CN114480261B - 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法 - Google Patents

一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN114480261B
CN114480261B CN202210085849.8A CN202210085849A CN114480261B CN 114480261 B CN114480261 B CN 114480261B CN 202210085849 A CN202210085849 A CN 202210085849A CN 114480261 B CN114480261 B CN 114480261B
Authority
CN
China
Prior art keywords
umbilical cord
cells
stem cells
cell
hsscs
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202210085849.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114480261A (zh
Inventor
刘衍志
高翔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Osmore Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Shenzhen Osmore Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Osmore Biotechnology Co ltd filed Critical Shenzhen Osmore Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210085849.8A priority Critical patent/CN114480261B/zh
Publication of CN114480261A publication Critical patent/CN114480261A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114480261B publication Critical patent/CN114480261B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/04—Drugs for skeletal disorders for non-specific disorders of the connective tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明属于细胞生物学技术领域，公开了一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法，所述分离方法包括以下步骤：(1)将脐带组织切成小块，静置25～40min，加入培养基，培养；(2)待脐带组织块边缘爬出细胞，剥离脐带组织块，收集爬出的细胞；(3)对步骤(2)收集的细胞进行分选，得到脐带来源的骨骼干细胞。本发明所提供的方法能从脐带中快速分离骨骼干细胞，获得骨骼干细胞的原代培养时间大大缩短，且爬出细胞多，分布均匀，生长速度快。

Description

一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法
技术领域
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法。
背景技术
骨骼干细胞(skeletal stem cell，SSC)是近年来在软骨细胞中发现的一类干细胞亚型，在Nature，Cell等知名杂志相继进行了相关报道，此类干细胞具有定向分化为软骨和骨骼的能力。SSC在体外具有自我更新的能力，实验表明在小鼠肾下移植，能够线性地分化出含有骨、软骨和基质的多向性小骨(multilineage ossicles)：首先分化出早期骨、软骨和基质的祖细胞(human bone，cartilage and stromal progenitor，hBCSP)，接着是骨祖细胞(human osteoprogenitor，hOP)和软骨祖细胞(human chondroprogenitor，hCP)，最后才分化出骨骼、软骨和基质细胞。SSC不会分化为脂肪细胞，SSC具有以下特征：①分布于骨骼相关的间充质中，包括骨、软骨、脂肪及骨髓基质；②SSC谱系分化方向明确；③体内外均可自我更新和克隆形成；④体内外均能多向分化；⑤在体内移植实验中可保持异位成骨能力。
因此，SSC是一群间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)异质性更低、表面标志物更明确和克隆形成能力更强的干细胞。SSC存在于胎儿和成人骨骼中，也可以源自BMP2处理的人类脂肪基质(human adipose stroma，B-HAS)和诱导多能干细胞(inducedpluripotent stem cells，iPSC)中，可通过以PDPN+CD146-CD73+D164+为特征分选得到。与小鼠SSC类似，人的以PDPN+CD146-CD73+CD164+为特征的SSC同样具有自我更新和克隆形成能力，Elisia D.Tichy等研究表明在肾移植实验中表现出持续的异位成骨能力，骨缺损时可迅速增殖分化。该细胞可生成骨骼、软骨和基质的祖细胞，但不生成脂肪。单个SSC的基因表达分析揭示了从不同来源获得的SSC之间具有总体相似性，但是略有不同，揭示了胎儿来源和iPSC衍生的人骨骼干细胞(human skeletal stem cell，hSSC)具有向软骨的倾斜分化的趋势。hSSC会因急性骨骼损伤而激活进行局部扩增。此外，hSSC衍生的基质可以在无血清培养条件下维持人类造血干细胞(human hematopoietic stem cells，hHSC)生长。MatthewP.Murphy等研究表明骨微骨折后，微环境中hSSC被激活可以诱导分化为软骨，可用于治疗局部性关节炎的软骨疾病。近年来，MSCs的旁分泌行为参与损伤组织修复、再生的功能成为生物制药研究的热点。众多研究人员通过体外培养实验证实了基于MSCs的旁分泌作用的条件培养基可以满足多种人源细胞体外培养的生长及扩增。
