CN1176207C - 神经干细胞培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种神经干细胞培养基及其制备方法，由DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液、胰岛素、盐酸丁二胺、硒化钠、氢化可的松、L-谷氨酰胺、人转铁蛋白和黄体酮配制而成，本发明具有使骨髓组织等不同来源种子细胞定向发育分化为神经干细胞功能，可随时准确无误地为医学科研教学及临床应用提供相关需要的神经干细胞；其配制方法简单，可重复性强，操作简便易行。

Description

神经干细胞培养基及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种细胞培养基，具体是涉及一种用于培养神经干细胞的培养基，本发明还涉及该神经干细胞培养基的制备方法。
背景技术
神经干细胞研究是1998年以来的国内外新研究课题。神经干细胞是中枢神经系统的多潜能细胞，是脑内三种主要细胞(神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞)的共同前体细胞，具有以下特性：(1)处于未分化状态，无成熟细胞的特异性标志；(2)具有多向分化潜能，即演变成不同类型成熟细胞的能力；(3)可通过不对称分裂而自我复制或更新，产生与自己相同的子代细胞，从而维持细胞数目的稳定。神经干细胞的来源主要有四个方面：胚胎干细胞(embryonic stem cells，ES细胞)或胚胎神经组织、神经嵴细胞、脑组织、骨髓基质。正由于神经干细胞是具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞的能力，能自我更新并足以提供大量脑组织细胞的细胞，因此培养神经干细胞旨在将作为种子细胞源的一定组织细胞(如骨髓间充质细胞等)在特制的培养基中调控分化成具有增殖及分化潜能的神经干细胞，以便进行自体回输、治疗中枢神经系统功能损害，为临床进一步应用于相关疾病的神经干细胞移植治疗奠定实验基础。
对于一般的胚胎干细胞而言，在适宜环境下可以分化生长成各种不同的组织细胞，故人们可用胚胎干细胞培育出各种新组织甚至器官进行移植。而对于神经干细胞而言，主要焦点在于成功地从不同途径培养、获得足够数量的神经前体细胞，以供移植治疗、或进行转基因操作攻击肿瘤的生长、观察某些合成/天然化合物的神经活性等。比如，若能从自体抽得骨髓组织作为神经干细胞的种子细胞，在一定条件下诱导分化为神经干细胞、进而回输于自体体内，并在局部微环境作用下产生多巴胺能神经细胞，就可用于治疗其帕金森症。而令这种技术应用的关键前提，是能否使骨髓源等种子细胞在特定环境中培养成所需的神经干细胞。现用一般合成细胞培养基均为普遍细胞存活培养之用，如Eagle，DMEM，F12，RPMI1640，CMRL1066，L15，199，MB752/1等，其主要含有成份为氨基酸、维生素、无机盐、糖类等。这些合成培养基的主要作用是为不同种类组织细胞提供一般生存生长的微环境，而上述细胞培养基都缺乏将不同来源的种子细胞(如骨髓组织细胞等)定向分化为神经干细胞的能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有使骨髓组织等不同来源种子细胞定向发育分化为神经干细胞功能的细胞培养基，可随时准确无误地为医学科研教学及临床应用提供相关需要的神经干细胞。
本发明的另一目的提供该神经干细胞培养基的制备方法。
为实现上述目的，本发明神经干细胞培养基包含下列重量配比的组分(重量份)：
DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液  10000～25000
胰岛素(Insulin)                      4.5～12.5
盐酸丁二胺(Putrescine)               9.2～35.6
硒化钠(Sodium Selenide)              0.01～0.51
氢化可的松(Hydrocortisone)           5.0～35.0
所述本发明各组分的优先重量(份)配比范围是：
DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液  10000～15000
胰岛素(Insulin)                      4.5～6.5
盐酸丁二胺(Putrescine)               9.2～15
硒化钠(Sodium Selenide)              0.01～0.4
氢化可的松(Hydrocortisone)           9～12
所述本发明还包含下列重量配比的组分(重量份)：
L-谷氨酰胺(L-Glutamine)              3.5～12.5
人转铁蛋白(Transferrin)              50.0～150.0
黄体酮(Progesterone)                 0.01～0.55
将上述各组分制成本发明神经干细胞培养基的制备方法依次包括以下步骤：
①按所述比例取DMEM和F12以1∶1混合而成的基础培养液，加纯净水至浓度为10～25g/L，并充分搅拌溶解，制得细胞的一般基础培养液；
②按所述比例再取胰岛素(Insulin)、盐酸丁二胺(Putrescine)、硒化钠(SodiumSelenide)、氢化可的松(Hydrocortisone)依次加入基础培养液中，充分搅拌均匀；
③以1～10当量浓度的氢氧化钠调pH7.4～8.0；
④层流细胞培养室抽滤消毒，4℃储存备用。
本发明神经干细胞培养基的制备方法的步骤2中还可按所述比例加入L-谷氨酰胺(L-Glutamine)、人转铁蛋白(Transferrin)、黄体酮(Progesterone)。
本发明中的DMEM和F12混合而成的基础培养液作为一般种子细胞生长发育的基本微环境；胰岛素可通过促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，从而促进细胞增殖分裂，特别是促进神经干细胞生长；L-谷氨酰胺可促进神经干细胞发育生长期间核酸、蛋白质的合成；盐酸丁二胺能刺激、诱导神经干细胞增殖；硒化钠参与、促进神经干细胞代谢；人转铁蛋白可结合铁离子，减少其毒性和被细胞所利用，同时使神经干细胞数量增多、减少成纤维细胞数；氢化可的松促进神经干细胞生长发育；黄体酮促进神经干细胞生长。用本发明培养的神经干细胞经过免疫细胞化学鉴定表达特有的高亲和力抗原NESTIN；表达NESTIN抗原的神经干细胞可进一步分化为神经元、神经胶质细胞，证明本发明能有效地诱导包括骨髓组织种子细胞在内的各种来源组织细胞分化为神经干细胞，其诱导时间为11～21天。用本发明培养的神经干细胞移植至有脑或脊髓损伤的病灶周围，移植3个月后症状有明显改善(主要表现为运动功能不同程度的恢复)，病理切片检测有神经干细胞向病灶区迁移、整合现象。另外其配制方法简单，可重复性强，操作简便易行。本发明为有关神经干细胞及其应用的科研、教学、临床应用等能起到不可估量的作用，同时也孕育着巨大的社会效益和经济效益。
具体实施方式
本实施例一由下列重量配比的组分配成：
DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液  12g
胰岛素(Insulin)                      5mg
L-谷氨酰胺(L-Glutamine)              3.9mg
盐酸丁二胺(Putrescine)               10mg
硒化钠(Sodium Selenide)              0.03mg
人转铁蛋白(Transferrin)              100mg
氢化可的松(Hydrocortisone)           10mg
黄体酮(Progesterone)                 0.02mg
本实施例二由下列重量配比的组分配成：
DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液  10g
胰岛素(Insulin)                      4.5mg
L-谷氨酰胺(L-Glutamine)              3.5mg
盐酸丁二胺(Putrescine)               9.2mg
硒化钠(Sodium Selenide)              0.01mg
人转铁蛋白(Transferrin)              50mg
氢化可的松(Hydrocortisone)           5mg
黄体酮(Progesterone)                 0.01mg
本实施例三由下列重量配比的组分配成：
DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液  25g
胰岛素(Insulin)                      12.5mg
L-谷氨酰胺(L-Glutamine)              12.5mg
盐酸丁二胺(Putrescine)               35.6mg
硒化钠(Sodium Selenide)              0.51mg
人转铁蛋白(Transferrin)              150mg
氢化可的松(Hydrocortisone)           35mg
黄体酮(Progesterone)                 0.55mg
本实施例四由下列重量配比的组分配成：
DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液  12g
胰岛素(Insulin)                      5mg
盐酸丁二胺(Putrescine)               10mg
硒化钠(Sodium Selenide)              0.03mg
氢化可的松(Hydrocortisone)           10mg
配制上述实施例一的制备方法依次包括以下步骤：
1、取DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液12g，加纯净水至浓度为12g/L，并充分搅拌溶解，制得细胞的一般基础培养液；
2、再取胰岛素(Insulin)5mg、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)3.9mg、盐酸丁二胺(Putrescine)10mg、硒化钠(Sodium Selenide)0.03mg、人转铁蛋白(Transferrin)100mg、氢化可的松(Hydrocortisone)10mg、黄体酮(Progesterone)0.02mg依次加入步骤1所制得的基础培养液中，充分搅拌均匀，并以纯净水定容为1000毫升，此时呈橙黄微浊状态；
3、以5当量浓度的氢氧化钠调pH为7.8，此时培养基呈桃红色清亮状态；
4、层流细胞培养室抽滤消毒(过滤膜孔直径为0.22μm规格)，4℃储存备用。
配制上述实施例二、三、四的制备方法与实施例一相同，不同之处在于各组分的含量。

