CN102429236A - 一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法，包括以下步骤：1、猪骨泥的制备，取新鲜猪骨破碎、脱脂、粉碎制成猪骨泥；2、骨胶原多肽的制备，配置猪骨泥培养液，接种粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种，发酵后离心、过滤、干燥制得骨胶原多肽；3、可溶性骨钙的制备，取发酵后剩余的骨泥渣，与盐酸混合制备可溶性骨钙；4、骨胶原多肽钙螯合物补钙剂的制备，取骨胶原多肽和可溶性骨钙螯合，制备猪骨胶原多肽钙螯合物补钙剂；本发明方法提高了猪骨资源的附加值，实现了猪骨中胶原蛋白和骨钙的综合开发利用，制备的螯合物补钙剂在水中的溶解度好，对于人体对螯合物中钙元素的吸收利用非常有利，并能应用于、化工、食品、化妆品、等多个领域。

Description

一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品的加工技术领域，具体涉及一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法。
背景技术
我国是一个畜牧业大国，随着我国畜禽养殖业的发展，每年我国约有近1500万吨的畜禽骨骼产生。对于畜禽骨资源综合开发直接影响着畜禽养殖的经济效益；对骨进行加工利用，将会产生极大的经济效益和社会效益，具有极大地开发前景。根据我国的2010年统计，我国的猪骨产量可达到800多万吨，并且每年还在上升。面对如此巨大的生物资源，长期以来对猪骨的加工主要集中在生产骨胶、骨脂、饲料、肥料等方面，很少用于开发附加值高的产品。这些低技术含量的加工产品不仅经济效益低下，而且造成了大量的环境污染问题。因此，针对大量的畜禽骨资源，开发新型的精深骨骼产品已成为目前迫切的任务。
畜禽骨骼中的胶原蛋白是营养全价的一种蛋白质，利用骨蛋白资源开发多肽制品是当前研究的热点。采用骨骼所开发的食品的营养价值等于或超过鲜肉，但价格只相当于鲜肉的一半。由于技术水平的限制，忽视了猪骨营养蛋白资源成分的利用，而猪骨中所含的钙，却是人体最易于吸收和消化的钙源之一。利用动物性蛋白资源开发多肽制品是当前研究的热点。近几年有关酶解畜禽骨骼的报道很多，虽然取得了一定的成绩和突破，但由于酶解骨骼的酶的来源不同，成本较高，而且由于没有找到真正合适的降解骨骼的大工业生产利用的蛋白酶，能否实现工业化生产面临极大挑战。因此，探索新的开发骨骼途径和方法仍成为骨开发的亟待解决问题。近年来，有学者从事微生物发酵骨泥利用骨中钙的相关研究，他们的研究结果表明乳酸菌发酵可以明显使骨泥液中离子钙的含量明显提高，但其发酵效果有待进一步的提高。
近几年资料表明，我国大多数人群处于缺钙边缘甚至严重缺钙，缺钙是我国人群中普遍存在的现象。缺钙可能会引起骨质疏松、佝偻症、小儿抽搐症等多种疾病。而目前市场上的钙制剂的发展历经了三个阶段，无机钙盐、有机酸钙盐以及氨基酸螯合钙。从吸收率的角度考虑，第三代氨基酸螯合钙＞第二代有机钙盐＞第一代无机钙盐。而近年来，随着小肽吸收理论的提出，第四代多肽螯合钙盐成为研究的热点。从吸收机制、螯合机制、转运机制、功能性以及稳定性方面而言，多肽螯合钙明显优于氨基酸螯合钙，充分发挥了胶原多肽和钙对人体的双重营养功能特性。研究表明，要预防和改善骨质疏松，最科学的方法是同时补充钙和胶原蛋白。
目前，有关动物骨开发制备骨胶原多肽螯合钙的专利都是采用酶解工艺完成，虽然关于骨骼酶解取得了一定的成绩和突破，但由于酶解骨骼所用酶的来源不同，成本较高，而且由于没有找到真正合适降解骨骼的大工业生产利用的蛋白酶，能否实现工业化生产仍面临极大挑战。因此，探索新的降解骨骼的途径现在成为骨骼产业化利用亟待解决的问题。
发明内容
本发明的目的是为解决上述技术问题的不足，提供一种投入成本低廉的微生物降解猪骨的制备胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法，用来提高猪骨加工的附加值，通过选育菌种的混合发酵，从废弃猪骨中制备高附加值的功能性补钙产品—胶原多肽钙螯合物的制备方法，实现了猪骨骼的综合利用。
本发明为解决上述技术问题的不足，所采用的技术方案是：一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法，所述方法包括以下步骤：
（1）、猪骨泥的制备：取新鲜猪骨，破碎后清洗干净， 121℃高压蒸煮脱脂40分钟，然后通过超微粉碎制成猪骨泥；