目前，已有大量研究结果表明，MSCs通过旁分泌作用分泌多种细胞因子，可以促进多种人源细胞的生长与增殖，为生物制药提供了一种更安全、有效的细胞培养途径。基于MSCs细胞外基质的培养基在现代生物制药领域有着广阔的发展前景。
BM-MSCs是最早发现的一类间充质干细胞，Parekkadan等对BM-MSCs条件培养基进行蛋白组学分析，检测到69种蛋白，其中大部分是细胞因子、生长因子和化学增活素，其中一些分子已经证明具有抗凋亡和刺激细胞增殖作用。
传统的分离骨骼干细胞SSC，多采用从骨髓、软骨及胎儿组织中获取组织后分选得到人骨骼干细胞，从上述组织中获得骨骼干细胞较为困难，且面临对供者伤害大，可获得细胞数量低，以及伦理问题。例如，临床中从骨髓中获得SSC，需要在手术中取得骨髓，目前临床能够取得骨髓的绝大多数为年纪70左右的骨科手术患者，此种来源由于患者年龄大，可获得相关细胞活力低，手术中可取骨髓量稀少，因此可获得SSC的数量和质量均难以满足临床研究或治疗应用需求。临床中从软骨中获得SSC更困难，人体软骨组织少，目前临床能够取得软骨的绝大多数为骨关节炎全关节置换手术获得软骨，患者自身病情显著影响对获得SSC的数量和质量，正常人软骨难以获得，且对供者造成二次伤害较大，获得SSC的数量和质量难以确定。从胎儿胚胎来源的SSC，面临来源少，伦理争议大的问题。
发明内容
针对现有技术手段难以获得大量活性高的SSC存在的难题，提供一种从脐带中提取分选得到骨骼干细胞的提取方法，通过设计一系列标准细胞分离提取流程，利用流式分选，能有效的获得大量骨骼干细胞，且细胞成活率较高，较其他组织分离SSC而言，更易于获得高质量的SSC。
本发明第一方面的目的，在于提供一种脐带来源的骨骼干细胞的分离方法。
本发明第二方面的目的，在于提供一种脐带来源的骨骼干细胞。
本发明第三方面的目的，在于提供本发明第一方面的分离方法或本发明第二方面的骨骼干细胞在制备修复组织损伤或组织再生的药物中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种骨骼干细胞制剂。
本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的分离方法或本发明第二方面的骨骼干细胞在制备促进成骨分化或软骨分化的药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种脐带来源的骨骼干细胞的分离方法，包括以下步骤：
(1)将脐带组织切成小块，静置25～40min，加入培养基，培养；
(2)待脐带组织块边缘爬出细胞，剥离脐带组织块，收集爬出的细胞；
(3)对步骤(2)收集的细胞进行分选，得到脐带来源的骨骼干细胞。
优选地，所述脐带组织选自人脐带组织、老鼠脐带组织、家兔脐带组织、狗脐带组织和猴脐带组织。
进一步优选地，所述脐带组织为人脐带组织。
优选地，所述培养基为含FBS的α-MEM培养基。
进一步优选地，所述培养基为含8v/v％～15v/v％FBS的α-MEM培养基。
更进一步优选地，所述培养基为含10v/v％～15v/v％FBS的α-MEM培养基。
优选地，所述静置的时间为25～30min。
优选地，步骤(2)中待人脐带组织块周围爬出的细胞的外沿距脐带组织块边缘0.4～0.8cm时，剥离脐带组织块。
优选地，所述培养的条件为35～37℃、4～7％CO2，培养8～15天，前2～6天内禁止移动。
优选地，所述分选包括通过荧光激活细胞分选、磁性细胞分选、荧光测定法、流式细胞术或显微技术进行分选。
优选地，所述分选为通过流式细胞术进行分选。
优选地，所述分选为分选出标志蛋白为CD45-PDPN+CD146-CD73+CD164+的细胞。
优选地，所述通过流式细胞术进行分选的具体步骤如下：将步骤(2)得到细胞进行胰酶消化，用含有FBS的α-MEM培养基终止消化，重悬，加入荧光标记的抗体，对细胞进行荧光标记染色，避光孵育，离心，重悬，于流式细胞分选仪进行分选，得到脐带来源的骨骼干细胞。
优选地，在将脐带组织切成小块之前，对所述脐带组织进行清洗。
进一步优选地，用含有青霉素和链霉素的PBS缓冲液清洗脐带组织，并去除脐带外层胶质、动脉和静脉。
优选地，所述青霉素和链霉素在PBS缓冲液中的终浓度分别为80～150U/mL和0.1～0.5mg/mL。
本发明的第二个方面，在于提供一种骨骼干细胞，由本发明第一方面的分离方法分离得到。
本发明的第三个方面，在于提供本发明第一方面的分离方法或本发明第二方面的骨骼干细胞在制备修复组织损伤或组织再生的药物中的应用。
本发明的第四个方面，在于提供一种骨骼干细胞制剂，包括本发明第二方面的骨骼干细胞和透明质酸基水凝胶。
本发明的第五个方面，在于提供本发明第一方面的分离方法或本发明第二方面的骨骼干细胞在制备促进成骨分化或软骨分化的药物中的应用。
本发明的有益效果是：
本发明所提供的方法能从脐带中快速分离骨骼干细胞，获得骨骼干细胞的原代培养时间大大缩短，且爬出细胞多，分布均匀，生长速度快，适合大量获得细胞供后续研究。
与现有技术中从骨髓、软骨、胎儿中分离提取骨骼干细胞，本发明所提供的方法，大大提高了提取骨骼干细胞的数量和质量，且伦理学争议较小，适合获取大量细胞用于制备制剂。
