CN103356701B - 用于色素沉着障碍的细胞疗法的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于色素沉着障碍的细胞疗法的药物组合物，该药物组合物包含(a)黑素细胞和角质细胞或(b)黑素细胞和成纤维细胞作为活性成分。本发明的细胞疗法组合物首次通过细胞疗法方案治疗色素沉着障碍。本发明的组合物包含黑素细胞和角质细胞的混合细胞制剂或黑素细胞和成纤维细胞的混合细胞制剂作为活性成分，使得其非常有效地诱导色素沉着以治疗与色素沉着不足相关的疾病，例如白斑。

Description

用于色素沉着障碍的细胞疗法的药物组合物
本申请为“用于色素沉着障碍的细胞疗法的药物组合物”发明专利申请的分案申请，母案的国家申请号为“200680050325.4”，PCT国际申请日为2006年6月20日，PCT国际申请号为PCT/KR2006/002366。
技术领域
本发明涉及用于治疗色素沉着障碍的药物细胞疗法组合物和着色皮肤重建模型。
背景技术
用于如白斑的色素沉着障碍的疗法包括化学疗法和外科疗法。化学疗法通常通过向皮肤施用或局部涂敷类固醇，或者向患者施用光敏剂和照射紫外线而进行。然而，该疗法可能诱导较低的再着色作用和副作用。外科疗法通过切除表现白斑症状的表皮并将正常自体表皮移植到切除部分的表皮移植而进行。
韩国专利No.293736披露了用于治疗白斑的包括糖结合蛋白质的苦楝皮(Meliae Cortex)提取物。韩国专利申请No.2003-0056823披露了用于治疗白斑的施用光敏剂和局部照射化学光的光动力学疗法。另外，韩国专利申请No.2003-7017182提出了能证明如减轻白斑的对皮肤有益的用于活组织的光调节的系统和方法。韩国专利申请No.2003-0049725报道了固态激光辐射系统以产生有效治疗如银屑病和白斑的皮肤疾病的具有310nm波长的紫外线。
本申请自始至终引用了多个专利和出版物，并在括号内提供了引用文。这些专利和出版物在此全部引入本申请作为参考以更全面地描述本发明和本发明涉及的技术水平。
发明内容
本发明人进行了深入研究以研发一种用于治疗色素沉着障碍或疾病，具体而言，与黑素细胞丧失或黑素产生降低相关的色素沉着不足症状的细胞疗法的治疗法，结果发现黑素细胞加上角质细胞或成纤维细胞的混合细胞制剂极大地增强了皮肤中的色素沉积。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于色素沉着障碍的细胞疗法的药物组合物。
本发明的另一目的是提供一种着色皮肤重建模型。
从以下的详细描述与所附权利要求和附图一起，本发明的其他目的和优点将变得显而易见。
本发明的一方面提供了用于色素沉着障碍的细胞疗法的药物组合物，所述药物组合物包含(a)黑素细胞和角质细胞或(b)黑素细胞和成纤维细胞作为活性成分。
本发明的另一方面提供了用于治疗色素沉着障碍的方法，所述方法包括向受试者施用包含(a)药学有效量的(i)黑素细胞和角质细胞或(ii)黑素细胞和成纤维细胞作为活性成分；和(b)可药用载体的药物组合物。
本发明的又一方面提供了将包含(i)黑素细胞和角质细胞或(ii)黑素细胞和成纤维细胞的细胞混合物用于制备用于治疗色素沉着障碍的药物的用途。
本发明人进行了深入研究以研发一种用于治疗色素沉着障碍或疾病，具体而言，与黑素细胞丧失或黑素产生降低相关的色素沉着不足症状的细胞疗法的治疗法，结果发现黑素细胞加上角质细胞或成纤维细胞的混合细胞制剂极大地增强了皮肤中的色素沉积。
本发明的显著特征在于同时使用黑素细胞加上角质细胞或成纤维细胞用于色素沉着障碍的细胞疗法。移植到皮肤中的角质细胞通过提供黑素细胞的附着和增殖必须的生长因子和如基底膜的组分的细胞间质促进黑素细胞附着于基底膜以及促进表皮的再生，导致产生更多的黑素细胞并增强了色素沉着。与黑素细胞一起移植到皮肤中的成纤维细胞通过提供如基底膜组分的细胞间质促进半桥粒(黑素细胞或角质细胞基底膜中的连接区域)的形成以及促进基底膜，从而增强了再着色的表皮和真皮之间的结合并提高了皮肤的机械强度。
根据优选的实施方案，黑素细胞、角质细胞和/或成纤维细胞从皮肤分离出，或从皮肤分离出并体外培养。
