CN105779383A - 一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种脂肪干细胞‑水凝胶三维培养体系的制备方法及应用，所述方法包含如下步骤：将脂肪干细胞与RADA肽水溶液、定向分化药物的水溶液混合，然后加入磷酸盐缓冲溶液或细胞培养液，36.5‑37.5℃孵育诱导，从而形成所述的脂肪干细胞‑水凝胶三维培养体系。用本发明方法获得的脂肪干细胞‑水凝胶三维培养体系可直接应用到体内进行组织再生和修复，由于是自体干细胞来源，因此无免疫排斥反应，并且本发明的方法培养脂肪干细胞的存活率高，分化效率高，生产成本低。

Description

一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及干细胞和再生医学领域，具体涉及一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的制备方法及应用。

背景技术

干细胞(Stemcells，SCs)是能够分化成组成肌体组织的多种细胞类型的细胞。干细胞处于未分化状态，可在一定的刺激条件(例如环境刺激)下分化成具体的细胞类型。干细胞总体上分为两类，即胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞分离自胚胎，具有分化成所有细胞类型的潜能，因此胚胎干细胞具有全能性(美国专利申请号20130023048A1)。成体干细胞是指存在于已经分化的组织中的未分化细胞，这种细胞能够自我更新并且能够特化形成组成该类型组织的细胞，因此具有多能性。成体干细胞存在于机体的各种组织器官中。成年个体组织中的成体干细胞在正常情况下大多处于休眠状态，在病理状态或在外因诱导下可以表现出不同程度的再生和更新能力。

由于干细胞具有分化成多种细胞组织的潜能，因此可以作为一种理想的生物学平台，用于多方面的科学研究与临床应用，如药物筛选平台的建立、细胞发育与分化的分子调节机制研究、基因靶向敲除动物模型的构建、组织工程种子细胞及基因治疗载体的建立、细胞治疗及再生医学等。在目前研究的各种干细胞中，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)由于具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点而日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为例如脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤的修复。

脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，其主要组成为脂肪间充质干细胞。研究发现ADSCs细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时它具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且其来源广泛，体内储备量大，适宜自体移植，逐渐成为近年来新的研究热点之一(中国专利申请号CN104611290A)。现有的研究表明，脂肪干细胞在特定的诱导条件下，具有分化为同胚层来源的成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，外胚层来源的神经细胞、表皮细胞，内胚层来源的肝细胞、内皮细胞、分泌胰岛素的β样细胞等不同胚层来源细胞的潜能。脂肪干细胞在不同诱导条件下的分化方向不同，因此构建脂肪干细胞的定向分化培养体系对于脂肪干细胞用于组织工程和再生医学具有非常重要的意义。

当前的主流干细胞培养体系主要采用二维细胞培养技术，细胞在平板表面或者培养瓶中以单层形式贴壁生长(参见图1)。二维细胞培养技术不能模拟细胞在人体内生长的三维环境，细胞间、细胞与胞外基质间的联系极少，细胞在生长过程中易失去其原有的形态特征及生长分化能力，因此对干细胞的培养十分不利。而且，由于细胞在平板表面贴壁生长，干细胞二维培养后往往需要经消化后再注射，对细胞活力的损失较大，并且细胞消化后表面抗原消失，易受机体免疫系统的攻击，不利于干细胞体内存活，再生组织的形成效果较差。此外，干细胞二维培养的生产效率低和与之相伴随的成本高也是一个困扰干细胞组织工程的棘手问题。

因此近年来在利用干细胞的组织工程和再生医学领域，人们开始尝试使用三维的材料和体系来培养和定向分化干细胞。三维细胞培养是指将具有三维结构的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养,使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长,构成三维的细胞-载体复合物。

