CN107683148A - 皮肤重建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于制备皮肤替代品的方法、用于制备真皮替代品的方法、皮肤替代品、真皮替代品和用于实施所述方法的试剂盒。本发明还涉及由皮肤替代品组成的移植体及其作为治疗皮肤疾病和/或皮肤物质损失的装置的用途。本发明可具体用于药理学、医学和临床领域。

Description

皮肤重建方法
技术领域
本发明涉及用于制备皮肤替代品的方法，涉及可以通过实施该方法得到的动物皮肤替代品、优选地哺乳动物和/或人皮肤替代品，并涉及用于实施该方法的试剂盒。
本发明还涉及由皮肤替代品组成的移植体及其作为用于治疗皮肤疾病和/或皮肤物质损失的装置(means)的用途。
本发明可以具体用于药理学、医学和临床领域。
在以下描述中，方括号([])中的参考号涉及在本文的末尾提供的参考文献列表。
背景技术
皮肤是包含非常特殊的层状结构的非常复杂的器官。其包括三个主要部分：
-表面部分，其是最薄的，称为表皮(epidermis)，
-较厚的内部部分，附接表皮的真皮(dermis)，和
-较深的层，下皮(hypodermis)。
其具体提供了许多哺乳动物的外部介质和内部介质之间的屏障，具体包括人类。借助于该“屏障”功能，皮肤天然向有机体提供保护，同时提供所述有机体和外部环境之间的连络(communication)。皮肤组成针对任何攻击的第一防御器官。
皮肤经受许多的攻击；它们可以是例如与可以导致是癌症的原因的炎症反应/细胞改变(cell modification)的UV射线有关的攻击，物理攻击如烧伤、例如由于钝的物体的皮上划痕(scarification)，例如与化学品例如洗涤剂有关的化学攻击。这些各种攻击可以具体诱发能够改变皮肤的结构、改变其颜色和/或引起皮肤伤口外露的皮肤疾病。
事实上已知化学品和/或分子如对苯二酚在高剂量下使用时可以导致强褪色，可以引起疤痕，延伸瘢痕(stretch mark)、严重的病理学病症例如糖尿病、高血压、皮肤癌或全身并发症、肾脏异常、发展多毛并可以引起胡须生长和体臭困扰。当褪色超过期望效果时，这些结果可以是不可逆转的。所以主要的解决方案仍是皮肤移植以试图“回到”正常的外观。
其他要素可能是皮肤改变的原因，例如遗传指令(genetic order)参数和/或与全身的内分泌和/或自身免疫异常有关的参数。它们具体可以是引起色素异常如白癫风、黑色素过多、黑色素过少或痣的病理学病症。用于治疗这种疾病的方法之一包括皮肤移植和/或实施色素细胞。然而，这些方法具有经常与应用的皮肤和/或色素细胞的稳定性有关的相对疗效。
皮肤也可以例如被外界要素如钝的物体所伤，引起或深或浅的伤口。皮肤具有非常显著的再生和愈合能力，大多数时候允许在或长或短的时期内愈合。愈合时间和/或能力可以具体取决于伤口的深度/程度以及个体的生理条件。确实，在深伤口的情况下，它们可以代表对病原体的“开放的门”，要求增加监测和/或需要干预以闭合伤口，例如用缝线或通过向其应用皮肤移植体以具体使皮肤能够再生，具体是修复各种损伤的部分。
在现有技术中，存在人工的真皮替代品，其具体是暂时允许形成对于皮肤再生有利的环境。这些替代品形成的结构和环境经常接近于真皮的那些。然而，这些替代品是医学设备，其基本上是合成的并且昂贵。
现有技术中还存在用于培养由个体的皮肤样品得到的细胞、具体是角化细胞的系统，其在若干星期之后形成可以沉积/喷射到伤口例如慢性伤口或烧伤上的培养物以促进其愈合。
然而，这些方法和替代品没有同样地构成包含皮肤的主要构成细胞如成纤维细胞、角化细胞和黑色素细胞的皮肤替代品。具体地，这些替代品不包含黑色素细胞并因此使得不可以得到色素化的和/或能够色素化的皮肤替代品。而且，这些替代品不能用于例如治疗色素异常、治疗例如由于手术操作、例如引起显著的皮肤损失(其可以发展到皮肤整体损失的地步)的事故所导致的深的伤口。
此外，用于得到可获得的真皮替代品的方法是“缓慢”的方法，其使得不能例如在与治疗特殊的伤口如深度烧伤相适合的时间周期中得到替代品。
最后，大部分的商业可获得的皮肤替代品是在结构方面和在流行病学方面都脆弱的产物。因此，这些产物的尺寸经常是小的以具体避免在其处理期间对产物的任何撕裂。
现有技术中还存在用于制备皮肤替代品的系统/方法，例如如在文件US 5 755814中所描述的，具体包括培养细胞，具体是成纤维细胞和/或黑色素细胞和角化细胞的混合物。然而，这些系统/方法使得不能得到具有与体内皮肤的那些相同的结构的替代品。另外，借助于这些方法得到的替代品表现出角化不全，这是皮肤分化异常，相当于角质层中的角质成熟不正常，因此不允许将它们用于治疗皮肤疾病和/或皮肤物质损失。最后，用于制备皮肤替代品的已知的系统/方法具体地使用包含与临床用途不相容的化合物例如牛垂体提取物的介质。
因此实际需要寻找用于制备克服现有技术的这些缺陷、缺点和障碍的皮肤替代品的方法，具体是使得可以得到包含皮肤的主要构成细胞、具体是成纤维细胞、角化细胞和黑色素细胞的皮肤替代品来降低替代品的成本和制备时间的方法。
现有技术中实际还需要寻找允许生产可再现的和可靠的皮肤模型的方法。
实际还需要寻找可以用于治疗皮肤疾病和/或皮肤物质损失的新型皮肤替代品。
实际还需要寻找可以容易处理且在其处理期间不表现出高撕裂风险的新型的皮肤替代品。
发明内容
本发明的目的具体是通过提供用于制备皮肤替代品的方法满足该需要，包括以下步骤：
a.在成纤维细胞培养介质M1中培养成纤维细胞；
b.将由步骤a产生成纤维细胞接种在包含胶原蛋白的基质中；
c.在包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的成纤维细胞培养介质M2中培养接种在包含胶原蛋白的基质中的成纤维细胞，基质和培养的成纤维细胞形成真皮替代品；
d.在黑色素细胞培养介质M3中培养黑色素细胞；
e.在角化细胞培养介质M4中培养角化细胞；
f.混合在步骤d中得到的黑色素细胞与在步骤e中得到的角化细胞；
g.用在步骤f中得到的混合物接种在步骤c中得到的真皮替代品(dermalsubstrate)；
h.在皮肤培养介质M5中培养在步骤g中接种的真皮替代品，从而形成皮肤替代品。
在本发明中，术语“包括”在一方面可以等同于是指“包含”、“含有”或“涵盖”以及在另一方面可以等同于是指“由……构成”或“由……组成”。
在本发明中，根据本发明的方法得到的真皮替代品是再现体内真皮的特征的完整的组织，即其包括蛋白质类型的高分子，具体是胶原纤维、糖胺聚糖纤维(glycosaminoglycan fiber)、蛋白质和功能化的成纤维细胞。
在本发明中，根据本发明的方法得到的皮肤替代品是再现体内皮肤的特征的完整的组织，即其包括包含再现基底层(stratum basal)、棘层(stratum spinosum)、颗粒层(stratum granulosum)和角质层(stratum corneum)(其是组织学正常的)的角化细胞和与包含功能成纤维细胞的真皮替代品经由功能基膜(basal lamina)接触的基底黑色素细胞的角化多层表皮。
有利地，根据本发明的方法使得可以得到包含基膜的皮肤替代品，基膜具体由通过替代品的细胞分泌的蛋白质混合物组成，因此形成再现体内皮肤的特征的真皮-表皮接合(junction)。
在本发明中，可以用于本发明的方法的成纤维细胞、黑色素细胞和角化细胞可以是本领域技术人员已知的所有成纤维细胞、黑色素细胞和角化细胞。它们可以是例如由细胞库得到的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞，例如来自Institut Pasteur,25ruedu Docteur Roux,F-75724Paris Cedex 15的Collection Nationale de Culture deMicroorganisme[法国微生物保藏中心(French National Collection of MicroorganismCultures)](CNCM)。它们也可以是商业可获得的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞，例如由Thermofischer scientific公司、CellnTec公司或Promocell公司出售的细胞。它们也可以是从动物、优选地哺乳动物和/或人类的提前分离的生物样品分离的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞。成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞可以是独立地从活组织样品或若干活组织样品分离的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞。成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞可以独立地分离自个体、优选地哺乳动物和/或人类的活组织样品或若干活组织样品，以将所述皮肤替代品移植到所述患者上。它们可以独立地是成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞，其对于个体是自体的或异源的。