Claims (5)

1、一种神经干细胞培养基，其特征在于：包含下列重量配比的组分：
DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液    10000～25000
胰岛素                                 4.5～12.5
盐酸丁二胺                             9.2～35.6
硒化钠                                 0.01～0.51
氢化可的松                             5.0～35.0
2、根据权利要求1所述的神经干细胞培养基，其特征在于：所述各组分的重量份配比是：
DMEM和F12按1∶1混合而成的基础培养液    10000～15000
胰岛素                                 4.5～6.5
盐酸丁二胺                             9.2～15
硒化钠                                 0.01～0.4
氢化可的松                             9～12
3、根据权利要求1或2所述的神经干细胞培养基，其特征在于：还包含下列重量配比的组分：
L-谷氨酰胺                             3.5～12.5
人转铁蛋白                             50.0～150.0
黄体酮                                 0.01～0.55
4、权利要求1所述神经干细胞培养基的制备方法，其特征在于依次包括以下步骤：
①按所述比例取DMEM和F12以1∶1混合而成的基础培养液，加纯净水至浓度为10～25g/L，并充分搅拌溶解，制得细胞的一般基础培养液；
②按所述比例再取胰岛素、盐酸丁二胺、硒化钠、氢化可的松依次加入基础培养液中，充分搅拌均匀；
③以1～10当量浓度的氢氧化钠调pH7.4～8.0；
④层流细胞培养室抽滤消毒，4℃储存备用。
5、根据权利要求4所述神经干细胞培养基的制备方法，其特征在于：步骤2中还可按所述比例加入L-谷氨酰胺、人转铁蛋白、黄体酮。
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