KR20240064196A - 3차원 배양을 통한 폐포 조직 유사 3d 폐세포 모델 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3차원 배양을 통한 폐포 조직 유사 3D 폐세포 모델 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 3D 폐세포 모델은 화학물질에 의한 상피세포의 손상에 따라 폐 섬유아세포의 3가지 생물학적 종말점 평가(세포독성, Cytokine 측정, 세포기능평가)뿐만 아니라 세포 외 기질 (ECM)의 세포 유도 수축을 측정과 같은 폐 섬유아세포의 분화에 의한 기능성 평가가 동시에 가능하다.
Description
본 발명은 3차원 배양을 통한 폐포 조직 유사 3D 폐세포 모델 제조방법에 관한 것이다.
3차원(Three Dimension, 3D) 배양 기술은 암 연구, 신약 발굴, 신경과학 및 재생의학을 비롯한 수많은 응용분야를 위한 보다 예측적인 시험관내 세포 모델의 창출을 이끌었다. 세포는 자연적으로는 3차원 환경에서 성장하고 분화한다. 세포는 이의 자연 환경 안에서 세포외 기질 단백질(ECM) 및 다른 세포와 지속적으로 상호작용하여 세포 이동, 세포사멸 또는 수용체 발현과 같은 복잡한 생물학적 기능을 조절한다. 이러한 상호 작용의 대부분은 전통적인 2D 세포 배양에서는 손실되거나 크게 감소된다. 진보된 3D 세포 시스템은 연구자들이 고전적인 2D 세포 배양과 생체내 동물 모델 사이의 간극을 메울 수 있게 하였다.
한편, 호흡기 질환의 경우 물질의 특성, 노출 방법, 노출 시기, 노출 양, 민감군에 따라 독성이 복잡하고 다양하게 나타날 수 있어 인체에 나타나는 환경성 호흡기 질환을 예측하고 정책에 활용되기 위해서는 기존의 단일 시험법으로는 매우 어렵다는 단점이 있다.
이에 따라 물질의 노출 특성 분석, 세포모델 시험법 및 동물모델 시험법을 통합 분석하는 통합시험전략 방법론을 개발·확립하여 인체의 환경성 호흡기 질환을 예측할 수 있는 시스템의 개발이 필요한 실정이다.
따라서, 본 발명자들은 폐포 조직 유사 3D 폐세포 모델을 개발하고자 하였으며, 본 발명의 상피세포 및 폐 섬유아세포 공배양 시스템을 이용한 3차원 배양 세포 모델은 상피세포 손상에 따른 폐 섬유아세포의 세포 독성 평가 및 생물학적 종말점(biological endpoint)뿐만 아니라 동시에 세포 수축과 같은 기능 평가까지 평가가 가능하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 3D 폐세포 모델을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 생체모사형 폐 상피세포 배양 방법을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 폐 질환 치료제의 후보물질 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 세포배양장치의 상부 챔버(upper chamber)에 폐 상피세포(pulmonary epithelial cell)를 시딩(seeding)하는 단계; 세포배양장치의 하부 챔버(lower chamber)에 폐 섬유아세포(lung fibroblast)를 시딩(seeding)하는 단계; 상기 상부 챔버 및 하부 챔버에 배양액을 주입하는 단계; 및 상기 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포를 공배양(co-culture)하는 단계;를 포함하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법을 제공한다.
이어서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 3D 폐세포 모델을 제공한다.
나아가, 본 발명은 폐 상피세포 및 폐섬유아세포를 공배양하는 단계를 포함하는 생체모사형 폐 상피세포 배양 방법을 제공한다.