本发明提供的从脐带组织中分离骨骼干细胞的方法与传统从骨髓中获得骨骼干细胞方法相比，平均每次手术取材可获得的脐带组织(约20cm)，经脐带组织剪碎后碎块铺板15个10cm细胞培养皿，经爬板后即可获得4.65×107个脐带干细胞，将获得此数量的脐带干细胞经过以CD45-PDPN+CD146-CD73+D164+为靶标的流式分选后可获得22.7％的SSC，即每次手术取材后可分选得到P0代SSC细胞数为1.05×107个细胞。细胞活力：将获得的P6代人脐带来源的骨骼干细胞以1×105密度/孔接种于12孔板，在培养3d后骨骼干细胞可观察到已经长满，且分布较均匀，呈梭形。
通过从骨髓中提取分离骨骼干细胞，平均每次手术取材可获得约8mL骨髓，从骨髓分离爬板可得到1.1×106个骨髓干细胞，将获得此数量的骨髓干细胞经过以CD45-PDPN+CD146-CD73+D164+为靶标的流式分选后可获得23.8％的骨骼干细胞)，即每次手术取材后可分选得到P0代骨骼干细胞数为2.6×105个细胞。细胞活力：将获得的P6代骨髓来源的骨骼干细胞以1×105密度/孔接种于12孔板，在贴壁7d后才接近长满，可见，骨髓组织来源的骨骼干细胞数量少，生长缓慢，细胞活力弱，不适合获取大量细胞。
通过对不同来源的骨骼干细胞进行经成骨诱导、成软骨诱导、成脂肪诱导实验检测，结果表明，U-hSSCs具有干细胞特性，具备快速良好的成软骨和成骨能力，且成脂能力弱，其中，U-hSSCs的成软骨能力远远高于B-hSSCs，成脂能力也远低于B-hSSCs，不易形成脂肪。
通过在动物关节软骨缺损的模型上，将U-hSSCs添加至透明质酸基水凝胶并植入关节软骨缺损的动物的软骨缺损处，结果表明U-hSSCs具有良好的促进软骨缺损的修复能力，可见，本发明获得的U-hSSCs适合用于制备制剂，扩充了骨骼干细胞的获得来源并证明了脐带来源的骨骼干细胞具有良好的促进软骨生成的能力，可用于软骨缺损，骨关节炎的治疗。
本发明提供的分离方法操作简单，取材方便，人脐带属于妇产科手术后的废弃物利用，提高了脐带的利用率。
附图说明
图1为流式细胞分选结果图；其中，A为人脐带来源的骨骼干细胞的流式细胞分选结果图，B为骨髓来源的骨骼干细胞的流式细胞分选结果图。
图2为U-hSSCs和B-hSSCs以相同密度培养1天、3天、7天的明场图片。
图3为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs分别进行成软骨诱导的阿利新蓝染色结果图；其中，A为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs未经过成软骨诱导的阿利新蓝染色结果图，B为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs进行成软骨诱导后的阿利新蓝染色结果图。
图4为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs分别进行成软骨诱导的阿利新蓝染色的面积统计图。
图5为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs分别进行成骨诱导的茜素红染色和碱性磷酸酶染色结果图；其中，A为茜素红染色结果图，B为碱性磷酸酶染色结果图。
图6为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs分别进行成骨诱导后的茜素红染色矿化面积和碱性磷酸酶面积的统计图；其中，A为茜素红染色矿化面积统计图，B为碱性磷酸酶面积的统计图。
图7为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs分别成脂诱导17天后的油红O染色结果图和明场图片。
图8为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs分别成脂诱导17天后的油红O染色的脂滴面积统计图。
图9为U-hSSCs、hUC-MSCs、hBMSCs、B-hSSCs分别成脂诱导4天后的实时荧光定量PCR的结果统计图；其中，A为CFD基因的mRNA表达量的结果统计图，B为PPARγ基因的mRNA表达量的结果统计图。
图10为装载骨骼干细胞的改性透明质酸水凝胶在修复骨软骨缺损动物实验的结果图。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1
一种脐带来源骨骼干细胞的提取方法，包括如下步骤:
S1.人脐带来源干细胞(hUC-MSCs)的原代分离
(1)将人脐带经过严格检测程序(ABO/Rh血型检测、HLA分型检测、梅毒抗体检测、HIV免疫检测、CMV抗体检测、乙型肝炎抗原抗体检测等)确定安全性后，取20cm脐带放入含双抗(青霉素终浓度为100U/mL和链霉素终浓度为0.1mg/mL)的PBS缓冲液的采集瓶中，封口送至无菌超净台进行处理；
(2)用75％的酒精对采集瓶外壁进行消毒，用无菌镊(大长镊)将脐带组织取出并转移至培养皿中，并用含双抗(青霉素终浓度为100U/mL和链霉素终浓度为0.1mg/mL)的PBS缓冲液充分漂洗、去除血渍；
(3)用无菌剪将脐带组织剪成2～3cm数段，使用含双抗(青霉素终浓度为100U/mL和链霉素终浓度为0.1mg/mL)的PBS缓冲液洗涤脐带组织中的血凝块，重复2～3次，直至洗涤液变为清澈；
(4)用无菌镊小心撕去脐带外层胶质，剪开脐带，依次剔除脐带中的两条动脉和一条静脉(动脉壁厚，官腔小，弹性较好，可使用镊子拉住动脉撕拉至完全将其拉出分离；静脉不易直接剔除，可沿静脉腔将脐带剖开，暴露在最外面的即为静脉，此时可用镊子将静脉撕拉分离)；