在本发明中，有利地，由成纤维细胞、黑色素细胞和角化细胞代表的三类细胞中的至少两类细胞对于个体是自体的。
在一个具体的实施方式中，成纤维细胞、黑色素细胞和角化细胞有利地是对于个体而言自体的细胞。
可以独立地从来自例如白人、亚洲或非洲皮肤的，来自各种解剖学部位例如人类的后背、脸、乳房、手背、手掌的活组织样品或若干活组织样品分离成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞。
它们可以独立地是从皮肤活组织样品(优选地来自人类)分离的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞，该人类患有一种或多种病理学皮肤病症，例如老年斑(日光性雀斑)、黑斑病、白癫风、痣或黑色素瘤。
它们也可以是独立地用例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)遗传改性的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞。它们可以例如是独立地过表达至少一种蛋白质(例如选自胶原蛋白VII、角质5,14、过氧化氢酶和SIRT6的蛋白质)和/或例如经由小发卡RNA(shRNA)或小干扰RNA(siRNA)技术抑制表达至少一种蛋白质(例如胶原蛋白VII、HIF1或CCN3)的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞。它们可以是例如如在Pendaries V etal.,JID 2012[1]；Petek LM et al.Mol ther 2010[2]中所描述的独立地地遗传改性的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞。它们可以是例如成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞，其可以是或可以不是独立地遗传改性的，例如在参考ATCC CRL-4048下鉴定的Ker-CT细胞或在参考ATCC CRL-4005下鉴定的TelCOFS02MA细胞。
它们也可以是源自细胞系例如HaCaT角化细胞系或WS1成纤维细胞系的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞。
优选地，可以使用的成纤维细胞不包含照射的3T3成纤维细胞。
它们也可以是成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞，独立地由成体干细胞、由例如通过保持所述成体干细胞诱导的多能干细胞和/或由经由例如引入Oct3/4、Sox 2、KLF4或c-Myc基因然后借助于因子混合物(cocktail)例如视黄酸和/或BMP-4分化为细胞系诱导的多能干细胞得到。它们也可以是通过在使用纳米颗粒例如精氨酸封端的聚酰胺基胺纳米颗粒的基础上通过非病毒技术诱导的成体干细胞和/或多能干细胞。本领域技术人员借助于它们的常识将能够选择方法和/或细胞。它们可以例如是借助于在Kogut etal.Methods Mol Biol 2014[3]、在Ohta et al.,Methods Mol Biol,2013[4]和在Revillaet al.,J Tissue Eng Regen Med,2015[5]中所描述的方法得到的成纤维细胞、黑色素细胞和/或角化细胞。
在本发明中，术语“成纤维细胞培养介质M1”旨在是指本领域技术人员已知的适用于培养成纤维细胞的任何介质。其可以是例如商业可获得的介质，例如由Gibco公司出售的Dulbecco改良的Eagle最低必需介质(Dulbecco’s modified Eagle's minimal essentialmedium(DMEM))，具体包含氨基酸、维生素、无机盐和糖(例如葡萄糖或由Cell Systems公司出售的Fibrolife介质)的混合物。
表1：Dulbecco改良的Eagle最低必需介质(DMEM)的组成
在本发明中，介质M1还可以包含补充剂，具体是胎牛血清(FCS)。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M1可以例如包含按重量计5％至15％、按重量计7.5至12.5％、按重量计10％的胎牛血清(FCS)。
在本发明中，介质M1可以包含至少一种抗真菌和/或抗生素化合物。其可以是例如本领域技术人员已知的和/或商业可获得的任何抗真菌和/或抗生素化合物。其可以是例如选自包含两性霉素B、酮康唑和它们的混合物的组的至少一种抗真菌化合物。其可以是例如选自包含青霉素、链霉素、环丙沙星和它们的混合物的组的至少一种抗生素化合物。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M1可以包含按重量计0.1％至10％、按重量计0.5％至5％、按重量计1％的抗真菌试剂。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M1可以包含按重量计0.1％至10％、按重量计0.5％至5％、按重量计1％的抗生素。
在本发明中，介质M1和/或它们的所有成分可以是临床等级的。
术语“临床等级的”在本发明中表示组分或介质已经由有关当局公认适合在给定领域临床使用的事实。有利地，在本发明中，当介质是临床等级时，其不包含牛垂体提取物。
在本发明中，可以在包括在30至40℃、35至39℃、或等于37℃的温度下进行成纤维细胞培养步骤a.。
在本发明中，步骤a.的成纤维细胞培养时间可以在5至21天、5至15天或8至15天之间。
在本发明中，可以在包含5％至10％的CO2的受控气氛下、例如在包含至少5％的CO2的气氛下进行步骤a.的成纤维细胞培养时间。
根据本发明，可以在温度为30至40℃、32至40℃、或等于37℃以及在包含至少5％的CO2的受控气氛下在温育箱中进行成纤维细胞培养步骤a.。
根据本发明，可以在本领域技术人员已知的任何合适的培养容器中进行成纤维细胞培养步骤a.。其可以是皮氏培养皿(petri dish)或容量为25至75cm2、25、75或175cm2的培养烧瓶。
根据本发明，通过根据步骤a.的培养得到的成纤维细胞可以在培养容器中形成汇合(confluence)的细胞层。例如，成纤维细胞可以是70％至100％汇合、优选地100％汇合。
根据本发明，当根据步骤a.的培养对应于可选地汇合时的细胞层时，方法还可以包括：
-步骤a’，除去培养介质，用溶液冲洗细胞，以及除去冲洗溶液，
-步骤a”，通过胰蛋白酶处理分离细胞，以及
-步骤a”’，粒化或离心。
根据本发明，在步骤a’中，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行培养介质的除去。其可以是例如抽吸介质或上下转动容器以除去培养介质。
根据本发明，在步骤a’中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法例如通过浸渍、喷撒(sprinkling)或在冲洗溶液中温育细胞进行细胞的冲洗。
在本发明中，术语“冲洗溶液”旨在是指本领域技术人员已知的用于冲洗细胞的任何溶液。其可以例如是pH包括在7.2至7.4的HBSS(Hank平衡盐液)缓冲液。
表2：HBSS介质的组成
其也可以是商业可获得的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或分别由Gibco、Sigma Aldrich或Lonza公司出售的Hank平衡溶液。
根据本发明，在步骤a’中，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行冲洗溶液的除去。其可以是例如抽吸冲洗溶液或上下翻转容器以除去冲洗溶液。
