KR20210093382A - 3ｄ 세포 배양을 위한 방법과 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

내피세포, 섬유아세포, 또는 표적 세포와 유사하거나 표적 세포와 동일한 종류의 세포주인 영양공급 세포 또는 세포주를 사용하여 3D 오가노이드를 생산하기 위한 시스템 및 방법. 상기 시스템 및 방법은 신속한 배양뿐만 아니라 장기간 유지 가능한 3D 세포 또는 조직 배양 환경을 제공한다.

Description

3Ｄ 세포 배양을 위한 방법과 시스템 및 이의 용도{SYSTEM AND METHOD FOR 3D CELL CULTURE AND USE THEREOF}
3D 배양 기술은 암 연구, 신약 발굴, 신경과학 및 재생의학을 비롯한 수많은 응용분야를 위한 보다 예측적인 시험관내 세포 모델의 창출을 이끌었다. 세포는 자연적으로는 3차원 환경에서 성장하고 분화한다. 세포는 이의 자연 환경 안에서 세포외 기질 단백질(ECM) 및 다른 세포와 지속적으로 상호작용하여 세포 이동, 세포사멸 또는 수용체 발현과 같은 복잡한 생물학적 기능을 조절한다. 이러한 상호 작용의 대부분은 전통적인 2D 세포 배양에서는 손실되거나 크게 감소된다. 진보된 3D 세포 시스템은 연구자들이 고전적인 2D 세포 배양과 생체내 동물 모델 사이의 간극을 메울 수 있게 하였다.
최근에는, 종양 스페로이드(spheroid), 줄기세포 오가노이드(organoid) 및 3D 바이오프린팅을 통한 조직 공학과 같은 진보된 3D 세포 배양 방법을 사용하여 실제 생체내 세포 반응을 보다 면밀한 모델링을 구현하였다. 자연 환경을 정확하게 복제하도록 3D 세포 배양 모델을 향상시킴으로써 보다 의미 있는 과학적 결과를 제공하고 궁극적으로 인간의 건강을 향상시킬 수 있을 것이다. 3D 세포 배양 모델은 2가지 주요 범주: 1) 동물 유래/합성 하이드로 겔 또는 구조적 3D 스캐폴드를 사용하는 스캐폴드 기반 방법 및 2) 스페로이드라 명명되는 자유롭게 부유하는 세포 응집체를 사용하는 무-스캐폴드(scaffold-free) 방법으로 나뉠 수 있다.
기존의 3D 방법은 제한 없이, 확장성, 재현성, 감도 및 고처리량 스크리닝(HTS) 기기와의 호환성을 포함하고 있지 않다. 3D 세포 모델을 성장시키는 것은 단기 임상 시험 용도로서 활용하기까지 오랜 시간이 걸린다. 또한, 3D 세포 모델을 장기간 동안 시험관내에서 유지시키는 것은 어려운 일이다. 따라서, 3D 세포 배양을 위한 새로운 방법과 시스템이 필요하다. 단기간에 배양될 수 있는 3D 세포 모델은 환자 특이적 의학치료에 사용될 수 있으며 신약 발굴의 효율성을 향상시킬 수 있다.
본원에 개시된 실시형태는 기존의 3D 배양 방법 및 시스템에 대한 하나 이상의 문제점을 극복하는 것에 관한 것이고 본 발명을 설명하고 있다. 본 발명의 범위는 개시된 실시형태로 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시형태는 3차원 구조 또는 3차원 구조의 세포 덩어리(mass), 예를 들어 오가노이드로 성장될 표적 세포의 빠른 성장을 지지하는 2차 세포주를 사용하여 3D 세포 덩어리를 효율적이고 효과적으로 생산하는 방법에 관한 것이며, 이러한 오가노이드는 본원에서 임의의 3D 세포 덩어리 또는 통상적인 오가노이드 및 스페로이드뿐만 아니라 조직을 포함하는 3D 세포 모델로서 정의된다. 이러한 3D 세포 모델은 종래의 2차원 세포 구조에 비해 많은 이점을 갖는다. 예를 들어, 3D 오가노이드는 실제 생물학적 기관 또는 조직과 생리학적으로 더 유사하며 신약 발굴 또는 스크린 또는 세포 치료법 등과 같은 의학치료에 사용될 수 있다. 3D 오가노이드는 어려운 임상 문제를 연구하기 위한 미세 생리학적 시스템 또는 장기칩(organs-on-chips)의 생성 및 잠재적 치료법의 개발을 위해 사용할 수 있다. 이러한 인간 대용물들은 튼튼하고 사용이 용이하고 비용이 저렴하고 대사작용과 기능적 반응을 측정할 수 있게 하는 무펌프 자체 완비된 시스템(pumpless self-contained system)을 사용한다.