(5)使用组织剪将脐带组织剪成表面积约为10～25mm2的细碎组织块，平铺于10cm培养皿底面(每块组织间隔0.5cm)，静置放置30min后沿侧壁缓缓加入8mL含10％(v/v)FBS的α-MEM培养基(含10％澳洲胎牛血清(Thermo Fisher ScientificTM，Cat#10099-141C)和1％青霉素/链霉素(Solarbio，Cat#P1400)的MEM Alpha(1×)培养基(Thermo FisherScientificTM，Cat#12571063))，培养皿表面标注细胞种类、细胞代数、处理日期等信息后，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(6)放置在二氧化碳培养箱中的培养皿，在前5天内，严禁移动；第6天后，将瓶中2/3液体更换为新鲜10％(v/v)FBS的α-MEM培养基，换液时应缓慢操作，切勿吹起组织块；
(7)继续静置培养7天，每2天更换2/3培养基，并置于显微镜下观察一次，若有组织块周围己爬出细胞，且长至半径0.5cm(即组织块周围爬出细胞的外沿距组织块边缘0.5cm)，镜下标记，用枪头或移液管轻轻将组织块拨离，令其从培养皿表面脱离；采用上述方法去除所有组织块，收集爬出的细胞，即得到脐带干细胞(hUC-MSCs)。
S2.脐带来源的骨骼干细胞的分选
利用流式细胞分选仪(BD FACS Aria II SORP)分选CD45-PDPN+CD146-CD73+CD164+为特征的骨骼干细胞，具体步骤如下：
(1)选择培养状态良好的原代人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)，吸弃培养皿中的培养基，PBS清洗细胞后，用0.25％胰酶消化贴壁细胞，1.5min，加入含10％(v/v)FBS的α-MEM培养基终止消化，用枪头吸取培养皿内培养基，反复吹打皿壁细胞；
(2)收集细胞液，800rpm离心5min，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于α-MEM培养基中，800rpm离心5min，弃去上清液；
(3)用100μL 10％(v/v)FBS的α-MEM培养基重悬细胞(107个细胞每100μL)，分别加入CD45(PerCP/Cyanine5.5)(Biolegend，Cat#368504)、CD146(PE-CY7)(Biolegend，Cat#342010)、PDPN(APC)(Thermo Fisher ScientificTM，Cat#17-9381-42)、CD73(FITC)(Biolegend，Cat#344016)和CD164(PE)(Biolegend，Cat#324808)抗体(107个细胞每100μL使用5uL抗体)，对细胞进行荧光标记染色；充分混匀后置于摇床，室温(26～28℃)避光孵育30min；另外建立阴性对照(阴性：不加任何抗体)的门控方案；
(4)将孵育后的细胞于800rpm离心5min，弃去上清液，加入1mL10％(v/v)FBS的α-MEM培养基重悬，800rpm离心5min，弃去上清液；
(6)用1mL10％(v/v)FBS的α-MEM培养基重悬细胞，经35μm的细胞滤网帽转移至流式检测管中，整个过程中注意避光；将装有细胞的流式检测管在流式细胞分选仪(BD FACSAria II SORP)上，使用85μm喷嘴进行流式分选FACS分析；
(7)分选后的U-hSSCs悬液于10％(v/v)FBS的α-MEM培养基中，800rpm离心5min，弃去上清，用10％FBS的α-MEM培养基重悬细胞，后转置培养箱37℃，5％CO2培养。
平均每次手术取材可获得的脐带组织(约20cm)，经脐带组织剪碎后碎块铺板15个10cm细胞培养皿，经爬板后即可获得4.65×107个脐带干细胞，将获得此数量的脐带干细胞经过以CD45-PDPN+CD146-CD73+D164+为靶标的流式分选后可获得22.7％的骨髓干细胞(图1中A)，即每次手术取材后可分选得到P0代骨髓干细胞数为1.05×107个。
对比例1
一种骨髓来源骨骼干细胞的提取方法，包括如下步骤:
S1.骨髓来源干细胞(hBMSCs)的原代分离
(1)将3.5mL骨髓样本转移到15mL离心管中，并加入等体积的PBS缓冲液(HyClone，Cat#PBS-SH30256.01)；
(2)再准备15mL离心管加入7mL的细胞分离液(Sigma，Cat#10771)，将骨髓样本和PBS混合液沿管壁缓缓滴入装有细胞分离液的离心管；
(3)用超高速离心机以400×g离心力离心20min，并设置最低加减速度(即ACC、DEC皆设置为1)；
(4)离心后小心取出，吸取中间云雾层细胞(下层：骨碎片、红细胞；中层：分离液、单细胞；上层：血小板、油脂)，并补充PBS至10mL，再以250×g离心力离心10min；
(5)离心后，弃上清，下层加入完全培养基吹匀并转入培养皿，培养皿表面标注细胞种类、细胞代数、处理日期等信息后，置于37℃、5％CO2培养箱中培养；
(6)放置在二氧化碳培养箱中的培养皿，在前3天内，严禁移动；第4天后，将皿中1/2液体更换为新鲜10％(v/v)FBS的α-MEM培养基，换液时应缓慢操作；第7天，将培养皿中全部液体更换为新鲜10％(v/v)FBS的α-MEM培养基，此后，每三天换液一次，待细胞长满即可传代。
S2.骨髓来源的骨骼干细胞的分选
利用流式细胞分选仪(BD FACS Aria II SORP)分选CD45-PDPN+CD146-CD73+CD164+为特征的骨骼干细胞，具体步骤如下：
(1)选择培养状态良好的原代人骨髓间充质干细胞(hBMSCs)，吸弃培养皿中的培养基，PBS清洗后，用消化液(胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25％)含酚红，Solarbio，Cat#T1320)消化贴壁细胞，加入10％FBS的α-MEM培养基终止消化，用枪头吸取培养皿内培养基，反复吹打皿壁细胞；
(2)收集细胞液，然后将溶液离心，除去上清液，将细胞沉淀重悬于细胞染色缓冲液(Cell Staining Buffer，Biolegend，Cat#420201)，将细胞悬液800rpm离心5min，弃去上清液；