中国专利申请CN201110191645.4公开了一种人体iPS细胞未分化扩散的水凝胶培养支架的制备方法，其使用了合成高分子水凝胶为细胞培养支架，合成高分子凝胶具有化学结构明确、物理化学性能稳定且易于调控、无异物感染且易于灭菌并且廉价的优势。其中用于制备高分子的单体包括甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸甲酯、N-乙烯基吡咯烷酮、二甲基丙烯酸乙二醇酯、丙烯酰胺或者N,N’二甲基丙烯酰胺。

中国专利申请201310041348.0公开了一种模拟体内微环境的干细胞培养体系，其利用琼脂糖构建了三维支架材料，模拟体内微环境动态培养干细胞，并测试了经培养的脂肪干细胞维持自我更新、增值、归巢及向内皮细胞定向分化的能力。

中国专利申请CN201310299224.2涉及一种筛选乳腺癌干细胞的三维培养方法，其将乳腺癌细胞接种在由胶原制成的三维支架材料中进行培养，其中使用的胶原具体主要是利用鲑鱼凝血酶和鲑鱼胶原蛋白形成软凝胶。

中国专利申请CN201310737266.X涉及一种人脂肪间充质干细胞三维培养分化成神经样干细胞的方法，其中用于形成三维材料的聚胶溶液为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液。

中国专利申请CN201410490078.6公开了一种在三维悬浮条件下将多能干细胞体外定向分化为心肌细胞的方法，其中使用了特别用于所述的三维悬浮条件的培养基，包括用于将多能干细胞诱导分化为中胚层前体细胞的分化培养基、用于将中胚层前体细胞分化为心肌细胞的分化培养基以及心肌细胞的长期维持培养基。

中国专利申请CN201410499649.2公开了一种胶质瘤干细胞的体外三维培养模型。根据该申请，目前应用在制备3D细胞培养的主要材质包括天然有机物和无机大分子聚合物，天然有机物有胶原、壳聚糖、葡萄糖氨基聚糖类、藻酸盐、丝心蛋白、琼脂糖、淀粉；无机大分子聚合物有PGA(聚乙醇酸)、PLA(聚乳酸)、PLC(聚己内酯)、POE(聚原酸酯)及其多相聚合支架如PLGA等。该申请的发明人采用三维胶原支架为胶质瘤干细胞的细胞培养支架，在体外培养得到一个有效的体外三维培养模型。

美国专利申请US20080038236A1公开了一种包括生物相容性的蚕丝支架和脂肪干细胞的组合物，所述组合物用于减轻或治疗骨疾病或软组织疾病。

目前已有大量文献报道了定向分化药物在诱导脂肪干细胞定向分化中的作用，例如：(1)表皮生长因子(epidermalgrowthfactor，EGF)：EGF是一种单链多肽，可提高冷冻保存后的人ADSCs的增殖及成脂分化能力。(2)成纤维生长因子(fibroblastgrowthfactor，FGF)：FGF能够促进人脂肪干细胞的增殖及成脂成骨分化能力，FGF的这种促成脂成骨分化能力可能源于FGF促进细胞的增殖能力。同EGF一样，FGF也能促进冷冻保存后的人脂肪干细胞的增殖及成脂分化能力,并且与EGF有协同作用。(3)骨形成态蛋白(bonemorphogeneticprotein，BMPs)：BMPs是B-转化生长因子超家族的一员，它们参与调节细胞增殖、分化和凋亡。骨形成态蛋白多达20多种,其中BMP2、4、6、7可以影响脂肪干细胞的成骨分化。(4)自体富含血小板血浆或富含生长因子血浆(plateletrichplasma，PRP)：PRP是将全血进行离心所得到的含高浓度血小板的自体血浆，体外激活后血小板脱颗粒释放出多种生长因子。PRP可促进人ADSCs增殖并诱导其向成骨细胞转化，其可能机制为：PRP中多种生长因子协同作用刺激成骨前体细胞的有丝分裂，增加成骨细胞数量，促进其分泌形成细胞外基质。(5)地塞米松：低浓度的地塞米松是无血清或低血清培养间充质干细胞的必需成分，能够促进间充质干细胞的体外快速增殖；较高浓度的地塞米松则可以诱导脂肪干细胞的成脂分化。

