CN104988111A - 用于将uc-msc转化为胰岛细胞的诱导液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于将UC-MSC分化为胰岛细胞的诱导液及其应用，该诱导液包括尼克酰胺和碱性成纤维细胞生长因子，尼克酰胺能够促进细胞的增殖分化，碱性成纤维细胞生长因子能够促进细胞加速增殖,细胞体积增大。因此，采用本发明提供的诱导液诱导UC-MSC分化的胰岛细胞不仅数量较多，细胞体积较大，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素，对于临床移植UC-MSC治疗1型糖尿病具有重要意义。

Description

用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程、组织工程和生物医药领域，特别涉及用于将UC-MSC诱导转化为胰岛细胞的诱导液。

背景技术

糖尿病是胰岛素分泌相对或绝对不足或胰岛素受体等缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱性疾病。临床上，Ⅰ型及部分Ⅱ型糖尿病多采用皮下注射胰岛素来治疗。而细胞治疗是糖尿病尤其是Ⅰ型糖尿病的理想治疗策略，尤其对于已经丧失胰岛细胞功能的糖尿病患者来说，植入能分泌胰岛素的胰岛细胞或其替代物是最理想的治疗方法。目前，胰岛细胞移植治疗糖尿病取得了一些疗效，但供者细胞来源不足、严重的免疫排斥反应等困难极大的限制了这种疗法的应用。

干细胞具有极强的自我更新能力及多向分化潜能，是基因治疗的理想靶细胞。干细胞分为全能干细胞(如胚胎干细胞，可以分化为机体所有组织细胞)、多能干细胞胞(具有多向分化潜能，可以分化为多种组织细胞，如间充质干细胞等)和专能干细胞(维持某一特定组织细胞的单一方向自我更新，如肠上皮干细胞等)。干细胞技术的不断突破及干细胞本身所具有的特性使人类有可能在体外培养某些干细胞，定向诱导其分化为我们所需要的各种组织细胞，或作为种子细胞用于组织工程以供临床所需，以此为目的的干细胞工程涉及人体几乎所有重要组织器官及人类面临的大多数医学难题，如心血管疾病、糖尿病、恶性肿瘤、骨及软骨缺损、老年性痴呆、帕金森病、烧伤、脊髓损伤和遗传性缺陷等的治疗。由于人羊水、脐带血、外周血和骨髓中的多能干细胞，具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点，此类干细胞移植在血液系统疾病、恶性肿瘤、自身免疫性疾病等的治疗中发挥了重要的作用。

对干细胞进行适当的基因修饰，使之成为能分泌胰岛素的细胞，是治疗Ⅰ型糖尿病的理想策略之一，而将干细胞分化为胰岛细胞过程中，诱导液起到至关重要的作用，针对干细胞不同的诱导方式，所需要的诱导液不同。然而，现有技术中最常用的诱导干细胞分化为胰岛细胞的方法为应用插入式细胞培养皿共培养板体外诱导UC-MSC(即脐带间充质干细胞)向胰岛样细胞分化具体为：选取第3代UC-MSC，用含10％FBS(胎牛血清)的L-DMEM培养基重悬细胞，调整细胞密度为1×105个/ml，接种于普通6孔板，倒置显微镜下观察细胞贴壁后，改为L-DMEM/RPMI 1640(1:1)培养基(低糖型改良杜氏伊格尔培养基与RPMI 16401:1混合而成的培养基)；同时将已分离获得的胰岛细胞，以50个/孔接种于共培养板的中，进行UC-MSC和胰岛细胞两种细胞的共培养。然而，此种共培养方法不仅需要一定的胰岛细胞源，过程较繁琐，花费较大，而且所获得的更多为散在胰岛样细胞，数量较少，胰岛细胞团几乎没有，而且散在的胰岛样细胞相对较小，胰岛素分泌量少难以达到临床移植要求。目前，也有研究者正在研究一种将UC-MSC直接诱导成胰岛细胞的方法，因此，迫切需要一种用于将UC-MSC直接诱导成胰岛细胞的诱导液。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对现有技术中诱导液诱导UC-MSC与胰岛细胞共培养方式所获得的胰岛细胞较小，数量较少，且花费较大等缺陷，提供一种可将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液，所述诱导液包括尼克酰胺和碱性成纤维细胞生长因子。