(3)用100uL细胞染色缓冲液重悬细胞，并加入针对CD45(PerCP/Cyanine5.5)，CD146(PE-CY7)，PDPN(APC)，CD73(FITC)，CD164(PE)的抗体(107个细胞每100uL使用5uL抗体)，对细胞进行荧光标记染色；充分混匀后置于摇床，4℃避光孵育30min；另外建立阴性(阴性：不加抗体)对照的门控方案；
(4)将抗体染色孵育后的细胞，于800rpm离心5min，弃上清液；
(5)加入1mL细胞染色缓冲液重悬，重复以上离心洗涤1次；
(6)再次将1mL细胞染色缓冲液加入细胞沉淀中，重悬后经35μm的细胞滤网帽转移至流式管中，整个过程中注意避光；将装有细胞的流式检测管在FACS Aria ll流式细胞分选仪上，使用85μm喷嘴进行流式分选FACS分析；
(7)收集分选得到的细胞(即为骨髓来源的骨骼干细胞B-hSSCs)悬液于10％(v/v)FBS的α-MEM培养基中，800rpm离心5min，弃去上清，用10％(v/v)FBS的α-MEM培养基重悬细胞，后转置培养箱37℃，5％CO2培养。
通过对骨髓SSC提取分离，平均每次手术取材可获得约8mL骨髓，从骨髓分离爬板可得到1.1×106个骨髓干细胞，将获得此数量的骨髓干细胞经过以CD45-PDPN+CD146-CD73+D164+为靶标的流式分选后可获得23.8％的SSC(图1中B)，即每次手术取材后可分选得到P0代SSC细胞数为2.6×105个细胞。
实施例2脐带来源的骨骼干细胞(U-hSSCs)和骨髓来源的骨骼干细胞(B-hSSCs)的细胞培养
将实施例1制得的U-hSSCs和对比例1制得的B-hSSCs分别接种于含有完全培养基的T25细胞培养瓶内，置于CO2浓度为5％，湿度为95％，温度为37℃的孵育箱中培养；每48h更换一次培养基，待细胞融合度达80％～90％时，分别用PBS清洗细胞2次；吸弃PBS，加入1mL消化液(胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25％)含酚红，Solarbio，Cat#T1320)，并放入孵育箱中消化1min；吸弃消化液，立即用完全培养基终止消化；将细胞悬液转移至15mL离心管中，800rpm离心5min；弃去上清液，用完全培养重悬细胞，分别接种(1×105个细胞/孔)于12孔板中继续培养。
通过对比脐带来源的骨骼干细胞和骨髓来源的骨骼干细胞的生长情况，结果如图2所示，在接种相同密度细胞的前提下，U-hSSCs在第3天就到了长满了整个培养板，且分布较均匀，呈梭形，必须进一步进行传代培养，而B-hSSCs培养7天后也尚未完全长满整个培养板，表明U-hSSCs的增殖能力比B-hSSCs的增殖能力更强。
实施例3脐带来源的hSSCs的软骨分化
将生长状态良好的脐带来源的骨骼干细胞(U-hSSCs)、人脐带干细胞(hUC-MSCs)(由实施例1制得)、人骨髓基质干细胞(hBMSCs)和人骨髓来源的骨骼干细胞(B-hSSCs)(由对比例1制得)分别接种于12孔板中，每种细胞2个孔，每孔中约10万个细胞，加入2mL完全培养基，置于37℃，5％CO2孵育箱中培养至长满；分别吸弃12孔板中的培养基，每种细胞的其中一个孔加入1mL软骨分化培养基(50％的StemPro软骨形成分化试剂(Thermo FisherScientificTM，Cat#A1007101，50％MEM Alpha(1×)培养基))进行成软骨诱导分化，另一个孔加入相同体积的完全培养基作为空白对照；在进行成软骨诱导第4天后用阿利辛蓝(Sigma-Aldrich，Cat#A5268)进行染色评估。每个处理重复3次。
结果如图3和图4所示，各细胞质染蓝，其中，人脐带来源骨的骼干细胞成软骨特性较强，即使不用成软骨诱导分化液诱导，自身也分泌软骨基质，软骨集落面积显著高于hUC-MSCs、hBMSCs和B-hSSCs(图3)；当经过成软骨分化培养基诱导4天后，各细胞的成软骨能力显著提高，其中，人脐带来源的骨骼干细胞快速团聚形成软骨小球，成软骨能力远远高于hUC-MSCs、B-hSSCs和hBMSCs(图4)。
实施例4脐带来源的hSSCs的成骨分化
将生长状态良好的脐带来源的骨骼干细胞(U-hSSCs)、人脐带干细胞(hUC-MSCs)(由实施例1制得)、人骨髓基质干细胞(hBMSCs)和人骨髓来源的骨骼干细胞(B-hSSCs)(由对比例1制得)分别接种于12孔板中，每种细胞各4个孔，每孔中约10万个细胞，加入2mL完全培养基，置于37℃，5％CO2孵育箱中培养至长满；分别吸弃12孔板中的培养基，每种细胞的其中两个孔中加入1mL新鲜的成骨分化培养基(低糖DMEM培养基中添加10％(v/v)FBS、1％(v/v)Pen-Strep、100nM地塞米松、10mMβ-甘油磷酸钠(Sigma-Aldrich，Cat#G9422)、50μML-抗坏血酸(Sigma-Aldrich，Cat#A0278))，另外两个孔加入相同体积的培养基(低糖DMEM培养基中添加10％(v/v)FBS)；每3天换一次新鲜的成骨分化培养基，成骨诱导持续15天；15天后，弃去各孔中的培养基，PBS冲洗两次，分别使用茜素红和碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase，ALP)染色进行成骨能力表征；显微镜下观察钙结节并拍照。每种处理重复3次。
由图5可以看出，经过茜素红染后的各细胞质内有红色的矿化结节形成(图5中A)，经过碱性磷酸酶染色后的各细胞质内有蓝色的钙结节形成(图5中B)，其中，未经过成骨分化培养基的诱导U-hSSCs、B-hSSCs和hBMSCs经过染色后都能形成钙结节，表明上述细胞在未诱导的情况下也具有一定的成骨矿化能力，而hUC-MSCs在未经过成骨诱导时，没有见到明显的茜素红染色矿化结节，其成骨矿化能力较弱。经过诱导后，各细胞的成骨矿化能力显著增强，其中，B-hSSCs成骨矿化能力最强，U-hSSCs成骨矿化能力高于hUC-MSCs(图6)。