目前，将定向分化药物结合三维培养体系诱导干细胞定向分化的研究较少。有少量研究将药物加入培养液中，药物通过扩散进入三维培养体系内促进三维培养体系中干细胞的分化，需要不断的更换培养液以维持药物的浓度，操作繁琐，不适合体内干细胞的定向分化研究与应用。也有研究者将药物混合在三维培养体系内，利用水凝胶体系的缓释效应促进三维培养体系中干细胞的分化，但药物尤其是大分子类药物释放较快，药物容易释放至三维培养体系外的介质中消除，往往三维培养体系内有效药物浓度只能维持2-3天，不适合体内干细胞的长期定向分化。

综上所述，虽然本领域已经研究和开发了几种用于不同类型干细胞的三维培养体系，但大多三维培养体系都存在以下几个方面的问题：(1)部分三维培养体系体内植入后难以生物降解。(2)定向分化药物不能长期缓慢释放，难以有效支持干细胞的长期扩增与分化。到目前为止，本领域仍然缺乏一种特别适用于培养和定向分化脂肪干细胞的理想的三维培养体系。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中缺乏适用于培养和定向分化脂肪干细胞的三维培养体系的问题，提供一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系。该体系可用于体内注射使用，在该体系中，脂肪干细胞能快速生长，而且在长效定向分化药物的作用下定向分化，提高干细胞用于体内组织再生与修复的效果。

本发明所要解决的上述技术问题通过以下技术方案予以实现：

本发明第一方面提供一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的培养方法，包含如下步骤：将脂肪干细胞与RADA肽水溶液、定向分化药物的水溶液混合，然后加入磷酸盐缓冲溶液或细胞培养液，36.5-37.5℃孵育诱导，从而形成所述的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系。

在水溶液中，RADA肽自组装形成纳米纤维，进而形成水凝胶。定向分化药物参与了水凝胶三维体系的形成并锚定在水凝胶的骨架纤维上，药物缓释效果持久，而且药物可与直接接触干细胞，持续促进其扩增与定向分化。该脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系特别适合体内植入后的组织再生。

在一个优选的实施方式中，脂肪干细胞与RADA肽水溶液的比例是每毫升RADA肽水溶液含1X10⁵-1X10¹⁰个脂肪干细胞。

在另一个优选的实施方式中，每毫升RADA肽水溶液含1X10⁶-1X10⁹个脂肪干细胞。

在另一个优选的实施方式中，所述RADA肽水溶液的浓度是0.1-5重量％。

在另一个优选的实施方式中，所述RADA肽水溶液的浓度是0.5-2.5重量％。

在另一个优选的实施方式中，所述定向分化药物的浓度是5ng/ml-1mg/ml。

在另一个优选的实施方式中，所述定向分化药物的浓度是10-1000ng/ml。

在另一个优选的实施方式中，所述的定向分化药物为蛋白或多肽类药物的PEG化衍生物。

在另一个优选的实施方式中，所述蛋白或多肽类药物的PEG化衍生物是蛋白或多肽类药物通过多功能PEG与RADA肽相连。

在另一个优选的实施方式中，所述多功能PEG为直链或支链PEG，分子量为400Da-5000Da。

在另一个优选的实施方式中，所述孵育诱导的时间为10分钟至48小时。

在另一个优选的实施方式中，所述孵育诱导的温度为37℃。

本发明第二方面提供一种脂肪干细胞制剂，所述制剂包含根据本发明第一方面的方法获得的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系，其中脂肪干细胞处于RADA肽形成的水凝胶中。

在一个优选的实施方式中，所述脂肪干细胞制剂中的脂肪干细胞是原代细胞或传代培养的细胞。

在另一个优选的实施方式中，所述制剂是试剂盒或药盒的形式。试剂盒或药盒中除包括脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系外还可包括说明书，说明书可用于指导使用该试剂盒或药盒，例如利用脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系进行实验室试验或用于临床用途。说明书例如可直接打印在试剂盒上或采用插页的形式。