根据本发明，可以通过将细胞浸没在包含胰蛋白酶的缓冲液(BS)中，随后添加胎牛血清(FCS)停止酶促反应来进行胰蛋白酶处理步骤a”。
根据本发明，缓冲液(BS)可以是本领域技术人员已知的可以用于胰蛋白酶处理方法的任何缓冲液。其可以例如是磷酸盐缓冲盐水(PBS)或分别由Gibco、Sigma Aldrich或Lonza公司出售的Hank平衡溶液。
根据本发明，相对于总重量，添加到缓冲液(BS)中的胰蛋白酶的量可以在按重量计0.01％和0.05％之间。
根据本发明，在添加FCS到缓冲液(BS)中之前，在包含胰蛋白酶的缓冲液中的温育时间可以在2和10min之间。
根据本发明，相对于总体积，添加到缓冲液(BS)中的FCS的量可以包括按体积计5％至20％。
根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行粒化步骤a”’。其可以是例如沉降或以800至1400转/分例如等于1200转/分的速度离心。
根据本发明，离心步骤a”’可以进行4至10min，例如等于5分钟的时间。
根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何设备进行粒化步骤a”’。其可以是例如由Eppendorf或Jouan公司出售的旋转式离心机。
在本发明中，术语“包含胶原蛋白的基质”旨在是指本领域技术人员已知的且可以接种细胞的任何包含胶原蛋白的基质。其可以例如是在Bell et al.,1979[6]中所描述的对应于非绷紧I型胶原蛋白凝胶(non-taut type I collagen gel)的胶原蛋白的基质，优选地没有施加成纤维细胞的任何优选组织。其可以例如是具有胶原蛋白的密度/浓度的基质，优选表面积为25至500cm2的I型胶原蛋白。其可以是包含商业可获得的胶原蛋白的基质，例如其可以是包含由Integra公司出售的胶原蛋白的基质。
有利地，包含胶原蛋白的基质可以是真皮再生基质。真皮再生基质可以具体选自在名称Integra(注册商标)和Matriderm(注册商标)下分别由Intégra Life ScienceCorporation和MedSkin Solutions Dr.Suwelack AG公司出售的基质。有利地，以及与包含胶原蛋白的其他基质相反，已经模型化了真皮再生基质如上述的那些，从而有助于重建皮肤等价物。
在一个实施方式中，包含胶原蛋白的基质可以是包含交联的胶原蛋白和至少一种糖胺聚糖(例如6-硫酸软骨素)的基质。其可以例如是由Integralife Sciences公司出售的Integra基质(注册商标)和/或根据文件Boyce ST et al.,1988[7]中所描述的方法得到的基质。
在另一个实施方式中，包含胶原蛋白的基质可以是包含天然结构的胶原蛋白的纤维和弹性蛋白的基质。术语“天然结构的胶原蛋白的纤维”旨在具体是指没有被化学交联的纤维。基质可以是例如由MedSkin Solutions Dr.Suwelack AG公司出售的Matriderm基质和/或根据文件Hafemann et al.,Burns 1999[8]中所描述的方法得到的基质。
在本发明中，在接种成纤维细胞之前，包含胶原蛋白的基质的厚度可以是1.0至3.0mm(包括边界值(limits included))。在一个具体的实施方式中，接种成纤维细胞之前，包含胶原蛋白的基质的厚度可以严格大于1.0mm。
在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行步骤b.的接种。其可以例如是应用，例如通过将包含成纤维细胞的培养介质喷撒到基质上，通过沉积通过在基质上继代培养(subculturing)细胞，通过将包含细胞的培养介质倾倒到悬浮液中，或通过例如在Wonhye Lee et al.“Multi-layered culture of human skin fibroblasts andkeratinocytes through three-dimensional freeform fabrication.”Biomaterials,2009,March；30(8):1587-95[7]中所描述的3D打印。
在本发明中，当步骤a.包括步骤a”时，本发明的方法可以包括在接种步骤b.之前将离心的细胞再悬浮在介质M1中的步骤b1。
在本发明中，可以以20000至50000成纤维细胞/cm2、优选地30000成纤维细胞/cm2包含胶原蛋白的基质的表面积的密度进行包含胶原蛋白的基质的步骤b.的接种。在一个具体的实施方式中，成纤维细胞密度可以严格地小于50000成纤维细胞/cm2包含胶原蛋白的基质。
在本发明中，成纤维细胞培养介质M2可以是本领域技术人员已知的适用于培养成纤维细胞的任何介质。其可以是例如商业可获得的介质，例如具体包含氨基酸、维生素、无机盐、糖例如葡萄糖的混合物的Dulbecco改良的Eagle最低必需介质(DMEM)。
在本发明中，介质M1还可以包含补充剂，具体是胎牛血清(FCS)。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M2可以包含按重量计5％至15％、按重量计7.5至12.5％、或按重量计10％的胎牛血清(FCS)。
在本发明中，介质M2可以包含至少一种抗真菌和/或抗生素化合物。其可以是例如本领域技术人员已知的和/或商业可获得的任何抗真菌和/或抗生素化合物。其可以是例如选自包含两性霉素B、酮康唑或它们的混合物的组的至少一种抗真菌化合物。其可以是例如选自包含青霉素、链霉素、环丙沙星和它们的混合物的组的至少一种抗生素化合物。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M2可以包含按重量计0.1％至10％、按重量计0.5％至5％、或按重量计1％的抗真菌试剂。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M2可以包含按重量计0.1％至10％、按重量计0.5％至5％、或等于按重量计1％的量的抗生素。
在本发明中，介质M2还可以包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物。例如，介质M2可以包含20至60mg.mL-1、例如30至55mg.mL-1、或等于50mg.mL-1的浓度的抗坏血酸或抗坏血酸盐。
在本发明中，术语“衍生物”表示本领域技术人员已知的羧酸或羧酸盐的任何衍生物。例如，该术语可以包括衍生物如对应的酸的酯或酸酐。
有利地，抗坏血酸使得可以通过刺激成纤维细胞的胶原蛋白合成具体促进重塑包含胶原蛋白的基质。
在本发明中，介质M2和/或它们的所有成分可以是临床等级的。
在本发明中，可以在包括30至40℃、35至39℃、或等于37℃的温度下进行成纤维细胞培养步骤c.。
在本发明中，步骤c.的成纤维细胞培养时间可以是5至12天或7至10天。
在本发明中，可以在包含至少5％的CO2的受控气氛下进行成纤维细胞培养步骤c.。
在本发明中，接种在包含胶原蛋白的基质中的成纤维细胞的培养的步骤c.可以包括：
-在既不包含抗坏血酸又不包含抗坏血酸盐的成纤维细胞培养介质M21存在的情况下第一培养步骤c’18至28天，以及
-在包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的成纤维细胞培养介质M22存在的情况下第二培养步骤c”至少两天。
在此实施方式中，成纤维细胞培养介质M21对应于以上所定义的既不包含抗坏血酸又不包含抗坏血酸盐也不包含它们的衍生物的介质M2。在本发明中，介质M21和/或它们的所有成分可以是临床等级的。
在此实施方式中，成纤维细胞培养介质M22对应于以上所定义的包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的介质M2。在本发明中，介质M22和/或它们的所有成分可以是临床等级的。
在本发明中，可以在包括30至45℃、35至39℃、或等于37℃的温度下进行培养步骤c’。
在本发明中，步骤c’.的培养时间可以是19至27小时，例如24小时。
在本发明中，可以在包括30至40℃、35至39℃、或等于37℃的温度下进行培养步骤c”.。
在本发明中，步骤c”.的培养时间可以在5和12天之间，或等于7天。
本发明人还有利地表明基质和在步骤c.中得到的培养的成纤维细胞形成对应于真皮替代品的结构。