（2）、骨胶原多肽的制备：取蒸馏水、蔗糖和步骤（1）中制备的猪骨泥配制成猪骨泥培养液，其中每升猪骨泥培养液中含有15～20g蔗糖、35～40g猪骨泥，将猪骨泥培养液的pH值调至7.2～7.4，在121℃条件下灭菌30分钟，然后接种粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种，粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的配比为1:1或2:1，混合菌种的总接种量为培养液质量的3～4%，接种完成后在35℃条件下，以140 转/分钟的转速摇床发酵培养48 小时，发酵培养结束后，在121℃条件下灭菌30 分钟，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，采用活性炭进行脱色处理，并经过滤，旋转蒸发后冷冻干燥，即得骨胶原多肽，分离出来的骨泥渣储存备用；
（3）、可溶性骨钙的制备：取步骤（2）中分离出来的骨泥渣与浓度为0.48 mol/L盐酸混合，每15ml盐酸加入1g骨泥渣，50℃水浴3 小时，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，调整pH值为7.0，再以8000 转/分钟的转速离心10 分钟，去除沉淀将上清液干燥制得可溶性的骨钙；
（4）、骨胶原多肽钙螯合物补钙剂的制备：取步骤（2）中制备好的骨胶原多肽，采用蒸馏水溶解，并调节pH值为7.5，然后加入骨胶原多肽质量1/3的可溶性骨钙，在 55～60℃条件下螯合反应2～3小时，反应结束后，向反应溶液中加入无水乙醇与水混合溶液，以5000 转/分钟的转速离心20分钟，取沉淀物，经过滤，冷冻干燥，粉碎，即制得猪骨胶原多肽钙螯合物补钙剂，其中无水乙醇与水混合溶液中无水乙醇与水的体积比为9:1。
所述步骤（1）中破碎后的猪骨反复煮沸100℃脱脂2～3小时，然后通过超微粉碎制成猪骨泥。
本发明的有益效果是：
（1）本发明方法提高了猪骨资源的附加值，实现了猪骨中胶原蛋白和骨钙的综合开发利用，防止猪骨遗弃造成的环境污染，且用到的设备均为普通设备，成本低，可操作性强，制备效率高，可用于规模生产。
（2）本发明方法制备的螯合物补钙剂在水中的溶解度好，这对于人体对螯合物中钙元素的生物吸收利用非常有利，且产品在PH 2.0～PH 8.0的范围内溶解度都很高。产品可应用于轻工、化工、食品、化妆品、医药等多个领域。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施例，但本发明不受具体实施例限制。
实施例1
（1）、猪骨泥的制备：取新鲜猪骨，破碎后清洗干净， 121℃高压蒸煮脱脂40分钟，然后通过超微粉碎制成猪骨泥。
超微粉碎，是指利用机械或流体动力的方法克服固体内部凝聚力使之破碎，从而将3毫米以上的物料颗粒粉碎至10-25微米的操作技术。
（2）、骨胶原多肽的制备：取蒸馏水、蔗糖和步骤（1）中制备的猪骨泥配制成猪骨泥培养液，其中每升猪骨泥培养液中含有15g蔗糖、35g猪骨泥，将猪骨泥培养液的PH值调至7.2，在121℃条件下灭菌30 分钟，然后接种粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种，粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的配比为2:1，混合菌种的总接种质量量为培养液质量的3 %，接种完成后在35℃条件下，以140 转/分钟的转速摇床发酵培养48 小时，发酵培养结束后，在121℃条件下灭菌30 分钟，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，采用活性炭进行脱色处理，并经过滤，旋转蒸发后冷冻干燥，即得骨胶原多肽，分离出来的骨泥渣储存备用；
（3）、可溶性骨钙的制备：取步骤（2）发酵剩余的骨泥渣与浓度为0.48 mol/L盐酸混合，每15ml盐酸加入1g骨泥渣，50℃水浴3 小时，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，调整pH值为7.0，再以8000 转/分钟的转速离心10 分钟，去除沉淀将上清液干燥制得可溶性的骨钙；
（4）、骨胶原多肽钙螯合物补钙剂的制备：取步骤（2）中制备好的骨胶原多肽，用蒸馏水溶解，并调节pH值为7.5，然后加入骨胶原多肽质量1/3的可溶性骨钙，在 55℃条件下螯合反应2小时，反应结束后，向反应溶液中加入无水乙醇与水混合溶液，以5000 转/分钟的转速离心20分钟，取沉淀物，经过滤，冷冻干燥，粉碎，即制得猪骨胶原多肽钙螯合物补钙剂，其中无水乙醇与水混合溶液中无水乙醇与水的体积比为9:1。