根据优选的实施方案，用作活性成分的混合细胞制剂包含黑素细胞和角质细胞。由黑素细胞和角质细胞组成的混合细胞制剂比由黑素细胞和成纤维细胞组成的混合细胞制剂更有效地诱导色素沉着。更优选，所述组合物的活性成分包括三种细胞类型，即黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞。
根据优选的实施方案，由本发明的组合物治疗的色素沉着障碍为色素沉着不足、花斑、白斑病、化学诱导的白斑病、白糠疹、痣色素脱失、炎症后的色素脱失或白斑，最优选白斑。
本发明的组合物中使用的黑素细胞的数目优选在1×103～1×107个细胞/cm2，更优选1×103～1×106个细胞/cm2，又更优选1×104～1×106个细胞/cm2，最优选1～5×105个细胞/cm2的范围内。本发明的组合物中使用的角质细胞的数目优选在1×104～1×108个细胞/cm2，更优选1×104～1×107个细胞/cm2，又更优选1×105～1×107个细胞/cm2，最优选大约1×106个细胞/cm2的范围内。在本发明的组合物中，黑素细胞和角质细胞数目的比率优选为1:1～1:1000，更优选为1:1～1:100，最优选为1:2～1:10。
本发明的组合物中使用的成纤维细胞的数目优选在1×103～1×107个细胞/cm2,更优选1×103～1×106个细胞/cm2，又更优选1×104～1×106个细胞/cm2，最优选大约1×105个细胞/cm2的范围内。在本发明的组合物中，黑素细胞和成纤维细胞数目的比率优选为1:1～1:1000，更优选为1:1～1:100，最优选为大约1:1。
用于本发明中的成纤维细胞不受限制且优选包含人正常成纤维细胞、用γ射线或丝裂霉素处理的有丝分裂无活性人成纤维细胞、动物正常成纤维细胞、用γ射线或丝裂霉素处理的有丝分裂无活性动物成纤维细胞或成纤维细胞细胞系(例如，Swiss3T3)。最优选地，用于本发明的成纤维细胞为人正常成纤维细胞。
本发明的药物组合物包含可药用载体以及混合细胞制剂。在药物制剂中通常使用，可药用载体包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯橡胶、磷酸钾、精氨酸酯(arginate)、明胶、硅酸钾、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。根据本发明的药物组合物可进一步包括润滑剂、湿润剂、增甜剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。适当的可药用载体和制剂的详细内容可在此处引入作为参考的Remington's PharmaceuticalSciences(19th ed.,1995)中找到。
根据本发明的药物组合物用于移植到皮肤中。本发明的药物组合物的适当的剂量可根据药物制剂方法、施用方法、患者年龄、体重、性别、致病状态、饮食、施用时间、施用途径、排泄率和对所用药物组合物的敏感性而变化。文中施用的术语“药学有效量”指的是对上述色素沉着障碍充分表现治疗效果的量。优选地，本发明的药物组合物可以每日剂量103～109个细胞施用。
根据本领域技术人员已知的常规技术，根据本发明的药物组合物可以用如上所述的可药用载体和/或媒介物制备，最终提供几种形式的单位剂量形式和多剂量形式。所述制剂的非限制性实例包括，但不限于，溶液、油或水介质中的悬浮剂或乳剂、提取物、酏剂、粉剂、颗粒、片剂和胶囊，并且可进一步包含分散剂或稳定剂。
本发明所述的药物组合物可制备成薄膜形式。例如，从正常皮肤组织分离的黑素细胞和角质细胞，或者黑素细胞和成纤维细胞在一张薄膜中共培养，然后将该薄膜纸用于患部。
所述药物组合物的制剂包括一种用于同时施用黑素细胞和角质细胞，或者黑素细胞和成纤维细胞的制剂，以及一种最终表现与同时施用效果相同的用于分开施用黑素细胞和角质细胞，或者黑素细胞和成纤维细胞的制剂。
本发明的细胞疗法组合物首次通过细胞疗法方案治疗色素沉着障碍。本发明的组合物包含黑素细胞和角质细胞的混合细胞制剂或者黑素细胞和成纤维细胞的混合细胞制剂作为活性成分使得其诱导非常有效的色素沉着以治疗与色素沉着不足相关的疾病，例如白斑。
