KR102426746B1 - 모낭 줄기 세포의 3d 오가노이드 시스템을 이용하여 모발을 재생시키기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents

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Abstract

영양공급 세포 또는 세포주를 사용하여 모낭 줄기 세포 3D 오가노이드를 생성하는 시스템 및 방법으로서, 상기 영양공급 세포 또는 세포주는 진피 내피 세포, 섬유 아세포, 또는 표적 세포와 유사하거나 또는 표적 세포의 유형과 동일한 세포주이다. 본 시스템 및 방법은 장기간 지속 가능한 3D 세포 또는 조직 배양 환경 뿐만 아니라 신속한 배양 및 모발 손실에 대한 치료를 제공한다.

Description

모낭 줄기 세포의 3D 오가노이드 시스템을 이용하여 모발을 재생시키기 위한 방법 및 시스템
모낭은 상피 줄기 세포 및 멜라닌세포 줄기 세포를 함유한 벌지(bulge)를 포함하는 성체 줄기 세포에 대해 잘-특성화된 니치(niche)를 함유하는 것으로 알려져 있다. 모발 벌지내의 줄기 세포는 모낭간 표피, 모낭 구조 및 피지선을 생성할 수 있다. 벌지 상피 줄기 세포는 또한 인공 생체 내 시스템에서 새로운 모낭으로 재구성될 수 있다. 대머리 두피에 모낭 줄기 세포를 이식하는 것은 모발 밀도를 증가시키고 새로운 모낭 형성을 촉진한다는 것으로 알려져 있다(Stem Ceel Investig. 2017, 4:58.). 그러나, 이식된 줄기 세포의 양은 물리적 분리를 통해 환자로부터 얻은 양으로 제한되기 때문에 이식의 결과는 다소 제한적이었다. 이러한 이식의 효과를 높이기 위해, 상기 줄기 세포를 시험관 내에서 특히 3D로 배양하게 하는 방법 및 시스템. 또한, 줄기 세포를 이식한 후에, 줄기 세포의 양호한 정착을 위한 심어진 두피 조건을 조정하는 것은 이러한 치료의 효율성을 도울 수 있다.
3D 배양 기술은 암 연구, 신약 발굴, 신경과학 및 재생의학을 비롯한 수많은 응용분야를 위한 보다 예측적인 시험관내 세포 모델의 창출을 이끌었다. 세포는 자연적으로는 3차원 환경에서 성장하고 분화한다. 세포는 이의 자연 환경 안에서 세포외 기질 단백질(ECM) 및 다른 세포와 지속적으로 상호작용하여 세포 이동, 세포사멸 또는 수용체 발현과 같은 복잡한 생물학적 기능을 조절한다. 이러한 상호 작용의 대부분은 전통적인 2D 세포 배양에서는 손실되거나 크게 감소된다. 진보된 3D 세포 시스템은 연구자들이 고전적인 2D 세포 배양과 생체내 동물 모델 사이의 간극을 메울 수 있게 하였다. 최근에는, 종양 스페로이드(spheroid), 줄기세포 오가노이드(organoid) 및 3D 바이오프린팅을 통한 조직 공학과 같은 진보된 3D 세포 배양 방법을 사용하여 실제 생체내 세포 반응을 보다 면밀한 모델링을 구현하였다. 자연 환경을 정확하게 복제하도록 3D 세포 배양 모델을 향상시킴으로써 보다 의미 있는 과학적 결과를 제공하고 궁극적으로 인간의 건강을 향상시킬 수 있을 것이다. 3D 세포 배양 모델은 2가지 주요 범주: 1) 동물 유래/합성 하이드로 겔 또는 구조적 3D 스캐폴드를 사용하는 스캐폴드 기반 방법 및 2) 스페로이드라 명명되는 자유롭게 부유하는 세포 응집체를 사용하는 무-스캐폴드(scaffold-free) 방법으로 나뉠 수 있다.