더불어, 본 발명은 (a) 상기 3D 폐세포 모델을 준비하는 단계; (b) 상기 3D 폐세포 모델에 호흡기 질환을 유발시키는 단계; (c) 호흡기 질환이 유발된 3D 폐세포 모델에 호흡기 질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계; (d) 상부 챔버에 배양된 폐 상피세포에서 호흡기 질환 관련 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; (e) 하부 챔버의 콜라겐 겔의 수축도를 평가하여 폐 섬유아세포의 섬유화(fibrosis)를 측정하는 단계; 및 (f) 상기 (d) 단계 및 (e) 단계의 측정 결과를 정상 대조군과 비교분석하는 단계;를 포함하는 호흡기 질환 치료제의 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 3D 폐세포 모델은 화학물질에 의한 상피세포의 손상에 따라 폐 섬유아세포의 3가지 생물학적 종말점 평가(세포독성, Cytokine 측정, 세포기능평가)뿐만 아니라 세포 외 기질 (ECM)의 세포 유도 수축을 측정과 같은 폐 섬유아세포의 분화에 의한 기능성 평가가 동시에 가능하다.
도 1a은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 폐포 조직 유사 3D 폐세포 모델 제조 과정을 간단히 나타낸 모식도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 제작이 완료된 폐포 조직 유사 3D 폐세포 모델의 단면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상피세포-폐섬유아세포 공동 배양 모델(Di-culture)과 상피세포 단독 배양 모델에 대한 PHMG-HCI 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 사이토카인의 발현 수준 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 세포기능평가 결과를 나타낸 도이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 제작이 완료된 폐포 조직 유사 3D 폐세포 모델의 단면도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상피세포-폐섬유아세포 공동 배양 모델(Di-culture)과 상피세포 단독 배양 모델에 대한 PHMG-HCI 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 세포 독성 평가 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 사이토카인의 발현 수준 측정 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 세포기능평가 결과를 나타낸 도이다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.
또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(Terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세하게 설명하도록 한다.
일 측면에서, 본 발명은 세포배양장치의 상부 챔버(upper chamber)에 폐 상피세포(pulmonary epithelial cell)를 시딩(seeding)하는 단계; 세포배양장치의 하부 챔버(lower chamber)에 폐 섬유아세포(lung fibroblast)를 시딩(seeding)하는 단계; 상기 상부 챔버 및 하부 챔버에 배양액을 주입하는 단계; 및 상기 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포를 공배양(co-culture)하는 단계;를 포함하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법을 제공한다.
또한, 상기 세포배양장치는 상부 챔버(Upper Chamber; 제품 카탈로그 내지 당 분야에서는 트랜스웰 인서트라고도 지칭됨)와 배지를 함유하는 하부 챔버(Lower Chamber)로 구성되며, 상부 챔버는 하부 챔버의 내부에 위치하며, 두 챔버는 배양배지를 공유한다.
또한, 상기 세포배양장치는 트랜스웰 플레이트(transwell plate)에 트렌스웰 인서트(transwell insert)가 결착된 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “트랜스웰” 또는 “트랜스웰 플레이트”는 당 분야에서 널리 사용되는 것으로, 상업적으로 시판되는 제품을 사용할 수 있으며, 대표적으로는 Corning Incorporated 사로부터 시판되는 제품을 사용할 수 있다. 제품에 대한 상세한 정보는 Corning Incorporated 사에서 제공하는 제품 카탈로그 내지 웹사이트 (www.corning.com)로부터 얻을 수 있으며, 실제로, 트랜스웰 플레이트에 대한 정보 및 사용법은 당 분야의 통상의 기술적 지식을 가진 자의 기술 수준의 범위 내에 있다.
또한, 상기 상부 챔버는 소정 높이를 가지는 측면부 및 다공성 막으로 형성된 투과성 지지체(permeable support)로 형성되는 하단부로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 다공성 막은 당 분야에서 통상적으로 사용되는 재료로 이루어진 막을 이용할 수 있으며, 예컨대, 폴리카르보네이트, 폴리에스테르, 콜라겐-코팅된 폴리테트라플루오로에틸렌 등이 다공성 막으로 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 다공성 막은 세포분비물질과 같은 세포성 물질, 배양배지, 세포 등이 투과할 수 있는 지지체로써, 다공성 막의 구멍의 크기는 당업자가 적절히 채택할 수 있다.