本发明的另一方面提供了一种着色皮肤重建模型，所述着色皮肤重建模型包含(i)I型胶原和镶嵌在I型胶原中的成纤维细胞作为真皮替代物，(ii)涂敷在I型胶原上的IV型胶原和层粘连蛋白，和(iii)接种和培养在IV型胶原和层粘连蛋白上的角质细胞和黑素细胞。
本发明的着色皮肤重建模型用于代替动物模型。
在所述着色皮肤重建模型中，作为真皮替代物的I型胶原在最低部分存在。在制备真皮替代物层时，涉及成纤维细胞。用于本发明的成纤维细胞不受限制并且优选包含人正常成纤维细胞、用γ射线或丝裂霉素处理的有丝分裂无活性人成纤维细胞、动物正常成纤维细胞、用γ射线或丝裂霉素处理的有丝分裂无活性动物成纤维细胞或成纤维细胞细胞系(例如，Swiss3T3)。最优选地，用于本发明的成纤维细胞为人正常成纤维细胞。接种的成纤维细胞的数目通常在1×103～1×107个细胞/ml，优选1×104～1×106个细胞/ml，最优选大约1.5×105个细胞/ml的范围内。
用IV型胶原和层粘连蛋白(基底膜组分)涂敷I型胶原以增强黑素细胞和角质细胞的附着。
黑素细胞和角质细胞位于涂敷有IV型胶原和层粘连蛋白的真皮替代物上。在真皮替代物上接种黑素细胞和角质细胞并培养。黑素细胞和角质细胞的培养可在如下取决于暴露于空气的三个条件之一进行，即：风干条件、半干条件和浸没条件。
文中使用的术语“风干条件”指的是将角质细胞层接种在I型胶原凝胶基质，即表皮完全暴露于空气中的条件(参见图10，A部)。
文中使用的术语“半干条件”指的是将角质细胞层接种在I型胶原凝胶基质，即表皮尽可能少的被基质覆盖的条件(参见图10，B部)。在这个条件下，影响角质细胞层的因素通过基质和空气起作用。
文中使用的术语“浸没条件”指的是将角质细胞层接种在I型胶原凝胶基质，即表皮尽可能完全被基质覆盖的条件(参见图10，C部)。在这个条件下，影响角质细胞层的因素仅通过基质起作用。
接种的角质细胞和黑素细胞的培养根据两个步骤进行。第一培养步骤(用于涂敷有角质细胞的I型胶原层的培养)在浸没条件下进行。用于第一培养步骤的时间周期优选为3～10天，最优选为7天。第二培养步骤在风干条件下进行，并且时间周期优选为8～20天，最优选为14天。
接种的角质细胞的数目通常在1×103～1×107个细胞/cm2，优选1×104～1×106个细胞/cm2，最优选大约3×105个细胞/cm2的范围内。接种的黑素细胞的数目通常在1×102～1×106个细胞/cm2，优选1×103～1×105个细胞/cm2，最优选大约3×104个细胞/cm2的范围内。在皮肤重建模型中，黑素细胞和角质细胞的数目的比率优选为1:1～1:1000，更优选为1:1～1:100，最优选为1:2～1:10。
在真皮替代物中培养的角质细胞和黑素细胞中，在最外部角质细胞形成表皮并且黑素细胞位于具有基底膜组分的相对低的部分。在皮肤重建模型中的黑素细胞产生黑色素并形成向角质细胞迁移的黑色素单元，从而成功地重建着色皮肤。
本发明的重建模型作为用于验证和研究黑素细胞的黑素生成、黑色素向角质细胞的送递、黑素细胞和角质细胞的相互作用和化妆品(例如，皮肤变白化妆品)的效果的模型非常有用。另外，所述重建模型可作为用于皮肤光老化/光损伤的临床前和动物实验的替代模型。
附图说明
图1a-1c表示从正常人皮肤组织分离出的黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞的免疫组织化学染色结果。
图2为说明根据分离的黑素细胞的数目黑色素的量的变化的曲线图。
图3为说明根据分离的黑素细胞的数目酪氨酸酶的活性变化的曲线图。
图4为表示将黑素细胞、黑素细胞和角质细胞、或者黑素细胞和成纤维细胞移植到裸鼠的结果的照片。M:黑素细胞，K:角质细胞以及F:成纤维细胞。
图5为表示将黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞的混合悬浮液移植到裸鼠2周后皮肤颜色变化的照片。混合的细胞悬浮液包含5×105个细胞/cm2的黑素细胞，1×106个细胞/cm2的角质细胞和1×106个细胞/cm2的成纤维细胞。