有利地，本发明人还表明培养步骤c’对应于基质由成纤维细胞粘附和定殖(colonization)的步骤，以及步骤c”有利地允许重塑包含成纤维细胞的基质以形成真皮替代品。具体地，分别使用介质M21和M22的连续的步骤c’和c”将有利地使得可以形成真皮替代品，其中成纤维细胞不能增殖，但是定殖包含胶原蛋白的基质，同时有利地允许通过成纤维细胞本身生产胶原蛋白，从而允许重塑真皮。
换句话说，可以将在步骤c.结束时得到的产物有利地用作真皮替代品。具体地，该产物包括可以衍生出成纤维细胞的真皮的全部物理化学特征。
根据本发明，可以在本领域技术人员已知的任何合适的培养容器中进行黑色素细胞培养步骤d.。其可以是皮氏培养皿或容量为25至75cm2、25、75或175cm2的培养烧瓶。
在本发明中，黑色素细胞培养介质M3可以是本领域技术人员已知的适用于培养黑色素细胞的任何介质。其可以是例如商业可获得的介质，例如在参考“黑色素细胞介质M2”下由Promocell公司出售的商业可获得的介质，由Promocell公司出售的“MBM”(在由Sigma-Aldrich公司出售的具体包含氨基酸、维生素、无机盐或糖例如葡萄糖的混合物的MCDB 153介质中(在如下表3所示))：
表3：MCDB 153介质的组成
其也可以是改良的商业可获得的介质，例如还进一步包含氨基酸例如酪氨酸、甲硫氨酸或它们的混合物、另外的无机盐例如碳酸氢钠(NaHCO3)的MCDB153介质。
在本发明中，介质M3还可以包含至少一种选自以下各项的补充剂：牛垂体提取物(BPE)、胰岛素、青霉素-链霉素(PS)、皮质醇、马血清、小牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、粒性白血细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、SCF或它们的任何混合物。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M3可以包含按重量计0.1％至10％、按重量计0.5％至5％、或按重量计1％的青霉素-链霉素(PS)。
在本发明中，介质M3可以包含1.25至1.60μM、1.40至1.55μM或1.45μM的皮质醇浓度。
在本发明中，介质M3可以包含100至160μg.mL-1、110至150μg.mL-1或等于140μg.mL-1的牛垂体提取物(BPE)浓度。
在本发明中，介质M3可以包含15至25μg.mL-1或等于20μg.mL-1的胰岛素浓度。
在本发明中，介质M3可以包含0.01至0.2μg.mL-1、0.01至0.1μg.mL-1或等于0.01μg.mL-1的GM-CSF浓度。
在本发明中，介质M3可以包含0.004至0.2μg.mL-1、0.01至0.15μg.mL-1或等于0.05μg.mL-1的SCF浓度。
在本发明中，介质M3可以包含0.1至10ng.mL-1、0.5至5ng.mL-1、0.8至2ng.mL-1或等于1ng.mL-1的bFGF浓度。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M3可以包含按重量计1％至5％、按重量计2％至4％或按重量计3％的马或小牛血清。
在本发明中，介质M3和/或它们的所有成分可以是临床等级的。
在本发明中，可以在环境温度例如在30至40℃、例如等于37℃的温度下进行黑色素细胞培养步骤d.。
在本发明中，步骤d.的培养时间可以是在15和28天之间。
在本发明中，可以在包含至少5％的CO2的受控气氛下进行黑色素细胞培养步骤d.。
根据本发明，通过根据步骤d.的培养得到的黑色素细胞可以在培养容器中形成汇合的细胞层。例如，黑色素细胞可以形成50％至100％汇合的细胞层。
根据本发明，当根据步骤d.的培养对应于可选地汇合的细胞层时，该方法还可以包括：
-步骤d’，除去培养介质，用溶液冲洗细胞，以及除去冲洗溶液，
-步骤d”，通过胰蛋白酶处理分离细胞，以及
-粒化步骤d”’。
在本发明中，在步骤d’中，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行培养介质的除去。其可以是例如抽吸介质或上下翻转容器以除去培养介质。
在本发明中，在步骤d’中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法例如通过喷洒或在冲洗溶液中浸渍细胞进行细胞的冲洗。
在本发明中，术语“黑色素细胞冲洗溶液”旨在是指本领域技术人员已知的任何黑色素细胞冲洗溶液。其可以是例如HBSS缓冲液，例如以上表2所描述的溶液或pH为7.2至7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其也可以是商业可获得的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或分别由Gibco、Sigma Aldrich或Lonza公司出售的Hank平衡溶液。
在本发明中，在步骤d’中，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行冲洗溶液的除去。其可以是例如抽吸冲洗溶液或上下翻转容器以除去冲洗溶液。
根据本发明，可以通过将细胞浸没在包含胰蛋白酶的缓冲液(BS)中，随后添加胎牛血清(FCS)停止酶促反应来进行胰蛋白酶处理步骤d”。
根据本发明，缓冲液(BS)可以是以上所定义的缓冲液。
根据本发明，相对于总重量，添加到缓冲液(BS)中的胰蛋白酶的量可以是按重量计0.01％至0.05％。
根据本发明，在添加FCS到缓冲液中之前，胰蛋白酶温育时间可以是2至5min。
在本发明中，相对于总体积，添加到溶液(BS)中的FCS的量可以在按体积计5％至20％之间。
根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何方法通过沉降、通过离心进行粒化步骤d”’。其可以是例如以800至1200转/分的速度的离心。
根据本发明，可以将离心步骤d”’进行5至10min的时间。
在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何设备进行离心步骤d”’。其可以是例如由Eppendorf或Jouan公司出售的旋转式离心机。
在本发明中，离心步骤d”’使得可以沉降细胞以将它们从介质中分离。本领域技术人员借助于常识将知道如何使用任何已知的技术(其可以沉降介质中的细胞)来改写/更改离心步骤d”’。
根据本发明，可以在本领域技术人员已知的任何合适的培养容器中进行角化细胞培养步骤e.。其可以是皮氏培养皿或容量为25至75cm2、25、75或125cm2的培养烧瓶。
在本发明中，角化细胞培养介质M4可以是本领域技术人员已知的适用于培养角化细胞的任何介质。其可以是例如商业可获得的介质，例如由Life-Technology公司出售的KSFM介质、由Lonza公司出售的KGM或由Sigma-Aldrich公司出售的具体包含氨基酸、维生素、无机盐、糖例如葡萄糖的混合物的MCDB 153介质中的Provitro。其还可以是改良的商业可获得的介质，例如包含0.100至0.110M/l例如0.104M/l的氯化钠浓度、2至3x10-2M/l例如2.29x10-2M/l的Hepes浓度、1.10x10-2M/l至1.25x10-2M/l例如1.19x10-2M/l的碳酸氢钠浓度并包含是未改良的MCDB 153介质的浓度的两倍的精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸和胆碱浓度的MCDB 153介质。
在本发明中，介质M4还可以包含选自生长因子例如上皮生长因子(EGF)、牛垂体提取物(BPE)、胰岛素、青霉素-链霉素(PS)、皮质醇或它们的任何混合物的补充剂。有利地，介质M4可以包含临床等级的补充剂。它们可以是例如选自生长因子例如上皮生长因子(EGF)、胰岛素、青霉素-链霉素(PS)、皮质醇(hydrocortisone)或它们的任何混合物的补充剂。
在本发明中，相对于介质的总重量，介质M4可以包含例如按重量计0.5％至5％、按重量计0.75％至3％、或按重量计1％的青霉素-链霉素(PS)。
在本发明中，介质M4可以包含1.25至1.60μM、1.40至1.55μM、或1.45μM的皮质醇浓度。
在本发明中，介质M4可以包含50至90μg.mL-1、60至80μg.mL-1或70μg.mL-1的牛垂体提取物(BPE)浓度。