또한, 상기 상부 챔버는 하부 챔버의 측면부에 결착하여 적층되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 하부 챔버는 상부 챔버의 측면부와 다른 높이를 가지는 측면부와 저면에 형성되어 세포가 배양되는 세포배양부로 이루어져 있고, 배양액이 수용되는 공간부를 구비하고 상단이 개구되게 형성되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 세포가 배양되는 세포배양부는 광학적으로 관찰가능하게 형성되므로, 상호 작용 하에 배양된 세포를, 세포 배양 플레이트를 분리한 상태로 개별적으로 관찰하고 다시 적층하는 등의 배양 과정에서의 다양한 접근과 관찰이 용이하다
본 발명에 의하면, 상기 세포배양장치는 서로 다른 종류의 세포들이 서로 상호 작용 하에 배양되는 것을 허용한다. 특히 일 종류의 세포들이 상호작용이 필요한 시점 까지 개별적으로 배양된 상태에서 상호 소통하는 환경 하에 놓이는 것을 허용한다.
또한, 상기 폐 상피세포는 폐 소기도 상피세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 폐 상피세포는 상부 챔버 내 투과성 지지체(permeable support)의 상측에 시딩(seeding)되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 폐 섬유아세포는 콜라겐 겔(collagen gel) 환경 내에서 배양되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 폐세포 모델은 폐세포의 수축 능력을 평가할 수 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이어서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 3D 폐세포 모델을 제공한다.
또한, 상기 3D 폐세포 모델은 폐포 조직 유사 생체 외 모델일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 폐포 조직은 폐포(alveolus) 상피조직일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 3D 폐세포 모델은 처리되는 독성물질에 따라 다양한 호흡기 질환 3D 모델로 이용될 수 있다. 상기 독성물질은 당 기술분야에서 호흡기 질환을 유발하는 물질이라면 화학물질, 바이러스, 미생물 등 종류에 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들면, 담배연기, 스모그, 미세먼지, 포름알데히드, 일산화탄소, 이소시아네이트, 목재분진, PHMG(폴리헥사메틸렌구아니딘), 클로록실레놀, 나프탈렌, 프탈레이트, 블레오마이신, 아데노바이러스(adenovirus), 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), 중증급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2(severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2; SARS-CoV2) 등이 있다.
본 발명에 의하면, 상기 3D 폐세포 모델은 실제 조직 수준의 생리학적 반응을 유사하게 재현한 것으로, 동물실험을 대체하는 효과를 마련할 수 있으며 동물실험에서 진행되었던 독성 및 대사 평가 시스템 확립 및 기본 동물실험에서 불가능 했던 측정 표준화가 가능해진다. 또한 2차원 또는 3차원 생체모사 및 질환 모사체를 이용해서 약물 독성 및 대사평가 유효성 검증 및 안정성 평가에 대한 표준 프로토콜 제시가 가능 해진다.
나아가, 본 발명은 폐 상피세포 및 폐섬유아세포를 공배양하는 단계를 포함하는 생체모사형 폐 상피세포 배양 방법을 제공한다.
또한, 상기 방법은 폐 상피세포 및 폐섬유아세포를 접촉시켜 세포간 상호작용을 통해 실제 조직 수준의 생리학적 반응을 밀접하게 모사한 것일 수 있다.
더불어, 본 발명은 상기 3D 폐세포 모델을 이용한 호흡기 질환 치료제의 후보물질 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, (a) 3D 폐세포 모델을 준비하는 단계; (b) 상기 3D 폐세포 모델에 호흡기 질환을 유발시키는 단계; (c) 호흡기 질환이 유발된 3D 폐세포 모델에 호흡기 질환 치료제 후보물질을 처리하는 단계; (d) 상부 챔버에 배양된 폐 상피세포에서 호흡기 질환 관련 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계; (e) 하부 챔버의 콜라겐 겔의 수축도를 평가하여 폐 섬유아세포의 섬유화(fibrosis)를 측정하는 단계; 및 (f) 상기 (d) 단계 및 (e) 단계의 측정 결과를 정상 대조군과 비교분석하는 단계;를 포함할 수 있다.
상기 방법은 본 발명의 3D 폐세포 모델에 독성물질을 처리하여 호흡기 질환을 구현할 수 있고, 이를 약물 스크리닝에 이용할 수 있다. 그러나 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니며, 편의에 따라 호흡기 질환을 보유한 대상체로부터 세포를 수득할 수 있고, 이와 같이 수행되는 경우 대상체 맞춤형 약물 스크리닝이 가능할 수 있다.