图6为表示将黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞的混合悬浮液移植到裸鼠后1周苏木精和伊红(H&E)染色结果的照片。M:黑素细胞，K:角质细胞和F:成纤维细胞。黑素细胞大部分在真皮中发现并显示迁移到基底层。
图7为表示将黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞的混合悬浮液移植到裸鼠后2周的苏木精和伊红(H&E)染色结果的照片。M:黑素细胞，K:角质细胞以及F:成纤维细胞。图中显示，黑素细胞移动到基底层，沿基底层移动到旁边并全部分布在操作码部分。
图8表示当黑素细胞和角质细胞共培养时，黑色素被送递到角质细胞。
图9表示体外着色皮肤重建的结果。
图10表示用于体外着色皮肤重建的黑素细胞和角质细胞的培养方法。最底层为真皮替代物，封闭框表示基质的高度以及钉子形状表示黑素细胞和角质细胞。
具体实施方式
本发明将通过实施例进一步详细说明。这些实施例用于更具体地说明，并且所附权利要求中阐明的本发明的范围不限于实施例或被实施例所限制，这对本领域技术人员是显而易见的。
实施例
实施例1:黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞的分离与培养
从正常人皮肤组织分离出的黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞并对其进行培养。
实施例1-1：黑素细胞的分离与培养
将皮肤组织用含有50μg/ml抗生素(庆大霉素，Gibco)的磷酸盐缓冲溶液(WelGENE)洗涤8次以除去凝固的血液和污染物。将皮肤组织真皮中的脂肪层除去，并将所述组织切成5mm大小，将切开的组织于4℃下用1mg/ml分散酶(Roche)孵育16小时。然后，从皮肤组织分离出表皮，用磷酸盐缓冲溶液洗涤表皮并于37℃下用胰蛋白酶-EDTA溶液(0.05%胰蛋白酶-0.53mM EDTA·4Na，Gibco)孵育30分钟。将包含表皮的胰蛋白酶-EDTA溶液进行数次吸液用于从表皮分离细胞(黑素细胞和角质细胞)。
在包含分离的黑素细胞和角质细胞的胰蛋白酶-EDTA溶液中加入作为黑素细胞培养基的MGM-3(Cambrex)并将生成物转移到50ml试管中，接着于300×g下离心。弃去上清液后，加入黑素细胞培养基以均质化分离的细胞并将均质化溶液(包含107个细胞)等分到100mm培养皿中。于37℃下在CO2培养箱中进行细胞培养并隔日更换培养基。一旦培养物汇合，将黑素细胞培养基弃去并将培养皿用磷酸盐缓冲溶液洗涤一次。将1.5ml的胰蛋白酶-EDTA溶液与所述培养皿孵育5分钟，并通过用胰蛋白酶消化使黑素细胞比角质细胞自培养皿分离更快的事实自培养的表皮细胞收获黑素细胞。将包含收集的黑素细胞的培养基于300×g离心并弃去上清液。然后，使用黑素细胞培养基均质化悬浮黑素细胞并将其等分试样(3×105个细胞)转移到100mm培养皿中用于传代培养。通过使用针对黑素细胞的标记物HMB-45的抗体证实培养的细胞为黑素细胞。
实施例1-2：角质细胞的分离与培养
将皮肤组织用含有50μg/ml抗生素(庆大霉素，Gibco)的磷酸盐缓冲溶液(WelGENE)洗涤8次以除去凝固的血液和污染物。将皮肤组织真皮中的脂肪层除去，并将所述组织切成5mm大小，将切开的组织用采用磁力棒物理刺激的10ml的胰蛋白酶溶液(0.125%胰蛋白酶:versene=1:1,Gibco)于室温下孵育45分钟以分离角质细胞。向包含分离的细胞的胰蛋白酶溶液中，加入0.1mg/ml的胰蛋白酶抑制剂(Gibco)并转移到50ml试管中，接着300×g离心。除去上清液后，加入作为角质细胞培养基的KGM(Cambrex)以均质化分离的细胞并将均质化溶液(包含3×105个细胞)等分到100mm培养皿中。于37℃下在CO2培养箱中进行细胞培养并隔日更换培养基。一旦培养物汇合，将角质细胞培养基弃去并将培养皿用磷酸盐缓冲溶液洗涤一次。将1.5ml的胰蛋白酶-EDTA溶液与所述培养皿孵育10分钟，并收获角质细胞。将含有收集的角质细胞的培养基于300×g离心并弃去上清液。然后，使用角质细胞培养基均质化悬浮角质细胞并将其等分试样(3×105个细胞)转移到100mm培养皿中用于传代培养。通过使用针对角质细胞的标记物全细胞角蛋白(pan-cytokeratin)的抗体证实培养的细胞为角质细胞。
实施例1-3:成纤维细胞的分离与培养
将皮肤组织用含有50μg/ml抗生素(庆大霉素，Gibco)的磷酸盐缓冲溶液(WelGENE)洗涤8次以除去凝固的血液和污染物。将所述组织切成5mm大小，将切开的组织于4℃下用1mg/ml分散酶(Roche)孵育16小时。然后，自皮肤组织分离表皮，用磷酸盐缓冲溶液洗涤真皮并于37℃下用1mg/ml胶原酶(Roche)孵育2小时。向包含分离的成纤维细胞的胶原酶溶液中，加入作为成纤维细胞培养基的FGM(Cambrex)并转移到50ml试管中，接着300×g离心。除去上清液后，加入成纤维细胞培养基以均质化分离的细胞并将均质化溶液(包含1×105个细胞)等分到100mm培养皿中。于37℃下在CO2培养箱中进行细胞培养并每三天更换培养基。一旦培养物汇合，将黑素细胞培养基弃去并将培养皿用磷酸盐缓冲溶液洗涤一次。将1.5ml的胰蛋白酶-EDTA溶液与所述培养皿孵育10分钟，并收获成纤维细胞。将含有收集的成纤维细胞的培养基于300×g离心并弃去上清液。然后，使用成纤维细胞培养基均质化悬浮成纤维细胞并将其等分试样(1×105个细胞)转移到100mm培养皿中用于传代培养。通过使用成纤维细胞的标记物波形蛋白证实培养的细胞为成纤维细胞。
实施例1-4:免疫组织化学染色
将包含在培养皿中的细胞用胰蛋白酶消化以收集各类型的细胞并在1ml用于各细胞类型的培养基中悬浮。将细胞悬浮液等分到包含盖玻片的24-多孔培养皿并于37℃下在5%CO2培养箱中培养24小时，使细胞附着在盖玻片上：黑素细胞，2×104个细胞/孔；角质细胞，1×104个细胞/孔；以及成纤维细胞1×104个细胞/孔。除去培养基并用1ml磷酸盐缓冲溶液(WelGENE)洗涤各孔，然后加入1ml的-20℃的甲醇以在4℃下进行固定20分钟。弃去甲醇后，将培养皿用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次并于室温下将1ml磷酸盐缓冲溶液中的0.2%Triton X-100(USB)与各孔细胞孵育10分钟，接着除去0.2%Triton X-100并用磷酸盐缓冲溶液洗涤两次。室温下用1ml磷酸盐缓冲溶液中的20%正常山羊血清(Sigma)孵育各孔1小时以阻断非特异性结合。将针对细胞类型的各标记物的小鼠-抗-人抗体在20%的山羊血清中稀释到1:50并将100μl抗体的等分试样滴加到薄石蜡膜上：黑素细胞，HMB-45抗体(DAKO)；角质细胞，全细胞角蛋白抗体(DAKO)；以及成纤维细胞，波形蛋白抗体(DAKO)。从培养皿中小心取出盖玻片并将其附着有细胞的平面接触稀释的抗体溶液。室温下孵育1小时后，将上平面具有附着细胞的盖玻片小心转移到培养皿中并用1ml磷酸盐缓冲溶液洗涤各孔两次。将FITC-结合的山羊-抗-小鼠抗体(Vector)在磷酸盐缓冲溶液中稀释到1:100并将100μl抗体的等分试样滴加到薄石蜡膜上。从培养皿中小心取出盖玻片并将其具有附着细胞的平面与稀释的抗体溶液接触。于室温下孵育1小时后，将上平面具有附着细胞的盖玻片小心转移到培养皿中并用1ml磷酸盐缓冲溶液洗涤各孔两次。将用于染色核的DAPI(Sigma)在磷酸盐缓冲溶液中稀释到1:1000并向各孔中加入1ml稀释的DAPI溶液，接着室温下反应5分钟。用1ml蒸馏水洗涤各孔两次，并将50μl用于荧光染色的封片溶液(Vectashield,Vector)滴加到载玻片上。从培养皿中小心取出盖玻片并将其具有附着细胞的平面与封片溶液接触用于在荧光显微镜下观察。
如图1所示，分离的黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞分别用HMB45、全细胞角蛋白和波形蛋白抗体染色，这证明成功分离到黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞。
实施例2:分离的黑素细胞滴度的分析
为了展示实施例1中分离与培养的黑素细胞的滴度，测定了黑素细胞中黑色素的总量和涉及黑色素生物合成的酪氨酸酶的活性。
如下分析黑色素的总量：在培养皿中通过胰蛋白酶消化重新得到黑素细胞和角质细胞(阴性对照)。然后，在50ml试管中制备1×103个细胞、1×104个细胞、2.5×104个细胞、5×104个细胞、7.5×104个细胞和1×105个细胞的黑素细胞以及在50ml试管中制备1×105个细胞的角质细胞。将制备的细胞溶液300×g离心以除去上清液并向各细胞沉淀物中加入100μl的1N NaOH溶液以悬浮细胞。使用1N NaOH溶液制备黑色素(Sigma)的标准溶液：1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml。具有多种浓度的标准溶液和细胞制剂在60℃水浴中保持1小时用于洗脱黑色素。使用分光光度计测定450nm的吸光度以分析黑色素的总量。
如下分析酪氨酸酶的活性：在培养皿中通过胰蛋白酶消化重新得到黑素细胞并在黑素细胞培养基(MGM,Cambrex)中悬浮所述黑素细胞。将黑素细胞悬浮液的等分试样(2×103个细胞、5×103个细胞、1×104个细胞和2×104个细胞)转移到96-孔培养板并于37℃下在5%CO2培养箱中培养24小时。弃去培养基后，用200μl磷酸盐缓冲溶液洗涤各孔并向各孔中加入90μl的磷酸盐缓冲溶液中的1%Triton X-100(USB)。将培养板于-70℃下保持30分钟用于冷冻细胞，然后将细胞在室温下融化以破坏细胞膜，从而得到黑素细胞提取物。向包含黑素细胞提取物的各孔中加入10μl10mM的作为酪氨酸酶底物的L-DOPA(Sigma)并于37℃下孵育1小时。当L-DOPA通过黑素细胞提取物中的酪氨酸酶转化为褐色化合物时，使用分光光度计测定450nm的吸光度以分析黑素细胞中酪氨酸酶的活性。
如图2所示，随黑素细胞数目的增加，黑色素的量增加。此外，观察到作为阴性对照的人表皮角质细胞(HEK)没有黑色素。
图3说明随黑素细胞的数目增加，酪氨酸酶的活性增强。
实施例3:将黑素细胞移植到裸鼠
制备黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞悬浮液。将包含在实施例1中分离与培养的黑素细胞、角质细胞或成纤维细胞的培养皿除去培养基，用PBS洗涤并在37℃下用胰蛋白酶处理10分钟。当细胞自培养皿底部分离时，将其在DMEM培养基(Gibco)中悬浮并收集，接着300×g离心。弃去上清液后，向各细胞制剂中加入DMEM培养基以获得5×105个细胞/cm2的黑素细胞悬浮液，1×106个细胞/cm2的角质细胞悬浮液和1×106个细胞/cm2的成纤维细胞悬浮液。
6周龄BALB/c SI c-nu/nu雄性小鼠(Central Lab.Animal Inc.，韩国)适应1周，通过腹膜内注射氯胺酮和盐酸甲苯噻嗪的混合物进行麻醉，然后其用于除去表皮的背部用倍特明(betamine)和70%的乙醇消毒。使用小刀将裸鼠臀部区域除去大小为1×1cm2的表皮。除去表皮的区域接种15μl的DMEM作为阴性对照或15μl的细胞悬浮液作为实验组：实验组1，1×105个细胞/cm2的黑素细胞；实验组2，1×105个细胞/cm2的黑素细胞和1×106个细胞/cm2的角质细胞；实验组3，5×105个细胞/cm2的黑素细胞，1×106个细胞/cm2的角质细胞和1×106个细胞/cm2的成纤维细胞；以及实验组4，1×105个细胞/cm2的黑素细胞和1×106个细胞/cm2的成纤维细胞。由于伤口区域除去了角质层并且具有一些渗出物，细胞悬浮液仅在具有除去表皮的区域残留。角质细胞的移植用于促进黑素细胞的附着和表皮的再生，以及成纤维细胞的移植用于治疗真皮损伤并促进基底层细胞和半桥粒(表皮和基底层的连接区域)的形成。