在本发明中，介质M4可以包含3至8μg.mL-1、例如等于5μg.mL-1的胰岛素浓度。
在本发明中，介质M4可以包含5至15ng.mL-1、6.5至13ng.mL-1、或等于10ng.mL-1的上皮生长因子(EGF)浓度。
在本发明中，介质M4和/或它们的所有成分可以是临床等级的。
在本发明中，可以在25至39℃、例如等于37℃的温度下进行角化细胞培养步骤e.。
在本发明中，步骤e.的培养时间可以是15至28天。
在本发明中，可以在包含至少5％的CO2的受控气氛下进行步骤e.的角化细胞培养。
根据本发明，通过根据步骤e.的培养得到的角化细胞可以在培养容器中形成单层细胞。其可以例如是在培养容器中接近汇合的、例如50％至80％汇合的单层细胞。
根据本发明，当根据步骤e.的培养对应于接近汇合、优选地50％至80％汇合的单层细胞时，该方法还可以包括：
-步骤e’，除去培养介质，用溶液冲洗细胞，以及除去冲洗溶液，
-步骤e”，通过胰蛋白酶处理分离细胞，以及
-离心步骤e”’。
在本发明中，在步骤e’中，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行培养介质的除去。其可以是例如抽吸介质或上下翻转容器以除去培养介质。
在本发明中，在步骤e’中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法例如通过浸渍、喷撒或在角化细胞冲洗溶液中温育细胞进行细胞的冲洗。
在本发明中，术语“角化细胞冲洗溶液”旨在是指本领域技术人员已知的任何角化细胞冲洗溶液。其可以是例如PBS缓冲液或例如如以上表2所描述的pH为7.2至7.4的HBSS缓冲液。其也可以是商业可获得的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)或分别由Gibco、SigmaAldrich或Lonza公司出售的Hank平衡溶液。
在本发明中，在步骤e’中，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法进行角化细胞冲洗溶液的除去。其可以是例如抽吸角化细胞冲洗溶液或上下翻转容器以除去角化细胞冲洗溶液。
根据本发明，可以通过将细胞浸没在包含胰蛋白酶的溶液(S)中，随后添加胎牛血清(FCS)停止酶促反应来进行胰蛋白酶处理步骤e”。
根据本发明，相对于溶液的总重量，添加到溶液(S)中的胰蛋白酶的量可以在按重量计0.01％至0.05％之间。
根据本发明，在添加FCS到介质中之前，胰蛋白酶温育时间可以在5至10min之间。
在本发明中，相对于溶液的总重量，添加到溶液(S)中的FCS的量可以在按重量计5％至20％之间。
根据本发明，可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行离心步骤e”’。其可以是例如以800至1200转/分的速度的离心。
根据本发明，可以将离心步骤e”’进行5至10min的时间。
在本发明中，可以通过使用本领域技术人员已知的任何设备进行离心步骤e”’。其可以是例如由Eppendorf或Jouan公司出售的旋转式离心机。
在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何合适的方法手段进行步骤f.，混合在步骤d.中得到的黑色素细胞与在步骤e.中得到的角化细胞。其可以是例如在培养介质中在搅拌下混合细胞。
在本发明中，可以以1/20至1/15或等于1/19的黑色素细胞/角化细胞数值比进行步骤f.的黑色素细胞和角化细胞的混合。
有利地，本发明人表明出乎意料地当以1/20至1/15、优选地等于1/19的黑色素细胞/角化细胞比值进行黑色素细胞和角化细胞的混合时，得到的皮肤替代品具有等同于体内皮肤的那些的结构/生物特征。
在一个优选的实施方式中，以1/20至1/15或等于1/19的黑色素细胞/角化细胞数值比进行步骤f.的黑色素细胞和角化细胞的混合，以及包含胶原蛋白的基质是如以上所定义的真皮再生基质。
在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行步骤g.的真皮替代品的接种。其可以是例如以下应用，例如通过喷撒包含在步骤f.中得到的黑色素细胞和角化细胞的混合物的培养介质，通过沉积通过将细胞传代培养(subculture)在真皮替代品上，通过将包含在步骤f.中得到的黑色素细胞和角化细胞的混合物的培养介质逐滴倾倒到外面，或通过例如如在Wonhye Lee et al.“Multi-layered culture of human skinfibroblasts and keratinocytes through three-dimensional freeformfabrication.”Biomaterials,2009,Mar；30(8):1587-95[9]中所描述的3D打印。
在本发明中，可以以9至19的(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值有利地进行步骤g.的真皮替代品的接种。本发明人表明出乎意料地，事实上当以9至19的(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值进行步骤g.的接种时，得到的皮肤替代品具有等同于正常皮肤的那些的结构/生物特征。
在一个优选的实施方式中，以9至19的(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值进行步骤g.的真皮替代品的接种，以及包含胶原蛋白的基质是如以上所定义的真皮再生基质。
在本发明中，术语“皮肤培养介质M5”旨在是指本领域技术人员已知的适用于培养皮肤的任何介质。其可以是商业可获得的介质，例如改良的Green介质，即包含2/3的Dulbecco/Vogt改良的Eagle最低必需介质(DMEM)；1/3的Ham’s F12介质并包含10％的胎牛血清(FCS)，其是由Gibco公司出售的具体包含氨基酸、维生素、无机盐以及糖例如葡萄糖的混合物的定制混合物。其还可以是改良的Green介质，也就是说不含霍乱毒素和三碘甲状腺原氨酸的Green介质，或Iscove改良的Dulbecco介质(IMDM)和包含％的FCS的MCDB 153介质的混合物；或包含10％的FCS的IMDM/dermalife角化细胞介质(分别由Gibco、Lifescience、Promocell和Sigma Aldrich公司出售)。
在本发明中，介质M5同样还可以包含选自透明质酸或透明质酸盐或其衍生物、抗坏血酸或抗坏血酸盐或其衍生物、或它们的混合物的补充剂。
在本发明中，介质M5可以包含例如40至60mg.L-1、45至55mg.L-1、或50mg.L-1的透明质酸盐或透明质酸。
有利地，当介质M5包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物时，其不包含牛垂体提取物。
在本发明中，介质M5可以包含例如40至60mg.L-1、45至55mg.L-1、或50mg.L-1的抗坏血酸或抗坏血酸盐。
在本发明中，可以在25至40℃、例如等于37℃的温度下进行皮肤培养步骤h.。
在本发明中，步骤h.的皮肤培养时间可以在6和21天之间，例如8至15天。
在本发明中，可以在包含至少5％的CO2的受控气氛下进行步骤h.的皮肤培养。
根据本发明，可以在25至40℃、例如等于37℃的温度下以及在包含至少5％的CO2的受控的气氛下进行步骤h.的皮肤培养。
在本发明中，介质M5和/或它们的每种成分可以是临床等级的。
在本发明中，步骤h.可以包括：
-在既不包含透明质酸也不包含透明质酸盐、既不包含抗坏血酸也不包含抗坏血酸盐的培养介质M51存在的情况下第一培养步骤h.至6小时、优选地6至24小时，
-在包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物的培养介质M52存在的情况下第二培养步骤h.”0至7天、优选地至少2天，以及
-在包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物和抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的介质M53中第三培养步骤h.”’至少两天。