상기 호흡기 질환은 상기 호흡기 질환은 폐섬유증, 기침 또는 가래를 동반하는 폐기종, 천식, 기관지염, 폐렴, 기관지 확장증 및 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참고하여 보다 상세하게 설명하도록 한다. 그러나, 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐, 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아닐 것이다.
<준비예 1> 재료의 준비
1-1. 세포 배양
실험에 사용된 상피세포는 1mm 세기관지 영역에 있는 정상적인 인간 폐 조직에서 폐의 원위 부분에서 분리된 소기도 상피세포인 SAEC (SAEC, Small Airway Epithelial Cells)로, LONZA Group Ltd (Muenchensteinerstrasse, Switzerland)에서 구매하여 사용하였다. 기본 성장배지인 PneumaCult™-Ex Plus Medium (ST05040, STEMCELL™)를 사용하여 배양하였으며, 계대배양 시에는 DPBS (LB 001-02, WEL GENE)를 사용하여 세척한 후, ACF Dissociation Solution (Cat #05427, STEMCELL™)과 ACF Enzyme Inhibition Solution (Cat #05428, STEMCELL™)을 사용하여 계대 배양하였으며, 37°C, 5 % CO2의 Thermo Scientific 배양기에서 배양하였다. 공동배양모델을 제작하기 위해 0.03 mg/mL의 Rat Tail Collagen Type Ⅰ (Corning, Fisher Scientific)으로 코팅된 12-well Carrier Plate with Cell Culture Inserts (Thermo Fisher SCIENTIFIC)에 시팅 후, ALI culture로 분화시키기 위해서는 분화배지인 PneumaCult™-ALI Medium Kit (ST05001, STEMCELL™)를 사용하였다. 또한, 폐 섬유아세포는 인간 섬유 아세포인 MRC-5 세포로, 한국세포주은행(KCLB, Korea cell line bank, Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다. 세포는 Penicillin (100 unit/ml)과 Streptomycin (100 unit/ml)이 1% 함유된 10% FBS(Corning, New York, USA)-MEM(Gibco, USA)로 37℃, 5% CO2의 Thermo Scientific 배양기에서 배양하였다. 배양된 폐 섬유아세포는 공동 배양 모델을 제작하기 위해 12-well Carrier Plate with Cell Culture Inserts (Thermo Fisher SCIENTIFIC)의 하단에 Collagen gel에 함유되어 시딩되었다.
1-2. 실험재료
세포 공동배양을 위해서 상단의 상피세포는 0.03 mg/mL의 Rat Tail Collagen Type Ⅰ (Corning, Fisher Scientific)으로 코팅된 12-well Carrier Plate with Cell Culture Inserts (Thermo Fisher SCIENTIFIC)를 사용하였으며, 하단의 폐 섬유아세포는 Rat Tail Collagen Type Ⅰ (Corning, Fisher Scientific)을 사용하여, Gel contraction assay를 진행하였다. 상피세포의 세포독성을 알아보기 위해서는 Cellvia (AbFrontier, Seoul, Korea)를 사용하였다. Cytokine (TGF-β1) 발현도를 확인하기 위해서는 Human TGF beta 1 ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Kit를 Abcam (카탈로그 번호: ab100647)에서 구매하여 제조업체의 지침에 따라 사용하였다. 폐 섬유아세포가 함유된 겔의 수축도는 실체 현미경 (SZ61, Olympus)을 사용하였다.
<실시예 1> 공동배양을 통한 3D 세포 배양 기술 모델 개발
도 1을 참조하여, 상피세포 및 폐 섬유아세포를 공배양하여 3차원 배양을 통한 세포 모델을 제조하였다.
구체적으로, 도 1a를 참조하여 해당 세포 모델은 높낮이 조절이 가능한 12-well Carrier Plate with Cell Culture Inserts (Thermo Fisher SCIENTIFIC)을 사용하였다 (Step 1). Transwell (Insert)에 0.03 mg/mL의 Rat Tail Collagen Type Ⅰ (Corning, Fisher Scientific)으로 코팅하였다 (Step 2). Transwell (Insert)의 상단에는 상피세포인 SAEC를 웰 당 200,000개씩 잠긴 배양 상태(상단 및 하단은 기본 성장배지)로 시딩하였다 (Step 3). 3-5일 후, 상단의 기본배지를 조심스럽게 빼주고 하단에 분화유도제가 첨가된 분화배지로 교체하여 ALI culture로 21일 이상 분화시켰다 (Step 4a). 분화가 완료된 시점에 12-well Carrier Plate with Cell Culture Inserts (Thermo Fisher SCIENTIFIC)의 하단에 폐 섬유아세포가 함유된 콜라겐 겔을 시딩하였다 (Step 4b). 폐 섬유아세포가 함유된 콜라겐 겔 위에 분화된 상피세포의 Transwell insert를 결착 및 공동배양하여 폐포 조직 유사 3D 폐 세포모델을 제작하였다 (Step 5). 제작이 완료된 폐포 조직 유사 3D 폐 세포모델의 단면도는 도 1b에 나타내었다.
<비교예 1> 단독배양모델의 제작
상피세포 (Small Airway Epithelial Cell, SAEC)는 기본 성장배지인 PneumaCult™-Ex Plus Medium (ST05040, STEMCELL™)을 사용하여 배양하였으며, 계대배양 시에는 DPBS (LB 001-02, WEL GENE)를 사용하여 세척한 후, ACF Dissociation Solution (Cat #05427, STEMCELL™)과 ACF Enzyme Inhibition Solution (Cat #05428, STEMCELL™)를 사용하여 계대 배양하였다. 단독배양모델을 제작하기 위해 0.03 mg/mL의 Rat Tail Collagen Type Ⅰ (Corning, Fisher Scientific)으로 코팅된 12-well Carrier Plate with Cell Culture Inserts (Thermo Fisher SCIENTIFIC)에 시딩 후, ALI culture로 분화시키기 위해서는 분화배지인 PneumaCult™-ALI Medium Kit (ST05001, STEMCELL™)를 사용하였다.
<실험예 1> 상피세포-폐 섬유아세포 상호작용 확인
실시예 1의 상피세포-폐섬유아세포 공동 배양 모델(Di-culture)과 비교예 1의 상피세포 (Small Airway Epithelial Cell, SAEC) 단독 배양 모델(도 2 mono-culture)에 각각 동일 농도의 폴리헥사메틸렌구아니딘 염산염(Polyhexamethylene guanidine hydrochloride, PHMG-HCl)을 처리하고, 3시간 동안 37°C, 5 % CO2의 Thermo Scientific 배양기에서 배양하였다. 이 후, 세포 독성을 평가하기 위하여 실시예 1 및 비교예 1의 세포 모델에서 상피세포를 각각 수득하여 cell viability assay를 수행하였다.
cell viability assay는 3시간 동안 노출 후, MEM (Gibco, USA) 400 ㎕와 Cellvia (AbFrontier, Seoul, Korea) 시약 40 ㎕를 각 세포마다 처치하고 배양기에 넣어 최대 60분 후 발색을 확인하였다. 발색이 확인되면 상층액을 96-well plate (Eppendorf)에 well 당 90 ㎕씩 분주하였다. 세포들의 Cell viability를 측정하기 위하여 Plate reader (TECAN, Zurrich, Switzerland)를 이용하여 450 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 단독 배양 또는 공동 배양에 관계없이 PHMG-HCl의 농도가 높아질수록 세포의 수가 줄어드는 경향을 보였다. 하지만, 고농도(80μg/ml)의 PHMG-HCl를 처리하는 경우 상피세포 단독 배양 모델(비교예 1)은 세포의 생존도가 대조군 대비 26% 낮아졌으나, 상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델(실시예 1)은 세포의 생존도가 대조군 대비 8% 낮아졌다. 이와 같이 단독 배양 모델보다 공동 배양 모델에서 상피세포가 덜 손상된 것으로 나타났으며, 이를 통해 본 발명의 폐 섬유증 평가용 세포 모델에서 상피세포와 폐 섬유아세포를 공동 배양하는 경우 상피세포와 폐 섬유아세포가 서로 상호작용 한다는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 상피세포는 폐 섬유아세포의 유무에 따라 상피세포의 세포독성이 달라져 폐 섬유아세포 존재 여부가 독성물질에 의한 세포손상에 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.