제2 세포 또는 세포주는, 관류된 마이크로유체 배지와 같은 배지에 제공되고 제2 세포 또는 세포주가 성장을 위한 표적 세포로부터 물리적으로 이격되는 방식으로 배치된다. 표적 세포용 배지와 제2 세포용 배지는 다를 수 있지만, 표적 세포와 제2 세포에 따라서는 동일할 수도 있다. 제2 세포는 표적 세포의 성장을 촉진하는 데 사용되며 자체의 성장을 위한 것은 아니다. 제2 세포는 내피세포 또는 섬유아세포, 바람직하게는 장기 특이적 내피세포 또는 섬유아세포이다. 내피세포는 바람직하게는 인간 진피 미세혈관 내피세포이다. 내피세포 또는 섬유아세포는 표적 세포가 얻어지는 장기 또는 조직과 동일하거나 유사한 장기 또는 조직으로부터 선택될 수 있다.
표적 세포는 분리 가능한 기질 플레이트상에 배치되므로 표적 세포를 갖는 기질 플레이트는 다른 배양층으로 옮겨질 수 있다. 이러한 방식으로, 배양된 표적 세포는 플래시(flash) 제2 세포 또는 세포주를 갖는 새로운 층에 노출될 수 있다. 표적 세포는 장기 조직 또는 피부 조직과 같은 인체의 임의의 부분에서 유래된 임의의 세포일 수 있지만, 암 세포와 같은 외래 세포 유래의 것일 수 있다.
표적 세포의 배양은 동일한 배양층에 제3 세포를 제공함으로써 더 촉진될 수 있다. 제3 세포는 표적 세포의 배양층에 배치되어 있는 배지에 배치될 수 있다. 제3 세포는 제3 세포가 표적 세포와 제2 세포로부터 이격되는 방식으로 배치될 수 있다.
제3 세포는 표적 세포와 동일하거나 유사한 세포주로부터 선택될 수 있다. 표적 세포가 암 세포인 경우, 제3 세포는 암 세포주일 수 있다. 제3 세포는 바람직하게는 이질성(heterogenecity)이 없는 단일 세포주일 수 있다. 암 세포주는 2D 또는 3D 세포주일 수 있다.
마트리겔(matrigel) 혼합물을 표적 세포를 함유하는 배지 위에 배치할 수 있다. 마트리겔 혼합물은 비율이 약 6:4 내지 약 8:2인 마트리겔과 제4 배지의 혼합물이다.
배양 기질은 유리 바닥 접시로서, 접시 바닥의 일부분은 유리 바닥 접시로부터 탈착될 수 있는 유리 플레이트를 갖는다. 예를 들어, 유리 플레이트를 들어올려서 표적 세포를 함유하는 배지 위의 마트리겔 혼합물의 일부분을 편리하게 꺼내어 다른 유리 바닥 접시로 이전시켜 신선한 영양공급 세포(feeder cell)를 제공할 수 있다. 유리 플레이트 및 유리 바닥 접시용 재료는 필요에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 플라스틱 재료가 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 실시양태는 표적 암 세포를 포함하는 제1 배지를 제조하는 단계; 상기 제1 배지를 성장 기질에 배치하는 단계; 마트리겔 혼합물을 상기 제1 배지 위에 배치하는 단계; 마트리겔 혼합물을 고형화시키는 단계; 내피세포, 섬유아세포 또는 이들 둘 다로부터 선택된 세포를 포함하는 제2 배지를 배치하는 단계; 제3 세포를 포함하는 제3 배지를 배치 - 상기 제3 세포는 표적 암 세포와 유사하거나 표적 암 세포와 동일한 종류의 암 세포이다 - 하는 단계; 조정 배지를 상기 제1 배지, 제2 배지 및 제3 배지를 덮도록 성장 기질 위에 배치하여 배양 플레이팅(culture plating)을 야기하는 단계; 및 상기 배양 플레이팅을 항온배양하여 3D 오가노이드를 성장시키는 단계에 의해 3D 오가노이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 표적 조직을 포함하는 제1 배지를 성장 기질상에 제공하고 제2 세포를 포함하는 제2 배지를 상기 성장 기질상에 제공함으로써 3D 조직 오가노이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 제2 배지는 제2 배지가 제1 배지로부터 물리적으로 분리되어 3D 조직 오가노이드를 생산하는 방식으로 배치될 수 있다.