기존의 3D 방법은 제한 없이, 확장성, 재현성, 감도 및 고처리량 스크리닝(HTS) 기기와의 호환성을 포함하고 있지 않다. 3D 세포 모델을 성장시키는 것은 단기 임상 시험 용도로서 활용하기까지 오랜 시간이 걸린다. 또한, 3D 세포 모델을 장기간 동안 시험관내에서 유지시키는 것은 어려운 일이다. 따라서, 3D 세포 배양을 위한 새로운 방법과 시스템이 필요하다. 단기간에 배양될 수 있는 3D 세포 모델은 환자 특이적 의학치료에 사용될 수 있으며 신약 발굴의 효율성을 향상시킬 수 있다.
본 개시에 개시된 실시형태는 기존의 3D 배양 방법 및 시스템에 대한 하나 이상의 문제점을 극복하는 것에 관한 것이고 본 발명을 설명하고 있다. 본 발명의 범위는 개시된 실시형태로 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시형태는 3차원 구조 또는 3차원 구조의 세포 덩어리(mass), 예를 들어 오가노이드로 성장될 모낭 줄기 세포의 빠른 성장을 지지하는 2차 세포주를 사용하여 3D 세포 덩어리를 효율적이고 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이며, 이러한 오가노이드는 본원에서 임의의 3D 세포 덩어리 또는 통상적인 오가노이드 및 스페로이드뿐만 아니라 조직을 포함하는 3D 세포 모델로서 정의된다. 이러한 3D 세포 모델은 종래의 2차원 세포 구조에 비해 많은 이점을 갖는다. 예를 들어, 3D 오가노이드는 실제 생물학적 기관 또는 조직과 생리학적으로 더 유사하며 신약 발굴 또는 스크린 또는 세포 치료법 등과 같은 의학치료에 사용될 수 있다. 3D 오가노이드는 어려운 임상 문제를 연구하기 위한 미세 생리학적 시스템 또는 장기칩(organs-on-chips)의 생성 및 잠재적 치료법의 개발을 위해 사용할 수 있다. 이러한 인간 대용물들은 튼튼하고 사용이 용이하고 비용이 저렴하고 대사작용과 기능적 반응을 측정할 수 있게 하는 무펌프 자체 완비된 시스템(pumpless self-contained system)을 사용한다.
특히, 하나의 실시형태는 영양공급 세포(feeder cell)를 사용함으로써 배양된 환자 유래 모낭 줄기 세포를 사용하여 모낭 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 여기서, 배지 내의 영양공급 세포는 영양공급 세포 배지가 모낭 줄기 세포용 배지로부터 분리되는 방식으로 제공될 수 있다. 다양한 성장 인자를 갖는 배지가 영양공급 세포 배지 및 모낭 줄기 세포 배지의 상부에 공급될 수 있다. 그 결과로 생성된 배양층이 항온 배양된다.
영양공급 세포(feeder cell)는 진피 내피 세포 또는 섬유 아세포, 바람직하게는 환자의 진피 내피 세포일 수 있다. 두피 조직은 환자로부터 분리될 수 있다. 단일 세포 단리 방법을 사용하여 진피 내피 세포 및 모낭 줄기 세포를 두피 조직으로부터 얻을 수 있다. 진피 내피 세포를 영양공급 세포로서 사용하기 전에, 진피 내피 세포는 3d 배양과 같은 그의 개체군을 확장시키기 위해 추가로 배양될 수 있다.
또 다른 실시형태는, 환자로부터 모낭 줄기 세포를 갖는 제 1 배지를 준비하고, 환자로부터 진피 내피 세포를 갖는 제 2 배지를 준비하고, 제 1 배지 및 제 2 배지를 성장 기질에 배치하고, 제 1 배지 및 제 2 배지를 덮도록 성장 기질 위에 조정 배지를 배치하여 배양 플레이팅(culture plating)을 야기시키고, 배양 플레이팅을 항온 배양하여 3D 오가노이드를 성장시키고, 배양된 모낭 줄기 세포를 수거하는 것에 의해, 모낭 줄기 세포의 3D 오가노이드를 성장시키는 방법을 제공한다.
다른 실시형태는, 환자의 피부에 환자로부터 유래된 모낭 줄기 세포를 주입함으로써 환자의 모발 성장을 촉진시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 모낭 줄기 세포는 환자로부터의 모낭 줄기 및 진피 내피 세포를 포함하는 배양층으로부터 수거하고, 상기 진피 내피 세포는 영양공급 세포이다. 모발 성장을 향상시키기 위해, 진피 내피 세포는 모낭 줄기 세포와 함께 주입될 수 있다.
표적 세포는 분리 가능한 기질 플레이트상에 배치되므로 표적 세포를 갖는 기질 플레이트는 다른 배양층으로 옮겨질 수 있다. 이러한 방식으로, 배양된 표적 세포는 플래시(flash) 제2 세포 또는 세포주를 갖는 새로운 층에 노출될 수 있다. 표적 세포는 장기 조직 또는 피부 조직과 같은 인체의 임의의 부분에서 유래된 임의의 세포일 수 있지만, 암 세포와 같은 외래 세포 유래의 것일 수 있다.
배양 기질은 유리 바닥 접시로서, 접시 바닥의 일부분은 유리 바닥 접시로부터 탈착될 수 있는 유리 플레이트를 갖는다. 예를 들어, 유리 플레이트를 들어올려서 표적 세포를 함유하는 배지 위의 마트리겔 혼합물의 일부분을 편리하게 꺼내어 다른 유리 바닥 접시로 이전시켜 신선한 영양공급 세포(feeder cell)를 제공할 수 있다. 유리 플레이트 및 유리 바닥 접시용 재료는 필요에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 플라스틱 재료가 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시형태의 실례이다.
도 2a는 본 발명에 따른 실시형태의 실례의 측면도이고, 도 2b는 탈착식(removable) 플레이트를 갖는 실시형태의 다른 측면도이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시형태를 이용하는 예시적인 흐름도이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시형태를 이용하는 예시적인 흐름도이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시형태를 이용하는 예시적인 흐름도이다.
도 6은 본 발명에 따른 실시형태를 이용하는 예시적인 흐름도이다.
도 7은 모발 줄기 세포 및 진피 내피 세포를 모발 조직으로부터 단리하는 것을 보여주는 예시도이다.
도 8은 진피 내피 세포를 영양공급 세포로서 사용하여 단리된 모낭 줄기 세포의 3D 오가노이드를 성장시키는 배양 시스템을 보여주는 공정의 예시이다.
도 9는 모발 재생을 위한 배양된 모낭 줄기 세포의 이식의 예시도이다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 배양 시스템을 나타낸다. 환자의 암 세포와 같은 표적 세포를 환자로부터 얻어서 작은 조각으로 분리한다. 분리한 세포(210)를 미세유체 배지와 같은 조정 배지 및 마트리겔에 배치한다. 혼합물(200)을 유리 바닥 접시(100)에 놓고 항온배양하여 접시에서 혼합물을 고형화시킨다. 조정 배지 및 마트리겔 중의 영양공급 세포 또는 세포주(310)는 동일한 접시에 제공되지만 영양공급 세포 또는 세포주 혼합물(300)이 표적 세포 혼합물(200)로부터 분리되는 방식으로 배치될 수 있다. 영양공급 세포 또는 세포주는 환자 유래의 것일 필요는 없으며 제3자 유래의 것일 수도 있다. 분리는 영양공급 혼합물로 인한 어떠한 세포 오염도 없이 배양된 표적 세포를 수거할 수 있게 한다.
영양공급 세포 또는 세포주는 표적 세포의 성장을 촉진시키기 위한 것이지 자체 성장을 위한 것이 아니다. 영양공급 세포 또는 세포주는 바람직하게는 내피세포 또는 섬유아세포이다. 보다 바람직하게는, 내피세포는 인간 진피 미세혈관 내피세포이다. 보다 더 바람직하게는, 영양공급 세포 또는 세포주는 표적 세포가 얻어지는 장기와 유사하거나 동일한 장기의 내피세포 또는 섬유아세포이다.
배양층은 조정 배지 및 마트리겔 중에서 유사하게 제조되는 제2 영양공급 세포 또는 세포주(410)를 가질 수 있다. 제2 영양공급 세포 또는 세포주 혼합물(400)도 혼합물(400)이 표적 세포 또는 세포주 혼합물로부터 분리되는 방식으로 배치될 수 있다. 제2 영양공급 세포 또는 세포주는 접시에 배치될 수 있다. 제2 영양공급 세포 또는 세포주는 바람직하게는 표적 세포와 유사하거나 동일한 세포 또는 세포주인 세포 또는 세포주이다. 표적 세포 혼합물층이 영양공급 세포층으로부터 분리되어 있기 때문에, 배양된 표적 세포는 영양공급 세포층으로 인한 어떠한 오염도 없이 수거될 수 있다.
선택적으로, 혼합물(200)은 별도의 탈착식 플레이트(500)에 배치되며, 이는 혼합물층을 접시에서 꺼내어 또 다른 접시로 이전시켜 추가적인 영양공급 세포 또는 영양소를 제공할 수 있게 한다.
표적 세포 및 영양공급 세포 혼합물을 접시에 배치한 후, 조정 배지를 접시에 충전시킬 수 있다.
조정 배지는 다양한 배지들로부터 선택될 수 있다. 많은 세포 배양 배지 제제가 문헌에 기재되어 있으며 다수의 배지가 시판되고 있다. 일단 배양 배지를 세포와 함께 항온배양하면, 그것은 "폐배지(spent medium)" 또는 "조정 배지(conditioned medium)"로서 당업자에게 알려져 있다. 조정 배지는 배지의 많은 본래 성분들뿐만 아니라, 예를 들어 생물학적 활성 성장인자, 염증 매개인자 및 기타 세포외 단백질을 비롯한 다양한 세포 대사산물 및 분비형 단백질을 함유한다.
배양된 표적 세포가 영양공급 세포 유래의 외래 세포로부터 분리될 필요가 없는 경우, 영양공급 세포 또는 세포주 혼합물(610)은 도 3에 예시된 배양층(600)과 같이 조정 배지(630) 중에서 표적 세포 혼합물(620)과 혼합될 수 있다.
도 4는 3D 배양을 위한 예시적인 프로토콜 및 배양된 세포의 사용을 나타낸다. 환자의 조직을 단일 세포 단리를 위해 해리한다. 단일 세포를 플라스크에 씨딩(seeding)하고, 부착된 플라스크를 37℃에서 15분 동안 항온배양하여 종양 섬유아세포를 제거한다. 이 단계 후, 암 마커 선별을 위해 부유 세포를 MACS® 기술(https://www.miltenyibiotec.com/DK-en/products/macs-cell-separation.html)을 통해 수거한다. 조정 배지에서 선별된 암 세포를 마트리겔과 혼합한다. 실험의 확장 및 대규모를 위해, 마트리겔 혼합물을 상기 설명한 바와 같이 영양공급 세포를 갖는 유리 바닥 접시에 플레이팅한다. 약물 스크리닝을 위해 1×104개의 암 세포 및 영양공급 세포를 갖는 마트리겔 혼합물을 96웰에 플레이팅한다. 이어서, 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 고형화시킬 수 있고, 조정 배지를 고형화된 혼합물의 상부에 첨가한다.
본 발명의 3D 배양 방법 및 시스템은 조직을 배양하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 5는 조직의 3D 배양을 위한 방법을 나타낸다. 환자의 암 조직을 절단하여 조직 샘플을 얻는다. 조직 샘플을 마트리겔에 배치할 수 있고 이의 혼합물을 37℃에서 45분 동안 고형화시킬 수 있다. 이어서, 마트리겔과 혼합된 영양공급 세포를 3D 배양을 위해 본원에서 설명한 바와 같이 배치한다. 배양된 조직은 약물 스크리닝 또는 민감성 검사, 또는 다른 검사 또는 사용을 위한 세포 수거를 위해 사용될 수 있다
본 발명의 일 실시형태는 환자에게 직접 이식하기 위한 세포 또는 조직을 배양하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 6은 모낭 줄기세포 및 진피 내피세포를 배양하여 이를 환자의 피부에 이식하기 위한 예시적인 프로토콜을 나타낸다. 이 경우에, 표적 세포 및 영양공급 세포는 배양된 세포가 이식될 예정인 환자로부터 얻을 수 있다. 환자로부터 모발 조직 샘플을 얻고, 모발 조직 샘플을 단일 세포 단리 과정에 적용하고 MACS와 같은 세포 분리 기술을 사용하여 모낭 줄기세포 및 진피 내피세포를 각각 수거한다. 진피 내피세포를 배양하여 세포 덩어리를 증가시키는데, 이는 모낭 줄기세포 배양을 위한 영양공급원으로서 사용될 뿐만 아니라, 환자에서 모발을 재성장시키기 위해 배양된 모낭 줄기세포와 함께 환자에게 이식될 수 있다.
도 7은 모발 조직(700)이 피부 생체 검사를 통해 환자로부터 얻어진다는 것을 예시한다. 모낭 줄기 세포 및 진피 내피 세포는 당업계에 공지된 단일 세포 단리 기술을 이용하여 조직으로부터 단리된다.
도 8은 진피 내피 세포를 영양공급 세포로 사용하여 단리된 모낭 줄기 세포의 3D 오가노이드를 성장시키는 배양 시스템을 보여주는 공정의 예시도이다.
도 9는 모발 재생을 위한 배양된 모낭 줄기 세포의 이식의 예시도이다.
3D 배양으로 성장시킨 다양한 줄기세포 콜로니는 줄기세포 치료, 신약 발굴, 약물 민감성 검사 및 기타 줄기세포 과학에서 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 3D 배양 방법 및 시스템은 종래의 방법 및 시스템보다 짧은 시간 내에 줄기세포 콜로니 또는 조직을 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 암은 대개 빠른 속도로 성장하므로 암 환자는 신속한 약물 스크린 또는 세포 치료법을 필요로 하기 때문에, 그 속도는 본 방법 및 시스템을 환자-특이적 약제로서 활용하는 데 특히 중요하다.
또한, 본 발명에 따른 3차원 배양 시스템 및 방법은 배양된 세포 또는 조직을 장시간 동안 유지시킨다. 필요하다면, 배양된 세포는 수개월 또는 심지어 더 오래 생존할 수 있다. 이것은 신약 발굴 또는 검사를 위해 매우 중요한 특징이다.
하기 실시예는 단지 설명하기 위한 것이다. 본 발명의 범위는 이러한 실시예로 한정되지 않아야 한다.
실시예 1. 모낭 줄기 세포의 단리
a. 피부 생체 검사 전에 리도카인 크라임(crime)으로 피부를 마취한다.
b. 펀치 생체 검사(1cm 직경)에 의해 진피를 포함하는 마우스 또는 인간의 피부를 수집한다.
c. 세정 배지가 충전된 50ml 원추형 튜브에 피부 조직을 넣는다.
d. 1% FBS를 갖는 높은 글루코스 DMEM.
e. 피부 조직을 접시에 옮긴다.
f. 피부 조직을 가위로 가능한 한 작게 세절하고 그것을 해리 용액에 넣는다.
g. 해리 용액: HBSS 중의 콜라게나제 II형 /DNase I
h. 세절된 종양 조직을 37℃에서 1 시간 동안 항온 배양한다.
i. 동등한 부피의 FBS를 가하고 100um 스트레이너(strainer)를 통해 용액을 걸러낸다.
j. 1000 rpm으로 10 분간 여과된 단일 세포를 스핀(spin)한다.
k. PBS로 세포 펠렛을 세척하고 1000 rpm에서 5 분간 스핀 다운(spin down)한다(3 회).
l. 펠렛에서 RBC를 발견할 수 있다면, 다음의 상품 설명서에 따라서 RBC 용해 완충액(lysis buffer)을 사용한다.
m. 그 다음, 세포를 400㎕ HBSS/0.5% BSA에 재현탁시키고, 1㎕ CD34-마이크로비드 mAb(1 : 200)와 혼합하고, 4 ℃에서 30 내지 40 분 동안 회전시켰다.
n. 그 다음, 세포를 마이크로 원심분리기에서 5분 동안 1200 rpm으로 멸균 MACS 완충액으로 1 회 세척하였다.
o. 자기 MACS 컬럼(MS 컬럼)에 세포를 적용하기 전에, 각 컬럼을 1 ml MACS 완충액으로 평형화시키고, 1 ml의 MACS 완충액을 세포에 가하고 전체 부피를 컬럼에 적용했다.
p. 컬럼을 500㎕ MACS 완충액으로 3 회 세척하고 마지막 세척 전에 적당한 양압을 플런지(plunge)로 가하였다.
q. 그 다음, 칼럼을 자석에서 꺼내고 세포를 양압으로 1ml MACS 완충액에 의해 15ml 원뿔 튜브로 용리시켰다.
r. 그 다음, 세포를 1000 rpm에서 5 분간 원심 분리하고 모낭 줄기 세포 성장 배지로 재현탁시켰다.
진피 내피 세포의 단리
a. 그 다음, 세포를 400㎕ HBSS/0.5% BSA에 재현탁시키고, 1㎕ CD31-마이크로비드 mAb(1 : 300)와 혼합하고, 4 ℃에서 30 내지 40 분 동안 회전시켰다.
모낭 줄기 세포의 3D 오가노이드 배양
a. 37 ℃에서 고형화되고 4 ℃에서 제거(liquidation)되는 매트릭스(Matrigel, BD)내의 진피 내피 세포와 단리된 모낭 줄기 세포를 혼합한다.
b. 혼합물을 유리-바닥 접시의 중앙에 플레이팅하고 혼합물을 가습실내에서 37℃에서 5% CO2로 1시간 동안 고형화시킨 후 모낭 줄기 세포 조정 배지를 가한다.
c. 매 3 - 4 일마다 배지를 교체한다.
d. 플래팅 후 7일 동안 모낭 오가노이드를 통과시킨다.

Claims (8)

  1. 모낭 줄기 세포를 배양하는 방법으로서,
    환자로부터 분리한 일련의 모낭 줄기 세포와 제 1 배지를 배양 기판(culture substrate) 상에 제공한 후 고형화하는 단계, 및
    영양공급 세포인 제2세포 진피 내피 세포와 제 2 배지를 상기 배양 기판(culture substrate) 상에 제공한 후 고형화하는 단계를 포함하고,
    상기 제 2 배지는 상기 제 1 배지로부터 물리적으로 분리되어 3D 오가노이드를 생성하는 방식으로 배치되는, 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 일련의 모낭 줄기 세포는 환자의 두피 조직으로부터 유래한 것이고, 상기 제 2 세포는 상기 두피 조직으로부터 유래한 내피 세포인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 제 2 세포는 3D 배양이 수행된 내피 세포인, 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
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