<실험예 2> 화학물질에 따른 세포 독성 평가
도 2의 결과에 따라 상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 세포 독성을 평가하기 위하여, 화학물질을 실시예 1의 공동 배양 모델에 다양한 농도로 처리하고 상피세포와 폐 섬유아세포에 대한 cell viability assay를 수행하여 상피세포 손상에 따른 폐 섬유아세포의 세포독성을 평가하였다.
구체적으로, 4종의 화학물질(A=Polyhexamethyleneguanidine hydrochloride (PHMG-HCl), B=Sodium dichloroisocyanurate (NaDCC), C=Benzalkonium chloride(BKC 50%), D=Methylchloroisothiazolinone / Methylisothiazolinone (CMIT/MIT=3:1))을 실시예 1의 공동 배양 모델에 각각의 화학물질들을 다양한 농도로 상단의 상피세포에만 액상 처치하여 3시간 동안 노출시켰으며, 이후 상기 실험예 1의 방법으로 cell viability assay를 수행하다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 공동 배양 세포 모델에서도 각각의 화학물질의 농도가 높아질수록 세포의 수가 줄어드는 경향을 보였다. 각각 화학물질의 고농도에서는 전부 세포 생존도가 20% 미만으로 사멸한 것으로 나타났다.
이러한 결과는 처치한 화학물질이 독성 유발물질로 알려진 살생물제 4종이며, 모두 세포 독성을 유도하는 것을 의미한다.
<실험예 3> 화학물질에 따른 사이토카인 발현 수준 평가
상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 사이토카인의 발현 수준을 확인하기 위해, 상피세포에 대한 TGF-β1 사이토카인 발현 수준을 평가하였다. TGF-β1은 폐 섬유증의 주요 마커로 알려져 있다.
구체적으로, 실험예 2에서 사용된 4종의 화학물질 (A-D)을 각각 분화된 상피세포(상단)에 3시간 처치 후, 상층액을 수거하여 ELISA kit를 이용하여 TGF-β1 발현 수준을 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 각각의 화학물질은 대조군 대비 A는 최대 1.7배, C는 최대 1.74배, D는 최대 2.56배까지 TGF-β1이 발현되었으며, 화학물질 B의 경우 대조군 대비 TGF-β1이 발현되지 않았다.
이러한 결과는 폐 질환 유발 물질로 알려진 살생물제 4종 중에 Polyhexamethyleneguanidine hydrochloride (PHMG-HCl), Benzalkonium chloride(BKC 50%), Methylchloroisothiazolinone/Methylisothiazolinone (CMIT/MIT=3:1)는 폐 섬유증을 유발할 가능성이 있음을 의미한다.
<실험예 4> 화학물질에 따른 세포기능평가
상피세포-폐 섬유아세포 공동 배양 모델에서 화학물질에 따른 세포기능을 평가하기 위해, 폐 섬유아세포에 대한 콜라겐 겔 수축도 평가(Gel contraction assay)를 수행하였다.
구체적으로, 화학물질 Polyhexamethyleneguanidine hydrochloride (PHMG-HCl), Sodium dichloroisocyanurate (NaDCC), Benzalkonium chloride(BKC 50%)를 각각 분화된 상피세포(상단)에 처리하였을 경우, 상피세포 손상에 따라 콜라겐 겔 안에 배양된 폐 섬유아세포(하단)의 기능 변화를 콜라겐 겔 수축도 평가를 통해 평가하였으며, 양성대조군으로 TGF-β1 5 ng/ml을 처리하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 상단의 상피세포에 화학물질 A=Polyhexamethyleneguanidine hydrochloride (PHMG-HCl), B=Sodium dichloroisocyanurate (NaDCC), C=Benzalkonium chloride(BKC 50%)에 의해 하단의 폐 섬유아세포가 함유된 콜라겐 겔이 수축된 것을 확인하였다.