本发明第三方面提供一种组合物，所述组合物包含本发明第二方面所述的脂肪干细胞制剂和至少一种药学上可接受的辅料或运载体。

在一个优选的实施方式中，所述组合物是药物组合物，可用于抗衰老、皮肤移植等多种用途。

本发明第四方面提供根据本发明第二方面所述的脂肪干细胞制剂的用途，其用于实验室试验或作为临床药物的应用。

在一个优选的实施方式中，所述作为临床药物的应用包括作为组织再生或/和修复的药物的应用。

本发明构建的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系具有以下优点：(1)可模拟体内生长环境的支架与基质，建立细胞间及细胞与胞外基质间的联系；(2)长效定向分化促进脂肪干细胞的组织再生；(3)直接注射，细胞活力高，有利于组织的再生；(4)自体干细胞来源，无免疫排斥反应；(5)生产效率高，降低生产成本。

附图说明

图1比较了细胞三维立体生长和二维贴壁生长。

图2显示了本发明的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的形成过程。

图3显示了本发明中脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的优势。

图4形象地显示了用本发明的方法形成的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系，该三维体系可直接用于注射到体内进行组织再生和修复。

图5形象地显示了用本发明的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系具有良好的体内定向分化成脂效果。**P<0.01，与定向分向干细胞水凝胶三维体系组(DX-ADSC)相比。

具体实施方式

除非另有说明，否则本文所用的所有科学和技术术语具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。一般而言，本文所用的命名和细胞培养、分子生物学、有机化学、组织工程、再生医学领域的实验室操作是本领域中公知和常用的。

定义

如本文所用，术语“一”指一或多个所指的对象。例如，“一”个细胞指一个或多个所指的细胞。

本领域一般技术人员理解，术语“约”指基于该术语所用的上下文可以有一定程度的变化，例如可以在±10％的范围内变化，例如“约”1分钟指在1分钟的±10％范围内的时间。

如本文所用，术语“脂肪干细胞(adipose-derivedstemcells，ADSCs)”指来源于脂肪组织的干细胞，具体而言，脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的具有多向分化潜能的干细胞。在本发明中，脂肪组织或脂肪原料没有特别限制，可以是来源于动物或人的任何部位的脂肪组织，优选哺乳动物尤其是人的脂肪组织。优选地，脂肪组织可以是腰部、臀部、腹部、大腿、上臂等部位的组织。人脂肪组织的一个方便和丰富的来源是吸脂术。脂肪干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，它取材容易、体内储备量大，适宜大规模培养、对机体损伤小、来源广泛、适宜自体移植。

如本文所用，术语“多能”或“多能性”或“多向分化潜能”指干细胞分化为多于一种细胞类型的细胞的能力。

如本文所用，术语“组织工程”指产生离体组织以用于组织替换或组织重建的过程。组织工程是“再生医学”的一个实例，“再生医学”涵盖了通过向损坏的组织和器官中掺入细胞、基因或其他生物学元件以及生物工程化的材料来修复或替代这些组织或器官的多种方法。

再生医学为伤口愈合以及为修复损坏的、退行性的或患病的组织提供了一种治疗选择。再生医学主要是利用了可再生的细胞(例如干细胞和/或组细胞)能够自我更新并发育为更成熟的专门化细胞的能力，例如再生医学中可将这些细胞施用到组织损伤、疾病或退行性组织的位点以促进这些组织的恢复或修复。