皮肤替代品培养介质M51对应于如以上所定义的既不包含抗坏血酸又不包含抗坏血酸盐或它们的衍生物的介质M5。
在本发明中，介质M51和/或它们的每种成分可以是临床等级的。
皮肤替代品培养介质M52对应于以上所定义的包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物同时不含抗坏血酸、抗坏血酸盐和它们的衍生物的介质M5。
在本发明中，介质M52和/或它们的每种成分可以是临床等级的。
皮肤替代品培养介质M53对应于以上所定义包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物和抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的介质M5。
在本发明中，介质M53可以是临床等级的介质。
在本发明中，可以通过将在步骤g.中得到的接种的真皮替代品沉积到培养介质M51中进行培养步骤h’。
在本发明中，可以在包括在25至40℃、例如等于37℃的温度下进行培养步骤h’.。
在本发明中，培养步骤h’.的持续时间可以是6至24小时，例如8至24小时或12至18小时。
在本发明中，可以在包含至少5％的CO2的受控气氛下进行皮肤培养步骤h’.。
有利地，本发明人表明步骤h’使得可以促进黑色素细胞和角化细胞粘附到真皮替代品上。
在本发明中，可以通过将在步骤h’.中得到的接种的真皮替代品沉积到培养介质M52中或将在步骤h’中得到的接种的真皮替代品浸没或浸泡在培养介质M52中进行培养步骤h”.。
在本发明中，可以在25至40℃、例如等于37℃的温度下进行培养步骤h”.。
在本发明中，培养步骤h”.的持续时间可以是0至7天、优选地2至7天。
在本发明中，可以在包含至少5％的CO2的受控气氛下进行皮肤培养步骤h”.。
在本发明中，可以通过将在步骤h”.中得到的接种的真皮替代品沉积到培养介质M52中、将在步骤h”.中得到的接种的真皮替代品浸没到培养介质M52中或浸没在步骤h”.中得到的接种的真皮替代品进行培养步骤h”’.，所述替代品浸没在所述介质中直到气-液界面或刚刚打破(break)所述介质的表面。
在本发明中，术语“打破所述介质的表面”旨在是指以这种方式将替代品浸没在介质中，以覆盖替代品超过其整个高度但是不浸过其上部(upper part)。
在本发明中，可以在25至40℃、例如等于37℃的温度下进行培养步骤h”’.。
在本发明中，培养步骤h”’.的持续时间可以是2至7天、优选地7天。
在本发明中，可以在包含至少5％的CO2的受控气氛下进行皮肤培养步骤h”’.。
有利地，本发明人表明将在步骤h”.中得到的接种的真皮替代品浸没在包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物和抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的培养介质M53中使得可以促进真皮-表皮接合(junction)的形成并从而提供接种的真皮替代品的细胞的更好的极化。
有利地，本发明人还表明将在步骤h”.中得到的接种的真皮替代品浸没在包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物和抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的培养介质M53中最高到气-液界面或刚刚打破介质的表面，使表皮能够分化，从而促进在皮肤替代品或等价物上形成角质层。
有利地，本发明人还表明将在步骤h”中得到的接种的真皮替代品浸没在包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物和抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的培养介质M53中最高到气-液界面或刚好打破介质的表面使得可以保持基底层的细胞的高增殖能力和与在体内皮肤中观察到的梯度类似的增殖能力随表皮分化增加而下降的梯度。
有利地，本发明人还表明当介质M5包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物时，这使得可以出乎意料地改善皮肤替代品或等价物的质量。
有利地，本发明人表明所述方法有利地使得可以得到包含其所有构成层的皮肤替代品或等价物。因此，根据本发明的方法得到的皮肤替代品具有与天然皮肤的那些类似的特征，这与现有技术中的已知的皮肤替代品相反。
有利地，本发明人还表明所述方法使得可以得到尺寸比现有技术中已知的那些大得多的真皮替代品和/或皮肤替代品。具体地，该方法有利地使得可以得到表面积为1至25cm2例如5至25cm2的真皮替代品和/或皮肤替代品。
本发明人还有利地表明该方法可以得到最低扩增能力为6的真皮替代品或等价物和/或皮肤等价物或替代品。
另外，本发明人还有利地表明根据本发明的方法可以得到可以被处理为具有粘弹性质的真皮和/或皮肤替代品，粘弹性质有利地可以避免所述替代品在其处理期间的任何撕裂/物理改变。
另外，根据本发明的方法的真皮和/或皮肤替代品制备时间一般小于30天，并因此满足特别是护理烧伤的要求。
本发明的主题还是通过实施以上定义的方法可以得到的皮肤替代品。
有利地，本发明人表明所述皮肤替代品包含在基底层水平的黑色素细胞，其形成表皮黑化单元。
有利地，可以通过本发明的方法得到的皮肤替代品借助于存在的黑色素细胞有利地表现出构成性色素沉着(pigmentation)。
有利地，该皮肤替代品在尺寸上比现有技术中已知的那些大得多，与现有技术的那些相比，这允许具体是当存在较大的伤口时，应用单个或较少数量的皮肤替代品。有待应用的皮肤替代品的数量的减少还有利地可以降低治疗费用，同时加速所述治疗。
本发明的主题还是在所述方法的步骤c.中得到的真皮替代品。
有利地，真皮替代品可以包含新形成(neoformed)类型的IV胶原蛋白。
有利地，真皮替代品包含至少一种基质，其包含成纤维细胞分布其中的I型胶原蛋白。其还可以包含其他细胞外基质成分，例如分子如胶原蛋白，具体是胶原蛋白IV、层粘连蛋白或糖胺聚糖(glycosaminoglycan)。
有利地，该真皮替代品在尺寸上比现有技术中已知的那些大得多，与现有技术的那些相比，这允许具体是当存在较大的伤口时，应用单个或较少数量的皮肤替代品。借助于例如提供覆盖待治疗的整个表面的单个设备，有待应用的替代品数量的减少还有利地可以降低治疗成本，同时加速治疗。
本发明人还表明根据本发明的真皮替代品和/或皮肤替代品可以有利地用于覆盖物质的损失(loss of substance)；根据本发明的真皮替代品和/或皮肤替代品因此可以被有利地用作移植体。
本发明的主题因此还是由以上定义的皮肤替代品或以上定义的真皮替代品组成的移植体。
在本发明中，可以将本发明的移植体用作用于治疗皮肤疾病和/或皮肤物质损失的装置(means)。具体地，可以将根据本发明的移植体用作用于治疗选自包含以下各项的组的皮肤疾病和/或皮肤物质损失的装置：烧伤、与创伤伤口或与慢性伤口有关的愈合缺陷、色素异常、血管瘤和皮肤癌。
本发明的主题因此还是用于治疗皮肤病的方法，包括移植或植入根据本发明的皮肤替代品或真皮替代品。
在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行皮肤替代品的植入。其可以是例如将替代品直接应用于待治疗区域，例如根据在and al.Use ofAutologous Skin Equivalents With Artificial Dermal Matrix(Integra)in DonorSite Coverage in Radial Forearm Free Flaps:Preliminary Cases J Oral andMaxillofacial Surgery,70:10 10,2012[10]中所描述的方法。
在本发明中，可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行皮肤替代品的移植。其可以是例如包括以下各项的方法：确定和除去待除去的皮肤/真皮的区域的第一步骤，随后是结合替代品到暴露的区域的第二步骤。其也可以是在文件E.Dantzer,F.BrayeReconstructive surgery using an artificial dermis(Integra):results with39grafts.Br J Plast Surg,54:8 8,2001[11]中所描述的方法。