在本发明提供的UC-MSC转化为胰岛细胞的方法中，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为5-15mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5-15μg/L。

在本发明提供的UC-MSC转化为胰岛细胞的方法中，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为10mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10μg/L。

在本发明提供的UC-MSC转化为胰岛细胞的方法中，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5μg/L。

在本发明提供的UC-MSC转化为胰岛细胞的方法中，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为15mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15μg/L。

本发明进一步保护上述诱导液在UC-MSC转化为胰岛细胞中的应用。

实施本发明提供的用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液，可以达到以下有益效果：该诱导液能够促进UC-MSC增大和增殖转化，促进UC-MSC转化成胰岛细胞团以及增大胰岛细胞，对于改善现有UC-MSC与胰岛细胞共培养获得胰岛细胞的方法具有重要的意义；由本发明提供的诱导液在UC-MSC转化为胰岛细胞过程中的应用可知，本发明提供的诱导液不仅省去现有诱导方法中前期获取胰岛细胞的过程，而且使得UC-MSC转化成的胰岛细胞数量较多，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素。

附图说明

下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：

图1为采用本发明提供的诱导液诱导UC-MSC转化成的胰岛细胞通过双硫腙染色得到的显微镜下的细胞分布图；

图2为采用本发明提供的诱导液诱导UC-MSC转化成的胰岛细胞通过双硫腙染色得到的显微镜下的细胞分布放大图。

具体实施方式

为解决现有技术中诱导液诱导UC-MSC与胰岛细胞共同培养方式所获得的胰岛细胞较小，且数量较少等缺陷，本发明的创新点在于提供一种可促进UC-MSC转化成胰岛细胞的诱导液，该诱导液可促进细胞增殖、增大，从而实现了提高UC-MSC转化率及提高转化后胰岛细胞质量的目的。

具体地，本发明提供的用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液包括：尼克酰胺和碱性成纤维细胞生长因子，优选地，尼克酰胺的浓度为5-15mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5-15μg/L。尼克酰胺的主要作用是参与呼吸链，参与细胞增殖转化的呼吸过程及电子传递过程，促进细胞的增殖转化；碱性成纤维细胞生长因子可促进细胞加速增殖,细胞体积增大，因此，本发明提供的诱导液能够促进UC-MSC的增殖转化，同时，促进UC-MSC细胞和胰岛细胞体积的增大。

采用本发明提供的诱导液将UC-MSC转化为胰岛细胞的方法步骤为：

取第三代UC-MSC，置于培养箱中，并按以下步骤对第三代UC-MSC进行诱导：

1)在细胞培养基中加入第一种诱导液，培养至细胞完成增殖过程，获得预转化干细胞体；

2)在含有质量分数为1％-5％的胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基中，加入第二种诱导液，培养上述预转化干细胞体至细胞转化结束，获得胰岛细胞液；

其中，第一种诱导液为5-15mmol/L尼克酰胺、15-30μg/L表皮生长因子、60μg/L-150μg/Lβ-神经生长因子和1-10nmol/L激活素A、5-15μg/Lβ-琉基乙醇；

第二种诱导液包括5-15mmol/L尼克酰胺和5-15μg/L碱性成纤维细胞生长因子；

含有胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基可促使预转化干细胞体定向转化成胰岛细胞。

与现有技术相比，采用本发明提供的诱导液，能够对UC-MSC分步进行转化，使得UC-MSC可直接转化成胰岛细胞，而无需将UC-MSC与胰岛细胞共培养获得转化后胰岛细胞，并且采用本发明提供的诱导液可促进UC-MSC细胞的增殖和增大，促进胰岛细胞团的形成，提高胰岛细胞的转化率。

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

在本发明提供的UC-MSC转化为胰岛细胞的方法包括以下步骤：

(1)UC-MSC的分离培养

无菌条件下取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，脐带离体后浸泡于每毫升含25U肝素钠的生理盐水中进行4-6h处理后，超净台内剔除脐带的动静脉，剥去外层羊膜，将脐带切成1mm×1mm×1mm大小的组织块并贴于培养皿底，加入含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM置于37℃、5％CO2饱和湿度培养箱中进行培养，培养2周后移除，待贴壁细胞达到80％-90％汇合时进行传代培养。

其中，含体积分数为10％胎牛血清的低糖DMEM(dulbecco's modifiedeagle medium，改良杜氏伊格尔培养基)成分为：含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、15ug/L的IL-3、5ug/L粒细胞集落刺激生物因子、1.0-3.3g/L葡萄糖。

当然可以理解的是，第三代UC-MSC的来源方式也并不局限于此，现有技术中可获取的第三代UC-MSC均适用于本发明。

(2)UC-MSC的诱导转化

1)在体积分数为30％胎牛血清的DMEM/F12培养基中加入含150μg/Lβ-神经生长因子，10nmol/L激活素A，5mmol/L尼克酰胺，30μg/L表皮生长因子，10μg/Lβ-琉基乙醇的第一种诱导液，在37℃和5％CO2的培养箱中培养7d至细胞完成增殖过程，获得预转化干细胞体；

添加含10mmol/L尼克酰胺，10μg/L碱性成纤维细胞生长因子的第二种诱导液，和含有质量分数为1％的胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基，在37℃和5％CO₂的培养箱中对预转化干细胞体培养14d至细胞转化结束，获得胰岛细胞液。

(3)胰岛细胞的分离

弃去上述培养液上清，用磷酸盐溶液(下称PBS缓冲液)清洗2次，加入L-DMEM(低糖型改良杜氏伊格尔培养基，葡萄糖浓度为1.0-3.3g/L)培育1-2h后，收集上清，PBS洗2次，再换为H-DMEM(高糖型改良杜氏伊格尔培养基，葡萄糖浓度为3.15-4.5g/L)培育1-2h，收集上清，即为分离后的胰岛细胞。

实施例2

该实施例与实施例1相比，除第三代UC-MSC的诱导转化步骤2)有所区别以外，其他过程步骤均相同。

该实施例中，第三代UC-MSC的诱导转化步骤2)为：

添加含5mmol/L尼克酰胺，5μg/L碱性成纤维细胞生长因子的第二种诱导液，和含有质量分数为3％的胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基，在37℃和5％CO2的培养箱中对预转化干细胞体培养14d至细胞转化结束，获得胰岛细胞液。

实施例3

该实施例与实施例1相比，除UC-MSC的诱导转化步骤2)有所区别以外，其他过程步骤均相同。

该实施例中，UC-MSC的诱导转化步骤2)为：

添加含15mmol/L尼克酰胺，15μg/L碱性成纤维细胞生长因子的第二种诱导液，和含有质量分数为5％的胰岛素-转铁蛋白-硒的DMEM/F12培养基，在37℃和5％CO2的培养箱中对预转化干细胞体培养14d至细胞转化结束，获得胰岛细胞液。

为进一步验证本发明提供的诱导液在UC-MSC转化为胰岛细胞过程中所起到的有益效果，对本发明实施例1-3中所获得胰岛细胞分别进行相应参数的测定，主要包括胰岛细胞率、C肽分泌量和胰岛素分泌量的测定；并通过设置对照组对比突出本发明的有益效果，对照组为通过利用现有技术中的诱导液诱导UC-MSC和胰岛细胞所获得的胰岛细胞,详见本发明说明书背景技术部分。

具体测定过程为：

1、采用流式细胞术检测胰岛细胞百分率

分别对本发明实施例1-3中诱导的胰岛细胞液以及对照组诱导第17d后的细胞培养上清液分别进行如下操作：用质量分数为0.25％胰蛋白酶消化后,PBS缓冲液洗涤3次,1000rpm离心5min,弃上清,加入insul in-CY5(胰岛素CY5荧光标记苏素),流式细胞仪计数105个细胞；分别进行6组平行实验胰岛细胞可被insul in-CY5标记，通过流式细胞器自带的软件分析可得出表1中胰岛细胞率的数据。

2、利用放射免疫法检测胰岛细胞分泌的胰岛素和C肽含量

分别对本发明实施例1-3中诱导的胰岛细胞液以及对照组诱导第17d后的细胞培养上清液分别进行如下操作：吸取培养上清液0.5ml于移液管中，-20℃冻存留取标本。按照北京福瑞生物工程公司的人胰岛素和C肽放免试剂盒说明测定留取标本中胰岛素和C肽的含量，测定结果如表1所示。

表1：

由表1可知，通过采用本发明提供诱导液诱导UC-MSC转化的胰岛细胞率远大于现有技术，且由C肽分泌量和胰岛素分泌量可知，转化后的胰岛细胞利用率较高，因此，本发明提供的诱导液不仅提高了胰岛细胞的数量，也提高了胰岛细胞的质量。

除此之外，通过设置双硫腙染色法来进一步验证通过采用本发明提供的诱导液诱导UC-MSC转化为胰岛细胞的方法能够提高胰岛细胞数量并获得的胰岛细胞团；本次测试对象为：1、实验组-本发明实施例1获得胰岛细胞；2、对照组-以现有技术中UC-MSC和胰岛细胞共培养方式诱导获得的胰岛细胞，详见本发明说明书背景技术部分；

具体步骤为：

1、配制双硫踪工作液:将50mg双硫腙溶于5毫升DMSO(二甲基亚砜)，过滤、分装贮存于-20℃保存。

2、将实验组和对照组分别以磷酸盐溶液洗涤2次,各加入l毫升的磷酸盐溶液和10μL的双硫腙工作液(终浓度1％,V/V),37℃孵育15min,倒置显微镜下观察胰岛细胞着色情况，分别如图1和图2所示。图1中深色部分代表通过本发明提供的方法诱导出的胰岛细胞，从图中可以看出，胰岛细胞聚集成团，面积较大，且数量较多；图2深色部分代表通过现有技术诱导出的胰岛细胞放大图，从图中可以看出胰岛细胞较分散、不成团，胰岛细胞数量相对较少。

综上所述，本发明提供的用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液，能够促进UC-MSC增殖转化以及增大UC-MSC，同时促进UC-MSC转化成胰岛细胞团、增大胰岛细胞，对于改善现有UC-MSC与胰岛细胞共培养获得胰岛细胞的方法具有重要的意义；由本发明提供的诱导液在UC-MSC转化为胰岛细胞过程中的应用可知，本发明提供的诱导液不仅省去现有诱导方法中前期获取胰岛细胞的过程，而且使得UC-MSC转化为胰岛细胞的过程更易操作，同时可减少花费，而且最终所获得胰岛细胞数量较多，且胰岛细胞质量较好，能够分泌较多的胰岛素，对于临床移植UC-MSC治疗1型糖尿病具有重要意义。

以上结合附图对本发明的实施例进行了描述，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式，上述的具体实施方式仅仅是示意性的，而不是限制性的，本领域的普通技术人员在本发明的启示下，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，还可做出很多形式，这些均属于本发明的保护之内。

Claims (6)

1.一种用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液，其特征在于：所述诱导液包括尼克酰胺和碱性成纤维细胞生长因子。

2.根据权利要求1所述的用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液，其特征在于，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为5-15mmol/L和碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5-15μg/L。

3.根据权利要求2所述的用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液，其特征在于，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为10mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10μg/L。

4.根据权利要求2所述的用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液，其特征在于，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为5mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为5μg/L。

5.根据权利要求2所述的用于将UC-MSC转化为胰岛细胞的诱导液，其特征在于，所述诱导液中尼克酰胺的浓度为15mmol/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15μg/L。

6.根据权利要求1-5任一项所述的诱导液在UC-MSC转化为胰岛细胞中的应用。