제2 배지의 제2 세포는 내피세포 또는 섬유아세포, 바람직하게는 장기 특이적 내피세포 또는 섬유아세포일 수 있다. 내피세포는 인간 진피 미세혈관 내피세포일 수 있다.
상기 방법은 제3 세포를 포함하는 제3 배지를 포함할 수 있고, 제3 배지는 제1 배지 및 제2 배지로부터 물리적으로 떨어져 배치될 수 있다.
제3 세포는 바람직하게는 표적 세포와 유사하거나 표적 세포와 동일한 종류인 세포이며, 제3 세포를 위한 조건은 제3 세포의 성장에 맞게 조정된다. 제3 세포는 한 종류 이상의 세포를 함유하는 세포주일 수 있다.
제1 표적 세포는 암 세포일 수 있고, 제3 세포는 암 세포주일 수 있다. 바람직하게는, 암 세포주는 이질성이 없는 단일 세포주이다. 암 세포주는 2D 또는 3D 세포주이다.
상기 방법은 마트리겔 혼합물을 제1 배지 위에 제공하는 단계를 포함할 수 있는데, 이때 상기 마트리겔 혼합물은 비율이 약 6:4 내지 약 8:2인 마트리겔과 제4 배지의 혼합물이다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 표적 세포 또는 조직을 포함하는 제1 배지 및 제2 세포를 포함하는 제2 배지를 포함하는 3D 오가노이드 성장시키기 위한 시스템이다. 제1 배지와 제2 배지는 서로 직접 접촉하지 않을 수 있다. 제2 세포는 내피세포, 섬유아세포, 표적 세포와 유사하거나 표적 세포와 동일한 종류인 세포주로부터 선택될 수 있고, 시스템은 3D 오가노이드를 성장시키는 데 사용된다.
상기 시스템은 제3 세포를 포함하는 제3 배지를 포함할 수 있다. 제3 배지는 제1 배지 또는 제2 배지와 직접 접촉하지 않을 수 있다. 제3 세포는 내피세포, 섬유아세포, 표적 세포와 유사하거나 표적 세포와 동일한 종류이고 제2 세포와 상이한 세포주로부터 선택된다.
상기 시스템은 비율이 약 6:4 내지 약 8:2인 마트트리겔과 제4 배지의 혼합물인 마트리겔 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시형태는 미세생리학 시스템, 장기칩 장치이다. 상기 장치 또는 시스템은 약동학적 모델에 생리학적으로 기반하며 미세제작된 장치에 배치된 인간 세포 또는 조직 공학 구조물을 사용한다. 상기 장치는 견고하고 사용이 쉬우며 비용이 저렴하고 대사작용과 기능 반응을 측정할 수 있게 하는 자체 완비된 시스템이다. 상기 장치는 약물 스크린 또는 추가의 의학치료 개발에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태는 a) 배양 시스템을 사용하여 배양한 3D 암 오가노이드를 제공하는 단계로서, 상기 시스템이 표적 세포 또는 조직을 갖는 제1 배지와 제2 세포를 갖는 제2 배지로 구성되고 상기 제1 배지와 제2 배지가 서로 직접 접촉하지 않으며 상기 제2 세포가 내피세포, 섬유아세포, 또는 표적 세포와 유사하거나 표적 세포와 동일한 종류인 세포주로부터 선택되는 단계; b) 상기 3D 암 오가노이드에 의학 물질을 적용하는 단계; 및 c) 상기 3D 암 오가노이드에 미치는 상기 의학 물질의 약학적 효과를 결정하는 단계에 의해, 3D 암 오가노이드를 사용하여 적절한 항암제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
단기간에 배양될 수 있는 3D 세포 모델은 환자 특이적 의학치료에 사용될 수 있으며 신약 발굴의 효율성을 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 실시형태의 실례이다.
도 2a는 본 발명에 따른 실시형태의 실례의 측면도이고, 도 2b는 탈착식(removable) 플레이트를 갖는 실시형태의 다른 측면도이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시형태를 이용하는 예시적인 흐름도이다.
도 4는 본 발명에 따른 실시형태를 이용하는 예시적인 흐름도이다.
도 5는 본 발명에 따른 실시형태를 이용하는 예시적인 흐름도이다.
도 6은 본 발명의 실시형태에 따라 3D로 성장된 인간 폐암 세포 콜로니의 사진을 도시한다.
도 7은 3D 인간 폐암 세포 콜로니에 대한 배양물의 사진이다.
도 8은 3D로 성장된 마우스 폐 줄기세포 콜로니의 사진을 도시한다. 도 8a는 7일 후의 콜로니를 도시하며 도 8b는 14일 후의 콜로니를 도시한다.
도 9는 3D 마우스 폐 전체 조직 배양물을 도시한다: 도 9a는 0일째의 3D 마우스 폐 전체 조직 배양물을 도시하며; 도 9b는 7일째의 3D 마우스 폐 전체 조직 배양물을 도시하고; 도 9c 및 도 9d는 혈관 성장을 도시한다.
도 10은 50일 후의 3D 마우스 폐 전체 조직 배양물의 사진이다.
도 11은 3D 배양으로 성장된 마우스 간관(liver duct) 줄기세포 콜로니의 사진을 도시한다.
도 12는 3D 배양으로 성장된 마우스 정조 줄기세포(spermatogonial stem cell) 콜로니의 사진을 도시한다.
도 13은 3D 배양으로 성장된 마우스 췌관 줄기세포 콜로니의 사진을 도시한다.
도 14는 약물 스크린을 위한 다중-배양 웰을 도시한다.
도 15는 (a) 의약 처리가 없는 배양 결과 및 (b) (a)와 동일한 기간 동안 의약 처리한 배양 결과를 도시한다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 배양 시스템을 나타낸다. 환자의 암 세포와 같은 표적 세포를 환자로부터 얻어서 작은 조각으로 분리한다. 분리한 세포(210)를 미세유체 배지와 같은 조정 배지 및 마트리겔에 배치한다. 혼합물(200)을 유리 바닥 접시(100)에 놓고 항온배양하여 접시에서 혼합물을 고형화시킨다. 조정 배지 및 마트리겔 중의 영양공급 세포 또는 세포주(310)는 동일한 접시에 제공되지만 영양공급 세포 또는 세포주 혼합물(300)이 표적 세포 혼합물(200)로부터 분리되는 방식으로 배치될 수 있다. 영양공급 세포 또는 세포주는 환자 유래의 것일 필요는 없으며 제3자 유래의 것일 수도 있다. 분리는 영양공급 혼합물로 인한 어떠한 세포 오염도 없이 배양된 표적 세포를 수거할 수 있게 한다.
영양공급 세포 또는 세포주는 표적 세포의 성장을 촉진시키기 위한 것이지 자체 성장을 위한 것이 아니다. 영양공급 세포 또는 세포주는 바람직하게는 내피세포 또는 섬유아세포이다. 보다 바람직하게는, 내피세포는 인간 진피 미세혈관 내피세포이다. 보다 더 바람직하게는, 영양공급 세포 또는 세포주는 표적 세포가 얻어지는 장기와 유사하거나 동일한 장기의 내피세포 또는 섬유아세포이다.
배양층은 조정 배지 및 마트리겔 중에서 유사하게 제조되는 제2 영양공급 세포 또는 세포주(410)를 가질 수 있다. 제2 영양공급 세포 또는 세포주 혼합물(400)도 혼합물(400)이 표적 세포 또는 세포주 혼합물로부터 분리되는 방식으로 배치될 수 있다. 제2 영양공급 세포 또는 세포주는 접시에 배치될 수 있다. 제2 영양공급 세포 또는 세포주는 바람직하게는 표적 세포와 유사하거나 동일한 세포 또는 세포주인 세포 또는 세포주이다. 예를 들어, 조정 배지에 대한 조건이 알려진 공개적으로 입수가능한 암 세포주가 암 세포의 3D 배양을 위해 사용될 수 있다. 표적 세포 혼합물층이 영양공급 세포층으로부터 분리되어 있기 때문에, 배양된 표적 세포는 영양공급 세포층으로 인한 어떠한 오염도 없이 수거될 수 있다.
선택적으로, 혼합물(200)은 별도의 탈착식 플레이트(500)에 배치되며, 이는 혼합물층을 접시에서 꺼내어 또 다른 접시로 이전시켜 추가적인 영양공급 세포 또는 영양소를 제공할 수 있게 한다.
표적 세포 및 영양공급 세포 혼합물을 접시에 배치한 후, 조정 배지를 접시에 충전시킬 수 있다. 또는, 비율이 약 6:4 내지 약 8:2인 마트리겔과 다른 배지의 혼합물을 접시에 충전시킬 수 있다.
본원에서 사용되는 배지는 세포 또는 세포주 종류에 따라 조정될 필요가 있을 수 있다. 배지에 들어갈 수 있은 많은 성분들이 있다. 예를 들어, 하기 표 1의 성분들 중 일부를 배합하여 적절한 배지를 형성할 수 있다:
3D 배양 배지를 위한 전형적 성분
StemProTM-34 (www.thermofisher.com)
성장 인자
StemProTM 34 + 영양소 + GPS
1% 소태아 혈청(FBS) (열 불활성화)
5mg/ml 소 혈청 알부민 (BSA)
인슐린 25mg,
트랜스페린 25mg,
25ug 아셀렌산
노긴: 100ng/ml
N-아세틸시스테인 1.25mM
Advanced DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium) (Thermo Fisher Scientific)
ECGS (Biomedical Technologies, 매사추세츠주 스토턴)
25 ml HEPES (Sigma),
100 ug/ml 헤파린 (Sigma)
DMEM/F12 (Thermo Fisher Scientific)
페니실린(100IU/ml)-스트렙토마이신 (100ug/ml)
2% NuSerumTM (BD Biosciences)
ACL-4 배지 (Thermo Fisher Scientific)
RPMI 1640 (Sigma)
EGM2 배지 (Lonza Bioscience)
EBM 배지 (Lonza Bioscience)
배지에서 이용될 수 있은 많은 성장 인자들이 있다. 예를 들어, 다음 성장 인자들 중 하나 이상을 사용할 수 있다: 인간 EGF 10 내지 100ng/ml, 인간 FGF10 10 내지 100ng/ml, 인간 FGF2 10 내지 100ng/ml, 인간 FGF110 내지 100ng/ml, 인간 HGF 10 내지 100ng/ml, 100ng/ml, 인간 VEGF 10 내지 100ng/ml, GDNF 20ng/ml, SDF-1 (CXCL12) 50ng/ml, CXCL1 10ng/ml, CXCL2 10ng/ml, NGF, PDGF, IGF-1 및 TGF-베타.조정 배지는 다양한 배지들로부터 선택될 수 있다. 많은 세포 배양 배지 제제가 문헌에 기재되어 있으며 다수의 배지가 시판되고 있다. 일단 배양 배지를 세포와 함께 항온배양하면, 그것은 "폐배지(spent medium)" 또는 "조정 배지(conditioned medium)"로서 당업자에게 알려져 있다. 조정 배지는 배지의 많은 본래 성분들뿐만 아니라, 예를 들어 생물학적 활성 성장인자, 염증 매개인자 및 기타 세포외 단백질을 비롯한 다양한 세포 대사산물 및 분비형 단백질을 함유한다.
배양된 표적 세포가 영양공급 세포 유래의 외래 세포로부터 분리될 필요가 없는 경우, 영양공급 세포 또는 세포주 혼합물(610)은 도 3에 예시된 배양층(600)과 같이 조정 배지(630) 중에서 표적 세포 혼합물(620)과 혼합될 수 있다.
도 4는 3D 배양을 위한 예시적인 프로토콜 및 배양된 세포의 사용을 나타낸다. 환자의 조직을 단일 세포 단리를 위해 해리한다. 단일 세포를 플라스크에 씨딩(seeding)하고, 부착된 플라스크를 37℃에서 15분 동안 항온배양하여 종양 섬유아세포를 제거한다. 이 단계 후, 암 마커 선별을 위해 부유 세포를 MACS® 기술(https://www.miltenyibiotec.com/DK-en/products/macs-cell-separation.html)을 통해 수거한다. 조정 배지에서 선별된 암 세포를 마트리겔과 혼합한다. 실험의 확장 및 대규모를 위해, 마트리겔 혼합물을 상기 설명한 바와 같이 영양공급 세포를 갖는 유리 바닥 접시에 플레이팅한다. 약물 스크리닝을 위해 1×104개의 암 세포 및 영양공급 세포를 갖는 마트리겔 혼합물을 96웰에 플레이팅한다. 이어서, 상기 혼합물을 37℃에서 1시간 동안 고형화시킬 수 있고, 조정 배지를 고형화된 혼합물의 상부에 첨가한다.
본 발명의 3D 배양 방법 및 시스템은 조직을 배양하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 5는 조직의 3D 배양을 위한 방법을 나타낸다. 환자의 암 조직을 절단하여 조직 샘플을 얻는다. 조직 샘플을 마트리겔에 배치할 수 있고 이의 혼합물을 37℃에서 45분 동안 고형화시킬 수 있다. 이어서, 마트리겔과 혼합된 영양공급 세포를 3D 배양을 위해 본원에서 설명한 바와 같이 배치한다. 배양된 조직은 약물 스크리닝 또는 민감성 검사, 또는 다른 검사 또는 사용을 위한 세포 수거를 위해 사용될 수 있다
본 발명의 일 실시형태는 환자에게 직접 이식하기 위한 세포 또는 조직을 배양하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 6은 모낭 줄기세포 및 진피 내피세포를 배양하여 이를 환자의 피부에 이식하기 위한 예시적인 프로토콜을 나타낸다. 이 경우에, 표적 세포 및 영양공급 세포는 배양된 세포가 이식될 예정인 환자로부터 얻을 수 있다. 환자로부터 모발 조직 샘플을 얻고, 모발 조직 샘플을 단일 세포 단리 과정에 적용하고 MACS와 같은 세포 분리 기술을 사용하여 모낭 줄기세포 및 진피 내피세포를 각각 수거한다. 진피 내피세포를 배양하여 세포 덩어리를 증가시키는데, 이는 모낭 줄기세포 배양을 위한 영양공급원으로서 사용될 뿐만 아니라, 환자에서 모발을 재성장시키기 위해 배양된 모낭 줄기세포와 함께 환자에게 이식될 수 있다.
인간 폐암 세포를 본 발명의 실시형태를 사용하여 배양하였다. 도 7 및 도 8은 본 발명의 일 실시형태에 따라 성장시킨 인간 폐암 콜로니를 나타낸다. 마찬가지로, 도 9, 도 10 및 도 11은 본 발명의 실시형태를 사용하여 성장시킨 마우스 폐 줄기세포 콜로니 및 전체 조직을 나타낸다. 도 12a는 2일부터 7일까지의 3D 배양된 마우스 간관의 상이한 크기를 나타낸다. 도 12b는 3D 배양된 마우스 간관의 면역형광 이미지이다.
도 13 및 도 14는 각각 3D 배양으로 성장시킨 마우스 정조 줄기세포 콜로니 및 마우스 췌관 줄기세포 콜로니의 사진이다.
3D 배양으로 성장시킨 다양한 줄기세포 콜로니는 줄기세포 치료, 신약 발굴, 약물 민감성 검사 및 기타 줄기세포 과학에서 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 3D 배양 방법 및 시스템은 종래의 방법 및 시스템보다 짧은 시간 내에 줄기세포 콜로니 또는 조직을 성장시킬 수 있다. 예를 들어, 암은 대개 빠른 속도로 성장하므로 암 환자는 신속한 약물 스크린 또는 세포 치료법을 필요로 하기 때문에, 그 속도는 본 방법 및 시스템을 환자-특이적 약제로서 활용하는 데 특히 중요하다.
또한, 본 발명에 따른 3차원 배양 시스템 및 방법은 배양된 세포 또는 조직을 장시간 동안 유지시킨다. 필요하다면, 배양된 세포는 수개월 또는 심지어 더 오래 생존할 수 있다. 이것은 신약 발굴 또는 검사를 위해 매우 중요한 특징이다.