经实验确定螯合率约为54.31±3.11%，螯合物得率为79.23±4.54%，对于所得产品采用茚三酮-硫酸钠法鉴定为猪骨胶原多肽钙螯合物。
制得的猪骨胶原多肽钙螯合物的组成成分如下表所示：
Figure 490852DEST_PATH_IMAGE001
其中粗蛋白（胶原多肽+其他杂质蛋白）的含量为81.57%；
从表中数据可知，所制备的猪骨胶原多肽钙螯合物的主要成分是多肽和钙，因此，该产品能完全达到胶原多肽和钙互补的效果。
制得的猪骨胶原多肽钙螯合物的溶解度如下表所示：
制得的猪骨胶原多肽钙螯合物在不同pH条件下的溶解度如下表所示：
Figure 455714DEST_PATH_IMAGE003
从以上结果分析可知，在水温接近人体正常的体温（30～40℃）条件下，螯合物的溶解度比较好，这对于人体对螯合物中钙元素的吸收非常有利。同时在pH为2～12范围内，产品都具有很好的溶解度；但pH为7.0时，其溶解度最小，而随着酸性或碱性增强，溶解度不断增加，同时，其在酸性条件下溶解度增加略大于在碱性条件下。表明，在胃肠道吸收时产品也同样具有很好的溶解度。
通过胃肠道模拟检测猪骨胶原多肽钙螯合物的持钙能力，将待测样0.5g研碎（模拟牙齿咀嚼或胃内崩解），充分溶于50ml的HCl中（模拟胃酸溶解）。酸液经离心（6000转/分钟，20 分钟），过滤处理收集上清液，测定滤液的pH值。用NaOH溶液调节滤液的pH值至4.5～5.0范围内，注意滴加碱液时应缓慢，防止沉淀产生并保持溶液处于澄清状态。取另一试管中加入10ml磷酸缓冲溶液（pH7.0～8.0，模拟小肠中性至弱碱性生理环境），用微量注射器向试管内注入上述处理好的滤液1ml（模拟钙离子在小肠中性至弱碱性环境中的变化），观察是否有沉淀产生。
制得的猪骨胶原多肽钙螯合物在模拟胃肠道中的持钙稳定性如下表所示:
Figure 482312DEST_PATH_IMAGE004
与市售的钙片相比，产品在模拟人体消化过程中能抑制沉淀的产生，具有较强的持钙能力。分析原因是由于一般的钙剂在胃酸的作用下离解出Ca2+，进入小肠后以离子形式被肠道吸收。Ca2+在小肠内的吸收分为主动运输和被动扩散两种方式。由于小肠中下段的pH值呈中性或弱碱性，钙离子极易在此生理环境中与某些弱酸根结合生成难溶的盐，从而降低Ca2+在小肠内的浓度，影响小肠壁对Ca2+的吸收。而猪骨胶原多肽与钙离子结合成稳定的可溶性络合物，有效抑制沉淀的产生，提高了Ca2+在小肠内的浓度，促进了小肠壁对Ca2+的吸收。
实施例2
（1）、猪骨泥的制备：取新鲜猪骨，破碎后清洗干净，反复煮沸100℃脱脂2～3小时，然后通过超微粉碎制成猪骨泥。
（2）、骨胶原多肽的制备：取蒸馏水、蔗糖和步骤（1）中制备的猪骨泥配制成猪骨泥培养液，其中每升猪骨泥培养液中含有20g蔗糖、40g猪骨泥，将猪骨泥培养液的pH值调至7.4，在121℃条件下灭菌30 分钟，然后接种粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种，粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的配比为1:1，混合菌种的总接种质量量为培养液质量的4 %，接种完成后在35℃条件下，以140 转/分钟的转速摇床发酵培养48 小时，发酵培养结束后，在121℃条件下灭菌30 分钟，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，采用活性炭进行脱色处理，并经过滤，旋转蒸发后冷冻干燥，即得骨胶原多肽，分离出来的骨泥渣储存备用；
（3）、可溶性骨钙的制备：取步骤（2）发酵后剩余的骨泥渣与浓度为0.48 mol/L盐酸混合，每15ml盐酸加入1g骨泥渣，50℃水浴3 小时，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，调整pH值为7.0，再以8000 转/分钟的转速离心10 分钟，去除沉淀将上清液干燥制得可溶性的骨钙；
（4）、骨胶原多肽钙螯合物补钙剂的制备：取步骤（2）中制备好的骨胶原多肽，用蒸馏水溶解，并调节pH值为7.5，然后加入骨胶原多肽质量1/3的可溶性骨钙，在 60℃条件下螯合反应3小时，反应结束后，向反应溶液中加入无水乙醇与水混合溶液，以5000 转/分钟的转速离心20分钟，取沉淀物，经过滤，冷冻干燥，粉碎，即制得猪骨胶原多肽钙螯合物补钙剂，其中无水乙醇与水混合溶液中无水乙醇与水的体积比为9:1。对于所得产品采用茚三酮-硫酸钠法鉴定为猪骨胶原多肽钙螯合物。