干细胞存在于动物体的整个发育阶段中。干细胞可发现于早期发育阶段的胚胎中，也可发现于胎儿或成人的器官或组织中。胚胎干细胞(embryonicstemcells，ESCs)通常是未分化的，并且具有分化成为多种不同的细胞和组织类型的能力。因此，胚胎干细胞应该在再生医学中具有巨大的应用潜力。但是，由于ESCs是来源于另一个个体(即，胚胎)，即不是自体移植，干细胞的接受者的免疫系统有可能排斥这些新的生物材料。已有报告称移植的ESCs可形成肿瘤。另外，胚胎干细胞尤其是人胚胎干细胞的使用有可能因为伦理道德的原因而受到限制，并且即使是在非人的动物中，ESCs也很难获得和大量增殖。

成体干细胞(adultstemcells，ASC)是胚胎干细胞的一个很好的替代。ASCs存在于多种成体组织中，可响应于正常的衰老过程、创伤或破坏性的疾病而分化出新的细胞从而修复受伤的组织和/或维持正常的组织。我们每个个体都带有一个ASCs库，这个ASCs库能够分化成不同类型的细胞和组织。与ESCs不同，这些成体干细胞可以自体移植以治疗疾病或受伤的组织。ASCs存在于骨髓、皮肤、脂肪、肝脏和脑中。因此，ASCs具有应用于再生医学的广阔前景。但是另一方面，ASCs在很多成体组织中存在的数量是很低的，而且ASCs的数目随着年龄的增加而减少。骨髓来源的干细胞在组织工程中的应用很有限，原因之一就是这种干细胞可获得的数目很少，而且它们容易分化。近年来也已经从分化的或部分分化的成体细胞中获得了诱导的多能干细胞(iPS)，但是获得iPS一般需要改变细胞或对细胞进行遗传修饰。

脂肪干细胞相对于其他来源例如骨髓来源的干细胞具有多种优势，例如(1)取材方便。脂肪组织储备丰富，取材痛苦小，目前一次吸脂术可获得200ml脂肪，分离出约1X10⁶干细胞，为骨髓分离量的40倍。(2)分离简单。外周脂肪经机械剪切，胶原酶消化和简单梯度离心即可获得脂肪干细胞。(3)易于培养。脂肪干细胞具有很强的体外扩增能力，多次传代(10-20代)后细胞增殖速度无明显减慢。(于婷等，脂肪来源间充质干细胞研究进展.军事医学科学院院刊.第32卷，第1期，2008年2月。)

如本文所用，细胞的三维培养是指将具有三维结构不同材料的载体与各种不同种类的细胞在体外共同培养，使细胞能够在载体的三维立体空间结构中迁移、生长，构成三维的细胞-载体复合物。参见图1，图1比较了细胞三维立体生长和二维贴壁生长。

RADA肽为含多个阴阳离子的多肽，可在水中溶解。在离子存在条件下可beta-折叠，由于该β折叠结构一侧是非极性疏水端，另一侧是由带有正负电氨基酸组成的亲水端，这类多肽分子又被称为“离子互补型自组装多肽分子”。在水溶液中，折叠肽在静电作用下自组装形成纳米纤维，进而形成水凝胶。参见图2和图3，图3显示了本发明中利用水凝胶构建脂肪干细胞三维培养体系的优势。图2显示了本发明所用RADA肽的分子结构，RADA肽的β折叠和形成的纳米结构及水凝胶。

可以利用脂肪干细胞的多种特征性表面抗原来鉴定用本发明的方法获得的脂肪干细胞的纯度。可利用多种抗原例如CD3、CD13、CD29、CD34、CD45、CD49e、CD59、CD73、CD90、CD105、HLA-ABC等来鉴定脂肪干细胞。

本领域技术人员可以用通用的方法检测脂肪干细胞的纯度和分化程度，如流式细胞仪法。检测时加入针对具体抗原的特异性抗体，抗体可以是完整的单克隆或多克隆抗体，也可以是具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段。加入的抗体与细胞表面抗原孵育一定时间，用流式细胞仪对细胞进行自动分析和分选。