신약 발굴 또는 검사를 위해, 다중 배양 웰을 사용할 수 있다. 도 15는 2가지의 상이한 다중 배양 웰의 예를 도시한다. 각각의 웰(600)은 3D 배양 시스템을 가질 수 있다. 각각의 웰이 동일한 3D 배양 시스템을 가질 수 있기 때문에, 이러한 시스템들은 종종 상이한 물질, 예를 들어 항암제에 대한 반응을 비교하는 데 사용된다. 도 16은 암 세포가 의학적 처리의 유무에 따라 상이하게 성장함을 도시하며, (b)의 세포는 (a)의 세포와 비교하여 성장 부족을 나타낸다.
하기 실시예는 단지 설명하기 위한 것이다. 본 발명의 범위는 이러한 실시예로 한정되지 않아야 한다.
실시예 1. 폐암 세포 단리
a. 종양 조직을 가위로 가능한 한 작게 세절하고 이를 해리 용액에 넣는다.
- 해리 용액: HBSS 중의 콜라게나 II형/DNase I
b. 세절된 종양 조직을 37℃에서 40분 동안 항온배양하고 중화를 위해 동일 용적의 FBS를 첨가한다.
c. 분해된 장기를 100 μM를 통해 여과한다.
d. 여과된 단일 세포를 10분 동안 1000rpm으로 스핀(spin)한다.
e. 세포 펠렛을 PBS로 세척하고 5분 동안 1000rpm으로 스핀 다운(spin down)한다(3회).
i. 펠렛에서 RBC를 발견할 수 있는 경우에는 다음의 상품 설명서에 따라 RBC 용해 완충액을 사용한다.
실시예 2. 폐암 세포와 영양공급 세포의 플레이팅(HMVEC 및 폐암 세포주)
a. 암 조직으로부터 단일 폐암 세포의 수를 카운팅한다.
b. 영양공급 세포용 1×105개의 HMVEC를 준비한다.
c. 접시의 측면 내 HMVEC 조정 배지(전체 혼합물의 20%)를 포함하는 마트리겔 혼합물에 100μL의 HMVEC(5×105)를 넣고 이를 37℃에서 45분 동안 항온배양한다.
d. 1×105개의 단일 폐암 세포를 마트리겔 및 EGF/FGF-2 성장 인자를 함유하는 조정 배지와 혼합한다.
e. 폐암 세포의 혼합물을 96웰 또는 12웰의 중앙에 놓고 이를 37℃에서 45분 동안 항온배양한다.
f. 3D 폐암 세포 혼합물을 고형화시킨 후, 조정 배지를 웰에 첨가한다.
g. 약물을 다음의 농도로 96웰 및 12웰에 첨가한다.
ii. 3D 오가노이드를 5일 내지 7일 동안 3일마다 약물로 처리한다.

Claims (9)

  1. 3D 오가노이드의 생산 방법으로서, 상기 방법은:
    a. 표적 세포 또는 조직을 포함하는 제1 배지를 배양 기판(culture substrate) 상에 제공한 후 고형화하는 단계 및
    b. 제2 세포를 포함하는 제2 배지를 상기 배양 기판(culture substrate) 상에 제공한 후 고형화하는 단계를 포함하고,
    상기 제2 배지는 상기 제1 배지로부터 물리적으로 분리되어 3D 오가노이드(organoid)를 생산하는 방식으로 배치되고,
    상기 제2 배지 중의 제2 세포가 내피세포인, 3D 오가노이드의 생산 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제2 세포가 장기 특이적 내피세포인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 제3 세포를 포함하는 제3 배지를 추가로 포함하고, 상기 제3 배지가 제1 배지 및 제2 배지로부터 물리적으로 떨어져 배치되는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 제3 세포가 표적 세포와 유사한 세포이거나 표적 세포와 동일한 종류의 세포인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 표적 세포가 암 세포인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 내피세포가 인간 진피 미세혈관 내피세포인, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 암 세포주가 이질성(heterogenecity)이 없는 단일 세포주인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 마트리겔(matrigel) 혼합물을 제1 배지 위에 제공하는 단계를 추가로 포함하고, 상기 마트리겔 혼합물이 약 6:4 내지 약 8:2의 비율을 갖는 마트리겔과 제4 배지의 혼합물인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, 탈착식 플레이트가 상기 배양 기판(culture substrate)상에 배치되는, 방법.
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KR20240064196A (ko) 2022-11-04 2024-05-13 호서대학교 산학협력단 3차원 배양을 통한 폐포 조직 유사 3d 폐세포 모델 제조방법

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