实施例5脐带来源的hSSCs的成脂分化
1.成脂分化实验
将生长状态良好的脐带来源的骨骼干细胞(U-hSSCs)、人脐带干细胞(hUC-MSCs)(由实施例1制得)、人骨髓基质干细胞(hBMSCs)和人骨髓来源的骨骼干细胞(B-hSSCs)(由对比例1制得)分别接种于12孔板中，每孔中约10万个细胞，加入2mL完全培养基，置于37℃，5％CO2孵育箱中培养至长满；吸弃12孔板中的培养基，分别加入1mL成脂诱导培养基(在DMEM培养基中添加10％(v/v)FBS、1％Pen-Strep、500nM地塞米松(MP Biomedicals，Cat#194561)、10μg/mL胰岛素溶液(Sigma-Aldrich，Cat#I9278)、0.5mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)(Sigma-Aldrich，Cat#I7018)、50μM吲哚美辛(Sigma-Aldrich，Cat#57413))；每三天换一次新鲜诱导液；成脂诱导17天后，使用油红O染色液进行染色，染色30min，PBS洗3次，去除残留的染色液和残渣，光学显微镜下进行脂滴观察。每种处理重复3次。
通过对U-hSSCs、hUC-MSCs、B-hSSCs和hBMSCs进行成脂化诱导，结果如图7和图8所示，各细胞经过17天的诱导后，其细胞质内有红色脂肪滴形成，表明各细胞在诱导培养基中均有一定的成脂化能力，其中人脐带来源的骨骼干细胞的成脂分化显著低于B-hSSCs和hBMSCs，也低于hUC-MSCs，表明U-hSSCs更不容易生成脂肪。
2.实时荧光定量PCR
(1)总RNA提取
按照成脂分化实验过程分别制备经过成脂诱导培养基诱导4天后的U-hSSCs、hUC-MSCs、B-hSSCs和hBMSCs，同时利用未被成脂诱导的各细胞作为对照组；弃去各细胞中的培养基，用PBS清洗2次，收集各细胞，分别采用TaKaRa RNAiso Plus试剂盒(Cat.#9108/9109)提取各细胞的总RNA，具体提取过程如下：向各细胞中加入300μL裂解液，轻轻吹打5～10次至固悬物溶解、溶液澄清，将溶液转移至1.5mL无酶离心管内，加入等体积的结合液，轻轻颠倒混匀3～5次，得到各细胞的混合物；将混合物(包括沉淀物)转移至纯化柱内，12 000rpm离心1min，倒弃收集管内液体，加入600μL洗涤液I，12 000rpm离心1min，倒弃收集管内液体；加入600μL洗涤液II，12 000rpm离心1min，倒弃收集管内液体，重复1次；15000rpm离心2min，去除残留的液体，随后将RNA纯化柱置于试剂盒提供的RNA洗脱管中，加入50μL洗脱液，室温放置3min，15 000rpm离心30s，所得溶液即为纯化的RNA；用分光光度计测量260nm、280nm波长处的吸光度值(OD值)，计算OD260/OD280比值，结果表明，各细胞的总RNA的OD260/OD280比值为1.8～2.0，说明所得到的总RNA纯度较好；将纯化的总RNA立即保存于-80℃低温冰箱或用于逆转录。
(2)逆转录反应
用QPCR逆转录试剂盒(TaKaRa，Cat#RR036A)将总RNA逆转录为cDNA，具体过程按照说明书进行操作，整个过程均在冰上进行；反应条件：37℃，15min，85℃，5s，然后降至4℃保存；反应结束得到各细胞的总cDNA；将得到的总cDNA立即进行实时荧光定量PCR或-20℃保存。
(3)实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR的具体过程按照TaKaRa公司Premix Ex TaqTM II试剂盒的说明书进行，根据表1配制PCR反应液，补体因子D(complement factor D，CFD)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPARγ)基因的引物见表2(各引物均由生工生物工程(上海)股有限公司设计合成)，PCR反应体系的配制过程均在冰上进行；反应参数为：95℃预变性30min，95℃变性5min，60℃退火30min，40个循环。
表1 PCR反应体系
表2 CFD和PPARγ基因的引物
(4)数据处理
实时荧光定量PCR反应结束后，系统会自动分析并计算结果。Ct值为结果中最原始数据，其表示PCR过程中，荧光强度达到阈值所需的循环周期数，但因其不具有线性关系，所以不能用Ct值作为统计量进行统计。本实验用2-ΔΔCt值相对定量方法进行数据分析，计算样品mRNA的表达量。
通过实时荧光定量PCR分析成脂诱导后的U-hSSCs、hUC-MSCs、B-hSSCs和hBMSCs中成脂分化基因CFD和PPARγ的表达量，结果如图9所示，各细胞在成脂分化培养基的诱导下，其成脂能力有所提高，但U-hSSCs的经成脂诱导4天后，其基因CFD和PPARγ的表达量显著低于B-hSSCs和hBMSCs，表明脐带来源的hSSCs的脂肪分化能力明显弱于人骨髓基质干细胞和骨髓来源的hSSCs，更不容易生成脂肪。
实施例6 U-hSSCs制剂在体内促进骨软骨缺损修复实验
本实施例所有操作严格遵守美国公共卫生署关于关爱和使用实验动物的相关指南，所有实验动物的饲养、手术操作、安乐死等均严格按照广东医科大学动物伦理委员会和委员会批准的方案进行。
