CN115820546B - 一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法及其应用，本发明首次发现并验证了ucOCN具有显著促进棕色脂肪干细胞在诱导分化早期的成软骨分化的能力，且在棕色脂肪干软骨诱导分化晚期，加入ucOCN依然能保持高效的诱导效率，本发明提供的方法可以有效诱导脂肪干细胞成软骨分化，可以以脂肪干细胞为种子细胞制备得到大量软骨细胞以满足临床对软骨细胞的需求。

Description

一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法及其应用

技术领域

本发明属于干细胞与组织工程领域，具体涉及一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法及根据所述方法制备得到的具有软骨细胞特性的细胞。

背景技术

因疾病、创伤等原因引起的创伤性和退行性软骨组织损伤一直是困扰关节外科医生的一大难题。由于关节软骨缺乏血管、淋巴和神经分布，且软骨细胞被致密的软骨基质包绕，增殖及迁移能力弱，一旦发生损伤，很难自行修复。传统软骨缺损修复的方法有软骨下骨微骨折术、镶嵌式成形术及同种异体骨软骨移植等。近年来又出现了自体软骨细胞移植等新技术。但以上方法常受到供体数量不足、免疫排斥反应的限制，患者常面临多次手术且效果不佳的痛苦，远期疗效并不理想。长期的关节软骨损伤会引起关节疼痛、水肿等症状，患者逐步丧失运动及自理能力，给社会和家庭带来沉重负担。

近年来，随着生物材料及细胞生物学研究的不断深入，组织工程技术也广泛应用于构建人工软骨、修复软骨缺损，为软骨再生提供了新的思路。组织工程主要包括三个方面：种子细胞、细胞因子、生物支架。脂肪干细胞(Adipose-derived mesenchymal stemcells，ADSCs)作为组织工程的理想细胞主要在于其来源丰富，容易获得，相比与骨髓间充质干细胞而言，其具有更强的免疫调节能力，且具有增殖快、数量多等优点。促进脂肪干细胞成软骨的分化能力调节，有望成为组织工程软骨修复过程中的重要一环。然而，如何诱导脂肪干细胞高效的向软骨细胞分化，仍是一个有待解决的问题。

骨钙素(Osteocalcin，OCN)，是骨中含量最丰富的非胶原蛋白。该蛋白存在两种形式，即羧化完全的骨钙素(Carboxylated osteocalcin，cOCN)和羧化不全的骨钙素(Undercarboxylated osteocalcin，ucOCN)，其中，cOCN主要沉积在骨基质中，其在成骨细胞中的作用已得到了广泛研究，cOCN在一定条件下可发生脱羧改变，这种羧化不全的骨钙素(ucOCN)进入循环系统，发挥内分泌作用。近年来，关于ucOCN的研究得到了很多喜人的结果，主要集中在ucOCN能够促进能量代谢、改善男性生殖能力、改善认知等，然而ucOCN在干细胞成软骨分化中的作用尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何体外高效的获得具有软骨细胞特征的细胞，为了解决上述技术问题，本发明提供了一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法，所述方法的具体步骤为：在体外进行棕色脂肪间充质干细胞成软骨定向分化的过程中加入ucOCN，使得分化效率显著提高。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

本发明的第一方面提供了一种促进脂肪间充质干细胞成软骨分化的方法。

进一步，所述方法包括在脂肪间充质干细胞成软骨分化诱导培养基中加入ucOCN；

优选地，所述ucOCN的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述ucOCN为非羧化形式的骨钙素。

在本发明的具体实施方案中，所述ucOCN选择如下(1)-(4)中的任意一种生物材料：

(1)ucOCN蛋白质；

(2)哺乳动物体内提取纯化获得的(1)物质；

(3)可持续分泌(1)物质的哺乳动物细胞；

(4)生物工程方法获取得到的与(1)物质结构一致的物质。

进一步，上述(1)-(4)中的任意一种生物材料或其任意组合在促进脂肪间充质干细胞成软骨分化中的应用均在本发明的保护范围内，所述ucOCN优选为氨基酸序列如SEQID NO:1所示ucOCN。

进一步，本发明通过实验首次发现并验证了所述ucOCN能够显著提升棕色脂肪间充质干细胞成软骨分化的效率，促进棕色脂肪间充质干细胞定向软骨分化，根据本发明提供的方法能够制备得到具有哺乳动物透明软骨性质的细胞，且所述细胞中软骨标志物COL2a1、SOX9的表达水平显著升高，所述细胞基质中AGAN的表达也显著升高，进一步表明了所述ucOCN具有促软骨分化能力。

进一步，本发明所提供的方法与常规成软骨定向诱导分化的方法相比，培养液中加入了5-10ng/mL的ucOCN。

进一步，所述常规成软骨定向诱导分化的方法，在加入ucOCN之前其特征为：具备维持离体干细胞生存、增殖的能力，且具有诱导离体干细胞定向成软骨分化的能力。

进一步，本发明所提供的方法与常规成软骨定向诱导分化的方法相比，其特征为加入ucOCN后，促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的能力显著增强。

进一步，根据本发明所提供的上述方法制备得到的具有软骨性质的细胞也在本发明的保护范围内。所述具有软骨性质的细胞具有以下特性：

(1)本发明所提供的方法与所述常规软骨定向诱导分化的方法相比，得到的软骨样细胞COL2a1表增高；

(2)本发明所提供的方法与所述常规软骨定向诱导分化的方法相比，得到的软骨样SOX9表达增高；

(2)本发明所提供的方法与所述常规软骨定向诱导分化的方法相比，细胞基质中AGAN的表达更丰富。

进一步，所述方法具体包括如下步骤：

(1)分离脂肪间充质干细胞；

(2)将步骤(1)中分离得到的脂肪间充质干细胞加入到含有ucOCN的成软骨诱导分化培养基中进行诱导培养。

进一步，步骤(1)中所述脂肪间充质干细胞为棕色脂肪间充质干细胞；

优选地，步骤(1)中所述脂肪间充质干细胞为离体的哺乳动物棕色脂肪间充质干细胞；

优选地，步骤(2)中所述ucOCN的用量为5-10ng/mL；

更优选地，步骤(2)中所述ucOCN的用量为10ng/mL；

优选地，步骤(2)中所述成软骨诱导分化培养基中还含有基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3；

更优选地，所述基础培养基为DMEM培养基；

更优选地，每200mL成软骨诱导分化培养基中含有194mL DMEM培养基、2mL ITS添加物、600μL抗坏血酸、200μL脯氨酸、200μL丙酮酸纳、20μL地塞米松、2mL TGF-β3；

优选地，步骤(2)中所述脂肪间充质干细胞的细胞密度为6-8×10⁵个/mL；

优选地，步骤(2)中所述诱导培养的时间为3-21天；

更优选地，步骤(2)中所述诱导培养的时间为21天。

进一步，本文中所述的脂肪间充质干细胞，是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，它是来源于脂肪组织的一种间充质干细胞，可以分化为成骨细胞、软骨细胞或脂肪细胞等，脂肪间充质干细胞能够在体外稳定增殖且衰亡率低，同时具有取材容易、少量组织即可获取大量干细胞，适宜大规模培养，对机体损伤小等优点，而且来源广泛，可从全身多处部位提取，体外储备量大，适宜自体移植。与其他来源干细胞相比，还具有增殖快、数量众多、免疫源性低、不易造成损伤等优点。

本发明的第二方面提供了一种诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化的诱导液。

进一步，所述诱导液中含有ucOCN；

优选地，所述ucOCN的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

进一步，所述诱导液中还含有地塞米松、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3。

进一步，所述诱导液中ucOCN的含量为5-10ng/mL；

优选地，所述诱导液中ucOCN的含量为10ng/mL；

优选地，每200mL诱导液中含有2mL ITS添加物、600μL抗坏血酸、200μL脯氨酸、200μL丙酮酸纳、20μL地塞米松、2mL TGF-β3。

本发明的第三方面提供了一种诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化的诱导分化培养基。

进一步，所述诱导分化培养基还含有基础培养基、本发明第二方面所述的诱导液；

优选地，所述基础培养基为DMEM培养基。

本发明的第四方面提供了一种脂肪间充质干细胞来源的软骨样细胞群体。

进一步，所述软骨样细胞群体为采用本发明第一方面所述的方法诱导分化得到的；

优选地，所述软骨样细胞中COL2a1的表达显著升高；

优选地，所述软骨样细胞中SOX9的表达显著升高；

优选地，所述软骨样细胞基质中AGAN的表达显著升高。

本发明的第五方面提供了一种用于软骨损伤修复的药物组合物。

进一步，所述药物组合物中含有本发明第四方面所述的软骨细胞样群体；

优选地，所述药物组合物中还含有药学上可接受的载体和/或辅料。

进一步，所述载体和/或辅料包括药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。

进一步，所述药物组合物为药学上可接受的任意剂型，包括注射剂、片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、溶液剂中的至少一种。

进一步，所述药物组合物的适合给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗有效的给药剂量。

进一步，所述药物组合物中的活性成分(本发明第四方面所述的软骨细胞样细胞群体)的实际剂量应根据多种相关因素来确定，包括待治疗的疾病严重程度、施用途径、患者年龄、性别、体重，因此，上述剂量不应以任何方式限制本发明的保护范围。

此外，本发明还提供了用于软骨损伤修复的软骨组织工程材料，所述软骨组织工程材料中含有本发明第四方面所述的软骨细胞样群体；

进一步，所述软骨组织工程材料中还含有软骨组织工程支架材料。

进一步，所述软骨组织工程支架材料可分为两类，即固定形态的组织工程支架材料和可注射式组织工程支架材料。

进一步，所述固定形态支架材料包括但不限于：聚羟基乙酸、聚乳酸-聚羟基乙酸、β-磷酸三钙、丙交酯乙交酯共聚酯。

进一步可注射式支架材料包括但不限于：胶原、海藻酸、透明质酸、纤维蛋白凝胶、液态硅胶。

进一步，在临床上，软骨损伤部位的形状常不规则，因此固定形态的支架材料在临床上的应用受到限制。可注射式组织工程支架利用液态的生物材料为载体，搭载种子细胞后直接注入到软骨缺损区域，并通过改变物理、化学条件凝固形成支架-细胞复合体，随着支架材料不断降解，种子细胞自身不断增殖分化形成新生组织，最终达到修复软骨缺损的目的。

在本发明的具体实施方式中，所述软骨组织工程支架材料为纤维蛋白凝胶，所述纤维蛋白凝胶是由人或动物血浆中的蛋白成分制备的生物支架材料。纤维蛋白原在哺乳动物种间差异性小，免疫源性低，因此制备纤维蛋白凝胶的原材料来源十分丰富。纤维蛋白凝胶的制备模仿生理凝血机制，由纤维蛋白原及凝血酶/氯化钙两种成分混合制成，无毒无菌，可降解吸收。这两种成分混合前为液体，混合后注入到软骨缺损部位，在凝固前可任意塑形，与损伤面高度贴合；并且具有良好的黏附能力，可防止细胞的流失。

本发明的第六方面提供了如下任一方面的应用：

(1)ucOCN在促进脂肪间充质干细胞成软骨分化中的应用；

(2)ucOCN在制备诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化的诱导液中的应用；

(3)ucOCN在制备诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化的培养基中的应用；

(4)本发明第二方面所述的诱导分化剂在诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化中的应用；

(5)本发明第三方面所述的诱导分化培养基在诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化中的应用；

(6)本发明第四方面所述的软骨样细胞群体在制备用于软骨损伤修复的药物组合物中的应用；

(7)本发明第四方面所述的软骨样细胞群体在制备用于软骨损伤修复的软骨组织工程材料中的应用。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：

(1)本发明提供了一种促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法，所述方法为在体外进行棕色脂肪干成软骨定向分化的过程中加入羧化不全的骨钙素蛋白(ucOCN)，使得分化效率显著提高；

(2)本发明首次发现并验证了羧化不全的骨钙素蛋白(ucOCN)具有显著的促进棕色脂肪干细胞在诱导分化早期的成软骨分化的能力，且在棕色脂肪干软骨诱导分化晚期，加入ucOCN依然能保持高效的诱导效率；

(3)本发明建立的高效诱导棕色脂肪干细胞成软骨分化的方法具有操作简单、方便实用等优点，可以高效诱导脂肪干细胞的成软骨分化，有望解决临床软骨组织工程中种子细胞不足的问题；

(4)本发明首次发现了在棕色脂肪干细胞成软骨分化的过程中，添加ucOCN对棕色脂肪干细胞成软骨分化的促进作用显著优于cOCN，取得了预料不到的技术效果。

附图说明

图1为棕色脂肪干细胞成软骨诱导分化4天的Q-PCR结果图，其中，A图：SOX9，B图：COL2a1；

图2为棕色脂肪干细胞成软骨诱导分化4天的Western blot结果图；

图3为棕色脂肪干细胞成软骨诱导分化21天的Q-PCR结果图；

图4为棕色脂肪干细胞成软骨诱导分化21天的阿利新蓝染色结果图；

图5为羧化不全的骨钙素(ucOCN)和羧化完全的骨钙素(cOCN)对棕色脂肪干细胞成软骨分化能力的影响结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例ucOCN在促进棕色脂肪干细胞成软骨分化中的应用

1、实验材料

小鼠脂肪间充质干细胞成软骨诱导液和阿利新蓝染色液购自于赛业生物公司，产品货号为MUBMD-9004；羧化不全的骨钙素蛋白(ucOCN)购自于Abcam公司，产品货号为ab274873；α-MEM培养液购自于Gibco公司，产品代码为CAT.NO.12000-022，胎牛血清购自于Gibco公司；0.01M、pH 7.2-7.4的PBS缓冲液、胰酶、TRIZOL试剂均购自于Sigma公司；反转录酶试剂盒和SYBR Green试剂均购自于东洋纺(上海)生物科技有限公司(TOYOBO)；RIPA组织细胞裂解液及SDS-PAGE凝胶试剂购自于索莱宝(Solarbio)公司；所使用的抗体、GAPDH、β-actin购自于CST公司；COL2a1抗体购自于武汉Abclonal公司，货号为A1560；SOX9抗体购自于Millipore公司，货号为2262679。

2、小鼠棕色脂肪干细胞成软骨诱导分化

小鼠的饲养与繁殖：小鼠的品系为C57BL/6，后于军事医学研究院动物中心进行繁殖，动物饲养和实验符合国家标准和相关要求，小鼠饲养在通风的隔离笼中(4-5只/笼)，保持上午7：00-下午7：00的光照，温度在21-23℃。动物饲养员每天给动物提供标准食物和水，并密切监测它们的健康和福利。所有动物实验均按照军事医学研究院批准的“实验动物的护理和使用指南”进行。

本实施例以小鼠棕色脂肪间充质干细胞作为受体间充质干细胞，在该细胞成软骨诱导分化的培养液中加入5-10ng/mL的ucOCN蛋白，优选地，在该细胞成软骨诱导分化的培养液中加入10ng/mL的ucOCN蛋白，使该受体细胞成软骨分化的效率增加。所述ucOCN蛋白的氨基酸序列为：YLGASVPSPDPLEPTREQCELNPACDELSDQYGLKTAYKRIYGITI(SEQ ID NO:1)，具体诱导分化方法如下：

(1)小鼠棕色脂肪干细胞的分离培养

取5-7天的C57BL/6乳鼠提取脂肪干细胞，具体方法如下：小鼠断颈处死后，酒精浸泡5-10分钟，沿颈部切开皮肤，皮下位于两肩胛骨之间可见棕褐色组织即为棕色脂肪组织，分离棕色脂肪组织，去除组织周围筋膜。使用PBS清洗脂肪组织后转移至1.5mL EP管中，加入1mL 0.2％的I型胶原酶，消化30-60分钟，观察脂肪组织消化至糜糊状终止消化，分别使用100目、200目过滤网进行过滤，离心后接种细胞。脂肪干细胞培养使用α-MEN完全培养基+胎牛血清(FBS)+100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素进行培养，每2-3天进行换液一次，细胞融合度在70％-80％时进行传代，使用P3代细胞进行诱导分化。

(2)棕色脂肪干细胞成软骨诱导分化

小鼠成软骨分化培养基购自于赛业生物科技有限公司(MUBMD-9004)，其主要成分有：a)地塞米松、b)抗坏血酸、c)ITS添加物、d)丙酮酸钠、e)脯氨酸，按照产品说明书等比例配比各组分，所述成软骨分化培养基中加入10ng/mL的ucOCN蛋白，成软骨诱导分化培养基中还含DMEM有基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3，优选地，每200mL成软骨诱导分化培养基中含有194mL DMEM培养基、2mL ITS添加物、600μL抗坏血酸、200μL脯氨酸、200μL丙酮酸钠、20μL地塞米松、2mL TGF-β3。细胞使用单层培养和成球培养两种方法进行培养，单层培养细胞于第4天收样，提取RNA和蛋白。成球培养细胞于第21天收样，提取RNA并行组织阿利新蓝染色。单层培养：将步骤(1)中的P3代棕色脂肪干细胞消化后计数，接种于6孔板中，每孔3×10⁵个细胞，细胞贴壁后分三组进行诱导，实验采用单层培养细胞分三组，分别为：干细胞组(B)、正常诱导分化组(Chondrogenesis)及加入ucOCN诱导分化组(Chondrogenesis+ucOCN)，每隔两天换液一次，于第4天收样，提取RNA和蛋白。成球培养：实验分为两组，分别为：正常诱导分化组(Chondrogenesis)和加入ucOCN诱导分化组((Chondrogenesis+ucOCN)。具体步骤如下：①进行成软骨诱导分化实验之前，对细胞进行计数。②将3-4×10⁵个细胞转移到15mL离心管中，250g离心4min。③吸去上清，加入0.5mL培养基预混液，重悬上一步离心所得沉淀，以清洗脂肪间质干细胞，室温下150g离心5min。④重复步骤③，再次清洗细胞。⑤将上一步所得沉淀用0.5mL小鼠脂肪间质干细胞成软骨诱导分化完全培养基重悬。⑥室温下150g离心5min。⑦拧松离心管盖以便于气体交换，将其放置于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。⑧当细胞团出现聚拢现象时(一般为24h或48h后，实际视细胞生长情况而定)轻弹离心管底部使软骨球脱离管底悬浮在液体中。⑨自接种开始计算，每隔2-3d给细胞换用新鲜的成软骨诱导分化完全培养基，每管约0.5mL成软骨诱导分化完全培养基。⑩于第21天收取组织样本，提取RNA并行组织阿利新蓝染色。

(3)实时荧光定量PCR检测诱导分化4天及21天棕色脂肪干细胞的诱导分化标志物COL2a1及SOX9

分别按(2)中所述分组收集棕色脂肪干细胞诱导4天及21天后的细胞，加入TRIZOL裂解细胞。按照每200μL三氯甲烷/组加入上述混合溶液中，充分漩涡震荡，室温静置10min，12000g，4℃离心15min，吸取上层清亮水相约400μL至新的1.5mL无RNA酶EP管，加入600mL异丙醇，漩涡混匀，室温静置10min，12000g，4℃离心15min，弃上清，沉淀至室温晾干，每孔加入75％酒精1mL进行洗涤，8000g，4℃离心7min，弃上清，沉淀至室温晾干，加入20mL RNA酶，测定RNA浓度以及RNA质量。以RNA为模板，进行反转录，按照说明书中记载的反转录体系，取1μg RNA反转录为cDNA。反应条件为35℃15min，50℃5min，95℃5min。测定RNA浓度以及RNA质量。qRT-PCR的反应条件为95℃3min、95℃5sec、60℃30sec，40个循环，得到溶解曲线，分析数据。以β-actin表达量为内参，qRT-PCR检测上述不同组别样本相关基因(COL2a1及SOX9)表达变化情况，引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

(4)Western blot实验检测诱导分化4天后棕色脂肪干细胞软骨化标志物COL2a1及SOX9的变化

1)细胞准备(一切操作在冰上-准备冰)：首先在显微镜下观察细胞的数目和状态。将培养板取出放在冰上，在冰上用PBS洗一遍后，尽量将PBS弃干净，否则会影响裂解液最后的定量，6孔板每孔加入100μL-120μL的裂解液(根据细胞量决定具体用量)，本实施例中所加裂解液为80μL，用干净的刮子尽力刮干净，移液到EP管中，冰上裂解30分钟后，冻于-70℃保存。

2)蛋白浓度检测：将裂解后的蛋白与裂解液混合物100℃煮沸10min，目的在于使蛋白变性，更稳定。煮沸后迅速放入冰上降温，4℃，12000g离心15分钟，吸取上清，丢弃下层沉淀物。

取1μL的样本，不同浓度的蛋白标准品稀释25倍与1:50的A液和B液配制的反应液反应。利用标准品测得吸光度与对应蛋白浓度绘制蛋白标准曲线。利用曲线计算出样本浓度。

3)电泳：将20μg不同浓度的样本加入对应孔中，定容为30μL，不足的用2xloadingbuffer补齐进行电泳，先用80V电压将样本跑至分离胶，然后120V进行电泳。

4)转膜：凝胶积层胶可以切除，剪与凝胶大小一致的PVDF膜，切左上角标记，将滤纸和多孔垫片浸入电转移缓冲液中，将PVDF膜浸入100％甲醇中30s，有的实验室2-10min，浸入电转移缓冲液。安装转膜装置：从正极(红色)到负极(黑色)依次为：多孔垫片、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、多孔垫片(注意一定红对红，黑对黑，凝胶在负极，膜与胶之间排气泡)(这一步多孔垫片、滤纸、凝胶都泡电转液里，小心胶裂)，电转槽中电转液要加满，放入冰。接通电源：恒压60V，3h，若分子量10kd左右的可以转2h，<0.16mA。

5)封闭与杂交：将含有蛋白的PVDF膜正面朝上放入TBST中清洗，再放入封闭缓，冲液(含5％脱脂奶粉的TBST)中，室温轻摇1h，TBST轻摇洗膜，将膜放入一抗稀释液中(BSA稀释)，4℃过夜。β-actin(R兔抗)，密封在封闭袋中，避免气泡。TBST轻摇洗膜10min*3(将膜取出放入洗液中，再吸出一抗回收，冻存于-20℃中)将膜放入二抗稀释液中(牛奶稀释)，室温轻摇1h。TBST轻摇洗膜10min。注意：膜一定要注意区分正反面，正面朝上，不能让膜干；一抗二抗要对应，兔对兔，鼠对鼠。

6)显色：配制显色液(ECL)：A液和B液等比例混合均匀，各200μL(此时枪头一定要换，混匀后装口袋避光)将膜平铺于塑料上，避免气泡，加匀显影。

(5)组织阿利新蓝染色检测棕色脂肪干细胞成软骨分化21天后基质中酸性粘多糖(AGAN)的含量

酸性粘多糖(AGAN)是软骨细胞外基质中的一种重要成分，含量丰富，是软骨分化晚期的另一重要表型指标，组织学上利用阿利新蓝染色可根据蓝色着色深浅显示出酸性粘多糖的含量；

组织阿利新蓝染色主要是反映软骨外基质中的酸性粘多糖(AGAN)的含量，阿利新蓝染色部分显示的是软骨组织中的AGAN，AGAN的含量越多着色显蓝色越明显，具体实验步骤如下：

1)将成球培养所获得的软骨球经石蜡包埋后切片。

2)染色步骤：a)脱蜡和脱水；b)阿利辛蓝染液染色30min；c)自来水冲洗2min；d)蒸馏水冲洗1次。

3)显微镜下观察阿利辛蓝染色效果，阿利辛蓝染色部分显示的是软骨组织中的内酸性粘多糖。

3、实验结果

软骨诱导分化早期为软骨诱导分化的启动过程，本实施例选择四天为早期时间节点，SOX9为软骨诱导分化过程中的核心转录因子，在软骨诱发分化初级及全程都发挥着重要作用，COL2a1是软骨细胞分化过程中持续高表达的胶原蛋白，SOX9及COL2a1表达增强表明脂肪干的成软骨分化能力增强。本实施例采用单层培养细胞并分为三组：干细胞组(B)、正常诱导分化组(Chondrogenesis)及加入ucOCN诱导分化组((Chondrogenesis+OCN)，qRT-PCR实验每个样本重复三次，实验结果显示，以体外分离的原代脂肪干细胞所表达转录水平的SOX9、COL2a1的mRNA相对于内参β-actin的mRNA的表达量为1，通过常规方法所得细胞经诱导分化4天后，SOX9、COL2a1的mRNA量相对于β-actin的值分别为1.698和1.913，加入ucOCN诱导分化4天后，SOX9、COL2a1的mRNA表达量相对于β-actin的值分别为2.195、3.032(见图1)，表明了与对照组相比，加入10ng/mL重组ucOCN的棕色脂肪干细胞诱导分化4天后软骨标志物SOX9、COL2a1的表达增多，且有显著性差异(P＜0.05)，进一步表明了在软骨诱导分化的初级阶段，ucOCN能够促进棕色脂肪干细胞向软骨分化，即ucOCN具有一定的促软骨分化作用。

给予药物干预后，软骨诱导分化过程中的不同阶段可能显示出不同的反应结果，持续促进SOX9和COL2a1的表达是促进软骨分化的关键。使用干细胞成球培养的方法，对照组加入正常的软骨诱导培养基，实验组加入10ng/mL的重组ucOCN，每2-3天换液一次，以21天为时间节点检测软骨诱导分化中晚期的状态。qRT-PCR的结果显示，在诱导分化21天后以常规诱导的棕色脂肪干细胞分化来的软骨细胞的SOX9、COL2a1的mRNA相对于β-actin的mRNA的表达量为1，加入ucOCN后诱导分化21天后，SOX9、COL2a1的mRNA表达量相对于β-actin的值分别为12.4、20.8(见图3)，表明了与对照诱导组比，加入ucOCN的棕色脂肪干细胞诱导分化21天后软骨标志物SOX9、COL2a1表达增多，且有显著性差异(P＜0.05)，进一步表明了ucOCN具有持续促软骨分化的作用。

Westen blot实验每个样本重复三次，实验结果显示，与对照组相比，加入10ng/mL重组ucOCN的棕色脂肪干细胞诱导分化4天后软骨标志物SOX9、COL2a1的表达显著增多，诱导分化4天后，以内参中β-actin的表达量为参考，代表总蛋白量是否一致，以蛋白条带的平均光密度作为对应蛋白表达的计量，诱导4天后，在β-actin表达一致性良好的情况下，加入ucOCN后，SOX9、COL2a1的条带灰度和宽度明显高于不加组(见图2)，表明了在诱导分化的早期，ucOCN有明显促进棕色脂肪干细胞成软骨分化的能力，从蛋白层面上再次证明了ucOCN能够促进棕色脂肪干细胞的成软骨分化。

阿利新蓝染色实验每个样本重复三次，结果显示，分化21天后，与对照诱导组相比，加入ucOCN组着色更深(见图4)，表明了在棕色脂肪干细胞成软骨诱导分化晚期，加入ucOCN依然能保持高效的诱导效率，从组织学上进一步验证了ucOCN具有促软骨分化能力。

对比例两种不同修饰形式的OCN分子ucOCN和cOCN对棕色脂肪干细胞成软骨分化能力的影响

1、实验方法

羧化完全的骨钙素(Carboxylated osteocalcin，cOCN)和羧化不全的骨钙素(Undercarboxylated osteocalcin，ucOCN)是成熟骨钙素蛋白骨钙素(Osteocalcin，OCN)的两种形式，为了进一步比较这两种不同修饰形式的OCN分子在棕色脂肪干细胞成软骨发育中的作用，本实施例通过对比实验分析了体外给予cOCN或ucOCN对棕色脂肪干细胞成软骨分化能力的影响。具体实验方法如下：在原代分离培养的棕色脂肪干细胞成软骨分化诱导体系中，分别加入重组cOCN和ucOCN蛋白进行干预，通过免疫印迹实验(Western blot实验)检测软骨分化标志分子表达变化。Western blot实验检测诱导分化4天后棕色脂肪干细胞软骨化标志物COL2a1及SOX9的变化的具体实验方法如下：

(1)细胞准备(一切操作在冰上-准备冰)：首先在显微镜下观察细胞的数目和状态。将培养板取出放在冰上，在冰上用PBS洗一遍后，尽量将PBS弃干净，否则会影响裂解液最后的定量，6孔板每孔加入100μL-120μL的裂解液(根据细胞量决定具体用量)，本实施例中所加裂解液为80μL，用干净的刮子尽力刮干净，移液到EP管中，冰上裂解30分钟后，冻于-70℃保存。

(2)蛋白浓度检测：将裂解后的蛋白与裂解液混合物100℃煮沸10min，目的在于使蛋白变性，更稳定。煮沸后迅速放入冰上降温，4℃，12000g离心15分钟，吸取上清，丢弃下层沉淀物。

取1μL的样本，不同浓度的蛋白标准品稀释25倍与1:50的A液和B液配制的反应液反应。利用标准品测得吸光度与对应蛋白浓度绘制蛋白标准曲线。利用曲线计算出样本浓度。

(3)电泳：将20μg不同浓度的样本加入对应孔中，定容为30μL，不足的用2xloadingbuffer补齐进行电泳，先用80V电压将样本跑至分离胶，然后120V进行电泳。

(4)转膜：凝胶积层胶可以切除，剪与凝胶大小一致的PVDF膜，切左上角标记，将滤纸和多孔垫片浸入电转移缓冲液中，将PVDF膜浸入100％甲醇中30s，有的实验室2-10min，浸入电转移缓冲液。安装转膜装置：从正极(红色)到负极(黑色)依次为：多孔垫片、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、多孔垫片(注意一定红对红，黑对黑，凝胶在负极，膜与胶之间排气泡)(这一步多孔垫片、滤纸、凝胶都泡电转液里，小心胶裂)，电转槽中电转液要加满，放入冰。接通电源：恒压60V，3h，若分子量10kd左右的可以转2h，<0.16mA。

(5)封闭与杂交：将含有蛋白的PVDF膜正面朝上放入TBST中清洗，再放入封闭缓，冲液(含5％脱脂奶粉的TBST)中，室温轻摇1h，TBST轻摇洗膜，将膜放入一抗稀释液中(BSA稀释)，4℃过夜。β-actin(R兔抗)，密封在封闭袋中，避免气泡。TBST轻摇洗膜10min*3(将膜取出放入洗液中，再吸出一抗回收，冻存于-20℃中)将膜放入二抗稀释液中(牛奶稀释)，室温轻摇1h。TBST轻摇洗膜10min。注意：膜一定要注意区分正反面，正面朝上，不能让膜干；一抗二抗要对应，兔对兔，鼠对鼠。

(6)显色：配制显色液(ECL)：A液和B液等比例混合均匀，各200μL(此时枪头一定要换，混匀后装口袋避光)将膜平铺于塑料上，避免气泡，加匀显影。

2、实验结果

实验结果显示，只有羧化不全的骨钙素(ucOCN)能够增加SOX9、COL2A1的表达，而羧化完全的骨钙素(cOCN)则不能(见图5)，即ucOCN组促进成软骨分化的效果显著优于cOCN组，进一步证明了ucOCN具有促软骨分化能力，表明了只有低羧化形式的OCN分子(即ucOCN)能够增强棕色脂肪干细胞成软骨分化的能力。本发明首次发现了在棕色脂肪干细胞成软骨分化的过程中，添加ucOCN对棕色脂肪干细胞成软骨分化的促进作用显著优于cOCN，取得了预料不到的技术效果。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (21)

1.一种促进脂肪间充质干细胞成软骨分化的方法，其特征在于，所述方法包括在脂肪间充质干细胞成软骨分化诱导培养基中加入ucOCN；

所述ucOCN的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述ucOCN的用量为5-10 ng/mL。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(1) 分离脂肪间充质干细胞；

(2) 将步骤(1)中分离得到的脂肪间充质干细胞加入到含有5-10 ng/mL ucOCN的成软骨诱导分化培养基中进行诱导培养。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述脂肪间充质干细胞为棕色脂肪间充质干细胞。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述ucOCN的用量为10 ng/mL。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述成软骨诱导分化培养基中还含有基础培养基、地塞米松、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM培养基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，每200 mL成软骨诱导分化培养基中含有194 mL DMEM培养基、2 mL ITS添加物、600 μL抗坏血酸、200 μL脯氨酸、200 μL丙酮酸钠、20 μL地塞米松、2 mL TGF-β3。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述脂肪间充质干细胞的细胞密度为6-8×10⁵个/mL。

9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述诱导培养的时间为3-21天。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述诱导培养的时间为21天。

11.一种诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化的诱导液，其特征在于，所述诱导液中含有ucOCN；

所述ucOCN的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；

所述诱导液中ucOCN的含量为5-10 ng/mL。

12.根据权利要求11所述的诱导液，其特征在于，所述诱导液中还含有地塞米松、抗坏血酸、ITS添加物、丙酮酸钠、脯氨酸、TGF-β3。

13.根据权利要求12所述的诱导液，其特征在于，所述诱导液中ucOCN的含量为10 ng/mL。

14.根据权利要求13所述的诱导液，其特征在于，每200 mL诱导液中含有2 mL ITS添加物、600 μL抗坏血酸、200 μL脯氨酸、200 μL丙酮酸钠、20 μL地塞米松、2 mL TGF-β3。

15.一种诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化的诱导分化培养基，其特征在于，所述诱导分化培养基含有基础培养基和权利要求11-14中任一项所述的诱导液。

16.根据权利要求15所述的诱导分化培养基，其特征在于，所述基础培养基为DMEM培养基。

17.ucOCN在促进脂肪间充质干细胞成软骨分化中的应用，其特征在于，所述ucOCN的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ucOCN的用量为5-10 ng/mL。

18.ucOCN在制备诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化的诱导液中的应用，其特征在于，所述ucOCN的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ucOCN的用量为5-10 ng/mL。

19.ucOCN在制备诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化的培养基中的应用，其特征在于，所述ucOCN的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述ucOCN的用量为5-10 ng/mL。

20.权利要求11-14中任一项所述的诱导液在诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化中的应用。

21.权利要求15或16所述的诱导分化培养基在诱导脂肪间充质干细胞成软骨分化中的应用。

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