在该治疗方法中，术语“皮肤病(skin ailment)”旨在是指烧伤、与创伤伤口或慢性伤口有关的愈合缺陷、色素异常、血管瘤和皮肤癌。
治疗方法因此可以允许用健康的皮肤替代品置换患病的和/或损坏的和/或病理的皮肤。
治疗方法可以包括在切除例如黑素细胞痣、巨大的黑素细胞痣、黑色素瘤、血管瘤或小汗管瘤(eccrine poroma)之后移植皮肤替代品。
治疗方法还可以包括将皮肤替代品植入和/或应用到烧伤和/或深的受伤处和/或慢性伤口例如糖尿病伤口上。
有利地，本发明人表明出乎意料地当根据本发明的其中介质M5包含透明质酸或透明质酸盐或它们的衍生物的方法得到皮肤替代品或等价物时，组织修复加速，具体是在治疗皮肤疾病期间。
本发明的主题还是用于实施根据本发明的方法的试剂盒，包含成纤维细胞培养介质M1、包含胶原蛋白的基质、用于在包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或它们的衍生物的基质中培养成纤维细胞的介质M2、黑色素细胞培养介质M3、角化细胞培养介质M4和皮肤培养介质M5。
本发明的主题还是用于实施根据本发明的方法的试剂盒，包含成纤维细胞培养介质M1、包含胶原蛋白的基质、用于在包含胶原蛋白的基质中培养成纤维细胞的介质M21、介质M22、黑色素细胞培养介质M3、角化细胞培养介质M4、皮肤培养介质M51和/或皮肤培养介质M52和/或皮肤培养介质M53。
介质M1、M2、M21、M22、M3、M4、M5、M51、M52和M53是如以上所定义的。
本发明的主题还是皮肤移植方法，包括以下步骤：
-从个体的未受影响的区域采集皮肤样品，
-使用来自采集的样品的成纤维细胞、角化细胞和成纤维细胞根据本发明制备皮肤替代品，以及
-将得到的替代品移植到个体上。
本领域技术人员在阅读以下的实施例后其他优点将变得更加明显，该实施例由附图(通过说明的方式给出)说明。
附图描述
图1表示用于得到皮肤替代品/等价物的步骤的图。
图2表示皮肤(图2中的A)和通过改变接种的细胞的比值根据本发明的方法得到的皮肤替代品(图2中的B和图2中的C)的光学显微照片。
图3中的A是在步骤c.中得到的真皮替代品的在染色成纤维细胞之后的光学显微照片。图3中的B是得到的小尺寸的即0.5cm2的皮肤替代品的照片。图3中的C是得到的中等尺寸即25cm2的皮肤替代品的照片。
图4表示在移植当天(第1行)、在移植后14天(第2行)或在移植后24天(第3行)在移植包含胶原蛋白的基质(A列)或移植在步骤c中得到的真皮替代品(B列)之后的照片。
图5表示在移植后24小时、苏木精-伊红染色之后从移植体采集的样品的光学显微照片。
图6表示以13.3的(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞接种细胞比值根据本发明的方法得到的皮肤等价物(图6中的A和图6中的B)；在基底位置(图6中的C，明亮区域)中的黑色素细胞的免疫组织化学标记和基膜的生产、胶原蛋白IV(图6中的D中的2)和p63增殖标记物(图6中的D中的1)的标记的光学显微照片(图6中的A至图6中的D)。图6中的E和图6中的F表示在基底位置中的黑色素细胞的免疫组织化学标记(图6中的E，明亮区域)、胶原蛋白IV(图6中的F中的2和p63增殖标记物(图6中的F中的1)的标记之后的皮肤的光学显微照片。
具体实施方式
实施例
实施例1：生产皮肤替代品的实施例
在本实施例中，使用的细胞来自从之前在患者上进行的乳房成形术采集的皮肤活组织样品。
活组织样品由整形外科医生采集并将活组织样品放置在包含生理盐水的无菌管中。
如下将细胞从活组织样品分离：
1.上皮细胞分离
a.在无菌HBSS(Hank平衡盐水溶液)中冲洗活组织样品。
b.由生物学家-技术人员使用手术刀除去脂肪组织。
c.用预热至37℃的胰蛋白酶-EDTA温育3至24h。
d.用照射的FCS(胰蛋白酶抑制剂)中和。
e.除去表皮并用手术刀刮去建立高度增殖的(p63阳性的)细胞的基底层。
f.过滤，以1200转/分离心并以100000细胞/cm2将球粒(pellet)接种在包含以下表4中提到的化合物和用于角化细胞的抗生素(青霉素和链霉素1％)的改良的*MCDB153介质中，其中L-精氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸和氯化胆碱的浓度加倍，NaCl的浓度降低至0.104M/l，Hepes降低至2.29x10-2M/l以及NaHCO3降低至1.19x10-2M/l，介质的pH调节为7.4。
对于黑色素细胞，过滤，以1200转/分离心并以100000细胞/cm2将球粒接种在包含以下表4中提到的化合物以及包含5.88g的碳酸氢钠//5I，0.272g的酪氨酸/5I和0.157g的L-甲硫氨酸/5I的改良的*MCDB153介质中，并将介质的pH调节到7.4。
表4：MCDB 153介质的标准组成
g.用每三天一换的介质在5％CO2下在37℃下温育一周。
h.在大约一周之后：差别的胰蛋白酶处理＝用0.025％的胰蛋白酶和0.0.1M EDTA的胰蛋白酶处理(1-2分钟以分离黑色素细胞，10分钟以分离角化细胞)。首先分离黑色素细胞，从而可以纯化培养物。
用照射的FCS中和，在1200转/分下离心并在相同的介质中接种球粒用于扩增。
i.用每三天一换的介质在5％CO2下在37℃下温育一周。
2.成纤维细胞分离
a.用HBSS冲洗真皮部分
b.以1％的胶原酶在37℃下温育真皮持续最长三小时，这取决于真皮的类型。
c.用照射的FCS中和。
d.经由40μm细胞筛过滤，在1200转/分下用GR 2022离心机离心5分钟并以100000细胞/cm2将球粒接种在包含10％照射的FCS和1％青霉素和链霉素的DMEM中24小时。
e.在37℃、5％CO2下在Jouan IG 150培育箱中温育一周，每三天换一次介质。
3.制备皮肤替代品
a.在量身定制(made-to-measure)的不锈钢温育室中，用0.025％胰蛋白酶和0.0.1M EDTA胰蛋白酶处理成纤维细胞10分钟，然后用照射的FCS中和，用GR 2022离心机以1200转/分离心5分钟，并以30000成纤维细胞/cm2的比列接种在包含10％FCS的DMEM中在无菌的胶原蛋白起源的真皮基质上即提前用Hank平衡盐液(HBSS)冲洗三次的Integra基质(注册商标)。
b.在37℃、5％CO2下培养24小时之后，从基质中移除温育室。
c.在37℃、5％CO2下在包含10％照射的FCS和1％的青霉素和链霉素以及50mg/mL抗坏血酸的DMEM中温育接种的基质一周，每三天换一次介质。
d.用0.025％胰蛋白酶和0.0.1M EDTA胰蛋白酶处理角化细胞和黑色素细胞1至2分钟以从黑色素细胞培养皿中分离黑色素细胞，10分钟以从角化细胞培养皿中分离角化细胞。用照射的FCS中和，以及离心和在包含1个黑色素细胞/19个角化细胞的混合物的温育室中以400000细胞/cm2接种。
e.粘附24小时。
f.在改良的green介质：DMEM/Ham’s F12/包含50mg/ml的透明质酸的10％FCS中浸泡七天。
g.在改良的Green介质：DMEM/包含10％FCS、50mg/mL的透明质酸和50mg/mL的抗坏血酸和抗生素即1％青霉素-链霉素的Ham’s F12中接触(interface)7天。
图1表示用于得到皮肤替代品的步骤的图。
在本实施例中，得到的两个皮肤替代品具有13.3的(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值。对于13.3的比值，在沉积成纤维细胞和角化细胞/黑色素细胞混合物的步骤期间，接种的细胞的量分别是对于成纤维细胞15000，对于黑色素细胞10000以及对于角化细胞190000。
一旦得到替代品，将其固定在4％甲醛中，包埋到石蜡中，然后切割4μm切片，然后进行苏木精-伊红染色以标记皮肤的各层。在光学显微镜下以及以x40的放大倍数进行观察。在将显微镜连接至CCD摄像机(Nikon，软件NIS element Br)开始，采集观察的照片。图2中的B表示根据该方法得到的皮肤替代品的光学显微照片，其中(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值是13.3。图2中的C表示根据该方法得到的皮肤替代品的光学显微照片，其中(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值是6.7以及图2中的A表示正常的皮肤活组织样品的光学显微照片。图6中的A和图6中的B也表示根据该方法得到的皮肤等价物的光学显微照片，其中(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值是13.3。
