清，加入新鲜配置的含10ul CCK8检测液的无血清DMEM培养液100ul，37度孵箱中孵育4h后，通过全自动酶标仪测定450nm OD值。设置无细胞孔为调零孔。以培养时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

计算群体倍增时间(PDT)：PDT＝[(T－T0)log2]/[logN-logN0]，N和N0分别指接种T和T0小时后的OD值，其中T和T0小时又分别指细胞处于对数生长期的结束和起始时间。

为了检测SCC细胞体外增殖能力，采用CCK8法绘制SCC细胞生长曲线。SCC细胞生长曲线呈典型的S型，分为潜伏期、对数期生长期和平台期三个时期(图4A)。SCC细胞的群体倍增时间为27.01h。

实施例7

细胞周期检测。

取对数增长期的细胞，预冷PBS清洗两次加入0.25％胰蛋白酶-EDTA液消化收集细胞，70％乙醇-20℃固定；取出已固定的细胞，1500rpm离心5min去上清，加入500ul细胞周期快速检测试剂，流式细胞仪行细胞周期检测。

流式细胞仪检测SCC细胞周期，结果显示G1期占67.81±3.54％，G2期占15.05±2.56％，S期占17.14±3.54％，G2/G1比值为1.65(图4B)。

实施例8

细胞平板克隆形成实验。

取对数生长的SCC细胞，反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95％以上。按浓度为500个/皿将5ml细胞悬液接种于60mm培养皿中，以十字方向轻轻晃动培养皿，使细胞分散均匀。依据培养液pH变化更换培养液，当2周后肉眼观测到细胞集落时终止培养，4％多聚甲醛固定细胞30min，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥，镜下计数大于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％。

平板克隆形成实验结果显示三瓶细胞平均有145个大于50个细胞的克隆集落形成(图4C)，集落/克隆形成率：146/500×100％＝29.2％。

实施例9

组织病理学检查。

荷瘤小鼠行脱颈处死后，环钻取瘤体组织，将瘤体组织放入10％福尔马林中性溶液中固定后，常规石蜡包埋，4um切片，行HE染色。具体步骤如下：(1)常规脱蜡至水：二甲苯Ⅰ处理10min，二甲苯Ⅱ处理10min，二甲苯III处理10min，无水乙醇5min，95％乙醇5min，80％乙醇5min，自来水水洗后，蒸馏水清洗2min×3次；

(2)染色：苏木素染液5min，自来水水洗5min，1％盐酸乙醇分化20s，伊红乙醇液2min；

(3)梯度脱水：80％酒精处理2min，5％酒精处理2min→无水乙醇Ⅰ处理2min，无水乙醇Ⅱ处理5min；

(4)透明、晾片、封片，贴标签作标记，镜下观察组织病理并拍照。

符合以下标准即诊断为SCC：a)新生物；b)鳞状上皮；c)核大且浓聚，多形性，染色深浅不一致；d)胞质嗜伊红，角化不全和角化不良细胞出现在表皮、表皮突或者成团异形细胞(鳞癌角珠)。

实施例10

组织免疫组化检测瘤体组织CK和Vim的表达。

石蜡切片经脱蜡、梯度酒精脱水后，采用修复液柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，然后用PBS缓冲液清洗3次，每次3-5min,5％BSA封闭液室温封闭20min，甩去多余液体，滴加一抗鼠抗小鼠CK(1∶100)或鼠抗小鼠Vim(1∶100)50-60ul，4℃孵育过夜，PBS洗3次，每次3-5min，滴加生物素化兔抗小鼠IgG，室温反应30min，PBS洗2min×3次，滴加SABC，37℃反应20min，PBS洗5min×4次，滴加DAB快速反应工作液显色。

实施例11

新分离细胞成瘤性试验.

待细胞生长至80％～90％汇合时，胰酶消化，1000rpm离心5min，收集细胞，调节细胞密度至5×10⁷/ml，注射200ul细胞悬液，约1×10⁷个细胞个细胞，于10只雌性BALB/c裸鼠和10只SKH-1无毛小鼠右侧躯干皮下注射。另取10只6-8周龄、雌性BALB/c裸鼠和10只SKH-1无毛小鼠作为阴性对照，小鼠右侧躯干皮下注射200ul PBS缓冲液，每三天观察一次，测量肿瘤大小，评估肿瘤发生率和肿瘤生长情况。并绘制BALB/c裸鼠肿瘤生长曲线。第39天，以7％水合氯醛麻醉小鼠后脱颈椎处死，取下瘤体组织，于10％福尔马林中性固定液中固定，用以待病理学检查和免疫组化试验。

10只BALB/c裸鼠皮下注射肿瘤细胞悬液，即刻在注射部位形成皮丘，第2天开始表现为注射局部红色炎性水肿性斑丘疹，炎症逐渐消退，至第7天，表现为黄豆大小结节，质中，与皮色一致，肿瘤体积逐渐增大，第20天肿物开始侵袭皮肤，质硬，开始出现新生血管，至30天，肿瘤生长更加迅速，表面乳头状生长或中央糜烂、溃疡、结痂，基底部有浸润，触之有坚实感，肿瘤周围往往充血(图5A,B)。组织病理学结果显示细胞排列紊乱，异型性明显，核大深染，可见角化不良细胞，鳞状窝及角化珠。免疫组化结果显示CK及Vim蛋白表达阳性，与UV诱导SKH-1无毛小鼠SCC结果一致。BALB/c裸鼠皮下注射PBS阴性对照组未见肿物形成。

在10只SKH-1小鼠皮下注射SCC肿瘤细胞悬液，也可形成不消退的肿物(2/10)，并逐渐增大，出现破溃(图6A)。病理结果检测显示细胞异型性明显，核大深染，可见角化不良细胞，鳞状窝及角化珠。组织免疫组化染色示CK蛋白阳性，Vimentin蛋白阳性，与紫外线所致SKH-1小鼠SCC一致。成功构建了SKH-1小鼠SCC种植瘤模型。SKH-1无毛小鼠皮下注射PBS阴性对照组未见肿物形成。

实施例12

统计分析。

应用GraphPad Prism 5统计软件进行统计分析，数据均采用均数±标准差表示。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系，其特征在于，命名为XL50，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号是：CCTCC No：C201827，保藏日期为2017年12月28日，保藏地址为：中国武汉大学。

2.权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系在种植瘤模型制备中的应用。

3.根据权利要求2所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系在种植瘤模型制备中的应用，其特征在于，BALB/c裸鼠皮下注射权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液，形成肿瘤。

4.根据权利要求2所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系在种植瘤模型制备中的应用，其特征在于，SKH-1小鼠皮下注射权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液，形成肿瘤。

5.一种SKH-1小鼠移植性皮肤鳞癌模型的构建方法，其特征在于，将权利要求1所述SKH-1小鼠皮肤鳞癌细胞系的细胞悬液注射SKH-1小鼠皮下，得到SKH-1小鼠移植性皮肤鳞癌模型。