由于脂肪干细胞具有多向分化能力，在一定的条件下对脂肪干细胞进行分化诱导，能够得到特定功能的分化细胞。

本领域技术人员可以使用通用方法对脂肪干细胞进行成脂诱导。例如可如国际专利申请WO2013/020492A1中所述，向培养基中加入地塞米松，例如地塞米松加1-甲基-3异丁基黄嘌呤，或地塞米松加胰岛素。低浓度的地塞米松是无血清或低血清培养间充质干细胞的必需成分，能够促进间充质干细胞的体外快速增殖，较高浓度的地塞米松可诱导间充质干细胞向脂肪细胞分化。如WO2013/020492A1中所述，本领域技术人员可使用通用的方法和染料对脂肪干细胞的成脂诱导进行检测。优选的染料例如OilRed(O)。

如上文所述，构建一种可用于体内注射使用的脂肪干细胞定向分化三维培养体系，使其在能快速生长，而且在长效定向分化药物的作用下定向分化，提高干细胞用于体内组织再生与修复的效果。

为实现上述目的，本发明第一方面提供一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的培养方法，所述方法包括以下步骤：将脂肪干细胞与RADA肽水溶液、定向分化药物的水溶液混合，然后加入磷酸盐缓冲溶液或细胞培养液，37℃孵育诱导，从而形成脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系；在该三维培养体系中培养所述脂肪干细胞，即可获得定向分化的脂肪干细胞。

在一个优选的实施方式中，脂肪干细胞与RADA肽水溶液的比例是每毫升RADA肽水溶液1X10⁵-1X10¹⁰个细胞。

在另一个优选的实施方式中，每毫升RADA肽水溶液含1X10⁶-1X10⁹个脂肪干细胞。

在另一个优选的实施方式中，所述RADA肽水溶液的浓度是0.1-5重量％。

在另一个优选的实施方式中，所述RADA肽水溶液的浓度是0.5-2.5重量％。

在另一个优选的实施方式中，所述定向分化药物的浓度是10-1000ng/ml。

在另一个优选的实施方式中，所述的定向分化药物为蛋白或多肽类药物的PEG化衍生物。

在另一个优选的实施方式中，所述蛋白或多肽类药物的PEG化衍生物是蛋白或多肽类药物通过多功能PEG与RADA肽相连。

在另一个优选的实施方式中，所述多功能PEG为直链或支链PEG，分子量为400Da-5000Da。

在另一个优选的实施方式中，所述37℃孵育诱导的时间为10分钟至48小时。

本发明构建的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系可直接用于注射到体内进行组织再生和修复。参见图4，图4形象地显示了用本发明的方法形成的干细胞和水凝胶的三维体系。

本发明还提供一种脂肪干细胞制剂，所述制剂包含由上述方法获得的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系，其中脂肪干细胞处于RADA肽形成的水凝胶中。

在一个优选的实施方式中，所述脂肪干细胞制剂中的脂肪干细胞是原代细胞或传代培养的细胞。所述传代培养的细胞可以是传代2-20次的细胞。

在另一个优选的实施方式中，所述制剂是试剂盒或药盒的形式。试剂盒或药盒中除包括干细胞-水凝胶三维培养体系外还可包括说明书，说明书可用于指导使用该试剂盒或药盒，例如利用干细胞-水凝胶三维培养体系进行实验室试验或用于临床用途。说明书例如可直接打印在试剂盒上或采用插页的形式。

本发明还提供一种组合物，所述组合物包含本发明的脂肪干细胞制剂和至少一种药学上可接受的辅料或运载体。

在一个优选的实施方式中，所述组合物是药物组合物，可用于抗衰老、皮肤移植等多种用途。

配制为药剂的药物组合物可以通过常规形式给药或施用，包括但不限于，肌肉内、皮下、真皮内、腹膜内、静脉内、口服、胃肠外、或局部给药。

本发明药物组合物的使用量可由有经验的医师根据具体情况确定，考虑的因素例如施用的途径，施用的目的，施用对象的健康状况、年龄、体重、性别和既往病史等等。

包括在本发明药物组合物中的药学上可接受的运载体可以是常用的运载体，包括例如乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、树胶、磷酸钙、海藻酸钠、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油、等等。除上述成分外，本发明的药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等等药学上常用的辅料。合适的药学上可接受的运载体和辅料可参见《雷明顿药物科学》(第19版，1995)

本发明的药物组合物可制成单位剂型或多剂型的形式。剂型可以是但不限于溶液、悬浮液、糖浆、粉末、颗粒、片剂、或胶囊。

本发明还提供根据本发明的脂肪干细胞制剂的用途，其用于实验室试验或作为临床药物的应用。

在一个优选的实施方式中，所述作为临床药物的应用包括作为组织再生或/和修复药物的应用。

下面将结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不以任何方式限制本发明的范围。下文实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，《分子克隆：实验室手册》，NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989中所述的条件，或按照制造商建议的条件。

实施例

实施例1.脂肪干细胞的分离

按照文献(例如WO2013/020492A1)中所述分离人脂肪干细胞。实验操作具体描述如下。

将来源于人吸脂术样本的脂肪组织洗涤，以除去血细胞：向含有脂肪的离心管中加入等量的生理盐水，拧紧盖子，晃动3min以充分洗涤脂肪组织，接着静止3-5min，使不同相分离，吸去下层水相；重复以上操作三次，直到下层液较为清澈。

胶原酶消化：吸弃生理盐水后，加预热的与脂肪等体积的含0.1％胶原酶I的DMEM，置恒温振荡器中，37℃,200rpm，消化lh，每隔15min晃动离心管5-10秒(使脂肪与胶原酶I充分接触)。收集沉淀：消化，2000rpm离心10min，弃去上层消化后的脂肪，收集两管的底层沉淀至一个新离心管，加DMEM至50ml，l000rpm离心8min洗涤一次。

过滤并计数：加DMEM至50ml，混匀，100μM滤器过滤去除未消化的组织块，加DMEM至50ml，吸取1ml计数细胞量及活力。

实施例2.脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的构建

准确称量RADA肽并溶解在去离子水中，搅拌均匀，形成约0.1重量％的RADA肽水溶液1ml。将实施例1分离得到的脂肪干细胞与RADA肽、定向分化药物RADA-PEG-FGF(100ng/ml)、RADA-PEG-EGF(100ng/ml)水溶液混合，混合比例为每毫升RADA肽水溶液约1X10⁶个脂肪干细胞，再加入50μl的磷酸盐缓冲溶液(20XPBS)，置于37℃温箱中过夜即形成脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系。

实施例3.脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的中药物的泄漏效果

同上制备不含脂肪干细胞的水凝胶三维体系，同时制备含游离FGF(20ng/ml)、EGF(20ng/ml)的RADA水凝胶三维体系。各取1g水凝胶放置在transwell供体池内，在受体池收集药物的释放液，酶联免疫法测定FGF和EGF的浓度，计算FGF、EGF的累计泄漏率或释放率和水凝胶三维体系体内的药物浓度。结果如图3所示：普通水凝胶2天后水凝胶内的FGF、EGF已完全释放至水凝胶外介质中，水凝胶内的FGF、EGF的浓度不足1ng/ml。而本发明的水凝胶21天后水凝胶内的FGF、EGF释放不足50％，水凝胶内的FGF、EGF的浓度仍高达10ng/ml以上。结果表明，本发明的水凝胶将非常有利于干细胞的体内增殖与定向分化。

实施例4.脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的定向分化成脂效果研究

同实施例2采用第2代的脂肪干细胞制备脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系和普通的干细胞水凝胶三维体系(FGF20ng/ml、EGF20ng/ml，10⁶个脂肪干细胞/ml)，采用细胞培养液培养28天，采用细胞计数仪测定细胞数目，OilRedO染色测定脂肪干细胞的成脂效果。OilRedO染色方法是本领域已知的，例如可按如下进行。染色：小心倒去培养液，将三维水凝胶采用OCT包埋，冰冻切片，用D-hanks轻缓漂洗，用10％中性甲醛固定细胞膜30min。加入0.5％OilRedO，染色1小时左右。脱色：75％酒精/60％异丙醇漂洗，除去多余的染料；复染，淡苏木染色lmin，PBS漂洗；甘油明胶封片，显微镜观察。每组样本随机选取5-10个视野进行拍照观察以考察成脂诱导分化效果。脂肪呈鲜红色，细胞核呈蓝色，间质无色。

实验结果表明：普通的干细胞水凝胶三维体系细胞数量为2.1±1.3X10⁹/ml，而本发明的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系细胞数量为1.1±0.5X10¹⁰/ml，细胞增殖的数量显著提高。OilRedO染色显示本发明的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系内85.3±16.3％的干细胞分化为脂肪细胞，而普通的干细胞水凝胶三维体系细胞的成脂细胞分化率仅为47.5±11.2％.

实施例5.脂肪干细胞-水凝胶三维体系的体内定向分化成脂效果研究

将祼鼠随机分为3组：普通干细胞水凝胶三维体系组(PT-ADSC)、脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系组(DX-ADSC)、干细胞溶液组(ADSC)。同实施例2采用第1代的脂肪干细胞制备脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系和普通的干细胞水凝胶三维体系(FGF20ng/ml、EGF20ng/ml，2X10⁶个脂肪干细胞/ml)。10％水合氯醛麻醉祼鼠，背部分别皮下注射0.5ml脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系、普通的干细胞水凝胶三维体系、干细胞溶液(含FGF20ng/ml、EGF20ng/ml，2X10⁶个脂肪干细胞/ml))。此后每周测定测定脂肪组织的体积(V＝0.5ab²，a、b分别为脂肪组织长径和短径)，28天后处死动物，取出脂肪组织称重。

实验结果如图5所示，三组动物背部植入部位脂肪体积随时间增加逐渐增大，28天后本发明的DX-ADSC组脂肪体积显著高于PT-ADSC和ADSC组。脂肪组织称重结果也显示DX-ADSC组显著高于PT-ADSC和ADSC组。上述结果表明，本发明的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系具有良好的定向分化成脂效果。

应理解，虽然上文详细描述了本发明的具体实施方式，但本领域技术人员在阅读了本发明讲授的上述内容之后，可对本发明做出各种改动或修改，这些改动或修改没有超出本发明的精神和范围，因此这些改动或修改作为本发明的等价形式同样落于本申请所附权利要求书限定的本发明范围内。

Claims (10)

1.一种脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系的培养方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：将脂肪干细胞与RADA肽水溶液、定向分化药物的水溶液混合，然后加入磷酸盐缓冲溶液或细胞培养液，36.5-37.5℃孵育诱导，从而形成所述的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂肪干细胞与RADA肽水溶液的比例是每毫升RADA肽水溶液含1X10⁵-1X10¹⁰个脂肪干细胞。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RADA肽水溶液的浓度是0.01-5重量％。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述37℃孵育诱导的时间为10分钟至48小时。

5.一种脂肪干细胞制剂，所述制剂包含用权利要求1的方法获得的脂肪干细胞-水凝胶三维培养体系，其中脂肪干细胞处于RADA肽形成的水凝胶中。

6.如权利要求5所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，所述脂肪干细胞制剂中的脂肪干细胞是原代细胞或传代培养的细胞。

7.如权利要求5所述的脂肪干细胞制剂，其特征在于，所述制剂是试剂盒或药盒的形式，试剂盒或药盒中还包括说明书。

8.一种组合物，所述组合物包含如权利要求5所述的脂肪干细胞制剂和至少一种药学上可接受的辅料或运载体。

9.如权利要求8所述的组合物，其特征在于，所述组合物是药物组合物，可用于抗衰老或皮肤移植。

10.如权利要求6所述的脂肪干细胞制剂的用途，其用于实验室试验或作为临床药物的应用。