使用灭菌硅纱布(silicon gauze)(Molnlycke Health Care AB)和Tegaderm(3M)敷药于移植区域。所述包含涂敷有软硅的聚酰胺基质的硅纱布在其孔中能够包含细胞悬浮液。稍微大于创伤区域的硅纱布附着在移植细胞悬浮液的皮肤表面，且其上平面由Tegaderm包围以保持创伤区域的湿润条件以及防止污染和干燥。每天向裸鼠腹膜内注射100μl的抗生素(5mg/ml头孢唑啉)两次，持续5天。移植后1周或2周，从移植区域除去敷药，并分析移植区域的污染、发炎、恢复和色素沉着。对裸鼠中新形成的皮肤组织进行活组织检查并使用10%福尔马林固定，接着用苏木精和伊红(H&E)染色。
如下进行H&E染色：将包埋在石蜡中的组织切片并附着在载玻片上，然后将载玻片在二甲苯中浸渍10分钟以除去组织周围的石蜡。然后，将载玻片用100%、90%、80%和70%的乙醇顺序洗涤10分钟以水合组织并用流水洗涤10分钟。将组织用苏木精(Autohematoxylin,ResGen)处理5分钟以使核染色，用水洗涤10分钟。然后，将组织用伊红(Sigma)处理1分钟以使细胞浆染色，用水洗涤10分钟。将组织用70%、80%、90%和100%的乙醇顺序处理2分钟用于脱水并用二甲苯处理10分钟。将载玻片上的组织用一滴封片剂(Shandon SyntheticMountant,Thermo)处理并装上盖玻片。
在所有实验组和对照中，没有观察到污染和发炎，几乎没有发现伤口收缩并保持了伤口的最初大小。认为在实施例中的伤口收缩比去除真皮的全层皮肤伤口中发现的伤口收缩少得多。
虽然裸鼠具有黑素细胞，但是其不产生黑色素。因此，在黑色素帮助下容易观察到移植的人黑素细胞。在所有实验组和对照中观察到皮肤组织正常再生。而且，与仅移植黑素细胞相比，当移植黑素细胞和角质细胞的混合细胞制剂时，在基底层发现非常大量的黑素细胞(图4)。令人惊奇地，当移植黑素细胞和成纤维细胞的混合细胞制剂时，在基底层和毛囊周围发现非常大量的黑素细胞(图4)。应该理解角质细胞向黑素细胞提供生长因子以及促进表皮再生，从而协助黑素细胞附着。基于所述结果，得到结论：黑素细胞和角质细胞的混合细胞制剂增强丧失表皮的皮肤的再着色作用。由于成纤维细胞促进基底层和半桥粒(表皮和基底层之间的连接区域)的形成，可以认识到其帮助黑素细胞附着到基底层。
移植2周后肉眼观察发现，由于移植的人黑素细胞，包含黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞的混合细胞群的移植诱导形成褐色的皮肤(图5)。作为苏木精和伊红染色的结果，虽然其显示具有再生的皮肤和分化良好的真皮，但是仅注射培养基的阴性对照显示没有黑素细胞。相反，在移植包含黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞的混合细胞群的实验组3中，移植1周后主要在真皮中发现移植的黑素细胞，并且产生轴突以将黑色素递送到角质层(图6)。移植2周后，位于真皮的黑素细胞迁移到基底层以在整个基底层表现均匀分布并活跃地将黑色素递送到角质细胞(图7)。这些结果表明真皮中存在的黑素细胞随时间向上移动到基底层，沿基底膜迁移以在整个基底层分布并通过黑素细胞的轴突将黑色素递送到周围的角质细胞的连续的再着色过程。这种与再着色作用相关的结构与人皮肤中发现的黑色素单元相同，表明移植到小鼠的黑素细胞导致如正常人皮肤的着色皮肤的形成。
因此，可以理解来自具有如白斑的色素沉着障碍的患者的正常皮肤的黑素细胞被分离和在体外培养，与如角质细胞和成纤维细胞的其他皮肤细胞混合以获得混合的细胞悬浮液，然后将其施用到患部，再着色作用是有效的。在实施例中的动物模型被认为是用于证实黑素生成、黑素细胞和角质细胞的相互作用或皮肤变白或UV阻断化妆品的效果的临床前模型。
实施例4：着色皮肤的重建
皮肤上皮细胞分化的主要原因是钙和风干条件。通过在由胶原和成纤维细胞组成的真皮上培养上皮细胞而进行三维培养。在空气层和水层之间的界面培养上皮细胞以分化为角化复层扁平上皮，以及黑素细胞在基底层产生黑色素并将黑色素递送到角质细胞，从而形成黑色素单元以给予包含与人皮肤相似的黑素细胞的皮肤结构。
制备胶原混合物作为真皮替代物。通过以8:1:1的比率混合I型胶原(Nitta)、10×E-培养基(包含DMEM:F12=3:1)和重建缓冲液(100ml的0.05N NaOH溶液中含有2.2g NaHCO3和4.77g HEPES)制备胶原混合物。在4℃下进行真皮替代物的制备以防止胶原的凝胶化。在24-孔板中制备0.6cm2的插入式细胞培养皿(Millicell)(Millipore,Inc)。从培养皿中重新得到成纤维细胞并以1.5×105个细胞/ml的浓度在胶原混合物中悬浮。在这个步骤，首先将成纤维细胞在培养基中悬浮，调整培养基的体积不超过胶原混合物的培养基体积的10%，然后在胶原混合物中悬浮。将200μl胶原混合物倒入插入式细胞培养皿中然后使胶原混合物在37℃培养箱中固化30分钟～1小时。向胶原混合物中加入200μl的E-培养基(包含DMEM:F12=3:1)并向插入式细胞培养皿的外部加入培养基以使插入式细胞培养皿的内部和外部具有相同的培养基高度。培养24小时后，用IV型胶原和层粘连蛋白涂敷真皮替代物的上部以促进黑素细胞和角质细胞的附着。使用20μl的0.2mg/ml胶原和30μg/ml层粘连蛋白的混合溶液在37℃下进行涂敷1小时。
然后，将角质细胞和黑素细胞用胰蛋白酶消化以从培养皿重新得到并以1:10的比率混合，接着将其分别以3×105个细胞/cm2和3×104个细胞/cm2的浓度同时接种到涂敷的胶原真皮上。在4小时内将角质细胞和黑素细胞附着到真皮替代物的上部。每两天或每三天更换培养基并进行培养7天。当角质细胞和黑素细胞在真皮替代物的上部均匀生长时，为了在水和空气之间的界面培养表皮，除去表皮上的培养基，并向插入式细胞培养皿的外部加入培养基，在风干条件下培养14天。
如图8和9所示，在风干培养14天后，接种角质细胞和黑素细胞均导致在皮肤重建模型中形成用黑色素着色的皮肤。然而，在仅使用角质细胞的皮肤重建模型中，没有观察到这种色素沉着作用。而且，当将皮肤重建模型进行切片和染色时，发现角质细胞分化以形成如人皮肤的角质化皮肤并且附着在角质化皮肤的基底层的黑素细胞产生并向分化的角质细胞递送黑色素。
观察到位于基底层的黑素细胞和产生并向角质细胞层递送黑色素的黑色素单元。因此，这些结果促使我们推论可以在体外构建包含黑素细胞的人皮肤样结构并替换动物模型。
如上文所述，本发明提供一种用于色素沉着障碍的细胞疗法的药物组合物。此外，本发明提供一种着色皮肤重建模型。本发明的组合物首次用于通过细胞疗法方案治疗色素沉着障碍。本发明的组合物包含黑素细胞和角质细胞的混合细胞制剂或黑素细胞和成纤维细胞的混合细胞制剂作为活性成分使得其可非常有效地诱导色素沉着以治疗如白斑的与色素沉着不足相关的疾病。
描述了本发明的优选的实施方案，应该理解落入本发明的实质的变化和改变对本领域技术人员是显而易见的，并且本发明的范围由所附权利要求及其等同物确定。

Claims (4)

1.一种细胞混合物在制备用于色素沉着障碍的细胞疗法的药物组合物中的用途，其中，所述细胞混合物包含黑素细胞、角质细胞和成纤维细胞，其中，黑素细胞的数目为1×103～1×107个细胞/cm2，角质细胞的数目为1×104～1×108个细胞/cm2，以及成纤维细胞的数目为1×103～1×107个细胞/cm2。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述黑素细胞、角质细胞和/或成纤维细胞从皮肤分离出，或者从皮肤分离出并在体外培养。
3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述色素沉着障碍为色素沉着不足、花斑、白斑病、化学诱导的白斑病、白糠疹、痣色素脱失、炎症后的色素脱失或白斑。
4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述黑素细胞的数目为1×103～1×106个细胞/cm2，以及角质细胞的数目为1×104～1×107个细胞/cm2，以及成纤维细胞的数目为1×103～1×106个细胞/cm2。
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