이러한 결과는 폐 독성 유발 물질로 알려진 살생물제 4종에 의해 상피세포가 손상되고, 상피세포 손상 시 분비되는 사이토카인에 의해 단 시간내에 폐 섬유아세포의 기능 변화(폐 섬유아세포가 근섬유아세포로 분화된 것)가 유도되었음을 의미한다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 구체적인 실시예를 상세하게 설명되었으나, 본 발명의 사상을 이해하는 당업자는 동일한 사상의 범위 내에서 다른 구성요소를 추가, 변경, 삭제 등을 통하여, 퇴보적인 다른 발명이나 본 발명 사상의 범위 내에 포함되는 다른 실시예를 용이하게 제안할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상술한 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구의 범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구의 범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (13)
- 세포배양장치의 상부 챔버(upper chamber)에 폐 상피세포(pulmonary epithelial cell)를 시딩(seeding)하는 단계;
세포배양장치의 하부 챔버(lower chamber)에 폐 섬유아세포(lung fibroblast)를 시딩(seeding)하는 단계;
상기 상부 챔버 및 하부 챔버에 배양액을 주입하는 단계; 및
상기 폐 상피세포 및 폐 섬유아세포를 공배양(co-culture)하는 단계;를 포함하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 상부 챔버는 하단부가 다공성 막으로 형성된 투과성 지지체(permeable support)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법.
- 제2항에 있어서,
상기 다공성 막은 폴리카르보네이트, 폴리에스테르 및 콜라겐-코팅된 폴리테트라플루오로에틸렌으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 소재로 이루어진 것을 특징으로 하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 폐 상피세포는 상부 챔버 내 투과성 지지체(permeable support)의 상측에 시딩(seeding)되는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법. - 제1항에 있어서,
상기 상부 챔버는 하부 챔버의 측면에 결착하여 적층되는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 하부 챔버는 측면부와 하단부로 이루어져 있고, 배양액이 수용되는 공간부를 구비하고 상단이 개구되게 형성되어 있는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 폐 섬유아세포는 콜라겐 겔(collagen gel) 환경 내에서 배양되는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 폐세포 모델은 폐세포의 수축 능력을 평가할 수 있는 것을 특징으로 하는, 3차원 배양을 통한 폐세포 모델 제조 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 3D 폐세포 모델.
- 제8항에 있어서,
상기 3D 폐세포 모델은 폐포 조직 유사 생체 외 모델인 것을 특징으로 하는, 3D 폐세포 모델.
- 폐 상피세포 및 폐섬유아세포를 공배양하는 단계를 포함하는, 생체모사형 폐 상피세포 배양 방법.
- (a) 제8항의 3D 폐세포 모델을 준비하는 단계;
(b) 상기 3D 폐세포 모델에 호흡기 질환을 유발시키는 단계;
(c) 호흡기 질환이 유발된 3D 폐세포 모델에 폐섬유증 치료제 후보물질을 처리하는 단계;
(d) 상부 챔버에 배양된 폐 상피세포에서 폐섬유증 관련 마커의 mRNA 또는 단백질 수준을 측정하는 단계;
(e) 하부 챔버의 콜라겐 겔의 수축도를 평가하여 폐 섬유아세포의 섬유화(fibrosis)를 측정하는 단계; 및
(f) 상기 (d) 단계 및 (e) 단계의 측정 결과를 정상 대조군과 비교분석하는 단계;를 포함하는 호흡기 질환 치료제의 후보물질 스크리닝 방법.
- 제12항에 있어서,
상기 호흡기 질환은 상기 호흡기 질환은 폐섬유증, 기침 또는 가래를 동반하는 폐기종, 천식, 기관지염, 폐렴, 기관지 확장증 및 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 호흡기 질환 치료제의 후보물질 스크리닝 방법.
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| KR20210093382A (ko) | 2018-03-22 | 2021-07-27 | 방동하 | 3ｄ 세포 배양을 위한 방법과 시스템 및 이의 용도 |
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