此外，根据在Salducci,M.,André,N.,Guéré,C.,Martin,M.,Fitoussi,R.,Vié,K.,and Cario-André,M.(2014)中描述的方法进行根据所述方法得到的替代品和体内皮肤的免疫组织化学标记，替代品中的(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值是13.3。由照射的老化的成纤维细胞分泌的因子诱导色素重建的表皮中的阳光性雀斑。Pigment CellMelanoma Res.27,502–504[12]或Simon,D.,Daubos,A.,Pain,C.,Fitoussi,R.,Vié,K.,Taieb,A.,de Benetti,L.,and Cario-André,M.(2013).暴露于移动电话暴露范围的严重的电磁辐射短暂改变色素重建的表皮的模型的皮肤动态平衡。Int.J.Cosmet.Sci.35,27-34[13]，从而鉴定替代品中存在黑色素细胞，具体包含胶原蛋白IV的基膜的生产(图6中的D中的2)、基膜中细胞的增殖能力(图6中的D中的1)和存在黑色素细胞(图6中的C)。图6中的E和图6中的F表示在基底位置中的黑色素细胞的免疫组织化学标记(图6中的E，明亮区域)、胶原蛋白IV的标记(图6中的F中的2和p63增殖标记物的标记(图6中的F中的1)之后的体内皮肤的光学显微照片。由图6中的C和图6中的D清楚可见的是根据本发明的皮肤替代品包含黑色素细胞和基膜，如由以对于体内皮肤存在的细胞是高度增殖的水平存在胶原蛋白IV所表明的(图6中的E和图6中的F)。
如这些照片所表示的，借助于所述方法得到的替代品具有与体内皮肤的那些相同的结构。
实施例2：将根据本发明的真皮替代品移植到小鼠上
在该实施例中，使用的皮肤替代品是如实施例1中所描述的通过乳房成形术得到的细胞得到的替代品，其中(角化细胞+黑色素细胞)成纤维细胞比值是13.3。使用的小鼠是来自杰克逊实验室的swiww nu/nu裸小鼠。
在该实施例中，在十个小鼠上平行进行移植。
在5cm2区域使用手术刀进行小鼠的切割，以除去真皮和表皮，并用生理盐水清洁去皮的区域。将之前制备的皮肤替代品应用于去皮区域以覆盖它(图4中的A，第1行)，然后通过缝合的小鼠皮肤闭合移植区域(附图4中的B，第1行)。
将小鼠以一只/笼子保持在专用的畜舍中持续采集移植体所需的时间，然后是五只/笼子(在适当尺寸的笼子中)。
两周之后，观察是如何通过除去小鼠的皮肤的皮瓣(flap)采集移植体的(图4中的A，第2行)。换句话说，从缝合的小鼠皮肤除去缝线，除去所述皮肤并显示移植的真皮替代品用于视觉观察(图4中的B，第2行)。
三周之后，视觉观察移植体是如何采集的(图4中的B和B，第3行)。
如图4所表明的，清楚可见的是在不会诱发副作用的情况下可以有利地将真皮替代品具体应用于移植体。
另外，为了研究应用后三周之后真皮替代品的结构状态，通过用手术刀切割替代品采集样品。将替代品固定在4％甲醛中，包埋到石蜡中，然后切割4μm切片，然后进行苏木精-伊红染色以标记皮肤的各层。在光学显微镜下在x40的放大倍数下进行观察。从将显微镜连接至CCD摄像机(Nikon，软件NIS element Br)开始，采集观察的照片。
图5表示移植的替代品的光学显微照片。具体地，图5示出了被鼠科成纤维细胞定殖的替代品，其中不存在非常多的胶原蛋白且其没有开始重新组织胶原蛋白。图5中的B示出了移植之前定殖人成纤维细胞的替代品。观察到大量成纤维细胞和基质的重组，具体是在具有较厚的胶原蛋白束的表面区域。本实施例因此清楚地表明存在所有细胞使得可以得到容易整合的替代品，其不随着时间退化并在移植之后表现成熟，这在基质中存在成纤维细胞的情况下加速。
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Claims (17)

1.一种用于制备皮肤替代品的方法，包括以下步骤：
a.在成纤维细胞培养介质M1中培养成纤维细胞；
b.将由步骤a产生的成纤维细胞接种在包含胶原蛋白的基质中；
c.在包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或其衍生物的成纤维细胞培养介质M2中培养接种在包含胶原蛋白的基质中的成纤维细胞，所述基质和培养的成纤维细胞形成真皮替代品；
d.在黑色素细胞培养介质M3中培养黑色素细胞；
e.在角化细胞培养介质M4中培养角化细胞；
f.混合在步骤d中得到的黑色素细胞与在步骤e中得到的角化细胞；
g.用在步骤f中得到的混合物接种在步骤c中得到的真皮替代品；
h.在皮肤培养介质M5中培养在步骤g中接种的真皮替代品，从而形成所述皮肤替代品。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述介质M5包含透明质酸或透明质酸盐或其衍生物。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述介质M5包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或其衍生物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中以1/20至1/15的黑色素细胞/角化细胞比值进行步骤f的黑色素细胞和角化细胞的混合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以9至19的(角化细胞+黑色素细胞)/成纤维细胞比值进行步骤g的接种。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中以20000至50000成纤维细胞/cm2包含胶原蛋白的基质的表面积的密度进行步骤b的接种。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤c包括在既不包含抗坏血酸也不包含抗坏血酸盐的成纤维细胞培养介质M21存在的情况下第一培养步骤c’18至28小时和在包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或其衍生物的成纤维细胞培养介质M22存在的情况下第二培养步骤c”至少两天。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤h.包括：
-在既不包含透明质酸也不包含透明质酸盐、既不包含抗坏血酸也不包含抗坏血酸盐的培养介质M51存在的情况下第一培养步骤h.’6至24小时，
-在包含透明质酸或透明质酸盐或其衍生物的培养介质M52存在的情况下第二培养步骤h.”至少2天，以及
-在包含透明质酸或透明质酸盐或其衍生物和抗坏血酸或抗坏血酸盐或其衍生物的介质M53中第三培养步骤h.”’至少两天。
9.一种通过实施前述权利要求中任一项中限定的方法可以得到的皮肤替代品。
10.根据权利要求9所述的皮肤替代品，其中为了将所述皮肤替代品移植到个体上，所述成纤维细胞对于所述个体而言是自体的。
11.根据权利要求10所述的皮肤替代品，其中所述成纤维细胞、所述黑色素细胞和所述角化细胞对于所述个体而言是自体的。
12.一种在前述权利要求任一项中限定的方法的步骤c.中可以得到的真皮替代品。
13.一种由权利要求10或11所述的皮肤替代品或权利要求12所述的真皮替代品组成的移植体。
14.根据权利要求13所述的移植体，用于作为用于治疗皮肤疾病和/或皮肤物质损失的装置而应用。
15.根据权利要求14所述的用于应用的移植体，其中所述皮肤疾病和/或皮肤物质损失选自包括烧伤、愈合缺陷、慢性伤口、色素异常、血管瘤和皮肤癌的组。
16.一种用于实施权利要求1至8中任一项所述的方法的试剂盒，包含成纤维细胞培养介质M1、包含胶原蛋白的基质、包含抗坏血酸或抗坏血酸盐或其衍生物的成纤维细胞培养介质M2、黑色素细胞培养介质M3、角化细胞培养介质M4、和皮肤培养介质M5。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其中所述介质M1至M5独立地是临床等级的介质。
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