本实验共选用40只雄性3月龄的SD大鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司；合格证号：SCXK(浙)2019-0001。分为四种处理方式，每种处理各10只大鼠，包括关节骨软骨损伤无处理组(Control)、单纯透明质酸基水凝胶处理组(MMP-MeHA)(透明质酸基水凝胶的制备方法参考文献“Yanzhi Liu,Liuqi Peng et al,3D-bioprinted BMSC-ladenbiomimetic multiphasic scaffolds for efficient repair of osteochondraldefects in an osteoarthritic rat model.Biomaterials,2021.32 1495-1507”进行)、U-hSSCs+透明质酸基水凝胶处理组(U-hSSCs-MMP-MeHA)和hBMSCs+透明质酸基水凝胶处理组(hBMSCs-MMP-MeHA)。骨软骨缺损手术造模：将大鼠采用异氟烷进行气体麻醉，常规消毒后，在每组大鼠的左侧股骨远端滑车槽处用无菌环钻制作出一个直径为2mm，深2mm的骨软骨全层缺损，用生理盐水冲洗清除组织碎屑和血块。根据分组情况，将各组制备好的直径为2mm，深2mm水凝胶(hSSCs-MMP-MeHA处理组和hBMSCs-MMP-MeHA处理组均含10万个细胞)植入软骨缺损处进行修复处理，对于损伤无处理组不植入任何材料。处理完成后逐层闭合肌肉层、筋膜层和皮肤切口，皮肤切口再次碘伏消毒。术后腹腔注射青霉素钠预防感染，大鼠术后自由活动。术后3各月后，对实验大鼠实施安乐死，获取股骨样本进行分析。
由图10可分析得出，与损伤无处理组相比，各处理组的软骨缺损均有不同程度的修复。MMP-MeHA处理组可见股骨髁部分软骨磨损痕迹，软骨缺损明显，部分缺损有少许白色瘢痕样纤维组织长入；U-hSSCs-MMP-MeHA处理组可见关节面平滑，未见明显软骨缺损，在肉眼观察下修复组织与正常软骨组织肉眼已难以区分，并发现该实验组所修复的组织表面光滑；hBMSCs-MMP-MeHA处理组可见部分软骨磨损痕迹，部分软骨有缺损痕迹。总体上来讲，MMP-MeHA处理组修复软骨缺损效果较差；hBMSCs-MMP-MeHA处理组修复软骨缺损效果较好，U-hSSCs-MMP-MeHA处理组修复软骨缺损效果最好。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (3)

1.一种脐带来源的骨骼干细胞的分离方法，包括以下步骤：
（1）脐带组织切成小块，静置25~40min，加入培养基，培养；
（2）待脐带组织块边缘爬出细胞，剥离脐带组织块，收集爬出的细胞；
（3）对步骤（2）收集的细胞进行分选，得到脐带来源的骨骼干细胞；
所述培养基为含8v/v%~15v/v%FBS的α-MEM培养基；
所述分选为通过流式细胞术进行分离，所述分选为分选标志蛋白为CD45-PDPN+CD146-CD73+CD164+的细胞。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，步骤（2）中待脐带组织块周围爬出的细胞的外沿距脐带组织块边缘0.4~0.8cm时，剥离脐带组织块。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其特征在于，所述培养的条件为35~37℃、4~7%CO2，培养8~15天，前2~6天内禁止移动。
CN202210085849.8A 2022-01-25 2022-01-25 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法 Active CN114480261B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210085849.8A CN114480261B (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210085849.8A CN114480261B (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114480261A CN114480261A (zh) 2022-05-13
CN114480261B true CN114480261B (zh) 2024-01-30

Family

ID=81474393

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210085849.8A Active CN114480261B (zh) 2022-01-25 2022-01-25 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN114480261B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN115089610A (zh) * 2022-06-28 2022-09-23 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 骨骼干细胞在制备用于治疗骨关节炎的产品中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104762258A (zh) * 2015-04-21 2015-07-08 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种人脐带间充质干细胞的培养方法
CN107517589A (zh) * 2015-01-08 2017-12-26 小利兰·斯坦福大学托管委员会 提供骨、骨髓及软骨的诱导的因子和细胞
CN109337867A (zh) * 2018-11-23 2019-02-15 北京太东生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞分离方法
CN113249317A (zh) * 2021-06-17 2021-08-13 北京国卫生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞的分离培养扩增方法及系统