实施例3
（1）、猪骨泥的制备：取新鲜猪骨，破碎后清洗干净，反复煮沸100℃脱脂2～3小时，然后通过超微粉碎制成猪骨泥。
（2）、骨胶原多肽的制备：取蒸馏水、蔗糖和步骤（1）中制备的猪骨泥配制成猪骨泥培养液，其中每升猪骨泥培养液中含有17g蔗糖、38g猪骨泥，将猪骨泥培养液的pH值调至7.3，在121℃条件下灭菌30 分钟，然后接种粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种，粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的配比为1:1，混合菌种的总接种质量量为培养液质量的4 %，接种完成后在35℃条件下，以140 转/分钟的转速摇床发酵培养48 小时，发酵培养结束后，在121℃条件下灭菌30 分钟，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，采用活性炭进行脱色处理，并经过滤，旋转蒸发后冷冻干燥，即得骨胶原多肽，分离出来的骨泥渣储存备用；
（3）、可溶性骨钙的制备：取步骤（2）发酵后剩余的骨泥渣与浓度为0.48 mol/L盐酸混合，每15ml盐酸加入1g骨泥渣，50℃水浴3 小时，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，调整pH值为7.0，再以8000 转/分钟的转速离心10 分钟，去除沉淀将上清液干燥制得可溶性的骨钙；
（4）、骨胶原多肽钙螯合物补钙剂的制备：取步骤（2）中制备好的骨胶原多肽，用蒸馏水溶解，并调节pH值为7.5，然后加入骨胶原多肽质量1/3的可溶性骨钙，在 57℃条件下螯合反应2.5小时，反应结束后，向反应溶液中加入无水乙醇与水混合溶液，以5000 转/分钟的转速离心20分钟，取沉淀物，经过滤，冷冻干燥，粉碎，即制得猪骨胶原多肽钙螯合物补钙剂，其中无水乙醇与水混合溶液中无水乙醇与水的体积比为9:1。对于所得产品采用茚三酮-硫酸钠法鉴定为猪骨胶原多肽钙螯合物。

Claims (2)

1.一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：
（1）、猪骨泥的制备：取新鲜猪骨，破碎后清洗干净， 121℃高压蒸煮脱脂40分钟，然后通过超微粉碎制成猪骨泥；
（2）、骨胶原多肽的制备：取蒸馏水、蔗糖和步骤（1）中制备的猪骨泥配制成猪骨泥培养液，其中每1L猪骨泥培养液中含有15～20g蔗糖和35～40g猪骨泥，将猪骨泥培养液的PH值调至7.2～7.4，在121℃条件下灭菌30分钟，然后接种粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的混合菌种，粘质沙雷氏菌和保加利亚乳杆菌的配比为1:1或2:1，混合菌种的总接种量为培养液质量的3～4%，接种完成后在35℃条件下，以140 转/分钟的转速摇床发酵培养48 小时，发酵培养结束后，在121℃条件下灭菌30 分钟，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，采用活性炭进行脱色处理，并经过滤，旋转蒸发后冷冻干燥，即制得骨胶原多肽，分离出来的骨泥渣储存备用；
（3）、可溶性骨钙的制备：取步骤（2）中分离出来的骨泥渣与浓度为0.48 mol/L盐酸混合，每15ml盐酸加入1g骨泥渣，在50℃条件下水浴3 小时，然后以6000 转/分钟的转速离心15分钟，取上清液，调整pH值为7.0，再以8000 转/分钟的转速离心10 分钟，去除沉淀将上清液冷冻干燥制得可溶性的骨钙；
（4）、骨胶原多肽钙螯合物补钙剂的制备：取步骤（2）中制备好的骨胶原多肽，采用蒸馏水溶解，并调节pH值为7.5，然后加入骨胶原多肽质量1/3的可溶性骨钙，在 55～60℃条件下螯合反应2～3小时，反应结束后，向反应溶液中加入无水乙醇与水混合溶液，以5000 转/分钟的转速离心20分钟，取沉淀物，经过滤，冷冻干燥，粉碎，即制得猪骨胶原多肽钙螯合物补钙剂，其中无水乙醇与水混合溶液中无水乙醇与水的体积比为9:1。
2.根据权利要求1所述的一种猪骨胶原多肽钙螯合补钙剂的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中破碎后的猪骨反复煮沸100℃脱脂2～3小时，然后通过超微粉碎制成猪骨泥。
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