CN108938669B

CN108938669B - 一种用于治疗皮肤损伤的干细胞软膏及其制备方法

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Publication number: CN108938669B
Application number: CN201710366533.5A
Authority: CN
Inventors: 王晓燕; 蒋斌; 徐仁和
Original assignee: University of Macau
Current assignee: University of Macau
Priority date: 2017-05-23
Filing date: 2017-05-23
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2037-05-23
Also published as: CN108938669A

Abstract

本发明提供一种干细胞软膏的制备方法及该方法制备的软膏。本发明通过将具有免疫调节和促进组织再生功能的间充质干细胞在3D悬浮培养条件下制备成大小均匀的团块，并混合在一种无生物毒性的活性能量基质中制成一种软膏。干细胞可以在这种软膏中于室温条件下可存活一周之久，保持生物活性。本发明提供的干细胞软膏可以直接涂抹于皮肤损伤处，其中的干细胞会迁移到伤口中抑制炎症并促进组织再生，加快伤口的愈合并显著改善愈合状况，减少疤痕形成。完成修复过程后，干细胞会被自体免疫系统清除，无残留，安全性稳定高效。

Description

一种用于治疗皮肤损伤的干细胞软膏及其制备方法

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域，具体来说，是将具有生物学活性功能的干细胞与无生物毒性的基质混合制作成一种软膏以及将该药膏的制备方法。

背景技术

急慢性伤口例如各种溃疡，缺血缺氧型伤口和烧伤残余创面，危害人类健康并影响生活质量，已经成为了现代社会的巨大问题。由于肥胖症，糖尿病的急剧增多，以及人口的老龄化，各种皮肤损伤尤其是慢性伤口的发病率还在持续上升。这些伤口的治疗消耗了大量的社会经济资源。目前治疗伤口的手段主要有抗生素干预，外科手术和负压治疗，虽然这些治疗有了很大的进步，但是慢性伤口的愈合率仍然小于50％。在过去二十年中，干细胞研究取得了巨大进步，干细胞已经成为治疗许多退行性疾病(包括慢性伤口)的最有潜力的手段之一。

干细胞是具有自我更新和分化成各种体细胞能力的细胞，可以参与并促进组织再生和器官功能恢复。最常用的干细胞类型是由成体组织例如骨髓(BM)，脂肪和脐带血分离的间充质干细胞(MSC)。由于它们取材方便，而且很少有伦理问题，所以是研究者的首选。它们已经在许多动物实验中被用来治疗皮肤伤口，其作用机制也已得到深入研究，然而，在临床上并没有得到广泛应用。主要障碍包括供体组织来源有限，体外扩增效率不高，质量不稳定，而且有携带病原体的风险。

人多能干细胞如人胚干细胞被认为是MSC的新来源，不再依赖供体捐献。由单一人多能干细胞(hPSC)株可源源不断地分化大量、高质量的MSC(hPS-MSC)，携带病原体的风险也可降低。研究表明，hPS-MSC具有比BM-MSC更低的免疫原性，在一些疾病模型中取得优于BM-MSC的疗效。

传统上，MSC对皮肤创伤的治疗大多通过皮内注射将单个MSC移植到伤口区域。该方法能部分改善伤口愈合，但是因为单细胞存活率低大大影响疗效，所以如何提高细胞移植后的存活率是增高疗效的关键。伤口存在炎性环境，而且血管受损造成缺血缺氧，常规培养的细胞很难适应这样的环境，移植后常因高死亡率影响疗效。

本发明通过3D培养让间充质干细胞聚集成球；细胞球内轻度缺氧而降低细胞能量代谢并抑制细胞凋亡；细胞球移植可大大提高细胞存活率和疗效。故此，本发明对皮肤损伤和其它炎性疾病的治疗具有重大的应用价值。

发明内容

本发明提供一种用于治疗皮肤损伤的干细胞软膏的制备方法。本发明所述的制备方法通过将具有免疫调节和促进组织再生功能的间充质干细胞在3D悬浮培养条件下制备成大小均匀的球体，并混合在一种无生物毒性的基质中后可以制成一种可用于治疗皮肤损伤的干细胞软膏。

为了实现本发明目的，本发明所述的方法，具体包括以下3个步骤；

步骤一,干细胞团块形成步骤：在3D悬浮培养条件下，利用间充质干细胞表面高表达细胞粘附因子cadherin,形成干细胞团块；

步骤二，干细胞软膏制备步骤：将无生物毒性的基质混合于活性能量液体培养基中形成软膏，将步骤一形成的干细胞团块收集起来置于所述软膏中形成干细胞软膏，其中，所述的活性能量液体培养基为液体基质添加增粘剂混合制成，所述的活性能量基质的成分包括DMEM低糖培养基，20％血清替代物，1％非必需氨基酸，5％L－谷氨酰胺，所述的增粘剂为食用级添加剂；

步骤三，干细胞软膏制品封装储备步骤：在常温条件下将所述干细胞软膏封装于无菌塑料容器中，使用前可直接涂抹于皮肤创口上即可发挥间充质干细胞的生物活性，治疗皮肤创口。

优选地，在所述干细胞团块形成步骤，可以利用U/V型超低吸附培养板或者悬滴法，根据不同地干细胞数目制备不同大小规格的细胞团块均匀球体，优选的，球体大小介于50微米－500微米。

优选地，在所述的干细胞块形成步骤也可以直接利用超低吸附培养板或者玻璃培养瓶中，直接将干细胞以高密度的条件下直接铺于板中或培养皿中低速搅拌，使其自发形成大小不一的团块。

优选地，干细胞团块化在常温条件下培养，通常需要在37度培养箱(5％二氧化碳和大于80％的湿度)中培养24-48小时完成。利用U/V型超低吸附培养板或者悬滴法或者玻璃培养瓶方法制备的干细胞团块主要是成本，大小和均匀度不同，存活率和生物活性没有显著差别。

优选的，在所述的干细胞团块形成步骤之前，还包括干细胞分离获取子步骤，所述的干细胞为由人多能干细胞株分化而成的间充质干细胞株或使用成体组织分离来的间充质干细胞，包括骨髓，脂肪和脐带血等。

在所述的干细胞团块形成步骤过程中，还包括干细胞培养子步骤，其中，在所述的干细胞培养子步骤中，调整所述的3D悬浮悬液的细胞密度至0.5-2×1000000细胞每毫升，培养时间为24-48小时。

优选地，在所述的干细胞软膏制备步骤中，用于将干细胞团块保存的基质为液体基质添加增粘剂。液体基质为任何种类细胞培养基，含有基础的养分和酸碱平衡系统，优选为干细胞培养基，成分包括DMEM低糖培养基，20％血清替代物(KnockOut SerumReplacement)，1％非必需氨基酸，5％L－谷氨酰胺。所述增粘剂为食用级添加剂可以提高液体的粘稠度，优选为甲基纤维素Methylcellulose，优选使用浓度为0.2％－0.5％.食用级增粘剂不会产生生物毒性，可代谢，无残留，安全性高，使用方便，可以使干细胞团块在运输途中减少颠簸造成的应力损伤。

优选地，所述的干细胞软膏的制备方法，所述的干细胞为由人多能干细胞株Envy细胞分化而来的间充质干细胞。

优选地，在所述的干细胞团块形成步骤过程中，还包括胰蛋白酶消化子步骤，其中，胰蛋白酶的(体积百分)比例为0.05-0.25％，消化时间为至少3分钟。

优选地，在所述的干细胞团块形成步骤过程中，在完成所述的胰蛋白酶消化子步骤后，还包括胰蛋白酶中和子步骤及干细胞离心法收集子步骤，其中，采用新鲜制备的所述3D悬浮培养液中和胰蛋白酶。

优选地，在所述的干细胞软膏制备步骤,所述的无生物毒性的基质为甲基纤维素，将甲基纤维素按终浓度0.2％－0.3％加入活性能量液体培养基形成基质软膏。

优选的，无生物毒性的基质还可以是基质胶(Matrigel),水凝胶(hydrogel),食品增粘剂或增稠剂。

优选地，在所述干细胞软膏制品封装储备步骤中，用于将干细胞团块封装保存于密封容器优选的容器为聚乙烯、聚丙烯和密胺等原料制成塑料容器，干细胞的封装密度为100万－1000万细胞每毫升的保存基质。

优选地，在所述的干细胞软膏制品封装储备步骤，将干细胞软膏制备步骤形成的系胞团块混合悬浮于所述基质软膏中，封装于1ml注射器中备用，调整细胞密度为每毫升1×1000000细胞。

封装时避免混入气体产生气泡。在运输途中，只需将细胞容器置于常温下即可，温度范围为10度－35度，避免强光照射，高温(大于42度)和低温(小于0度)即可。

本发明还提供一种应用本发明所述的制备方法制备的干细胞软膏，具体的，所述的干细胞是多能干细胞分化来源间充质干细胞。所述的干细胞还可以使用成体组织分离来的间充质干细胞，包括骨髓，脂肪和脐带血等。

在应用依本发明所述方法制成的干细胞软膏时，只需对皮肤创口进行清洁处理后，直接将其均匀涂抹于创口处，然后覆盖防水透气薄膜即可，推荐使用3M公司出品的Tegaderm透明防水敷贴。依本方法制备的干细胞软膏在应用到伤口模型后具有以下治疗效果：

1.和未处理的对照组相比，干细胞软膏加快了伤口的愈合，改善了伤口的愈合质量，促进了伤口的血管生成和再上皮化。

2.储存在软膏中的干细胞仍具有很强的生物活性，移植到伤口后，干细胞能存活并迁移，促进损伤组织的再生。

本发明方法不仅可以应用在由多能干细胞分化而来的间充质干细胞，也可以使用成体组织分离来的间充质干细胞例如骨髓，脂肪和脐带血等。干细胞可以在这种软膏中于室温条件下存活一周之久，并不会影响其生物活性。本发明提供的干细胞软膏可以直接涂抹于皮肤损伤处，其中的干细胞会迁移到伤口中抑制炎症并促进组织再生，明显加快伤口的愈合并显著改善愈合状况，减低疤痕形成。完成修复过程后，干细胞会被自体免疫系统清除，无残留，安全性极高。本发明方法简单可靠，价格低廉，稳定高效，整个过程无需任何维持温度或条件，可以直接用于皮肤损伤的治疗，可以及时处理各种烧伤，创伤和急慢性伤口形成，若推广具有极高的科学和社会经济效益。

本发明的有益效果是依本方法常温存储7天的间充质干细胞在恢复常规培养条件后仍具有以下特征和活性：

1.和普通培养的间充质干细胞相比，有相似的生长速率，更低的老化程度和相似的生物功能，包括定向分化为各种组织(骨，软骨和脂肪)的能力和免疫调节功能。

2.在体外实验中与普通培养的间充质干细胞一样具有抑制淋巴细胞增殖的能力。

3.在由化学物质导致的两种小鼠肠炎实验模型中，能有效保护肠道损伤和体重削减；病检显示移植细胞可以迁移到受损的肠道组织中，抑制炎性反应并促进受损肠壁的组织再生。

本发明提供的方法不仅可以应用在间充质干细胞(骨髓来源和多能干细胞分化来源)上，也可以直接应用在多能干细胞和其他干细胞种类上，例如脂肪干细胞，肌肉干细胞和神经干细胞等，但依不同细胞其储存培养基各异，储存时间也可能长短不一。本发明提供的方法和基质可以保证干细胞在常温条件下7-10天后的存活率高达90％，在恢复常规培养条件后，其仍具有和正常对照细胞相似的生长速率，更低的老化程度和相似的生物功能，包括定向分化为各种组织(骨，软骨和脂肪)的能力和免疫调节功能，在体外实验中与对照细胞具有相似的抑制淋巴细胞增殖的能力，并且在由化学物质导致的两种小鼠肠炎实验模型中，有效的保护了肠道损伤和体重削减。病理切片证明，直接应用本发明方法在常温下保存7天的间充质干细胞可以迁移到受损的肠道组织中，抑制炎性反应并促进受损肠壁的组织再生。

附图说明

图1为实施例一的间充质干细胞聚集成球后在常温条件(AC)下可维持高存活率的图示,其中，

附图1A所示为单层培养的人多能干细胞来源的间充质干细胞(EMSC)。

附图1B的图示为悬滴法制备干细胞球及其在显微镜下的形态，细胞聚集为大小均一的球体。

附图1C所示为干细胞软膏的制备，干细胞球混悬于培养基质中，减少了流动性，避免了细胞球的聚集和运输途中的机械碰撞，故对细胞球有保护作用。

附图1D的图示为将干细胞软膏直接涂抹于实验小鼠的皮肤创面。

附图2A所示干细胞EMSC移植对伤口闭合率的影响及不同时期的伤口外观。与传统移植组(EMSC_ML)和对照组相比，EMSC球(EMSC_Sp)在所有时间点都显示了明显的治疗效果，尤其在术后第10-14天，*P<0.05。

附图2B所示为，除了加速伤口闭合，通过组织学检测，EMSC_Sp处理组的伤口表现出明显的组织再生，具有改善的皮肤结构。病理组织学评分，EMSC_Sp处理组的伤口恢复质量明显优于传统移植组(EMSC_ML)和对照组。

附图2C-2D所示为干细胞球移植后的体内追踪。附图2C与传统移植方式相比，干细胞球滴加到伤口后显示出很强的荧光信号，随着伤口修复的进程，干细胞球组有稳定的细胞存活并能观察到细胞的迁移。在所有观察时间点，干细胞球的荧光强度均高于传统移植组，*P<0.05，*P<0.01。附图2D冰冻切片结果显示术后14天，局部移植的干细胞球整合到愈合伤口中，细胞密度明显高于传统移植组。

附图2E-2H所示为干细胞球改善伤口愈合的机制。附图2E通过Masson’s三色染色法检测到干细胞球组在术后14天伤口中心有大量的胶原沉积，相比传统移植组，只有少量且不规则的胶原沉积。附图2F通过免疫荧光染色检测血管内皮标记物(CD31)和血管平滑肌细胞标记物(αSMA),与传统移植组相比，术后14天干细胞球组有高密度的毛细血管增生。附图2G通过免疫荧光双染色，观察到移植的GFP阳性EMSC细胞像血管平滑肌细胞分化。附图2H通过检测表皮细胞标记物(Cytokeratin)，观察到术后14天，干细胞球组有完整的再上皮化，角质干细胞增殖并迁移到整个伤口表皮，而传统移植组仍然上皮缺失。通过计数伤口中心的皮肤附属器，干细胞球组有明显增多的毛囊新生。

附图2I-2J所示为干细胞球混悬于软膏中促进伤口修复的治疗效果。附图2I为干细胞软膏室温放置7天后直接涂抹到伤口表面，与对照组相比，干细胞软膏明显促进了伤口的闭合。附图2J为冰冻切片结果显示，术后14天，干细胞在伤口中存活并迁移。

具体实施方式

下面结合附图和实施例来解释本发明的发明内容，本发明所采用的实施例仅用于解释本发明的内容，并不用于限制本发明。

实施例一

本发明提供一种用于治疗皮肤损伤的干细胞软膏的制备方法，所述的制备方法包括以下三个步骤；

步骤一,干细胞团块形成步骤，在悬浮培养条件下，利用间充质干细胞表面高表达细胞粘附因子cadherin，使干细胞自发聚集，形成团块；

步骤二，干细胞软膏制备步骤，将无生物毒性的基质混合于活性能量液体培养基中形成软膏，将步骤一形成的干细胞团块置于所述软膏中形成干细胞软膏；

步骤三，干细胞软膏制品封装储备步骤，在常温条件下将所述干细胞软膏封装于无菌塑料容器中，使用前可直接涂抹于皮肤创口上即可发挥间充质干细胞的生物活性，治疗皮肤创口。

具体的，将结合附图1，其中附图1A-附图1D对间充质干细胞软膏的制备及其在室温下保存7天后的生物学活性进行说明。

实验采用绿色萤光蛋白标记的间充质干细胞株(由人多能干细胞株Envy细胞分化而来)用于实验。细胞生长于正常的培养环境(37摄氏度，5％二氧化碳，90％湿度)至培养面积大约80％融合度即可进行实验，具体的实验步骤如下：

步骤一、在间充质干细胞团块形成步骤，制备干细胞3D悬浮培养液,其组分构成包括DMEM低糖培养基，20％胎牛血清或者血清替代物，1％非必需氨基酸，5％L－谷氨酰胺，在3D悬浮培养条件下，使干细胞自发聚集，形成团块；具体的，包括以下子步骤：

1.1干细胞分离获取子步骤，实验采用的干细胞为由人多能干细胞株Envy细胞分化而来间充质干细胞株；

1.2将单层培养的细胞取出，去除培养基并用生理盐水(PBS)清洗细胞两遍；

1.3胰蛋白酶消化子步骤，加入0.05－0.25％胰蛋白酶消化细胞3分钟，本实施例中采用0.05％；此子步骤中，胰蛋白酶还可以由0.05-0.5％的胶原酶替代。

1.4用新鲜配制的3D悬浮培养液培养中和胰蛋白酶，采用离心法收集细胞；

1.5将细胞混匀于步骤1.4所述的新鲜培养基中，调整细胞悬液密度在0.5-2×1000000细胞每毫升,本至1×1000000细胞每毫升；

1.6按悬滴法(hanging drop)制备干细胞球，25微升每滴均匀滴于培养皿中；

1.7将培养皿放入培养箱，正常条件下培养24-48小时，在本实施例中，条件是37摄氏度，5％二氧化碳，90％湿度培养时间为48小时，形成细胞团块，本实验中形成的细胞团块为均匀的球体，球体大小介于50微米－500微米；

1.8离心去除培养基，收集细胞球；

步骤二、干细胞软膏制备步骤，将无生物毒性的基质混合于活性能量液体培养基的中形成软膏，将步骤一形成的干细胞团块置于所述软膏中形成干细胞软膏；具体的包括以下子步骤：2.1配制活性能量液体培养基，活性能量液体培养基的组成包括，本实验采用的无生物毒性的基质为甲基纤维素(Methylcellulose)，将甲基纤维素(Methylcellulose)按终浓度0.3％加入活性能量液体培养基形成软膏；

2.2制备干细胞软膏，将步骤一形成的干细胞团块置于步骤2.1形成的软膏中形成干细胞软膏

然后进入步骤三，细胞软膏制品封装储备步骤，在常温条件下将所述干细胞软膏封装于无菌塑料容器中，具体的，

将细胞团块用移液器吹吸混合悬浮于基质软膏中，封装于1ml注射器中备用，调整细胞密度0.5-2×1000000细胞每毫升，本实施例中，为每毫升1×1000000细胞，50个干细胞球。

采用上述方法制备的干细胞软膏，使用前可直接涂抹于皮肤创口上即可发挥间充质干细胞的生物活性，治疗皮肤创口。

如附图1所示，绿色萤光蛋白标记的间充质干细胞可以在基质中常温存活一周，存活率高达90％，并保证生物活性，其中：

实验结果表明，采用上述的方法制备的干细胞软膏，干细胞保持了很高的存活率。

实施例二

本实施例与实施例一的制备方法和步骤基本相同，不同之处仅在于，在所述干细胞团块形成步骤，利用U/V型超低吸附培养板进行干细胞团块的培养，根据不同地干细胞数目制备不同大小规格的细胞团块均匀球体，利用U/V型超低吸附培养板或者悬滴法或者玻璃培养瓶方法制备的干细胞团块主要是成本，大小和均匀度不同，存活率和生物活性没有显著差别；以及在实施例一所述的干细胞软膏制备步骤中的胰蛋白酶消化子步骤，所述的胰蛋白酶由0.05-0.5％的胶原酶替代，以下将对应用本发明的方法制成的干细胞软膏对免疫缺陷小鼠皮肤损伤疗效进行说明，具体的，

将本发明的干细胞软膏移植到小鼠皮肤伤口模型，并对治疗效果进行说明。

将实施例1中的干细胞软膏在室温下保存7日后对6-8周龄小鼠进行实验。实验所采用的动物是免疫缺陷小鼠(6-8周龄；雄性；体重，20-23g)。进行全层皮肤缺失的伤口造模并移植干细胞软膏。

实验步骤如下：

1.将小鼠麻醉后，剃除背部毛发并进行消毒。

2.用皮肤活检器在背部中线两侧产生两个直径为5mm全层皮肤切除伤口。

3.造模后的小鼠随机分为三组(n＝5每组)：对于干细胞球组，1×1000000个细胞形成的球体直接涂敷在伤口表面或混悬在软膏中直接涂敷伤口；对于对照实验组，按照传统移植的方法，在伤口周围皮内注射0.7×1000000个单细胞，并联合局部滴加0.3×1000000个细胞；空白对照组则不予任何处理。