WO2021222298A1 (en) * 2020-04-29 2021-11-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mechanical and biochemical activation and control of skeletal stem cells for cartilage regeneration

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107517589A (zh) * 2015-01-08 2017-12-26 小利兰·斯坦福大学托管委员会 提供骨、骨髓及软骨的诱导的因子和细胞
CN104762258A (zh) * 2015-04-21 2015-07-08 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 一种人脐带间充质干细胞的培养方法
CN109337867A (zh) * 2018-11-23 2019-02-15 北京太东生物科技有限公司 一种脐带间充质干细胞分离方法
WO2021222298A1 (en) * 2020-04-29 2021-11-04 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Mechanical and biochemical activation and control of skeletal stem cells for cartilage regeneration
CN113249317A (zh) * 2021-06-17 2021-08-13 北京国卫生物科技有限公司 一种人脐带间充质干细胞的分离培养扩增方法及系统

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Identification of the Human Skeletal Stem Cell;Charles K. F. Chan 等;Cell;43-56 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN114480261A (zh) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP1845154A1 (en) Multipotent stem cells derived from placenta tissue and cellular therapeutic agents comprising the same
JP6687757B2 (ja) ３ｄ軟骨オルガノイドブロックを調製するための方法
KR100871984B1 (ko) 태반 조직 유래 다능성 줄기세포 및 이를 함유하는세포치료제
Danišovič et al. Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from different tissue sources in respect to articular cartilage tissue engineering
EP3019599B1 (en) Method for isolating stromal vascular fraction
JP2009523438A (ja) 細胞の富化
CN106459908A (zh) 来源于纯滋养层的干细胞及包含其的细胞治疗剂
US9211306B2 (en) Cellular therapeutic agent for incontinence or urine comprising stem cells originated from decidua or adipose
CN112029717B (zh) 无血清体外驯化培养人间充质干细胞
CN108685948A (zh) 一种新型医用细胞修复剂的制备方法
CN106255747A (zh) 来源于滋养层基底层的干细胞及包含其的细胞治疗剂
CN104651305A (zh) 一种利用脐带间充质干细胞获取生物活性蛋白的方法
KR20100084620A (ko) 조직 재생을 위한 세포 조성물
CN114480261B (zh) 一种脐带来源骨骼干细胞的提取分离方法
CN108938669B (zh) 一种用于治疗皮肤损伤的干细胞软膏及其制备方法
CN109628388B (zh) 用消化酶组合物从胎盘血管分离间充质干细胞
KR101380561B1 (ko) 말과동물 양수 유래 다분화능 줄기세포 및 그 제조방법
CN101543644B (zh) 无支架工程软骨组织的构建方法及其产品
KR101389851B1 (ko) 신경능선줄기세포의 배양방법 및 그 용도
EP2732030B1 (en) Preparation of parental cell bank from foetal tissue
CN107058225B (zh) 一种复合诱导培养基以及采用该培养基诱导脐带间充质干细胞成神经元样细胞的方法
Chen et al. Enhanced repaired enthesis using tenogenically differentiated adipose-derived stem cells in a murine rotator cuff injury model
CN111040994A (zh) 一种高效分离脂肪来源脂肪间充质干细胞的方法
CN1397640A (zh) 一种干细胞、其制备方法及其用途
CN108251358B (zh) 一种相同供体来源人间充质干细胞的多批次原代分离方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant