CN103301153B - 脐带间质干细胞培养液或由其制得的产物作为制备治疗皮肤创伤的药剂的应用 - Google Patents
脐带间质干细胞培养液或由其制得的产物作为制备治疗皮肤创伤的药剂的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种脐带间质干细胞培养液或由其制得的产物作为制备治疗皮肤创伤的药剂的应用，其中该培养液不含细胞。
Description
技术领域
本发明是关于皮肤创伤治疗的技术领域。具体而言，本发明是关于一种脐带间质干细胞培养液或由其制得的产物作为制备治疗皮肤创伤的药剂的应用，其中该培养液不含细胞。
背景技术
皮肤创伤为日常生活中普遍的意外伤害。当受伤面积过大，如烧烫伤，或是伤及真皮层时，照顾不当容易感染发炎，若未及时处理，严重者甚至可能危害生命。当前临床上用以辅助皮肤伤口愈合主要是以人工皮肤及组织移植为主，然而其要价昂贵且耗时费工。
皮肤创伤的愈合主要必须历经发炎反应、表皮再生、肉芽组织(granulationtissue)生成、血管增生，创伤收缩以及细胞外基质重新建构等过程，才能帮助创伤后再生的皮肤组织。近年来随着干细胞研究的兴起，研究人员使用不同来源的干细胞给予创伤皮肤治疗，期望干细胞能够在各方面帮助整个皮肤创伤的再生与重建，且已达不错成效(Yaojiong et al.,Mesenchymal stem cells enhance wound healing throughdifferentiation and angiogenesis.Stem Cells,25(10)：2648-59,2007)。
惟大部分干细胞来源不易取得或有道德上的疑虑，且含有活体细胞的制剂不但储存困难，更有许多安全上的顾虑，在临床应用上仍有许多问题待解决。因此针对皮肤创伤愈合以开发不含细胞或干细胞的治疗药剂或敷料为先。
发明内容
本发明首次提出脐带间质干细胞经培养继而移除细胞后的培养液具有优异的治疗皮肤创伤的功效，例如，促进纤维母细胞的活性、加速皮肤创伤的愈合、缩小伤口体积、帮助皮肤创伤愈合过程中毛囊的生长及胶原蛋白的建构、增加嗜中性白血球和巨噬细胞的聚集、以及促进伤口区域内的血管增生等。本发明的脐带间质干细胞培养液不含细胞，可直接冷冻或简单浓缩干燥成粉末状，长期保存，且无活细胞可能产生的安全顾虑，或与其他皮肤伤口愈合例如植皮技术等一起使用，具有极佳的临床应用潜力。
因此，本发明提供一种脐带间质干细胞培养液或由其制得的产物作为制备治疗皮肤创伤及促进创伤愈合的药剂的应用，其中该培养液不含细胞。
本发明的脐带间质干细胞培养液或由其制得的产物可用于制备供治疗皮肤创伤及促进创伤愈合的医药或敷料，或与其他皮肤创伤治疗法合用，并可促进创伤愈合。
在一具体实例中，本发明的由该培养液制得的产物呈液状或粉末状。
具体而言，本发明的培养液经由将该脐带间质干细胞培养于一液状培养基中，再经分离移除该脐带间质干细胞后取得上清液而获得。其中，该上清液可进一步经干燥而呈粉末状。
在一具体实例中，本发明的脐带间质干细胞培养于含氧浓度为约20%或以下的条件。
在一具体实例中，本发明的脐带间质干细胞培养于正常含氧条件下。
在一具体实例中，本发明的脐带间质干细胞培养于低氧条件下。
另一方面，本发明提供一种治疗皮肤创伤及促进创伤愈合的医药组合物，其特征是包含以脐带间质干细胞培养液去除细胞的培养液为活性成份和适当医药可接受的载剂。
本发明的各个具体实施方式的细节说明如后。本发明的其他特征将会经由以下各个具体实施方式中的详细说明及权利要求而清楚呈现。
无须进一步的阐述，咸相信本发明所属技术领域的技术人员基于前述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明的用，而非以任何方式限制其余的揭露内容。
附图说明
前文的所述以及后附的具体实施方式可通过说明书附图达到更好的说明效果。为了加强本发明的说明，将适当的实施例的附图列举于此。
图1显示低氧下培养的人类脐带间质干细胞，无论经过1天、或2天，其增生能力与正常培养下相当。*为和同条件下培养1天的组别相比。有统计差异者，P<0.05。
图2显示以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理培养中的纤维母细胞，在12小时、18小时及24小时，其剩余面积比率与正常组相比，有显着的减少情形，即代表有较多的纤维母细胞移行至刮除区域内，导致空白面积减少。*剩余面积比率和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图3显示处理低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，有助于伤口的愈合。*面积百分比和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图4显示给予低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，大白鼠伤口在第2天、第4天、及第14天时的创伤体积与控制组相比，有明显的减少情形。*伤口体积和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图5显示给予低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，大白鼠伤口在第8天、及第14天，单位长度下伤口周边毛囊的数目明显多于控制组。*周边毛囊的数目和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图6显示以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，在第2天、第4天、及第8天，创伤区域内胶原蛋白所占面积明显高于控制组。*胶原蛋白面积百分比和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图7显示以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，在第2天、第4天、及第8天，创伤区域内嗜中性白血球的细胞数明显高于控制组。*呈色细胞数和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图8显示以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，在第2天及第4天，创伤区域内吞噬性白血球的细胞数明显高于控制组。*呈色细胞数和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图9显示以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，在第2天、第4天、第8天及第14天，创伤区域内血管密度明显高于控制组。*血管密度百分比和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图10显示给予正常氧浓度培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，大白鼠伤口在第2天时的创伤体积与控制组相比，有明显的减少情形。*伤口体积和同一时间的控制组组相比。有统计差异者，P<0.05。
图11显示以正常氧浓度培养的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，在第4天及第8天，创伤区域内嗜中性白血球的数目明显高于控制组。*呈色细胞数和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图12显示以正常氧浓度培养的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，在第4天，创伤区域内巨噬细胞的数目明显高于控制组。*呈色细胞数和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
图13显示以正常氧浓度培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，在第4天，创伤区域内血管密度明显高于控制组。*血管密度百分比和同一时间的控制组相比。有统计差异者，P<0.05。
具体实施方式
除非另外定义，本文中所用的所有技术及科学词汇具有所属技术领域的技术人员所通常明了的相同意义。
在本文中，冠词「一」系指一个或一个以上（亦即，至少一个）的该冠词的文法客体。举例而言，「一组件」意谓一个组件或一个以上的组件。
在一方面，本发明提供一种脐带间质干细胞培养液或由其制得的产物作为制备治疗皮肤创伤的药剂的应用，其中该培养液不含细胞。
本文所使用的「脐带间质干细胞（umbilical mesenchymal stem cells）」乙词是指位于哺乳类动物脐带，较佳为人类脐带间质组织中的干细胞，可为未经纯化的细胞培养物或纯化后的细胞。以下实例说明从个体组织取得脐带间质干细胞的流程。脐带为生产后废弃物，来源取得容易，没有道德顾虑，处理方式简单，数量极多、繁殖快速。且本实验室先前发现，移植人類脐带间质干细胞，不会引起宿主产生免疫排斥反应。所以人類脐带间质干细胞为一种适合用來进行異体移植的良好干细胞來源。在一具体实例中，本发明的脐带间质干细胞是來自人類脐带沃顿胶(Wharton’s jelly)。
本文所使用的「脐带间质干细胞培养液（umbilical mesenchymal stem cellculture fluid）」是指脐带间质干细胞经培养后，继而经分离移除细胞后的培养液体。用于培养脐带间质干细胞的培养基可为任何习知的基本培养基，其可自商业上购得或依需要调制而成。商业上可购得的培养基包括DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、MEM(Minimal Essential Medium)或RPMI等。此等培养基可进一步添加适当含量的血清蛋白，例如，1-20%的牛血清蛋白，特定为1-5%的牛血清蛋白，更特定为2%的牛血清蛋白。
根据本发明，脐带间质干细胞可培养于约20%或以下的条件下，亦即正常氧条件或低于正常氧的低氧条件下。正常氧条件是指培养环境中的氧气百分比约20%，而低氧环境是指培养环境中的氧气百分比低于约20%，特定而言，低于约10%，更特定而言，低于约5%。在一特定实例中，脐带间质干细胞为培养于约1%的低氧条件。
培养一段时间后，例如，一天或二天以上，离心移除细胞，以取得不含细胞的脐带间质干细胞培养液，其经证实具有优异的治疗皮肤创伤的功效（请参以下实例）。本发明的脐带间质干细胞培养液可以冷冻保存，或可经浓缩，或以冷冻干燥形成粉末，长期储存。使用前，可将粉末溶于无菌水，再经过滤除菌处理。
为有利于输送，根据本发明的脐带间质干细胞培养液或由其制得的产物可进一步配制成药剂，包括医药或敷料。
一种治疗皮肤创伤及促进创伤愈合的医药组合物，其特征是包含以脐带间质干细胞培养液去除细胞的培养液为活性成份，和适当医药可接受的载剂。
本文所使用的「药剂」是指一种作为医药的组合物或混合物，其通常含有载体，诸如，医药可接受的载体或赋形剂，其为技艺中所习知且适合投药至对象中，以作为治疗性、诊断性或预防性的目的。此处「医药上可接受」是指该载剂可与本发明药剂内所含的有效成分兼容，其较佳为能稳定该活性成分并且对被治疗的个体无害。医药组合物的形式可为溶液、悬浮液、锭剂、丸剂、胶囊或粉末的医药或敷料，其给药方式较佳为局部敷用。
本文所使用的「医药可接受的载体」是指任何习知类型的无毒固体、半固体或液体的填充剂、稀释剂、包胶囊材料、调配物辅助剂或赋形剂。医药可接受的载体为在所用的剂量及浓度下，对接受者无毒性，且可与该调配物的其他成分兼容。医药可接受的载体一般均可由公众轻易取得。此外，医药可接受的辅助物质，诸如，pH调节及缓冲剂、渗透压调节剂、安定剂、湿润剂及类似物，亦皆可由公众取得。
适当的载体包括，但不限于，水、葡萄糖、甘油、盐水、乙醇及其组合。载体可含有额外的试剂，诸如，湿润及乳化剂、pH缓冲剂或是佐剂，其可增强该调配物的有效性。局部性载体包括液体石油、棕榈酸异丙酯、聚乙二醇、乙醇（95%）、溶于水中的聚氧乙烯单月桂酸酯（5%）或是溶于水中的十二烷基硫酸钠（5%）。可视需要加入其他材料，诸如，抗氧化剂、保湿剂、黏度稳定剂及类似试剂。
本发明的药剂可用于治疗皮肤创伤，个体较佳为哺乳动物，更佳为人类。在一具体实例中，所述药剂可植入皮肤创伤，或置于皮肤创伤周围，或皮肤创伤上。或施加于敷料在置于皮肤创伤上。
本发明药剂的剂量可视各种因素而变动，例如，投药途径、接受该药剂的个体的体重和品种，以及投药目的。技术人员可根据此处的揭示及此领域已建立的方法依经验决定每一个别案例的剂量。
现参考以下具体实施例更明确地描述本发明，其目的为用以说明而非作为限制。
实例
实例1：人类脐带间叶干细胞的制备
本实验室采用人类分娩后的脐带，以无菌操作方式保存在4℃的HBSS(BiochromL201-10)中，24小时内进行脐带间质干细胞分离操作。实验器械皆需经过高温高压灭菌，分离操作中全程以75%酒精消毒，并于使用前过火。于无菌操作台中取出脐带，并以酒精消毒后置于无钙及无镁離子的缓冲溶液(CMF,Gibco14185-052)。接着，以器械将脐带纵切，剥离其动脉与静脉后，收集脐带间质组织，瓦顿氏凝胶(Wharton’s Jelly)，并切成0.5立方公分的小块，以4000rpm離心5分钟。去除上清液后，加入适量无血清DMEM培养液(Gibco12100-046)以4000rpm離心5分钟，清洗沉淀物二次。将间质组织在37℃下以胶原酵素(collagenase)反应14至18小时，再以2.5%的胰蛋白酵素(trypsin)于37℃震荡下作用30分钟，然后加入FBS(Hyclone SH30071.03)终止胰蛋白酵素反应。最后，计数分离出来的人類脐带间质细胞(human umbilical mesenchymal stem cell；简称HUMSCs)，并进行体外培养。
实例2：人类脐带间叶干细胞培养液的制备（正常氧浓度及低氧浓度）
取人类脐带间质干细胞进行体外培养，待24小时细胞完全贴附后，再换成含有2%BSA(Albumin,bovine serum,Sigma A4503)的DMEM培养液，个别置于正常培养箱(Normoxia；20%O2、5%CO2)、或低氧培养箱(Hypoxia；1%O2、5%CO2)中，培养1天、或2天以上，收集干细胞条件培养液，分别称为正常氧1天、正常氧2天、低氧1天、和低氧2天HUMSCs条件培养液(简称Normoxia1D、Normoxia2D、Hypoxia1D、和Hypoxia2D)，以1200rpm离心5分钟，分离细胞与培养液，吸取上清液，置于-80℃冷冻保存。冷冻后的培养基经由冷冻干燥机(VIRTISBENCHTOP2K)成粉末，可长期保存。于使用前，以无菌三次水溶解粉末，再以0.45μm孔径大的滤膜过滤，方可使用。
实例3：正常氧浓度及低氧环境不影响人类脐带间质干细胞的增生能力
经由正常氧浓度、或低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞，以0.05%胰蛋白酶(Biochrom L2153)处理三分钟后分别收集细胞液，并加入等量10%FBS DMEM培养液中和并均匀打散，吸取适量细胞液至于细胞计数器计数，比较正常、或低氧环境培养下，人类脐带间质干细胞的生长速度是否有受到影响(图1)。
结果显示，正常氧浓度培养1天(正常氧Normoxia1D组)的人类脐带间质干细胞，其数目为4.9±0.29(x105)；低氧环境下培养1天(Hypoxia1D组)的人类脐带间质干细胞数，其数目为4.87±0.29(x105)；正常氧浓度培养2天(正常氧Normoxia2D组)的人类脐带间质干细胞，其数目为12.8±0.8(x105)；低氧环境培养2天(低氧Hypoxia2D组)的人类脐带间质干细胞，其数目为11.77±0.59(x105)。结果显示，在正常氧浓度、及低氧环境下培养，人类脐带间质干细胞，皆有增生情形；但在正常氧浓度、及低氧环境下培养，细胞数目并没有统计差异(图1)。因此，正常氧浓度及低氧环境不影响人类脐带间质干细胞的增生能力。
实例4：大白鼠真皮纤维母细胞(Rat dermal fibroblasts)的体外培养及移行能力测试
本实验使用阳明大学实验动物中心所繁殖的Spraque-Dawley(S.D.)种系出生三天内新生幼鼠。幼鼠经腹腔注射麻醉，进行纤维母细胞分离操作。实验器械皆需经过高温高压灭菌，分离操作中全程以75%酒精消毒，并于使用前过火。麻醉后幼鼠浸泡于75%酒精消毒，以器械取下幼鼠躯干皮肤后，加入胰蛋白酵素于4℃作用12小时以弱化表皮与真皮的连结。接着去除表皮后，真皮组织置于37℃胶原酵素下反应30分钟，然后加入FBS终止酵素反应，并加入DMEM清洗沉淀物二次，最后计数分离出来的大鼠纤维母细胞进行体外培养。本研究以继代2-3次的大鼠纤维母细胞进行实验。
为了定量真皮纤维母细胞的活性，我们将培养中的真皮纤维母细胞刮出一道刮痕(gap)，再计算刮痕内，除掉移行过来的细胞数目后的空白面积，空白面积越大表示移行的细胞越小，以此作为真皮纤维母细胞的活性指数。以2%BSA DMEM培养液、或低氧Hypoxia2D条件培养液培养的大鼠真皮纤维母细胞，当细胞形成单层后，于培养的真皮纤维母细胞，刮出一道宽度固定的区域，并用倒立式光学显微镜确认区域内的细胞完全被刮除。接着，持续培养细胞，分别于0小时、12小时、18小时、24小时，计算没有纤维母细胞存在的空白区域面积。
显微镜下观察显示，被刮除的区域形成一道没有细胞的空白区域。的后，于第12小时、第18小时、第24小时进行观察，随着时间增加可见细胞朝刮除区移动，而刮除区域面积逐渐减少。我们以第0小时刮除的空白区域面积为100%，观察在第12、第18、和第24小时后，所剩刮除空白区域面积占第0小时刮除的空白区域面积的百分比，来表示纤维母细胞爬行的速度，即代表纤维母细胞的活性。
从统计结果显示，经低氧环境培养2天以上的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠真皮纤维母细胞，在第12、18及24小时后，其刮除区域面积大小与同时间的控制组相比，有明显缩小的情形(P<0.05，图2)。结果显示，经低氧环境培养的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠真皮纤维母细胞，可促进纤维母细胞的移行能力。
实例4：动物实验
4.1材料方法
4.1.1实验动物
本实验所用的SD(Sprague-Dawley)种系六周大白鼠购自阳明大学实验动物中心，每日人工照明12小时，恒温控制于22±2℃，充分供应饮水与食物。
4.1.2大白鼠背部皮肤创伤的建立
S.D.大白鼠(雄性，250-300g)注射麻醉剂后，剃除背部毛发，以酒精消毒背部皮肤，利用直径8mm的组织钻孔组织切割器(biopsy punch)完整去除同大小的表皮与真皮，形成圆形背部皮肤创伤。再以防水透气敷料(Tegaderm，3M,London ON,Canada)覆盖于伤口上，避免抓伤。
4.1.3实验分组
实验动物分成三组：
第一组为控制组，即大白鼠背部创伤建立后，注射10倍浓缩的2%BSA DMEM培养液200μl。
第二组为正常氧Normoxia组，即大白鼠背部创伤建立后，注射10倍浓缩的正常氧浓度培养两天以上的人類脐带间质干细胞的条件培养液200μl。
第三组为低氧Hypoxia组，即大白鼠背部创伤建立后，注射10倍浓缩的低氧环境下培养两天以上的人類脐带间质干细胞的条件培养液200μl。
4.1.4人类脐带间质干细胞的条件培养液的处理步骤
大白鼠背部创伤建立后，立即给予浓缩的人類脐带间质干细胞培养基治疗200μl。将培养基由微注射针注入伤口周围的真皮组织中(intradermal)，四个注射点，每点约50μl培养液，总计体积200μl。
4.1.5定量伤口的变化：
为了定量伤口修复的情形，将大白鼠麻醉后，使用OxyLab LDF进行拍摄，用來记录创伤愈合的过程中，伤口大小的变化。背部创伤建立为第0天，的后每隔两天拍照一次，一直拍摄到第14天。
4.1.6伤口微观组织型态观察
4.1.6.1实验动物牺牲、灌流固定及冷冻切片
麻醉的大白鼠以4%三聚甲醛(paraformaldehyde，Sigma16005)，7.5%苦味酸(picric acid，Sigma P6744in0.1MPB)的固定液灌流固定。将皮肤组织取出，依序浸泡于固定液、30%蔗糖(sucrose in0.1M PB)，待组织脱水沈底后，进行冷冻切片，将皮肤组织切成厚度为20μm的连续组织片，以进行接下来的组织免疫染色(图3)。
4.1.6.2苏木精及伊红染色
将组织切片置于苏木精(Hematoxylin)溶液中(J.T.Baker3870)染色30分钟，经二次水清洗，再以伊红溶液(Eosin Y solution)(J.T.Baker3874)染色2分钟。接着将切片浸泡于浓度递增的酒精内进行脱水(50%、70%、80、90%、95%、100%2次)，最后再浸泡于100%xylene(J.T.Baker94943-14)中2次，每次5分钟。完成后以片胶(permount，FisherScientific SP15-500)封片，进行光学显微镜观察，并撷取影像，定量组织内伤口的总体积(图4和图10)，与测量出创伤区域范围内的毛曩数目(图5)，即可知道伤口复原的状况。
4.1.6.3天狼猩红染色
为了探究伤口愈合过程中，胶原纤维堆积的状况，因此以天狼猩红(sirus red)染剂标定胶原纤维成红色，并定量胶原纤维的量。将组织切片置于0.1%天狼猩红(SigmaDirect Red80)于苦味酸(picric acid)中染色7分钟，二次水清洗二次，接着将切片浸泡于浓度递增的酒精内进行脱水 (50%、70%、80、90%、95%、100%2次)，最后再浸泡于100%xylene2次，每次5分钟。完成后以片胶封片，进行光学显微镜观察，并撷取影像，进行定量(图6)。
4.1.6.3组织免疫染色
免疫染色法是藉由抗原抗体结合的原理，标定出细胞内特定蛋白质所在位置的方法。
将组织切片先以0.1M PBS(磷酸缓冲液盐水)清洗5分钟3次，再浸泡于0.5%过氧化氢溶液中20分钟，以去除组织中的内生性过氧化氢酵素活性，的后以0.1M PBS清洗5分钟3次。以阻断溶液(3%牛血清蛋白BSA、1%Triton X-100、5%胎牛血清FBS)室温下反应60分钟，用以去除的后初次抗体作用所可能产生的非特異性抗体结合。加入初级抗体小鼠抗ED1抗体(Mouse anti-ED1antibody，MAB1435,1:500针对单球细胞或巨噬细胞(图8和图12))、兔抗骨髓过氧化酶(Rabbit anti-myeloperoxidase antibody，简称anti-MPO,RB-373-A,1:100针对嗜中性球细胞(图7和图11))，于4℃下反应12至16小时。
以0.1M PBS清洗5分钟3次，接着与次级抗体(Goat anti mouse IgG biotin,1:250)(Goat anti rabbit IgG biotin,1:250)于室温下反应60分钟，同样以0.1MPBS清洗5分钟3次。接着以亲和素-生物素辣根过氧化酶复合物(Avidin-biotinylated-horseradishperoxidase complex，ABC Kit,Vector)室温下反应60分钟，以0.1M PBS清洗5分钟3次，最后以DAB呈色。
完成后，将玻片浸泡至浓度递增的酒精内进行脱水(50%、70%、80、90%、95%、100%2次)，再以浸泡于100%二甲苯(xylene)2次，每次5分钟。完成后以片胶封片，进行光学显微镜观察，并撷取影像，进行定量。
4.1.6.4背部皮肤血管测量
20μm厚度的组织切片，以加纳谷物1-凝集素(Griffonia simplicifomia 1-lectin，简称GS1-lectin，Vector Laboratories)来标定周边血管与微血管的绿色荧光染剂(Hansen-Smith,Egginton et al.1998)。将组织切片浸泡于最终浓度25μg/ml的GS1-lectin溶液中，避光染色60分钟后，以0.1M PB 清洗5分钟3次，封片后以荧光显微镜观察，并撷取影像，进行定量(图9和图13)。
4.2结果
4.2.1以低氧环境培养下获得的人类脐带间质干细胞的条件培养液的治疗皮肤创伤效果
4.2.1.1皮肤创伤愈合
如前述，大白鼠背部皮肤以组织钻孔组织切割器造成一个直径约8mm的伤口，此时为第0天，每两天巨观拍照一次，从第0天持续观察到第14天。我们以各组第0天的伤口面积为100%，来计算往后伤口面积与第0天相比的百分比。结果显示Hypoxia组别，在第二天伤口已降为71.31±1.63%，明显小于控制组(P<0.05，图3)，此现象一直维持到第14天(P<0.05，图3)。由统计结果可见，以低氧环境培养的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠的背部伤口，有加速皮肤创伤的愈合(P<0.05，图3)。
4.2.1.2伤口体积较小
接下来，在我们进一步利用连续的皮肤组织切片，进行H&E染色观察，在创伤后第2天，低氧Hypoxia组的伤口体积为44.82±1.05mm3，明显小于控制组的伤口体积(65.14±4.44mm3)(P<0.05，图4)。此明显的差异，也出现在创伤后第4天与第14天(P<0.05，图4)。
4.2.1.3毛囊生长效果
在创伤后第8天，伤口组织建构已渐趋完整，此时表皮几乎已完全覆盖于伤口上方，毛囊也从伤口周边开始新生。经过统计分析，以低氧环境培养的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠的背部伤口(低氧Hypoxia组)，其单位长度下毛囊的数目为为1.94±0.11个/mm，显着高于控制组1.48±0.15个(P<0.05，图5)。到第14天，低氧Hypoxia组的皮肤上毛囊数目，仍然较控制组来得多(P<0.05，图5)。因此推论，以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的培养基，处理大白鼠的背部伤口，有助于皮肤创伤愈合过程中毛囊的生长。
4.2.1.4胶原蛋白的建构效果
以天狼猩红标识创伤皮肤中的胶原蛋白，从染色结果显示，在创伤后第2天，肉芽组织(granulation tissue)尚未形成，细胞外胶原蛋白的堆积松散。第4天，细胞外胶原蛋白正要开始堆积，胶原蛋白分布的情形也都有提高。到了第8天，此时伤口建构稳定，胶原蛋白则大量表现。由统计结果发现，以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的培养基，处理大白鼠伤口(即低氧Hypoxia组)，在第2天、第4、及第8天，创伤区域内胶原蛋白所占面积明显高于控制组(P<0.05，图6)。
4.2.1.5嗜中性白血球和巨噬细胞的聚集效果
先前研究已得知，在伤口愈合初期，嗜中性白血球(neutrophil)会率先浸润到创伤区域清除坏死组织，同时，释放细胞激素吸引巨噬细胞(macrophage)到创伤部位，帮助伤口重建与愈合。因此在伤口修复初期，嗜中性白血球(neutrophil)和巨噬细胞(macrophage)扮演着加速伤口愈合重要角色。
如前述的抗骨髓过氧化酶抗体(简称anti-MPO)标定嗜中性白血球，分别观察创伤后第2天、第4天、第8天、及第14天，在创伤组织中表现情形。切片结果显示，在创伤第2天，两组均可观察到有嗜中性白血球浸润于伤口下方；在创伤后第4天，嗜中性白血球的表现量更是达到高峰；第8天，随着伤口逐渐愈合稳定，浸润的现象趋缓，整体细胞数量皆有减少的趋势。根据统计结果显示，而以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠的背部伤口(即低氧Hypoxia组)，显示浸润到皮肤创伤区域内的嗜中性白血球，不论在第2天、第4天、与第8天，控制组相比，均有明显增加的现象(P<0.05，图7)。
接着以抗ED1抗体标定巨噬细胞，分别观察创伤后第2天、与第4天，在创伤组织中的表现情形。切片结果显示，在创伤第2天与第4天，两组均可观察到有巨噬细胞浸润于伤口下方。根据统计结果显示，而以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠的背部伤口(即低氧Hypoxia组)，显示浸润到皮肤创伤区域内的巨噬细胞，不论在第2天、和第4天，控制组相比，均有明显增加的现象(P<0.05，图8)。
4.2.1.6伤口区域内的血管增生
为了探讨以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，对大鼠皮肤损伤处血管密度的影响，我们以GS1-lectin标定皮肤内的血管与微血管。定量结果显示，在第2天，各组皆有被荧光标定的物质，其形态尚未形成管状，低氧Hypoxia组所标定到的物质明显多于控制组。第4天及第8天时，GS1-lectin标定到的血管型态非常清楚，并观察到低氧Hypoxia组的血管分布明显多于控制组。到了第14天，各组伤口的重建修复已近完整，血管密度也渐趋回复。统计分析，Hypoxia组在第2天、第4、第8、及第14天，创伤区域内血管密度明显高于控制组(P<0.05，图9)，即代表以低氧环境培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，有助于促进伤口区域内的血管增生。
4.2.2以正常氧浓度培养下获得的人类脐带间质干细胞的条件培养液的治疗皮肤创伤效果
4.2.2.1皮肤创伤愈合
如前述，大白鼠背部皮肤以组织钻孔组织切割器造成一个直径约8mm的伤口，此时取正常氧浓度培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠的背部伤口(即为正常氧Normoxia组)，我们利用连续的皮肤组织切片，进行H&E染色定量，在创伤后第2天，正常氧Normoxia组的伤口体积为54.95±3.35mm3，明显小于控制组的伤口体积(65.14±4.44mm3)(P<0.05，图10)。
4.2.2.2嗜中性白血球和巨噬细胞的聚集效果
进一步，以抗骨髓过氧化酶抗体(简称anti-MPO)标定嗜中性白血球，分别观察创伤后第4天、及第8天，在创伤组织中表现情形。切片结果显示，在创伤后第4天，嗜中性白血球大量的表现；第8天，随着伤口逐渐愈合稳定，浸润的现象趋缓，整体细胞数量皆有减少的趋势。根据统计结果显示，而以正常氧浓度培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠的背部伤口(即正常氧Normoxia组)，显示浸润到皮肤创伤区域内的嗜中性白血球，不论在第4天、与第8天，控制组相比，均有明显增加的现象(P<0.05，图11)。
接着以抗ED1抗体标定巨噬细胞，分别观察第4天，在创伤组织中的表现情形。切片结果显示，在创伤第4天，两组均可观察到有巨噬细胞浸润于伤口下方。根据统计结果显示，而以正常氧浓度培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠的背部伤口(即正常氧Normoxia组)，显示浸润到皮肤创伤区域内的巨噬细胞，在第4天，控制组相比，均有明显增加的现象(P<0.05，图12)。
4.2.2.3伤口区域内的血管增生
为了探讨以正常氧浓度培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，对大鼠皮肤损伤处血管密度的影响，我们以GS1-lectin标定皮肤内的血管与微血管。定量结果显示，第4天时，GS1-lectin标定到的血管型态非常清楚，并观察到正常氧Normoxia组的血管分布明显多于控制组(P<0.05，图13)，即代表以正常氧浓度培养下的人类脐带间质干细胞的条件培养液，处理大白鼠伤口，有助于促进伤口区域内的血管增生。
Claims (3)
1.一种制备治疗皮肤创伤及促进创伤愈合的药剂的方法，其中包括收集人类脐带间质干细胞之瓦顿氏凝胶(Wharton’s Jelly)，切成小块，以一培养液清洗并以胶原酵素(collagenase)及胰蛋白酵素(trypsin)处理，然后终止胰蛋白酵素反应，分离出脐带间质干细胞，培养于含氧浓度为约20％或以下的条件的一高糖DMEM液状培养基中，再经分离移除该脐带间质干细胞后取得上清液而获得，该上清液进一步经干燥而呈粉末状，并加入适当医药可接受的载剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中该脐带间质干细胞培养于正常含氧条件。
3.如权利要求1所述的方法，其中该脐带间质干细胞培养于低氧条件。
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