4.移植细胞后用硅胶垫片固定伤口周围皮肤，并将伤口进行包扎。

5.对伤口术后即时，术后3，7,10,14天拍照记录，采用图像分析软件跟踪伤口变化并测量伤口面积。伤口的闭合率采用如下公式计算：原始伤口的面积-实际伤口的面积)/原始伤口的面积×100％。

6.采用慢病毒转导的iRFP荧光蛋白标记移植的EMSC，通过小动物活体成像仪对伤口术后即时，术后3，7,10,14天进行荧光拍照追踪移植细胞的存活及迁移。

7.术后14天处死小鼠，收集伤口及周围2mm的皮肤进行组织学的分析。

如附图2A-2B所示为干细胞球移植对伤口修复的治疗效果。

实验结果表明，具体结果如图2所示，干细胞球能加速伤口闭合，促进伤口的血管增生和再上皮化，改善愈合质量。移植的干细胞球能在伤口中存活并迁移至损伤区域。干细胞软膏的使用同样提高了伤口的愈合效率，并保存了干细胞的生物活性，这是最简便的细胞移植方式。

Claims

1.一种用于治疗皮肤损伤的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，所述的干细胞为由人多能干细胞株分化而成的间充质干细胞株或使用成体组织分离来的间充质干细胞，包括以下三个步骤：

步骤一,干细胞团块形成步骤，制备干细胞3D悬浮培养液，在3D悬浮培养条件下，形成干细胞团块；

步骤二，干细胞软膏制备步骤,将无生物毒性的基质混合于活性能量液体培养基中形成基质软膏，将步骤一形成的干细胞团块收集起来置于所述基质软膏中形成干细胞软膏，其中，所述的活性能量液体培养基为液体基质添加增粘剂混合制成，所述的活性能量基质的成分包括DMEM低糖培养基，20％血清替代物，1％非必需氨基酸，5％L－谷氨酰胺，所述的增粘剂为食用级添加剂；

步骤三，干细胞软膏制品封装储备步骤，在常温条件下将所述干细胞软膏封装于无菌塑料容器中，

所述的干细胞软膏可直接涂抹于皮肤创口上即可发挥间充质干细胞的生物活性。

2.根据权利要求1所述的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，在所述的干细胞团块形成步骤，所述的3D悬浮培养液的组分构成包括DMEM低糖培养基，20％胎牛血清或者血清替代物，1％非必需氨基酸，5％L－谷氨酰胺。

3.根据权利要求2所述的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，在所述的干细胞团块形成步骤之前，还包括干细胞分离获取子步骤，所述的干细胞为由人多能干细胞株分化而成的间充质干细胞株或使用成体组织分离来的间充质干细胞。

4.根据权利要求3所述的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，在所述的干细胞团块形成步骤过程中，还包括干细胞培养子步骤，其中，在所述的干细胞培养子步骤中，调整所述的3D悬浮悬液的细胞密度至0.5-2×1000000细胞每毫升，培养时间为24-48小时。

5.根据权利要求4所述的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，所述的干细胞为由人多能细胞株Envy细胞分化而来的间充质干细胞株。

6.根据权利要求5所述的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，在所述的干细胞团块形成步骤过程中，还包括胰蛋白酶消化子步骤，其中，胰蛋白酶的体积百分比例为0.05-0.25％，消化时间为至少3分钟。

7.根据权利要求6所述的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，在所述的干细胞团块形成步骤过程中，在完成所述的胰蛋白酶消化子步骤后，还包括胰蛋白酶中和子步骤及干细胞离心法收集子步骤，其中，采用新鲜制备的所述3D悬浮培养液中和胰蛋白酶。

8.根据权利要求1所述的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，在所述的干细胞软膏制备步骤,所述的无生物毒性的基质为甲基纤维素，将甲基纤维素按终浓度0.2％－0.3％加入活性能量液体培养基形成基质软膏。

9.根据权利要求8所述的干细胞软膏的制备方法，其特征在于，在所述的干细胞软膏制品封装储备步骤，将干细胞软膏制备步骤形成的系胞团块混合悬浮于所述基质软膏中，封装于1ml注射器中备用，调整细胞密度为0.5-2×1000000细胞每毫升。

10.一种可治疗皮肤损伤的干细胞软膏，其特征在于，所述的干细胞软膏采用如权利要求1-9任一的方法制备而成。